FARMACIJOS FAKULTETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

KRISTINA KLUSAVIČIŪTĖ

SUNKIŲJŲ METALŲ POVEIKIO

METALOTIONEINŲ SINTEZEI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI

LABORATORINIŲ PELIŲ ORGANUOSE

ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

LSMU MA Neuromokslų instituto Molekulinės neurobiologijos laboratorijos vr. m. d., MA Biochemijos katedros profesorė dr. Ilona Sadauskienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, ____________

(parašas)

____________

(data)

SUNKIŲJŲ METALŲ POVEIKIO

METALOTIONEINŲ SINTEZEI IR LIPIDŲ PEROKSIDACIJAI

LABORATORINIŲ PELIŲ ORGANUOSE

ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

prof. dr. Ilona Sadauskienė ______________ (parašas)

__________

(data)

Recenzentė Darbą atliko

dr. Inga Stanevičienė _______________ magistrantė

(parašas) Kristina Klusavičiūtė ______________ (parašas) _______________ _____________ (data) (data)

KAUNAS, 2012

TURINYS

SANTRAUKA ... 4

SANTRUMPOS ... 6

ĮVADAS ... 7

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

2.1 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas ... 10

2.1.1. Laisvųjų radikalų susidarymas ir poveikis ląstelėms ... 10

2.2 Ląstelių antioksidacinė sistema ... 13

2.2.1. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai ... 13

2.2.2. Antioksidaciniai fermentai ... 14

2.2.3. Nefermentiniai antioksidantai ... 15

2.3. Sunkieji metalai. Bendra charakteristika ... 17

2.4 Kadmio poveikis organizmui ... 19

2.4.1. Kadmio vaidmuo ligų patogenezėje ... 19

2.4.2. Kadmis ir oksidacinis stresas ... 20

2.5. Nikelio poveikis organizmui ... 21

2.5.1. Nikelio vaidmuo ligų patogenezėje ... 21

2.5.2. Nikelis ir oksidacinis stresas ... 22

2.6. Cinko biologinis poveikis... 23

2.6.1. Cinko funkcijos organizme ... 23

2.6.2. Cinko antioksidacinio poveikio mechanizmai ... 24

3. TYRIMO METODIKA ... 25

3.1. Tyrimo objektas ir reagentai ... 25

3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai ... 26

3.3. Tyrimo metodai ... 28

3.3.1. MT koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse ... 28

3.3.2. MDA koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse ... 28

3.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas ... 29

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

4.1. Ūmus kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis MT sintezei pelių kepenyse ir smegenyse ... 30

4.1.1. Vienkartinis kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis MT sintezei pelių kepenyse ir smegenyse ... 30

4.1.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse ir smegenyse ... 31

4.2. Ūmus kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir smegenyse ... 36

4.2.1. Vienkartinis kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir smegenyse ... 36

4.2.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, nikelio ir cinko jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir smegenyse ... 37

5. IŠVADOS ... 42

SANTRAUKA

Kristinos Klusavičiūtės magistro baigiamasis darbas „Sunkiųjų metalų poveikio metalotioneinų sintezei ir lipidų peroksidacijai laboratorinių pelių organuose įvertinimas“; mokslinė vadovė prof. dr. Ilona Sadauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Neuromokslų instituto, Molekulinės neurobiologijos laboratorija – Kaunas.

Atlikto darbo tikslas buvo įvertinti kadmio, nikelio bei cinko jonų poveikį metalotioneinų sintezės intensyvumui ir lipidų peroksidacijai laboratorinių pelių organuose – kepenyse ir smegenyse. Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti uždaviniai: nustatyti metalotioneinų koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po vienkartinio (24 val.) ir kartotinio (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų poveikio; įvertinti ūmų vienkartinį (24 val.) ir kartotinį (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų poveikį lipidų peroksidacijai pelių smegenyse ir kepenyse; įvertinti cinko jonų gebą apsaugoti smegenų ir kepenų antioksidacinę sistemą esant toksiniam kadmio ir nikelio jonų poveikiui.

Eksperimentams atlikti naudotos baltosios beveislės laboratorinės pelės. Metalotioneinų koncentracija nustatatyta pagal Peixoto ir bendraautorių, o malondialdehido – pagal Uchiyama ir bendraautorių pasiūlytas metodikas.

Tyrimo rezultatai parodė, kad tiek kadmio, tiek ir nikelio jonai pelių kepenyse metalotioneinų koncentracijos padidėjimą sukėlė ir po vienkartinio 24 val., ir po kartotinio 14 dienų šių jonų poveikio, o smegenyse – tik praėjus 24 valandoms po kadmio ar nikelio jonų poveikio. Cinko jonai veikdami kartu su kadmio jonais statistiškai reikšmingą metalotioneinų koncentracijos padidėjimą sukėlė smegenyse po 14 dienų šių jonų kompleksinio poveikio. Cinko jonams veikiant kartu su nikelio jonais, statistiškai reikšmingas metalotioneinų koncentracijos padidėjimas taip pat nustatytas smegenyse po 14 dienų šių jonų kompleksinio poveikio. Tad cinko jonai paskatino antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių metalotioneinų sintezę kepenyse ir smegenyse esant toksiniam kadmio ir nikelio jonų poveikiui.

Kadmio jonai malondialdehido koncentracijos padidėjimą kepenyse sukėlė tik po ūmaus šių jonų poveikio, o smegenyse – ir po ūmaus, ir po kartotinio. Nikelio jonai kepenyse malondialdehido koncentracijos padidėjimą sukėlė ir po ūmaus, ir po kartotinio, o smegenyse – tik po ūmaus šių jonų poveikio. Cinko jonai, esant toksiniam kadmio jonų poveikiui, kepenyse lipidų peroksidaciją slopino ir po 24 val., ir po 14 dienų, o smegenyse – tik po 14 dienų. Cinko jonai, esant toksiniam nikelio jonų poveikiui, maliondialdehido koncentracijos sumažėjimo nesukėlė nei kepenyse, nei smegenyse nei po ūmaus, nei po kartotinio šių jonų poveikio. Tad cinko jonai apsaugojo lipidus nuo peroksidacijos esant toksiniam kadmio jonų poveikiui, tačiau neapsaugojo esant toksiniam nikelio jonų poveikiui.

SUMMARY

Kristinos Klusavičiūtės master thesis „The evaluation of heavy metals influence on metallothionein synthesis and lipid peroxidation in laboratory mice organs“; supervisor prof. dr. Ilona Sadauskienė; Laboratory of Molecular Neurobiology, Neuroscience Institute, Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences – Kaunas.

The aim of the work was to evaluate the influance of cadmium, nickel and zinc ions on metallothionein synthesis and lipid peroxidation intensity in mice organs – the liver and brain. The tasks of the work were: to determine the concentration of MT in mice brain and liver after both acute (24 hours) and repeated (14 days) influence of cadmium and nickel ions, to evaluate the acute (24 hours) and repeated (14 days) effects of cadmium and nickel ions on lipid peroxidation in mouse brain and liver and to evaluate the ability of zinc ion to protect the brain and liver antioxidant system from the toxicity of cadmium and nickel ions.

We used white laboratory mice in our experiments. MT concentration was established according to Peixot and contributors proposed method and MDA concentration – according to Uchiyama and contributors proposed method.

The results have shown that both cadmium and nickel ions increased metallothionein concentration in the liver of mice after a single (24 hours) and after repeated (14 days) exposure of these ions. The increased metallothionein concentration in the brain was established only 24 hours after cadmium or nickel ions exposure. Zinc ions in cooperation with the cadmium ions a statistically significant increase of metallothionein levels caused in the brain 14 days after the complex effects of these ions. Zinc ions, acting with the nickel ions, a statistically significant increase of metallothionein concentration caused as well in the brain after 14 days of the complex effect of these ions. Thus, zinc ions stimulated the synthesis of metallothionein in the liver and in the brain while toxicity of cadmium and nickel ions.

We have found that in the liver cadmium ions increased the concentration of malondialdehyde only after a single effect of these ions and in the brain – both after a single and repeated effects of cadmium ions. Nickel ions in the liver increased malondialdehyde concentration after a single and after repeated effects of nickel ions and in the brain - just after a single effect of these ions. Zinc ions, at toxic cadmium exposure, inhibit hepatic lipid peroxidation after 24 hours and after 14 days of these ions effect, and inhibit the brain lipid peroxidation – just after 14 days of zinc ions effect. Zinc ions, while toxicity of nickel ions did not decrease maliondialdehyde concentration nor in the liver or brain, nor after a single or repeated exposure of these ions. Thus, the zinc ions protected from lipid peroxidation at toxic cadmium exposure, but failed to secure at toxic effect of nickel ions.

SANTRUMPOS

Cd-MT CNS

kadmio-metalotioneino kompleksas centrinė nervų sistema

ATP adenozino 5-trifosfatas

DTNB 5,5-ditiobisnitrobenzoinė rūgštis DTT ditiotreitolis EDTA FAD etilendiamintetraacetatas flavin-adenin-dinukleotidas Gred glutationo reduktazė

GSH redukuotas glutationas Gpx glutationo peroksidazė GSSG oksiduotas glutationas GST glutationo S-transferazė GTP guanozino 5-trifosfatas HEPES HIF N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfo rūgštis hipoksijos indukuojamasis faktorius

HO hemo oksigenazė

Hsp šiluminio šoko baltymai

KAT katalazė

LD50

LOPL

vidutinė mirtina dozė

lėtinė obstrukcinė plaučių liga

MDA malondialdehidas MT metalotioneinas PMSF fenilmetilsulfonilfluoridas SM sunkieji metalai SOD superoksiddismutazė TBR tiobarbituro rūgštis TChA trichloracto rūgštis

ĮVADAS

Su sunkiaisiais metalais (SM) žmogus jį supančioje aplinkoje susiduria kiekvieną dieną. Tam tikri jų kiekiai yra maiste, kurį valgome, vandenyje, kurį geriame, ore, kuriuo kvėpuojame. Kai kurie metalai (cinkas, varis, manganas ir kt.) kaip mikroelementai yra būtini normaliai organizmo medžiagų apykaitai, fiziologiniams procesams vykti, kita dalis (kadmis, gyvsidabris ir kt.) neatlieka jokių biologinių funkcijų. Vis dėlto tiek vienų, tiek kitų elementų kiekio padidėjimas organizme gali sukelti apsinuodijimus. Toksinis SM poveikis gali pasireikšti iš karto, ar po kelių ar net keliolikos metų (Hall ir kt., 2007). Intensyvėjanti pramonės įmonių veikla, transporto srautų didėjimas teršia aplinką, vis didesni SM kiekiai patenka į organizmą, sukelia apsinuodijimus, o jie – įvairių ligų išsivystymą (Jomova ir kt., 2010). Pasaulyje susidomėjimas sunkiaisiais metalais, jų poveikiu aplinkai ir žmogaus sveikatai pastaraisiais metais didėja, nes nustatomi aplinkos taršos sąlygojami gyventojų apsinuodijimų ir net mirties atvejai (Soghoian, 2011).

Kadmis yra vienas toksiškiausių gyviesiems organizmams SM (Bernard 2008). Apsinuodijama šiuo metalu valgant užterštus maisto produktus, nemaži kadmio kiekiai į organizmą patenka rūkant, apsinuodyti galima ir dirbant tam tikrose pramonės srityse (Soghoian, 2011). Apsinuodijimus, lyginant su kitais SM, sukelia labai maži šio SM kiekiai (Ercal ir kt., 2001). Kadmiui būdingi kancerogeninis, nefrotoksinis, neurotoksinis, genotoksinis poveikiai, kurie pasireiškia keletu mechanizmų – slopinant ląstelių antioksidacinę sistemą, sutrikdant baltymų sintezę ar tiesiogiai toksiškai veikiant tam tikras ląstelių struktūras (Casalino ir kt., 2002; Filipič ir kt., 2006). Naujausi tyrimai rodo, kad kadmis sukelia organizme oksidacinį stresą, kurio metu pažeidžiami ląstelių komponentai – baltymai, lipidai, DNR dėl ko ir pasireiškia šio metalo įvairiapusis toksinis poveikis (Amara ir kt., 2011; Bernard 2008). Galima kadmio poveikio organizmui rizika buvo intensyviai tiriama daugelį metų, dabar turimos žinios nuolat yra gilinamos siekiant nustatyti naujus galimus šio metalo toksiškumo mechanizmus.

Dar vienas plačiai naudojamas ir potencialiai pavojingas SM yra nikelis. Platus šio metalo pritaikomumas įvairiose pramonės srityse paskatino domėjimąsi nikeliu. Vis daugiau tyrimų atliekama siekiant sustatyti, koks tikrasis šio metalo poveikis žmogaus sveikatai, kokia yra rizika su juo dirbantiems žmonėms. Naujausi tyrimai rodo, kad apsinuodijus nikeliu gali pasireikšti citotoksinis, genotoksinis, pneumotoksinis, neurotoksinis, kancerogeninis ir kiti poveikiai (Cameron ir kt., 2011) Nikelio jonų sukeliamas oksidacinis stresas taip pat yra pagrindinis šio SM toksiškumą lemiantis veiksnys (Chen ir kt., 2003; Das ir kt., 2008). Vis dėlto tiksliai nėra aišku, kuriuos specifinius taikinius nikeliui veikiant ląstelėse pasireiškia jo toksinis poveikis, ir tai yra perspektyva naujiems tyrimams.

Organizmo antioksidacinės sistemos tyrimai, svarbūs nustatant paties organizmo gebą apsisaugoti nuo oksidacinio streso bei ištirti antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių elementų, pavyzdžiui, cinko, seleno ir kitų junginių gebą sustiprinti šią antioksidacinę apsaugą (Kunwar ir kt.,).

Dabar jau žinoma, kad sunkiųjų metalų poveikyje ląstelėse susidarantys laisvieji radikalai bei kiti aplinkoje esantys oksidantai yra labai svarbi paveldimų ligų bei senėjimo proceso organizme, priežastis (Soghoian, 2011; Costa ir kt., 2002). Todėl ir tyrimai, susiję su įvairių veiksnių, tame tarpe ir sunkiųjų metalų, ląstelėse sukeliamu oksidaciniu stresu bei antioksidacine sistema yra labai svarbūs ir kelia vis didesnį susidomėjimą.

Šis darbas tai įnašas į integruotą biologinę intoksikacijos metalais sampratą, pagilinantis žinias apie SM poveikio organizmui mechanizmus bei padarinius, o tai neabejotinai svarbu klinikiniu požiūriu. Taigi šio darbo tikslas yra nustatyti sunkiųjų metalų – kadmio ir nikelio jonų poveikį ląstelių antioksidacinės sistemos aktyvumui ir įvertinti šios sistemos pajėgumus neutralizuojant SM.

Gauti tyrimų rezultatai pristatyti tarptautinėje neuromokslų konferencijoje:

 I. Sadauskienė, R. Bernotienė, J. Šulinskienė, K. Klusavičiūtė, L. Ivanovienė, A. Liekis, L. Ivanov. The content of metallothionein and lipid peroxidation in mouse brain: effects of cadmium and nickel ions. International Translational Neuroscience Conference: 16-17th June, 2011; Europa Royale Hotel; Kaunas 2011: 95.

Rezultatai taip pat bus pristatyti birželio mėnesį vyksiančios biochemikų draugijos konferencijos metu:

 I. Sadauskienė, A. Liekis, R. Bernotienė, K. Klusavičiūtė, L. Ivanovienė, L. Ivanov. “Sunkiųjų metalų poveikio lipidų peroksidacijai smegenyse įvertinimas“. Lietuvos Biochemikų Draugijos XII-oji Konferencija “Biochemijos studijoms Lietuvoje – 50 metų”: 2012 m. birželio mėn. 28-30 d., Tolieja (Molėtų tajonas).

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Įvertinti kadmio, nikelio bei cinko jonų poveikį metalotioneinų sintezės intensyvumui ir lipidų peroksidacijai laboratorinių pelių organuose – kepenyse ir smegenyse.

Uždaviniai:

1. Nustatyti MT koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po ūmaus vienkartinio (24 val.) kadmio ir nikelio jonų poveikio;

2. Įvertinti ūmų vienkartinį (24 val.) kadmio ir nikelio jonų poveikį lipidų peroksidacijai pelių smegenyse ir kepenyse;

3. Nustatyti MT koncentraciją pelių smegenyse ir kepenyse po kartotinės (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų dozės įvedimo;

4. Įvertinti kartotinės (14 dienų) kadmio ir nikelio jonų dozės įtaką lipidų peroksidacijos žymens malondialdehido koncentracijai laboratorinių pelių smegenyse ir kepenyse;

5. Įvertinti cinko jonų gebą apsaugoti smegenų ir kepenų antioksidacinę sistemą esant toksiniam kadmio ir nikelio jonų poveikiui.

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas

2.1.1. Laisvųjų radikalų susidarymas ir poveikis ląstelėms

Laisvieji radikalai – tai daugiausia deguonies (reaktyvios deguonies formos – ROS) ir azoto (reaktyvios azoto formos – RNS) junginiai, produkuojami įvairių organizmo endogeninių sistemų. Jų susidarymą lemia tam tikros fizikocheminės sąlygos arba patofiziologiniai procesai, vykstantys organizme (Valko ir kt., 2006). Šiuos procesus skatina įvairūs egzogeniniai ir endogeniniai veiksniai: tarša, jonizuojanti spinduliuotė, cigarečių dūmai, išemija, audinių pažeidimai ir uždegiminis atsakas, ląstelėse vykstanti medžiagų apykaita (elektronų transporto grandinės veikla) ir kt., (Kunwar ir kt., 2011). Laisvieji radikalai gali pažeisti ląstelių makromolekules – lipidus, baltymus, DNR, o tai gali būti susiję su senėjimo procesu, širdies-kraujagyslių, neurodegeneracinių, imuninės sistemos, onkologinių ir kitų ligų išsivystymu (Valko ir kt., 2006; Jomova ir kt., 2010; Soghoian, 2011).

Laisvųjų radikalų susidarymą lemia tai, kad molekulinis deguonis, turintisi du nesuporintus elektronus sunkiai redukuojasi. Tačiau, esant tam tikroms sąlygoms (veikiant radiacijai, sunkiesiems metalams), šis procesas labai pagreitėja. Kuo daugiau molekulinis deguonis prisijungia elektronų, tuo didesnis yra jo reaktingumas (Kunwar ir kt., 2011). Ląstelėse didžiausi kiekiai susidaro superoksido (O2•‾) ir azoto oksido (NO•) radikalų, kurie toliau yra paverčiami į stipriomis oksidacinėmis savybėmis

pasižyminčius radikalus – tai hidroksilo (•OH), alkoksi (RO•), peroksilo (ROO•) radikalus, singuletinį deguonį (1

O2). Kai kurios radikalų rūšys yra paverčiamos molekuliniais oksidantais – vandenilio

peroksidu (H2O2), peroksinitritu (ONOO‾), hipochloritine rūgštimi (HOCl), kurie gali veikti kaip

laisvųjų radikalų šaltiniai. Pavyzdžiui, H2O2 yra verčiamas •OH radikalais vykstant Fentono reakcijai,

o HOCl reaguojant su H2O2, gali susidaryti 1O2. ONOO‾, esant fiziologinei CO2 koncentracijai,

ląstelėse yra karbonato radikalų (CO3•‾) šaltinis (Valko ir kt., 2006). Laisvųjų radikalų susidarymas

vyksta skirtingais keliais, o daugiausia jų susidaro ląstelių mitochondrijose (Circu ir kt., 2011; Murphy, 2008; Valko ir kt., 2006). Laisvųjų radikalų susidarymo mechanizmai pateikiami 1 pav.

Laisvieji radikalai ląstelėse oksiduoja įvairias molekules. Pavyzdžiui, veikiant O2

•_{‾, lengvai}

oksiduojami katecholaminai, askorbo rūgštis, tioliniai junginiai. Aktyviausia vitamino E forma – α-tokoferolis bei geležies turinčių baltymų molekulių centrai taip pat labai jautrūs šių aktyvių deguonies formų poveikiui (Valko ir kt., 2005). O2•‾ gali sudaryti kompleksu su Fe3+ – perferilo radikalus

[Fe3+O2]•, kurie nėra linkę dalyvauti oksidacijos reakcijose, tačiau gali toliau skilti. Tokiu būdu iš

perferilo radikalų susidaro ferilo radikalai [Fe3+

O]•, kurie yra aktyvūs, turi daug elektronų. Todėl yra manoma, kad būtent O2•‾ yra pagrindinis junginys, dalyvaujantis susidarant kitoms reaktyvioms

molekulėms vykstant lipidų peroksidacijai ir kitų makromolekulių oksidaciniams pažeidimams (Kunwar ir kt., 2011; Jomova ir kt., 2010). Labai svarbus yra savaiminis O2

•_{‾ skilimas į H}

2O2 ir O2 ir

šio radikalo geba redukuoti pereinamosios būsenos metalus (Fe, Cu ir kt.) ir jų kompleksus susidarant kitiems, oksidacinius pažeidimus sukeliantiems, laisviesiems radikalams (Circu ir kt., 2011).

O2•- - superoksido radikalas; SOD – superoksiddismutazė; H2O2 – vandenilio peroksidas; •OH – hidroksilo radikalas; LH – riebalų rūgštis; L• - lipidinis radikalas; LO• - lipidinis oksi-radikalas; LOO• - lipidinis peroksi-radikalas NO• - azoto oksido radikalas; ONOO- - peroksinitrito anijonas; ONOOCO2

- nitrozoperoksikarbonato jonas; CO3•

- karbonato radikalo anijonas; MPO – mieloperoksidazė; HOCl – hipochloritinė rūgštis; 1O2 –singletinis deguonis; Cl• - chloro radikalas.

1 pav. Laisvųjų radikalų susidarymo būdai

Iš Free radicals, oxidative stress and importance of antioxidants in human health (Kunwar ir kt., 2011) Kitas labai reaktyvus radikalas – •OH – yra ypač stirpus oksidatorius. Jis labai nestabilus ir reaguoja su dauguma biologinių molekulių, turinčių SH grupes ar FeS fragmentus. Tai pats stipriausias ir aktyviausias oksidantas, kuris efektyviai oksiduoja baltymus, nukleorūgštis ir lipidus. Jo sukeltos grandininės reakcijos pažeidžia ląstelę (Valko ir kt., 2006). Hidroksilo radikalas susidaro iš H2O2

oksidacijos-redukcijos reakcijose, tokiose kaip Fentono reakcija (Kunwar ir kt., 2011). Su makromolekulėmis organizme reaguoja ir 1

O2. Beveik visų šių reakcijų metu vyksta šios

aktyvios deguonies formos prijungimas prie oksiduojamų junginių konjuguotųjų jungčių. Pavyzdžiui, dalyvaujant reakcijose riebalų rūgštims, susidaranys produktai yra organiniai peroksidai, sukeliantys grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas (Valko ir kt., 2006; Circu ir kt., 2011).

Laisvųjų radikalų, sukeliančių ląstelių pažeidimus, susidarymą lemia tiek endogeniniai (uždegiminės reakcijos, medžiagų apykaitos procesai), tiek egzogeniniai veiksniai (metalų jonai, radiacija, tam tikri ksenobiotikai, pvz., barbitūratai). Jie susidaro dviems pagrindiniais būdais – veikiant fermentams (NADH dehidrogenazei, ksantinoksidazei, laktatdehidrogenazei,

glutationreduktazei, citochromo P-450 fermentams) ir nefermentiniu būdu (Valko ir kt., 2006). Pavyzdžiui, O2

•_{‾ nefermentiniu būdu susidaro vykstant kai kurių ląstelės komponentų – ubichinonų,}

flavinų, tiolinių junginių – savaiminei oksidacijai, elektrofilinėmis savybėmis pasižyminčių chinono junginių redokso ciklui, OH• susidaro vykstant H2O2 reakcijai su redukuotąja geležimi – Fentono

reakcijai, skylant O2•‾, glutationo peroksidui (Circu ir kt., 2011). Organizmo fagocitinės ląstelės taip

pat yra laisvųjų radikalų susidarymo šaltinis (Kunwar ir kt., 2011). Įvairūs egzogeniai veiksniai dažniausiai paspartina nefermentinį laisvųjų radikalų susidarymą (Valko ir kt., 2006).

Maži laisvųjų radikalų kiekiai yra būtini normaliai fiziologinių funkcijų veiklai – genų raiškai, ląstelių augimui, apsaugai nuo infekcijų (Circu ir kt., 2011). Jie taip pat gali veikti kaip ląstelėse vykstančių biocheminių procesų stimuliatoriai grįžtamai oksiduodami transkripcijos faktorių, atsakingų už genų raišką ir ląstelių augimą, tam tikras aktyvias sritis ar netiesiogiai indukuodami transkripcijos faktorius ir aktyvindami signalų perdavimo kelius ląstelėse (Kunwar ir kt., 2011).

Laisvųjų radikalų koncentracijos padidėjimas ląstelėse ir nesugebėjimas jų detoksikuoti, sukelia organizme oksidacinį stresą. Oksidacinis stresas – tai laisvųjų radikalų ir kitų aktyvių deguonies ir azoto formų sukelto biomolekulių pažeidimo padarinys (Kunwar ir kt., 2011). Cheminiu požiūriu oksidacinis stresas – tai žymus ląstelių redukcinio potencialo padidėjimas (redukcinis potencialas tampa mažiau neigiamas) arba ląstelių redokso porų, pavyzdžiui, redukuoto glutationo (GSH), redukcinės galios sumažėjimas (Ercal ir kt., 2001). Oksidacinio streso padariniai priklauso nuo šių pokyčių laipsnio. Ląstelės, veikiant antioksidacinei sistemai, gali atlaikyti nežymius oksidacinės – redukcinės sistemos stabilumo pakitimus ir atgauti pradinę būseną, tačiau labiau išreikštas oksidacinis stresas gali sukelti ląstelių žūtį dėl ko atsiranda įvairūs susirgimai (Apel ir kt., 2004; Circu ir kt., 2011). Vienas iš oksidacinio streso padarinių yra laisvųjų radikų sukelta lipidų peroksidacija, dėl kurios su šlapimu išsiskiria įvairūs toksiški metabolitai, pvz., malondialdehidas (MDA), formaldehidas ir kt. (Del Rio ir kt., 2005). MDA yra lipidų peroksidacijos indikatorius ir, esant organizme oksidaciniam stresui, kepenyse ir kituose organuose yra stebimas jo kiekio padidėjimas. Šis aldehidas yra polinesočiųjų riebalų rūgščių peroksidacijos galutinis produktas, todėl pagal jo kiekį ląstelėse galima spręsti apie biologinių struktūrų pažeidimo laipsnį (Grotto ir kt., 2009).

Oksidacinio streso metu taip pat yra paveikiama ląstelių branduolio DNR – didėja genetinio ląstelės pažeidimo tikimybė, paveikiama antioksidacinė organizmo sistema – sumažėja GSH kiekis kepenyse ir kituose organuose, sutrikdoma antioksidacinių fermentų veikla (Bernard, 2008). Laisviesiems radikalams reaguojant su biologinėmis makromolekulėmis – lipidais, baltymais, DNR – susidaro įvairūs antriniai radikalai, pavyzdžiui, lipidiniai, aminorūgščių, tioliniai radikalai, kurie veikiant deguoniui virsta peroksi-radikalais, susidaro įvairūs peroksidai. Pastarieji biologinėse sistemose yra svarbūs tuo, kad sukelia grandinines reakcijas ir dėl to yra pažeidžiamos įvairios ląstelių struktūros, sutrinka jų funkcija (Del Rio ir kt., 2005).

2.2 Ląstelių antioksidacinė sistema

2.2.1. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai

Žmogaus organizmo ląsteles nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio saugo endogeninė daugiakomponentė antioksidacinė sistema (Valko ir kt., 2006). Antioksidacinėmis savybėmis pasižymintys junginiai neutralizuoja laisvuosius radikalus juos sujungdami, keisdami struktūrą arba tiesiog suardydami (Apel ir kt., 2004; Kunwar ir kt., 2011).

2 pav. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai ir jų veikimas

Iš Molecular and cellular mechanisms of iron homeostasis and toxicity in mammalian cells (Waisberg ir kt., 2003)

Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai yra:

1. Antioksidacinio poveikio fermentai: glutationo S-transferazė (GST), superoksiddismutazė (SOD), katalazė (KAT), glutationo peroksidazė (Gpx), glutationo reduktazė (Gred) (Valko ir kt., 2006). 2. Nefermentiniai antioksidantai – redukcinėmis savybėmis pasižymintys junginiai (glutationas,

askorbo rūgštis, vitaminai A ir E, flavonoidai, kofermentas Q ir kt.). Nefermentiniams antioksidantams taip pat priklauso baltymai, sujungiantys pereinamųjų metalų jonus, pavyzdžiui

transferinas, feritinas, celuplazminas (Kunwar ir kt., 2011; Verma ir kt., 2005; Valko ir kt., 2006; ). Antioksidacinės sistemos komponentai ir jų veikimo mechanizmai pateikiami 2 pav.

2.2.2. Antioksidaciniai fermentai

Greičiausiai atsakas į laisvuosius radikalus pasireiškia veikiant antioksidaciniams fermentams. SOD sukelia pirminį antioksidacinį poveikį ir dėl to atlieka labai svarbų apsauginį vaidmenį. Ji katalizuoja aktyvaus O2•‾ pavertimą H2O2 (Kunwar ir kt., 2011; Murphy, 2008). Šis

fermentas turi keletą izoformų. Žmogaus ir kitų žinduolių ląstelėse randamos trys fermento formos – tai SOD1, į kurios sudėtį įeina Zn2+ ir Cu2+ ir kuri daugiausia randama ląstelių citoplazmoje, SOD2, kurios sudėtyje yra Mn2+

ir kuri randama ir veikia ląstelių mitochondrijose. Ląstelių išorėje veikia trečioji SOD izoforma – SOD3, į kurios sudėtį įeina Zn2+

ir Cu2+ (Valko ir kt., 2005; Jomova ir kt., 2010). Taigi organizme stingant minėtų elementų ląstelių antioksidacinė apsauga sutrinka.

KAT, kuri pagal savo struktūrą yra hemoproteinas, katalizuoja H2O2 skaidymą į vandenį ir

deguonį. Daugiausia ši reakcija vyksta peroksisomose, kur yra didžiausi KAT kiekiai, tačiau ši reakcija gali vykti ir ląstelių citoplazmoje, kur fermento kiekiai yra mažesni (Valko ir kt., 2006). KAT aktyvumą slopina SM jonai, fermento aktyvumui įtakos turi ir kiti ksenobiotikai, patenkantys į žmogaus organizmą. Pavyzdžiui, cianidai inhibuoja fermento veikimą, nes prisijungia prie jo sudėtyje esančio hemo (Jomova ir kt., 2010).

Gpx bendrai yra vadinama izofermentų šeima, neutralizuojanti įvairios kilmės peroksidus – tiek H2O2, tiek organinius hidroperoksidus. Peroksidų redukcijos reakcijoms kaip elektronų donoras

naudojamas GSH, o reakcijų metu susidaro vanduo arba atitinkami alkoholiai (Apel ir kt., 2004; Margis ir kt., 2008). Žinduolių audiniuose randami 4 pagrindiniai Gpx izofermentai – Gpx1, Gpx2, Gpx3 ir Gpx4, kurie nustatyti eritrocituose, kepenyse, plaučiuose, inkstuose, virškinamajame trakte, placentoje, raumenyse. Į Gpx sudėtį įeina selenas, todėl fermento antioksidacinis aktyvumas priklauo nuo šio mikroelemento kiekio organizme, ir jo trūkstant, ląstelių antioksidacinė apsauga sutrinka (Margis ir kt., 2008). Gpx daugiausia yra kepenų ląstelėse, kur ji randama ląstelių citoplazmoje ir mitochondrijų matrikse. Tokiu būdu H2O2, kuris susidaro endoplazminiame tinkle ir mitochondrijose,

daugiausia suardomas Gpx, o H2O2, susidarantis veikiant peroksisomų fermentams, neutralizuojamas

veikiant KAT (Valko ir kt., 2005).

Gred antioksioksidacinį veikimą galima pavadinti netiesioginiu, nes fermentas ne tiesiogiai inaktyvuoja laisvuosius radikalus, bet, veikiant šiam fermentui, oksiduota glutationo forma (GSSH), naudojant redukuotą kofermentą NADPH, yra paverčiama GSH, kuris ląstelėse veikia kaip stiprus antioksidantas (Kunwar ir kt., 2011). Gred sudėtyje yra 2 FAD molukulės, kurios yra redukuotos. Šie

redukuoti flavinai, jiems reaguojant su GSSH molekulėmis, yra nedelsiant reoksiduojami. Taigi GSH kiekis ląstelėse ir jo antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo Gred veikimo. Tokiu būdu pasireiškia netiesioginis šio fermento antioksidacinis veikimas (Apel ir kt., 2004).

2.2.3. Nefermentiniai antioksidantai

Ląstelių antioksidacinę sistemą sudarantiems nefermentiniams antioksidantams, prijungiantiems laisvuosius radikalus, priklauso GSH ir kiti redukuoti ląstelės tioliniai junginiai, askorbo rūgštis, vitaminai A, E, flavonoidai, kofermentas Q (Kunwar ir kt., 2011).

GSH yra laikomas bene svarbiausiu daugiafunkciniu endogeniniu antioksidantu (Valko ir kt., 2005). Pirmiausia, vykstant oksidacijos-redukcijos reakcijoms, veikiant fermentui Gpx, GSH yra oksiduojamas, o įvairūs peroksidai – redukuojami ir tokiu būdu nukenksminami (Circu ir kt., 2011; Valko ir kt., 2006). GSH taip pat gali tiesiogiai reaguoti su laisvaisiais radikalais. Šios reakcijos metu praradęs elektroną GSH pats tampa reaktyvus, tačiau nedelsiant reaguoja su kita tokia pat reaktyvia dalele ir susidaro GSSH, kuris veikiant Gred vėl yra paverčiamas į antioksidaciniu poveikiu pasižyminčią redukuotą formą (Valko ir kt., 2006; Martin ir kt., 2009; Circu ir kt., 2011).

GSH taip pat gali reaguoti su oksidacinio streso metu ląstelėse susidariusiais dalinai oksiduotais baltymų produktais (baltymas-S•) susidarant disulfidiniams junginiams (baltymas-SSG), kurie vėliau veikiant fermentui Gred ir mažos molekulinės masės baltymams – glutaredoksinui, tioredoksinui – yra redukuojami susidarant pradinės struktūros baltymams su laisvomis tiolinėmis grupėmis (Jomova ir kt., 2010).

GSH atlieka dar vieną svarbią funkciją. Jis dėl struktūroje esančios sulfhidrilinės grupės geba sujungti į organizmą patekusius sunkiuosius metalus, kurie turėdami elektrono donorinių savybių, gali sudaryti kovalentinius ryšius su baltymų sulfhidrilinėmis grupėmis. Tokiu būdu GSH apsaugo ląstelės baltymus, peptidus nuo oksidacinių pažeidimų (Martin ir kt., 2009; Jomova ir kt., 2010).

Antioksidacinio poveikiu pasižymi ir vitaminas C, kuris yra vidutiniškai stiprus reduktorius (Verma ir kt., 2005). Šis antioksidantas geba neutralizuoti 1O2, •OH, O2•‾, o reakcijų metu susidaro

stabilesni junginiai, kurie yra labai mažai aktyvūs (Kunwar ir kt., 2011). Askorbo rūgštis taip pat veikia kaip antrinis antioksidantas – redukuoja kito natūralaus antioksidanto – tokoferolio radikalą, apsaugo fermentus, turinčius pereinamųjų metalų jonų prostetines grupes (Jomova ir kt., 2010).

Vitaminas E ir jo dariniai (tokoferoliai) yra hidrofobinėmis savybėmis pasižymintys antioksidantai. α-tokoferolis yra pati aktyviausia vitamino E forma randama žmogaus ląstelėse (Valko ir kt., 2005). Vitamino E pagrindinė antioksidacinė funkcija yra apsaugoti ląstelių membranas nuo lipidų peroksidacijos. Tokoferoliai veikia sujungdami laisvuosius radikalus, susidarančius lipidų

peroksidacijos grandininių reakcijų metu. Šis susidariusių lipidinių radikalų pašalinimas neleidžia susidaryti naujiems radikalams ir vykti grandininėms reakcijoms, pažeidžiančioms ląstelių membranų lipidus (Singh ir kt., 2005).

Ubichinolis – redukuota kofermento Q forma – tai antioksidantas kuris saugo lipidus nuo laisvųjų radikalų poveikio (Quinzii ir kt., 2010). Kaip energijos perdavėjas elektronų transporto grandinėje kofermentas Q nuolat dalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose. Redukuotos formos kofermento Q molekulėje elektronai gana silpnai prisijungę ir tokia molekulė lengvai atiduoda vieną ar du elektronus, taip pasireiškiant antioksidaciniam jo poveikiui. Kofermentas Q stabdo lipidų peroksidaciją slopindamas lipidinių peroksi-radikalų susidarymą, jis taip pat slopina [Fe3+O2]•, 1O2

formavimąsi (Kunwar ir kt., 2011). Taip pat jis geba efektyviai regeneruoti vitaminą E iš oksiduotos į antioksidaciniu poveikiu pasižyminčią redukuotą formą (Petillo ir kt., 2008).

Baltymams, sujungiantiems pereinamųjų metalų jonus, priklauso baltymai, dalyvaujantys metalų apykaitoje organizme ir galintys sujungti sunkiųjų metalų jonus, pavyzdžiui, transferinas, laktoferinas, ceruloplazminas. Transferinas ir ceruloplazminas yra serumo baltymai, pasižymintys lipidų peroksidaciją slopinančiu poveikiu (Verma ir kt., 2005). Transferinas dalyvauja geležies apykaitoje, sujungia laisvą geležį. Tokiu būdu slopinamos Fentono reakcijos, kurių metu susidaro laisvieji radikalai (Esposito ir kt., 2003). Ceruloplazminas pasižymi fermentiniu aktyvumu, jis katalizuoja reakciją, kurios metu Fe2+

oksiduojami į Fe3+, būtent tokiu pavidalu šiuos jonus prijungia pernašos baltymas transferinas (Verma ir kt., 2005).

Nefermentiniams antioksidantams taip pat galima priskirti metalotioneinus (MT). Tai yra daug cisteino turintys mažos molekulinės masės baltymai, gebantys sujungti SM ir tokiu būdu juos nukenksminti. Keletas atliktų tyrimų parodė, kad MT taip pat gali tiesiogiai neutralizuoti SM poveikyje susidarančius laisvuosius radikalus – O2•‾, •OH, H2O2, NO, ONOO‾. MT sintezę skatina

sunkieji metalai, hormonai, uždegiminiai procesai, vaistai, įvairūs oksidantai ir prooksidantai (Cai ir kt., 2000).

MT randami daugelyje stuburinių gyvūnų organų. Kepenyse ir inkstuose būna didžiausia jų koncentracija, nes šiuose organuose MT kaupiasi organizmui senstant (Bobillier-Chaumont ir kt., 2006). Yra atrastos 4 pagrindinės MT izoformos: MT-I ir MT-II randamos visuose audiniuose, tačiau didžiausi jų kiekiai yra aptinkami kepenyse, inkstuose, žarnyne, MT-III izoforma nustatyta tik smegenyse, MT-IV – epitelio ląstelėse (Jacob ir kt., 2002). MT skirtingų tipų ląstelėse, kaip ir skirtinguose organuose, pasiskirsto taip pat pakankamai nevienodai. Pavyzdžiui, kepenyse MT randami hepatocituose, o fibroblastuose ar kitose ląstelėse jų neaptinkama. Nustatyta, kad MT koncentracija skirtingų organizmų tuose pačiuose organuose taip pat skiriasi (Park ir kt., 2001).

MT pasižymi antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu, jie taip pat slopina įvairius patofiziologinius procesus ląstelėse. Šie apsauginiai baltymai reguliuoja cinko absorbciją ir dėl to yra

svarbūs įvairių fermentų, transkripcijos veiksnių veiklai, baltymų sintezės procesui (Park ir kt., 2001). MT taip dalyvauja cinko apykaitoje organizme – jie geba sujungti, o reikiant atpalaiduoti cinko jonus, tokiu būdu veikdami kaip pagrindiniai šio mikroelemento reguliaciniai komponentai ląstelėje. Ši MT funkcija yra ypatingai svarbi smegenyse (Cai ir kt., 2000). Eksperimentų su gyvūnais metu nustatyta, kad MT veiksmingai slopina oksidacinį stresą smegenyse in vivo sąlygomis. Antioksidacinis jų poveikis pasireiškia slopinant lipidų peroksidaciją, azoto oksido susidarymą – reiškinius, kurie sukelia neuronų pažeidimus ir ląstelių žūtį (Feng ir kt., 2005).

Antioksidacines MT savybes lemia juos sudarančių cisteino molekulių tiolinių grupių nukleofiliškumas ir MT gebėjimas sudaryti su metalais kompleksinius junginius. MT gali sujungti pakankamai didelį metalų jonų kiekį – iki 7 kadmio, gyvsidabrio ir cinko, 12 vario, 18 sidabro. MT ypatingai svarbūs kadmio detoksikavimo procese, o Cd2+

yra stiprūs MT sintezės induktoriai (Park ir kt., 2001). MT, surišdami laisvus SM jonus, juos detoksikuoja, neleisdami sukelti oksidacinių pažeidimų. SM turi didelį afinitetą tiolines grupes turintiems junginiams. MT, kurių sudėtyje cisteino kiekis siekia ne mažiau 20-30%, taip pat turi laisvų tiolinių grupių, prie kurių ir prisijungia SM jonai. Taip sumažėja SM geba difunduoti pro ląstelių sieneles į ląstelių vidų ir mažėja jų toksiškumas (Haq ir kt., 2003). Svarbu paminėti ir tai, kad patekę į organizmą SM, ypač kadmis, yra saugomi sujungti su MT kompleksinių junginių pavidalu kepenyse. Iš ten šie kompleksai bėgant laikui patenka į kitus audinius, kuriuose iš kompleksų su MT atpalaiduoti SM jonai vėl gali būti sujungiami MT. Trūkstant šių apsauginių baltymų, kai SM jonai lieka laisvi, gali pasireikšti toksinis jų poveikis (Kang ir kt., 2006, Kara ir kt., 2005). Metalų atpalaidavimo mechanizmas iš komplekso su MT nėra visiškai aiškus. Manoma, kad metalai gali būti atlaisvinami nuo MT oksiduojant šiuos baltymus (Haq ir kt., 2003).

2.3. Sunkieji metalai. Bendra charakteristika

SM – tai grupė cheminių elementų, kurių tankis didesnis nei 5 g/cm3. Kai kurie šių metalų – kobaltas, varis, molibdenas, cinkas, stroncis labai mažais kiekiais yra būtini žmogaus organizmui. Kobaltas įeina į vitamino B12, mielino sudėtį, kuris svarbus kraujodarai (Jomova ir kt., 2010). Varis

reikalingas organizmo fermentų veiklai, elastino, kolageno gamybai, svarbus normaliai skydliaukės veiklai (Angelova ir kt., 2011; Fraga, 2003). Molibdenas reikalingas kraujodaros procesui organizme, veikia kaip įvairių fermentų, kofaktorius (Fraga, 2003). Cinkas taip pat reikalingas fermentų veiklai organizme – jis yra beveik šimto fermentų kofaktorius, svarbus imuninės sistemos veiklai, baltymų, DNR sintezei, skatina žaizdų gijimą (Prasad, 2008). Stroncis reikalingas elementas kaulų mineralizacijai – jis pasižymi anaboliniu poveikiu kaulams (Bonjour ir kt., 2009). Dalis metalų – stibis,

švinas, nikelis, alavas mikro kiekiais taip pat randami žmogaus organizme, tačiau jie neturi biologiškai aktyvaus poveikio (Hall ir kt., 2007).

SM šaltiniai yra natūralūs (gamtiniai) ir antropogeniniai. Natūraliai aplinkoje SM randami dėl uolienų ir dirvožemio erozijos, atmosferinių nuosėdų. Antropogeniniai SM šaltiniai yra pramonės įmonių, žmogaus ūkinė bei gamybinė veikla. Metalai į žmogaus organizmą gali patekti įvairiais keliais: per kvėpavimo takus, per virškinamąjį kanalą, tiesiogiai per odą (Soghoian, 2011).

Tam tikros sunkiųjų metalų koncentracijos gali sukelti ūminį ar lėtinį apsinuodijimą, o jų toksiškumas gali pasireikšti sutrikusia centrinės nervų sistemos (CNS) veikla, pvz, atminties susilpnėjimu, energijos trūkumu, kraujo sudėties pokyčiais, plaučių, kepenų, inkstų ir kitų gyvybiškai svarbių organų pažeidimais (Kurowska ir kt., 2010). Ilgas buvimas sveikatai žalingoje aplinkoje, kai į organizmą nuolat patenka nedideli minėtų sunkiųjų metalų kiekiai, gali sukelti lėtai progresuojančius fizinius ir neurologinius degeneracinius procesus, tokius kaip Alzheimerio liga, Parkinsono liga, raumenų distrofija ar išsėtinė sklerozė. Alergijos dėl sunkiųjų metalų poveikio pasireiškia labai retai, tačiau pakartotinis ilgalaikis kontaktas su kai kuriais sunkiaisiais metalais, pavyzdžiui, kadmiu, nikeliu ar jų junginiais gali sukelti netgi vėžį (Soghoian, 2011).

SM toksiškumą lemia keletas veiksnių. Specifiniai apsinuodijimo simptomai priklauso nuo konkretaus metalo, patekusios į organizmą, dozės ir nuo poveikio trukmės. Apsinuodijimo sunkumas taip pat priklauso ir nuo apsinuodijusio asmens amžiaus (Soghoian, 2011).

Neigiamas SM poveikis organizmui pasireiškia keletu mechanizmų, vienas jų - aktyvuojant oksidacinio streso sistemą. SM yra vieni laisvųjų radikalų susidarymą skatinančių veiksnių. Molekulinio deguonies redukcijos procesas, veikiant SM jonams labai pagreitėja (Kunwar ir kt., 2011). SM patekimas padidina nefermentį laisvųjų radikalų susidarymą vykstant redokso ciklo reakcijoms. Tai aiškinama tuo, kad SM yra geri deguonies molekulės redukcijos vienu elektronu katalizatoriai (Valko ir kt., 2006). Esant organizme SM jonų, laisvųjų radikalų susidarymas, dalyvaujant fagocitinėms ląstelėms (makrofagams, leukocitams), taip pat suintensyvėja (Kunwar ir kt., 2008). Dėl šių priežasčių biologinėse sistemose SM veikia kaip oksidacinio biologinių makromolekulių pažeidimo katalizatoriai ir todėl pasižymi įvairiapusiu toksiniu poveikiu, keliančiu grėsmę gyvajai gamtai ir žmonių sveikatai (Valko ir kt., 2005; Hengstler ir kt., 2003). Dėl SM sukelto laisvųjų radikalų susidarymo pažeidžiamos lipidų, baltymų molekulės, DNR ir tokiu būdu sukeliami įvairūs patologiniai procesai žmonėms ir gyvūnams (Valko ir kt., 2006). Visa tai lemia, kad SM poveikio tyrimas yra tinkamas modelis jų toksiškumo gyviesiems organizmams ir ląstelių antioksidacinės sistemos aktyvumo įvertinimui. 3 pav. pateikiami sunkiųjų metalų jonais sukeliamo oksidacinio streso keliai organizme ir galimos jo pasekmės.

3 pav. Metalų jonais sukelto oksidacinio streso keliai organizme Sudaryta autorės

2.4 Kadmio poveikis organizmui

2.4.1. Kadmio vaidmuo ligų patogenezėje

Kadmis (Cd) – sunkusis metalas, periodinės elementų lentelės IIB grupėje esantis tarp cinko ir gyvsidabrio. Jis įeina į įvairių lydinių sudėtį, naudojamas galvanizacijai, graviravimui, atominėje pramonėje, nikelio – kadmio elementams, šarminiams akumuliatoriams, dažams, gaminti, jo yra cigarečių dūmuose (Fraga, 2003).

Kadmis yra vienas toksiškiausių SM žmogaus organizmui (Shadi ir kt., 2001; Sharma ir kt., 2008; Hall ir kt., 2007). Remiantis PSO rekomendacijomis, šio SM paros dozė žmogaus organizme neturėtų viršyti 70 µg. Vis dėlto, manoma, kad dėl plataus vartojimo per parą į žmogaus organizmą gali patekti dvigubai didesni šio metalo kiekiai (Satarug ir kt., 2009). Kadmio toksiškumą sustiprina tai, kad jo eliminacijos iš organizmo laikas yra labai ilgas – 13-40 metų (Waisberg ir kt., 2003).

Šis metalas yra labai nuodingas ir kelia rimtą pavojų gyvybei kai patenka į organizmą per virškinamąjį traktą ar kvėpavimo takus. Ūmi intoksikacija pasireiškia į organizmą patekus 15 mg/kg kadmio (Kurowska ir kt., 2010).

Eksperimentiniams gyvūnams šis metalas sukelia kvėpavimo sistemos, urogenitalinės (prostatos, sėklidžių), kraujodaros sistemų navikus. Tyrimų su gyvūnais metu taip pat nustatytas nefrotoksinis, neurotoksinis šio metalo poveikiai. (Lin ir kt., 2009; Mendez-Armenta ir kt., 2007). Kadmio ir jo junginių toksiškumas gali pasireikšti ir susilpnėjusia imuninės sistemos funkcija – ūmios intoksikacijos kadmio junginiais metu eksperimentiniams gyvūnams susilpnėja humoralinis imuninis atsakas, sumažėja makrofagų aktyvumas, vystosi užkrūčio liaukos atrofija, splenomegalija. Dėl visų šių poveikių kadmio ir jo junginių intoksikacijos metu sumažėja organizmo atsparumas infekcijoms (Neelima ir kt., 2008).

Žmonėms ūmių apsinuodijimų kadmiu metu pasireiškia kvėpavimo takų funkcijos sutrikimas – išsivysto plaučių edema, pneumonija (Bernard, 2008). Lėtinės intoksikacijos kadmio junginiais atveju taip pat pasireiškia kvėpavimo takų organų pažeidimai ir jų disfunkcija – gali išsivystyti plaučių emfizema, lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL), taip pat gali pasireikšti plaučių jungiamojo audinio irimas, išsivystyti plaučių navikai (Satarug ir kt., 2009; Waisberg ir kt., 2003). Lėtinius apsinuodijimus šiuo sunkiuoju metalu dažnai sukelia cigarečių dūmai (Kurowska ir kt., 2010).

2.4.2. Kadmis ir oksidacinis stresas

Kadmis organizme sukelia oksidacinį stresą, kuris pasireiškia keliais mechanizmais: 1. Ląstelių apsauginių sistemų aktyvinimas (MT, GSH sintezė) ir poveikis tioliniams junginiams; 2. Lipidų peroksidacijos sukėlimas;

3. Žalingas poveikis ląstelių fermentams (Ercal ir kt., 2001; Mahmodabady ir kt., 2006).

Į organizmą patekęs kadmis indukuoja MT, kurie suriša Cd2+_{, sintezę. Susidarę kadmio – MT}

kompleksai (Cd-MT) saugomi kepenyse. Iš kepenų šie kompleksai laikui bėgant patenka į inkstus, kitus audinius. Inkstuose jie filtruojami ir reabsorbuojami proksimaliniuose kanalėliuose. Cd-MT kompleksai yra metabolizuojami lizosomose. Šio proceso metu yra išlaisvinami Cd2+_{, kurie vėl}

jungiasi prie MT molekulių arba, būdami laisvi, Cd2+ gali toksiškai veikti audinius (Ercal ir kt., 2001; Kang, 2006). Kadmis daugiausia kaupiasi kepenyse ir inkstuose, ten ir yra nustatomi didžiausi MT kiekiai (Klaasen ir kt., 2009).

Kadmis keičia ir GSH kiekį ląstelėse. Bet koks šio tripeptido kiekio pokytis rodo oksidacinės sistemos būsenos sutrikimą. Kai ląstelės yra paveikiamos sunkiųjų metalų jonų, GSH sintezė suintensyvėja, tokiu būdu siekiant neutralizuoti SM ir jų poveikyje susidarančius laisvuosius radikalus

bei atkurti įprastą ląstelės oksidacinę būseną. Neigiamas kadmio poveikis tioliniams junginiams pasireiškia Cd2+

jungiantis prie tiolinių grupių turinčių baltymų molekulių ir slopinant jų aktyvumą (Pacheco ir kt., 2008; Templetom ir kt., 2010).

Patekęs į organizmą kadmis sukelia ir lipidų peroksidaciją. Šio proceso suintensyvėjimas aiškinamas GSH ir MT išeikvojimu. Kai šių junginių pradeda trūkti ląstelėse, Cd2+

nėra sujungiami ir inaktyvuojami, o tai lemia laisvųjų deguonies radikalų susidarymą, kurie atakuoja ląstelių membranų lipidus (Ercal ir kt., 2001; Grotto ir kt., 2009). Kadmio gebėjimą sukelti lipidų peroksidaciją rodo tai, kad šiam metalui patekus į organizmą, kepenyse ir inkstuose yra stebimas MDA kiekio padidėjimas (Ercal ir kt., 2001). Pagal šio aldehido kiekį ląstelėse galima spręsti apie biologinių struktūrų oksidacinio pažeidimo laipsnį, todėl MDA kiekio tyrimas dažnai taikomas eksperimentuose vertinant kadmio sukeltus pažeidimus (Grotto ir kt., 2009). Lipidų peroksidacija yra žalinga ląstelėms ne tik dėl ląstelės struktūrinių pažeidimų. Susidaręs MDA nėra neutralus junginys, jis geba reaguoti su DNR nukleotidais susidarant tam tikriems cheminiams junginiams. Tokie pokyčiai DNR molekulėse lemia mutageninį MDA poveikį žmogaus ląstelėms (Filipič ir kt., 2006).

Cd2+ taip pat neigiamai veikia ir ląstelių fermentus. Ypač stipriai šis metalas slopina du pagrindinius antioksidacinės sistemos fermentus – KAT ir SOD (Ercal ir kt., 2001). SOD2 inhibavimas yra susijęs su Mn2+

pakeitimu Cd2+ jonais fermento aktyviajame centre, o SOD1 inakyvinimas siejamas ne su Zn2+ pakeitimu Cd2+, bet su fermento ir Cd2+ tarpusavio sąveika. KAT inhibavimas vyksta dėl fermento molekulės struktūrinių pokyčių, kurių katalizatorius yra Cd2+

. Jiems veikiant imidazolo liekana jungiasi su His-74 liekana, kuri yra būtina H2O2 skaidymo reakcijose ir tokiu būdu

fermentas netenka aktyvumo (Ercal ir kt., 2001; Casalino ir kt., 2002).

Kaip matyti iš 3 pav. pateiktos schemos, kadmio ir kitų SM patekimas į organizmą lemia ir DNR pažeidimus (Risso-de Faverney ir kt., 2004). Cd2+

slopinant ląstelių antioksidacines sistemas susidaro laisvieji radikalai. Aktyvių deguonies formų susidarymas skatina baltymų ir DNR-amino rūgščių kompleksų susidarymą dėl ko sutrinka DNR reparacijos sistema, gali įvykti mutacijos (Nzengue ir kt., 2008; Pal ir kt., 2011; Filipič ir kt., 2006). Taip pat gali būti slopinamas DNR sintezės procesas, sutrikdoma genų raiška, baltymų sintezės procesai (Hsiao ir kt., 2004; Sandalio ir kt., 2009).

2.5. Nikelio poveikis organizmui

2.5.1. Nikelio vaidmuo ligų patogenezėje

Dar vienas šiais laikais pramonėje plačiai naudojamas metalas yra nikelis. Jis pritaikomas įvairioms reikmėms: galvanizacijai, elektroninės įrangos, plieno, keramikos, nikelio – kadmio

elementų gamybai (Kasprzak ir kt., 2003). Tai taip pat sunkusis metalas, kuris, patekęs į organizmą per kvėpavimo takus, odą ar virškinamąjį traktą, gali sukelti ūminius ir lėtinius apsinuodijimus (Forti ir kt., 2011). Natūraliai aplinkoje nikelio yra labai maži kiekiai. Ten, kur šis metalas yra naudojamas pramoniniais tikslais, jo koncentracija gali būti žymiai didesnė. Dėl to pagrindinė apsinuodijimų nikeliu priežastis yra pramonės įmonių veikla. Nikelis pasižymiu stipriu kancerogeniniu poveikiu, todėl yra labai pavojingas su juo dirbantiems žmonėms (Raymond ir kt., 2005).

Ūmiai apsinuodijama nikelio junginiams patekus į organizmą per kvėpavimo takus ar virškinamąjį traktą. Jis kaupiasi plaučiuose, kepenyse, inkstuose. Tyrimų su gyvūnais metu nustatyta, kad jis taip pat gali kauptis širdies raumenyje, riebaliniame ir periferiniame nerviniame audiniuose, smegenyse (Das ir kt., 2008). Atliktų tyrimų metu nustatyta, kad nikelio junginiai žmonėms sukelia negrįžtamus plaučių audinio pažeidimus ir funkcijos sutrikimus, inkstų kanalėlių nekrozę, anemiją, eozinofiliją, nosies pertvaros išopėjimą (Chen ir kt., 2003). Ūmiai apsinuodijus taip pat gali pasireikšti miokarditas, encefalopatija, o nikelio junginiams patekus ant odos gali prasidėti alerginės reakcijos, dermatitas. Labai pavojingas yra ūmus apsinuodijimas organiniu nikelio junginiu - tetrakarbonilnikeliu, kuris susidaro reaguojant CO su aktyviu nikeliu (Kasprzak ir kt., 2003).

Nikeliui patekus į organizmą stebimi fiziologinių ir cheminių procesų pokyčiai organizme – tai sumažėjęs azoto sulaikymas, gliukozurija, fosfaturija, kalcio ir cinko išsiskyrimas su šlapimu (Das ir kt., 2008). Ni2+ taip pat slopina ATP‘azės – fermento, dalyvaujančio ląstelių energijos apykaitoje, aktyvumą, o tai gali sukelti neurologinius sutrikimus, traukulius, komą (Kurowska ir kt., 2010). Lėtinis apsinuodijimas nikeliu pasireiškia redukuoto kofermento nikotinamido – NADH, kuris yra būtinas oksidacinio fosforilinimo procesui mitochondrijose vykti, kiekio sumažėjimu. Tokiu būdu sutrinka energijos atpalaidavimas ląstelėse dėl ko gali pasireikšti nuovargis, imuniteto susilpnėjimas, apatija, pagreitėjęs širdies ir kitų ligų progresavimas (Denkhaus ir kt., 2002; Demir ir kt., 2011).

2.5.2. Nikelis ir oksidacinis stresas

Bendrai, kaip ir kadmio, nikelio toksiškumas pasireškia sukeliamu oksidaciniu stresu ląstelėse, kuriam būdinga laisvųjų deguonies radikalų susidarymas, baltymų sulfhidrilinių grupių sujungimas, glutationo kiekio sumažėjimas, dėl ko ir pasireiškia citotoksinis, genotoksinis ir kiti šio metalo poveikiai (Chen ir kt., 2003; Costa ir kt., 2002).

Lyginant su variu, geležimi, kobaltu ar kitais redokso-aktyviais metalais, nikelio poveikyje susidaro santykinai mažiau, tačiau pakankamas kiekis ląstelių pažeidimus sukeliančių laisvųjų radikalų (Chen ir kt., 2003). Šių reaktyvių junginių susidarymą skatina tiek vandenyje tirpūs, tiek netirpūs nikelio junginiai (Kurowska ir kt., 2010).

Nikelis, kaip ir kadmis, sukelia lipidų peroksidaciją (Valko ir kt., 2006). Šio proceso metu oksiduojamos nesočiosios riebiosios rūgštys dėl ko pažeidžiamos ląstelių membranos, o susidarę reaktyvūs lipidiniai peroksi-radikalai gali sukelti tolesnius ląstelių pažeidimus. Tai yra ūmaus nikelio toksiškumo pasekmė, o tyrimų su graužikais metu nustatyta, kad intensyviausiai lipidų peroksidacija Ni2+ poveikyje indukuojama kepenyse, inkstuose, kraujo ląstelėse, raumenyse, sėklidėse (Doreswamy ir kt., 2004; Chen ir kt., 2003). Svarbu ir tai, kad nikelio junginiams patekus į organizmą stipriai slopinamas antioksidacinių fermentų – SOD, KAT, Gpx, Gred aktyvumas, dėl ko lipidų peroksidacija, veikiant Ni2+, dar labiau suintensyvėja (Doreswamy ir kt., 2004, Cameron ir kt., 2011).

Nikelio junginiai, patekę į organizmą, sukelia ir baltymų, atliekančių daug gyvybiškai svarbių funkcijų, oksidaciją (Valko ir kt., 2006). Oksidacijos metu gali susidaryti baltymų hidroperoksidai, gali būti hidroksilinamos aminorūgščių aromatinės grupės ir šoninės grandinės, nitrinamos aromatinės aminorūgščių liekanos, oksiduojamos sulfhidrilinės grupės, amino rūgščių liekanos konvertuojamos į karbonilines grupes. Taip pat oksidacijos metu gali skilti baltymų molekulių polipeptidinės grandinės ir tarp jų gali formuotis skersinės jungtys. Visi šie procesai keičia peptidų, baltymų molekulių struktūrą dėl ko pakinta jų aktyvumas ir funkcijos (Jha ir kt., 2011).

Ni2+ poveikyje susidarę laisvieji radikalai taip pat gali pažeisti DNR azotines bazes ir sukelti genetines modifikacijas, o jos – įvairių navikų išsivystymą (Das ir kt., 2008; Cameron ir kt., 2011).

2.6. Cinko biologinis poveikis

2.6.1. Cinko funkcijos organizme

Cinkas kaip mikroelementas organizme yra svarbus įvairiems medžiagų apykaitos procesams vykti. Jis reikalingas normaliai imuninės sistemos veiklai, augimui, vystymuisi, taip pat skatina žaizdų gijimą, pasižymi priešuždegiminiu poveikiu (King, 2011). Vidutinis šio mikroelemento trūkumas pasireiškia augimo sulėtėjimu ir vyrų hipogonadizmu paauglystėje, trūkstant cinko būna šiurkšti oda, prastas apetitas, susilpnėjusi atmintis, pablogėjęs žaizdų gijimas (Osredkar ir kt., 2011). Sunkus cinko trūkumas sukelia dar rimtesnių sveikatos sutrikimų – gali išsivystyti pūslelinis dermatitas, alopecija, emociniai sutrikimai, svorio netekimas, gretutinės infekcijos dėl susilpnėjusio ląstelinio imuninio atsako. Taip pat gali pasireikšti neurosensoriniai sutrikimai, vyrams – hipogonadizmas. Jei sunkus cinko trūkumas nėra laiku nustatomas ir gydomas, jis gali būti netgi mirtinas (Prasad, 2008).

Cinkas svarbus normaliai ląstelių, atsakingų už įgimtą imunitetą, neutrofilų ir „natūralių žudikių“ ląstelių, T ir B imuninės sistemos ląstelių diferenciacijai ir funkcijai. Šis mikroelementas reikalingas ir makrofagų subrendimui, fagocitozės procesui vykti, citokinų gamybai (Prasad, 2009).

Cinkas ląstelėse atlieka daug svarbių funkcijų (Cousins ir kt., 2003). Būdamas daugiau nei 100 fermentų kofaktorius, cinkas atlieka labai svarbią katalizinę funkciją (King, 2011). Šis metalas įeidamas į baltymų molekulių sudėtį atlieka struktūrinę funkciją. Keturių aminorūgščių cisteino arba histidino molekulės ir cinkas formuoja tetraedrinius „cinko pirštų“ kompleksus. Tokie kompleksai aptinkami įvairių baltymų, dalyvaujančių ląstelių diferenciacijos, proliferacijos, signalų perdavimo, ląstelių adhezijos ar transkripcijos procesuose, struktūroje (Osredkar ir kt., 2011). Trečia labai svarbi cinko atliekama funkcija yra reguliacinė. Šis metalas reguliuoja kai kurių genų raišką (Peixoto ir kt., 2003; Cousins ir kt., 2003). Cinkas taip pat dalyvauja baltymų, DNR sintezės ir ląstelių dalijimosi procesuose, pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, geba stabilizuoti ląstelių membranas. Šis poveikis rodo, cinko gebėjimą užkirsti kelią laisvųjų radikalų sukeltai žalai uždegiminių procesų metu (Cousins ir kt., 2003). Antioksidacinis šio metalo poveikis gali apsaugoti nuo senėjimo, įvairių ligų atsiradimo, taip pat padeda paspartinti gijimo procesą po įvairių traumų (Prasad, 2009; Osredkar ir kt., 2011).

2.6.2. Cinko antioksidacinio poveikio mechanizmai

Cinko antioksidacinis poveikis pasireiškia keletu mechanizmų. Pirmiausia, jis slopina laisvųjų radikalų susidarymą, inhibuodamas fermentą NADPH oksidazę (Prasad, 2009). Šis fermentas dalyvauja pernešant elektronus per ląstelės membraną nuo redukuoto kofermento NADPH molekuliniam deguoniui. Proceso metu vyksta ir O2•‾ susidarymas. Inhibuodamas NADPH oksidazę

cinkas slopina oksidacinio streso pasireiškimą ir jo sukeliamus ląstelių, audinių ir organų pažeidimus (Kuroda ir kt., 2010).

Cinkas įeina į antioksidaciniu poveikiu pasižyminčio fermento – SOD – vienos iš izoformų, kuri dalyvauja neutralizuojant laisvuosius radikalus, sudėtį (Valko ir kt., 2006). SOD1 yra metalofermentas, kurio struktūroje yra vario ir cinko jonai. SOD1 randamas ląstelių citozolyje, branduolyje, peroksisomose, mitochondrijose – ląstelių organoiduose, kuriuose susidaro laisvieji radikalai, ir kuriuos reikia greitai inaktyvuoti. Šis fermentas neutralizuoja labai aktyvius superoksido radikalus (Kunwar ir kt., 2011; Circu ir kt., 2011).

Cinkas taip pat skatina MT – baltymų, dalyvaujančių neutralizuojant laisvuosius radikalus, sintezę (Prasad, 2009). Nors variui ir kadmiui MT turi didesnį giminingumą negu cinkui, šie baltymai normaliomis sąlygomis organizme randami susijungę būtent su šiuo metalu. Viena MT molekulė gali prijungti iki 7 Zn2+ (Feng ir kt., 2005; Nemec ir kt., 2009). Apsinuodijus sunkiaisiais metalais, pavyzdžiui, kadmiu, nikeliu MT geba sujungti šiuos metalus neleisdamas jiems skatinti laisvųjų radikalų susidarymo ir sukelti oksidacinių pažeidimų. (King, 2011).

3. TYRIMO METODIKA

3.1. Tyrimo objektas ir reagentai

Eksperimentai atlikti su nelinijinėmis 4-6 savaičių amžiaus baltosiomis laboratorinėmis pelėmis, sveriančiomis 20-25 g (4 pav.). Moksliniai tyrimai atlikti remiantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Žin., 1997, Nr. 108-2728) 14 straipsniu, Valstybinės veterinarijos tarnybos 1998 m. gruodžio 31 d. įsakymu Nr. 4-361 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ ir 1999 m. sausio 18 d. įsakymu Nr. 4-16 „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ bei sveikatos apsaugos ministro 1999 m. balandžio 12 d. įsakymu Nr. 155 „Dėl geros laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams“, o taip pat Europos etikos komiteto darbui su laboratoriniais gyvūnais nustatytų reikalavimų. Darbui su laboratoriniais gyvūnais gavome leidimą, kurį išdavė Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos (leidimo Nr. 0200).

Eksperimentams naudotos baltosios laboratorinės pelės iš LSMU VA vivariumo ir 7 dienas laikytos karantino sąlygomis. Patinai ir patelės laikyti atskiruose narveliuose, sudarant optimalias laikymo sąlygas: patalpų temperatūra ~20°C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc., natūralus šviesos (diena/naktis) režimas. Pakratams naudotos medienos drožlės ir šienas, kuriuos kiekvieną dieną keitėme švariais. Peles šėrėme „Kauno grūdų“ pilnaverčiu maistu graužikams ir girdėme vandentiekio vandeniu ad libitum.

4 pav. Tyrimo objektas

Eksperimentams naudojome šiuos reagentus: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), nikelio chloridas (NiCl2×6H2O) – firmos „Sigma“ (JAV); fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), etanolis, 5,5

-ditiobisnitrobenzoinė rūgštis (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); 2-merkaptoetanolis, kalio chloridas (KCl), druskos rūgštis (HCl), ortofosforo rūgštis (H3PO4), – firmos „Merck“ (Vokietija);

(Čekija); trichloracto rūgštis (TChA), n-butanolis, chloroformas – Rusija. Tirpalams gaminti naudojome dejonizuotą vandenį.

3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai

Medžiagos toksiškumas dažniausiai vertinamas vidutine mirtina doze (LD50). Tai yra

mažiausia jos koncentracija, nuo kurios žūva 50 proc. visų bandomųjų gyvūnų. Kiekvieno tirto metalo toksiškumui įvertinti, nustatėme atitinkamą LD50 dozę baltosioms laboratorinėms pelėms. Ji

išreiškiama miligramais metalo, tenkančiais bandomojo gyvūno vienam kūno masės kilogramui. Šią dozę paskaičiavome vadovaujantis Ašmarino ir Vorobjovo pateikiama metodika (Ашмарин ИП, 1962). LD50 dozės nustatymui kiekviename narvelyje dešimčiai pelių į pilvo ertmę sušvirkštėme tam

tikrą metalo druskos (CdCl2, NiCl2, ZnSO4) tirpalo kiekį (5 pav.). Po paros laiko vertinome, kiek

procentų sudarė kritusios ir išgyvenusios pelės. Jei kritusios ir išgyvenusios pelės sudarė po 50 proc., tai fiziologiniame tirpale esantis metalų kiekis mg ir yra LD50. Jei kritusių ir išgyvenusių pelių skaičius

nevienodas, LD50 paskaičiuojama pagal formulę (Ашмарин ir kt., 1962):

lgLD50 = lgDN – δ(ΣLi – 0,5)

DN – eksperimente panaudota maksimali medžiagos dozė, δ – panaudotų dozių santykio logoritmas, Li – kritusių ir visų pelių, kurioms buvo įvedama medžiagos dozė, santykis, ΣLi – Li reikšmių, paskaičiuotų visoms panaudotoms dozėms, suma.

Nustatėme tokias metalų dozes, atitinkančias LD50:

CdCl2 – 3,2 mg Cd (28 µmol) vienam kūno masės kilogramui;

NiCl2 – 11,2 mg Ni (190 µmol) vienam kūno masės kilogramui;

ZnSO4 – 10,3 mg Zn (157 µmol) vienam kūno masės kilogramui.

Metalų jonų poveikį laboratorinėms pelėms įvertinome 2 pasirinktais modeliais:

1. Ūmios vienkartinės intoksikacijos modelis (n=50): pelėms į pilvo ertmę (5 pav.) švirkštėme vienodą fiziologinio tirpalo tūrį, kuriame buvo ištirpintas reikalingas CdCl2, NiCl2 arba

ZnSO4 kiekis. Organizmo veikimo metalų jonais trukmė buvo 24 val. Metalų intoksikacijai, peles

suskirstėme į grupes:

 pelės, kurioms švirkštėme CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme NiCl2 (5,6 mg (95 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui)

 pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių NiCl2 (5,6 mg (95 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

 kontrolinėms pelėms švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį.

2. Kartotinės 14 dienų trukmės intoksikacijos modelis (n=50): 14 dienų vieną kartą per dieną pelėms į pilvo ertmę švirkštėme (5 pav.) vienodą fiziologinio tirpalo tūrį, kuriame buvo ištirpintas reikalingas CdCl2, NiCl2 arba ZnSO4 kiekis. Metalų intoksikacijai, peles suskirstėme į 6

grupes:

 pelės, kurioms švirkštėme CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme NiCl2 (1,12 mg (19 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių CdCl2 (1,6 mg (14 µmol) Cd vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

 pelės, kurioms švirkštėme ZnSO4 (1,56 mg (24 µmol) Zn vienam kūno masės kilogramui)

ir po 20 minučių NiCl2 (1,12 mg (19 µmol) Ni vienam kūno masės kilogramui) tirpalą;

 kontrolinėms pelėms švirkštėme atitinkamą fiziologinio tirpalo tūrį.

Praėjus numatytai intoksikacijos trukmei, pelėms buvo atlikta cervikalinė dislokacija ir dekapitacija. Tyrimams buvo išimti pelių organai, praplauti šaltu (4 ºC) fiziologiniu tirpalu ir patalpinti į Petri lėkštelę, atšaldytą ant ledo.

3.3. Tyrimo metodai

3.3.1. MT koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse

MT koncentraciją nustatatėme pagal Peixoto ir bendraautorių pasiūlytą metodiką (Peixoto ir kt., 2003). Pelių kepenis ir smegenis pasvėrėme ir susmulkinome (homogenizavome) 4 tūriuose (lyginant su kepenų ir atitinkamai smegenų mase) buferinio tirpalo (20 mM Tris-HCl (pH 8,6), 0,5 M PMSF (proteazių slopiklis), 0,01 proc. β-merkaptoetanolio (merkapto grupių reduktorius)). Homogenatą centrifugavome 17000×g pagreičiu 30 min. Beckman J2-21 centrifuga (JAV). Gautą supernatantą naudojome MT koncentracijos nustatymui tiriamuose organuose.

Į 1 ml gauto supernatanto įpylėme 1,05 ml šalto (–20°C) absoliutaus etanolio ir 80 µl chloroformo. Šį gautą mišinį centrifugavome 6000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga. Po centrifugavimo nupylėme vandeninį sluoksnį, į kurį įpylėmė trigubą tūrį (lyginant su supernatanto frakcija) šalto etanolio (–20 °C) ir laikėme –20 °C temperatūroje 1 val. Nuosėdas surinkome centri-fuguodami 6000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga, tirpinome etanolio ir 1 proc. chloroformo tirpaluose. Tuomet mišinį centrifugavome 6000×g pagreičiu 10 min. ir gautas nuosėdas tirpinome 150 µl 0,25 M NaCl, 15 µl 1 M HCl tirpaluose. Po to kambario temperatūroje įpylėme 4,2 ml 2 M NaCl (pH 8,0) buferinio tirpalo ir centrifugavome 3000×g pagreičiu 5 min. K-24 centrifuga. MT koncentraciją gautame supernatante nustatėme spektrofotometriškai matuojant sugertį ties 412 nm banga, naudojant molinį sugerties koeficientą 13600. MT koncentracija išreiškiama μg/gramui kepenų ir smegenų masės.

3.3.2. MDA koncentracijos nustatymas laboratorinių pelių kepenyse ir smegenyse

MDA koncentraciją nustatėme pagal Uchiyama ir bendraautorių pasiūlytą metodiką (Uchiyama ir kt., 1978). Pelių kepenis ir smegenis pasvėrėme ir susmulkinome 9 tūriuose (lyginant su kepenų ir smegenų svoriu) šalto 1,15 proc. KCl tirpalo. Į 0,5 ml gauto homogenato įpylėme 3 ml 1 proc. H3PO4 ir 1 ml 0,6 proc. TBR vandeninio tirpalo. Mišinį maišėme stikline lazdele ir inkubavome

45 min. verdančio vandens vonioje, po to atšaldėme ledo vonioje 10 min. Į atšaldytą mišinį įpylėme 4 ml n-butanolio, stipriai sumaišėme ir centrifugavome 8000×g pagreičiu 10 min. K-24 centrifuga. Po centrifugavimo nusiurbėme viršutinį sluoksnį ir tirpalo sugertį nustatėme spektrofotometriškai ties 535 ir 520 nm banga. Iš kalibracinės kreivės apskaičiuojama MDA koncentracija (1,1,3,3-tetrahidroksipropanas naudojamas kaip standartas), kuri išreiškiama μmol/gramui kepenų ir smegenų masės(Uchiyama ir kt., 1978).

3.3.3. Duomenų patikimumo įvertinimas

Gautus duomenis analizavome Statistikos 6.0 paketu. Duomenų patikimumą vertinome pagal Stjudento t-testą (Swiergosz-Kowalewska, 2001). Skirtumai statistiškai reikšmingi, kai reikšmingumo lygmuo p0,05.