(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

(1)

5 priedas

DARBAS ATLIKTAS ANALIZINĖS IR TOKSIKOLIGINĖS CHEMIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kokybinis ir kiekybinis B grupės vitaminų tyrimas maisto papilduose“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(2)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

GABIJA KRUOPYTĖ

KOKYBINIS IR KIEKYBINIS B GRUPĖS VITAMINŲ TYRIMAS

MAISTO PAPILDUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Vadovas: Prof. dr. Liudas Ivanauskas

(4)

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Parašas

Data

KOKYBINIS IR KIEKYBINIS B GRUPĖS VITAMINŲ TYRIMAS

MAISTO PAPILDUOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Liudas Ivanauskas Parašas Data: Recenzentas Vardas, pavardė Parašas Data: Darbą atliko Magistrantė Gabija Kruopytė Parašas Data: KAUNAS, 2020

(5)

3

TURINYS

SANTRAUKA...5 SUMMARY ... 6 SANTRAUPOS ... 8 ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Vitamino B3 literatūros analizė ... 11

1.1.1 Vitamino B3 cheminė struktūra ir fizikinės savybės ... 11

1.1.2 Vitamino B3 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai ... 11

1.3 Biotino literatūros analizė ... 15

1.3.1 Biotino cheminė struktūra ir fizikinės savybės... 15

1.3.2 Biotino biologinis poveikis, vitamino šaltiniai ... 15

1.5 B grupės vitaminų analizės metodai ... 20

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS... 24

2.1 Tyrimo objektas ... 24

2.2 B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis vertinimas ESC metodu... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28

3.1 ESC metodo pritaikymas ... 28

3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija biotinui ... 28

3.2.1 Biotino analizės specifiškumas ... 29

(6)

4

3.2.3 Biotino analizės tiesiškumas, aptikimo ir nustatymo ribos ... 32 3.3 Maisto papildų turinčių B grupės vitaminų analizės rezultatai ... 33 3.3.1 Vitamino B3 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose .... 33 3.3.2 Vitamino B6 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose .... 35 3.3.3 Biotino kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose ... 36 3.3.4 Vitamino B12 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose .. 38 3.3.5 Palyginamoji vit. B3 ir vit. B6 kiekybinė analizė maisto papilduose... 40 4. IŠVADOS ... 42 5. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 43

(7)

5

SANTRAUKA

G. Kruopytės magistro baigiamasis darbas „Kokybinis ir kiekybinis B grupės vitaminų tyrimas maisto papilduose“. Mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2020

Raktiniai žodžiai: B grupės vitaminai, efektyvioji skysčių chromatografija.

Tikslas: identifikuoti vitaminus B3, B6, B12 ir biotiną bei įvertinti jų kiekį B grupės turinčiuose maisto papilduose.

Tyrimo uždaviniai: parinkti tinkamiausią analizės metodą B grupės vitaminų kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui; atlikti pasirinktos metodikos validaciją B grupės vitaminų analizei; pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ir identifikuoti B grupės vitaminus deklaruojamus maisto papildų etiketėse; kiekybiškai įvertinti B grupės vitaminų sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei gautus duomenis palyginti su gamintojo deklaruojamais etiketėje vitamino kiekiais.

Darbo objektas: maisto papildų preparatai su B grupės vitaminais. Metodas: efektyvioji skysčių chromatografija.

Pagrindiniai tyrimo rezultatai ir išvados: pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodologija vitamino B3, B6, B12 ir biotino analizei. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika validuota biotinui atsižvelgiant į specifiškumo, atsikartojamumo, tiesiškumo parametrus. Atlikus kokybinį maisto papildų vertinimą vitaminas B6 buvo nustatytas visuose tirtuose maisto papilduose, vitaminas B3 buvo identifikuotas keturiuose maisto papilduose (X4, X5, X6, X7), vitaminas B12 identifikuotas tik viename maisto papilde (X3). Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacijos metu nustatyta biotino aptikimo riba – 0,2 µg/ml, nustatymo riba – 1,1 µg/ml, nors pasirinktų tirti maisto papildų ekstraktų koncentracija nurodyta 5-20 µg/ml ribose, vitaminas identifikuotas nebuvo. Įvertinus vitaminų kiekius gautus tyrimo metu, mažiausias vitamino B3 nuokrypis nuo deklaruojamo kiekio etiketėje būdingas maisto papildui X5 (-45 proc.), didžiausias – maisto papilduose X2 ir X3 (-100 proc.). Vitamino B6 mažiausi kiekio nuokrypiai nustatyti papilduose X3 (+45proc.) ir X5 (+27proc.), didžiausias maisto papilde X1 (+360 proc.). Vitaminas B12 identifikuotas tik maisto papilde X3, kurio nuokrypis nuo gamintojo deklaruojamo kiekio etiketėje yra -84 proc.

(8)

6

SUMMARY

Gabija Kruopytė Master‘s thesis „Qualitative and quantitative analysis B- group vitamins in food supplements“. Academic cordinator prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, medicine faculty, department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2020.

Keywords: Biotin, B-group vitamins, liquid chromatography.

Aim of search: the aim of study is to evaluate quantitative and qualitative determination of B-group vitamins in food supplements using High - performance liquid chromatography.

Tasks of research: to select the most appropriate analytical method for qualitative and quantitative analysis of B-group vitamins; to validate selected methodology for analysis of B-group vitamins, to apply HPLC method for the qualitative evaluation B-group vitamins, to compare obtained data with the manufacturers declared vitamin amounts.

Object: food supplements containing B-group vitamins. Method: high performance liquid chromatography

Results and conclusions: The applied HPLC method was suitable for determination of B-group vitamins in food supplements. The HPLC methodology was validated for biotin applying specificity, repeatability, linearity parameters. Following a qualitative evaluation of food supplements, vitamin B6 was detected in all tested food supplements, vitamin B3 has been identified in four food supplements (X4, X5, X6, X7), vitamin B12 has been identified in only one food supplement (X3). Biotin limit of detection – 0,5 µg/ml, limit of quantitation - 2,2 µg/ml, although the concentration of food supplement extracts were found to be in the range of 5 to 20 µg / ml, no vitamin was identified. After estimating the amounts of vitamin obtained during the study, the smallest deviation of vitamin B3 from the declared amount on the label is characteristic in food supplement X5 (45%), the largest - in food supplements X2 and X3 (100%). The smallest deviations of vitamin B6 content were found in supplements X3 (45%) and X5 (27%), the largest in food supplement X1 (360%). Vitamin B12 has been identified only in food supplement X3, which deviates from the amount declared by the manufacturer on the label by 84%.

(9)

7

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju savo darbo vadovui prof. Liudui Ivanauskui už konsultacijas, vertingus patarimus, pagalbą atliekant tyrimą bei rašant baigiamąjį darbą. Dėkoju lektoriui Mindaugui Marksai už bendradarbiavimą ir suteiktas žinias.

(10)

8

SANTRAUPOS

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija NAD – nikotinamido adenino dinukleotidas

NADP – nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas PLP – piridoksalio fosfatas

UESC – ultraefektyvioji skysčių chromatografija UV – ultravioletinė spinduliuotė

Vitaminas B3 – niacinas Vitaminas B6 – piridoksolis Vitaminas B7 – biotinas Vitaminas B12 – kobalaminas

(11)

9

ĮVADAS

Kiekvienos vaistinės asortimente gausu maisto papildų, kurių sudėtyje yra įvairių vitaminų ir mikroelementų. Nagrinėjant vaistinės asortimentą matyti, kadmaisto papildų etiketėse dažnai nurodyti B grupės vitaminai, kurie yra svarbūs daugeliui biocheminių procesų vykstančių žmogaus organizme, normaliam kūno augimui, tinkamam nervų sistemos darbui.

Vitaminai skirstomi į dvi stambias grupes – tirpius riebaluose arba vandenyje. Tirpiems vandenyje vitaminams priklauso tiaminas (vitaminas B1), riboflavinas (vitaminas B2), niacinas (vitaminas B3), pantenono rūgštis (vitaminas B5), piridoksinas (vitaminas B6), biotinas (vitaminas B7), folio rūgštis (vitaminas B9) ir kobalaminas (vitaminas B12). Trūkstant B grupės vitaminų teigiama, jog jaučiamas silpnumo jausmas, nuovargis, nervų sistemos funkcijų sutrikimo problemos.

Vandenyje tirpių B grupės vitaminų svarba dažnai nagrinėjama literatūroje. Vitaminas B3 naudojamas redokso reakcijose, jo trūkumas dažniausia siejamas su pelagra, kuri pasireiškia viduriavimu, dermatitu ir demencija [1]. Vitaminas B6 svarbus raudonųjų kraujo kūnelių gamyboje, o esant trūkumui pastebimas padidėjęs dirglumas, periferinė neuropatija, sideroblastinė anemija [2]. Vitaminas B7 būtinas baltymų, riebalų, angliavandenių apykaitoje, trūkumas gali sukelti širdies funkcijos sutrikimus, anemiją, depresiją [3]. Vitaminas B12 svarbus tinkamai nervų sistemos veiklai, trūkumas dažnai sukelia anemiją [2]. Norint išvengti vitaminų disbalanso ir palaikyti normalias organizmo funkcijas patariama vartoti B grupės vitaminų turinčius maisto papildus arba praturtinti maisto racioną produktais, kuriuose gausu trūkstamų vitaminų.

Siekiant užtikrinti maisto papildų vartojimo racionalumą būtina analizuoti jų sudėtį, ištirti kokybę ir kiekybę. Šio darbo tikslas yra identifikuoti vitaminus B3, B6, B12 ir biotiną bei įvertinti jų kiekį B grupės turinčiuose maisto papilduose, taip siekiant išsirinkti kokybiškiausią produktą iš didelės maisto papildų pasiūlos.

(12)

10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tyrimo tikslas: identifikuoti vitaminus B3, B6, B12 ir biotiną bei įvertinti jų kiekį pasirinktuose tirti B grupės turinčiuose maisto papilduose.

Tyrimo uždaviniai:

1. Parinkti tinkamiausią analizės metodą B grupės vitaminų kokybiniam ir kiekybiniam tyrimui. 2. Atlikti pasirinktos metodikos validaciją B grupės vitaminų analizei.

3. Pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ir identifikuoti B grupės vitaminus deklaruojamus maisto papildų etiketėse.

4. Kiekybiškai įvertinti B grupės vitaminų sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu bei gautus duomenis palyginti su gamintojo deklaruojamais etiketėje vitamino kiekiais.

(13)

11

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Vitamino B3 literatūros analizė

1.1.1 Vitamino B3 cheminė struktūra ir fizikinės savybės

Vitaminas B3 dar žinomas kaip vitaminas PP, kuris turi du aktyvius junginius – nikotino rūgštį

(niaciną) ir nikotinamidą. Vitaminas priklauso vandenyje tirpių vitaminų klasei [4]. Nikotino rūgšties cheminis pavadinimas – 3-piridinkarboksirūgštis, nikotinamido cheminis pavadinimas – 3- piridinkarboksiamidas, jų cheminės formulės nurodytos 1 pav. Abu junginiai lengvai virsta vienas kitu [5]. Vitaminas PP yra jautrus šviesos, deguonies poveikiui. [6]

Nikotino rūgštis (3-piridinkarboksirūgštis) Nikotinamidas (3-piridinkarboksiamidas)

1 pav. Vitamino B3 junginiai: nikotino rūgštis ir nikotinamidas

Iš vitamino B3 junginio niacino susintetinamos biologiškai aktyvios formos NADP+ ir NAD+, kurios atlieka svarbias ląstelėje funkcijas [4].

1.1.2 Vitamino B3 biologinis poveikis, vitamino šaltiniai

Vitamino B3 junginiai – nikotino rūgštis ir nikotinamidas lengvai virsta vienas kitu. Nikotinamidas gaunamas amidinant nikotino rūgštį, o nikotino rūgštis gaunama hidrolizuojant nikotinamidą. Iš vitamino B3 junginio niacino susintetinamos biologiškai aktyvios formos NADP+ ir

NAD+_{, kurios atlieka svarbias ląstelėje funkcijas. NAD}+ _{dalyvauja kaip substratas sintezės reakcijose, jo}

trūkstantgali pakisti ląstelių dalijimosi procesas, kuris ypač svarbus greitai besidalinantiems audiniams [7].

Vitaminas siūlomas vartoti kraujagyslių ligoms gydyti, nes turi antitrombozinį poveikį, pagerina endotelio funkciją [8],[7]. Jeigu padidėjęs mažo ir labai mažo tankio lipoproteinų kiekis tikslinga vartoti B3 preparatus, nes nikotino rūgštis inhibuoja lipolizę riebaliniame audinyje, taip kraujyje

sumažindami riebalų rūgštis, o kepenyse – trigliceridų sintezę, kas slopina mažo tankio lipoproteinų sintezę. NAD+ _{ir NADP}+ _{dalyvauja biologinės oksidacijos reakcijose susidarant redukuotiems NADH ir}

(14)

12

NADPH, kurie atlieka reguliacinę funkciją energijos apykaitoje. Nuo NADPH pertekliaus priklauso fermento gliukozės 6-fosfato hehidrogenazės aktyvumas, o NADH inhibuodamas fermentus reguliuoja Krebso ciklo oksidacinių reakcijų greitį [5].

Vitaminas B3 padeda metabolizuoti angliavandenius, riebalus, alkoholį. Vitaminas B3

dalyvauja ne tik biologinių procesų, tokiuose kaip energijos gamyba, cholesterolio ir riebalų rūgščių sintezė, valdyme, tačiau ir klinikinių ligų (diabetas, šizofrenija) gydyme. Palaiko normalią odos būklę. Vitaminas B3 yra svarbus žmogaus organizmui mikroelementas dėl savo savybių palaikyti cholesterolio kiekį ir normalų virškinimo sistemos darbą [9]. Nikotino rūgštis plečia kraujagysles ir mažina aterosklerozės riziką, todėl rekomenduojama vartoti kraujagyslių ligoms ir hiperlipoproteinemijai gydyti.

Nikotinamidas gali būti gaunamas keliais būdais: laikantis subalansuotos mitybos, kai valgomi kiaušiniai, mėsa, žuvis, grybai, arba kitu atveju nikotinamidas gaunamas endogeninio triptofano metabolizmo metu.

Vitamino B3 randama jautienoje, vištienoje, žemės riešutų svieste, žuvyje [10].

1 lentelė. Vitamino B3 šaltiniai

Produktas Vitamino B3 kiekis niacino ekvivalentais/100g

Jautienos kepenys 14,5 Lašiša 11,1 Kiauliena 10 Jautiena 10 Pupelės 7,0 Bulvės 3,0

Rekomenduojama vitamino B3 paros norma yra 14 mg niacino moterims ir 16 mg niacino

vyrams. Reikia atsižvelgti, jog nėščioms ir maitinančioms moterims vitamino poreikis yra didesnis [10]. Vitamino B3 trūkumą dažnai sukelia gaunamas nepakankamas vitamino kiekis su maistu arba susilpnėjusi rezorbcija plonojoje žarnoje. Vitamino B3 gali trūkti dažniau padidėjus vitamino poreikiui nėštumo metu arba laktacijos periodu. Trūkstant vitamino sutrinka oksidacijos procesai ląstelėse. Pažeidžiami greitai atsinaujinantys audiniai. Trūkstant vitamino B3 pasireiškia pelagra, kurios metu pažeidžiama oda (galimi įvairūs odos uždegiminiai procesai, būdingas dermatitas atsirandantis dėl saulės

poveikio), virškinamasis traktas (būdinga apetito stoka) ir nervų sistema (gali pasireikšti galvos skausmas, depresija, psichozės, silpnaprotystė) [11].

(15)

13

1.2 Vitamino B6 literatūros analizė

Vitaminas B6 (piridoksolis) apibūdinamas trimis aktyviais piridino grupės junginiais:

piridoksoliu, piridoksaliu, piridoksaminu bei kitomis fosforilintomis vitamino formomis. Vitaminas yra gerai tirpus vandenyje ir etanolyje, atsparus rūgščių ir temperatūrų poveikiui, tačiau neatsparus veikimui UV spinduliuote [6].

Piridoksolis Piridoksalis Piridoksaminas Piridoksolio

fosfatas

2 pav. Vitamino B6 junginiai

Vitaminas B6 svarbus aminorūgščių apykaitoje. Daugiausia funkcijų atlieka kofermentas piridoksalio fosfatas (PLP), kuris dalyvauja aminorūgščių metaboliniuose procesuose. Dėl savo struktūros PLP gali dalyvauti ir kitose svarbiose reakcijose: glikogenolizėje, aminorūgščių dekarboksilinime, skydliaukės hormonų biosintezėje, vitamino PP sintezėje ir kt. [12]. Kofermentas PLP dalyvauja dopamino, norepinefrino, seratonino, γ-aminosviesto rūgšties sintezėje, trūkstant vitamino B6 sutrinka nervų sistemos funkcijos, galimas dirglumas, depresija. Vitaminas B6 triptofano metabolizmo metu veikia kaip kofaktorius ir apsaugo nuo neurotoksinių produktų kaupimosi [13]. Vitaminas B6 aktyviai dalyvauja sveikų raudonųjų kraujo kūnelių gamyboje, taip pat sumažina krūties vėžio riziką [14],[15].

(16)

14

Vitamino B6 rekomenduojama paros dozė iki 1 mg vaikams, suaugusiems - 1,3 mg, nėščiosioms - 1,9 mg, maitinančioms iki 2 mg [10]. Per didelės vitamino B6 dozės gali sukelti periferinę neuropatiją ir nervų degenergaciją, perdozavus vitamino ir nutraukus jo vartojimą šie pakitimai yra negrįžtami. Cukriniu diabetu sergantiems asmenims dažnai yra vitamino B6 stygius, nes vitaminas dalyvauja triptofano katabolizme, kuris gali daryti įtaką insulino sekrecijos kiekiui ir gliukozės tolerancijai [13].

Vitaminas B6 randamas ir gyvūninės, ir augalinės kilmės produktuose. Didelė vitamino koncentracija randama mėsoje (jautienoje, jautienos kepenyse, viščiukų kepenyse), kiaušinio trynyje, ir ankštinėse kultūrose. Vitamino B6 taip pat randama bananuose, žuvyje, alaus mielėse. [5].

Produktas Vitamino B6 kiekis mg/100g

Kukurūzai 2,30 Kviečių sėlenos 2,40 Jautiena 0,25 Kiauliena 0,57 Lašiša 0,98 Sojų pupelės 0,95 Bulvės 0,20

Vitamino B6 avitaminozė pasireškia retai, tačiau yra veiksnių kas gali daryti įtaką šio vitamino

trūkumui. Būtina įvertinti, kad skiriant gydymą pacientui antituberkulioziniais vaistais tokiais kaip izoniazidas arba gydant pacientus sulfidrilo junginiais tokiais kaip penicilaminu yra galima šio vitamino hipovitaminozės rizika. Gydantis antibiotikais galimas vitamino B6 trūkumas, dėl susilpnėjusios žarnyno

bakterijų veiklos ir pakitusios mikrofloros. Nėštumo ir laktacijos periodu vitamino poreikis padidėja [12].

Vitamino B6 trūkumas gali sukelti nervų sistemos pažeidimus: epilepsijos priepuolius,

depresiją, periferinę neuropatiją, padidėjusį dirglumą, nervingumą [13]. Trūkstant vitamino B6

(17)

15 1.3 Biotino literatūros analizė

1.3.1 Biotino cheminė struktūra ir fizikinės savybės

Vitaminas B7 yra žinomas kaip biotinas, vitaminas H, koenzimas R (C10H16N2O3S), kuris

priklauso tirpių vandenyje vitaminų klasei. Cheminis junginio pavadinimas 2‘-okso-3,4-imidazoli-2 tetrahidrotiofenpentano rūgštis. Vitamino stabilumui įtaką daro šarmų, rūgščių poveikis bei šviesa [6].

3 pav. Biotino cheminė formulė

1.3.2 Biotino biologinis poveikis, vitamino šaltiniai

Biotinas yra ligazių klasės fermentų kofermentas. Fermento ir biotino kompleksas gaunamas vitaminui jungiantis amidiniu ryšiu su tokiais biotininiais fermentais kaip propionil-CoA-karboksilaze (trumpinys-PCC), kuri katalizuoja fermentus svarbius amino ir riebalų rūgščių katabolizme, metilkrotanil-CoA-karboksilaze (trumpinys-MCC), kuri katalizuoja fermentus svarbius leucino ir izovalerijono rūgšties katalizei ir acetil-CoA karboksilaze (trumpinys-ACC), dalyvaujančioje riebalų rūgščių biosintezėje [17]. Taigi, biotinas daro įtaką organizmui svarbioms reakcijoms: riebalų rūgščių sintezei, angliavandenių sintezei, leucino apykaitai ir kt.

Dėl savo kainos ir lengvo prieinamumo šis vitaminas yra populiari medžiaga maisto papildų sudėtyje, kurie skirti plaukų slinkimui mažinti ir normaliai odos būklei palaikyti. Biotinas dažnai rekomenduojamas kaip maisto papildas plaukams stiprinti, todėl daugelyje plaukų ir odos kosmetikos ir maisto papildų sudėtyje galime jį rasti, nors pats biotinas nedaro tiesioginės įtakos kultūrinių žmogaus folikulų keratinocitų proliferacijai ir diferenciacijai [18].

Biotino trūkumas žmogaus organizme pasireiškia retai, nes žarnyno bakterijos pačios sintetina šį vitaminą, tačiau susirgus virškinamojo trakto ligomis tokiomis kaip virškinamojo trakto disbakteriozė, organizmas gali negebėti pats susintezuoti pakankamą kiekį biotino. Biotinas gali būti gaunamas kartu su maistu, jo galima rasti tiek augalinės, tiek gyvūninės kilmės produktuose. Vitamino didesni kiekiai

(18)

16

randami kiaušinyje (ypač gausus jo kiekis yra trynyje), pieno produktuose (sūryje, piene), mėsoje (kiaulienoje, kiaulienos kepenyse), avižiniuose dribsniuose, šiek tiek mažiau daržovėse, vaisiuose ir kt [18].

3 lentelė. Biotino šaltiniai

Maisto produktas Biotino kiekis µg/100 g

Kiaušinio trynys (kiaušinis) 53,0 (25,0)

Kiaulienos kepenys 27,0 Avižiniai dribsniai 20,0 Sūris 6,2 Karvės pienas 3,5 Kiauliena 5,0 Morka 5,0 Obuolys 4,5 Špinatai 6,9

Biotinas yra būtinas žmogaus organizmui vitaminas, kurio reikalinga paros dozė suaugusiam žmogui yra 30 μg [19]. Nėščiosioms rekomenduojama paros dozė – 30 µg, naujagimiams rekomenduojama skirti 5 µg per parą, o moterims laktacijos periodu 35 µg [10].

Biotino trūkumas gali būti įgytas arba įgimtas. Biotino kiekio stygius naujagimiams atsiranda dėl fermento halokarboksilazės trūkumo, dažniausia pasireiškia per pirmas 6 gyvenimo savaites ir pasireiškia dermatitu, alopecija, antakių ir blakstienų nebuvimu [20]. Žmogaus žarnyno bakterijoms sintetinant biotiną, jo trūkumas pasireiškia retai, tačiau avitaminozei būdingi tokie požymiai: dermatitas (paraudusi ir pleiskanota oda), komplikuojantis šiai būklei galimas plaukų slinkimas, nagų skilinėjimas, jaučiamas raumenų skausmas, širdies sutrikimai. Pažeidžiama nervų sistema, jaučiamas mieguistumas, depresija, sunkiais atvejais – paralyžius. Biotino trūkumas gali turėti neigiamos įtakos moters reprodukcinei sistemai [21].

Reikėtų atsižvelgti, kad nėštumo laikotarpiu paspartėja biotino katabolizmas, o laktacijos periodu, dėl padidėjusio vitamino poreikio reikia palaikyti didesnę biotino koncentraciją kraujyje [18]. Dažnai vitamino trūkumą gali sukelti ne tik ligos, tačiau ir mitybos ypatumai: galima susirgti valgant daug žalių kiaušinių, nes kiaušinio baltyme yra daug glikoproteino avidino, kuris žarnyne susijungia su biotinu ir sudaro vandenyje netirpų ir nerezorbuojamą kompleksą. Vitamino hipovitaminozė taip pat galima dėl vartojamų vaistų – sulfanilamidų, kurie slopina žarnyno bakterijų veiklą ir taip stabdo vitamino biosintezę. Didesnis šio vitamino trūkumas pastebimas žmonėms sergantiems alkoholizmu, rūkantiems ir vyresnio amžiaus žmonėms [18].

(19)

17 1.4 Vitamino B12 literatūros analizė

Vitaminas B12 yra vandenyje tirpus vitaminas, kurio cheminis molekulės pavadinimas yra

α-(5,6-dimetilbenzimidazol-1-il) kobamido cianidas. Vitaminas yra atsparus temperatūros poveikiui, tačiau paveiktas rūgščių ar šviesos – kinta. [6]. Pagrindinis B12 cheminės struktūros bruožas yra korino

žiedas, kurio keturi pirolo žiedų azoto atomai susijungia su centriniu kobalto atomu, kuris paprastai būna Co(III) oksidacijos būsenoje. B12 molekulę atpažįstama dėl kobalto atomo, kuris yra susijungęs su

heterociklinės bazės 5,6-dimetilbenzimidazolo azoto atomu (trumpinys-DMB) [22],[23].

4 pav. Vitamino B12 cheminė formulė

Dvi pagrindinės vitamino B12 biologinės formos yra metilkobalaminas ir

deoksiadenozilkobalaminas (vitamino B12 kofermentas), jie abu turi alkilo grupes, o dėl Co-C ryšių gali

būti lengvai suskaidomos, nes jų disociacijos energija yra maža, kai nėra šviesos energijos. Dėl šių savybių metilkobalaminas ir deoksiadenozilkobalaminas yra naudojami kaip kofaktoriai fermentų katalizėje. Esant kitokiai B12 biologinei formai pvz. cianokobalamino atveju, biologinio poveikio nėra ir

(20)

18

B12 yra reikalingas folio ir riebalų rūgščių apykaitos procesuose [25]. Metilkobalaminas

(metil-B12) dalyvauja metionino sintezėje, kurios metu homocisteinas virsta į metioniną. Reakcija vyksta citozolinėje aplinkoje, o dėl vitamino kofaktoriaus trūkumo padidėja N-metil-THFR kiekis, kas daro įtaką, jog proceso eigoje THRF darinių trūksta, tad sutrinka aminorūgščių sintezė (metionino sintezė iš homocisteino). Šis procesas yra būtinas, o disfunkcija paveikia DNR sintezę, fiziologinius procesus, kuriems reikalinga intensyvi ląstelių replikacija. Deoksiadenozilkobalaminas (5’-adenozil-B12) reikalingas riebalų rugščių apykaitoje. Metilmalonil-CoA inhibuoja riebalų rūgščių biosintezę, todėl galimi neurologiniai sutrikimai dėl ląstelių atrofijos, audinių vientisumo pokyčių, aksonų pažeidimų, audinio demielinizacijos. Neuronų mielino apvalkalų būklė itin priklauso nuo riebalų rūgščių metabolizmo, todėl dėl nedidelio deoksiadenozilkobalamino biologinio praeinamumo neuronuose, mielino sluoksnis išeikvojamas, atsiranda nervų signalų perdavimo sutrikimai [26].

Vitamino B12 šaltiniai yra gyvūninės kilmės produktai: kiauliena, žuvis, paukštiena, kepenys,

inkstai ir kt. Tik labai maži kiekiai vitamino randami tokiose daržovėse kaip brokoliai, šparagai, pupų daigai. Vitamino B12 didesni kiekiai daržovėse randami tokiuose augaliniuose produktuose, kurie buvo

apdoroti fermentuojant tam tikromis pieno rūgštimis ar propioninėmis bakterijomis. Vitamino B12 yra

įvairių rūšių arbatos lapuose, auksinėse voveraitėse (Cantharellus cibarius), jūros dumbliuose (Enteromorpha sp) ir kt. [26].

Maisto produktas Vitamino B12 kiekis µg/100 g

Kiauliena 4

Žuvis 9

Arbatos lapai 0,1-1,2

Auksinės voveraitės 1,09-2,65

Rekomenduojama vitamino B12 paros dozė vyrams ir moterims – 2,4 µg. Nėštumo metu ir

maitinant kūdikį vitamino poreikis didesnis, atitinkamai 2,6 µg ir 2,8 µg. [10]

B12 yra būtinas eritropoezės funkcijai ir nervų sistemos tinkamai veiklai. Trūkumas gali sukelti

makrocitinę anemiją, kuri panaši į folio rūgšties trūkumą. Norint jas atskirti būtina nustatyti homocisteino ir metilmalono rūgšties kiekį serume. Vitamino B12 trūkumas yra išgydomas, tačiau

negydomas gali sukelti sunkius neurologinius sutrikimus. Naujagimiams, kuriems trūksta vitamino B12

(21)

19

vitamino trūkumo nustatymas yra efektyvesnis nei gydymas pradėtas simptominėje stadijoje [27]. Vitamino B12 trūkumas yra labai dažnas senyvo amžiaus žmonėms. Pagrindinės būklės, kurias sukelia

kobalamino trūkumas: nepageidaujami reiškiniai kraujotakos sistemai (labai dažnai makrocitozė, makrocitinė aemija, neutrofilų hipersegmentacija, rečiau trombocitopenija, neutropenija), nervų sistemos sutrikimai (labai dažni polineuritas, ataksija, retai optinė atrofija, šlapimo ar išmatų nelaikymas), virškinimo trakto sutrikimai (pagrindiniai simptomai medžiotojo glositas, gelta, bilirubino kieko padidėjimas, rečiau pilvo skausmas, pykinimas, vėmimas, viduriavimas), kiti sutrikimai (nuovargio jausmas, apetito nebuvimas) [28].

Vitaminas B12 yra būtinas nervų sistemai, norint išvengti nervinio audinio demielinizacijos,

ląstelių atrofijos, audinių vientisumo pokyčių, aksonų pažeidimų. Jo trūkumas gali būti besimptomis, nors pacientai ir patiria sunkų nepakankamumą. Vitamino B12 trūkumas gali būti matomas magnetinio

rezonanso tomografijos vaizduose, tačiau įprastai MRT smegenų tyrimas ne visada parodo visus vitamino trūkumus [29].

(22)

20

1.5 B grupės vitaminų analizės metodai

Vandenyje tirpūs vitaminai yra žinomi dėl savo svarbos energijos metabolizme, norint palaikyti sveiką odą, plaukus, raumenis. Jų trūkumas ar perteklius gali sukelti medžiagų apykaitos sutrikimus, dėl kurių atsiranda tokių sveikatos sutrikimų kaip anemija, įvairūs neurologiniai sutrikimai, pelagra. Remiantis Europos parlamento ir tarybos reglamentu (EB) Nr. 1925/2006 nutarimu dėl maisto produktų papildymo vitaminais ir mineralais bei tam tikromis kitomis medžiagomis suprantama, jog norint kontroliuoti potencialią riziką vartotojams reikia žinoti bendrus vitaminų kiekius, kad būtų išvengiama trūkumo ar vitaminų pertekliaus [6]. Per didelis vitaminų kiekis gali turėti neigiamų pasekmių, tad būtina atsižvelgti į rekomenduojamas vitaminų paros normas. Tikslūs vitaminų analizės metodai yra svarbūs norint patvirtinti nurodytą vitaminų kiekį etiketėje. Vandenyje tirpių vitaminų analizė yra sudėtinga dėl mažų vitamino kiekių ir skirtingų koncentracijų, sąveikos su kitais junginiais. [30], [31].

Ypatingas dėmesys turėtų būti skiriamas mėginių paruošimui dėl vitaminų cheminio nestabilumo. Visi mėginiai turėtų būti ruošiami tamsaus stiklo induose, palaikant optimalią temperatūrą ir pH viso tyrimo metu. Norint išvengti vitaminų oksidacijos rekomenduojama naudoti tinkamus stabilizatorius, tai ypač svarbu vitaminui B9, kuris yra linkęs greitai oksiduotis.

Analizuojant literatūros šalinius dažniausia pasirenkami metodai norint įvertinti vandenyje tirpių vitaminų kiekybę yra chromatografijos metodai tokie kaip efektyvioji skysčių chromatografija, atvirkštinių fazių skysčių chromatografija ir kt. Taip pat minimas kapiliarinės elektroforezės metodas.

Literatūroje minimuose tyrimuose vitaminas B3 (niacinas), vitaminas B6 (piridoksinas), vitaminas B7 (biotinas) esantys maisto papilduose tiriami skysčių chromatografijos metodu su masių spektrometrija. B3 (nikotinamidas), B6 (piridoksinas) gali būti tiriami naudojant diodų matricos nustatymo metodą. Vitaminas B7 yra gana atsparus UV spinduliuotei, tad analizuoti pritaikant ją gali būti sudėtinga [30].

Kapiliarinė elektroforezė

Kapiliarinė elektroforezė yra efektyvi, tačiau nėra tokia jautri lyginant su kitais chromatografijos metodais [32]. Pasirinkus kapiliarinei elektroforezei tinkamus detektorius (fluorescencijas) gaunami analitės rezultatai. Naudojant kapiliarinės elektroforezės metodą mėginiai ekstrahuojami ultragarsu acetonitrilo ir vandens mišiniu, kurio santykis 20:80. Pasirinktas elektrolitas – natrio borato buferinis tirpalas, kurio pH=9. Aptikimo ribos (LOD) buvo intervale nuo 2,5 iki 36 mg/l. Santykinis standartinis nuokrypis 1,3 - 1,9%. Metodas tinkamas tiksliai nustatyti vitamino B1, B2, B3 ir B6 kiekį maisto papilduose [33].

(23)

21

Atviršktinių fazių skysčių chromatografija

Remiantis literatūros šaltiniais metodas naudojamas vandenyje tirpių vitaminų kiekybei nustatyti. Judrioji fazė yra poliškesnė už nejudriąją. Tarp skirtingų fazių, dažniausia naudojama C18 tipo kolonėlė, eliuuojant vandens ir organinių tirpiklių (etanolio, metanolio) mišiniu [6]. Metodas sėkmingai naudojamas vandenyje tirpių vitaminų junginių nustatymui: nikotinamido, nikotino rūgšties, piridoksalo, piridoksamino, kobalamino.

Ultra efektyvioji skysčių chromatografija (UESC)

Ultra efektyviosiosios skysčių chromatografijos analizei būdinga didelė skiriamoji geba, naudojama chromatografavimo kolonėlė, kurios sorbentų dalelių dydis 2 µm, o slėgis ypač didelis. Dėl itin aukštos skiriamosios gebos galima atskirti homologiškus vitaminus ir aptikti jų mažus kiekius. Literatūroje minima, jog vienu metu nustatant tris vitamino B6 junginius – piridoksalą, piridoksiną,

piridoksaminą, jų fosforilines formas, vitamino B2 junginius, jų fosforilines formas analizė efektyviosios

skysčių chromatografijos metodu buvo atlikta per 6 minutes [6].

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)

Literatūros šaltiniuose nagrinėjama vitamino B12 ir biotino nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Cianokobalamino ir biotino tyrimas mišiniuose yra sudėtingas dėl didelio vitamino B12 kiekio, kas gali apsunkinti vitamino B7 analizę. [21].

Visi naudoti reagentai analitinio švarumo. Ruošiami standartiniai vitamino B12 ir biotino tirpalai, kurių koncentracijos 160 μg ir 200 μg atitinkamai. Biotino standartui gaminti buvo papildomai dedama 200 μl 1 N NaOH, kad medžiaga geriau tirptų. Atlikus kelis skiedimus paruošti 6 tirpalai, kurių koncentracijos – nuo 92 ng/ml iki 9200 g/ml biotinui ir nuo 4,846 ng/ml iki 484,6 ng/ml vitaminui B12. Šie tirpalai naudojami tiesiškumo parametrui įvertinti [21],[34].

(24)

22

Mėginių paruošimas – B grupės vitaminų turinčios tabletės sutrinamos grūstuvėje, analitinėmis svarstyklėmis atsveriama po 0,5 g (tikslus svoris). Atsvertas mėginys ištirpinamas 100 ml vandenyje, kaitinamas 80°C 15 minučių, po to 15 min laikomas ultragarso vonioje. Tiriamam tirpalui atšalus iki kambario temperatūros mėginiai filtruojami pro 0,45 μm filtrą į analizinius indus. Šio tiriamojo tirpalo sudėtis turėtų būti 40 μg/ml vitamino B12 ir 0,8 μg/ml biotino. Paruoštas etaloninis B12 tirpalas, kurio koncentracija 40 μg/ml ir etaloninis biotino tirpalas, kurio koncentracija 0,8 μg/ml. [21]. Žemiau pateikiama B12 tiriamojo mėginio ir standarto chromatograma (5 pav.) ir biotino tiriamojo ir standarto chromatograma (6 pav.).

5 pav. Vitamino B12 standarto ir tiriamojo mėginio chromatograma [21]

(25)

23

Norint validuoti šį analizės metodą vitaminui biotinui ir vitaminui B12, pasirinktas vienas iš kriterijų – tiesiškumas. Vitamino B12 ir biotino tiesinės regresijos kreivės pavaizduotos žemiau. (7 pav., 8 pav.). Įvertinami koreliacijos koeficientų rezultatai.

7 pav. Vitamino B12 tiesinės regresijos kreivė [21]

8 pav. Biotino tiesinės regresijos kreivė [21]

Tyrimo metu gauti koreliacijos koeficientų rezultatai yra tinkami metodo validacijai. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas sėkmingai pritaikytas biotino ir vitamino B12 tyrime. Atsižvelgus į metodo galimybes aptikti mažus medžiagų kiekius ir metodo ekonomiškumą, pasirinkau pritaikyti šį metodą savo tyrime.

(26)

24

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKOS

2.1 Tyrimo objektas

Tyrime analizuojami maisto papildai, kurių sudėtyje yra vitaminai B3, B6, B7 ir B12. Maisto

papildai pasirinkti atsitiktinai, siekiant įvertinti jų sudėtyje esančių B grupės vitaminų kokybinę sudėtį ir įvertinti kiekybiškai efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Visi tyrime analizuojami maisto papildai įsigyti Lietuvos vaistinėse. Tyrime analizuojami maisto papildai:

• X1 (pagaminta Lenkijoje) • X2 (pagaminta Danijoje) • X3 (pagaminta Belgijoje)

• X4 (pagaminta Jungtinėje Karalystėje) • X5 (pagaminta Danijoje)

• X6 (pagaminta Jungtinėje Karalystėje) • X7 (pagaminta Danijoje)

• X8 (pagaminta Danijoje) Maisto papildų sudėtis

X1 dviejose tabletėse yra 102 mg magnio, 2 mg vitamino B6. Pagalbinės medžiagos: magnio laktatas, užpildas mikrokristalinė celiuliozė, tirštiklis polivinilpirolidonas, lipnumą reguliuojančios medžiagos, riebalų rūgščių magnio druskos ir silicio dioksidas, piridoksino hidrochloridas, stabilizatorius polivinilpolipirolidonas.

X2 vienoje tabletėje yra 1,65 mg tiamino (vit. B1), 1,4 mg riboflavino (vit. B2), 24 mg niacino, 2,4 mg vitamino B6, 2,5 mg vitamino B12, 400 mg folio r., 9 mg pantoteno r., 50 mg biotino, 80 mg vitamino C, 20 mg vitamino D, 120 mg kalcio, 56,25 mg magnio, 14 mg geležies, 10 mg cinko, 1000 mg vario, 150 mg jodo, 3 mg mangano, 40 mg chromo, 55 mg seleno, 50 mg molibdeno. Pagalbinės medžiagos: kalcio karbonatas, magnio hidroksidas, mikrokristalinė celiuliozė, talkas, šelakas, gumiarabikas, karnaubo vaškas, glicerolis, titano dioksidas.

X3 vienoje tabletėje yra 18 mg pantenono rūgšties, 16 mg niacino, 5,6 mg vitamino B6, 5,6 mg vitamino B2, 4,4 mg vitamino B1, 0,3 mg folio rūgšties, 200 µg biotino, 10 µg vitamino B12. Pagalbinės medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, hidroksipropilmetilceliuliozė, natrio karboksimetilceliuliozė, talkas, magnio druskos, hidroksipropilceliuliozė, palmių aliejus, kokosų aliejus, glicerolis, geležies oksidas, titano dioksidas.

X4 dviejose tabletėse yra 600 mg RE vitamino A, 1,3 mg tiamino (vit. B1), 1,5 mg riboflavino (vit. B2), 1,6 mg vitamino B6, 2 mg vitamino B12, 300 mg folio r., 17 mg NE niacino, 6 mg

(27)

25

pantoteno r., 50 mg biotino, 75 mg vitamino C, 25 mg vitamino D, 10 mg α-TE vitamino E, 400 mg kalcio, 67,5 mg magnio, 9 mg geležies, 9 mg cinko, 900 mg vario, 150 mg jodo, 2 mg mangano, 40 mg chromo, 50 mg seleno, 50 mg molibdeno. Pagalbinės medžiagos: kalcio karbonatas, maltodekstrinas, magnio hidroksidas, užpildas (mikrokristalinė celiuliozė), glajinės medžiagos (hidroksipropilmetilceliuliozė, riebalų rūgščių magnio druskos, akacijų derva, talkas, šelakas, karnaubos vaškas), geležies fumaratas, drėgmę išlaikanti medžiaga (glicerolis), dažiklis (titano dioksidas), kalcio D-pantotenatas, mangano sulfatas, polifruktozė.

X5 vienoje tabletėje yra 2 mg liuteino esterių, 20 mg žaliosios arbatos ekstrakto, 10 mg fosfatidilcholino, 2 mg kofermento Q10, 10 mg L-karnitino, 20 mg alfa lipo rūgšties, 10 mg bioflavanoidų, 2 mg betakaroteno, 10 µg vitamino D3, 15 mg α-TE vitamino E, 60 mg vitamino C, 14 mg vitamino B1, 4 mg vitamino B2, 30 mg NE vitamino B3, 10 mg vitamino B6, 200 µg folio r., 5 µg vitamino B12, 50 µg biotino, 6 mg pantoteno r., 60 mg magnio, 10 mg geležies, 15 mg cinko, 1000 µg vario, 0,5 mg mangano, 120 µg seleno, 75 µg chromo. Pagalbinės medžiagos: mikrokristalinė celiuliozė, silicio dioksidas, vario chlorofilinai (dažiklis).

X6 vienoje tabletėje yra 800 µg RE vitaminas A, 1,7 mg vitamino B1, 2 mg vitamino B2, 2,4 mg vitamino B6, 4,5 µg vitaminas B12, 50 mg vitamino C, 5 µg vitamino D, 8 mg α-TE vitamino E, 150 µg folio r., 14 mg NE niacino, 4,5 mg pantoteno r., 100 mg kalcio, 50 mg magnio, 12 mg geležies, 0,45 mg vario, 150 µg jodo, 1,2 mg mangano, 20 µg chromo, 25 µg seleno, 50 µg molibdeno. Pagalbinės medžiagos: saldikliai (ksilitolis, acesulfamas K, aspartamas, neohesperidinas DC, taumatinas), glajinės medžiagos (polivinilpirolidonas, riebalų rūgščių magnio druskos, šelakas), kvapiosios medžiagos.

X7 dviejose tabletėse yra 99 mg vienmečių paprikų ekstrakto, atitinkančio 396 mg vaisių, 53 mg kvapiųjų rozmarinų lapų miltelių, 50 mg dirvinių asiūklių miltelių, 26 mg pipirmėtės lapų miltelių, atitinkančių 26 mg lapų, 20 mg paprastųjų kraujažolių miltelių, 7 mg paprastųjų moliūgų sėklų miltelių, 7 mg grauželinių gudobelių lapų ir žiedų ekstrakto, atitinkančio 42 mg lapų ir žiedų, 800 mg RE vitamino A, 1,1 mg tiamino (vit. B1), 1,4 mg riboflavino (vitamino B2), 1,4 mg vitamino B6, 2,5 mg vitamino B12, 200 mg folio r., 16 mg NE niacino, 6 mg pantoteno r., 50 mg biotino, 80 mg vitamino C, 20 mg vitamino D, 12 mg α-TE vitamino E, 400 mg kalcio, 14 mg geležies, 10 mg cinko, 1 mg vario, 150 mg jodo, 2 mg mangano, 40 mg chromo, 55 mg seleno, 50 mg molibdeno. Pagalbinės medžiagos: užpildai (mikrokristalinė celiuliozė, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė), glajinės medžiagos (riebalų rūgščių magnio druskos, hidroksipropilmetilceliuliozė, šelakas, polietilenglikolis, karnaubo vaškas).

(28)

26

2.2 B grupės vitaminų kokybinis ir kiekybinis vertinimas ESC metodu Reagentai

Tyrime naudotos medžiagos ir reagentai yra analitinio švarumo: 98 proc. trifluoracto rūgštis (Sigma Aldrich, Šveicarija), 99,9 proc. acetonitrilas (Sigma Aldrich, Vokietija), 70 proc. metanolis (Sigma Aldrich, Vokietija), išgrynintas vanduo (Milipore, JAV).

Apraratūra ir įranga

Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Vokietija) Vandens gryninimo sistema (Milipore, JAV)

Ultragarso vonelė (Biosonic UC100, JAV)

Centrifuga („Centurion Scientific C2006“, Jungtinė Karalystė) Kolonėlė ACE 5 C18 (250 x 4,6 mm, x 5µm)

Chromatografas Waters 2695

Etaloninių tirpalų paruošimas

Visi etaloniniai tirpalai buvo ruošiami tirpinant medžiagas 70% metanolyje. Vitaminui B3 ruošiami 5 skirtingų koncentacijų mėginiai, kurių koncentracija 5,77 – 92,1 mkg/ml ribose, vitaminui B6 ruošiami 8 skirtingų koncentracijų mėginiai, kurių koncentracija 0,21 – 22,6 mkg/ml ribose, vitaminui B12 ruošiami 8 skirtingų koncentracijų mėginiai, kurių koncentracija 0,24 – 31,9 mkg/ml, biotinui ruošiami 6 skirtingų koncentracijų mėginiai, kurių koncentracija 5,93 – 190 mkg/ml. Visi gauti mėginiai supilami į chromatografinius buteliukus, užsukami, patalpinami į chromatografo mėginių lizdą tolimesniems tyrimams.

(29)

27 Tiriamųjų tirpalų paruošimas

Tyrime analizuojamų maisto papildų tabletės buvo susmulkintos po vieną grūstuvėje, pasvertos. Tyrimui naudotų tablečių masės: X1=0,59 g, X2=0,95 g, X3=0,75 g, X4=1,15 g, X5=1,02 g, X6=0,96 g, X7=1,8 g. Atsverti milteliai suberti į 10 ml matavimo kolbas, ištirpinti 8 ml 70 proc. metanolyje. Mėginiai tirpinami ultragarso vonelėje 20 minučių. Praskiedžiami iki 10 ml 70 proc. metanoliu. Tirpalai centrifuguojami 5 min taikant 3600 apsisukimus per minutę, kad nusistovėtų nuosėdos. Gautus mėginių supernatantus patalpiname į chromatografinius buteliukus, užsukame, patalpiname į skysčių chromatografą tyrimui atlikti.

Metodika/metodo sąlygos

Analizei atlikti taikoma gradientinė eliuacija, naudojant du eliuentus: A – trifluoracto rūgšties vandeninį tirpalą (0,1%), B – acetonitrilą. Eliuento tekėjimo greitis – 1 ml/min, analizės laikas - 24 minutės, kolonėlės temperatūra 25 °C. Analizės metu injekuojama po 10 µl tiriamojo tirpalo. Vitaminas B3 identifikuojamas prie 260 nm bangos ilgio, vitaminas B6 prie 290 nm bangos ilgio, vitaminas B12 prie 360 nm bangos ilgio, biotinas prie 207 nm bangos ilgio. Gradientinio režimo sąlygos nurodytos 5 lentelėje.

5 lentelė. Gradientinio režimo sąlygos

Chromatografavimo laikas, min

Judančioji fazė A, % Judančioji fazė B, %

0 98 2

1 98 2

20 2 98

22 2 98

(30)

28

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 ESC metodo pritaikymas

Remiantis literatūros apžvalga B grupės vitaminų – B3, B6, B12 ir biotino kiekybei ir kokybei nustatyti pasirinktas ESC metodas. ESC metodas pasižymi selektyvumu, tikslumu, efektyvumu ir trumpa tyrimo trukme lyginant su kitais chromatografavimo metodais. Metodui atlikti naudojamas chromatografas Waters 2695, pasirinkta chromatografinė kolonėlė ACE C18 (250 x 4,6 mm x 5µm), siekiant geriausio tiriamųjų junginių atsiskyrimo pasirinktas tinkamas judriosios fazės tėkmės greitis – 1 ml/min, kolonėlės temperatūra 25 °C, injekuojama po 10 µl tiriamojo tirpalo, naudojami analitinio švarumo eliuentai – acetonitrilas ir trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (0,5 ml: 500 ml), taikomas gradientinis eliuavimas.

Šio darbo metu pritaikoma Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, analizinės ir toksikologinės katedroje validuota vitaminų B3, B6, B12 kokybinė ir kiekybinė analizė [35]. Ankstesnė metodika papildyta biotino kiekybės ir kokybės nustatymu, pilna validacijos procedūra.

3.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija biotinui

ESC validacija atliekama norint įrodyti metodo tinkamumą remiantis ICH (International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use) gairėmis. Chromatografijos metodo validacija atliekama pagal pasirinktus parametrus:

• specifiškumą, • atsikartojamumą, • tiesiškumą,

(31)

29 3.2.1 Biotino analizės specifiškumas

9 pav. Biotino standarto chromatograma su UV spektru

Specifiškumo dėka analizės metodo metu galima nustatyti analitės buvimą tiriamajame mėginyje nepaisant kitų panašių medžiagų, metabolitų, izomerų ir kt. Norint įvertinti ESC metodikos validaciją specifiškumo parametru tiriamos etalonų ir tiriamųjų tirpalų chromatogramos, vertinamas sulaikymo trukmės laikas ir spektrai. Biotino sulaikymo laikas – 9,452 min. ir UV spektras matomas biotino chromatogramoje (9 pav.).

(32)

30 3.2.2 Biotino analizės atsikartojamumas (glaudumas)

Įvertinus to pačio mėginio analizės rezultatus kelis kartus nekeičiant bandymo metodikos ir sąlygų, galime daryti išvadas apie rezultatų tikslumą. Siekiant įvertinti atsikartojamumą, tą pačią dieną mėginys tiriamas 5 kartus, gautos chromatogramos palyginamos apskaičiuojant standartinį variacijos koeficientą sulaikymo laikui, smailės plotui ir smailės aukščiui. Tinkamo variacijos koeficiento ribos yra < 5%. Biotino analizės glaudumas pirmą dieną pavaizduotas chromatogramoje žemiau (10 pav.).

10 pav. Biotino analizės glaudumas pirmą dieną

6 lentelė. Biotino variacijos koeficientas smailės plotui, smailės aukščiui ir sulaikymo laikui pirmą dieną Tiriamasis Variacijos koeficientas (RSD) smailės plotui Variacijos koeficientas (RSD) smailės aukščiui Variacijos koeficientas (RSD) sulaikymo laikui Tyrimas pirmąją dieną

Biotinas (vitaminas B7) 0,3% 0,1% 0,2%

Atlikus atsikartojamumo testą gauti ir 6 lentelėje pavaizduoti rezultatai pirmąją tyrimo dieną – variacijos koeficientas neviršija 5%, tad galime teigti, kad glaudumo kriterijus atitinka reikalavimus nurodytus ICH gairėse.

(33)

31

Siekiant tikslumo atsikartojamumas vertinamas antrą dieną tomis pačiomis sąlygomis. Tinkamumo variacijos riba <10%. Biotino analizės glaudumas antrą dieną pavaizduotas chromarogramoje žemiau (11 pav.).

11 pav. Biotino analizės glaudumas antrą dieną

7 lentelė. Biotino variacijos koeficientas smailės plotui, smailės aukščiui ir sulaikymo laikui antrą dieną Tiriamasis Variacijos koeficientas (RSD) smailės plotui Variacijos koeficientas (RSD) smailės aukščiui Variacijos koeficientas (RSD) sulaikymo laikui Tyrimas antrąją dieną

Biotinas (vitaminas B7) 0,2% 0,3% 0,1%

Atlikus atsikartojamumo testą gauti ir 7 lentelėje pavaizduoti rezultatai antrają tyrimo dieną neviršija 10%, todėl rezultatai yra priimtini.

(34)

32

3.2.3 Biotino analizės tiesiškumas, aptikimo ir nustatymo ribos

ESC metodo validacijos biotinui metu nustatyta analitės aptikimo riba – 0,2 µg/ml, kiekybinio nustatymo riba – 1,1 µg/ml.

Tiesiškumas apibūdina smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės koncentracijos. Tiesiškumas įvertinamas matuojant skirtingų koncentracijų standarto tirpalus ir sudarant kalibracinę kreivę (12 pav.). Biotino koncentracijų ribos nuo 5,94 mkg/ml iki 189,16 mkg/ml. Nustatomas biotino koreliacijos koeficientas, kuris nurodytas 8 lentelėje.

12 pav. Biotino tiesinės regresijos kreivė

8 lentelė. Biotino kalibracinės kreivės charakteristika

Tiriamasis Kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtis

Koreliacijos koeficientas

Biotinas (vitaminas B7) Y=6.09e+033X+2.55e+004 0,999821

Atlikus tiesiškumo parametro testą 8 lentelėje pateiktuose rezultatuose matyti, kad tiesiškumo kriterijus atitinka reikalavimus nurodytus ICH gairėse, koreliacijos koeficientas yra ne mažesnis kaip 0,990.

Pl

(35)

33

3.3 Maisto papildų turinčių B grupės vitaminų analizės rezultatai

Vaistinėje atsitiktiniu būdu pasirinkti 7 skirtingi maisto papildai, kurių sudėtyje yra B grupės vitaminų. Siekiant nustatyti maisto papildų kokybę pasirinktu analizės metodu identifikuoti tiriami B grupės vitaminai. Norint įvertinti kiekybinę maisto papildų sudėtį tyrimo metu rasti vitaminų kiekiai palyginami su gamintojo nurodytais etiketėje kiekiais. Maisto papildai analizuojami vertinant chromatogramose nurodytus sulaikymo laikus, UV spektrus ir lyginant su standartu.

3.3.1 Vitamino B3 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose

Siekiant įvertinti pasirinktų tirti maisto papildų kokybę vertinami UV spektrai ir tyrimo metu gauti sulaikymo laikai. Lentelėje nurodyti vitamino B3 kokybės rezultatai tiriamuosiuose maisto papilduose. Atliekant bandymus po tris kartus, gautas sulaikymo laiko vidurkis nurodytas 9 lentelėje, gautos paklaidos skaičiuojant vidurkį buvo ±0,02, o atsižvelgiant į tai, kad statistinio pakartojamumo paklaidos nebuvo didesnės nei 5 procentai galime teigti, jog ESC metodas yra patikimas naudoti.

9 lentelė. Vitamino B3 kokybės analizės rezultatai, sulaikymo laikas, koncentracija

Tiriamasis Vitamino B3 kokybė (rasta-nerasta tyrimo metu /nurodyta-nenurodyta gamintojo etiketėje) Sulaikymo laikas, min Koncentracija, mkg/ml Maisto papildas X1 -/- - - Maisto papildas X2 -/+ - - Maisto papildas X3 -/+ - - Maisto papildas X4 +/+ 4,119 72,127 Maisto papildas X5 +/+ 4,112 167,935 Maisto papildas X6 +/+ 4,118 78,738 Maisto papildas X7 +/+ 4,120 84,483

Maisto papildo X1 etiketėje nenurodytas vitaminas B3, kokybinio tyrimo metu vitaminas identifikuotas nebuvo. Maisto papildų X2 ir X3 etiketėse deklaruojamas vitaminas B3, tačiau jis kokybinės analizės metu nustatytas nebuvo. Maisto papildų X4, X5, X6, X7 etiketėse deklaruojamas vitaminas B3 – kokybinio tyrimo metu pavyko identifikuoti vitaminą, lentelėje nurodyti sulaikymo laikai ir koncentracijos. Kaip pavyzdys pateikiama maisto papildo X6 chromatograma (13pav.).

(36)

34

13 pav. Maisto papildo X6 chromatograma

Vitamino B3 kiekybės tyrimas atliekamas lyginant tyrimo metu gautus duomenis ir gamintojo deklaruojamus kiekius etiketėje (14 pav.). Skaičiuojama pagal validuotos metodikos metu gautą kalibracinės kreivės lygtį Y = 3.86e+004 X + 6.44e+003 [35]. Vadovaujantis Europos komisijos parengtu dokumentu, leistini maisto papildų kiekio verčių nuokrypiai vitaminams yra nuo +50% iki -20%, įskaitant matavimo neapibrėžtį. Visų tirtų maisto papildų – X2, X3, X4, X5, X6, X7 sudėtis neatitinka leistinų nuokrypių. Mažiausias nuokrypis nustatytas maisto papildui X5, kuriame tyrimo metu nustatyta 16,46 mg vitamino vienoje tabletėje, o gamintojo etiketėje deklaruojamas 30 mg vit. B3 kiekis.

(37)

35

3.3.2 Vitamino B6 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose

Siekiant identifikuoti vitaminą B6 pasirinktuose tirti maisto papilduose analizuojame sulaikymo laikus, kurie pateikti lentelėje žemiau. Kokybinio tyrimo metu visuose tirtuose maisto papilduose X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 identifikuotas vitaminas B6 kaip ir deklaruoja maisto papildų gamintojas etiketėje. Atliekant bandymus po tris kartus, gautas sulaikymo laiko vidurkis nurodytas 10 lentelėje. Gautos paklaidos skaičiuojant vidurkį buvo ±0,02, o atsižvelgiant į tai, kad statistinio pakartojamumo paklaidos nebuvo didesnės nei 5 procentai galime teigti, jog ESC metodas yra patikimas naudoti.

Tiriamasis Vitamino B6 kokybė (rasta-nerasta tyrimo metu /nurodyta-nenurodyta gamintojo etiketėje) Sulaikymo laikas, min Koncentracija, mkg/ml Maisto papildas X1 +/+ 6,660 43,620 Maisto papildas X2 +/+ 6,664 14,33 Maisto papildas X3 +/+ 6,662 617,22 Maisto papildas X4 +/+ 6,668 8,618 Maisto papildas X5 +/+ 6,660 129,692 Maisto papildas X6 +/+ 6,651 31,671 Maisto papildas X7 +/+ 6,658 16,135

Vitamino B6 kiekybės analizė atliekama skaičiuojant pagal validuotos metodikos metu gautą kalibracinės kreivės lygtį Y = 2.35e+004 X - 3.35e+002 [35]. Kiekybinio tyrimo metu gauti vitamino B6 kiekiai maisto papilduose yra lyginami su etiketėje nurodytais vitamino B6 kiekiais, kurie pavaizduoti diagramoje žemiau (15 pav.). Rezultatuose matyti, jog maisto papildai X3, X5 atitinka maisto papildams leidžiamus nuokrypius. Maisto papildas X1 – viršija leidžiamą +50% nuokrypį, o maisto papildai X2, X4, X6, X7 neatitinka leidžiamo – 20% nuokrypio.

(38)

36

15 pav. Vitamino B6 kiekybės lyginamoji analizė

3.3.3 Biotino kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose

Norint identifikuoti biotiną pasirinktuose tirti maisto papilduose atliekamas kokybinis tyrimas, kurio metu gautas biotino standarto sulaikymo laikas – 9,452 min. Pateikiama biotino standarto ir visų maisto papildų chromatograma, kurioje matyti, kad vertinant sulaikymo laikus – biotinas neidentifikuojamas visuose pasirinktuose tirti maisto papilduose (16 pav.).

(39)

37

Vitamino B7, dar žinomo kaip biotino, deklaruoti kiekiai etiketėse yra pateikti 11 lentelėje. Maisto papildo X1 sudėtyje vitaminas biotino nėra nurodomas, analizei aktualūs kiti tiriamieji – maisto papildai X2, X3, X4, X5, X6, X7. Visuose pasirinktuose tirti maisto papilduose biotino kiekis nėra didelis, didžiausias nurodytas kiekis tabletėje – 200 µg. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacijos metu nustatyta biotino aptikimo riba– 0,2 µg/ml, nustatymo riba 1,1 µg/ml, nors pasirinktų tirti maisto papildų ekstraktų koncentracija nustatyta 5-20 µg/ml ribose, vitaminas identifikuotas nebuvo. Identifikavus biotiną jo kiekį galima apskaičiuoti naudojantis tiesinės regresijos lygtimi Y=6.09e+033X+2.55e+004.

11 lentelė. Biotino kiekis tiriamuose maisto papilduose

Maisto papildas Biotino nurodytas pakuotėje kiekis, µg

Biotino kiekis nustatytas tyrimo metu, µg X2 50 0 X3 200 0 X4 50 0 X5 50 0 X6 50 0 X7 50 0

(40)

38

3.3.4 Vitamino B12 kokybinis ir kiekybinis tyrimas B grupės turinčiuose maisto papilduose Norint įvertinti vitamino B12 kokybę vertinami sulaikymo laikai, kurie pateikti 12 lentelėje. Atliekant bandymus po tris kartus, maisto papildo X3 sulaikymo laiko vidurkis 8,501, pasikliautinasis intervalas 8,095-8,826, paklaida ±0,02. Kadangi, atlikto statistinio pakartojamumo bandymo paklaidos neviršijo 5%, galima teigti, jog ESC metodas yra patikimas atlikti B12 kokybės analizę.

Tiriamasis Vitamino B12 kokybė (rasta-nerasta tyrimo metu /nurodyta-nenurodyta gamintojo etiketėje) Sulaikymo laikas, min Koncentracija, mkg/ml Maisto papildas X1 -/- - - Maisto papildas X2 -/+ - - Maisto papildas X3 +/+ 8,501 0,122 Maisto papildas X4 -/+ - - Maisto papildas X5 -/+ - - Maisto papildas X6 -/+ - - Maisto papildas X7 -/+ - -

Maisto papilde X3 identifikuotas vitaminas B12 kaip ir deklaruoja maisto papildų gamintojas produkto etiketėje. Maisto papilduose X2, X4, X5, X6, X7 gamintojo etiketėje nurodytas vitaminas, tačiau tyrimo metu vitaminas identifikuotas nebuvo. Pateikiama maisto papildo X3 chromatograma, kurioje matyti identifikuotas vitaminas B12 (17 pav.).

(41)

39

Atlikti kiekybinį vitamino B12 tyrimą buvo galima tik su maisto papildu X3, kuriame buvo identifikuotas vitaminas B12. Skaičiuojama pagal validuotos metodikos metu gautą kalibracinės kreivės lygtį Y =5.80e+004 X + 9.62e+002 [35]. Tyrimo metu maisto papilde X3 nustatyti labai maži vitamino B12 kiekiai.

13 lentelė. Vitamino B12 kiekybės analizė tiriamuose maisto papilduose

Maisto papildas Vitamino B12 kiekis vienoje tabletėje nurodytas pakuotėje

Vitamino B12 kiekis vienoje tabletėje nustatytas tyrimo metu

X2 2,5 µg - X3 10 µg 1,6 µg X4 2 mg - X5 5 µg - X6 4,5 µg - X7 2,5 µg -

(42)

40

3.3.5 Palyginamoji vit. B3 ir vit. B6 kiekybinė analizė maisto papilduose

Pavykus sėkmingai pritaikyti ESC metodą vitaminų B3 ir B6 kiekio nustatymui maisto papilduose, žemiau pateikiamos diagramos, kuriose lyginami gamintojo deklaruojami ir tyrimo metu gauti vitaminų kiekiai procentine išraiška.

18 pav. Procentinė vitamino B3 kiekio palyginamoji analizė

Atlikus pasirinktų tirti maisto papildų kiekybės tyrimą buvo pastebėti dideli vitaminų masės nuokrypiai lyginant tyrimo metu gautus duomenis ir gamintojų etiketėse deklaruojamus kiekius. Leidžiami tirpių vandenyje vitaminų nuokrypiai svyruoja nuo +50% iki -20%. Diagramoje mėlyna spalva pažymėtas vitamino B3 kiekis procentais gautas tyrimo metu, o šalia oranžine spalva gamintojo deklaruojamas kiekis procentais. 100% neatitikmuo buvo gautas net dviejuose maisto papilduose (X2, X3) tiriant vitaminą B3, kas reiškia, jog tyrimo metu maisto papilde vitaminas nebuvo rastas. Pažvelgus į 18 pav. diagramą galime matyti, jog mažiausias vitamino B3 nuokrypis identifikuotas maisto papilde X5, kuris yra -45 proc.

(43)

41

19 pav. Procentinė vitamino B6 kiekio palyginamoji analizė

Diagramoje mėlyna spalva vaizduojamas vitamino B6 kiekis procentais gautas tyrimo metu, o šalia nurodomas gamintojo deklaruojamas vitamino kiekis etiketėje. Maisto papilduose X1, X3, X5 analizuojant vitaminą B6 buvo nustatytas didesnis jo kiekis nei teigiama etiketėje, ypač ženklus nuokrypis pastebėtas maisto papilde X1 – nustatytas vitamino B6 kiekis viršija deklaruojamą kiekį etiketėje 3,5 karto. Tirti maisto papildai X3 ir X5 atitinka maisto papildams leidžiamus nuokrypius.

(44)

42

4. IŠVADOS

1. Pritaikyta efektyviosios skysčių chromatografijos metodologija vitamino B3, B6, B12 ir biotino identifikavimui ir kiekio nustatymui.

2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika validuota biotinui atsižvelgiant į specifiškumo (sulaikymo laikas 9,452 min), atsikartojamumo (variacijos koeficientas <5%), tiesiškumo (R2 _{=0,999821) parametrus.}

3. Atlikus kokybinį maisto papildų vertinimą vitaminas B6 buvo nustatytas visuose tirtuose maisto papilduose, vitaminas B3 buvo identifikuotas keturiuose maisto papilduose (X4, X5, X6, X7), vitaminas B12 identifikuotas tik viename maisto papilde (X3). Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacijos metu nustatyta biotino aptikimo riba – 0,2 µg/ml, nustatymo riba – 1,1 µg/ml, nors pasirinktų tirti maisto papildų ekstraktų koncentracija nurodyta 5-20 µg/ml ribose, vitaminas identifikuotas nebuvo.

4. Įvertinus vitamino kiekius gautus tyrimo metu, mažiausias vitamino B3 nuokrypis nuo deklaruojamo kiekio etiketėje būdingas maisto papildui X5 (-45 proc.), didžiausias – maisto papilduose X2 ir X3 (-100 proc.). Vitamino B6 mažiausi kiekio nuokrypiai nustatyti papilduose X3 (+45proc.) ir X5 (+27proc.), didžiausias maisto papilde X1 (+360 proc.). Vitaminas B12 identifikuotas tik maisto papilde X3, kurio nuokrypis nuo gamintojo deklaruojamo kiekio etiketėje yra -84 proc.

(45)

43

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. S. Amanullah and C. Seeber, “Niacin deficiency resulting in neuropsychiatric symptoms: A case study and review of literature,” Clin. Neuropsychiatry, vol. 7, no. 1, pp. 10–14, 2010.

2. H. E. Meyer, W. C. Willett, T. T. Fung, K. Holvik, and D. Feskanich, “Association of High In takes of Vitamins B6 and B12 From Food and Supplements With Risk of Hip Fracture Among Postmenopausal Women in the Nurses’ Health Study,” JAMA Netw. open, vol. 2, no. 5, p. e193591, 2019, doi: 10.1001/jamanetworkopen.2019.3591.

3. K. Mikkelsen, L. Stojanovska, M. Prakash, and V. Apostolopoulos, “The effects of vitamin B on the immune/cytokine network and their involvement in depression,” Maturitas, vol. 96, pp. 58– 71, 2017, doi: 10.1016/j.maturitas.2016.11.012.

4. J. M. Denu, “Vitamin B3 and sirtuin function,” Trends Biochem. Sci., vol. 30, no. 9, pp. 479–483, 2005, doi: 10.1016/j.tibs.2005.07.004.

5. A. Praškevičius, L. Ivanovienė, N. O. Stasiūnienė, J. M. Burneckienė, and H. Rodovičius,

Biochemija _ bendrasis vadovėlis _ LSMU DSpace_CRIS. Kaunas: Vitae Litera, 2006.

6. Z. Fatima, X. Jin, Y. Zou, H. Y. Kaw, M. Quinto, and D. Li, “Recent trends in analytical methods for water-soluble vitamins,” J. Chromatogr. A, vol. 1606, p. 360245, 2019, doi: 10.1016/j.chroma.2019.05.025.

7. P. Xu and A. A. Sauve, “Vitamin B3, the nicotinamide adenine dinucleotides and aging,” Mech.

Ageing Dev., vol. 131, no. 4, pp. 287–298, 2010, doi: 10.1016/j.mad.2010.03.006.

8. R. A. Fricker, E. L. Green, S. I. Jenkins, and S. M. Griffin, “The Influence of Nicotinamide on Health and Disease in the Central Nervous System,” Int. J. Tryptophan Res., vol. 11, 2018, doi: 10.1177/1178646918776658.

9. M. Sharma, P. K. Banipal, and T. S. Banipal, “Hydration characteristics, structural effects and the taste quality of some polyhydroxy compounds in aqueous solutions of nicotinic acid (vitamin B3) at (288.15–318.15) K,” Food Chem., vol. 310, no. November 2019, p. 125861, 2020, doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125861.

10. R. Moore, “Water-Soluble Vitamins : B-Complex and Vitamin C,” Color. State Univ., vol. Fact Sheet, no. 9, p. 5, 2012.

11. J. E. Prousky, “Treating dementia with vitamin B3 and NADH,” J. Orthomol. Med., vol. 26, no. 2, pp. 163–174, 2011.

12. M. P. Wilson, B. Plecko, P. B. Mills, and P. T. Clayton, “Disorders affecting vitamin B6 metabolism,” J. Inherit. Metab. Dis., vol. 42, no. 4, pp. 629–646, 2019, doi: 10.1002/jimd.12060. 13. S. P. Arévalo, T. M. Scott, L. M. Falcón, and K. L. Tucker, “Vitamin B-6 and depressive symptomatology, over time, in older Latino adults,” Nutr. Neurosci., vol. 22, no. 9, pp. 625–636, 2019, doi: 10.1080/1028415X.2017.1422904.

14. A. C. Mamede, S. D. Tavares, A. M. Abrantes, J. Trindade, J. M. Maia, and M. F. Botelho, “The role of vitamins in cancer: A review,” Nutr. Cancer, vol. 63, no. 4, pp. 479–494, 2011, doi: 10.1080/01635581.2011.539315.

15. P. Zhang, T. Suda, S. Suidasari, T. Kumrungsee, N. Yanaka, and N. Kato, “Novel preventive mechanisms of vitamin B6 against inflammation, inflammasome, and chronic diseases,” in

Molecular Nutrition, Academic Press, 2020, pp. 283–299.

16. J. M. Gostner, K. Kurz, and D. Fuchs, “The significance of tryptophan metabolism and vitamin B-6 status in cardiovascular disease,” Am. J. Clin. Nutr., vol. 111, no. 1, pp. 8–9, 2020, doi: 10.1093/ajcn/nqz291.

17. A. León-Del-Río, “Biotin in metabolism, gene expression, and human disease,” J. Inherit. Metab.

Dis., vol. 42, no. 4, pp. 647–654, 2019, doi: 10.1002/jimd.12073.

18. R. M. Trüeb, “Serum biotin levels in women complaining of hair loss,” Int. J. Trichology, vol. 8, no. 2, pp. 73–77, 2016, doi: 10.4103/0974-7753.188040.

(46)

44

20. H. M. Almohanna, A. A. Ahmed, J. P. Tsatalis, and A. Tosti, “The Role of Vitamins and Minerals in Hair Loss: A Review,” Dermatol. Ther. (Heidelb)., vol. 9, no. 1, pp. 51–70, 2019, doi: 10.1007/s13555-018-0278-6.

21. B. Nshime, J. Koedam, B. Stanton, Q. Tran, and P. Chen, “Liquid chromatography method for the simultaneous quantification of biotin and vitamin B12 in Vitamin B supplements,” J. AOAC

Int., vol. 102, no. 2, pp. 445–450, 2019, doi: 10.5740/jaoacint.18-0029.

22. S. Padmanabhan, M. Jost, C. L. Drennan, and M. Elías-Arnanz, “ A New Facet of Vitamin B 12 : Gene Regulation by Cobalamin-Based Photoreceptors ,” Annu. Rev. Biochem., vol. 86, no. 1, pp. 485–514, 2017, doi: 10.1146/annurev-biochem-061516-044500.

23. J. Wuerges, G. Garau, S. Geremia, S. N. Fedosov, T. E. Petersen, and L. Randaccio, “Structural basis for mammalian vitamin B12 transport by transcobalmin,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 103, no. 12, pp. 4386–4391, 2006, doi: 10.1073/pnas.0509099103.

24. R. Banerjee and S. W. Ragsdale, “ The Many Faces of Vitamin B 12 : Catalysis by Cobalamin-Dependent Enzymes ,” Annu. Rev. Biochem., vol. 72, no. 1, pp. 209–247, 2003, doi: 10.1146/annurev.biochem.72.121801.161828.

25. G. Rizzo and A. S. Laganà, “A review of vitamin B12,” Mol. Nutr., pp. 105–129, Jan. 2020, doi: 10.1016/B978-0-12-811907-5.00005-1.

26. G. Rizzo et al., “Vitamin B12 among vegetarians: Status, assessment and supplementation,”

Nutrients, vol. 8, no. 12, pp. 1–23, 2016, doi: 10.3390/nu8120767.

27. G. Gramer et al., “Newborn Screening for Vitamin B12 Deficiency in Germany—Strategies, Results, and Public Health Implications,” J. Pediatr., vol. 216, pp. 165-172.e4, 2020, doi: 10.1016/j.jpeds.2019.07.052.

28. E. Andrès, A. A. Zulfiqar, and T. Vogel, “State of the art review: oral and nasal vitamin B12 therapy in the elderly,” QJM, vol. 113, no. 1, pp. 5–15, 2020, doi: 10.1093/qjmed/hcz046. 29. K. Vishwakarma et al., “Financial support and sponsorship Piloerection : A Rare Ictal

Phenomenon – Case Report and Review of Literature,” Ann. Indian Acad. Neurol., vol. 20, no. 2, pp. 169–172, 2017, doi: 10.4103/aian.AIAN.

30. P. Chen and W. R. Wolf, “LC/UV/MS-MRM for the simultaneous determination of water-soluble vitamins in multi-vitamin dietary supplements,” Anal. Bioanal. Chem., vol. 387, no. 7, pp. 2441– 2448, 2007, doi: 10.1007/s00216-006-0615-y.

31. P. Moreno and V. Salvadó, “Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography,” J.

Chromatogr. A, vol. 870, no. 1–2, pp. 207–215, Feb. 2000, doi:

10.1016/S0021-9673(99)01021-3.

32. Z. Sun et al., “A yellow-emitting nitrogen-doped carbon dots for sensing of vitamin B12 and their cell-imaging,” Dye. Pigment., vol. 176, no. December 2019, p. 108227, 2020, doi: 10.1016/j.dyepig.2020.108227.

33. W. Hu, J. Tao, Q. Wang, J. Li, C. Yan, and X. Xu, “[Simultaneous determination of vitamins B1, B2, B6, niacinamide and calcium pantothenate in compound vitamin B tablets by high performance quantitative capillary electrophoresis],” Se pu = Chinese J. Chromatogr., vol. 37, no. 6, p. 661—665, 2019, doi: 10.3724/sp.j.1123.2018.12040.

34. A. H. Kamal, A. A. Marie, and S. F. Hammad, “Stability indicating RP-HPLC method for simultaneous determination of omeprazole and aspirin in the presence of salicylic acid as degradation product,” Microchem. J., vol. 152, no. August 2019, p. 104350, 2020, doi: 10.1016/j.microc.2019.104350.

35. M. Lukošaitytė, “B grupės vitaminų ko kybinis ir kiekybinis tyrimas vitaminizuotuose gėrimuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu,” Kaunas, 2019.