LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
Arnė Antanavičiūtė
AVIŲ UŽSIKRĖTIMAS VIRŠKINAMOJO TRAKTO NEMATODAIS IR NEMATODŲ ATSPARUMAS ANTIHELMINTINĖMS MEDŽIAGOMS
THE INFECTION OF GASTROINTESTINAL NEMATODES IN SHEEP AND DETECTION OF ANTIHELMINTIC RESISTANCE
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: lekt. dr.Inga Stadalienė
2 DARBAS ATLIKTAS DR. L. KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „AVIŲ UŽSIKRĖTIMAS
VIRŠKINAMOJO TRAKTO NEMATODAIS IR NEMATODŲ ATSPARUMAS
ANTIHELMINTINĖMS MEDŽIAGOMS“ 1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Arnė Antanavičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Arnė Antanavičiūtė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Inga Stadalienė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KLINIKOJE Birutė Karvelienė
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)
vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5 SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 1. ĮVADAS ... 8 2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 102.1. DAŽNIAUSIAI APTINKAMI AVIŲ VIRŠKINAMOJO TRAKTO NEMATODAI ... 10
2.1.1. Hemonchozė ... 10 2.1.2. Teladorsagiozė ... 10 2.1.3. Trichostrongiliozė ... 11 2.1.4. Nematodirozė... 12 2.1.5. Koperiozė ... 12 2.1.6. Chabertiozė ... 13 2.1.7. Trichurozė ... 13 2.1.8. Ezofagostomozė... 14 2.1.9. Strongiloidozė ... 14
2.2. Antihelmintiniai vaistai ir jų naudojimas veterinarijoje ... 15
2.3. Ivermektinas ir jo veikimo mechanizmas ... 15
2.4. Benzimidazolai ir jų veikimo mechanizmas ... 16
2.5. Levamizolio hidrochloridas ir jo veikimo mechanizmas ... 17
2.6. Antihelmintinis atsparumo atsiradimo mechanizmas ... 17
2.7. Epidemiologiniai antihelmintinio atsparumo duomenys Europoje ir kituose žemynuose ... 18
2.8. Avių virškinamojo trakto nematodų ir jų atsparumo antihelmintinėms medžiagoms diagnostika ... 19
3. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21
4
3.2. Modifikuotas MakMaster metodas ... 22
3.3. Išmatų plovimas ir kiaušinėlių surinkimas ... 23
3.4. Lervų išsiritimo testas (LRT) ... 24
3.5. Lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) ... 25
3.6. Statistinė analizė ... 26
4. TYRIMO REZULTATAI... 27
4.1. Nematodų paplitimas tiriamuosiuose ūkiuose ... 27
4.2. Nematodų atsparumo nustatymas benzimidazolams ... 30
4.3. Nematodų atsparumas makrocikliniams laktonams... 32
4.4. Nematodų atsparumas levamizolui ... 36
5. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 38
6. IŠVADOS ... 40
PADĖKA ... 41
5
SANTRUMPOS
AR – antihelmintinis rezistentiškumas
DMSO – dimetilo sulfoksidas
FAMACHA – angl. FAffa MAlan CHArt
FAO - Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio organizacija (angl. Food and Agricultural organization)
GABR - gama-aminosviesto rūgštis/ gama-aminobutirinė rūgštis
KSG – kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų (angl. Faecal egg count)
KST – kiaušinėlių sumažėjimo testas (angl. Faecal egg count reduction test)
LRT – Lervų išsiritimo testas (angl. Egg hatch test)
LVTMA – lervų vystymosi testas mikro agare
PCV – suspaustų ląstelių tūris
PI – pasikliautinis intervalas
TBZ - tiabendazolas
TV – tarptautiniai vienetai
6
SANTRAUKA
Avių užsikrėtimas virškinamojo trakto nematodais ir nematodų
atsparumas antihelmintinėms medžiagoms
Arnė Antanavičiūtė Magistro baigiamasis darbas
Šį Magistro baigiamąjį darbą sudaro šios dalys: įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo metodika, tyrimų rezultatai, rezultatų apibendrinimas, išvados, literatūros sąrašas. Darbo apimtis – 45 puslapiai. Šiuose puslapiuose galima rasti 4 nuotraukas, 10 grafikų ir 1 lentelę. Panaudoti 44 literatūros šaltiniai.
Magistro baigiamajame darbe aprašoma avių užsikrėtimas virškinamojo trakto nematodais ir jų atsparumas antihelmintinėms medžiagoms.
Literatūros apžvalgoje aprašomi dažniausiai sutinkami avių virškinamojo trakto parazitai, pateikiami epidemiologiniai duomenys Europoje ir kituose žemynuose. Taip pat glaustai aprašomi antihelmintinių preparatų panaudojimas ir veikimo mechanizmas, rezistentiškumas ir rezistentiškumo mechanizmas.
Tyrimas buvo atliktas 2017 metų gegužės – lapkričio mėnesiais. Buvo tiriami 13 avių ūkių, esančių įvairiose Lietuvos dalyse. Tyrimas buvo atliktas pasirenkant tik tuos avių ūkius, kurių ankstesnis gydymas antihelmintinėmis medžiagomis buvo atliktas ne vėliau nei prieš 10 savaičių. Tirti ūkiai buvo sudaryti tiek iš vietinių avių veislių, tiek iš įvežtinių (mišrūnės). Visas tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Parazitologijos laboratorijoje. Tyrimui naudotas modifikuotas MakMaster metodas bei šie in vitro metodai: lervų išsiritimo testas (LRT) - nustatyti atsparumą benzimidazolams, ir lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) - nustatyti atsparumą makrocikliniams laktonams ir levamizolui.
Bendras avių ūkių užsikrėtimas strongiliatų kiaušinėliais gana silpnas, o vidutinis kiaušinėlių skaičius grame išmatų buvo 418,3 (± 227,1). 11-ai ūkių darytas LRT ir gautas 100 proc. atsparumas benzimidazolams. Taip pat 13 ūkių darytas in vitro LVTMA ir 84,6 proc. rastas atsparumas makrocikliniams laktonams. Levamizolui atsparus buvo tik 1 ūkis, kuris sudarė tik 7,7 proc. iš visų 13 tirtų avių ūkių. Tirtuose Lietuvos ūkiuose nustatytas multirezistentiškumas. 76,9 proc. tirtų avių ūkių turėjo multirezistentiškumą benzimidazolams ir makrocikliniams laktonams.
Raktažodžiai: atsparumas antihelmintikams, benzimidazolas, makrocikliniai laktonai, levamizolas, nematodai, avys.
7
SUMMARY
The infection of gastrointestinal nematodes in sheep and detection of
antihelmintic resistance
Arnė Antanavičiūtė Master’s degree Final Thesis
This is Master’s degree Final Thesis. It contains of: Introduction, Review of Literature, Materials and Methods, Results, Discussion, Conclusions and Reference list. The Thesis consists of 45 pages which includes 4 photos 10 figures and 1 table. Thesis contains of 44 literature references.
The Thesis is about the infection of sheep gastrointestinal nematodes and detection of antihelmintic resistance.
There is a brief description of sheep gastrointestinal nematodes in the Review of Literature. In addition to, the situation of antihelmintic resistance in other European countries as well as other Continents is also described. You can also find information about most common antihelmintic drugs, their way of action, records for antihelmintic resistance (AR), its mechanism and the diagnosis of gastrointestinal nematodes in sheeps.
The Research was made from May to November in 2017. 13 sheep farms in total were enrolled in this study from various regions of Lithuania. Farms were chosen to have their antihelmintic treatment for at least 10 weeks prior the beginning of study. Both, local and imported (mixed) sheep breeds were involved in the study. The whole research was made in the Parasitology laboratory, Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary academy. Methods, that was used were Modified McMaster technique, Egg Hatch Test (EHT) and Larval Development Test in micro agar (LDTMA) in vitro.
General infection of strongyle eggs were mild with average prevalence of 418,3 eggs per gram of faeces (± 227,1). 11 (100%) farms had antihelmintic resistance to benzimidazole, detected by in vitro EHT. 84,6% of farms (which in total were 13) had antihelmintic resistance to macrocyclic lactones. There was only 1 sheep farm (of total 13), having AR to levamisole (7,7%). In the study of this research multiresistance was detected in lithuanian sheep farms. 76,9% had antihelmintic resistance to macrocyclic lactones and benzimidazoles.
Keywords:, antihelmintic resistance, benzimidazole, ivermectin, levamisole, nematodes, sheep.
8
1. ĮVADAS
Avininkystė – visame pasaulyje labai populiari gyvulininkystės šaka (1; 2). Avys iš kitų produkcijos gyvūnų išsiskiria savo lanksčia ir neišrankia priežiūra, nereiklumu pašarams. Avys geba gyventi ir atnešti didelius produkcijos kiekius tose vietovėse, kur kiti produkcijos gyvūnai gyventų labai skurdžiai (1; 3). Nepaisant to, gaunamos produkcijos įvairovė daro šiuos smulkiuosius atrajotojus labai patrauklia verslo sritimi visame pasaulyje. Avių produktams priskiriami jų pienas, mėsa, odos bei vilna (1).
Statistikos duomenimis visame pasaulyje yra apie 1000 milijonų registruotų avių, iš kurių kiekvienais metais išgaunama apie 14 milijonų tonų avienos (3). Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio organizacijos (FAO) 2012 m. duomenimis fiksuojama, jog visame pasaulyje avininkystės pasiskirstymas yra: 44,9 proc. Azijoje, 27,6 proc. Afrikoje, 11,1 proc. Europoje, 9,1 proc. Okeanijos salose bei 7,3 proc. Šiaurės ir Pietų Amerikos žemynuose (4; 5).
Lietuvoje avių sparčiai daugėja, avininkystė tampa patrauklia gyvulininkystės šaka. 2015 m. vasario 1 d. Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro (ŽŪIKVC) duomenimis Lietuvoje yra registruoti 8 997 avių laikytojai. Visoje šalyje suskaičiuotos 123 902 avys. Daugiausia registruoti po 1-2 avis laikantys ūkiai, kurių suskaičiuota 2 343, o po 3-5 avis laikoma 2 233 ūkiuose. Registruoti 255 ūkiai, laikantys iki 100 avių, daugiau nei 150 avių laiko 58 ūkiai, kuriuose suminė laikomų avių suma yra 23 917 (6). Daugiausia registruotų avių yra Anykščių, Biržų, Kaišiadorių, Lazdijų, Molėtų, Telšių, Ignalinos, Utenos, Vilniaus ir Zarasų rajonuose (6; 7). Per dvejus metus Lietuvoje registruotų avių skaičius padidėjo 41,35 proc. ir 2017 m. gruodžio 1 d. siekė 175 133 avių (7).
Virškinamojo trakto parazitai plačiai paplitę visame pasaulyje ir jų sukeliamos ligos - viena iš dažniausiai pasireiškiančių problemų smulkiųjų atrajotojų ūkiuose (8), o sergantys produkcijos gyvūnai atneša milžiniškus ekonominius nuostolius ūkininkams (9; 10). Vis intensyvėjant avių auginimui, didėja ir parazitinių infekcijų problema (6), todėl stebimas ir gaunamos produkcijos sumažėjimas dėl mažo priesvorio. Gausus užsikrėtimas virškinamojo trakto parazitais ūkiuose yra sunkiai kontroliuojamas ir gali sukelti didelį avių gaištamumą (8). Esant gausiam užsikrėtimui helmintais, intensyviai naudojami antihelmintikai norint kontroliuoti jų sukeliamus nuostolius, todėl dažnai pasitaiko ir klaidų atliekant gydymą ūkiuose. Intensyvus ir netinkamas naudojimas antihelmintinių preparatų veda link nematodų atparumo naudojamiems antihelmintikams (11). Šiuo metu rezistentiškumas vaistams nuo parazitų yra nustatomas vis dažniau ir kelia grėsmę avininkystės ūkiui visame pasaulyje (12). Atsparumas antihelmintinėms medžiagoms kelia nemažai problemų ne tik tropinėse ir subtropinėse klimato juostose, bet visame pasaulyje, ypač tose šalyse,
9 kuriose avininkystė užima labai svarbią dalį – Australijoje, Naujojoje Zelandijoje, Afrikoje bei Pietų Amerikoje (13; 14). Nematodų atsparumas benzimidazolams naujausiais duomenimis buvo nustatytas Amerikoje, Afrikoje, Europoje, Azijoje ir Okeanijos salose. Sunkumų sudaro tai, jog antihelmintinis rezistentiškumas vystosi sparčiau nei yra sukuriami nauji vaistiniai preparatai (9; 10).
Atsparumo atihelmintikams situacija Lietuvos avių ūkiuose pradėta tirti visai neseniai ir Kupčinsko su kitais bendraautoriais (2015) pirmieji duomenys parodė esančią atsparumo problemą (15). Norint sužinoti kokio masto atsparumo paplitimas šalyje, reikalingi papildomi tyrimai, išplečiantys tyrimo regionus, todėl pasirinkta darbui ši tema.
Magistrinio darbo tikslas: nustatyti avių užsikrėtimą virškinamojo trakto nematodais Lietuvos ūkiuose ir ištirti šių nematodų antihelmintinį rezistentiškumą in vitro metodais.
Magistrinio darbo uždaviniai:
1. Nustatyti užsikrėtimo virškinamojo trakto nematodais gausumą avių ūkiuose;
2. Nustatyti antihelmintinį atsparumą benzimidazolams, naudojant in vitro lervų išsiritimo testą;
3. Nustatyti antihelmintinį atsparumą makrocikliniams laktonams, naudojant in vitro lervų vystymosi testą mikro agare;
4. Nustatyti antihelmintinį atsparumą levamizolui, naudojant in vitro lervų vystymosi testą mikro agare;
5. Nustatyti atsparias nematodų gentis makrocikliniams laktonams ir levamizolui; 6. Įvertinti nematodų atsparumo situaciją Lietuvoje.
10
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. DAŽNIAUSIAI APTINKAMI AVIŲ VIRŠKINAMOJO TRAKTO
NEMATODAI
2.1.1. Hemonchozė
Haemonchus contortus - vienas iš produktyviausių strongylidų klasei priklausančių nematodų (16). Paplitę visame pasaulyje, tačiau dominuoja tropinėse ir subtropinėse klimato juostose. Suaugėliai lengvai diagnozuojami dėl savo didelio dydžio (2.0-3.0 cm) ir parazitavimo vietos (16; 17). Parazituoja avių ir ožkų šliuže. Patinėliai turi asimetrinę dorsalinę skiauterėlę ir spygliuotas spikules. Patelės dažniausiai turi vulvos atlapą. Vulva randama užpakaliniame kūno trečdalyje. Abejoms lytims būdingos cervikalinės papilės ir žiočių kapsulėje esantis mažas lancetas. Lervos turi 16 žarnyno ląstelių, siaurą užapvalintą galvutę. Kiaušinėliai vidutinio dydžio (64-95 x 40-50 µm), plačios elipsės formos, bukais galais. Vidinė membrana susiraukšlėjusi, o išorinėje pusėje plonas, lygus, šviesiai geltonas chitininis apvalkalas. Kiaušinėlio viduje daug blastomerų, užpildančių beveik visą kiaušinėlio tūrį. Invazyvi lerva yra 690 µm dydžio (18). Patelės padeda tūkstančius apvaisintų kiaušinėlių per dieną. Dėl to ganyklų užterštumas būna labai didelis ir siejamas su hemonchozės protrūkiais. Avių organizmuose inkubacinis periodas trunka 18-21 dieną. Suaugėlių gyvenimo trukmė pakankamai neilga – tik keleta mėnesių. Pavojingiausi yra L4 stadijos lervos ir suaugėliai, nes misdami krauju sukelia anemiją, kuri išryškėja po dviejų savaičių po užsikrėtimo. Ligos sunkumas tiesiogiai priklausomas nuo užsikrėtimo intensyvumo. Ūmiais atvejais užsikrėtimas sukelia hemoraginę anemiją, tuštinimasi su kraujo priemaiša (melena), edemą, bendrą silpnumą, sumažėjusią vilnos produkciją. Taip pat užsikrėtimas pasireiškia raumenų masės sumažėjimu bei sunkiais užsikrėtimo atvejais - mirtimi. Lėtinei ligos formai būdingas sumažėjęs apetitas, svorio kritimas ir lengvo laipsnio anemija. Kitaip nei kiti virškinamojo trakto parazitai, H. contortus infekcija nėra avių viduriavimo pirminė priežastis ir užsikrėtimas ne visada pastebimas bendros gyvūnų apžiūros metu (16).
2.1.2. Teladorsagiozė
Avių ir ožkų šliuže parazituoja Teladorsagia circumcincta, Ostertagia trifurcata ir Teladorsagia davtiani. Suaugusios kirmėlės yra plonos, raudonai - rudos spalvos su trumpa žandine
11 ertme. Patinėliai būna 6-8 mm , o patelės 8-10 mm ilgio. T. circumcincta kiaušinėliai yra vidutinio dydžio (apie 80-100 x 40-55 µm), taisyklingos elipsės formos, kurios galai vidutinio platumo. Kiaušinėlių apvalkalas yra lygus ir plonas. Viduje daug blastomerų, užpildančių visą kiaušinėlio plotą ir kurių kiekvieno ribas sunku išskirti (18). Teladorsagia circumcincta yra mažiau produktyvios, lyginant su H. contortus, vidutiniškai 1 teladorsagijų patelė padeda apie 100-200 kiaušinėlių per dieną. Teladorsagia lervos nesimaitina krauju ir pagrindinis patologinis efektas yra sukeliamas lervos stadijų. Lervų vystymasis vyksta skrandžio liaukutėse. Tai sukelia mazgų susidarymą tikrojo skrandžio gleivinėje (abomasum) ir plačiai pažeidžia parietalines ląsteles. Tai lemia sumažėjusią skrandžio rūgšties gamybą. Vėliau, padidėjęs skrandžio pH sutrikdo pepsinogeno virtimą į aktyvią pepsino formą ir dėl to pakyla plazmos pepsinogeno kiekis ir sutrinka bei sumažėja baltymų virškinimas (16). Kraujo plazmos pepsinogeno kiekį rodo tilozinas (norma 0,8 TV) ir ūmių infekcijų metu jis avių kraujo plazmoje pakyla iki 2.0 TV (18). Infekcijos daromos žalos stiprumas priklauso nuo esančių kitų infekcijų, nuo avių įmitimo ir sugebėjimo sudaryti organizmo imunogeninį atsaką. Dažnai avims užsikrėtimas būna subklinikinis ar vidutinio stiprumo. Tai sukelia viduriavimą, prastą svorio prieauglį (dažnais atvejais krenta svoris) bei sumažėja vilnos augimas (16).
2.1.3. Trichostrongiliozė
Trichostrongylus rūšies nematodai sudaro svarbią grupę ganomų smulkiųjų atrajotojų tarpe (16). Trichostrongylus axei parazituoja avių šliuže, o T. colubriformis, T. vitrinus ir T. longispicularis parazituoja avių plonosiose žarnose. Trichostrongylus rūšių kirmėlės yra mažos, šviesios rudai raudonos spalvos, plauko plonumo, todėl sunkiai įžiūrimos plika akimi. Patinėliai yra apie 4,0-5,5 mm ilgio, o patelės 5,5-7,5 mm ilgio. Kirmėlės neturi žiočių kapsulės. Stemplinėje srityje yra išorinės kutikulės nelygumas – tai būdingas bendrinis trychostrongilų išorės bruožas (18). Trichostrongylus spp. turi trumpą nefilamentinę uodegėlę (19). Spikulės smailėjančios, tvirtos, rudai pigmentuotos, su gauburėliu. Rūšis apibūdinama pagal spikulių formą ir dydį. Patelių uodegėlė kūgio formos ir neturi vulvos atlapo. Kiaušinėliai turi ploną apvalkalą, yra tipiški stongylams. Mikroskopiškai trichostrongilai sukelia žarnų gleivinės gaurelių atrofiją ir susiliejimą, kriptų išsiplėtimą ir padidėja gleives išskiriančių ląstelių skaičius. Dėl to į žarnų gleivinės savąją plokštelę (lamina propria) infiltruojami eozinofilai ir leukocitai (18).
12 2.1.4. Nematodirozė
Pagrindinės rūšys yra Nematodirus battus, N. filicollis ir N. Spathiger (20). Šie nematodai parazituoja avių plonosiose žarnose. Suaugusios kirmėlės yra ilgos ir plonos. Patinėliai yra 11-16 mm ilgio, o patelės 15-25 mm ilgio.Patelės turi ilgą ir smailią uodegėlę (20). Patelių priekinė dalis yra siauresnė už užpakalinę, dėl to kai kurioje literatūroje šios kirmėlės vadinamos siaurakaklėmis arba plonakaklėmis (20). Kirmelių kūnas užsilenkęs ar užsirietęs, dėl to jos linkusios susipinti viena su kita (18). Kiaušinėliai yra dideli, lygiagrečiais kraštais, 150-180 x 67-80 µm dydžio. Chitininis kiaušinėlių apvalkalas yra plonas, lygiasienis, o kiaušinėlio viduje yra nuo 4 iki 8 tamsios spalvos blastomerų (18). Dėl didesnio kiaušinėlio dydžio L₃ invazinė lerva susiformuoja dar kiaušinėlio viduje. Vystymasis yra gana lėtas, o lervos išsiritimą kai kurioms rūšims (N. battus ir N. filicollis) skatina atvėsęs aplinkos oras (20). L₃ stadijos lerva, esanti kiaušinėlyje, ganykloje gali išgyventi iki 2 metų (18). Išsiritusias iš kiaušinėlio L₃ stadijos lervas avys suėda su ganyklų žole. Invazinės lervos prasiskverbia per žarnų gleivinę, dažniausiai klubinės žarnos dalyje. Nepaisant to, dauguma lervų būna aptinkamos ant gleivinės paviršiaus. Nuo užsikrėtimo pradžios iki lervos virtimo L₅ stadijos praeina 10-12 dienų. Per tą laiką stipriai pažeidžiami žarnų gaureliai – gleivinėje atsiveria erozijos ir opos, kas lemia gaurelių atrofiją. Dėl to sumažėja žarnų gleivinės pajėgumas absorbuoti maisto medžiagas bei skysčius, gyvūnai pradeda viduriuoti ir tampa stipriai dehidratavę. Viduriavimas būna geltonai - žalios spalvos ir visoms gausiai užsikrėtusioms avims būdingas enteritas (18).
2.1.5. Koperiozė
Tai plonosiose žarnose parazituojantys nematodai. Avys dažniausiai užsikrečia Cooperia curticei ir Cooperia surnabada. Cooperia curticei yra gana mažos kirmėlės, turinčios didelę bursą su joje esančiais mėsingais spinduliais. Cooperia surnbada yra labai panašios išvaizdos, tačiau jų bursa yra didesnė, o spinduliai plonesni. Patinėliai yra 4,5 – 6,0 mm ilgio, o patelės 6,0-8,0 mm ilgio, rausvai baltos spalvos. Pagrindinis bendrinis bruožas yra labai maža galvinė pūslelė ir stemplinėje dalyje susiformavusios kutikulės strijos. Kūnas turi išilgines briaunas. Spikulės yra vienodo ilgio, turi centrinį gumburą, užsibaigiančiu diskinės formos struktūra. Patelės turi ilgą siaurėjančią uodegėlę. Kiaušinėliai yra ovalios formos, turi ploną lygų apvalkalą. Kiaušinėlio viduje yra daug blastomerų. Invazinė lerva yra apie 780 µm ilgio. Cooperia curticei nėra labai patogeniškos avims ir ėriukams, nes negausiai užsikrėtę gyvūnai būna asimptomatiniai. Tačiau buvo atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, jog gausiai užsikrėtusioms avims ir ėriukams sutrinka
13 virškinimas. To pasekmėje sergančios avys prarasdavo apetitą ir sumažėdavo jų priesvoris. Cooperia nematodai neįsiskverbia į žarnų epitelio gleivinę, tačiau susirango tarp žarnų gaurelių. Gaureliai yra spaudžiami ir atrofuojasi. Po užsikrėtimo praėjus 8-12 dienoms, susidaro dalinis imunitetas pakartotinei infekcijai (18).
2.1.6. Chabertiozė
Avys užsikrečia Chabertia ovina, kitaip dar vadinama plačiaburne žarnų kirmele. Parazituoja storosiose žarnose, dažniausiai randama gaubtinėje žarnoje. Chabertia kirmėlės yra didžiausios iš visų, randamų atrajotojų gaubtinėje žarnoje. Suaugėliai yra baltos spalvos, stambios, jų dydis varijuoja nuo 1,3 iki 2,0 cm ilgio. Turi labia didelę žiočių kapsulę, dėl to priekinis galas yra bukas ir trumpas. Žiočių kapsulės pakraščiuose yra dvi eilės mažų spenelių. Dantų neturi. Patinėliams yra gerai išsivysčiusi galvinė pūslė, o jos spikulės yra 1,3-1,7 mm ilgio. Patelėms vulvos atsivėrimas yra 0,4 mm aukščiau nuo kūno galo krašto. Kiaušinėliai yra lygūs, plono apvalkalėlio, vidutinio dydžio (90-100 x 45-55 µm), plačios taisyklingos elipsės formos su šiek tiek suplokštėjusiais galiniais poliais. Kiaušinėlio viduje yra 16-32 blastomeros. Invazinė lerva turi apvalią galvutę, 32 žarnyno ląsteles ir ilgą filamentinę uodegėlę. Lervos dydis yra maždaug 730 µm ilgio. Avims chabertiozė siejama su parazitų sukeltu gastroenteritu, tačiau tik nedaugelis avių užsikrečia pakankamai, jog pasireikštų ligos klinikinė išraiška. Yra nustatyta, jog 300 šių nematodų yra pakankamas kiekis sukelti patologinį ligos efektą ir ryškiausia žala yra padaroma vėlyvuoju latentiniu periodu. Pavojingiausios yra L₅ arba suaugėliai, nes jie prisitvirtina prie gaubtinės žarnos gleivinės sienelės ir maitinasi žarnų audiniu. Dėl to prasideda vietinis kraujavimas ir avių organizmas dėl pažeistos gleivinės praranda baltymus. Pažeistų žarnų siena pasidaro edemiška, išburkusi ir sustorėjusi, su vietinėmis hemoragijomis nematode prisitvirtinimo vietose (18).
2.1.7. Trichurozė
Avių trichurozę dažniausiai sukelia Trichuris ovis, tačiau taip pat gali sukelti ir Trichuris skrjabini ir Trichuris discolor. Serga avys, ožkos, galvijai ir kiti atrajotojai. Suaugusios kirmėlės yra ilgos, baltos spalvos, turi plačią ir storą užpakalinę kūno dalį. Priekinis kūno galas yra staigiai suplonėjantis į filamentinę ataugą. Dėl to šios kirmėlės kitaip dar vadinamos plaukagalviais. Patinėlio uodegos galas susisukęs ir užsibaigia viena spikule. Patelių uodegėlė yra tik išlenkta.
14 Patinėliai yra 5-8 cm ilgio, o patelės 3,5-7,0 cm ilgio. Plonuoju priekiniu kūno galu lervos įsiskverbia į gleivinę. Kiaušinėliai yra labia išsiskiriantys savo išvaizda. Jiems būdinga citrinos forma su išorę gaubiančiu storu, lygiu apvalkalu. Kiaušinėlio abiejuose poliuose yra lengvai pastebimi sustorėjimai – kamšteliai (operculum). Išmatose šie kiaušinėliai yra nuo geltonos iki rudos spalvos, 70-80 x 30-42 µm dydžio. Dauguma užsikrėtusių avių klinikinių simptomų neturi. Tačiau esant dideliam užsikrėtimui klinikiniai požymiai pasireiškia hemoraginiu kolitu, difteriniu aklosios žarnos gleivinės uždegimu (18).
2.1.8. Ezofagostomozė
Oesophagostomum spp. parazituoja avių, ožkų, kupranugarių ir laukinių atrajotojų storosiose žarnose. Avys dažniausiai užsikrėčia Oesophagostomum columbianum, Oesophagostomum venulosum, rečiau – O. multifoliatum ir O. asperum. Paplitę visame pasaulyje. Suaugusios kirmėlės yra plonos, patinėliai 12-17 mm ilgio, o patelės 15-22 mm ilgio. Patinėliai turi gerai išsivysčiusią bursą. Kiaušinėliai yra vidutinio dydžio (70-89 x 36-45 µm), bespalviai, plono, lygaus apvalkalo, taisyklingos plačios elipsės formos. O. Columbianum kiaušinėlio viduje yra 8-16, o O. venulosum turi 16-32 blastomeras. L₃ lervos turi ilgą filamentinę uodegėlę, kūgio formos galvutę ir 32 žarnyno ląsteles. Lervos kūno ilgis apie 790 µm. Patekusios į žarnyną, O. columbianum L₃ lervos migruoja giliai įsiskverpdamos į žarnų gleivinę. Prasideda uždegiminis procesas, nes susiformuoja plika akimi matomi mazgeliai. Mazgeliai gali siekti 2.0 cm, jų viduje yra žalsvos spalvos eozinofilinių pūlių ir L₄ stadijos lervų. Kai L₄ lervos subręsta ir išeina iš mazgelio, atsiveria gleivinės opos. Avys pradeda viduriuoti praėjus maždaug savaitei po pirmojo užsikrėtimo ir gali tęstis iki metų po reinfekcijos. Gausaus užsikrėtimo metu avims prasideda opinis kolitas ir liga pereina į lėtinę formą. To pasekoje aviena ir vilna būna prastos kokybės, o pažeistas avių žarnas negalima realizuoti chirurginių siūlų gamybai ar kitai paskirčiai (18).
2.1.9. Strongiloidozė
Strongiloidozę sukelia visame pasaulyje paplitusios plonos, siūlo pavidalo Strongyloides papillosus kirmėlės, kurių dydis paprastai yra mažesnis nei 1,0 cm. Serga avys, ožkos, galvijai ir kiti atrajotojai, kiaulės ir triušiai. Strongyloides papillosus parazituoja šių gyvūnų plonosiose žarnose. Tik patelės yra parazitinės reikšmės. Ilga stemplė sudaro daugiau nei vieną trečiąją kūno
15 ilgio, o gimda susisukusi su žarna – primena susisukusį siūlą. Skirtingai nei kitos panašaus dydžio kirmėlės, S. papillosus uodegėlė užsibaigia buku galu. Kiaušinėliai yra ovalios formos, turi ploną, lygų apvalkalą. Šie kiaušinėliai yra bespalviai, labai maži (43-60 x 20-25 µm), o jų viduje susiformavusi L1 stadijos lerva. Invazinė lerva yra apie 600 µm dydžio. Invazinės lervos iš aplinkos
gali į organizmą prasiskverbti pro nepažeistą odą. Tai sukelia odos eriteminę reakciją.Suaugę parazitai randami dvylikapirštėje ir proksimalinėje tuščiosios žarnos dalyje. Šie nematodai sukelia žarnų epitelio eroziją, uždegimą ir edemą. To pasekoje prasideda katarinis plonųjų žarnų uždegimas dėl ko sutrinka žarnų virškinimo ir absorbcijos funkcija. Dažniausiai klinikiniai požymiai pasireiškia jauniems gyvūnams. Jie pradeda viduriuoti, dehidratuoja, būna silpni, prasto apetito ir sumažėjusio priesvorio (18).
2.2. Antihelmintiniai vaistai ir jų naudojimas veterinarijoje
Parazitų kontrolei visame pasaulyje yra naudojami antihelmintiniai vaistai. Jie naudojami tiek gydomuoju, tiek profilaktiniu tikslu. Gydymas naudojimas pasireiškus klinikiniams požymiams, o profilaktinis – atsižvelgiant į epidemiologinius parazitų duomenis. Dažniausiai naudojami vaistai nuo parazitų yra benzimidazolų, makrociklinių laktonų ir imidazotiazolų/tetrahidropirimidinų grupės vaistai. Kiekviena šių grupių turi savo plataus ar siauro spektro vaistinius preparatus. Benzimidazolų grupei priskiriami šie preparatai: tiabendazolas, parbendazolas, oksibendazolas, fenbendazolas, oksfenbendazolas, albendazolas ir probendazolai. Makrocikliniams laktonams priskiriamas ivermektinas, albamektinas, doramektinas, moksidektinas ir selamektinas. Imidazotiazolių grupė sudaryta iš levamizolio, tetramizolio, pirantelio ir morantelio. Tikslingas ir apgalvotas šių preparatų naudojimas padeda palaikyti sveiką gyvūnų bandą (18).
2.3. Ivermektinas ir jo veikimo mechanizmas
Ivermetinas yra vaistinis preparatas, priklausantis makrociklinių laktonų grupei. Ivermektinas buvo išskirtas iš grybelio Streptomyces avermitilis fermentacijos produktų. Chemiškai tai yra medžiaga, sudaryta iš 80 proc. dihidroksiavermektino B1a ir iš 20 proc. dihidroksiavermektino B1b.
Ivermektinas yra priklausantis pusiau sintetiniams avermektinams. Ivermektinas iš organizmo pašalinamas su išmatomis. Yra nustatyta, jog 45 proc. ivermetino pašalinama nepakitusios cheminės
16 sudėties, o likę 55 proc. pašalinami su išmatomis įvairių metabolitų pavidalu, įvairių monosacharidų, aglikonų, hidroksiivermektino darinių pavidalu (21).
Ivermektinas parazitus veikia neurotoksiškai stiprindamas gliutamato kontroliuojamų chloro kanalų aktyvumą. Padidėja jų praeinamumas chloro jonams, o tai sukelia parazitų nervinių ląstelių hiperpoliarizaciją ir žūtį. Ivermektinas taip pat aktyvina kitų jono kanalų pralaidumą, tokius kaip GABR (gama-aminosviesto rūgšties). Žinduoliai, skirtingai nei bestuburiai, neturi gliutamato kontroliuojamų jono kanalų, dėl to ivermektinas jų toksiškai neveikia. Nepaisant to, ivermektinas paprastai nepraeina kraujo-smegenų barjero, todėl GABR kontroliuojami kanalai yra nepaliečiami (22).
Ivermektinas gerai veikia nematodus ir lervas: Ascaris spp., Trichuris spp., Parascaris spp., Toxocara spp., Toxascaris spp., Ancylostoma spp., Uncinaria spp., Hyostrongylus spp., Nematodirus spp., Haemonchus spp., Ostertagia spp., Cooperia spp., Capillaria spp., Filaroides spp., Oesophagostomum spp., Bunostomum spp., Strongyloides spp., Metastrongylus spp., Stephanurus spp., Dirofilaria spp., Habronema spp., Onchocerca spp., Oxyuris spp., Parascaris spp., Cyanthostomum spp., Strongylus spp., Dictyocaulus spp., Triodontophorus spp., Trichostrongylus spp., Draschia spp. Taip pat veikia ir ektoparazitus: Psoroptes spp., Sarcoptes spp., Otodectes spp., Haematopinus spp., Demodex spp., Gastrophilus spp., Hypoderma spp., Linognathus spp., Damalina spp., Solenopotes spp., Hematobia spp. (21).
2.4. Benzimidazolai ir jų veikimo mechanizmas
Tiabendazolas yra vaistinis preparatas, priklausantis benzimidazolų grupei. Tai buvo pirmasis benzimidazolų grupės vaistas, susintetintas 1950 metais. Chemiškai visos šios grupės veikliosios medžiagos turi benzolo žiedą. Tiabendazolas, skirtingai nei kiti benzimidazolų grupės vaistai, yra tirpus, todėl patekęs į virškinimo traktą yra greitai rezorbuojamas. Po 2-7 valandų po sušėrimo, gyvūno kraujo plazmoje randama didžiausia vaistų koncentracija. Tiabendazolas organizme sparčiai suskaldomas į metabolitus ir pašalinami su išmatomis per 24-48 valandas (21).
Tiabendazolo, kaip ir kitų benzimidazolų grupės vaistų, veikimo mechanizmas yra nukreiptas į mikrotubulių degeneraciją (22). Mikrotubulės yra vamzdelio formos polimerai, sudaryti iš baltymų dimerų (α ir β tubulinų) ir įeinančių į helmintų ląstelių sandarą (skeletoną) (21). Mikrotubulės yra esminė struktūra, palaikanti helmintų ląstelių homeostazę ir jų praradimas sustabdo daugelį įvairių gyvybiškai svarbių mechanizmų helmintų organizme (9). Nepaisant to, tiabendazolas negrįžtamai blokuoja gliukozės įsisavinimą helmintų ląstelėse. Dėl to parazitai išeikvoja savo energijos atsargas ir žūva. Tačiau tai neveikia žinduolių gliukozės metabolizmo (22).
17 Tiabendazolas turi platų veikimo spektrą, yra mažai toksiški ir gyvūnų organizmas juos gerai toleruoja. Visi benzimidazolams priskiriami vaistiniai preparatai gerai veikia helmintų lervas (žarnyno, audinių bei migruojančias) (21). Yra nustatyta, jog benzimidazolų grupės vaistai veikia visų formų nematodus ir pasižymi kiaušinėlius, lervas ir suaugėlius naikinančiomis savybėmis (9). Benzimodazolai naudojami avių virškinamojo trako nematodozėms gydyti (Trichostrongylus spp., Haemonchus spp., Ostertagia spp., Cooperia spp., Nematodirus spp., Bunostomum spp., Strongyloides spp., Chabertia spp., Oesophagostomum spp.) (22). Yra nustatyta, jog greičiausiai benzimidazolų grupės vaistams atsparūs tampa avių trichostrongilai (21).
2.5. Levamizolio hidrochloridas ir jo veikimo mechanizmas
Levamizolio hidrochloridas yra vaistinis preparatas, priskiriamas imidazotiazolių grupei (22). Šie preparatai savo cheminėje sudėtyje turi imidazolio žiedą (21). Imidazotiazoliai parazitus veikia neuro-muskulo-toksiškai (22). Levamizolis veikia sutrikdydamas nematodų bioenergetiką. Helmintų audiniuose sumažėja glikogeno fosforilazės aktyvumas, dėl to parazitų raumenys staigiai sutraukiami ir paralyžuojami. Patys helmintai pašalinami su išmatomis (21). Nepaisant to, levamizolis stimuliuoja gyvūnų imuninę sistemą. Patekęs į organizmą jis aktyvina bei stimuliuoja T limfocitų, makrofagų gamybą ir proliferaciją, skatina chemotaksį ir fagocitozę. Taip pat aktyvuoja monocitus ir padidina neutrofilų judrumą. Tačiau reiktų paminėti, jog levamizolio veikimas nėra citotoksiškas gyvūno neutrofilams ar kitų imuninių ląstelių atžvilgiu (22). Levamizolis greitai rezorbuojasi patekęs į organizmą įvairiais būdais: per virškinamąjį traktą ar injekcijos metu patekęs per odą. Didžiausia levamizolio koncentracija avių kraujo plazmoje pasiekiama po 17 minučių. Terapinė dozė išlieka iki 6-9 valandų. Kepenyse vyksta levamizolio skaidymas į glukuronidiną ir parahidrooksilevamizolio darinius. Šie metabolitai pašalinami su šlapimu ir išmatomis (21).
Levamizolio hidrochloridas naudojamos įvairioms avių ir ožkų nematodozėms gydyti: skrandžio (Haemonchus, Trichostrongylus ir Ostertagia spp.), žarnų (Trichostrongylus, Cooperia, Nematodirus, Bunostomum, Oesophagostomum ir Chabertia spp.), plaučių (Dictyocaulus spp.) (22).
2.6. Antihelmintinis atsparumo atsiradimo mechanizmas
Augant avių produkcijos ekonominei svarbai, tolygiai visame pasaulyje didėja ir atsparumo antihelmintinėms medžiagoms problema (23). Antihelmintinis rezistentiškumas – tai problema, kurios metu nustatyta normali vaistinio preparato dozė tampa nebeveiksminga ir neatlieka
18 reikiamos paskirties (9). Visame pasaulyje yra pastebimas atsparumas plataus veikimo spektro antihelmintikams, ypač makrocikliniams laktonams (ypač ivermektinui, moksidektinui ir kt.) (24).
Gydymas benzimidazolų grupės vaistais yra tapęs labai populiariu prevenciniu ir gydymo metodu visame pasaulyje, dėl savo plataus veikimo spektro, nedidelės kainos ir nesudėtingo vaisto panaudojimo. Todėl dėl plataus šio vaisto naudojimo yra iškilusi problema, jog parazitai tampa atsparūs šiems vaistiniams preparatams ir jie jų nebeveikia. Atsparumo vystymosi mechanizmas benzimidazolams yra gerai nustatytas. Atsparumas išsivysto dėl β-tubulino struktūros pasikeitimų tam tikrose kodono vietose, kai atskiri nukleotidai įgyja įvairias atmainas. Turėdami tokias genetines mutacijas helmintai dauginasi ir pradeda toleruoti benzimidazolų normalią nustatytą dozę. Pagrindinės nematodų rūšys, kurioms nustatytas atsparumas benzimidazolams yra Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta ir Trichostrongylus colubriformis (9).
Atsparumo mechanizmas ivermektinui buvo nustatytas tiriant plačiai paplitusius H. contortus nematodus. Tyrimai parodė, jog atsparių ivermektinui nematodų membranoje padidėja P-glikoproteinų kiekis mitochondrinėje RNR. Taip pat kitas pakitimas, atsirandantis ivermektinui atspariems nematodams yra pakitimai glutamato kontroliuojamuose chloro kanaluose. Šie kanalai tampa mažiau jautrūs ivermektino keliamam poveikiui ir nematodai išgyvena. Tai perduodama genetiškai iš kartos į kartą (25; 26).
Levamizolas, kaip ir kiti cholinerginių receotorių agonistai (pirantelis, oksantelis) veikia aktyvuodamas acetilcholino receptorius (AChRs), esančius nematodų kūno sienelėje. Nustatyta, jog levamizolui atsparių nematodų sienelėje šie acetilcholino receptoriai tampa nebejautrūs, nes pasikeičia penkių genų mutacijos: UNC-63, UNC-38, LEV-8,UNC-29 ir LEV-1 (27).
2.7. Epidemiologiniai antihelmintinio atsparumo duomenys Europoje ir kituose
žemynuose
Daugelyje Europos šalių buvo nustatytas nematodų atsparumas benzimidazolams ir levamizolui. Taip pat sparčiai daugėja atsparumo atvejų makrocikliniams laktonams (ypač ivermektinui) (11). Nyderlanduose buvo nustatytas atsparumas doramektinui (tik 15proc. veiksmingumas) ir moksidektinui (44 proc. veiksmingumas). Šioje šalyje taip pat buvo rastos Cooperia curticei padermės, atsparios benzimidazolams ir ivermektinui. Didžiosios Britanijos 97 proc. tirtuose ūkiuose, nustatytas atsparumas benzimidazolams, levamizolui bei ivermektinui (vyrauja Teladorsagia circumcincta). Slovakijos respublikoje atliktų tyrimų duomenimis, 4 proc. tirtuose ūkiuose nustatytas atsparumas albendazolui ir 23 proc. ūkių – atsparumas ivermektinui. Italijoje visiems tirtiems ūkiams nustatytas atsparumas levamizolui, o ⅔ ūkių buvo atsparūs ir
19 ivermektinui. Dominuojančios nematodų padermės buvo Teladorsagia spp. ir Trichostrongylus spp. Ispanijoje Teladorsagia spp. ir Trichostrongylus spp. buvo atsparūs benzimidazolams, o ivermektinui – tik Teladorsagia spp. Švedijoje nustatytas H. contortus antihelmintinis atsparumas benzimidazolams ir ivermektinui (28).
Kinijoje benzimidazolai labai dažnai naudojimi smulkiųjų atrajotojų gydymui. Dėl to H. contortus nematodų atsparumas šiai vaistų grupei randamas visoje šalyje (29). Tuo tarpu Brazilijoje buvo užfiksuotas multirezistentiškumas makrocikliniams laktonams H.contortus ir T. colubriformis (30).
2.8. Avių virškinamojo trakto nematodų ir jų atsparumo antihelmintinėms
medžiagoms diagnostika
Antemortem1 diagnostika, nustatyti avių užsikrėtimą virškinamojo trakto nematodais, daroma tiriant jų išmatas ir identifikuojant jose rastus nematodų kiaušinėlius. Galima atlikti tiesioginį išmatų tepinėlį, tačiau šiuo būdu negalima tiksliai nustatyti atskirų avių ar bandos užsikrėtimo gausumo. Kiekybiškai apskaičiuoti išmatose rastų kiaušinėlių skaičių (FEC) galima atlikti modifikuotu MakMaster metodu. MakMaster‘io metodas parodo nematodų kiaušinėlių skaičių viename grame išmatų (24). Tačiau rastų nematodų kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų ribotai koreliuoja su užsikrėtimo žala, daroma produkcijai. Tai yra pagrindinis šio metodo trūkumas (31; 11; 15). Be to, šiuo metodu visi rasti Trichostrongylus spp. kiaušinėliai atrodo panašiai ir negali būti identifikuoti iki rūšies. O žinojimas kuri nematodų rūšis vyrauja tiriamų avių išmatose gali padėti nuspręsti gydymo ir prevencijos strategiją. Todėl yra tiriamos išmatų kultūros ir izoliuotos lervos mikroskopuojamos. Tais atvejais, kai vyrauja anemiją sukeliantys nematodai (visų pirmiausia H. contortus), skaičiuojamas suspaustų ląstelių tūris (PCV) bei įvertinamas FAMACHA aneminis balas (24).
Siekiant nustatyti užsikrėtusių avių nematodų atsparumą vaistams nuo parazitų yra taikomi in vivo ir in vitro tyrimų metodai. Antihelmintinių vaistų efektyvumas in vivo gali būti nustatomas kiaušinėlių sumažėjimo testu (KST). Šis metodas remiasi vaistų efektyvumo įvertinimu prieš gydymą ir po jo (32). Testas turėtų būti pakartoninai atliekamas kas 2-3 metus ar pagal poreikį įtarus atsparumą antihelmintinėms medžiagoms (24). KST yra jautriausias metodas įvertinti antihelmintinių preparatų efektyvumą gydant avių bandas, tačiau turi keletą trūkumų. Kiaušinėlių sumažėjimo testas atliekamas tiriant avis prieš gydymą bei pakartotinai po gydymo praėjus tam tikram laiko tarpui, kas užima labai daug laiko ir darbo sąnaudų. Nepaisant to, šis metodas yra
20 brangus, nes į jį įtraukiami gyvi gyvūnai, todėl praktikoje pritaikomas vis rečiau. Pagrindiniams in vitro tyrimams priskiriami šie metodai: lervų išsiritimo testas (LRT), lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) bei molekuliniai tyrimo metodai (32). In vitro lervų išsiritimo testas (LRT) atliekamas nustatyti atsparumą benzimidazolams (9; 33). Dažniausiai nustatomas atsparumas tiabendazolui, nes šis yra tirpiausias šios grupės vaistas, dėl to tinkamiausias in vitro tyrimui. Teigiamos metodo savybės remiasi jo pigumu, atlikimo paprastumu bei rezultatai gaunami sąlyginai greitai. Tačiau LRT išmatų mėginiai turi būti tiriami per 3 valandas nuo mėginio paėmimo arba paruošti anaerobinėmis sąlygomis ir transportuojami bei laikomi tam tikroje temperatūroje. Mėginio tikslas yra inkubuoti nematodų kiaušinėlius tam tikrose tiabendazolo koncentracijose. Tačiau netinkamai paruošti išmatų mėginiai, kai nematodų kiaušinėliuose vystymasis tęsiasi, sukelia riziką gauti klaidingai teigiamus atsparumo rezultatus. Kiti šio metodo trūkumai yra ribotas tiriamų vaistų spektras, nes LRT galima tirti atsparumą tik benzimidazolams (tiabendazolui) ir levamizolui (32), o šio testo rezultatai yra patikimi tik tais atvejais, kai daugiau nei 25 proc. lervų yra atsparios (33). Galiausiai, rastas lervas negalima identifikuoti iki genties ar rūšies (32). Kitas in vitro tyrimo metodas yra lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA), naudojamas nustatyti lervų atsparumą ivermektinui, tiabendazolui ir levamizoliui (31; 33). Jis yra jautrus diferencijuoti sąlyginai atsparias ir atsparias grupes. Taip pat pakankamai pigus ir nesudėtingai atliekamas, o rezultatų gavimas yra greitesnis nei FECRT tyrimo metodu. LVTMA galima nustatyti atsparias lervas diferencijuojant jas iki genties ar rūšies. Visi šie privalumai paaiškina, kodėl LVTMA yra dažniausiai pritaikomas praktikoje. Molekuliniai in vitro tyrimo metodai atliekami labai retai, dažniausiai tik mokslinių tyrimų tikslu, nes jiems reikia specialios brangios įrangos, įgudusių ir kvalifikuotų specialistų. Nors gauti rezultatai būna tikslūs ir patikimi, tačiau tai yra labai brangu. Nepaisant to, molekuliniai in vitro tyrimo metodai taikomi tik benzimidazolų grupės vaistų atsparumui nustatyti. Kitų vaistinių grupių atsparumo tyrimas šiuo in vitro metodu kol kas yra tik tiriamas ir analizuojamas (32).
21
3. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
„Avių užsikrėtimas virškinamojo trakto nematodais ir nematodų atsparumas antihelmintinėms medžiagoms“ tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedros Parazitologijos laboratorijoje. 2017 metų gegužės – lapkričio mėnesiais buvo ištirta 13 avių ūkių, esančių Molėtų, Kauno, Vilniaus, Telšių rajonuose. Tyrimas buvo atliktas pasirenkant tik tuos avių ūkius, kuriuose gydymas antihelmintinėmis medžiagomis buvo atliktas ne vėliau nei prieš 10 savaičių, kadangi reikalingas pakankamas užsikrėtimo gausumas. Išmatų mėginiai imti iš vyresnių nei 6 mėn. avių. Tirtos tiek vietinių, tiek įvežtinių veislių avys. Mėginiai imti atsitiktine tvarka iš ne mažiau nei 10 proc. avių, sudarančių vieną ūkį, tačiau ne mažiau nei 10 avių vienetų. Atskiri avių ūkiai buvo sudaryti iš 15-200 avių.
Tirtų ūkių apibendrinimas pateikiamas 1 lentelėje:
Avių ūkiai Veislė Avių skaičius Ganymo pobūdis, plotas Gydymų sk. per metus Naudoti antihelmintikai per pastaruosius 5 metus
1. Mišrūnės 80 Rotuoja, 7 ha 2 Ivermektinas
2. Mišrūnės 20 Nerotuoja, 10 a 0 Nėra
3. Mišrūnės 200 Rotuoja, 3 ha 2 Ivermektinas
4. Šarolė 40 Laisvas 1 Albendazolas,
ivermektinas
5. Mišrūnės 25 Nerotuoja, 5 a 0 Nėra
6. Mišrūnės 63 Rotuoja, 20 ha 0 Nėra
7. Mišrūnės 81 Rotuoja, 13 ha 2 Albendazolas,
ivermektinas
8. Mišrūnės 54 Laisvas 0 Nėra
9. Romanovo 30 Rotuoja mažai, 2 ha 1 Ivermektinas
10. Lietuvos juodgalvės 20 Rotuoja, 10 ha 1 Ivermektinas
11. Lietuvos juodgalvės 15 Rotuoja, 1,5 ha 1 Levamizolis
12. Lietuvos juodgalvės 50 Rotuoja mažai, 5 ha 1 Albendazolas
13. Lietuvos juodgalvės 100 Rotuoja, 12 ha 1 Ivermektinas
Lentelė 1 Informacija apie tyrime dalyvavusius ūkius.
11-oje ūkių buvo atliktas lervų išsiritimo testas (LRT) nustatyti atsparumą benzimidazolams (tiabendazolui). Visiems 13 ūkių buvo atliktas lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA) nustatyti atsparumą makrocikliniams laktonams (ivermektinui) bei imidazotiazolams (levamizolui). Visi tyrimai buvo atlikti vadovaujantis Lietuvos gyvūnų gerovės reikalavimais (Nr. B1-866, 2012; Nr. XI-2271,2012).
22
3.1. Mėginio paėmimas
Išmatų mėginiai imti atsitiktine tvarka pasirenkant atskirus gyvūnus. Mėginiai imti iš ne mažiau nei 10 proc. avių, auginamų ūkyje, tačiau ne mažiau nei iš 10 avių vienetų. Išmatos imtos iš tiesiosios žarnos. Iš kiekvieno gyvūno buvo paimta maždaug 5g išmatų ir sudėti į atskirus polietileninius maišelius. Kadangi šviežių išmatų mėginiai nebūdavo tiriami iškart po paėmimo, reikėjo juos paruošti anaerobinėmis sąlygomis. Tuo tikslu iš kiekvieno maišelio imtas nedidelis išmatų kiekis ir dedamas į bendrą atskirą indelį kievienam ūkiui. Kiekvienam ūkiui būdavo ruošiami po 2-3 tokius indelius. Kiekvieno indelio ⅓ užpildėme išmatomis ir praskiedėme vandentiekio vandeniu, kuris indelį užpildytų iki ⅔. Užsukus indelį mėginys gerai sumaišytas plakamuoju judesiu. Paskutinis etapas buvo pripildyti indelį vandeniu iki pat viršaus sklidinai ir sandariai užsukti (Pav. 1.).
Pav.1 Išmatų mėginys paruoštas anaerobinėmis sąlygomis
3.2. Modifikuotas MakMaster metodas
Kad nustatyti užsikrėtimo gausumą buvo atliktas modifikuotas MakMaster‘io metodas. Svarstyklėmis pasveriama 4g išmatų 0,1 g tikslumu. Tuomet ant išmatų buvo užpilama 56,0 ml vandens (1,0 g išmatų reikia 14,0 ml vandens). Išmatos gerai išmaišomos ir perkošiamos per marlę į kitą indelį. Tai atliekama norint iš mėginio pašalinti labai stambias priemaišas. Filtratas buvo išmaišomas dar kartą ir 10,0 ml įpilta į centrifūginį mėgintuvėlį. Centrifūguota 7 min. 1200 apsisukimų per minutę greičiu. Baigus centrifūguoti pipete reikėjo nusiurbti virš nuosėdų susidariusį skystį, paliekant tik nuosėdas. Tuomet į mėgintuvėlį/-ius su gautomis nuosėdomis
23 įpilama flotacinio tirpalo (cinko chlorido – 1,4 tankis) iki 4,0 ml padalos. Gerai išmaišyti mėginiai imami pipete ir užpildomos abi Makmasterio kameros (34). Skaičiuojamas kiekvienas identifikuotas kiaušinėlis. Kiaušinėlių skaičius, gautas peržiūrėjus abi Makmasterio kameros puses, daugintas iš 20, kad gautas rezultatas būtų „kiaušinėlių skaičius 1 grame išmatų, KSG“ (18). Pabaigus skaičiuoti kameros kruopščiai išplautos tekančiu vandeniu, o jų vidus išsausinamas filtriniu popierėliu.
3.3. Išmatų plovimas ir kiaušinėlių surinkimas
Naudojome anaerobinėmis sąlygomis paruoštus mėginius. Plovimui atlikti buvo naudoti trys skirtingo akučių dydžio sietai, sudėti vienas ant kito: apačioje buvo laikytas 25 µm dydžio akučių sietas, vidurinysis – 100 µm akučių dydžio sietas, o viršutinysis buvo stambiausiomis akutėmis, kurių dydis buvo 250 µm. Į viršutinį (stambiausią) sietą buvo supilti visi anaerobinėmis sąlygomis paruošti vieno ūkio indeliai ir plauti paprasto vandens srove keletą kartų. Galiausiai iš 25 µm sieto nuosėdos buvo supilamos į stiklinę. Stiklinė dėta į šaldytuvą (15-20 min.) ir palikta nusistovėti. Nuosėdoms nusistovėjus, viršutinis skystis nupilamas, paliekant tik nuosėdas. Tuomet nuosėdos buvo tolygiai perpilamos į centrifūginius mėgintuvėlius. Centrifūguojama 2 min. 1500 apsisukimų per minutę greičiu. Po centrifūgavimo nupiltas virš nuosėdų susidaręs skystis, paliktos tik nuosėdos. Ant nuosėdų pilamas sotusis cukraus flotacinis tirpalas, sumaišoma. Cukraus flotacinis tirpalas turėtų būti pilamas iki pat viršaus, kad mėgintuvėlio viršuje susidarytų meniskas. Uždedami specialūs mėgintuvėlių kamštukai ir centrifūguojama 2 min. 1500 aps./min. greičiu. Po centrifūgavimo kamštukai nuimti ir nuo jų į stiklines nuplaunamas dionizuotu vandeniu turinys kartu su nuosėdomis. Nuplovimui buvo naudojamas didelis 20 ml talpos švirkštas ir 0,6 x 25 mm dydžio adata. Gautose nuosėdose buvo visi iš išmatų išskirti kiaušinėliai. Tokios nuosėdos vėl turėjo būti išplautos per 20 µm dydžio sietą, kad būtų nuplautos visos cukraus flotacinio tirpalo liekanos. Nuplautos nuosėdos maišomos su dionizuotu vandeniu, kad suminis tirpalo kiekis būtų apie 10ml. Paimama 10 µl kiaušinėlių suspensijos (3 mėginiai) ir apskaičiuojamas kiaušinėlių skaičius 1 ml.
24
3.4. Lervų išsiritimo testas (LRT)
Lervų išsiritimo testas (LRT) yra tinkamas nustatyti antihelmintinį atsparumą benzimidazolų grupės vaistams. Buvo naudojamos lėkštelės, turinčios 24 akutes (4 į apačią ir 6 į šoną) (Pav. 2).
Pav. 2 Lėkštelės, paruoštos lervų išsiritimo testui
Akutės sužymėtos į apačią nuo A iki D, o į šoną nuo 1 iki 6. Šiam tyrimui buvo naudotas tiabendazolo tirpalas, paruoštas iš anksto skirtingomis koncentracijomis: 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0 µg/ml. Kontrolinei grupei (A1-D1) naudojamas dimetilsulfoksido tirpalas. Kontrolinei grupei į akutes pipete buvo pilta 10 µl dimetilsulfoksido tirpalo. A2-D2 akutėse buvo 0,05 µg ml-1 tiabendazolo tirpalas, A3-D3 akutėse – 0,1µg/ml tiabendazolo tirpalas, A4-D4 – 0,3 µgml-1 tiabendazolo tirpalas, A5-D5 – 0,5 µg/ml tiabendazolo tirpalas, A6-D6 – 1,0 µg ml-1 tiabendazolo tirpalas. Paruošus akutes su tirpalais tolimesnis žingsnis buvo įdėti į kiekvieną akutę po apytiksliai 300vnt. kiaušinėlių kartu su 2ml dionizuoto vandens. Paruoštos lėkštelės uždengiamos, kraštai apklijuojami parafino juostele ir įdedama į polietileninius maišelius. Tokios lėkštelės įdėtos į 27° C termostatą ir laikomos 48 val. Po 48 val. į kiekvieną akutę buvo įpilta po 10-25 µl Lugolio tirpalo,
25 jog lervos būtų fiksuojamos. Tada vertinami ir skaičiuojami rezultatai. Sterilia pipete kiekvienos akutės turinys išsiurbiamas ir perkeliamas ant atskirų specialių lėkštelių mikroskopavimui. Mikroskopuojama pasirinkta kryptimi, geriausia judant zigzagais. Skaičiuojamos lervos ir kiaušinėliai kartu, kad sumoje būtų gauta 100, tokia tvarka, kokia rasta (pvz. suskaičiuoti 54 kiaušinėliai ir 46 lervos).
3.5. Lervų vystymosi testas mikro agare (LVTMA)
Šis testas atliekamas norint nustatyti antihelmintinį jautrumą ivermektinui bei levamizolui. Lervų vystymosi testas mikro agare atliekamas mikrotitro lėkštelėse su 96 akutėmis (12 į šoną ir 8 į apačią). Horizontalios linijos akutės sunumeruotos nuo 1 iki 12, o vertikaliosios linijos akutės pažymėtos raidėmis nuo A iki H (Pav. 3).
Vietoj ivermektino šiam tyrimui naudotas ivermektino aglikonas, nes yra nustatyta, kad pastaroji medžiaga in vitro tyrimams išlieka stabilesnė ir yra lengviau diferencijuoti tarp ribinių atsparumo koncentracijų (15; 35). Turimas ivermektino aglikonas buvo serijiniu būdu praskiestas su dimetilo-sulfoksidu (DMSO), santykiu 1:2, norint gauti 12 skirtingų koncentracijų (varijuojančių nuo 0,084 iki 173,6 µg ml-1). Toliau reikėjo iš paruoštų šių 12 skirtingų koncentracijų ivermektino aglikono tirpalo pipete paimti po 12 µl ir sumaišyti su 150 µl 2 proc. Bakto agaru. Agaras naudotas 45° C temperatūros. Kiekvienai eilei pilant agarą reikėjo pamaišyti, kad nepradėtų sluoksniuotis
26 stingimo metu. Supylus Bakto agarą lėkštelės dėtos 5 min į šaldytuvą. Tuomet, kai agaras sustingo, imta 10 µl kiaušinėlių, paruoštų su 0,3 mg/ml amfotericino B tirpalu (kad sustabdyti mieliagrybių dauginimasi) ir sumaišyta su 10 µl mielių estraktu. Kontrolinei grupei buvo naudotas tik 1,6 proc. DMSO tirpalas, be vaistų. Be to, A1-12 ir H1-12 akutėse įpilta po 200 µl dionizuoto vandens. Paruoštos lėkštelės kraštai apvynioti parafino juosta ir dėtos 7d. į 27° C termostatą. Po 7 dienų lervos buvo fiksuojamos, į kiekvieną akelę (išskyrus tas, kuriose tik vanduo) pipete įpilant po 50 µl Lugolio tirpalo.
Ivermektino aglikono koncentracija, kurioje rastos L3 stadijos lervos laikomos atspariomis,
buvo 21,6 ng ml-1. Lervos buvo identifikuojamos pagal jų išorines morfologines savybes (19) (Pav. 4).
Pav. 4 LVTMA tyrimo metu matoma L3 stadijos lerva.
3.6. Statistinė analizė
Duomenų aprašomoji ir statistinė analizė atlikta naudojantis Microsoft® Excel 2010 programa. Apskaičiuoti kiaušinėlių skaičiaus vidurkiai kiekviename ūkyje, vidurkių palaida. Pasikliautinis intervalas (PI) 95 proc. patikimumu, apskaičiuota naudojantis svetainėje
http://statpages.info/confint pateikta skaičiuokle. Grafinis duomenų vaizdavimas atliktas Microsoft® Excel 2010 programa. Statistiškai patikimais rezultais laikytini duomenys, kuomet p<0,05.
27
4. TYRIMO REZULTATAI
4.1. Nematodų paplitimas tiriamuosiuose ūkiuose
Tyrimo metu ištirta 121 išmatų mėginių iš 13 avių ūkių, kurie įvertinti dėl užsikrėtimo virškinamojo trakto parazitais, užsikrėtimo spektro ir gausumo.
Modifikuoto MakMaster metodu buvo skaičiuoti visi rasti parazitų kiaušinėliai bei oocistos, tačiau nematodų atsparumo tyrimui svarbūs tik strongiliatai. Kiekvieno ūkio duomenys skaičiuoti kiaušinėlių skaičiumi 1 grame išmatų (KSG). Užsikrėtimo gausumas vertintas trimis lygiais: jei suskaičiuota 20-500 KSG – tai užsikrėtimas vertinamas lengva forma. Jei 500-1000 KSG – užsikrėtimas vidutinio stiprumo. Galiausiai, jei rasta >1000 KSG – avių užsikrėtimas labai gausus (36).
Pav. 5 Strongiliatų kiaušinėlių pasiskirstymas atskiruose avių ūkiuose
Pateiktame grafike (Pav. 5) matomas kiekviename ūkyje rastas užsikrėtimo lygis. Gausus užsikrėtimas strongiliatais nustatytas dviems ūkiams: nr. 4 ir nr. 8. Tai sudaro 15,4 proc. (PI 95
98 34 70 2830 294 354 2 1176 218 102 72 98 90 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 S tr on gil iatų k iau šin ėli ų sk aičiau s vid u rk is gr am e išm at ų Avių ūkiai
28 proc., 1,9-45,5). Visi likę 11 ūkių turėjo lengvo laipsnio užsikrėtimą. Tai sudarė 84,6 proc. (PI 95proc., 54,6-98,1). Vidutinis kiaušinėlių pasiskirstymas ūkiuose buvo 418,3 KSG, ± 227,1.
Tyrimo metu aptikti ir kiti nematodai: Nematodirus spp., Strongiloides papillosus, Trichuris spp., kurių paplitimas ženkliai mažesnis, lyginant su strongiliatais. Dažniausiai ūkiuose iš kitų nematodų kiaušinėlių buvo išskirta Strongiloides papillosus - 9-iuose ūkiuose iš 13 tirtų (69,2 proc. PI 95 proc., 38,6-90,9). Mažiau, t.y. 7-iuose ūkiuose buvo randama Trichuris spp. kiaušinėlių (53,9 proc. PI 95 proc., 25,1-80,8). Nematodirus spp. rasta tik 6 ūkiuose iš 13. Tai sudarė 46,2 proc. PI 95 proc., 19,2-74,9. Vertinant avių užsikrėtimą įvairiais nematodais, dažniausiai užsikrėtę strongiliatais 73,1 proc (PI 95 proc., 64,3-81,4) (p<0,05). Mažesnę dalį sudarė Strongiloides papillosus (25,1 proc. PI 95 proc., 17,7-34,7), o rečiausiai nustatyti Nematodirus spp. (1,14 proc. PI 95 proc., 0,2-5,5) ir Trichuris spp. (0,66 proc. PI 95 proc., 0,03-3,62) nematodai.
29 Pav. 6 Identifikuotų L3stadijos lervų procentinis pasiskirstymas (LVTMA).
Tyrimo metu buvo identifikuotos L3 stadijos lervos iki genties/rūšies pagal savo
morfologinius požymius. Pateiktame grafike (Pav. 6) vaizduojamas lervų genties/rūšies pasiskirstymas visuose tiriamuosiuose ūkiuose. Daugiausia iš visų identifikuotų lervų sudarė Trichostrongylus spp. (38,5 proc., 95 proc. 29,4-48,3) ir Teladorsagia spp. (29,7 proc., PI 95 proc. 21,2-38,9) (p<0,05) lyginant Chabertia spp., Haemonchus contortus (14,6 proc., PI 95 proc. 8,7-22,4) ir Cooperia spp. ( 2,6 proc., PI 95 proc. 0,6-7,0). Visuose ūkiose identifikuotos mažiausiai dvi nematodų gentys. 38,5 proc. 29,7 proc. 14,6 proc. 14,6 proc. 2,6 proc. Trichostrongylus spp. Teladorsagia spp. Chabertia spp. Haemonchus contortus Cooperia spp.
30
4.2. Nematodų atsparumo nustatymas benzimidazolams
Buvo atliktas lervų išsiritimo testas benzimidazilams atsparumui nustatyti. Iš gautų tyrimo duomenų matoma, jog visuose ūkiuose (100 proc.), kuriuose buvo atliktas LRT, buvo gautas antihelmintinis rezistentiškumas.
Buvo nustatytas antihelmintinio rezistentiškumo intervalas pagal duomenis, gautus iš aptiktų lervų procentinio skaičiaus slenkstinėje 0,1 μg ml-1
tiabendazolo koncentracijoje: <10 proc. lervų reiškia labai žemą rezistentiškumą, 10-20 proc. – žemą rezistentiškumą, 20-40 proc. – vidutinį rezistentiškumą, o >40 proc. lervų – aukštą rezistentiškumą tiabendazolui. Rezultatai matomi pateiktame paveiksle (Pav. 7).
Pav. 7. Ribinėje 0,1 µg/ml tiabendazolo koncentracijoje nustatytas atsparumo intervalas (proc.), tirtuose avių ūkiuose
Iš tirtų 11 avių ūkių, dviejuose (18,2 proc. PI 95proc., 2,3-51,8) ūkiuose nustatytas labai žemas rezistentiškumo lygis (<10 proc.). Trims ūkiams (27,3 proc. PI 95 proc.,6,0-61,0) nustatytas žemas rezistentiškumas (10 – 20 proc.). Taip pat dviejuose avių ūkiuose (18,2 proc. PI 95 proc., 2,3-51,8) nustatytas vidutinis atsparumo intervalas (20 - 40 proc.), o net keturiuose avių ūkiuose (36,3 proc.PI 95 proc., 10,3-69,2) buvo nustatytas aukštas atsparumo intervalas (>40 proc.).
2 3 2 4 0 1 2 3 4 5 <10 10-20 20-40 >40 Av ių ū kių s ka ič iu s
31 Rezultatai rodo (Pav. 8), kad trijuose ūkiuose iš visų 11 tirtų (27,3 proc. PI 95 proc., 6,0-61,0) minimali inhibitorinė tiabendazolo koncentracija, kurioje jau buvo pastebėtas lervų išsiritimo slopinimas, buvo 0,1 µg/ml. Kituose trijuose ūkiuose (27,3 proc. PI 95 proc., 6,0-61,0) MIK buvo nustatytas 0,3 µg ml-1 tiabendazolo koncentracijoje. LRT parodė, jog aukštoje 0,5 µg ml-1 tiabendazolo koncentracijoje minimali inhibitorinė koncentracija buvo pastebėta kituose trijuose avių ūkiuose (27,3 proc. PI 95proc., 6,0-61,0). Aukščiausioje 1,0 µg/ml TBZ koncentracijoje MIK buvo pasiekę du ūkiai (18,2 proc.PI 95 proc., 2,3-51,8).
Taip pat buvo nustatytas „sąlyginis rezistentiškumas“. „Sąlyginis rezistentiškumas“ apibrėžiamas, kai randamas žemas bei lengvai kontroliuojamas atsparumas, ar tiesiog klaidingi rezultatai, dėl tam tikrų priežasčių ar rezultatą įtakojančių veiksnių. Į šią sąvoką įeina ribinė 0,1 µg/ml tiabendazolo koncentracija. Taigi iš 11 tirtų ūkių tik 3 avių fermoms (27,3 proc. PI 95 proc., 6,0-61,0) buvo nustatytas „sąlyginis rezistentiškumas“. 8 likę ūkiai nepriklauso šiai kategorijai, nes jų MIK buvo nustatyta >0,1 µg/ml.
3 3 3 2 0 1 1 2 2 3 3 4 0,1 0,3 0,5 1,0 A vi ų ū ki ų sk ai či u s Tiabendazolo koncentracija, µg/ml Pav. 8 Minimalios inhibitorinės tiabendazolo koncentracijos (MIK)
32
4.3. Nematodų atsparumas makrocikliniams laktonams
Atlikus lervų vystymosi testą mikro agare (LVTMA) iš 13 tirtų avių ūkių buvo nustatytas atsparumas ivermektinui 11 ūkių. Atsparumas buvo nustatytas iš L3 lervų skaičiaus,
gautoslenkstinėje 21,7 ng ml-1
ivermektino aglikono koncentracijoje (Pav.9).
Pav. 9 Antihelmintinio rezistentiškumo ivermektinui pasiskirstymas tirtuose avių ūkiuose
Taigi, rezistentiškumas ivermektinui nustatytas 11-ai tirtų avių ūkių. Tai sudaro 84,6 proc. (PI 95 proc.,54,6-98,1). Jautrūs ivermektinui buvo tik du tirti ūkiai (15,4 proc., PI 95 proc., 1,9-45,5).
15,4 proc. 84,6 proc.
Jautru Atsparu
33 Pav. 10 Atsparių ivermektinui lervų procentinis pasiskirstymas tiriant LVTMA
Lervų vystymosi testu mikro agare buvo skaičiuotos L3 stadijos lervos, kurios pagal savo
morfologinius požymius identifikuotos iki genties ar rūšies. Lervos identifikuotos buvo ivermektino aglikono 21,7 ng ml-1 koncentracijoje. Gauti rezultatai pateikti grafiškai (Pav. 10). Nustatyta, jog ivermektinui atsparumas labiausiai išsivystęs Trichostrongylus spp. nematodams (59,2 proc. PI 95 proc., 49,7-68,7). Mažesnę dalį (16,9 proc. P 95 proc., 10,2-24,7) ivermektinui jautrių lervų sudarė Teladorsagia spp. ir Haemonchus contortus (12,5 proc. PI 95 proc., 7,1-20,0). Mažiausiai ivermektinui atsparios buvo Chabertia spp. lervos (11,4 proc., PI 95 proc. 6,4-18,8).
59,2 16,9 11,4 12,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Trichostrongylus spp.
Teladorsagia spp. Chabertia spp. Haemonchus contortus
P
roc
en
tai
Atsparių L3 stadijos lervų gentis/rūšis
Ivermektinui atsparios
34 Pav. 11 Avių ūkių, kuriuose nustatytas antihelmintinis rezistentiškumas ivermektinui, pasiskirstymas pagal rezistentiškumo išsivystymo lygį
Remiantis L3 lervų išsivystymo procentiniu skaičiumi 21,7 ng/ml ivermetino aglikono
koncentracijoje buvo nustatytas rezistentiškumo intervalas (Pav.11). Jei L3 stadijos lervų
procentiškai buvo gauta <10 proc. – tai buvo traktuojama žemu rezistentiškumo intervalu. Pagal gautus duomenis žemo rezistentiškumo intervalo nebuvo gauta nei viename ūkyje. Jei toje pačioje koncentracijoje L3 stadijos lervų gauta 10-30 proc. – skaitoma vidutiniu rezistentiškumu. Tokių
ūkių buvo net 4 (36,4 proc., PI 95 proc., 10,9-69,2). Tyrimo metu nustatyta, jog daugiausia tirtuose ūkiuose buvo nustatytas aukštas rezistentiškumo lygis. Tai sudarė 7 ūkius (63,6 proc., PI 95 proc. 30,8-89,1) iš visų 11 ūkių, kuriuose nustatytas atsparumas ivermektinui.
0 1 2 3 4 5 6 7 <10 10-30 >30 0 4 7 Avi ų ū ki ų sk ai či u s
35 Pav. 12 Avių fermų, kuriose buvo aptiktas antihelmintinis reziztentiškumas ivermektinui pasiskirstymas pagal minimalią inhibicinę koncentraciją (MIK)
Taip pat kitas būdas įvertinti antihelmintinį rezistentiškumą yra pagal minimalią inhibicinę ivermektino koncentraciją (MIK) (Pav.12). Minimali inhibicinė koncentracija parodo minimalią vaistinės medžiagos koncentraciją, kurioje pastebimi pirmi lervų vystymąsi slopinantys požymiai. Kuo didesnė MIK, tuo didesnis atsparumas vaistams. Dažniausiai gauti rezultatai buvo 86,8 ng ml-1
. Tai sudarė net 6 tirtus ūkius (46,2 proc. PI 95 proc., 19,2-74,9) iš visų 13 tirtų. Didžiausia minimali inhibicinė ivermektino koncentracija (173,6 ng/ml) buvo nustatyta net 4 ūkiuose (30,8 proc.PI 95 proc., 9,1-61,4).1 ūkiui (7,7 proc. PI 95 proc., 0,19 - 36,3) MIC buvo 21,6ng/ml. Du ūkiai (15,4 proc.PI 95 proc., 1,9 - 45,5) buvo jautrūs ivermektinui, tad jų minimali inhibicinė koncentracija buvo gauta palyginti maža – 10,85 ng ml-1
. 2 1 6 4 0 1 2 3 4 5 6 7 10,85 21,6 86,8 173,6 A vi ų ū ki ų sk ai či u s
36
4.4. Nematodų atsparumas levamizolui
Pav. 13 Antihelmintinio rezistentiškumo levamizolui pasiskirstymas tirtuose avių ūkiuose, proc.
Atsparumas levamizolui buvo nagrinėjamas 2 µg ml-1
levamizolo koncentracijoje. Ši analizė atlikta naudojant lervų vystymosi testą mikro agare (LVTMA). Pagal gautus rezultatus matoma (Pav. 13), jog tik viename tirtame ūkyje (7,7 proc. PI 95 proc., 0,2-36,0) buvo rastas atsparumas levamizolui, o ribinėje koncentracijoje lervos sudarė 20 proc. Likę 12 tirtų ūkių (92,3 proc. PI 95 proc.,64,0-99,8) buvo jautrūs.
92,3 7,7
Jautru Atsparu
37 Pav. 14 Atsparių levamizolui lervų procentinis pasiskirstymas tiriant LVTMA
Lervų vystymosi testu mikro agare buvo skaičiuotos L3 stadijos lervos, kurios pagal savo
morfologinius požymius identifikuotos iki genties ar rūšies. Gauti rezultatai pateikti grafiniame paveiksle (Pav. 14). Lervos identifikuotos buvo 2µg ml-1 levamizolo koncentracijoje. Skirtingai nei ivermektino atsparumo rezultatuose, mažiausią dalį sudarė Trichostrongylus spp. lervos. Tai sudarė tik 20 proc. (PI 95 proc. 12,7-29,2). Likusią didžiąją levamizolui atsparių lervų dalį sudarė Chabertia spp. lervos (80 proc. PI 95 proc., 70,8-87,3).
20 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Trichostrongylus spp. Chabertia spp. P roc en tai
Atsparių L3 stadijos lervų gentis/rūšis
Levamizolui atsparios
