LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA GABRIELĖ GIEDRAITYTĖ SIAURALAPIŲ LUBINŲ (Lupinus angustifolius L.) AUGALŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

GABRIELĖ GIEDRAITYTĖ

SIAURALAPIŲ LUBINŲ (Lupinus angustifolius L.) AUGALŲ FENOLINIŲ

JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: doc.dr. Raimondas Benetis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

SIAURALAPIŲ LUBINŲ (Lupinus angustifolius L.) AUGALŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Darbą atliko

doc. dr. Raimondas Benetis Magistrantė

Gabrielė Giedraitytė

Recenzentas

dr. Guoda Kiliuvienė

TURINYS

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...13

4. LITERATŪROS APŽVALGA ...14

4.1. Siauralapis lubinas (Lupinus angustifolius L.) ...14

4.1.1. Lupinus genties augalai ...14

4.1.2. L. angustifolius morfologija ...15

4.1.3. L. angustifolius paplitimas ...15

4.1.4. L. angustifolius kaupiamos medžiagos ...16

4.1.5. L. angustifolius panaudojimas ...17 4.2. Fenoliniai junginiai ...18 4.2.1. Klasifikacija ...19 4.3. Oksidacinis stresas ...22 4.3.1. Antioksidantai ...23 4.3.2. Polifenoliniai antioksidantai ...23

4.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ...25

5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ...26

5.1. Tyrimo objektas ...26

5.2. Naudotos medžiagos ir reagentai ...27

5.3. Naudota aparatūra ...27

5.4. Tyrimų metodai ...28

5.4.1. L. angustifolius žaliavų ekstraktų paruošimas ...28

5.4.2. Reagentų paruošimas ...28

5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ...29

5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ...30

5.4.5. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ...31

5.5. L. angustifolius žaliavų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ...31

5.5.1. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas DPPH radikalų surišimo metodu ...31

5.5.2 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS radikalų - katijonų surišimo metodu ...32

5.5.3. Chelatinio aktyvumo įvertinimas FIC metodu ...33

5.6. Duomenų analizė ...34

6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ...35

6.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas ...35

6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas ...36

6.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros parinkimas ...37

6.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas L. angustifolius žaliavose ...38

6.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas L. angustifolius žaliavose ...40

6.4. Bendro fenolio rūgščių kiekio nustatymas L. angustifolius žaliavose ...41

6.5. L. angustifolius žaliavų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ...42

6.5.1. L. angustifolius augalinių žaliavų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH surišimo metodu ...43

6.5.2. L. angustifolius augalinių žaliavų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS radikalų - katijonų surišimo metodu ...45

6.5.3. L. angustifolius augalinių žaliavų ekstraktų chelatinio aktyvumo nustatymas FIC metodu46 6.6. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekių ir antioksidacinio aktyvumo ...47

7. IŠVADOS ...49

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...50

SANTRAUKA

Gabrielės Giedraitytės magistro baigiamasis darbas, mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.

Siauralapių lubinų (Lupinus angustifolius L.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.

Tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių siauralapių lubinų (Lupinus angustifolius L.)

augalinių žaliavų fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį, antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai: 1) Nustatyti optimalias fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš L. angustifolius

žaliavų. 2) Ištirti fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose L. angustifolius žaliavų mėginiuose bei įvertinti šių rodmenų įvairavimą atskirose morfologinėse augalo dalyse. 3) Įvertinti L. angustifolius ekstraktų antioksidacines savybes ir jų varijavimo dėsningumus trijose in vitro sistemose (FIC, ABTS ir DPPH). 4) Įvertinti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekio L. angustifolius žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti naudotos augalinės L. angustifolius žaliavos, surinktos iš

22 skirtingų augaviečių Lietuvoje. Taikytas ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu, ekstrahentas – 80% (V/V) etanolis, ekstrakcijos laikas – 15 min, ekstrakcijos temperatūra – 50˚C. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentais (mg/g). Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti taikyta reakcija su AlCl3, o rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (mg/g). Bendram fenolio rūgščių kiekiui tirti taikytas metodas panaudojant Arnow reagentą, bendras fenolio rūgščių kiekis išreikštas chlorogeno rūgštimi (mg/g). Ekstraktų antioksidacinis aktyvumas tirtas DPPH, ABTS ir FIC spektrofotometriniais metodais bei išreikštas procentais (%) ir trolokso ekvivalentais (μmol/g) (ABTS metodas).

Rezultatai ir išvados: Tyrimo metu nustatyta, kad L. angustifolius žaliavose sukaupiami

reikšmingi fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekiai. Šių medžiagų kiekis ženkliai įvairuoja priklausomai nuo morfologinės augalo dalies bei augalo augavietės. Bendras fenolinių junginių kiekis žaliavose įvairavo nuo 4,253 iki 31,126 mg/g, flavonoidų – nuo 0,493 iki 16,043 mg/g, fenolinių rūgščių – nuo 1,493 iki 163,142 mg/g. Didžiausi šių minėtų medžiagų kiekiai nustatyti lapų žaliavose, surinktose iš gamtinių cenopopuliacijų, esančių Baisogaloje, Pašušvyje bei Preiloje. L. angustifolius augalų žaliavų ekstraktuose nustatytas antioksidacinis aktyvumas. DPPH surišimas žaliavų ekstraktuose varijavo plačiose ribose nuo1,160 % iki 38,472 % , o ABTS TE reikšmės – nuo

5,473 iki 31,480 µmol/l. Chelatinis aktyvumas ekstraktuose kito ribose nuo 4,19 iki 76,78 %. Stipriausiomis antiradikalinėmis savybėmis pasižymėjo lapų ekstraktai iš Jurbarko cenopopuliacijos, tuo tarpu didžiausias chelatinis aktyvumas būdingas Druskinininkų cenopopuliacijos lapų ekstraktams. Stipriausi koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp bendro fenolinių junginių ir bendro flavanoidų kiekio (r=0,960), bendro flavonoidų kiekio ir DPPH surišimo (r=0,939) bei bendro fenolinių junginių kiekio ir DPPH surišimo (r=0,932).

SUMMARY

The supervisor of the final master’s thesis/research prepared by Gabrielė Giedraitytė is assoc. prof. PhD. Raimondas Benetis; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. – Kaunas.

The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of narrow-leaved lupin (Lupinus angustifolius L.) plants.

The aim: To assess quantitative composition of phenolic compounds, flavonoids and

phenolic acids in the raw materials of narrow-leaved lupin (Lupinus angustifolius L.) collected from natural habitats in Lithuania and to evaluate the antioxidant activity of these plants.

The objectives of the study: 1) To optimize extraction conditions of phenolic compounds

from L. angustifolius raw materials. 2) To analyse quantitative composition of total phenolics, flavonoids and phenolic acids in L. angustifolius raw materials collected from natural habitats and to analyse their variation patterns depending on morphology of the plants. 3) To evaluate antioxidant activity in the extracts of L. angustifolius raw materials and their variation patterns in three in vitro systems (DPPH, ABTS and FIC). 4) To evaluate correlation between the quantitative composition of total phenolics, flavanoids and phenolic acids in L.angustifolius raw materials and antioxidant activity of their extracts.

Research methodology: The study was carried out using samples of the raw materials of L. angustifolius plants collected from 22 different natural habitats in Lithuania. The method of extraction – ultrasound agitation, extractant - 80% (V/V) ethanol, extraction time – 15 min, extraction temperature - 50ºC. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used to determine the total content of phenolic compounds, results were expressed as gallic acid equivalent (mg/g). To determine the total content of flavonoids reaction with AlCl3 was used, results were expressed as rutin equivalent (mg/g). DPPH, ABTS and FIC spectrophotometric assays were applied to determine radical scavenging and chelating activities of plant extracts, results were expressed as percentage and trolox equivalent (μmol/g) (ABTS method).

Results and conclusions: This study revealed that L. angustifolius raw materials accumulate

significant amounts of phenolics, flavonoids and phenolic acids. Their amount varies significantly depending on the morphological part of the plant and its cenopopulation. Total phenolic content varied between 4,253 iki 31,126 mg/g, total flavonoid content varied between 0,493 iki 16,043 mg/g, while total phenolic acid content was between 1,493 iki 163,142 mg/g. The highest amounts of these compounds were determined in leaves of Baisogala, Pašušvys and Preila. Extracts of L. angustifolius raw materials showed antioxidant activity. DPPH radical scavenging activity varied from 1,160 % to 38,472 % , while ABTS radical scavenging acitivy was between 5,473 and 31,480 µmol/l. Chelating

activity in the extracts of L. angustifolius varied from 4,19 to 76,78 %. The highest radical scavenging acitivities were measured in leaves extracts of Jurbarkas cenopopulation, while leaves extracts of Druskininkai showed the greatest chelating activity. The strongest correlations were determined between total phenolic content and total flavonoidų content (r=0,960), total flavonoid content and DPPH radical scavenging activity (r=0,939) and total phenolic content and DPPH radical scavenging activity (r=0,932).

PADĖKA

Dėkoju šio darbo vadovui Raimondui Benečiui už suteiktas konsultacijas, duotus patarimus bei skirtą laiką. Už materialinę bazę bei reikalingus laboratorinius prietaisus atliekant magistrinį baigiamąjį darbą dėkoju Vaistų chemijos katedrai.

1. SANTRUMPOS

ABTS 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)

ATP adenozin-5'-trifosfatas

DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

FIC Fe2+ jonų sujungimas (angl. ”Ferrous Ion Chelation“)

GRE galo rūgšties ekvivalentai RE rutino ekvivalentai

RNS reaktyviosios azoto rūšys

ROS reaktyviosios deguonies rūšys

UV ultravioletiniai spinduliai

V/V tūrio procentai W/V masės tūrio procentai

2. ĮVADAS

Žmonija augalus ir jų žaliavas dėl gydomųjų savybių naudoja jau tūkstančius metų, o seniausias rašytinis šaltinis, kuriame aprašytas toks gydymo būdas – maždaug 5000 metų senumo Šumerų civilizacijos molio lentelės su 12 augalinių vaistų receptų [64].Nors šiandien egzistuoja platus sintetinių bei pusiau sintetinių vaistų pasirinkimas ir tiriama daugybė potencialių naujų vaistų molekulių, augaliniai preparatai nepraranda savo aktualumo. Pasaulinės sveikatos organizacijos duomenimis apie 80 % pasaulio gyventojų ligų gydymui bei profilaktikai naudoja tradicinę mediciną, kuri daugiausiai apima augalinių ekstraktų bei augaluose esančių biologiškai aktyvių medžiagų vartojimą [49]. Pastaruoju metu pasaulyje stebimas augalinių produktų, tokių kaip arbatos, sultys, augaliniai maisto papildai, vartojimo padidėjimas, tokiais produktais siekiant papildyti mitybą bei palaikyti gerą organizmo būklę [10]. Ląstelių veiklos metu organizme gaminasi laisvieji radikalai, kurie priklausomai nuo kiekio, gali būti ir naudingi, ir žalingi. Nedidelis jų kiekis gali būti naudingas apsaugant organizmą nuo įvairių pažaidų, pavyzdžiui, kovojant su infekcijomis [83]. Laisvųjų radikalų kiekiui ląstelėse ženkliai padidėjus, ypač esant nepalankioms aplinkos sąlygoms bei žalingiems įpročiams, atsiranda būsena, vadinama oksidaciniu stresu [14][33]. Oksidacinis stresas pavojingas organizmui, nes galimi baltymų, lipidų, DNR bei genų ekspresijos pokyčiai ląstelėse, kurie turi svarbią reikšmę astmos, neurodegeneracinių, širdies-kraujagyslių bei daugelio kitų ligų atsiradimui, senėjimo procesų spartėjimui [39][48].

Organizme sintezuojamos molekulės, galinčios neutralizuoti laisvuosius radikalus, tai – antioksidantai. Antioksidantai apsaugo įvairias ląstelių struktūras nuo galimų laisvųjų radikalų pažaidų. [14]. Organizme egzistuoja fermentinių bei nefermentinių sistemų, kurios veikia kaip antioksidantai [37].Vis dėlto esant tokiam sparčiam gyvenimo tempui visuomenėje, šioms sistemoms darosi vis sunkiau efektyviai neutralizuoti laisvuosius radikalus, todėl organizmui reikalinga egzogeninių antioksidantų pagalba [14][54].

Polifenoliai – vieni labiausiai tiriamų antioksidantų, kurie randami augaluose kaip antriniai metabolitai. Šios medžiagos turi įrodytų antioksidantinių savybių bei gali padėti apsaugoti nuo įvairių, dėl oksidacinio streso atsiradusių, sutrikimų [76]. Atsižvelgiant į galimą polifenolinių junginių naudą organizmui, vykdomi tyrimai su įvariais augalais, kurių žaliavos gali būti potencialus šių antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių medžiagų šaltinis.

Lupinus gentis priklauso pupinių (Fabaceae L.) šeimai. Tai yra žoliniai vienmečiai arba daugiamečiai augalai, jų gentyje priskaičiuojama apie 200 skirtingų rūšių [21]. Lubinai jau seniai vartojami kaip pašaras, maistiniai grūdai bei žalioji trąša [22]. Tačiau fitocheminių tyrimų su kai kuriomis lubinų rūšimis rezultatai rodo, jog šie augalai kaupia ženklius kiekius fenolinių junginių bei pasižymi antioksidaciniu aktyvumu [46][59][74]. Vienas iš tokių augalų – Lietuvoje plačiai paplitęs

siauralapis lubinas (Lupinus angustifolius L.). Šio augalo kaupiamų fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinių savybių tyrimai tikslingi ieškant galimų natūralių fenolinių junginių gavybos šaltinių.

Lietuvoje iki šiol buvo atlikti kultivuojamų L. angustifolius augalų sėklų fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo įvertinimo tyrimai. Mūsų tyrimų metu buvo tirtos skirtingų augalo morfologinių dalių – žiedų, stiebų bei lapų, bei skirtingose cenopopuliacijose surinktos, žaliavos. Taip pat atliktas žaliavų fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygų optimizavimas. Taikant spektrofotometrinius metodus ištirti bendri fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekiai žaliavose bei antioksidacinis aktyvumas žaliavų ekstraktuose. Gauti rezultatai leidžia įvertinti siauralapių lubinų augalų žaliavas kaip galimą antioksidantų šaltinį.

Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių siauralapių lubinų (Lupinus angustifolius

L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį, antioksidacinį aktyvumą.

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių siauralapių lubinų (Lupinus angustifolius L.)

augalinių žaliavų fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį bei antioksidacinį aktyvumą.

Uždaviniai:

1) Nustatyti optimalias fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš L. angustifolius žaliavų.

2) Ištirti fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose L. angustifolius žaliavų mėginiuose bei įvertinti šių rodmenų įvairavimą atskirose morfologinėse augalo dalyse.

3) Įvertinti L. angustifolius ekstraktų antioksidacines savybes ir jų varijavimo dėsningumus trijose in vitro sistemose (FIC, ABTS ir DPPH).

4) Įvertinti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekio L. angustifolius žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4.1. Siauralapis lubinas (Lupinus angustifolius L.)

4.1.1. Lupinus genties augalai

Lubinų (Lupinus L.) gentis priklauso pupinių (Leguminosae L. arba Fabaceae L.) šeimai. Priskaičiuota apie 200 rūšių augalų priklausančių lubinų genčiai, kurių dauguma susitelkę Šiaurės bei Pietų Amerikoje, mažesnė jų įvairovė būdinga šiaurės Afrikos bei Viduržemio jūros regionams

[6][21]

.

Lubinai būna vienmečiai žoliniai arba daugiamečiai krūminiai augalai, priklausomai nuo rūšies. Jų aukštis gali siekti nuo maždaug 0,2 m iki 2,5 m. Būdingi pirštiški lapai. Žiedų spalva įvairi – balta, mėlyna, violetinė, rožinė, geltona. Kiekvienai rūšiai būdingos tik viena ar kelios galimos spalvos, tačiau įdomu tai, jog, pavyzdžiui, L. angustifolius natūraliai augančio augalo žiedų spalva yra mėlyna arba rožinė, tuo tarpu genetiškai išvesta jo forma turi baltus žiedus, visai kaip L. albus [40].

Lubinai kaip ir kiti pupinių šeimos augalai dėl šaknų gumbeliuose esančių bakterijų gali fiksuoti atmosferos azotą, todėl geba augti nederlingose dirvose, jose sukurdami geresnes sąlygas kitiems augalams augti [26].

Lubinus žmonės vartoja jau labai seniai. Maistiniams grūdams, pašarui galvijams bei žaliajai trąšai šie augalai pasaulyje auginami jau keletą tūkstančių metų. Lubinų sėklos Viduržemio jūros regione maistui vartotos jau prieš 3000 m., o Andų kalnų vietovėse – netgi prieš 6000 m [22][82].

Kad pasišalintų lubinų sėklose esantys kartūs alkaloidai, sėklas reikėdavo mirkyti vandenyje. Tačiau šiuo metu jau yra išvesta L. albus, L. luteus bei L. angustifolius rūšių, kurių sėklose alkaloidų tėra pėdsakai. Tokią genetiškai pakeistą alkaloidų kiekybinę sudėtį turintys lubinai vadinami saldžiaisiais [18][65]. Pastaraisiais dešimtmečiais vykdyta gan nemažai tyrimų ieškant augalinio pakaitalo sojų pupelėms. Paaiškėjo, jog lubinų sėklos yra gera alternatyva [41]. Kaip ir sojų pupelės, lubinų sėklos yra gausus baltymų, o taip pat ir energijos šaltinis. Jos nekaupia nepageidaujamų junginių, trukdančių užtikrinti optimalų maistingumą, pavyzdžiui, tripsino inhibitorių (pastaruosius kaupia sojų pupelės), fitohemagliutininų, vandenilio cianido [66]. Dar vienas lubinų sėklų privalumas tas, jog jų apdirbimui prieš vartojimą nereikalingas kaitinimas, dėl tvirtos sėklų luobelės jas lengva sandėliuoti [41].

Jau minėtosios lubinų sėklų savybės bei palyginus nebrangus šių augalų kultivavimas, gebėjimas prisitaikyti ir augti įvairiose klimatinėse zonose lemia, jog lubinai plačiai vartojami tiek gyvuliniams pašarams, tiek žaliajai trąšai. Be to, lubinų savybė kaupti atmosferos azotą ir juo

praturtinti dirvą bei gebėjimas į dirvos paviršių iškelti naudingus augimui elementus įgalina jų auginimą ekologiniuose ūkiuose, kur ribojamas mineralinių trąšų naudojimas [5].

Baltymai bei nepakeičiamosios amino rūgštys esančios lubinų sėklose labai svarbios galvijams, tad įeina į gyvulinių pašarų racioną kartu su rapsų išspaudomis, žirniais ar pupomis. Avys ir karvės yra labiausiai lubinus ėdantys gyvuliai, šiek tiek mažiau jų sunaudojama vištoms bei kiaulėms [40]. Tačiau svarbu, jog tai būtų alkaloidų neturintys lubinai. Sėklose esantys alkaloidai lupaninas, 13-hidroksilupaninas, angustifolinas, alfa-izolupaninas bei kiti yra kenksmingi gyvūnams, dėl sukeliamo toksiškumo gyvūnai gali mirti [5][66].

4.1.2. L. angustifolius morfologija

Siauralapis lubinas (1 pav. A) – vienmetis, žolinis, savidulkis augalas. Stiebas status ir nešakotas. Augalas 60-150 cm aukščio. Lapai pirštiški, besidalijantys į segmentus, kurių gali būti nuo 5 iki 9, o kiekvieno iš šių segmentų ilgis apie 4 cm. Žiedai susitelkę kekės pavidalo žiedynuose, jų spalva įvairi – mėlyna, violetinė, rožinė, balta, tačiau būdingiausia – mėlyna. Būdingos pūkuotos pailgos atsidarančios ankštys, jų viduje randamos ovalios sėklos (1 pav. B) [23].

A B

1 pav. Lupinus angustifolius L. antžeminė dalis (A) ir Lupinus angustifolius L. ankštys su sėklomis (B)

4.1.2. L. angustifolius paplitimas

L. angustifolius rūšis būdingiausia Eurazijai ir Šiaurės Afrikai. Ji buvo aklimatizuota Šiaurės Amerikoje bei dalyje Australijos, kurioje pastartuoju metu intensyviai kuriamos vis naujesnės, geresnėmis savybėmis pasižyminčios L. angustifolius veislės [22][40].

Ši rūšis auga gan įvairioje aplinkoje – pievose, uolėtose vietovėse, krūmynuose, smėlynuose prie vandens, palei kelius bei laukuose. Labiau mėgsta lengvą dirvą. Kaip ir kiti lubinų genties augalai, gali augti ir nederlingoje vietovėje [50].

4.1.3. L. angustifolius kaupiamos medžiagos

Daugiausiai tirta L. angustifolius sėklų cheminė sudėtis. Nustatyta, jog jas sudaro skaiduliniai angliavandeniai, baltymai, amino rūgštys, aliejai, krakmolas, cukrūs, pektinas, alkaloidai, mineralai, bei polifenoliniai junginiai [22][65][77].

Šios rūšies augaluose randamos tiek pakeičiamosios, tiek nepakeičiamosios amino rūgštys. Iš pakeičiamųjų amino rūgščių daugiausiai kaupiama glutamo rūgšties, asparto rūgšties bei arginino. Iš nepakeičiamųjų amino rūgščių, kurių sėklose randama 13, daugiausiai kaupiamas leucinas, fenilalaninas su tirozinu bei lizinas [77].

Kaip ir kitos lubinų rūšys, L. angustifolius turtingas baltymais. Baltymai sėklose kartais sudaro daugiau nei 50 % jų masės. Augalas kaupia ir tirpius, ir netirpius vandenyje baltymus. Pagrindiniai kaupiami vandenyje tirpūs baltymai – globulinai, albuminai, glutelinai, jie augalui reikalingi kaip maisto atsargos. Be šių randama ir kitų baltymų – fermentų, fermentų inhibitorių, lektinų, tačiau skirtingai nuo prieš tai minėtų baltymų, šie skirti sėklai apsaugoti, žmonių ir kitų žinduolių maisto racionui jie nėra naudingi [2]. Bermudez ir kt. (2014) ištyrė siauralapių lubinų baltymų hidrolizatų poveikį makrofagams in vitro. Pastebėti teigiami pokyčiai, tokie kaip mažesnė prouždegiminių citokinų gamyba, didesnė priešuždegiminių genų ekspresija, padidėjęs makrofagų išgyvenamumas bei kt. Taigi, manoma, kad vartojant L. angustifolius savo maisto racione, galima išvengti su ūminiu uždegimu susijusių ligų, tokių kaip reumatoidinis artritas, aterosklerozė, vėžys [13]. Siauralapių lubinų sėklose kaupiamos tiek tirpios, tiek ir netirpios vandenyje skaidulos [77]. Skaiduloms būdingos savybės gerinti virškinamojo trakto veiklą. Johnson bei kiti (2005) ištyrė, kokį poveikį žarnyno funkcijai bei išmatų kokybei turi lubinuose esančių skaidulų vartojimas su maistu. Nustatyta, jog tokia dieta padidino tuštinimosi dažnumą, išmatų kiekį ir jų drėgmę, taip pat sumažėjo išmatų slinkimo žarnynu laikas bei išmatų pH, o visa tai lemia mažesnę riziką susirgti storosios žarnos vėžiu [44].

Sėklose L. angustifolius taip pat kaupia alkaloidus. Jie suteikia kartų skonį, taip pat ir toksinį poveikį organizmams, kuris pasireiškia kvėpavimo sutrikimais bei kepenų pažaida [2]. Visose lubinų rūšyse rasta apie 200 skirtingų alkaloidų, tuo tarpu L. angustifolius augaluose randama apie 15 alkaloidų, iš kurių didžiausią dalį sudaro 13α-hidroksilupaninas bei lupaninas. Be šių dar randama amodendrino, izoangustifolino, angustifolino, α-izolupanino, tetrahidrorombifolino bei įvairių

lupanino junginių su valerijono bei cinamono rūgštimis [2][24]. Erdemoglu ir kiti (2006) tyrė L. angustifolius alkaloidų ekstrakto poveikį tipinėms bakterijų padermėms bei grybeliams. Nustatytas stiprus poveikis prieš bakterijas B. subtilis, S. aureus, P. aeruginosa, bei vidutinis poveikis prieš grybelius C. albicans ir C. krusei [24]. Taip pat tirta, kokį poveikį vėžinėms pelių ląstelėms turi įvairių rūšių karčiųjų bei saldžiųjų lubinų sėklų alkaloidų ekstraktas. Nustatyta, jog toks poveikis egzistuoja, tačiau karčiųjų lubinų rūšių jis stipresnis [46].

Sėklose taip pat randama mineralų – magnio, geležies, kalcio, cinko, kalio, bei vitaminų, tokių kaip tiaminas, riboflavinas, niacinas [17].

Siauralapių lubinų sėklose yra ir lipidų. Didžioji dalis jų – trigliceridai (apie 70 %), mažesnės frakcijos fosfolipidų, sterolių, glikolipidų. Kaupiamos riebiosios linolo, oleino, palmitino, linoleno rūgštys [35].

Be jau minėtų medžiagų, L. angustifolius būdingi fenoliniai junginiai, kurie kaupiami kaip antriniai metabolitai [22]. Svarbiausia jų savybė yra antioksidacinis aktyvumas pasireiškiantis dėl gebėjimo surišti laisvuosius radikalus. Daugybe tyrimų įrodyta, jog antioksidantai svarbūs širdies-kraujagyslių, uždegiminių bei vėžinių, diabeto, osteoporozės, neurodegeneracinių bei kitų ligų gydymui ir prevencijai [49][61]. Siauralapiuose lubinuose randama įvairių fenolinių medžiagų: apigenino, liuteolino, genisteino, priklausančių plačiai flavonoidų grupei, taip pat galo, sinapo, kavos, kumaro, ferulo rūgščių ir kt., kurios prisikiriamos fenolio rūgštims [46][74]. Fenoliniai junginiai plačiau bus aptariami tolimesniame skyriuje.

4.1.4. L. angustifolius panaudojimas

Kaip jau minėta, L. angustifolius augalai naudojami pašarui bei žaliajai trąšai. Tai bene seniausios bei populiariausios šios rūšies panaudojimo sritys. L. angustifolius puikūs pašarui dėl kaupiamo didelio baltymų kiekio bei gyvuliams ypač reikalingų nepakeičiamųjų amino rūgščių, taip pat ir kitų maistingųjų medžiagų [22][82]. Kaip trąša siauralapiai lubinai naudojami dėl unikalių savo šaknų savybių. Siauralapis lubinas šaknų gumbeliuose esančių bakterijų pagalba pasisavintą azotą verčia įvairiais azoto junginiais, o augalui žuvus, šie junginiai patenka į dirvą ir juos naudoja aplinkiniai augalai. Šių lubinų šaknys būna stiprios, iki kelių metrų ilgio. Jos pasiekia kitiems augalams sunkiai prieinamas maisto medžiagas ir jas kaupia, gerai ir giliai išpurena dirvožemį, stabdo eroziją ir naikina piktžoles [40].

L. angustifolius taip pat vartojamas gaminant maistą. Nors, kaip jau buvo minėta, šioje srityje augalas kai kur naudotas jau prieš kelis tūkstantmečius, šiandien jo panaudojimas grįstas biologinėmis savybėmis, maistingumu, kaupiamomis naudingosiomis medžiagomis. L. angustifolius sėklos

naudojamos miltams gaminti. Sėklose esantys baltymai gali būti alternatyva kiaušinių baltymams formuojant putas kepinių gamybai. Lubinų miltai naudojami įvairiems gaminiams, pavyzdžiui, makaronams, duonai, biskvitams, sausainiams, bandelėms, traškučiams ar blynams gaminti. Tokiuose gaminiuose šie miltai gali būti kaip pakaitalas sviestui ar kiaušiniams. Lubinų miltai gali būti maišomi su kviečių miltais, taip pagerinamos tešlos savybės bei padidinamas maistingumas. Be to, tokie miltai gaminiams suteikia geltoną spalvą, kuri dažnam vartotojui yra patrauklesnė nei kvietinių miltų gaminių spalva. Svarbu paminėti, jog lubinų miltuose nėra gliuteno, todėl jie tinkami ir gliuteno neturintiems produktams gaminti. Tačiau lubinų miltus gali vartoti ne visi – turintiems alergiją žemės riešutams gali pasireikšti alergija ir lubinų miltams [47].

Įvairių tyrimų autoriai į dietą siūlo įtraukti siauralapius lubinus. Jau minėta, jog šie augalai labai maistingi dėl didelio baltymų kiekio, kuris sudaro apie 38 % sėklų komponentų, todėl tai gali būti puikus energijos šaltinis [17]. Taip pat teigiama, jog mėsos produktų pakeitimas į siauralapių lubinų dietą, gali turėti teigiamą įtaką gyvenimo trukmei, cukriniui diabetui, širdies ir kraujagyslių ligoms bei kūno svoriui [56]. Tokie poveikiai aiškinami tuo, jog L. angustifolius kaupia daug angliavandenių, turinčių mažą glikemijos indeksą – pilnai nesuskaidomo krakmolo, oligosacharidų bei skaidulų. Šios medžiagos storąsias žarnas pasiekia nesuskaidytos ir ten veikia kaip maistas probiotinėms ten esančioms bakterijoms. Jos fermentuoja storųjų žarnų mikrobiomai palankias riebiąsias rūgštis, tokias kaip butiratą, todėl palaikant gerą žarnų būklę, mažėja vėžio rizika [15]. Lubinų kaupiamos maisto medžiagos nesunkiai sukelia sotumo jausmą, todėl mažėjant suvalgomo maisto kiekiui, galima lengviau kontroliuoti kūno svorį [53]. Be to, minėtosios lubinuose esančios medžiagos padeda reguliuoti gliukozės kiekį kraujyje po valgio bei mažina širdies-kraujagyslių ligų rizika sergant II tipo cukriniu diabetu [43].

4.2.

Fenoliniai junginiai

Augaliniai polifenoliai – labai plati vaisiuose, daržovėse, kruopose bei riešutuose randamų junginių klasė [36][81]. Jiems būdingi vienas ar keli benzeno žiedai su viena ar daugiau fenolinių funkcinių grupių [36]. Polifenoliai augaluose egzistuoja kaip antriniai metabolitai, o jų atliekamos funkcijos bei augalo vieta, kurioje jie randami, labai įvairūs [28][61]. Iš viso nustatyta apie 8000 polifenolinių junginių, o apie 4000 iš jų priklauso flavonoidų grupei [29][61].Polifenoliai augaluose kilę iš aminorūgščių fenilalanino ar tirozino [61][62]. Fenoliniai junginiai reikalingi augalams apsisaugoti nuo ultravioletinės spinduliuotės, patogenų [61]. Šie junginiai dalyvauja ląstelių antrinės sienelės susidaryme taip sutvirtindami augalą bei padėdami lengviau prisitaikyti prie sausrų [28].

Nustatyta, jog fenolio rūgštys bei flavonoidai veikia kaip signalinės molekulės, svarbios simbiozei su bakterijomis bei augalo vystymuisi, ypač stresinėmis sąlygomis [28][55][69].

Pastebėta, jog daugiau fenolinių junginių augale gaminasi jam patiriant stresines sąlygas – esant intensyviai saulės šviesai ir negaunant vandens ar azoto, esant šalčiui ar karščiui bei dideliam druskų kiekiui šaknų zonoje [28][69]. Augalui susiduriant su stresinėmis sąlygomis, polifenoliai veikia stabdydami reaktyvių deguonies bei azoto formų susidarymą bei nukenksmindami jau susidariusias. Šį antioksidacinį augalų polifenolinių junginių poveikį stengiamasi pritaikyti žmonių ligų profilaktikai bei gydymui, normalios organizmo būklės palaikymui [28][60]. Neseniai nustatyta, jog polifenolinių junginių poveikis gyvūnų organizmams grįstas ne vien antioksidantinėmis savybėmis – polifenolių metabolitai ląstelių viduje veikia kaip signalinės molekulės, padedančios reguliuoti ląstelių augimą, dauginimąsi bei žūtį [60].

Epidemiologiniai tyrimai parodė, jog polifenoliai gali padėti apsaugoti organizmą nuo širdies ir kraujagyslių, vėžinių ligų, cukrinio diabeto bei astmos, taip pat stabdyti infekcinių, neurodegeneracinių ligų vystymąsi bei lėtinti senėjimą [61]. Susidomėjimas augalų fenolinių junginių poveikiu organizmui bei jų pritaikymu ne tik medicinos, bet ir maisto pramonės srityje, auga. Vis dėlto, tyrimų apie mitybą augaliniais polifenoliais duomenys nėra pakankamai išsamūs, o kai kurie netgi prieštaringi. Be to, kai kurių tyrimų rezultatai rodo, jog lėtinių, degeneracinių bei infekcinių ligų rizika netgi padidėja vartojant daug fenolinių junginių turintį maistą. Taip pat trūksta tyrimų bei informacijos apie šalutinius tokios mitybos poveikius organizmui – galimą kancerogeninį aktyvumą, citotoksiškumą, ląstelių apoptozės skatinimą bei sąveikas su vaistais [51][61].

4.2.1. Klasifikacija

Polifenoliai gali būti klasifikuojami įvariai – pagal cheminę struktūrą, kilmę ar biologinę funkciją [81]. Čia apžvelgiama jų cheminė klasifikacija, žemiau pateikiama jos schema su labiausiai ištirtais kiekvienos grupės junginių pavyzdžiais (2 pav.).

2 pav. Polifenolių cheminė klasifikacija

Fenolio rūgštys

Skirstomos į hidroksibenzoines (3 pav. A) ir hidroksicinamono (3 pav. B) rūgštis priklausomai nuo to, ar yra benzoinės ar cinamono rūgšties dariniai [61]. Išskyrus raudonuosius vaisius, uodeguotuosius ridikus bei svogūnus, hidroksibenzoinių rūgščių augaluose randama palyginus nedideli kiekiai [61].Vaisiuose ir daržovėse esančios fenolio rūgštys randamos laisvame pavidale, tuo tarpu sėklose ir grūduose – sujungtoje formoje.Norint paversti šias rūgštis laisvomis, reikia vykdyti rūgštinę ar šarminę hidrolizę arba veikti fermentais. Taip pat jas išlaisvinti iš sienelių galima vykdant fermentaciją, daiginant, skrudinant, karštai ar šaltai išspaudžiant [61][72].

3 pav. A – hidroksibenzoinių rūgščių bendroji formulė, B – hidroksicinamono rūgščių bendroji formulė, R – įvairūs pakaitai

Stilbenai

Jiems būdinga struktūra – dvi fenolinės dalys, sujungtos dviejų anglies atomų tilteliu. Dauguma stilbenų augaluose veikia kovodami prieš patogenines infekcijas [42][61].Žmonės su maistu

jo gauna nedaug. Resveratrolis – geriausiai ištirtas stilbenas, jo gausu vynuogėse bei vynuogių vyne [61].

Flavonoidai

Flavonoidai yra labiausiai ištirta polifenolinių junginių grupė. Ši grupė pagal hidroksilo grupių skaičių bei chromano žiedo (C žiedo) variacijas junginiuose dar skirtoma į keletą pagrindinių pogrupių (4 pav.): flavonus, antocianinus, izoflavonus, flavonolius, flavanonus bei flavanolius [61].

4 pav. Flavonoidų grupės su pagrindinėmis struktūrinėmis formulėmis, R – įvairūs pakaitai

Literatūroje išskiriamos ir kitos flavonoidų grupės: chalkonai, neoflavonoidai, auronai, flavandioliai, proantocianidinai [29][81]. Žemiau vaizduojamos bendros flavonoidų anglikonų struktūrinės formulės, tačiau augaluose dauguma flavonoidų sutinkami glikozidų pavidalu. Junginių struktūra ir buvimas glikozilintoje formoje bei jos pobūdis nulemia biologines junginių savybes [19]. Įvairiems flavonoidams būdingos skirtingos funkcijos – jie apsaugo augalus nuo UV spinduliuotės, patogenų, kaip signalinės molekulės reguliuoja augale vykstančius procesus, svarbūs auksino transportui, suteikia lapams, vaisiams bei žiedams spalvą, tuo pačiu pritraukdami ir žiedų apdulkintojus [29][61].

Lignanai

Lignanai struktūra gali būti apibrėžta kaip cinamono rūgščių dimeras turintis dibenzilbutano skeletą. Vienas svarbiausių lignanų – sekoizolaricirezinolis (5 pav.), jo ypač daug sėmenyse, taip pat randama ir sojų pupelėse, žemės riešutuose, brokoliuose [58]. Šiam bei dar trims lignanams –

matairezinoliui, laricirezinoliui bei pinorezinoliui, būdingas fitoestrogeninis poveikis. Žinduolių organizmuose jie veikia kaip estrogenų prekursoriai [58][61].

5 pav. Sekoizolaricirezinolis

4.3.

Oksidacinis stresas

Oksidacinis stresas apibūdinamas kaip pusiausvyros sutrikimas tarp antioksidantų bei oksidantų kiekio, kai ženkliai padaugėja oksidantų [14][33]. Ši pusiausvyra nuolat šiek tiek kinta, nes ląstelių veiklos metu mitochondrijose sinteninat ATP taip pat gaminasi ir RONS. Rūkant bei kvėpuojant cigarečių dūmais, aplinkoje esant ozono, patiriant jonizuojančią, UV spinduliuotę ar hiperoksiją, organizme taip pat padaugėja RONS [14][34][54]. Oksidacinis stresas pavojingas ląstelėms, nes pernelyg didelis oksidantų kiekis gali pakeisti DNR, lipidų, baltymų struktūras bei kai kurių genų ekspresiją. Visa tai gali prisidėti prie onkologinių bei neurologinių ligų, tokių kaip Parkinsono bei Alzhaimerio, taip pat astmos, kataraktos, plaučių fibrozės, aterosklerozės, hipertenzijos, diabeto bei kitų ligų, atsiradimo, skatinti senėjimą [14][31][38][39][48][75].

ROS – tai laisvieji radikalai reaktyvios molekulės bei jonai, kilę iš O2. Svarbiausios endogeninės ROS formos yra superoksido anijonas (O2∙-), hidroksilo radikalas (∙OH) bei vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl), peroksilo radikalas (ROO∙), hiperperoksilo radikalas (HOO∙), svarbiausios RNS formos – azoto oksido radikalas (NO∙), peroksinitrito anijonas (ONOO

-) [14][73]. Kai kurie RONS, pavyzdžiui, H2O2, O2∙-, NO∙, ląstelėse dalyvauja signalų perdavimo procesuose [63].

Net aukšti pirminių RONS (pavyzdžiui, superoksido ar azoto oksido radikalų) kiekiai biologinėje sistemoje nesukelia žalingo poveikio, jei yra tik viena iš šių pirminių rūšių. Tačiau sureagavus dvejoms pirminėms RONS rūšims arba pirminei ROS rūšiai su pereinamųjų metalų jonais, susidaro antrinės šių formų rūšys. Jos labai reaktyvios, toksiškos, sunkiai kontroliuojamos bei sukelia negrįžtamus biomolekulių pokyčius [48]. Pačiu pavojingiausiu laisvuoju radikalu laikomas ∙OH. Šis radikalas negali būti pašalinamas fermentinėmis reakcijomis kaip kiti laisvieji radikalai, todėl susidaręs jis gali reaguoti su bet kokio tipo substratu ir daryti žalą ląstelės struktūroms [52][73]. Hidroksilo radikalas dalyvaujant pereinamųjų metalų – geležies, vario, kobalto ar mangano, jonams, susidaro iš

vandenilio peroksido, kuris yra ląstelinio kvėpavimo šalutinis produktas [52][63][73]. Tai vadinamoji Fentono reakcija. Antioksidantai pasižymintys chelatinėmis savybėmis gali šią reakciją stabdyti, nes prisijungia šiai reakcijai reikalingus metalų jonus [52][73].

4.3.1. Antioksidantai

Antioksidantais laikomos bet kokios medžiagos, kurios geba stabdyti DNR, angliavandenių, lipidų bei baltymų oksidaciją. Kitaip tariant, jie kovoja su galima reaktyvių deguonies bei azoto formų žala ląstelėms [14][37].

Antioksidantai gali būti skirstomi į egzogeninius ir endogeninius, fermentinius ir nefermentinius, sintetinius ir natūralius [37].Antioksidantais gali būti organizme esančios medžiagos: fermentai – superoksido dismutazė, katalazė, glutationo reduktazė, lipazė, proteazė, transferazės, metionino sulfoksido reduktazė, DNR taisantys fermentai; mineralai – cinkas, selenas, varis, geležis bei manganas; vitaminai – vitaminas E (tokoferolis), vitaminas C (askorbo rūgštis); kitos medžiagos – šlapimo rūgštis, bilirubinas, tioliai (pavyzdžiui, glutationas), albuminas; taip pat ir egzogeninės medžiagos – polifenoliai, karotenoidai [34][54][75]. Paminėtieji antioksidantai priskiriami pirminiams (natūraliems) antioksidantams. Antriniams (sintetiniams) antioksidantams būdinga fenolinė struktūra, jie daugiausiai naudojami kaip konservantai maiste ar kosmetikoje [34][54][75]. Tokių antioksidantų pavyzdžiai: butilintas hidroksianizolas, butilintas hidroksitoluenas, propilo galatas, etilendiaminotetraacto rūgštis (EDTA) [34][54].Dėl kai kurių sintetinių antioksidantų savybių, tokių kaip lakumas, nestabilumas esant aukštai temperatūrai ar kancerogeninis poveikis, maisto bei kosmetikos pramonėje pereinama prie natūralių antioksidantų [54].

4.3.2. Polifenoliniai antioksidantai

Polifenoliai – antioksidantams priklausantys junginiai. Dėl savo natūralios kilmės bei poveikio organizmui pastaruoju metu susilaukia vis daugiau dėmesio [52][67]. Antioksidacinį aktyvumą polifenoliuose lemia hidroksilo (OH) grupės skaičius bei konfigūracija [25][76][79]. Nustatyta, jog antioksidacinis aktyvumas tarp augalinių fenolių mažėja tokia tvarka: procianidinų dimerai > flavanoliai > flavonoliai > hidroksicinamono rūgštys > hidroksibenzoinės rūgštys [76].

Polifenoliniams junginiams būdingi antioksidaciniai mechanizmai: 1) vandenilio atomo perdavimas laisvajam radikalui 2) elektrono perdavimas laisvajam radikalui 3) metalų jonų chelacija 4) antioksidacinių fermentų aktyvacija 5) superoksido sintezei reikalingų oksidazių inhibavimas [52][67]

Pirmojo mechanizmo reakciją galima pavaizduoti taip: ArOH + R∙ → ArO∙ + RH (ArOH – polifenolis,turintis OH grupę, R∙ - laisvasis radikalas). Susidaręs produktas RH yra nepavojingas. Kitas produktas – ArO∙ lyginant su R∙ yra mažiau reaktyvus ir pavojingas, nes yra daug stabilesnis nei laisvasis radikalas R∙ [52].

Elektrono perdavimo reakcija gali būti pavaizduota šitaip: ArOH + R∙ → ArOH+ + R- . Polifenolis atiduoda savo elektroną laisvajam radikalui, susidaro energetiškai stabilus anijonas R-, turintis lyginį elektronų skaičių, bei taip pat mažai reaktyvus katijoninis radikalas ArOH+

[52].

Metalų jonų chelacija padeda sustabdyti jau minėtą Fentono reakciją, kurios produktas hidroksilo radikalas gali pažeisti lipidus, baltymus, angliavandenius bei DNR [52][63]. Metalų chelacija būdinga flavonoidų grupėms bei hidroksicinamono rūgščių dariniams [57][78]. Flavonoiduose yra trys koordinacinės sritys, kuriose jungiasi metalų jonai: a) tarp 5-OH ir 4-C grupių b) tarp 3-OH ir 4-C grupių c) tarp 3`-OH ir 4`-OH grupių B žiede (6 pav.) [57][78]. Nustatyta, jog flavonoido-metalo kompleksai laisvuosius radikalus pašalina efektyviau nei laisvi flavonoidai [78].

6 pav. Metalų jonų jungimosi su flavonoidais sritys

Nustatyta, jog flavonoidams būdingas ne tik antioksidacinis, bet ir prooksidacinis aktyvumas. Tai, kuris poveikis pasireikš, priklauso nuo flavonoidų koncentracijos bei struktūros [20][67]. Pavyzdžiui, esant 1–50 μM kvercetino koncentracijai, žmogaus leukocituose dėl superoksido readikalo poveikio pažeidžiama mažiau DNR, nei lyginant su 100 μM koncentracija – tuomet pažeidimų daugiau, nes kvercetinas veikia kaip prooksidantas [85]. Struktūros atžvilgiu, kuo daugiau hidroksilo grupių turi flavonoidai, ypač B žiede, tuo ryškesnis jų prooksidacinis aktyvumas [67][68]. Tokio poveikio galimybę flavonuose padidina 2,3-dviguba jungtis bei 4-okso grupė [67]. Taip pat pastebėta, jog kai kurie flavonoidai veikia kaip prooksidantai esant dideliam pH bei didelei pereinamųjų metalų jonų koncentracijai [20][68]. Manoma, kad prooksidacinis aktyvumas gali būti naudingas, kai jis sukelia nedidelį oksidacinį stresą – padidėja antioksidantų bei biotransformacijos fermentų, todėl didėja ląstelių apsauga [67].

4.4.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas

Antioksidacinis aktyvumas gali būti nustatomas in vivo arba in vitro [3][8].Antioksidacinio aktyvumo nustatymui dažniausiai naudojama spektrofotometrinė analizė. Spektrofotometriškai ištirti atskirus junginius iš augaluose esančių antioksidantų kompleksų neįmanoma, todėl šie antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai tiria bendrą junginių antioksidacinį aktyvumą. Didelės skiriamosios gebos metodais galima tirti kompleksinių mišinių atskirų junginių antioksidacinį aktyvumą. Tokiam tyrimui naudojama efektyvioji skysčių chromatografija [3]. Tačiau tokio pobūdžio tyrimai brangesni ir sudėtingesni. Bendro antioksidacinio aktyvumo tyrimas praktiškesnis ir norint įvertinti bei apibūdinti tiriamųjų antioksidantų poveikį organizmui [20]. Antioksidaciniam aktyvumui įvertinti reikia pasitelkti bent keletą skirtingų metodų, nes kiekvienu atveju rezultatai gali skirtis [8]. Pagal savo mechanizmą jie skirstomi į HAT – kai perduodamas vandenilio atomas, SET – kai perduodamas vienas elektronas bei metalų jonų chelatinius metodus [20]. Toliau bus aptariami spektrofotometriniai in vitro antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai, kuriems būdingi SET ir metalų jonų chelatinis mechanizmai.

DPPH metodas. Tai SET metodas, pasižymintis greitumu ir paprastumu. Junginys 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo hidratas (DPPH.) yra stabilus violetinės spalvos laisvasis radikalas. Jam sureagavus su elektroną atiduodančiu antioksidantu, dingsta violetinė DPPH spalva. Etanoliniuose tirpaluose DPPH radikalo inaktyvavimo laipsnis nustatomas naudojant 517 nm bangą. Sumaišius DPPH su antioksidantu, reikia palaukti 30 min [3][9][30].

ABTS metodas. Taip pat priklauso SET metodams. Laisvasis katijoninis radikalas yra 2,2`-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono rūgštis) (ABTS.+). Tai stabilus radikalas, turintis net keturis absorbcijos maksimumus regimosios šviesos spektre. Pats radikalas yra mėlynai žalios spalvos [3][9]. ABTS.+ susidarymui reikalinga reakcija tarp ABTS bei oksidanto, tokio kaip K2S2O8, MnO2 ar peroksilo radikalas.Absorbcija matuojama prie 734 nm bangos po radikalo ir antioksidanto sąveikos praėjus apie 30 min. ar daugiau [9].

Dažnai naudojami ir geležies (FRAP) bei vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai. Pagal mechanizmą tai taip pat SET metodai [3][11]. Čia antioksidantai redukuoja komplekse esančius metalų jonus. Kompleksai įgija spalvą, matuojamas jų absorbcijos pokytis [3][8]. FRAP tyrimui reikalinga rūgštinė pH 3,6 terpė, naudojamas geležies ir 2,4,6-tripyridyl-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ kompleksas, tuo tarpu CUPRAC vykdomas pH 7,0 terpėje naudojant dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) kompleksą. FRAP absorbcijos pokytis matuojamas prie 593 nm, CUPRAC – prie 450 nm ilgio bangos [3][8][9]. Šie metodai pasižymi paprastumu, tačiau kaip ir ABTS ar DPPH metoduose skirtingiems bandiniams būdingi nevienodi reakcijų laikai [9][11].

Vienas iš metalų jonų chelatinių metodų – FIC metodas. Ferozinas su Fe2+

sudaro raudonos spalvos chelatinį kompleksą. Kai įvedama kitų chelatuojančių agentų, pavyzdžiui, polifenolių, toks kompleksas nesusidaro, nes Fe2+ jungiasi prie šių agentų, o ne prie ferozino [8].Taigi, nyksta raudona komplekso spalva, tirpalo absorbcijos pokytis matuojamas esant 562 nm bangos ilgiui [8][84]. Čia antioksidacinio aktyvumas grįstas junginių savybe prisijungiant Fe2+ užkirsti kelią šio jono dalyvavimui jau minėtoje Fentono reakcijoje [63][84].

5. TYRIMO METODIKA IR METODAI

5.1.

Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – natūraliai augančių siauralapių lubinų (Lupinus angustifolius L.) augalinės žaliavos. Jos buvo surinktos iš 22 skirtingų augaviečių, esančių šiaurės rytų, šiaurės vakarų, pietryčių, pietvakarių bei centriniame Lietuvos regionuose (7 pav.). Mėginiai surinkti masinio žydėjimo metu 2016 m. gegužės-birželio mėnesiais. Iš gamtinių cenopopuliacijų surinkti augalinės žaliavos mėginiai buvo suskirstyti į lapus, žiedus ir stiebus, taip buvo gauti trijų augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdžiai.

7 pav. L. angustifolius stiebų, lapų ir žiedų žaliavų (♦) rinkimo vietos gamtinėse cenopopuliacijose, 2016 m.

L. angustifolius augalų žaliavos rinktos iš natūralių augaviečių šiose Lietuvos vietose: Kėdainiai (Kėdainių r.sav), Pageluvis (Šiaulių r.sav.), Bijotė (Šiaulių r.sav.), Šiluva (Raseinių r.sav.), Cigonaliai (Kretingos r.sav.), Kuršėnai (Šiaulių r.sav.), Luokė (Telšių r.sav.), Darbėnai (Kretingos r.sav.), Giedraičiai (Molėtų r.sav.), Molėtai (Molėtų r.sav.), Pašušvys (Radviliškio r.sav.), Baisogala (Radviliškio r.sav.), Aukštadvaris (Trakų r.sav.), Vencavai (Utenos r.sav.), Tarprubežiai (Kalvarijos sav.), Žagarė (Joniškio r.sav.), Kudirkos Naumiestis (Šakių r.sav.), Preila (Neringos sav.), Nida (Neringos sav.), Jurbarkas (Jurbarko r.sav.), Druskininkai (Druskininkų sav.), Birštonas (Birštono sav.).

Surinktos L. angustifolius žaliavos džiovintos gerai vėdinamoje, sausoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje, 30-35 °C temperatūroje jas paskleidus plonu sluoksniu ir periodiškai vartant.

5.2. Naudotos medžiagos ir reagentai

Tyrimams naudoti analitinio švarumo reagentai: ferozinas (≥97,0%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, JAV), metenaminas (≥99,5%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Rusija), natrio karbonatas (99,5-100,5%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Prancūzija), aliumino chlorido heksahidratas (≥95%) ir acto rūgštis (100%)(Carl Roth GmbH, Vokietija), galo rūgšties monohidratas (≥98,0%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Kinija), Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (2M)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Šveicarija), bevandenis geležies (II) chloridas (99,5%) ir DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) (95%) radikalas (Alfa Aesar GmbH & Co, Vokietija), rutino hidratas (≥94%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono)) rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Kanada), kalio persulfatas (SIAL, Kanada), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksi rūgštis) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, JAV), analitinio švarumo natrio nitritas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatas (≥ 99%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis (37%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio šarmas (99%)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), etanolis (96%) (V/V) (UAB „Stumbras“, Lietuva), išgrynintas vanduo.

Bandinių ekstrakcijos sąlygoms optimizuoti bei bandinių ekstrakcijai atlikti naudota ultragarso vonelė „ElmaSonic S40H“ (Elma Schmidbauer GmbH, Vokietija), orbitalinė kratyklė „IKA®KS 130 basic (Vokietija). Spektrofotometrinei analizei naudoti spektrofotometrai „Genesys 2“ (Spectronic, JAV) bei „Agilent Cary 60“ (Agilent Technologies, USA).

5.3.

Tyrimų metodai

5.3.1. L. angustifolius žaliavų ekstraktų paruošimas

Siauralapių lubinų (Lupinus angustifolius L.) žaliavos sumaltos elektriniu smulkintuvu. Etanoliniai ekstraktai ruošiami atsveriant tikslų kiekį 0,100 g žaliavos, užpilant ją 10 ml 80% (V/V) etanolio-vandens tirpalu (1:100). Ekstraktai ultragarsinėje vonelėje veikiami 15 min., esant 50°C temperatūrai. Po to ekstraktai filtruojami į matavimo cilindrus naudojant popierinius filtrus. Likutis ant filtro praplaunamas 80% (V/V) etanoliu iki 10 ml. Iš kiekvienos žaliavos pagaminami 2 mėginiai, o iš viso pagaminti 132 ekstraktai.

5.3.2. Reagentų paruošimas

80 proc. (V/V) etanolio-vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 760 ml 96% (V/V) etanolio ir 240 ml išgryninto vandens.

0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas matavimo kolboje 10 ml Folin-Ciocalteu fenolinio reagento (2M) skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

7,5% (W/V) Na2CO3 tirpalas ruošiamas 7,5 g bevandenio Na2CO3 ištirpinant 100 ml išgryninto vandens.

33% acto rūgšties tirpalas paruošiamas 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties praskiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

10% aliuminio chlorido tirpalas paruošiamas 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

5% metenamino tirpalas paruošiamas 2,5 g analitinio grynumo metenamino ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

Rutino etanolinis tirpalas ruošiamas 0,025 g tiksliai atsverto 99% grynumo rutino ištirpinant 25 ml 80% (V/V) etanolio tirpalo.

6×10-5

M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas ruošiamas tiksliai atsveriant 0,00118 g chemiškai švaraus DPPH reagento ir jį ištirpinant 50 ml 96% (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas

kiekvieną kartą ruošiamas iš naujo ir laikomas tamsaus stiklo butelyje, kad būtų apsaugotas nuo saulės spindulių.

ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių tirpinama 50 ml išgryninto vandens, pridedama 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 15-16 val. Motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS•+ tirpalą.

2 mM FeCl2 tirpalas ruošiamas tiksliai atsveriant 0,0063 g chemiškai gryno FeCl2 ir jį ištirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas.

5 mM ferozino tirpalas paruošiamas tiksliai atsveriant 0,0616 g ferozino ir jį ištirpinant 25 ml išgryninto vandens.

0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas gaminamas atmatuojant 42 ml 37% vandenilio chlorido rūgšties ir ją maišant su išgrynintu vandeniu iki 1 litro.

Praskiestas natrio šarmo tirpalas gaminamas pasveriant tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį, kuris ištirpinamas išgrynintame vandenyje ir praskiedžiamas iki 100 ml.

Arnow reagentas gaminamas pasveriant tikslų 10,000 g natrio molibdato kiekį, ištirpinant jį 70-80 ml išgryninto vandens. Pasveriamas tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris ištirpinamas gautame tirpale ir praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

5.3.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti augalinėje žaliavoje buvo naudojamas spektrofotometrinis metodas naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Imamas 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100) ir sumaišoma su 5 ml 0,2 Folin-Ciocalteu reagento. Praėjus 3 min. įpilama 4 ml 7,5% (W/V) Na2CO3 tirpalo. Optinis tankis matuojamas po 60 min. esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo. Kiekvienas ekstraktas tiriamas po 3 kartus.

Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GRE) remiantis kalibracine kreive (8 pav.) naudojant formulę:

GRE (mg/ml) = c x V/m; c – galo rūgšties koncentracija, mg/ml; V – pagaminto ekstrakto tūris, ml; m – atsvertas žaliavos kiekis, g.

Galo rūgšties kalibracinė kreivė sudaroma 96% (V/V) etanolyje paruošiant etaloninius galo rūgšties tirpalus (8 pav.).

8 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė. (n=2)

5.3.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas tiriamąjį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido ir metenamino tirpalais acto rūgštimi parūgštintoje aplinkoje.

Vienam analizės bandymui iš kiekvieno ekstrakto gaminama po du tirpalus – tiriamąjį ir lyginąmajį. Tiriamasis tirpalas gaminamas 25 ml kolbutėje maišant 1 ml tiriamo ekstrakto (1:100), 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5% metenamino tirpalo. Kolbutės turinys praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės, sumaišoma. Absorbcijos dydis matuojamas po 30 min. esant 407 nm bangos ilgiui. Lyginamuoju tirpalu naudojamas tirpalas, paruoštas 25 ml matavimo kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100) su 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo. Kolbutės turinys skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Kiekvienas ekstraktas tiriamas po 3 kartus.

Duomenys įvertinami gautą absorbcijos koeficiento dydį lyginant su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu. Etaloninio tiriamojo ir palyginamojo rutino tirpalo paruošimas vykdomas vietoje 1 ml ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Etaloninis rutino tirpalas ruošiamas 0,05 g rutino tirpinant 96% (V/V) etanolio 100 ml talpos kolboje.

Bendras flavonoidų kiekis perskaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g remiantis formule:

y = 11,45x - 0,0158 R² = 0,9896 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 A b so rb ci ja

X (mg/g) = mR x A x V

m x AR x VRx 1000 ;

mR – rutino masė, g, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti;

A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – pagaminto ekstrakto tūris, ml;

m – atsvertas žaliavos kiekis, g;

AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;

VR – etaloninio rutino tirpalo tūris, ml.

5.3.5. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Vienam analizės bandymui iš kiekvieno ekstrakto gaminama po du tirpalus – tiriamąjį ir lyginamąjį. Tiriamasis tirpalas gaminamas kolbutėje maišant 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, dedant 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedžiant išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišant. Gauto tirpalo absorbcija matuojama esant 525 nm bangos ilgiui.

Lyginamuoju tirpalu naudojamas tirpalas, paruoštas kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedžiant išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišant. Kiekvienas ekstraktas tiriamas po 3 kartus.

Bendras procentinis fenolio rūgščių kiekis ekstrakte perskaičiuojamas chlorogeno rūgštimi remiantis formule:

X (%) = A x 5,3

m

;

A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis;; m – atsvertas žaliavos kiekis, g.

5.4.

L. angustifolius žaliavų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas

5.4.1. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas grįstas elektronų perdavimo reakcijomis. 50 μl tiriamojo ekstrakto (1:100) kvarcinėje kiuvetėje sumaišoma su 2 ml 6x10-5 M DPPH tirpalo. Tuščias bandinys ruošiamas 50 μl 80% (V/V) vandeninio etanolio tirpalo sumaišant su 2 ml 6x10-5 M DPPH tirpalo. Spektrofotometru išmatuojami mėginių absorbcijos dydžio mažėjimai esant

515 nm bangos ilgiui, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 25 min.). Kiekvienas ekstraktas tiriamas po 3 kartus.

Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:

DPPH surišimas = Ab− Aa

Ab

x 100 % ;

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (po 25 min.);

Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t= 0 min.).

5.4.2. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS

radikalų - katijonų surišimo

metodu

Antiradikalinio aktyvumo įvertinimui taikomas 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgšties radikalo sujungimo metodas. Sveriama 0,0548 g (tikslus kiekis) ABTS reagento, jis tirpinamas 50 ml išgryninto vandens tamsaus stiklo buteliuke. Taip pagaminamas 2mM motininis ABTS tirpalas. Šis tirpalas aktyvuojamas įdedant kalio persulfato, kruopščiai sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje 15-16 val. Darbinis ABTS•+ tirpalas ruošiamas praskiedus motininį tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 ±0,03 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.

Augalinių žaliavų etanolinių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas matuojamas į 3,0 ml darbinio ABTS•+ tirpalo įpilant 30 μl tiriamojo ekstrakto. Mišinys 60 min. laikomas kambarioje temperatūroje. Absorbcijos kitimas nustatomas esant 734 nm bangos ilgiui. Kiekvienas ekstraktas matuojama po 3 kartus.

Laisvųjų radikalų surišimo geba (antiradikalinis ekstraktų aktyvumas) įvertinama išreiškiant trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos:

TE(ABTS) = c x V

m ;

c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (μmol/l); V – paruošto ekstrakto tūris, ml;

m – atsvertas žaliavos kiekis, g.

Antiradikaliniam aktyvumui išreikšti naudojamas standartinis antioksidantas troloksas. Vykdoma jo kalibracija: sveriamas tikslus trolokso kiekis (g), tirpinama 80% (V/V) etanolio-vandens tirpale, pagaminami 6 skirtingų koncentracijų trolokso tirpalai (400-8000 μmol/l). Kalibracinė kreivė sudaroma 3,0 ml darbinio ABTS•+ tirpalo maišant su 30 μl kiekvienos koncentracijos trolokso tirpalu. Mišiniai laikomi kambario temperatūroje po 60 min. Tirpalų absorbcijos kitimas nustatomas esant 734

nm bangos ilgiui, kiekvienas tirpalas tiriamas po 3 kartus. Gauta trolokso kalibracinė kreivė pavaizduota 9 pav.

9 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu. (n=2)

5.4.3.

Chelatinio aktyvumo įvertinimas FIC metodu

FIC metodas grįstas chelatinėmis ekstraktų savybėmis, kai matuojamas Fe (II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimas esant 562 nm bangos ilgiui. Į 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:200) dedama 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo ir gerai sumaišoma. Įdedama 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo, gerai sumaišoma ir paliekama 10 min. Mišinio absorbcija matuojama esant 562 nm ilgio bangai. Tuščio bandinio ruošimas: į 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:200) dedama 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo ir 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo. Kiekvieno bandinio absorbcija matuojama po 3 kartus. Palyginamasis tirpalas – 80% (V/V) vandeninis etanolio tirpalas.

Ekstrakto chelatinės savybės išreiškiamos procentais ir apskaičiuojamos pagal formulę:

Fe+2 sujungimas = Ab− Aa

Ab

x 100 % ;

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis;

Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis.

y = 0,0001x + 0,0905 R² = 0,9788 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 A b so rb ci ja

5.5.

Duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė ir duomenų grafinis atvaizdavimas atlikti Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV) kompiuterine programa bei SPSS 20 (IBM, JAV) statistiniu paketu. Visi tyrimai kartoti po 3 kartus ir išvestas gautų rezultatų matematinis vidurkis. Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuotas vidurkis, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida ir variacijos koeficientas. Tiesinės regresijos modelio tinkamumui apskaičiuotas determinacijos koeficientas R2

. Taip pat atliktas koreliacinių ryšių įvertinimas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05, todėl rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, jei p<0,05.

6. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

6.1.

Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Prieš kokybiškai bei kiekybiškai tiriant augalinėse žaliavose esančius junginius labai svarbu tinkamai atlikti jų ekstrakciją. Pagrindiniai ekstrakcijos efektyvumą lemiantys faktoriai yra tirpiklis ir jo poliškumas, ekstrakcijos trukmė bei temperatūra. Literatūroje metanolis ir etanolis minimi kaip dažniausiai polifenolių ekstrakcijai naudojami tirpikliai, taip pat naudojamas acetonas, etilo acetatas bei įvairios jų kombinacijos [20]. Etanolis mažiausiai pavojingas žmogaus sveikatai, taip pat jis tinkamas įvairių struktūrų polifenolių ekstrakcijai [16][20]. Atsižvelgiant į tai, šiam darbui atlikti pasirinktas etanolio ir vandens mišinys. Literatūroje aprašytuose L. angustifolius augalų tyrimuose fenolinių junginių ekstrakcijai iš žaliavų naudoti metanolio, acetono bei etanolio mišiniai su vandeniu [59][74].

Toliau aptariama, kokio poliškumo etanolio-vandens mišinys, ekstrakcijos trukmė bei temperatūra buvo tinkamiausia fenolinių junginų ekstrakcijai iš siauralapių lubinų augalų žaliavų.

6.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas

L. angustifolius žaliavų ekstrakcija atlikta paprastosios maceracijos būdu. Ekstraktams gaminti naudoti 40%, 50%, 60%, 70% ir 80% (V/V) vandeniniai etanolio tirpalai. Naudota masinio žydėjimo metu rinkta antžeminė L. angustifolius žaliava. Pasirinktas žaliavos ir ekstrahento santykis 1:100. Atsveriamas tikslus 0,100 g žaliavos kiekis užpilamas 10 ml atitinkamos koncentracijos ekstrahento. Kiekvienas ekstraktas 60 min. purtomas orbitalinėje kratyklėje ir 24 val. paliekamas stovėti tamsoje. Vėliau ekstraktai pakartotinai 60 min. purtomi kratyklėje, o po to filtruojami pro popierinius filtrus. Fenolinių junginių kiekiui nustatyti palyginamuosiuose ekstrakcijos tyrimuose pasitelktas Folin–Ciocalteu metodas. Fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentais. Rezultatai pateikti 10 pav.

10 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas L. angustifolius masinio žydėjimo antžeminės augalo dalies mėginiuose paprastosios maceracijos metodu. (n=2)

Grafike matoma tiesioginė priklausomybė tarp etanolio koncentracijos vandeniniame etanolio tirpale bei išekstrahuoto bendro fenolinių junginių kiekio. Didėjant etanolio koncentracijai etanolio-vandens mišinyje, išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis nuosekliai didėjo. Didžiausias bendras fenolinių junginų kiekis nustatytas ekstrakciją vykdant su 80% (V/V) etanolio-vandens mišiniu (12,211 ± 0,180 mg/g). Šio poliškumo ekstrahentas ir buvo pasirinktas tolimesniems tyrimams.

6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas

Ekstrakcijos ultragarsu laiko parinkimui naudota ultragarso vonelė, 80% (V/V) vandeninis etanolio tirpalas bandinių ekstrakcijai (1:100) bei masinio žydėjimo metu rinkta antžeminė siauralapių lubinų žaliava. Bandiniai veikti ultragarsu 5, 10, 15, 20 bei 25 min, esant 30 ± 5°C temperatūrai. Gauti rezultatai apibendrinami 11 pav.

9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5 13 40 50 60 70 80 G R E, m g/m l

11 pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės įvertinimas ultragarso vonelėje naudojant 80% (V/V) etanolinius L. angustifolius masinio žydėjimo antžeminės augalo dalies mėginius. Temperatūra – 30

± 5°C. (n=2)

Tyrimai parodė, jog ekstrakcijos trukmei didėjant nuo 5 iki 15 min., didėjo ir išekstrahuotas fenolinių junginių kiekis, o ekstrakcijos trukmę nuo 15 min. didinant iki 25 min., bendras fenolinių junginių kiekis palaipsniui mažėjo. Ektrakcijos laikui didėjant, išskirtų polifenolių kiekis mažėti gali dėl ultragarso bangų sukelto polinės tirpiklių sistemos perkaitimo, sukeliančio tirpale esančių fenolinių junginių skilimą [70].Naudojant ultragarsinę ekstrakciją išekstrahuotas didesnis medžiagų kiekis nei maceracijos būdu (atitinkamai 13,902 ± 0,458 mg/g ir 12,211 ± 0,180 mg/g) bei gerokai sutrumpėjo ekstrakcijos trukmė – nuo 26 val. iki 15 min. Atsižvelgiant į gautus rezultatus 15 min. ekstrakcijos trukmės intervalas leido išskirti didžiausią fenolinių junginių kiekį, todėl jis pasirinktas tolimesniems tyrimams.

6.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros parinkimas

Efektyviai fenolinių junginių ekstrakcijai ultragarsu užtikrinti svarbu optimizuoti temperatūrinį režimą. Tyrimui naudota ultragarso vonelė, 80% (V/V) vandeninis etanolio tirpalas bandinių ekstrakcijai (1:100) bei masinio žydėjimo metu rinkta antžeminė siauralapių lubinų žaliava. Ekstrakcijos trukmė – 15 min. Vertintas išskirtas fenolinių junginių kiekis esant skirtingoms temperatūroms – 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C ± 5°C. Gauti rezultatai pateikti 12 pav.

12 12,5 13 13,5 14 14,5 5 10 15 20 25 G R E, m g/ g