PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ursolo rūgšties poveikis astroglijos ląstelių kultūroms“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Evelina Gudoitytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-06 Evelina Gudoitytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Siūlau Evelinos Gudoitytės paruoštą magistro baigiamąjį darbą teikti gynimui.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020-05-08 Julius Liobikas
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
EVELINA GUDOITYTĖ
URSOLO RŪGŠTIES POVEIKIS ASTROGLIJOS LĄSTELIŲ
KULTŪROMS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Julius Liobikas
Konsultantas
Dr. Silvija Jankevičiūtė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė
Data
URSOLO RŪGŠTIES POVEIKIS ASTROGLIJOS LĄSTELIŲ
KULTŪROMS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantas
Dr. Silvija Jankevičiūtė
Data
Darbo vadovas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Astroglija: struktūra ir funkcijos ... 10
1.1.1. Astrocitų struktūra ... 10
1.1.2. Astrocitams būdingi metaboliniai procesai ... 11
1.1.3. Astrocitų dalyvavimas adaptacinėse reakcijose ... 12
1.2. Glioma ... 13
1.2.1. Glioblastoma (GBM) ... 13
1.2.2. Molekuliniai ir metaboliniai GBM pokyčiai ... 14
1.2.3. Neištirti GBM aspektai ... 15
1.3. Ursolo rūgštis (UR) ... 17
1.3.1. UR cheminė struktūra ... 17
1.3.2. UR bioprieinamumas ir farmakokinetika ... 18
1.3.3. Gamtiniai UR šaltiniai ... 20
1.3.4. UR priešvėžinis poveikis ... 20
1.3.5. UR toksiškumas ... 22
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.2. Reagentai ir aparatūra ... 23
2.3. Metodai ... 25
2.3.1. Ląstelių kultivavimas ... 25
2.3.2. Ląstelių paruošimas UR poveikio tyrimui ... 25
2.3.3. Ląstelių metabolinio aktyvumo nustatymas MTT metodu ... 26
2.3.4. Ląstelių gyvybingumo nustatymas fluorescencinės mikroskopijos metodu ... 27
2.3.5. Ląstelių autofagijos nustatymas taikant dažymą akridino oranžiniu (AO) ... 28
2.3.6. Liuminometrinis viduląstelinio ATP koncentracijos nustatymas ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
3.1. UR poveikis C6 ir Astro ląstelių metaboliniam aktyvumui ... 31
3.2. UR poveikis C6 ir Astro ląstelių gyvybingumui ... 33
3.3. C6 ir Astro ląstelių morfologiniai ir skaičiaus pokyčiai po poveikio UR ... 34
3.4. UR poveikis autofagijai C6 ir Astro ląstelėse ... 36
3.5. UR įtaka C6 ir Astro ląstelių ATP koncentracijai ... 38
IŠVADOS ... 40
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
SANTRAUKA
E. Gudoitytės magistro baigiamasis darbas „Ursolo rūgšties poveikis astroglijos ląstelių kultūroms“. Mokslinis vadovas – doc. dr. Julius Liobikas, konsultantas – dr. Silvija Jankevičiūtė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorija. Kaunas, 2020.
Darbo tikslas: ištirti astroglijos ląstelių (C6 gliomos ir WT-iAstro astrocitų) atsaką į poveikį ursolo rūgštimi (UR).
Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti UR poveikį gliomos ląstelių ir astrocitų metaboliniam aktyvumui in vitro. 2. Nustatyti UR poveikį gliomos ląstelių ir astrocitų gyvybingumui in vitro. 3. Įvertinti UR poveikį autofagijos procesui gliomos ląstelėse ir astrocituose in vitro. 4. Nustatyti gliomos ląstelių ir astrocitų ATP koncentracijos pokyčius in vitro po poveikio UR.
Metodai. UR poveikis buvo tiriamas naudojant C6 žiurkių gliomos ir WT-iAstro pelių astrocitų (Astro) ląstelių linijas. Ląstelių metabolinio aktyvumo pokyčiai buvo nustatomi MTT metodu. UR poveikis ląstelių gyvybingumui ir autofagijos procesui buvo tiriamas fluorescencinės mikroskopijos metodu, ląsteles dažant Hoechst ir propidžio jodido ar akridino oranžinio dažais, atitinkamai. Viduląstelinio ATP koncentracijai nustatyti taikytas liuminometrijos metodas.
SUMMARY
E. Gudoitytė Master thesis „Effects of ursolic acid on astroglial cell cultures“. Scientific supervisor – doc. dr. Julius Liobikas, consultant – dr. Silvija Jankevičiūtė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Neuroscience Institute, Laboratory of Biochemistry. Kaunas, 2020.
The aim: to investigate the response of astroglial cells (C6 glioma and WT-iAstro astrocytes) to ursolic acid (UA) treatment.
The objectives: 1. To determine the effect of UA on metabolic activity of glioma cells and astrocytes in vitro. 2. To determine the effect of UA on viability of glioma cells and astrocytes in vitro. 3. To evaluate the impact of UA on the process of autophagy in glioma cells and astrocytes in vitro. 4. To determine the changes of ATP concentration in glioma cells and astrocytes in vitro after treatment with UA.
Methods. The effects of UA were examined in C6 rat glioma and WT-iAstro mouse astrocyte (Astro) cell lines. The changes in metabolic activity were determined using MTT method. Fluorescent microscopy was employed to investigate the impact of UA on cell viability and autophagy process by staining the cells with Hoechst and propidium iodide or acridine orange respectively. Intracellular ATP concentration was tested by luminometric assay.
SANTRUMPOS
AMPK AO ATP AUC CNS DMEM DMSO DNR FBS GBM HBSS HEB IC50 IDH JNK KoA MKN MPTP mTOR MTT NADPH NF-κB PI PSO ROS TMZ UR URLnuo adenozino 5`-monofosfato priklausoma baltymų kinazė akridino oranžinis
adenozino 5`-trifosfatas
plotas po kreive (angl. area under the curve) centrinė nervų sistema
Dulbecco modifikuota Eagle terpė (angl. Dulbecco`s Modified Eagle Medium) dimetilsulfoksidas
deoksiribonukleorūgštis
fetalinis jaučio serumas (angl. fetal bovine serum) glioblastoma
Henkso subalansuotas druskų tirpalas (angl. Hank`s Balanced Salt Solution) hematoencefalinis barjeras
koncentracija, sukelianti 50 proc. atsaką izocitrato dehidrogenazė
c-Jun N-galo kinazė (angl. c-Jun N-terminal kinase) kofermentas A
monokarboksilatų nešiklis
mitochondrijų nespecifinio laidumo pora (angl. mitochondrial permeability transition pore)
žinduolių rapamicino taikinys (angl. mammalian target of rapamycin) 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas
nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas, redukuotas branduolio veiksnys κB (angl. nuclear factor κB) propidžio jodidas (angl. propidium iodide) Pasaulio sveikatos organizacija
aktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) temozolomidas
ursolo rūgštis
ĮVADAS
Augalų vartojimas tradicinėje medicinoje ir neginčijama augalinės mitybos nauda sveikatai – svarus įrodymas, kad fitocheminiai junginiai pasižymi biologiniu aktyvumu ir mažu toksiškumu (1,2). Todėl augalai yra svarbus naujų terapinių molekulių šaltinis, ypač ieškant alternatyvių strategijų modifikuoti patologinius procesus, susijusius su vėžinėmis bei kitomis lėtinėmis ligomis. Vienas iš perspektyvių, plačiai tyrinėjamų junginių yra ursolo rūgštis (UR) – pentaciklis triterpenoidas, randamas kinų ir Vakarų medicinoje vartojamuose vaistiniuose augaluose, bei vaisiuose ir uogose (3–6).
Yra žinoma, kad UR pasižymi priešuždegiminėmis ir antioksidacinėmis savybėmis, nustatytas antibakterinis, priešvirusinis ir priešvėžinis poveikis (4,6,7). Visgi, tikslus UR veikimo mechanizmas nėra aiškus: ji gali moduliuoti daugelį signalinių kelių, susijusių su ląstelių proliferacija, žūtimi, metabolizmu, citokinų sekrecija, invazija ir kt. (4,5), pastebėta UR įtaka epigenetinėms modifikacijoms (8). Būtent veikdama kompleksiškai ši medžiaga sutrikdo pakitusią vėžinių ląstelių homeostazę, todėl slopina naviko vystymąsi ir ligos progresavimą. Dabartinių priešvėžinių vaistų veiksmingumas dažnai yra nepakankamas, atsiranda vėžinių ląstelių atsparumas terapijai, kurios taikiniai dažniausiai yra apoptozės procese dalyvaujantys baltymai. Tuo tarpu UR veikia mitochondrijų funkciją (9,10), metabolinį glikolizės kelią (11) bei autofagiją (3,5). Daugėja tyrimų, kuriuose UR derinant su kitais priešvėžiniais vaistais, ląstelės sensitizuojamos ir vaistų poveikis pagerinamas (3).
DARBO TIKLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti astroglijos ląstelių (C6 gliomos ir WT-iAstro astrocitų) atsaką į poveikį ursolo rūgštimi.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti ursolo rūgšties poveikį gliomos ląstelių ir astrocitų metaboliniam aktyvumui in vitro. 2. Nustatyti ursolo rūgšties poveikį gliomos ląstelių ir astrocitų gyvybingumui in vitro.
3. Įvertinti ursolo rūgšties poveikį autofagijos procesui gliomos ląstelėse ir astrocituose in vitro.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Astroglija: struktūra ir funkcijos
Nervinis audinys yra sudėtinga ir iki galo neištirta sistema, sudaryta iš pagrindinių dviejų ląstelių tipų – neuronų ir glijos (16,17). Neuronai generuoja veikimo potencialus bei perduoda signalus sinapsėse (17), tačiau kad galėtų vykdyti šias specifines funkcijas, jie turi būti efektyviai aprūpinami metaboliniais substratais (16–20). Daugėja įrodymų, kad normalus CNS funkcionavimas priklauso ne tik nuo neuronų, bet ir nuo glijos bei jų tarpusavio ryšių. Glija skirstoma į tris pagrindinius tipus: astrogliją, oligodendrogliją ir mikrogliją (16). Astrocitai, kurie sudaro astrogliją, yra pati gausiausia ląstelių grupė žmogaus smegenyse (apie 40 proc.) (20,21), o smegenų žievėje jų daugiau nei neuronų (19). Tai liudija, kad astrocitai yra ne vien struktūrinės, bet ir specializuotos reguliacinės, apsauginės nervų sistemos ląstelės (16–18).
1.1.1. Astrocitų struktūra
Astrocitai savo struktūra yra heterogeniška ląstelių grupė (18,21), tačiau atitinka šiuos kriterijus: yra nejautrūs elektriniams impulsams; turi labai neigiamą membranos potencialą, astrocitams specifinius glutamato, γ-aminosviesto rūgšties nešiklius, tarpinius citoskeleto filamentus; kaupia glikogeną; turi ataugų; sudaro plyšines jungtis (18,22). Astrocitų žvaigždiška forma (1 pav., raudona spalva), kurią lemia daug plonų ataugų, leidžia jiems užimti unikalią anatominę padėtį – vienos ataugos supa kraujagysles, o kitos sudaro kontaktus su neuronais sinapsėse (16,18,19). Tokiu būdu suformuojami dalinai autonominiai nerviniai-kraujagysliniai vienetai – struktūros, kurios reguliuoja medžiagų pernašą iš kraujotakos priklausomai nuo sinapsinio aktyvumo (17,18). Taigi, astrocitai yra viena iš HEB sudedamųjų dalių, susiejanti kraujotakos intensyvumą su informacijos perdavimu (18).
1 pav. Fluorescencinė astroglijos nuotrauka. Raudona spalva – glijos
fibrilinis rūgštinis baltymas (astrocitų žymuo); žalia spalva – koneksinas 30 (plyšinių jungčių žymuo); mastelis – 25 μm.
1.1.2. Astrocitams būdingi metaboliniai procesai
Daugiausiai energijos reikalaujantys procesai vyksta neuronuose, tačiau jie neturi tiesioginio ryšio su smegenų kraujagyslėmis. Tuo tarpu 99 proc. kapiliarų paviršiaus supa astrocitų ataugos (19). Nustatyta, kad šie du ląstelių tipai turi skirtingus metabolinius fenotipus: neuronams būdingas didelis oksidacinio fosforilinimo, o astrocitams – glikolizės aktyvumas (16,20). Astrocitams būdingi fermentai, kurių nėra neuronuose, pavyzdžiui, piruvato dehidrogenazės kinazė 4 (23). Lemiamą reikšmę turi skirtingas monokarboksilatų nešiklių (MKN) giminingumas laktatui: astrocitų mažas, o neuronų – didelis (16,23). Taigi, ląstelės yra specializuotos vykdyti koordinuotą gliukozės metabolizmą, kurį aiškina astrocitų-neuronų laktato pernašos hipotezė (2 pav.) (16). Pagal ją, didžiąją dalį gliukozės, gaunamos su krauju, pasisavina astrocitai. Gliukozė yra oksiduojama iki piruvato, kuris verčiamas laktatu ir tuomet tiekiamas neuronams per MKN. Neuronų laktato dehidrogenazė katalizuoja atvirkštinę reakciją ir susidaręs piruvatas toliau metabolizuojamas Krebso cikle, o redukuotuose nukleotiduose sukaupta energija panaudojama ATP sintezei (16,18–20,23). Tyrimų su radioaktyviais žymenimis metu nustatyta, kad neuronuose gliukozė yra panaudojama pentozių fosfatų kelyje generuojant NADPH, kuris reikalingas apsaugai nuo oksidacinio streso (23). Be to, smegenyse nėra angliavandenių atsargų, išskyrus glikogeną, sintetinamą ir kaupiamą tik astrocituose. Esant hipoglikeminėms sąlygoms glikogenas taip pat suskaidomas iki laktato ir panaudojamas neuronuose (19). Taigi, laktatas yra pagrindinis neuronų energetinis substratas, o astroglija – esminis metabolizmo partneris (23).
2 pav. Astrocitų-neuronų laktato pernašos hipotezė ir glutamino-glutamato ciklas. GLUT – gliukozės
nešiklis; MKN – monokarboksilatų nešiklis; GLT – glutamato nešiklis; LDH – laktato dehidrogenazė; PPP – pentozių fosfatų kelias; ADP – adenozino 5`-difosfatas; ATP – adenozino 5`-trifosfatas; NADPH –
Astroglijos, kaip ir visos nervų sistemos, metabolizmas prisitaiko prie nervinio aktyvumo. Astrocitai reaguoja į neuronų išskirtą glutamatą (16). Glutamatas iš sinapsinio plyšio į astrocitus patenka antrinės aktyviosios pernašos būdu, t.y. vykstant sąnašai su Na+. Dėl to aktyvinamas Na+/K+ siurblys, o
kartu ir ATP sintezė, susijusi su gliukozės pasisavinimo ir laktato sintezės padidėjimu. Svarbu tai, kad glutamatas astrocituose metabolizuojamas susidarant glutaminui, kuris grąžinamas neuronams (2 pav.) ir tik maža glutamato dalis α-ketoglutarato pavidalu patenka į Krebso ciklą (19,23,25). Užląstelinio K+ koncentracijos padidėjimas aktyvina astrocitų glikolizę (25), azoto monoksidas slopina mitochondrijų elektronų pernašos grandinės IV kompleksą (23,25). Šie pokyčiai astroglijoje lemia aerobinės glikolizės suintensyvėjimą, kuris nustatomas smegenyse nervinės stimuliacijos metu. Įdomu tai, kad aerobinė glikolizė yra laikoma viena iš naviko charakteristikų, t.y. patologiniu pakitimu. Astrocitų atžvilgiu tai taip pat energetiškai neefektyvus procesas, tačiau turintis fiziologinę reikšmę: suaktyvėjus glikolizei astrocituose, sintetinamas laktatas, tačiau neeikvojamas deguonis, todėl neuronai yra aprūpinami oksidaciniam fosforilinimui reikalingomis medžiagomis (25).
Nervinis audinys geba naudoti ir kitus metabolinius substratus – riebalų rūgštis ir ketoninius kūnus, kuriems laidus HEB (19). Nesutariama, kiek tai reikšminga, tačiau astrocitai gali patenkinti dalį energijos poreikio oksiduodami riebalų rūgštis bei ketoninius kūnus Krebso cikle (16,19). Ketoninių kūnų metabolizmą reguliuoja nuo AMP priklausoma kinazė (AMPK), kuri aktyvinama esant energijos trūkumui. Astrocitai – vienintelės smegenų ląstelės, kuriose įmanomas šis alternatyvus metabolinis kelias (20). Kadangi ketoninių kūnų metabolizmas iki acetil-KoA nepriklauso nuo piruvato dehidrogenazės komplekso (PDK), jis reikšmingas reperfuzijos po išemijos atveju, kai oksidacinis stresas inaktyvina PDK (19).
Dėl aktyvaus mitochondrijų oksidacinio metabolizmo, neuronuose neišvengiamai susidaro aktyviosios deguonies formos (ROS). Neuronų antioksidaciniai mechanizmai yra nepakankami, todėl reikalingas bendradarbiavimas su astrocitais. Nustatyta, kad astrocituose pentozių fosfatų kelias yra septynis kartus aktyvesnis nei neuronuose (19), todėl sudaromos sąlygos redukuoto glutationo sintezei astrocituose ir jo tiekimui neuronams (19,20,23).
1.1.3. Astrocitų dalyvavimas adaptacinėse reakcijose
astrocitai moduliuoja sinapsėmis sklindančių signalų trukmę ir intensyvumą (16,18). Per plyšines jungtis jie perduoda informaciją kitoms glijos ląstelėms bei kraujagyslių endoteliui (22). Išskirdami citokinus, astrocitai reguliuoja komplemento sistemos baltymų raišką mikroglijoje, todėl vaidina svarbų vaidmenį sinapsių genėjime, o dėl kamieninių ląstelių savybių netgi gali turėti įtakos neuronų skaičiui (17).
Astrogliozė – tai reakcija į nervų sistemos pažeidimus, tokius kaip smegenų trauma, išemija, kraujavimas, epilepsija ar Alzheimerio liga. Astrocitų proliferacija yra svarbus apsauginis mechanizmas, užtikrinantis neuronų maitinimą, pažeistos vietos izoliavimą, HEB atkūrimą, rando suformavimą ir kt. Kita vertus, užsitęsusi ar nekontroliuojama astrogliozė skatina uždegimą ir prisideda prie neurodegeneracinių ligų vystymosi (17). Jų metu nustatomas astrocitų remodeliavimas, atrofija ar metabolizmo pakitimai rodo, kad pažeidus astrogliją sutrinka visos CNS funkcija (17,18).
1.2. Glioma
Glioma – tai CNS navikas, išsivystantis iš glijos ląstelių (13,26,27). Tai dažniausias iš visų CNS navikų, nors apskritai yra gana retas – pasireiškia 5 iš 100 tūkst. suaugusiųjų per metus (13). Glioma apima labai įvairius navikus, kurių diagnozė ir klasifikacija remiasi histologine analize, tačiau į atnaujintą PSO CNS navikų klasifikaciją (2016 m.) buvo įtraukti ir molekuliniai žymenys (28). Pagal naviko vystymąsi, invazyvumą ir tikėtiną gyvenimo trukmę glioma skirstoma į keturis piktybiškumo lygius (13,27). I lygio glioma yra lokalizuota, daugiausia nepiktybinė (27). II-III lygio glioma yra difuzinė ir piktybinė, o pati pavojingiausia yra IV lygio astrocitoma, kuriai priskiriama glioblastoma (26–28).
1.2.1. Glioblastoma (GBM)
nėra išsamiai charakterizuota, pasižymi didele įvairove viename navike, todėl kiekvienas atvejis yra unikalus. Dar daugiau, išgyvenamumo mediana diagnozavus pirminę GBM ir taikant standartinį gydymą yra tik iki 15 mėn. (13,27,28), be to, atkryčiai yra neišvengiami (30).
Šiuo metu standartinis GBM gydymas – chirurginė intervencija, radioterapija ir alkilinantis chemoterapinis vaistas temozolomidas (TMZ). Gydymo neefektyvumą lemia GBM infiltravimasis normaliame audinyje, o chemoterapijos vystymą apsunkina HEB. Vienintelis naujas vaistas, indikuotinas GBM – angiogenezės slopiklis bevacizumabas, tačiau didelės apimties III fazės klinikiniuose tyrimuose nebuvo nustatyta teigiama jo įtaka pacientų išgyvenamumui. Taigi, vaistų nuo GBM vystymo pažanga, lyginant su kitomis vėžio formomis, yra labai maža (27).
1.2.2. Molekuliniai ir metaboliniai GBM pokyčiai
GBM patogenezės supratimas molekuliniame lygmenyje yra būtinas prognozuojant ligos eigą ir vystant individualizuotą gydymą (31). IDH geno mutacija, lemianti onkometabolito 2-hidroksiglutarato susidarymą, yra svarbus gliomagenezės žymuo, tačiau būdinga tik nedidelei daliai (12 proc.) GBM atvejų (27). TP53, koduojančio naviko supresorių p53, mutacija yra viena dažniausių įvairiuose navikuose, bet pirminėje GBM ji taip pat reta (27 proc.). Dažniau nustatomos ląstelės ciklo kontrolės genų ir TERT promotoriaus mutacijos (27,28). Taigi, GBM pasižymi netipišku genetiniu profiliu, todėl vaistai, veiksmingi kitose vėžio formose, gali neturėti poveikio.
Onkometabolizmas yra ne mažiau svarbus tyrimo objektas, nes yra įrodymų, kad būtent pakitęs metabolizmas ilgainiui lemia somatines mutacijas (32). Viena iš pagrindinių teorijų – Warburg efektas – teigia, kad naviko vystymosi priežastis yra aerobinė glikolizė kaip kompensacinė reakcija į pažeistą mitochondrijų elektronų pernašos grandinę. Tuomet gliukozė citoplazmoje metabolizuojama iki laktato, nepriklausomai nuo deguonies buvimo (29,32–34). Warburg efektas yra ryškus ir GBM: nustatyta mitochondrijų kristolizė, pakitęs kardiolipinas (33), sumažėjęs mitochondrijų elektronų pernašos grandinės baltymų (I-IV kompleksų) aktyvumas (35). Yra įvairių aiškinimų, kokie metaboliniai pokyčiai vyksta intensyviai proliferuojančiose vėžinėse ląstelėse, kad jos gebėtų patenkinti padidėjusius anabolinius ir energijos poreikius.
padidėjusio nukleorūgščių poreikio (11,33). Glikolizės metu susidarančio piruvato pagrindinis metabolinis kelias glioblastomoje – laktato susidarymas, kuris svarbus naviko vystymuisi ir migracijai (33,36). Pagal Chinopoulos ir Seyfried teoriją (33), vėžinių, tarp jų ir GBM, ląstelių energijos poreikį patenkina substratinis fosforilinimas mitochondrijose. Tai tiesioginis didžiaenergių ryšių susidarymas be tarpinio elektrocheminio gradiento (3 pav) (37). Galutinę reakciją katalizuoja sukcinil-KoA sintetazė, o jos substratas sukcinil-KoA gali susidaryti iš įvairių metabolitų, iš kurių svarbiausias – glutaminas. GBM modeliuose nustatyta, kad glutaminas būtinas nukleotidų, aminorūgščių bei glutationo sintezei. Dėl to GBM, kitaip nei normalioje astroglijoje, nevyksta glutamino-glutamato ciklas – ląstelės sekretuoja glutamatą, tokiu būdu skatindamos ekscitotoksiškumą, kuris palengvina jų invaziją (32,33).
Dar vienas GBM ypatumas – ketonų metabolizmas. Lyginant su normaliais astrocitais, daug mažesnis tokių fermentų kaip β-ketoacil-KoA transferazė aktyvumas, todėl GBM ląstelės negeba panaudoti ketonų kaip alternatyvių energetinių substratų (33). Dėl to vėžinės ląstelės yra itin jautrios gliukozės ir glutamino trūkumui, kuriam esant greitai išeikvojama ATP ir vyksta ląstelių nekrozė (38).
1.2.3. Neištirti GBM aspektai
Vienas iš pagrindinių naviko bruožų – ląstelių žūties ir išlikimo signalų pusiausvyros sutrikimas, todėl nenuostabu, kad didelės dalies priešvėžinių vaistų taikinys yra apoptozės procesas (38). Visgi, vėžinės ląstelės geba prisitaikyti prie streso, o GBM – ryškus atsparumo chemo- ir radioterapijai pavyzdys (30).
3 pav. Substratinis fosforilinimas mitochondrijose. SUKS - sukcinil-KoA sintetazė; GDP – guanozino
difosfatas, GTP – guanozino trifosfatas, ADP – adenozino difosfatas, ATP – adenozino 5`-trifosfatas; NDK – nukleozidodifosfato kinazė; punktyrinės linijos – mažiau svarbūs metaboliniai keliai,
Kaip vienas iš procesų, kuris lemia atsparumo terapijai atsiradimą, tiriama autofagija. Makroautofagija (šiame darbe – autofagija) – koordinuotas katabolinis procesas, kurio metu organelės ar kiti citoplazmos komponentai yra supakuojami į membranines pūsleles ir joms susiliejus su lizosomomis, suardomi (2,39). Pagrindinė funkcija yra užtikrinti ląstelės išlikimą nepalankiomis sąlygomis, pavyzdžiui, trūkstant metabolinių substratų ar esant hipoksijai. Autofagija taip pat būtina ląstelės homeostazei, nes lemia pakitusių baltymų, genotoksiškų molekulių ir pažeistų mitochondrijų sunaikinimą (39,40). Dėl to autofagija yra vienas iš veiksnių, neleidžiančių atsirasti vėžiui, tačiau vėlesnėse vėžio vystymosi stadijose ji tampa naviko išlikimo ir plitimo mechanizmu bei lemia naviko atsparumą gydymui (39). Taip pat nustatyta, kad autofagija gali sukelti ląstelių žūtį, kuri traktuojama kaip alternatyvus programuotos žūties būdas ir vyksta ląstelėse, kurių apoptozė sutrikusi (2). Autofagijos vaidmuo gliomoje taip pat nevienareikšmiškas: GBM ląstelėse nustatytas sumažėjęs autofagijos aktyvumas (pagal Beclin1 geną), tačiau gliomos kamieninėse ląstelėse su autofagija susijusių genų raiška yra padidėjusi (40). Atsižvelgiant į autofagijos svarbą ir jos pakitimus vėžio ir kitų ligu metu, auga susidomėjimas autofagijos moduliatoriais. Manoma, kad dauguma priešvėžinių, o ypač fitocheminių vaistų turi įtakos autofagijai, o apsauginį ar citotoksinį poveikį lemia autofagijos laipsnis, kuris priklauso nuo paties moduliatoriaus ir jo dozės (4 pav.) (2). Autofagijos mechanizmas taip pat skiriasi tarp ląstelių linijų ir priklauso nuo užląstelinių signalų (41).
4 pav. Autofagijos moduliavimas siekiant terapinio poveikio (adaptuota iš (2))
1.3. Ursolo rūgštis (UR)
1.3.1. UR cheminė struktūra
UR (3-beta-3-hidroksi-urs-12-en-28-oinė rūgštis, 5 pav.) – tai antrinis augalų metabolitas, priklausantis ursano tipo pentacikliams triterpenoidams. Triterpenoidai yra labai plačiai paplitusi junginių grupė, kurią sudaro daugiau nei 20 tūkst. šiuo metu identifikuotų junginių (44). Jiems būdinga penkių izopreno vienetų struktūra sintetinama mevalonato kelyje, o ciklų ir pakaitų išsidėstymo įvairovę lemia tolesnės oksidacijos reakcijos (7,45). Be to, triterpenoidai gali būti glikozilinti, pavyzdžiui, UR yra saponinų aglikonas (46).
Medicininės chemijos požiūriu UR yra maža molekulė (C30H48O3, molekulinė masė 456,7 g/mol)
(44). Penkių ciklų angliavandenilinė struktūra lemia didelį lipofiliškumą (logPow = 6,43 (45)) ir labai mažą
tirpumą vandenyje (1,02×10-4 mg/L (25°C) (47)). Molekulėje taip pat yra dvigubas ryšys (C12-C13),
hidroksilo (C3 padėtyje) ir karboksilo (C28 padėtyje) grupės. Panaudojant palyginti nebrangias augalines žaliavas, gali būti vykdoma dalinė sintezė, siekiant gauti UR darinius (5 pav.), pasižyminčius stipresniu biologiniu poveikiu bei palankesnėmis farmakokinetinėmis savybėmis (48). Žinoma, kad ciklinė struktūra yra pagrindinis farmakoforas, o modifikacijos vertinamos nevienareikšmiškai. Vienų autorių duomenimis,
5 pav. UR cheminės struktūros ypatumai. Skaičiai – padėtys, kuriose dažniausiai atliekamos
priešvėžiniam aktyvumui būtina hidroksilo grupės esterifikacija ar oksidacija, kiti nustato, kad aktyviausi dariniai yra nemodifikuoti (46,48,49). Atsižvelgiant į sėkmingą giminingo junginio – oleanolio rūgšties – modifikaciją C2 padėtyje, buvo susintetinti analogiški ciano-UR dariniai, tačiau efektyvumo padidėjimas nebuvo toks reikšmingas kaip oleanolio rūgšties atveju (48). Atkreiptinas dėmesys į tai, kad UR struktūros modifikacijos neišvengiamai lemia molekulinės masės padidėjimą, lipofiliškumo bei reaktyvumo pokyčius (50). Todėl, nors nauji dariniai yra perspektyvūs, jų įvertinimui reikalingi ne tik in vitro, bet ir in vivo tyrimai.
1.3.2. UR bioprieinamumas ir farmakokinetika
Biologiškai aktyvių junginių poveikis yra priklausomas nuo jų bioprieinamumo. Triterpenoidai, kaip ir nemažai augalinių biologiškai aktyvių junginių, neatitinka Lipinskio taisyklės, todėl pasižymi prastu bioprieinamumu iš virškinamojo trakto (45). UR – ne išimtis – ji priskirama IV klasei (mažas tirpumas ir maža skvarba) pagal biofarmacinę klasifikacijos sistemą (47).
In vitro skvarbos tyrimai numato vidutinišką (20-70 proc.) (45) UR absorbciją iš virškinamojo trakto. Skvarbos per imortalizuotų žmogaus kolorektalinės adenokarcinomos ląstelių (Caco-2) monosluoksnį eksperimentai parodė, kad UR pernaša vyksta pasyvios difuzijos būdu. Taip pat nustatyta, kad UR nebūdingas metabolizmas (konjugacija su gliukurono ar sulfato rūgštimi) žarnyno epitelio ląstelėse (51). In vivo duomenys taip pat patvirtina, kad UR nemetabolizuota patenka į kraujotaką (52–54). Tačiau, taikant 10 mg/kg dozę per os, plazmoje susidaranti koncentracija yra nedidelė, t.y. mažesnė, nei naudojama in vitro tyrimuose (53,54) (1 lentelė). Tai galima paaiškinti trumpu pusinės eliminacijos laiku, kuris parodo greitą šalinimą (53) arba pasiskirstymą kituose organizmo audiniuose bei metabolizmą (51). Didelį pasiskirstymo tūrį patvirtina žiurkių bei pelių audinių tyrimai. Didžiausia UR koncentracija nustatyta kepenyse, taip pat UR rasta plaučiuose, blužnyje, gaubtinėje žarnoje, inkstuose, širdyje, smegenyse (52,53). Tai rodo, kad UR yra metabolizuojama kepenyse ir gali pereiti HEB (didžiausia smegenyse nustatyta koncentracija 1,6±0,2 µg/g (52)). Be to, pelėse nustatyta, kad ilgalaikis vartojimas (8 savaites) lemia UR kaupimąsi organizmo audiniuose (52).
nustatyta tiek UR, tiek epoksido konjugatų su glutationu, glicinu ir gliukurono rūgštimi (5 pav.). II fazės metabolitai paprastai yra neaktyvūs ir greitai pašalinami, o UR epoksidai gali pasižymėti farmakologiniu poveikiu dėl struktūros panašumo į aromatazės slopiklius (55).
1 lentelė. UR farmakokinetiniai rodikliai
Rodiklis Reikšmė (± SN)
UR, 10 mg/kg per os (žiurkės) (53)
Cmax, µg/mL (atitikmuo µM) 1,10 ± 0,31 (2,41)
Tmax, h 0,42 ± 0,11
T1/2, h 0,71 ± 0,09
AUC0→12 µg/h*L 1,45 ± 0,21
UR nanodalelės, 10 mg/kg per os (žiurkės) (54) Cmax, µg/mL (atitikmuo µM) 9,32 ± 0,46 (20,42)
AUC0→12 µg/h*L 36,57 ± 1,90
UR liposomos, 98 mg/m2, infuzija į veną 4 h (žmonės) (56)
Cmax, µg/mL 3,457 ± 0,856
Tmax, h 4,0 ± 0,00
T1/2, h 3,90 ± 2,08
AUC0→24 µg/h*L 9,696 ± 1,134
Cmax – didžiausia koncentracija kraujo plazmoje; Tmax – laikas, per kurį pasiekiama Cmax; T1/2 – pusinės
eliminacijos laikas; AUC – plotas po kreive; Vd – pasiskirstymo tūris
Fizikocheminėms bei farmakokinetinėms savybėms pagerinti kuriamos įvairios UR formos. Viena iš jų – nanodalelės, kurių suspensija pasižymi mažesniu dalelių dydžiu ir didesniu bendru paviršiaus plotu, lyginant su nemodifikuotos UR suspensija. Tokiu būdu pagerinamas tirpumas vandeninėje terpėje, susidaro didesnė maksimali koncentracija plazmoje, ji yra pasiekiama greičiau (1 lentelė). Nustatytas plotas po kreive (AUC) naudojant nanosuspensiją padidėjo net 25,7 karto (54). Kita forma, kuri yra tinkama intraveniniam vartojimui – liposomos (URL). Jų privalumas yra galimybė išvengti metabolizmo bei selektyviai tiekti vaistą (57). Su URL taip pat buvo atliktas I fazės klinikinis tyrimas, kurio metu nustatyta didžiausia toleruojama dozė (98 mg/m2) bei farmakokinetiniai parametrai žmonėse (1 lentelė) (56). Kitas klinikinis
1.3.3. Gamtiniai UR šaltiniai
UR yra nustatyta daugelyje vaistinių, taip pat įprastų maistinių augalų. Didžiausias UR kiekis – iki 2,95 proc. džiovintos žaliavos masės – nustatomas Lamiaceae šeimos augaluose, ypač vaistiniame rozmarine (Rosmarinus officinalis), vaistiniame šalavijuje (Salvia officinalis), tikrojoje levandoje (Lavandula angustifolia), vaistiniame čiobrelyje (Thymus vulgaris), vaistinėje melisoje (Melissa officinalis) (59,60). Taip pat svarbus UR šaltinis yra uogos: miltinė meškauogė (Arctostaphylos uva-ursi), stambiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpon), bruknė (Vaccinium vitis-idea) (59,61). Didesni UR kiekiai (>1 proc. džiovintos žaliavos masės) taip pat nustatyti arabiniame kavamedyje (Coffea arabica), eukalipte (Eucalyptus spp) (59), vaistinėje medetkoje (Calendula officinalis) (60). Nustatyta, kad juodauogio šeivamedžio (Sambucus nigra) uogų biologinį poveikį lemia ne tik gerai žinomi antocianinai bei polifenoliai, bet ir UR (62). Svarbu paminėti, kad UR – pagrindinis triterpenoidas viename iš plačiausiai vartojamų vaisių – obuoliuose (Malus domestica vaisiuose). Liofilizuotose obuolių žievelėse nustatyta iki 6,434 mg/g UR (63).
Daugiausia UR augalai sukaupia antžeminėje dalyje, o kiekis priklauso nuo augalo dalies. Kadangi UR – lipofilinė mežiaga, augaluose ji randama lapų ar vaisių kutikulėje, taip pat žiedynuose. Dėl šios priežasties UR kiekis obuolių žievelėse yra beveik 26 kartus didesnis nei minkštime (63); dideli kiekiai nustatomi džiovintose spanguolėse, bet visai maži – spanguolių sultyse (61). Taigi, kaip žaliavos UR ekstrakcijai gali būti panaudojami šalutiniai augalų apdorojimo produktai (60).
1.3.4. UR priešvėžinis poveikis
Vis daugiau tyrimų atskleidžia, kad iš augalų išskirtos biologiškai aktyvios medžiagos yra perspektyvios alternatyvos vėžio gydymui. UR priešvėžinis poveikis pastebėtas tiek in vitro, tiek in vivo, krūties, gimdos kaklelio, prostatos, kasos, skrandžio, plaučių, kolorektalinio vėžio, melanomos, hepatoceliulinės karcinomos, gliomos ir kituose modeliuose (4,7). Nustatyta, kad UR mažina vėžinių ląstelių gyvybingumą, sutrikdo ląstelės ciklą, slopina migraciją, angiogenezę ir sukelia ląstelių žūtį (44). Nors tiklus veikimo mechanizmas nėra žinomas, nustatyta UR sąveika su daugeliu taikinių.
kaspazių priklausoma apoptozė nustatyta įvairiose ląstelių linijose po poveikio skirtingomis UR koncentracijomis, pavyzdžiui, 5 μM – Panc-28 kasos vėžio (8), 20 μM – U251 gliomos (65), 80 μM – PC3 prostatos vėžio ląstelėse (8). Vienas iš galimų molekulinių taikinių – onkogeninė mikro-RNR (miR-21), kurios padidėjusi raiška yra būdinga gliomai. UR mažina miR-21 lygį U251 gliomos ląstelėse ir tokiu būdu skatina jų apoptozę (65). UR sukelta apoptozė taip pat susijusi su į streso signalus reaguojančios baltymų kinazės (JNK) aktyvinimu (66). Nors UR laikoma antioksidantu, vėžinėse ląstelėse ši medžiaga skatina oksidacinį stresą, dėl kurio vyksta ne tik JNK, bet ir kitų baltymų kinazių (Akt, AMPK) konformaciniai pokyčiai, nulemiantys apoptozę (11).
UR sukelia ląstelių žūtį ne tik apoptozės, bet ir alternatyviais keliais. Pavyzdžiui, neprogramuota ląstelių žūtis – nekrozė – nustatyta DBTRG-05MG gliomos ląstelių linijoje, atsparioje TMZ, ląsteles 24 h paveikus 17,5 μM UR (67). UR taip pat sukelia citotoksinę autofagiją. U87MG gliomos ląstelėse ≥20 μM UR skatina nuo ROS priklausomą endoplazminio tinklo stresą, kuris aktyvina autofagiją sukeliančius signalinius kelius (64), o TC-1 gimdos kaklelio karcinomos ląstelėse UR sukelta autofagija susijusi su fosfoinozitido 3-kinazės signaliniu keliu (68). Kita vertus, autofagija yra ir adaptacinis vėžinių ląstelių atsakas į poveikį UR, nes apoptozė sukeliama tik kartu su UR naudojant autofagijos slopiklius (41,69).
UR sukeliama ląstelių žūtis yra siejama su mitochondrijų disfunkcija. DBTRG-05MG gliomos ląstelėse nustatyta mitochondrijų nespecifinio laidumo poros (MPTP) indukcija bei ATP lygio sumažėjimas kaip veiksniai, sukeliantys nekrozę (67). CAL 27 burnos plokščialąstelinės karcinomos ląstelėse UR poveikis mitochondrijų membranai sudaro sąlygas apoptozei vykti vidiniu keliu, aktyvinant pro-apoptozinius (Bax ir Bad) ir slopinant išgyvenamumo (Bcl-2, Bcl-xL) veiksnius (70). Mitochondrijų, kaip UR taikinio, hipotezė tirta su izoliuotomis širdies mitochondrijomis ir H9c9 miokardo ląstelių linija. Nustatytas oksidacinį fosforilinimą atskiriantis poveikis, kurio pagrindas gali būti UR gebėjimas didinti biologinių membranų takumą (9,10).
UR veikimo mechanizmo tyrimuose taip pat figūruoja žinduolių rapamicino taikinys (mTOR), kurio aktyvumas yra padidėjęs daugelyje navikų. mTOR aktyvina anabolizmą ir ląstelių proliferaciją, reaguodamas į tokius signalus kaip aminorūgštys, insulinas, ATP, augimo veiksniai (71). Nustatyta, kad UR slopina mTOR per reguliacines molekules: baltymų kinazę B (Akt) (5,11,41,69), AMPK (11,64) ir Ca2+
(64). Todėl mTOR slopinimas yra vienas iš veiksnių, kurie lemia UR antiproliferacinį (stabdomas ląstelės ciklas) ir katabolinį (aktyvinama autofagija) poveikį (41,64,69). Akt signalinio kelio moduliavimas taip pat lemia glikolizės aktyvumo sumažėjimą ir ATP trūkumą, nustatytą krūties vėžio ląstelių linijose (11).
fermentų (matrikso metaloproteinazių (MMP-2, MMP-9)) transkripciją (44,69,72). Tokiu būdu UR slopina vėžinių ląstelių migraciją bei invaziją, kuri ypač būdinga gliomai (69,72).
Daugialypis poveikis atveria galimybes derinti UR su kitomis farmakologiškai aktyviomis medžiagomis, siekiant sinergistinio ar sensitizuojančio poveikio. Pavyzdžiui, nustatyta, kad 5-fluorouracilo ir UR kombinacija sukelia apoptozei atsparių HCT-15 kolorektalinio vėžio ląstelių žūtį nuo kaspazių nepriklausomais mechanizmais (73). SiHa gimdos kaklelio vėžio ląstelių linijoje UR sustiprina cisplatinos apoptozinį ir antiproliferacinį poveikį per NF-κB signalinį kelią (74). Sensitizuojantis UR poveikis nustatytas su gemcitabinu ir kapecitabinu atitinkamai kasos ir kolorektalinio vėžio ląstelių linijose (3). TMZ atspariose LN18 ir T98G gliomos ląstelių linijose nustatyta apoptozė, nekrozė ir kolonijų formavimo sutrikimas, naudojant TMZ ir UR derinį. UR slopina O6-metilguanin-DNR-metiltransferazės raišką, t.y. fermentą, kuris lemia TMZ neveiksmingumą (75). Taip pat UR – perspektyvus P-glikoproteino slopiklis, todėl gali užkirsti kelią vaistų pašalinimui iš ląstelių-taikinių (76).
1.3.5. UR toksiškumas
UR toksiškumas gyvūnams ir žmonėms nėra nustatytas. Rozmarinų ekstraktas, kurio vienas iš pagrindinių komponentų yra UR, patvirtintas kaip saugus maisto papildas JAV ir Europoje (3). In vivo vėžio modeliuose nebuvo nustatytas UR poveikis gyvūnų kūno svoriui po 14-21 d. (73,75); nebuvo hematologinių ir biocheminių rodiklių pokyčių po 10 d. (5). I fazės klinikinis tyrimas taip pat parodė priimtiną intraveniškai vartojamų URL toksiškumą, vartojant 14 d. Nė vienam tiriamajam nepasireiškė sunkūs šalutiniai poveikiai, o svarbiausias iš pasireiškusiųjų buvo hepatotoksiškumas, susijęs su paciento Cmax ir AUC (58).
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Šio magistro baigiamojo darbo objektas – astroglijos ląstelės. Buvo tiriamas UR poveikis šioms imortalizuotų ląstelių linijoms:
• C6 – žiurkių (Wistar veislės) gliomos ląstelių linija (Cell Lines Service GmbH, Vokietija) (6 pav. A). Šios ląstelės pasižymi pleomorfiškumu, kamieninių ląstelių savybėmis, o jų genų raiška yra panaši kaip žmogaus smegenų navikuose (79);
• WT-iAstro – netransgeninių pelių (C57BL6 veislės) astroglijos ląstelių linija (toliau – Astro) (6 pav. B). Tai nauja ląstelių linija, išvesta iš pirminės hipokampo astrocitų kultūros (80). Šios ląstelės gautos iš prof. Dmitry Lim (Rytų Pjemonto universitetas, Italija).
6 pav. Tyrime naudotų ląstelių šviesinės (fazių kontrasto) nuotraukos. A – C6 ląstelės; B – Astro
ląstelės. Mikroskopas Olympus IX71S1F-3, objektyvas ×20, padidinimas – 500 kartų
2.2. Reagentai ir aparatūra
Reagentai:
• UR (≥98 proc., Extrasynthese, Prancūzija);
• Fetalinis jaučio serumas (angl. fetal bovine serum (FBS)) (Gibco by Life Technologies, JAV); • Penicilino-streptomicino tirpalas (10 000 vnt/mL penicilino, 10 000 μg/mL streptomicino) (Gibco
by Life Technologies, JAV);
• Tripsino-EDTA tirpalas (0,025 proc. tripsino, 0,01 proc. etilendiaminotetraacto rūgšties (EDTA)) (Gibco by Life Technologies, JAV);
• Tripano mėlio tirpalas 0,4 proc. (Sigma-Aldrich, JAV);
• 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (Invitrogen by Life Technologies, JAV);
• Henkso subalansuotas druskų tirpalas (angl. Hank`s Balanced Salt Solution (HBSS)), su Ca2+ ir
Mg2+ (Gibco by Life Technologies, JAV);
• Bisbenzimido H 33342 trichloridas (Hoechst 33342) (Sigma-Aldrich, JAV); • Propidžio jodidas (Sigma-Aldrich, JAV);
• Akridino oranžinis (Sigma-Aldrich, JAV);
• Bafilomicinas A1 (iš Streptomyces griseus ≥90 proc., Sigma-Aldrich, JAV);
• Somatinių ląstelių bioliuminescencinis ATP nustatymo rinkinys (katalogo nr. FLASC, Sigma-Aldrich, JAV);
• Dimetilsulfoksidas (DMSO) (≥99,9 proc., Sigma-Aldrich, JAV).
Aparatūra:
• Inkubatorius (Heracell 150i, Thermo Fisher Scientific, JAV); • Hemocitometras (Fuchs-Rosenthal, Vokietija);
• Šviesinis mikroskopas (CKX41, Japonija);
• Centrifuga (Eppendorf Centrifuge 5810R, Vokietija);
2.3. Metodai
2.3.1. Ląstelių kultivavimas
Visi darbai, susiję su ląstelių kultivavimu, buvo atliekami steriliomis sąlygomis. Buvo gaminama auginimo terpė, sudaryta iš DMEM bazinės terpės, papildytos 10 proc. FBS ir antibiotikais (100 vnt/mL penicilino ir 0,1 mg/mL streptomicino); naudojami 75 cm2 flakonai. Ląstelės kultivuojamos inkubatoriuje, kuriame palaikoma 37°C temperatūra ir 5 proc. CO2.
Ląstelės persėjamos kas 2-3 paras, joms padengus 70-90 proc. augimo paviršiaus. Persėjimo eiga: • nusiurbiama auginimo terpė, ląstelės 2 kartus praplaunamos 10-15 mL fosfatinio buferinio druskų
tirpalo;
• pridedama 700 μL tripsino-EDTA tirpalo (tripsino koncentracija 0,01 mM) ir inkubuojama 2-3 min., kol ląstelės atkimba nuo augimo paviršiaus (tikrinama šviesiniu mikroskopu);
• tripsinas neutralizuojamas 7 mL auginimo terpės, ląstelės suspenduojamos ir suspensija centrifuguojama 5 min. (290×g – C6, 250×g – Astro);
• supernatantas nupilamas, o nusėdusios ląstelės yra išsėjamos į kultivavimo indus arba į plokšteles, skirtas ekperimentams.
2.3.2. Ląstelių paruošimas UR poveikio tyrimui
Eksperimentai buvo atliekami tikslų ląstelių skaičių išsėjant į standartinių matmenų 96 šulinėlių plokšteles. Ląstelių skaičius buvo vertinamas naudojant hemocitometrą ir ląsteles dažant tripano mėliu. Ląsteles suspendavus auginimo terpėje, imama 20 μL suspensijos ir sumaišoma su 20 μL tripano mėlio tirpalo. 20 μL šio mišinio suleidžiama į hemocitometro kamerą ir, stebint pro šviesinį mikroskopą, suskaičiuojamos ląstelės keturiuose kampiniuose kvadratuose. Tripano mėlis prasiskverbia ir mėlynai nudažo ląsteles, kurių membrana pažeista, todėl skaičiuojamos tik skaidrios ląstelės. Gautas skaičius dauginamas iš hemocitometro konstantos (×5000) ir skiedimo (×2). Rezultatas – ląstelių skaičius/mL. Pagal tai gaminama ląstelių suspensija auginimo terpėje, kad išsėjant po 100 μL, C6 ląstelių tankis būtų 20×103
ląst./šul., Astro – 15×103 ląst./šul. Praėjus 24 h į šulinėlinius pridedama reikiamos koncentracijos UR tirpalų
(po 100 μL) ir paliekama inkubacijai.
2.3.3. Ląstelių metabolinio aktyvumo nustatymas MTT metodu
UR poveikis ląstelių metaboliniam aktyvumui buvo tiriamas dideliame koncentracijų intervale (1, 5, 10, 15, 20, 40, 60, 80, 100 μM). Kontrolinės ląstelės buvo paveiktos tik tirpikliu (DMSO) – jo koncentracija terpėje buvo 0,25 proc. C6 ir 0,2 proc. Astro ląstelėms. Kiekvienam priedui buvo skirta po 6 šulinėlius.
Po 24 h ar 48 h inkubacijos su UR iš šulinėlių nusiurbiama auginimo terpė, ląstelės 2 kartus praplaunamos HBSS ir į šulinėlius pilama po 200 μL 0,5 mg/mL MTT tirpalo. Plokštelė paliekama inkubatoriuje 2 h. Tuomet dažas pašalinamas, o susidariusios nuosėdos ištirpinamos į šulinėlius pridedant po 100 μL DMSO ir plokštelę 15 min. inkubuojant tamsoje ant purtyklės (20 rpm). Po to spektrofotometru nustatoma tirpalų šviesos sugertis ties 570 ir 620 nm bangos ilgiais.
MTT metodas paremtas tetrazolio junginio redukcija iki formazano druskos. Šią reakciją vykdo nepažeistų, gyvybingų ląstelių dehidrogenazės, todėl susidariusio spalvoto produkto kiekis tiesiogiai priklauso nuo ląstelių metabolinio aktyvumo (7 pav.). Formazano druskos yra netirpios vandeninėje terpėje, todėl prieš matuojant sugertį yra ištirpinamos DMSO (81).
Ląstelių metabolinis aktyvumas šiame darbe išreiškiamas procentais nuo kontrolinių ląstelių metabolinio aktyvumo, kuris prilyginamas 100 proc.
7 pav. Spektrofotometriniam matavimui paruošta plokštelė. UR poveikio C6 ląstelėms
pavyzdinis eksperimentas. Iš kairės į dešinę: ląstelės (be priedų), 0,25 proc. DMSO, 1 μM UR, 5 μM UR, 10 μM UR, 15 μM UR, 20 μM UR, 40 μM UR, 60 μM UR, 100 μM UR; perimetrą
2.3.4. Ląstelių gyvybingumo nustatymas fluorescencinės mikroskopijos metodu
UR poveikis ląstelių gyvybingumui buvo tiriamas tokiomis pačiomis sąlygomis kaip poveikis metaboliniam aktyvumui (2.3.3. skyrelis), tik šiuo atveju kiekvienam priedui buvo skiriama po 3 šulinėlius.
Gyvybingumo nustatymui naudoti Hoechst 33342 (toliau – Hoechst) ir propidžio jodido (PI) fluorescenciniai dažai. Jie švyti prisijungę prie DNR, tačiau skiriasi jų gebėjimas pereiti ląstelių plazminę membraną. Nepažeista membrana laidi Hoechst, todėl gyvų ląstelių branduoliai fluorescuoja mėlyna spalva, yra homogeniški. Kai chromatinas labiau kondensuotas – ląstelių dalijimosi ir apoptozės metu – mėlyna fluorescencija yra ryškesnė (82). Besidalijančių ląstelių branduoliai yra netaisyklingos (žvaigždiškos ar pailgos) formos (8 pav. A, balti apskritimai). Apoptozinės ląstelės atskiriamos pagal ypač ryškius, apvalius branduolius ir atitinkamose šviesinėse nuotraukose matomus apoptozei būdingus morfologinius pokyčius (ląstelės susitraukimą, apoptozinius kūnelius (38)) (8 pav. A – žalia rodyklė, B – žalias apskritimas). PI į ląsteles patenka tik tada, kai membrana yra pažeista (82), todėl raudonai švytinčios ląstelės buvo vertinamos kaip žuvusios nekrozės būdu (8 pav. A, baltos rodyklės).
8 pav. Pavyzdinės C6 ląstelių nuotraukos. A – ląstelės, nudažytos Hoechst/PI (DAPI filtras), B –
atitinkama šviesinė (fazių kontrasto) nuotrauka. Baltos rodyklės, raudona spalva – nekrozės būdu žuvusių ląstelių branduoliai; žalia rodyklė, žalias apskritimas – apoptozės būdu žuvusi ląstelė; mėlyna spalva – gyvų ląstelių branduoliai; balti apskritimai – besidalijančių ląstelių branduoliai. Mikroskopas Olympus
Po 24 h ar 48 h inkubacijos su UR iš šulinėlių nusiurbiama terpė ir pridedama fluorescencinių dažų: PI (7 μM) bei Hoechst (4 μg/mL). Plokštelė inkubuojama 10 min., tuomet ląstelės vizualizuojamos fluorescenciniu mikroskopu prieš tai nusiurbus terpę (paliekant ~10 μL). Mikroskopuojama naudojant 20×
objektyvą (suminis padidinimas ~500 kartų) ir DAPI filtrą (sužadinimas 330-385 nm, emisija 420 nm). Naudojant integruotą kamerą buvo daromos šviesinės (fazių kontrasto) ir fluorescencinės ląstelių nuotraukos, kiekviename šulinėlyje pasirinkus ne mažiau kaip po 3 atsitiktinius laukus. Vaizdų analizė atliekama ImageJ programa (versija 1.52a), kiekvienai UR koncentracijai vertinant po 5-7 nuotraukas. Gyvų ir žuvusių ląstelių skaičius išreiškiamas procentais nuo bendro ląstelių skaičiaus.
2.3.5. Ląstelių autofagijos nustatymas taikant dažymą akridino oranžiniu (AO)
AO – per plazminę membraną pereinantis dažas, kuriam būdinga dvejopa fluorescencija. Citoplazmoje ir branduolyje AO fluorescuoja žaliai, o rūgštinėse organelėse (pH 5), tarp jų ir autolizosomose – raudonai, nes dažo molekulės protonizuojasi ir susidaro AO dimerai (9 pav. A). Todėl AO fluorescencijos metodu nustatomi autofagijos vėlyvajai stadijai būdingi morfologiniai požymiai (83).
UR poveikio ląstelių autofagijai eksperimentų serija buvo atlikta ląsteles veikiant 10 μM, 15 μM ir 20 μM UR (po 3-4 šulinėlius kiekvienam priedui) 24 h ar 48 h. Kontrolinės ląstelės buvo paveiktos 0,1 proc. DMSO. Šiuo atveju teigiama kontrolė – ląstelės, 24 h ar 48 h inkubuotos su HBSS (badavimo sukelta autofagija) (9 pav. C). Kaip neigiama kontrolė taikytas poveikis bafilomicinu A1 (lizosomų protonų siurblio slopikliu (83)) (9 pav. B).
9 pav. Autofagijos procesas ir jo tyrimas naudojant AO. A – autofagijos proceso schema (adaptuota iš
(83,84)); B – neigiama kontrolė (Astro ląstelės, nudažytos AO, pridėjus bafilomicino A1); C – teigiama kontrolė (Astro ląstelės, nudažytos AO, po inkubacijos su HBSS). AO – akridino oranžinis; AOH+ –
protonizuotas akridino oranžinis; žalia fluorescencija – citoplazma ir branduoliai; raudona fluorescencija – rūgštinės organelės ir pūslelės. Mikroskopas Olympus IX71S1F-3, objektyvas ×20, padidinimas – 500
kartų
2.3.6. Liuminometrinis viduląstelinio ATP koncentracijos nustatymas
10 pav. Liuciferazės reakcija. ATP – adenozino 5`-trifosfatas; PPi – neorganinis pirofosfatas; AMP –
adenozino 5`-monofosfatas (adaptuota iš (85))
ATP koncentracijos nustatymui naudotas analizės rinkinys, kurios reagentai paruošti pagal gamintojo protokolą. Po inkubacijos su UR iš šulinėlių nusiurbiama po 180 μL terpės. Pridedama po 90 μL ląsteles lizuojančio reagento, tuomet po 90 μL ATP nustatymo mišinio darbinio tirpalo ir nedelsiant atliekamas matavimas liuminometru. Liuminescencijos intensyvumo priklausomybė nuo ATP koncentracijos nustatyta pagal ATP standartą (0-100 μM koncentracijos tirpalus ląstelių auginimo terpėje). Naudojant Ascent Software programinę įrangą gauta regresijos lygtis (𝑦 = 4,220𝑥 − 4,917; 𝑅2 = 0,996),
pagal kurią apskaičiuota ATP koncentracija tiriamose ląstelėse.
2.3.7. Statistinė duomenų analizė
Duomenų apdorojimui naudoti Microsoft Excel (Microsoft Office Professional Plus 2019) ir GraphPad Prism (versija 8.4.1) statistiniai paketai. Koncentracija, sukelianti 50 proc. atsaką (IC50),
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. UR poveikis C6 ir Astro ląstelių metaboliniam aktyvumui
Pirmiausia buvo įvertintas UR poveikis C6 ir Astro ląstelėms plačiame koncentracijų intervale po 24 h ir 48 h inkubacijos. UR koncentracijos pasirinktos remiantis ankstesniais laboratorijoje atliktais tyrimais (86) bei atsižvelgiant į DMSO poveikį ląstelėms. Didžiausia netoksiška DMSO koncentracija buvo 0,25 proc. C6 ir 0,2 proc. Astro ląstelėms (1 priedas). Todėl didžiausia šiame darbe naudota UR koncentracija buvo atitinkamai 100 μM ir 80 μM.
MTT testas parodė, kad UR skirtingai mažina tirtų ląstelių linijų metabolinį aktyvumą (11 pav. A, B). Po 24 h inkubacijos mažos UR koncentracijos (1-15 μM) neturėjo poveikio, tačiau esant 20 μM UR ląstelių metabolinis aktyvumas statistiškai reikšmingai sumažėjo: C6 ląstelių iki 33,3±6,5 proc., Astro – iki 19,1±7,1 proc. Ląsteles veikiant UR 48 h, statistiškai reikšmingas Astro ląstelių metabolinio aktyvumo sumažėjimas pasireiškė jau esant 15 μM UR (iki 18,8±3,8 proc.), o C6 – 20 μM (iki 15,1±7,5 proc.). Paveikus ląsteles 40-100 μM UR tiek 24 h, tiek 48 h, metabolinis aktyvumas sumažėjo iki minimumo (<3 proc.). Svarbu paminėti, kad po 48 h inkubacijos mažos UR koncentracijos (1-15 μM) padidino tik C6 ląstelių metabolinį aktyvumą, net iki 149,2±15,4 proc. Žinoma, kad C6 ląstelių dvigubėjimo laikas eksponentinėje augimo fazėje yra apie 16 h (87), todėl metabolinio aktyvumo padidėjimas atspindi ląstelių proliferaciją. 0 20 40 60 80 100 0 50 100 150 UA koncentracija (M) L ąs te li ų m e ta b o li n is a k ty v u m a s ( p ro c .) 24 h 48 h 5 1015 ✱
*
*
*
*
*
# # # # # 0 20 40 60 80 0 50 100 150 UR koncentracija (M) L ąs te li ų m e ta b o li n is a k ty v u m a s ( p ro c .) 24 h 48 h * * * * * # # # # 5 10 15(A)
(B)
11 pav. UR poveikis C6 (A) ir Astro (B) ląstelių metaboliniam aktyvumui. Taškai – vidurkiai±SN (n≥3);
Pagal apkaičiuotas IC50 reikšmes, po 24 h inkubacijos UR yra vienodai toksiška abiem ląstelių
linijoms, o po 48 h – labiau toksiška Astro nei C6 ląstelėms. Abiem ląstelių linijoms UR poveikis yra priklausomas nuo inkubacijos trukmės (2 lentelė).
2 lentelė. Apskaičiuota IC50 reikšmė, įvertinus ląstelių metabolinį aktyvumą po inkubacijos su 1-100
μM UR Inkubacijos trukmė Ląstelių linija UR IC50 ± SN (μM) C6 Astro 24 h 19,3 ± 0,4 18,7 ± 1,0 48 h 18,0 ± 0,9 * 12,4 ± 4,5 #, ^
*– statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su reikšme po C6 ląstelių inkubacijos 24 h; #– statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant su reikšme po Astro ląstelių inkubacijos 24 h; ^– statistiškai reikšmingas
skirtumas lyginant su reikšme po C6 ląstelių inkubacijos 48 h (p<0,05)
Gauti rezultatai patvirtina kitų autorių tyrimuose nustatytą UR poveikį vėžinių ląstelių metaboliniam aktyvumui. Pavyzdžiui, anksčiau laboratorijoje taip pat buvo nustatytas citotoksinis UR poveikis C6 ląstelėms, tačiau pateikta IC50 po 48 h inkubacijos nuo mūsų gautos reikšmės skiriasi beveik 2
kartus (9,26±0,81 μM) (86). Nuo UR koncentracijos priklausomas metabolinio aktyvumo sumažėjimas nustatytas ir U87MG gliomos ląstelių linijoje, tačiau dozės-atsako kreivė daug lėkštesnė: statistiškai reikšmingas poveikis po 24 h inkubacijos pasireiškė esant jau 5 μM UR, o IC50 buvo net 71,02 μM (64).
Lyginant UR poveikį skirtingos kilmės vėžinėms ląstelėms nustatyta, kad UR citotoksiškai veikė C6 ląsteles jau esant 10 μM koncentracijai (po 24 h ir po 48 h), o A431 žmogaus plokščiojo epitelio karcinomos ląstelėse net paveikus 100 μM UR poveikis nepasireiškė (88). Šie pavyzdžiai rodo, kad UR mažina vėžinių ląstelių metabolinį aktyvumą, tačiau poveikis priklauso nuo ląstelių linijos bei eksperimentinių sąlygų.
3.2. UR poveikis C6 ir Astro ląstelių gyvybingumui
Kadangi ląstelių metabolinis aktyvumas priklauso nuo jų gyvybingumo, MTT teste naudotų UR koncentracijų poveikis buvo analizuojamas ląsteles dažant Hoechst/PI ir vertinant ląstelių žūtį. Mažos UR koncentracijos (1-15 μM) neturėjo įtakos ląstelių gyvybingumui, tačiau viršijus slenkstinę koncentraciją UR sukėlė ląstelių nekrozę. Nekrozinių ląstelių skaičius C6 ląstelių kultūroje statistiškai reikšmingai padidėjo, ląsteles paveikus 20 μM UR tiek 24 h, tiek ir 48 h (sudarė atitinkamai 12,4±4,3 proc. ir 64,8±3,8 proc.) (12 pav. A, B). Po 24 h Astro ląstelių inkubacijos su UR statistiškai patikimas nekrozės būdu žuvusių ląstelių skaičiaus padidėjimas nustatytas tik esant 40 μM UR koncentracijai (nekrozinės ląstelės sudarė 56,4±6,8 proc.), o po 48 h – 20 μM, taip pat kaip C6 (65,2±4,2 proc.) (12 pav. C, D). Nustatėme, kad UR neskatino nei C6, nei Astro ląstelių žūties apoptozės būdu: apoptozės būdu žuvusios ląstelės sudarė tik iki 1,25 proc. C6 ir 0,41 proc. Astro ląstelių populiacijos.
0 1 5 10 15 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 UR koncentracija (M) L ą s te li ų g y v y b in g u m a s ( p ro c .)
* * * * *
0 1 5 10 15 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 UR koncentracija (M) L ą s te li ų g y v y b in g u m a s ( p ro c .) Gyvos Nekrozinės Apoptozinės* * * * *
0 1 5 10 15 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 UR koncentracija (M) L ą s te li ų g y v y b in g u m a s ( p ro c .)* * *
0 1 5 10 15 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100 UR koncentracija (M) L ąs te li ų g y v y b in g u m a s ( p ro c .) Gyvos Nekrozinės Apoptozinės* * * *
24 h
48 h
C
6
A
s
tr
o
(A)
(B)
(C)
(D)
12 pav. UR poveikis C6 (A, B) ir Astro (C, D) ląstelių gyvybingumui. Stulpeliai – vidurkiai±standartinė
Priešingai mūsų rezultatams, pro-apoptozinis UR poveikis yra nustatytas įvairiose vėžinių ląstelių linijose: krūties, kepenų, kolorektalinio vėžio, plokščiojo epitelio karcinomos, gliomos ir kt. (11,44,69). Ląstelių gyvybingumas yra vertinamas tėkmės citometrijos metodu, ląsteles dažant PI ir aneksinu V (AV), kuris jungiasi su apoptozės būdu žūstančių ląstelių membranoje esančiu fosfatidilserinu (82). Bergamin et al. duomenimis, UR sukelia C6 ląstelių žūtį apoptozės būdu, ląsteles paveikus 15 μM ir 20 μM UR 24 h. Tiesa, autoriai atsižvelgė tik į ankstyvąją apoptozę (ląsteles, nusidažiusias AV, bet ne PI (AV+/PI-)), o nusidažymą ir AV, ir PI (AV+/PI+) interpretavo kaip vėlyvąją apoptozę ir neįvertino tokiu būdu žūstančių ląstelių skaičiaus (5). Tuo tarpu Lu et al. tyrime AV+/PI+ nusidažiusios ląstelės priskirtos žūstančioms nekrozės būdu ir buvo nustatyta, kad jų skaičius padidėja po DBTRG-05MG gliomos ląstelių inkubacijos su 17,5 μM UR 24 h (67). Zhu et al. pastebėjo, kad paveikus LN18 ir T98G gliomos ląsteles 12,5 μM UR 48 h, padidėja tiek nekrozinių (AV-/PI+), tiek apoptozinių (AV+/PI+, AV+/PI-) ląstelių skaičius (75). Taigi, UR sukeliama apoptozė gali vykti kartu su nekroze. Siūlytume tolimesniuose UR poveikio ląstelių gyvybingumui tyrimuose naudoti papildomus metodus apoptozei įvertinti, pavyzdžiui, su apoptoze susijusių baltymų (aktyvintų kaspazių, BAD, Bcl-2, Bcl-xL ir kt.) raiškos analizę (11,70).
3.3. C6 ir Astro ląstelių morfologiniai ir skaičiaus pokyčiai po poveikio UR
0 1 5 10 15 20 40 60 80100 0 1 5 10 15 20 40 60 80100 0 200 400 600 UR koncentracija (M) L ąs te li ų s k a ič iu s m a ty m o l a u k e 24 h 48 h
*
* * * *
*
*
* * * *
0 1 5 10 15 20 40 60 80 0 1 5 10 15 20 40 60 80 0 200 400 600 UR koncentracija (M) L ąs te li ų s k a ič iu s m a ty m o l a u k e 24 h 48 h*
*
*
* *
*
*
(A)
(B)
13 pav. UR poveikis C6 (A) ir Astro (B) ląstelių skaičiui. Stulpeliai – vidurkiai±SN (n=3); *– statistiškai
reikšmingas skirtumas lyginant su kontroline grupe (p<0,05)
Pastebėta, kad UR sukelia ląstelių morfologijos pokyčius mažesnėmis koncentracijomis nei gyvybingumo pakitimus. Pavyzdžiui, C6 ląsteles paveikus 10 μM ir didesnės koncentracijos UR tirpalais, jos tapo apvalesnės, turėjo mažiau ataugų, o Astro ląstelės, paveikus 15 μM ir 20 μM – buvo sukibusios į grupes (2 priedas, „fazių kontrastas“). Pastebėta, kad po inkubacijos su 15 μM ir 20 μM UR 24 h ir 48 h tiek Astro, tiek C6 ląstelių membrana yra nevientisa, terpėje daug smulkių atplaišų, nors pagal dažymą Hoechst/PI ląstelės yra gyvos (2 priedas). Panašūs pokyčiai pastebėti ir 24 h 15-20 μM UR veiktose DBTRG-05MG gliomos ląstelėse (67). Wang et al. nustatė, kad UR padidina nuo augimo paviršiaus atsiskyrusių U251 gliomos ląstelių skaičių (65) – tai galėjo vykti ir su C6 bei Astro ląstelėmis, joms ruošiantis žūti.
3.4. UR poveikis autofagijai C6 ir Astro ląstelėse
14 pav. UR poveikis C6 (A) ir Astro (B) ląstelių autofagijos procesui. Ląstelių morfologija – šviesinės
(fazių kontrasto) nuotraukos; citoplazma ir branduoliai – fluorescencinės nuotraukos, ląsteles nudažius AO (FITC filtras); rūgštinės organelės – fluorescencinės nuotraukos, ląsteles nudažius AO (TXRED filtras); bendras vaizdas – fluorescencinis AO nudažytų ląstelių vaizdas (perdengtos FITC ir TXRED
nuotraukos). Mikroskopas Olympus IX71S1F-3, objektyvas ×20, padidinimas – 500 kartų
skirtingų eksperimentų seriją: analizę elektroniniu mikroskopu, dažymą AO ir specifiniu autolizosomų dažu monodansilkadaverinu bei autofagijos žymens LC3-II raiškos tyrimą (64). Lin et al., be šių autofagijos požymių, dar tyrė autofagiją aktyvinančio baltymo p62 raišką (69).
3.5. UR įtaka C6 ir Astro ląstelių ATP koncentracijai
Viduląstelinio ATP koncentracijos pokyčiai buvo nustatomi ląsteles 24 h ir 48 h veikiant 10 μM, 15 μM ir 20 μM UR. C6 ląstelėse po 24 h inkubacijos statistiškai reikšmingas ATP koncentracijos sumažėjimas iki 26,4±4,9 proc., lyginant su kontrole, nustatytas esant 20 μM UR (15 pav. A). Tai taip pat buvo slenkstinė UR koncentracija, kuriai esant nustatytas statistiškai reikšmingas metabolinio aktyvumo sumažėjimas (11 pav. A) ir nekrozės būdu žuvusių ląstelių skaičiaus padidėjimas (12 pav. A). Po 48 h C6 ląstelių inkubacijos su UR viduląstelinio ATP koncentracijos pokytis buvo statistiškai reikšmingas, esant jau 15 μM UR (15 pav. A). Astro ląstelėse po 24 h inkubacijos statistiškai reikšmingo ATP lygio sumažėjimo nenustatyta, nors MTT testas parodė, kad esant 20 μM UR ląstelių metabolinis aktyvumas sumažėja (11 pav. B). Tačiau po 48 h, kaip ir C6 atveju, viduląstelinio ATP koncentracija statistiškai reikšmingai sumažėjo UR koncentracijai esant 15 μM (14 pav. B). Įdomu tai, kad 48 h veikiant C6 ir Astro ląsteles 15 μM UR, nebuvo nustatytas statistiškai reikšmingas ląstelių, žūstančių nekrozės būdu, skaičiaus padidėjimas. Esant šiai UR koncentracijai ATP lygis (lyginant su kontrole) buvo sumažėjęs iki 23,2±12,0 proc. ir 23,9±2,9 proc. atitinkamai C6 ir Astro ląstelėse.
0 10 15 20 0 10 15 20 0 10 20 UR koncentracija (M) A T P k o n c e n tr a c ij a ( M ) 24 h 48 h
*
*
*
0 10 15 20 0 10 15 20 0 10 20 30 UR koncentracija (M) A T P k o n c e n tr a c ij a ( M ) 24 h 48 h*
*
(A)
(B)
15 pav. Viduląstelinio ATP koncentracija C6 (A) ir Astro (B) ląsteles paveikus UR. Stulpeliai –
IŠVADOS
1. UR (≥20 μM) po 24 h ir 48 h inkubacijos daugiau nei 70 proc. sumažino C6 ir Astro ląstelių metabolinį aktyvumą.
2. UR mažina C6 ir Astro ląstelių gyvybingumą, sukeldama ląstelių žūtį nekrozės būdu. Po 24 h inkubacijos Astro ląstelių gyvybingumas sumažėja esant didesnei UR koncentracijai (40 μM) nei C6 (20 μM), o po 48 h UR poveikis abiem ląstelių linijoms pasireiškė esant tai pačiai UR koncentracijai (20 μM).
3. UR nesuaktyvino autofagijos proceso C6 ir Astro ląstelėse.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Abotaleb M, Liskova A, Kubatka P, Büsselberg D. Therapeutic potential of plant phenolic acids in the treatment of cancer. Biomolecules. 2020;10(2):1–23.
2. Sun CY, Zhang QY, Zheng GJ, Feng B. Autophagy and its potent modulators from phytochemicals in cancer treatment. Cancer Chemother Pharmacol. 2019;83(1):17–26.
3. Prasad S, Tyagi AK, Aggarwal BB. Chemosensitization by Ursolic Acid: A New Avenue for Cancer Therapy. In: Role of Nutraceuticals in Chemoresistance to Cancer. Elsevier Inc.; 2018. p. 99–109. 4. Shanmugam MK, Dai X, Kumar AP, Tan BKH, Sethi G, Bishayee A. Ursolic acid in cancer
prevention and treatment: Molecular targets, pharmacokinetics and clinical studies. Biochem Pharmacol. 2013;85(11):1579–87.
5. Bergamin LS, Figueiró F, Dietrich F, Manica F de M, Filippi-Chiela EC, Mendes FB, et al. Interference of ursolic acid treatment with glioma growth: An in vitro and in vivo study. Eur J Pharmacol. 2017;811(June):268–75.
6. Ren Y, Kinghorn AD. Natural Product Triterpenoids and Their Semi-Synthetic Derivatives with Potential Anticancer Activity. Planta Med. 2019;85(11–12):802–14.
7. Woźniak Ł, Skąpska S, Marszałek K. Ursolic acid - A pentacyclic triterpenoid with a wide spectrum of pharmacological activities. Molecules. 2015;20(11):20614–41.
8. Ramirez CN, Li W, Zhang C, Wu R, Su S, Wang C, et al. In Vitro-In Vivo Dose Response of Ursolic Acid, Sulforaphane, PEITC, and Curcumin in Cancer Prevention. AAPS J. 2018;20(1).
9. Liobikas J, Majiene D, Trumbeckaite S, Kursvietiene L, Masteikova R, Kopustinskiene DM, et al. Uncoupling and antioxidant effects of ursolic acid in isolated rat heart mitochondria. J Nat Prod. 2011;74(7):1640–4.
10. Chen J, Wong HS, Ko KM. Mitochondrial reactive oxygen species production mediates ursolic acid-induced mitochondrial uncoupling and glutathione redox cycling, with protection against oxidant injury in H9c2 cells. Food Funct. 2015;6(2):549–57.
11. Lewinska A, Adamczyk-Grochala J, Kwasniewicz E, Deregowska A, Wnuk M. Ursolic acid-mediated changes in glycolytic pathway promote cytotoxic autophagy and apoptosis in phenotypically different breast cancer cells. Apoptosis. 2017;22(6):800–15.
12. Ramos-Hryb AB, Pazini FL, Kaster MP, Rodrigues ALS. Therapeutic Potential of Ursolic Acid to Manage Neurodegenerative and Psychiatric Diseases. CNS Drugs. 2017;31(12):1029–41.
