LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Vladimiras Drazdovas
TGFBR1 ir PPARGC1 genų polimorfizmo sąsajos su kiaulių ūkinių
savybių fenotipu
Associations of TGFBR1 and PPARGC1 genes polymorphism with pig
farm traits phenotype
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovė: prof. Dr. Ilona Miceikienė
DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „
TGFBR1 ir PPARGC1 genų
polimorfizmo sąsajos su kiaulių ūkinių savybių fenotipu
―.1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŢVALGA... 9 1.1. Kiaulių genomas ... 91.2. Kiaulių genai veikiantys penėjimosi, mėsos kokybės, bei reprodukcines savybes ... 10
1.3. Transformuojančio augimo faktoriaus beta I tipo receptorių koduojančio (TGFBR1) geno polimorfizmas ... 14
1.4. Peroksisomų proliferatoriaus aktyvuojančio receptoriaus - gama koaktyvatoriaus - 1 (PPARGC1A) koduojančio geno polimorfizmas ... 15
2. TYRIMŲ MEDŢIAGA IR METODAI ... 17
2.1. Tyrimų medţiaga ... 17
2.2. Tyrimų medţiaga molekuliniams tyrimams ... 17
2.3. DNR ekstrakcija Chelex dervų pagalba ... 18
2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas ... 19
2.5. Kiaulių peroksisomų proliferatoriaus aktyvuojančio receptoriaus gama koaktyvatorius 1 (PPARGC1A) geno tyrimas PGR – RFIP metodu ... 19
2.6. Kiaulių transformuojančio augimo faktoriaus beta I tipo receptoriaus (TGFBR1) geno tyrimas PGR – RFIP metodu ... 21
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 23
3.1. PPARGC1A geno polimorfizmo tyrimai ... 23
3.2. PPARGC1A geno poveikis kiaulių penėjimosi ir mėsinėms savybėms ... 24
3.3. TGFBR1 geno polimorfizmo tyrimai ... 26
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27
IŠVADOS ... 30
SANTRAUKA
TGFBR1 ir PPARGC1 genų polimorfizmo sąsajos su kiaulių ūkinių savybių
fenotipu
Vladimiras Drazdovas Magistro baigiamasis darbas
Darbo tikslas buvo ištirti transformuojančio augimo faktoriaus beta I tipo receptoriaus (TGFBR1) ir peroksisomų proliferatoriaus - aktyvuojančio receptoriaus - gama koaktyvatoriaus - 1 (PPARGC1A) genų polimorfizmo asociacijas su kiaulių penėjimosi, mėsinėmis ir reprodukcinėmis savybėms. Tyrimai atlikti su 40 Jorkšyrų veislės ir 39 Didţiųjų Baltujų x Danijos Landrasų mišrūnų kiaulėms. PPARGC1A ir TGFBR1 genai genotipuoti PGR – RFIP metodu. Penėjimosi ir mėsinių savybių duomenys gauti iš Valstybinės kiaulių kontrolinio penėjimo stoties.
Atlikus PPARGC1A geno tyrimus su Lietuvoje veisiamomis Jorkšyrų veislės kiaulėmis buvo identifikuoti trys genotipai - homozigotinis AA genotipas (35 proc. kiaulių), heterozigotinį AT (20 proc. kiaulių) ir homozigotinį TT genotipas (45 proc. kiaulių). A alelis pasireiškė 0.45 daţniu ir T alelis 0.55 daţniu. Vertinant PPARGC1A geno įtaką penėjimosi savybėms nustatyta, kad kiaulės turinčios AA genotipą vienam kilogramui svorio priaugti sunaudodavo 0,19 kg maţiau pašarų, negu TT genotipą turinčios kiaulės (P < 0,05). Taip pat AT genotipo kiaulės sunaudojo 0,14 kg maţiau pašaro 1 kg kūno svorio priaugti, negu TT genotipo kiaulės (P < 0,05). Taipogi nustatyta, kad AA genotipo kiaulių didţiausias priesvoris per parą, lyginant su TT ir AT genotipo kiaulėmis. PPARGC1A geno heterozigotinės AT genotipo kiaulės turėjo geresnes mėsines savybes nei AA ir TT genotipo kiaulės, bet statistiškai reikšmingų asociacijų nenustatyta. Geresnės mėsinės savybės galėjo pasireikšti dėl heterozės efekto, kada poţymiai geriau išreikšti kai organizme yra ir recesyvinis ir dominantinis geno aleliai.
Atlikus TGFBR1 geno tyrimus Jorkšyrų veislėje ir Didţiųjų Baltųjų x Danijos Landrasų mišrūnuose buvo nustatytas tik vienas genotipas – AA (100 proc.). Alelis A pasireiškė daţniu - 1, alelis G daţniu - 0. Kadangi TGFBR1 genas rastas monomorfiškas tirtoje kiaulių grupėje, tolimesni tyrimai dėl TGFBR1 geno polimorfizmo asociacijos su penėjimosi, mėsinėmis bei reprodukcinėmis savybėmis nebuvo vykdomi.
PPARGC1A gali būti naudojamas bioţymeniu vykdant kiaulių selekcją. TGFBR1 genas tirtoje populiacijoje būdamas monomorfiškas nėra tinkamas kaip genas kandidatas kiaulių selekcijoje.
SUMMARY
Associations of TGFBR1 and PPARGC1 genes polymorphism with pig farm
traits phenotype
Vladimiras Drazdovas Master‘s Thesis
Object of work was to investigate the transforming growth factor beta receptor type I (TGFBR1) and peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 (PPARGC1A) genes polymorphism associations with pig fattening, carcass and reproduction traits. Testing was carried out with 40 Yorkshire and 39 Big White x Danish Lanrace crossbred pigs. PPARGC1A and TGFBR1 genes were genotyped using PCR - RFIP method. Fattening and carcass traits data were obtained from the National pig controlled fattening station.
Three genotypes for PPARGC1A gene in Lithuanian bred Yorkshire pigs were identified: 35 % of the pigs had homozygous AA genotype, 20 % heterozygous AT and 45 % homozygous TT genotype. Observed frequency for A allele was 0,45 and 0,55 for allele T. The analysis of caried out experiment data showed that PPARGC1A gene polymorphism had influence on fattening properties. Pigs with AA genotype consumed 0.19 kg less feed for 1 kg of body weight gain than the TT genotype pigs (P < 0.05). As well the AT genotype pigs consumed 0.14 kg less feed for 1 kg of body weight gain than TT genotype pigs (P < 0.05). It was also found that the AA genotype pigs had the largest daily gain, compared with TT and AT genotype pigs. Pigs with heterozygous (AT) PPARGC1A gene genotype had better carcass characteristics than AA and TT genotype pigs, but statistically significant associations were not observed. Better carcass traits of pigs with AT genotype could result from heterosis effect, where traits are better expressed when the dominant and recessive gene alleles are present.
Analysis of caried out experiment data showed that TGFBR1 gene in Yorkshire and Large White x Danish Landrace breeds was monomorphic. Only one genotype - AA (100 %) was observed. A allele occurred at a frequency of – 1, G allele at the frequency of - 0. Since TGFBR1 gene in investigated populations was found monomorphic, further research on the TGFBR1 gene polymorphism association with pig fattening, carcass and reproduction traits haven’t been carried out.
PPARGC1A can be used as a biomarker in pig selection. TGFBR1 gene being monomorphic in investigated populations might not be considered as a good candidate gene for pig selection.
SANTRUMPOS
bp – bazių poraCAST - kalpastatino baltymo genas DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis
GHRH - augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas HAL - halotano genas
IgF2 - insulino augimo faktoriaus LEP - leptino genas
LPIN1 - lipinas 1 (genas)
MC4R - melanokortino 4 receptoriaus genas MYOG - miogeninis genas
MSTN - miostatino genas
PGR – polimerazinė grandininė reakcija PIT1 - pituitrino genas
PPARGC1A - peroksisomų proliferatoriaus - aktyvuojančio receptoriaus- gama koaktyvatoriaus - 1 genas
QTL – kokybinių poţymių lokusas QTLs - kokybinių poţymių lokusai
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas
SERCA1 - Sarkoendoplazminio tinklo Ca2+ -ATP-azės 1 genas SNP – pavienio nukleotido polimorfizmas
SNPs – pavienio nukleotido polimorfizmai SSC - sus scrofa chromosoma
TAE – TAE buferinis tirpalas
ĮVADAS
Raumenų augimą, lašinių storį ir kitus mėsos kokybę įtakojančius rodiklius lemia šimtai skirtingų genų variacijų ir mutacijų. Tokie ţymenys gali būti aptinkami atliekant smulkų genomo ţemėlapio sudarymą, lyginamąsias sekas ar tiriant numanomų genų kandidatų polimorfizmą. Pastarasis būdas (genų kandidatų polimorfizmo tyrimai) buvo naudojamas daugelio mokslininkų grupių, ir lėmė atradimą dešimčių genų, dalyvaujančių audinių ar kitų norimų tirti bruoţų biocheminiuose ir fiziologiniuose procesuose, sekos kodavime ar kitų genų reguliavimo elementų procesuose, turinčiuose įtakos aminorūgščių sekai arba geno transkripcijos eigai (1). Apie genetinius veiksnius veikiančius kiaulienos raumenų augimą ir metabolizmą yra maţai ţinoma. Tik keli genetiniai ţymenys, susiję su kiaulienos mėsinėmis savybėmis yra gerai ištirti: 1) Halotano genas - įtakoja mėsos kokybę (PSE – blyškios, minkštos, vandeningos mėsos sindromas), 2) RN mutacija baltymų kinazės gene, 3) „insulino tipo“ augimo faktorius 2(susijęs su raumenų augimu), ir 5) melanocortino-4 receptoriaus genas įtakojantis riebumą, augimą, ir dienos preaugį (1).
Manoma, kad tuo pačiu metu genotipuojant keletą skirtingų informatyvių genų, lems geresnį supratimą apie kiaulių genetinę kilmę ir kiaulienos bruoţų pasireiškimą. Iki šiol, daugumos skirtingų genų polimorfizmas buvo vertintas atskirai. Tyrimai atliekami skirtingais metodais (RFIP, SSCP, DGGE ir sekvenavimo). Tolimesni tyrimai dėl kiaulienos poţymių variacijos turėtų sujungti duomenis, iš kaip įmanoma daugiau skirtingų genų. Netolimoje ateityje, genų sąveikos tyrimai turėtų suteikti geresnę įţvalgą (genetiniu pagrindu) į kiaulienos savybes. Šiuo metu vienas geriausių metodų skirtingiems genams kartu tirti yra DNR mikrogardelių metodas (1). Augimo ir mėsinės savybės yra labai svarbūs ekonomikos faktoriai gyvulininkystėje.
Darbo tikslas: ištirti transformuojančio augimo faktoriaus beta I tipo receptoriaus (TGFBR1) ir peroksisomų proliferatoriaus - aktyvuojančio receptoriaus - gama koaktyvatoriaus - 1 (PPARGC1A) genų polimorfizmo asociacijas su kiaulių penėjimosi, mėsinėmis ir reprodukcinėmis savybėms.
Darbo uţdaviniai:
Ištirti PPARGC1A geno polimorfizmą, nustatant geno alelių ir genotipų daţnius tiriamojoje kiaulių grupėje.
Ištirti TGFBR1 geno polimorfizmą, nustatant geno alelių ir genotipų daţnius tiriamojoje kiaulių grupėje.
Nustatyti asociacijas tarp kiaulių PPARGC1A geno polimorfizmo ir mėsinių bei penėjimosi savybių.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Kiaulių genomas
Genomas – tai organizmo genetinė medţiaga, uţkoduota DNR. Visa organizmo DNR seka randama viename chromosomų rinkinyje, kurį organizmas turi kiekvienoje somatinėje ląstelėje. Kiaulių chromosomų rinkinį sudaro 18 porų autosomų ir 1 pora lytinių chromosomų, 2n = 38. Patino lytinės chromosomos yra XY, o autosomas sudaro: 4 poros metacentrinių, 9 poros submetacentrinių ir 6 poros akrocentrinių chromosomų. Patelės lytinės chromosomos XX, o autosomas sudaro: 1 - 7 porų submetacentrinių, 8 - 12 porų matecentrinių ir 13 - 18 porų akrocentrinių chromosomų. Kiaulių lytinė X – vidutinio dydţio submetacentrikas, Y – maţas metacentrikas.
Kiaulės – vienos ekonomiškai svarbiausių ūkinių gyvūnų, todėl kiaulių genomas, pradėtas sekvenuoti vienas anksčiausių. Pilnas kiaulių genomo ištyrimas padės suprasti kiaulių fiziologiją, produktyvius bruoţus, kiaulės genetinę istoriją, tai taip pat turės svarbią reikšmę naudojant šiuos gyvūnus biomedicinoje (4). Kiaulių genomo projektas buvo pradėtas 2003 metais, baigtas 2009 metais apie kurį paskelbė mokslinių tyrimų grupės iš Edinburgo (JK), Ilinojaus valstijojos (JAV), Upsalos (Švedija) ir Wageningen (Nyderlandai) universitetų. Sekvenuojant genomą genetinė medţiaga buvo paimta iš Diurokų veislės patelės. Tyrimo (4) rezultatai parodė, kad bendras kiaulių genomo dydis yra 2.8 milijardai bazinių porų, kurių sudėtyje yra 21,640 baltymus koduojantys genai. Įdomu tai, jog kiaulių genome variacijų, įskaitant ir komercines kiaulių rūšis, yra net du kartus daugiau nei ţmonių genome (4).
1 lentelė. Kiaulių genomas (4).
Baltymus koduojantys genai 21630
Trumpieji baltymus nekoduojantys genai 2989
Ilgieji baltymus nekoduojantys genai 135
Pseudogenai 568
Geno iššifruotos stenogramos 30586
augančią paklausą (gerų mėsinių savybių) ir efektyviau kovoti su senomis paveldimomis kiaulių ligomis. Visa tai turi didţiulę svarbą ţemės ūkiui. Būtina paminėti ir tai, jog gerai ištirtas genomas leis tyrėjams tiksliai nustatyti genus, kurie gali būti naudingi kiaulienos augintojams arba yra susiję su imunitetu ir kitais svarbiais kiaulių fiziologijos procesais. Taigi tyrimai naudingi kiaulių selekcijai, padės perprasti ligų mechanizmus, taip pat tikriausiai padės išsaugoti retas veisles ir nykstančias laukinių kiaulių rūšis (4).
Kiaulių genomas buvo lyginamas su ţmogaus genomu. Panašumai tarp šių genomų atskleidė naujas galimybes ţmogaus organų transplantacijoje, taip pat kiaules galima taikyti kaip modelį norint atskleisti ţmonių genetines ligas. Iš viso genome buvo rastos 112 DNR pozicijos, kur baltymai turėjo tą pačią amino rūgštį, susijusią su tam tikromis ţmonių ligomis, įskaitant Alzheimerio liga, diabetą, nutukimą ir Parkinsono ligą. Tai rodo, kad kiaulė yra puikus biomedicininis modelis aiškinantis tokias sveikatos problemas kaip vėţys, širdies ir kraujagyslių ligos, bei infekcinės ligos. Po kiaulių genomo sekvenavimo taip pat buvo išskirti svarbūs kiaulių genai, lemiantys kokybinius ir kiekybinius poţymius.
1.2. Kiaulių genai veikiantys penėjimosi, mėsos kokybės, bei reprodukcines
savybes
Halotano (streso) genas (HAL). Vieta – šešta kiaulių chromosoma (SSC6). HAL genas atsakingas uţ kiaulių mėsos kokybinius ir kiekybinius rodiklius, dienos prieaugį. Šis genas dar vadinamas streso genu, nes recesyvinę šio geno formą (nn) turinčios kiaulės yra linkusios patirti stresą ir tai sukelia PSE sindromą (angl., pale, soft, exudative), dėl kurio suprastėja mėsos kokybė. Nors raumeningumo procentas padidėja, tačiau mėsa būna rūgštesnė, mėsos spalva šviesesnė, mėsoje kaupiasi daugiau skysčio (eksudacinė mėsa), kas lemia suprastėjusią mėsos ekonominę vertę ir prekinę išvaizdą. Pokyčius mėsoje sukelia dėl streso pakitęs (paspartėjęs) glikogeno skilimo į pieno rūgštį greitis (pH gali kristi iki 5,5) (5). HAL geną neturinčių kiaulių ir geną turinčių kiaulių prieugis vienodas, tačiau kiaulių neturinčių recesyvinės geno formos pašarų suvartojimas maţesnis, geresnė pašaro konversija į svorį. Vienas populiariausių tyrimo metodų – PGR metodas, nes galima nustatyti tiek recesyvinį geną turinčias kiaules (nn), tiek nešiotojas (Nn), tiek stresams atsparesnes kiaules (NN), kas ekonomiškai svarbu veisiant mėsines kiaules. Taip pat šis metodas yra geras tuo, kad genotipą galima nustatyti bet kokio amţiaus kiaulėms (5).
(stimuliatorius). GHRH (augimo hormoną atpalaiduojantis hormonas somatoliberinas) dalyvauja augimo metabolizmo procesuose ir įtakoja skerdenos kokybę (riebalų storį), VDP (vidutinį dienos prieaugį), todėl gali būti laikomas ekonomiškai svarbiu rodikliu veisiant kiaules mėsos produkcijai. GHRH taip pat yra patikimas ţymuo dėl kiaulienos išeigos procentais (P < 0,01), tačiau šiek tiek svyruoja priklausomai nuo veislės. GHRH polimorfizmo asociacijų patikimumas dėl vidutinio paros prieaugio (P = 0,0001), riebalų storio (P = 0,0004) (6).
Insulino augimo faktoriaus (IgF2) genas. Vieta – antroji kiaulių chromosoma (SSC2). Į insuliną panašus augimo faktorius vaisiaus laikotarpiu įtakoja: ląstelių dauginimąsi ir diferenciaciją, jauniklių raumenų augimą. IgF2 gali būti laikomas svarbiu ţymeniu dėl įtakos ekonomiškai naudingoms kiaulių mėsinėms savybėms (7). Burgos ir bendraautorių (8) atliktame tyrime kiaulės, turinčios G alelį, turėjo didesnį lašinių kiekį nugaros ir pilvo srityse. Kiaulės neturinčios G alelio turėjo didesnį raumeninio audinio kiekį nugaros srityje, kumpiuose ir 0.19 vieneto maţesnį pašaro konversijos indeksą. Skirtumų nebuvo rasta nei skirtingose kiaulių veislėse, nei skirtingose kiaulių grupėse. Kiaulių turinčių G alelį kumpiai buvo turtingesni tiek poodiniu riebaliniu audiniu (G - 23,1 mm; A - 19,1 mm) ir raumenyse esančiu riebalų kiekiu. IGF2 G alelis turi stiprų adipogeninį poveikį, todėl kiaulės turinčios šį geną turėjo storesnį poodinio riebalinio audinio sluoksnį. Kiaulių turinčių IGF2 G alelį turėjo daugiau tarpraumeninio riebalinio audinio kumpiuose (8).
Kalpastatino baltymo genas (CAST). Vieta – antroji kiaulių chromosoma (SSC2). Tarp pagrindinių veiksnių, darančių įtaką mėsos minkštumui yra proteolizė, kuri yra priklausoma nuo kalcio cisteino proteazės (l-kalpino). Kalcio cisteino proteazė (1-kalpinas) yra reguliuojama kalpastatino baltymo geno (CAST), kuris yra kalpino inhibitorius (9). Kalpastatino baltymo genas turi įtakos raumenų sintezei: ląstelių dauginimuisi ir proliferacijai. Remdamasi šiomis funkcijomis ir vieta, kalpastatino (CAST) genas yra laikomas geru kandidatu selekcijai mėsinėms savybėms. Ciobanu ir bendraautorių (10) atliktame tyrime su CAST genu buvo analizuojama jo įtaka mėsos kokybės bruoţams. Rezultatai parodė, kad vienas lietinio haplotipas buvo reikšmingai susijęs su mėsos virimo nuostolių ir mėsos sultingumu (gebėjimu sulaikyti vandenį), todėl šis genas gali būti vienas iš mėsos kokybės rodiklių (10).
baltymas, fiziologinių ir endokrininių mechanizmų pagalba, gali įtakoti organizmo augimą ir audinių struktūrą. Todėl, leptino gene aptinkami polimorfizmai yra potencialūs genetiniai markeriai nusakantys tokius poţymius kaip augimo greitis ir pašaro suvartojimas (13).
Melanokortino 4 receptoriaus genas (MC4R). Vieta – pirmoji kiaulių chromosoma (SSC1). Polimorfizmas šiame gene gali būti susietas su augimu ir nutukimu. MR4R dalyvauja medţiagų apykaitos procesuose, energijos balanso reguliavime. Lemia riebalų atsidėjimą, augimo greitį ir maisto medţiagų pasisavinimą. Veikia ekonomiškai naudingas mėsines savybes: raumeningumo procentą, dienos prieaugį ir nugaros lašinių storį (14). MC4R genas gali būti naudojamas kaip svarbus ţymuo mėsos kokybės rodikliams. Taip pat buvo atlikti tyrimai su Lietuvos baltosiomis kiaulėmis, kur šis genas taip pat parodė įtaką mėsos kokybei, bei kiaulių augimo spartai (15).
Miogeninis genas (MYOG). MYOG genas turi įtakos raumeninių ląstelių diferenciacijai. Šio geno polimorfizmas yra susijęs su raumeninio audinio miofibrilių ir mioblastų kiekiais (6). MYOG genas yra MyoD genų šeimos narys (myogeninas, MyoD1, myf-5, ir myf-6), kurie veikia miogenezę, sintezuoja skeleto raumenų miofibrilinius baltymus ir reguliuoja miofibrilių skaičių (6). Taip pat veikia visų fazių mioblastus iki proliferacijos. Taigi MYOG yra glaudţiai susijęs su raumenų skaidulų skaičiumi, kuris yra svarbus nustatant maksimalias kiaulių liesos mėsos augimo galimybes. Yra ţinoma, kad mioblastų ir miofibrilių skaičius turi įtakos raumenų vystymuisi ir augimui (6).
Miostatino genas (MSTN). Miostatinas (MSTN) yra transformuojančio augimo faktoriaus β superšeimos narys, atsakingos uţ raumenų augimą, vystymąsį ir raumenų masę. MSTN baltymas funkcionuoja kaip neigiamas reguliatorius raumenų augime ir yra susijęs su taip vadinamo dvigubo - raumens fenotipu galvijuose. Belgijoje Pjietrėnų veislės kiaulėse, taip pat įtakoja raumeningą fenotipą. Dėl raumeningų fenotipų tiek galvijuose ir kiaulėse rodo, kad MSTN gali būti geras kandidatas įtakojantis raumenų hipertrofija kiaulėse (16). Tyrimas parodė, kad mutacija MSTN gene buvo susijusi su nugaros raumenų dydţiu vyresnių kaip 4 mėnesių kiaulių (16).
stimuliuojančio hormono beta (TTH-beta) genų reguliacijai. Vištienos PIT1 genas yra laikomas vienu svarbiausių kandidatų vištų mėsinėms savybėms. Tyrime buvo nustatytas PIT1 geno įtaka viščiukų augimui, skerdenos ir riebalų kokybei (18).
Troponinas I tipo 2 genas (TNNI2). Xu su kolegomis (19) aprašo, kad raumenų pluošto sudėtis turi didelę įtaką, kiaulių skerdenos ir mėsos kokybei. TNNI2 priklauso TNI kompleksui, kuris randamas ant skersaruoţių raumenų ir dalyvauja ATPazės slopinime. TNI komplekso baltymai (iskaitant TNNI2) dalyvauja širdies bei skeleto raumenų miofibrilinių susitraukime salygotame kalcio jonais (19). TNNI1 atsakingas uţ lėtą raumenų skaidulų susitraukimą, o TNNI2 atsakingas uţ greitą raumenų skaidulų susitraukimą, todėl skirtinga šių genų išraiška gali turėti įtakos raumenų skaiduloms, o tai reiškia, kad šie genai gali turėti įtakos mėsos kokybei (20).
Fosfatido fosfatazė LPIN1 (lipinas 1). He su grupe tyrėjų (21) teigia, kad Lpin1 trūkumas sutrukdo normalų riebalinio audinio vystymąsi ir smarkiai sumaţina riebalinio audinio kiekį, padidėjusi Lpin1 geno išraiška tiek skeleto raumenyse tiek riebaliniame audinyje skatina nutukimą pelėse. Kiaulėse LPIN1 atsakingas uţ riebalų atsidėjimą: Lpin1 genas susijęs su taukų ir tarpraumeniniu riebalų kiekiu. LPIN1 veikia riebalinio audinio vystymąsi ir riebalų metabolizmą (21).
Sarkoendoplazminio tinklo Ca2+ -ATP-azė 1 (SERCA1) genas – SERCA1 dalyvauja skeleto raumenų atsipalaidavime valdydamas Ca2+ judėjimą iš citozolio į sarkoplazminį tinklą (22).
Pakitusi SERCA1 geno išraiška potencialiai gali sutrikdyti normalų Ca2+
1.3. Transformuojančio augimo faktoriaus beta I tipo receptorių koduojančio
(TGFBR1) geno polimorfizmas
Kiaulių genome buvo identifikuota daugiau nei 6300 kiaulių kiekybinių poţymių lokusų (QTLs), atstovaujančių 593 skirtingus bruoţus. 1391 (21.93 proc.) QTLs aptikta kiaulių pirmojoje chromosomoje (SSC1) (23). Tiriamasis kiaulių transformuojančio augimo faktoriaus beta tipo 1 receptoriaus (TGFBR1) genas taip pat buvo atrastas SSC1, tarp mikrosatelitinių ţymenų SW803 (94,3 cM) ir SW705 (122,6 cM) (23). Genas sudarytas iš 9 egzonus apimančio transkripcijos vieneto (62 kb) (24).
TGFB receptoriai dalyvauja ląstelių augimo ir diferenciacijos procesuose (25). TGFBR1 genas koduoja baltymą, kuris atlieka receptoriaus funkciją ir yra randamas ląstelių membranose. Šis receptorius perduoda signalus iš ląstelės paviršiaus į ląstelę transdukcijos būdu. Perduodamas signalas atsakingas uţ ląstelės augimo stimuliaciją ir dauginimąsi. Baltymas ląstelės membranoje įsitvirtinęs taip, kad vienas galas randamas išoriniame membranos paviršiuje (ekstraląstelinis domenas), o kitas galas lieka ląstelės viduje (intraląstelinis domenas). Prie šio TGFBR1 baltymo ekstraląstelinio domeno rišasi kitas baltymas - TGF-β, kuris įjungia (aktyvuoja) receptorių ir leidţia jam jungtis su receptorių atitinkančiu baltymu. Šie trys baltymai sudaro kompleksą, kuris suaktyvina kitus signalo kelyje esančius baltymus.
Signalai, sukelti susidariusio TGFBR1 receptoriaus baltymų komplekso, įtakoja šiuos ląstelių atsakus: augimą ir dalijimasi (proliferaciją), ląstelių brendimą (diferencijaciją), ląstelių judėjimą, kontroliuojąmą ląstelių mirtį (apoptozę). Kadangi TGFB 1 tipo receptorius atsakingas uţ proliferaciją t.y. saugo ląsteles nuo per greito arba nekontroliuojamo dalijimosi, jis taip pat slopina navikų susidarymą.
Mutacijos TGFBR1 ir TGFBR2 genuose susiję su paveldimų sutrikimų vystymusi: širdies ir kraujagyslių, kaukolės, veido, neurokognityvinio aparato ir skeleto, ţmogaus organizme (26). Kiaulių TGFBR1 genas buvo susietas su augimo sparta, mėsos kokybe, taukų kiekiu, riebalų sudėtimi, riebumo procentu, raumenų spalva, raumeningumu ir skerdenos sudėtimi (27-33). TGFBR1 taip pat susijęs su reprodukcinėmis savybėmis, kaip: spenių skaičiumi ir brendimo amţiumi (34-36), ovuliacija (37, 38). Taip pat elgesiu (39) ir imuninės sistemos parametrais (40).
Chen ir kitų bendraautorių (2) atlikta TGFBR1 asociacinė analizė su augimo ir mėsinėms savybėms naudojant šias tris SNP (SNP3, SNP43, SNP64) didelėje komercinėje 1008 gyvūnų populiacijoje, parodė, kad TGFBR1 geno polimorfizmas (SNP64) yra reikšmingai susijęs (P < 0,05) su augimo tempu, įskaitant vidutinį dienos prieugį tarp gimimo ir 56 kg (P = 0,049), tarp 5,5kg ir 56 kg (P = 0,024), tarp 35kg ir 56 kg (P = 0,021). Paršavedės, turinčios genotipą SNP64_AG vaikingumas truko ilgiau 1,93 dienomis (P = 0,0008), nei su genotipu SNP64_AA. Taip pat buvo nustatyta svarbi priklausomybė tarp TGFBR1 SNP3 / SNP43 ir mėsinių savybių, įskaitant nugaros raumens skersmenį (P = 0,022), nugaros riebalų storio (P = 0,0009), raumenų kiekio procentinės išraiškos (P = 0,0023) ir raumenų spalvos (P = 0,021) (2).
Atsiţvelgiant į TGFBR1 geno fiziologinę funkciją augimo ir vystymosi etapuose (42), taip pat savo pozicija kiekybinių poţymių lokusais (QTLs) turtingame SSC1 chromosomos regione, kiaulių TGFBR1 genas gali būti geras kandidatas mėsos kokybės ir penėjimosi savybėms vertinti (2).
1.4. Peroksisomų proliferatoriaus aktyvuojančio receptoriaus - gama
koaktyvatoriaus - 1 (PPARGC1A) koduojančio geno polimorfizmas
Vienas turtingiausių kiekybiniais poţymių lokusais (QTLs), atsakingais uţ augimą bei kūno sudėjimą, regionas yra kiaulių 8 chromosomoje (SSSC8), tarp Sw905 ir Sw933 ţymenų. Šiame regione taip pat lokalizuotas ir peroksisomų proliferatoriaus aktyvuoto gama receptoriaus koaktyvatoriaus 1 alfa (PPARGC1A) genas. PPARGC1A yra branduolio hormonų receptorių transkripcinis koaktyvatorius. Jam pavaldus ir peroksisomų proliferatorius aktyvuojantis receptorių gama, kuris yra atsakingas uţ lipidų metabolizmą ir vaidina svarbų reguliacinį vaidmenį riebalų lastelių (adipocitų) diferenciacijoje (43).
Peroksisomų proliferatoriaus aktyvuoto gama receptoriaus koaktyvatorius 1 alfa (PPARGC1A) yra transkripcijos aktyvatorius ir viena jo pagrindinių funkcijų yra susijusi su riebalų ir energijos metabolizmu. Šis genas turi įtakos prisitaikymo termogenezei ir yra pagrindinis adipogenezės, adipocitų diferenciacijos ir mitochondrijų biogenezės reguliatorius. Šis genas taip pat atsakingas uţ angiogenezės procesą, jis turi įtakos branduolio hormonų receptoriams ir kitiems transkripcijos faktoriams ir yra gausiausiai išreikštas audiniuose su dideliu energijos poreikiu (43). PPARGC1A turi didelę įtaką kūno riebalų kiekio reguliavimui ir jų susidarymui, jis taip pat turi įtakos raumenų skaidulų sudėčiai.
mėsos kokybines savybes. Naujausiuose tyrimuose daug dėmesio skiriama genams, lemiantiems mėsos kokybę ir kitus ekonomiškai svarbius rodiklius kaip penėjimosi savybes. PPARGC1A genas gali būti tinkamu kandidatu naujiems tyrimams kiaulių selekcijoje ir dėl to, kad PPARGC1A genas turi įtakos kito geno - GLUT4 veiklai, kuris atsakingas uţ kiaulių mėsines savybes, kaip nugaros lašinių storį (43).
Jacobs su kitais mokslininkais (3) atliktoje polimorfizmo analizėje ir PPARGC1A geno ţemėlapio sudaryme buvo aprašytas T/A pokytis 1378 nukleotidų pozicijoje sukeliantis amino rūgščių pokytį ( iš Cys į Ser) 430 pozicijoje. Cys/Ser pokyčiai galėtų turėti didelį poveikį disulfidiniams ryšiams, kurie veikia audinių struktūrą (3).
Riebalinio audinio augimas yra reguliuojamas transkripcijos faktorių, kurie taip pat įeina į adaptacinės termogenezės ir mitochondrijų biogenezės procesus. Vienas iš faktorių yra PPARGC1A geno baltymas, kuris yra branduolinio receptoriaus PPARγ transkripcijos koaktyvatorius. Tai svarbus faktorius adipocitų diferenciacijos procese ir raumenų skaidulų tipo formavimęsi. PPARGC1A stimuliuoja mitochondrijų biogenezę ir raumeninių ląstelių kvėpavimą. Skatina genų, susijusių su organizmo temperatūros ir mitybos pokyčiais adaptaciją, aktyvumą, adipogenezės reguliacijos mechanizmą (44).
2. TYRIMŲ MEDŢIAGA IR METODAI
2.1. Tyrimų medţiaga
Baigiamasis darbas atliktas 2013 – 2016 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute. Molekuliniai tyrimai atlikti LSMU K. Janušausko genetikos laboratorijoje. Visi tyrimai buvo atlikti laikantis Nacionalinių ir Europos Sąjungos teisės aktų reikalavimų: Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Ţin., 1997, Nr.108-2728); Europos Ekonominės Bendrijos Stuburinių gyvūnų, naudojamų eksperimentiniams ir kitiems mokslo tikslams, apsaugos direktyvos ir Stuburinių gyvūnų, naudojamų eksperimentams ir kitiems mokslo tikslams, apsaugos Europos tarybos Konvencija.
2 lentelė. Tyrimų medžiaga.
Gyvulio veislė Mėginių skaičius Biologinio mėginio
rūšis Šaltinis Jorkšyrai 40 šeriai Valstybinė kiaulių kontrolinio penėjimo stotis Didţiosios Baltosios x Danijos Landrasai (mišrūnai) 39 DNR mėginiai DNR bankas
2.2. Tyrimų medţiaga molekuliniams tyrimams
Penėjimosi ir mėsinių savybių duomenys iš Valstybinės kiaulių kontrolinio penėjimo stoties, Kauno skyriaus:
Penėjimosi savybės:
1. priesvoris per parą, g.;
2. pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio;
3. amţius dienomis, kai gyvuliai pasiekia 100 kg masę; 4. priesvoris per parą, g.;skerdimo amţius, d.;
5. skerdimo svoris, kg.
Mėsinės savybės:
1. šiltos skerdienos masė, kg; 2. skerdienos puselės ilgis, cm; 3. bekono puselės ilgis, cm; 4. nugaros raumens plotas, cm²; 5. kumpio masė, kg;
6. lašinių storis taške Fat1, mm;
7. lašinių storis taške Fat2,mm;
8. raumeningumas, proc.
2.3. DNR ekstrakcija Chelex dervų pagalba
2.4. DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
Genominės DNR koncentracija ir švarumas nustatomas spektrofotometriniu metodu. Paruošiamas l00 μl DNR mišinys (l0 μl koncentruotos DNR ir 90 μl distiliuoto vandens). DNR kiekis nustatomas išmatuojant DNR mišinio tirpalo optinį tankį (OD) prie 260 nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai l ml tirpalo yra 50 ug dvigrandės DNR. DNR kokybė įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260 / OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8 - 2. Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis būna maţesnis. Baltymų koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų daugiau, atliekamas genominės DNR valymas.
2.5. Kiaulių peroksisomų proliferatoriaus aktyvuojančio receptoriaus gama
koaktyvatorius 1 (PPARGC1A) geno tyrimas PGR – RFIP metodu
Polimerazės grandinės reakcija – PGR-RFIP PPARGC1A geno tyrimui (45). PPARGC1A geno pradmenys:
PPARGC1A F 5‘-TAAAGATGCCGCCTCTGACT-3‘
PPARGC1A R 5‘-CTGCTTCGTCGTCAAAAACA-3‘
3 lentelė. PGR komponentai kiaulių PPARGC1A geno tyrimui. Eil.
Nr. PGR mišinio komponentai Kiekis 1 mėginiui(μl)
1 Geros kokybės dejonizuotas vanduo (ddH2O) 6.5
PGR buvo atlikta naudojant 50 ng DNR ir 15 l reakcijos mišinio. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje tokiu reţimu:
PPARGC1A PGR programa:
950C 5 min (pirminė denatūracija) 30 ciklų: 950C 45 s (denatūracija) 590C 45 s (oligonukloetidų prisijungimas) 720C 45 s (DNR grandinės sintezė) 720C 7min. Laikyti 40 C.
PGR produkto karpymas fermentais: PGR produktų karpymas atliekamas naudojant 2U AluI restriktazės fermento. Reakcija atliekama 12 valandų 37 °C temperatūroje.
Elektroforezė agarozės gelyje: restriktazės fermentu sukarpytas PGR produktas elektroforezės būdu frakcionuojamas 2 proc. agarozės gelyje. Gelis daţomas etidţio bromidu (0,5 μl) 15 − 20 min. ir analizuojamas UV šviesoje.
2.6.
Kiaulių transformuojančio augimo faktoriaus beta I tipo receptoriaus
(TGFBR1) geno tyrimas PGR – RFIP metodu
Polimerazės grandinės reakcija – PGR-RFIP(2). TGFBR1 geno pradmenys:
TGFBR1 SNP64 P2 F 5’-GCT-TGG-GAG-CAG-ACT-TGT-ATT-3’
TGFBR1 SNP64 P2 R 5’-TCA-TTC-CAT-TAC-TGC-CAC-ACA-3’
5 lentelė. TGFBR1 mišinys polimerazės grandinės reakcijai. Eil.
Nr. PGR mišinio komponentai Kiekis 1 mėginiui(μl)
1 Geros kokybės dejonizuotas vanduo (ddH2O) 3.45
2 Buferinis tirpalas 10xPCR (be MgCl2) 2.50
3 MgCl2 2.00 4 dNTP 2.50 5 Pirminis pradmuo 2.00 6 Antrinis pradmuo 2.00 7 BSA 0.25 8 Taq polimerazė 0.30 - Viso: 15.00
PGR atlikta sumaišius 10 l DNR mišinio ir 15 l PGR reakcijos mišinio. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje.
TGFBR1 PGR programa:
PGR atlikta naudojant 10 μl DNR mišinio ir 15 μl PGR mišinio. 94°C 5 min (pirminė denatūracija)
39 ciklai:
94°C 45 s (denatūracija)
PGR produkto karpymas fermentais: PGR produktai karpomi restrikcijos karpymo fermentu Hinfl, 12 valandų 37°C.
6 lentelė. Mišinio komponentai PGR produkto karpymui. Eil.
Nr.
PGR produkto karpymo mišinio
komponentai Kiekis 1 mėginiui(μl)
1 Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O 7.5
2 Buferinis tirpalas R 2.0
3 Hinfl 0.5
- Viso: 10.0
Elektroforezė agarozės gelyje: Karpytas PGR produktas (po 10 μl į agaro šulinėlį) elektroforezės būdu frakcionuotas 2,5 proc. TAE agarozės gelyje 40 min. Gelis daţytas etidţio bromidu ir analizuojamas UV šviesoje.
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1. PPARGC1A geno polimorfizmo tyrimai
PPARGC1A geno polimorfizmo asociacijos su penėjimosi ir mėsinėmis savybėmis tirtos 40 Jorkšyrų veislės kiaulių grupėje. Siekiant eliminuoti kitų veiksnių įtaką ūkinėms savybėms individai tyrimui buvo atrinkti vienos veislės, vieno amţiaus, laikomi ir šeriami vienodomis sąlygomis.
8 lentelė. PPARGC1A geno alelių dažniai tirtoje kiaulių grupėje.
A alelio daţnis T alelio daţnis
0.45 0.55
Tirtoje kiaulių grupėje (ţr. 8 lentelę) identifikuoti du PPARGC1A geno aleliai – A ir T. T alelis aptiktas daţniau 55 proc., A rečiau 45 proc.
9 lentelė. PPARGC1A geno genotipų dažniai tirtoje kiaulių grupėje.
AA genotipo daţnis AT genotipo daţnis TT genotipo daţnis
0.35 0.20 0.45
Tirtoje kiaulių grupėje identifikuoti trys PPARGC1A geno genotipai (ţr. 9 lentelę). Homozigotinį TT genotipą turėjo 45 proc. tirtų individų, homozigotinį AA - 35 proc. ir rečiausiai aptiktas heterozigotinis AT genotipas, jį turėjo tik 20 proc. tirtų kiaulių.
10 lentelė. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas PPARGC1A geno lokuse.
Heterozigotiškumas X2
Faktinis heterozigotiškumas 0,200
Teorinis heterozigotiškumas 0,495
Įvertinus faktinį ir teorinį heterozigotiškumą tirtoje gyvulių grupėje (ţr. 10 lentelę), faktinis heterozigotiškumas buvo maţesnis, nei teorinis. Tai rodo nepakankamą genetinės įvairovės kiekį tirtame lokuse. Buvo aptiktas statistiškai patikimas nuokrypis nuo Hardţio – Weinbergo pusiausvyros dėsnio. Gauti rezultatai gali reikšti, kad buvo vykdoma kryptinga selekcija homozigotinių individų atrankos ir tolimesnio veisimo kryptimi.
3.2. PPARGC1A geno poveikis kiaulių penėjimosi ir mėsinėms savybėms
Buvo ištirta asociacijos tarp PPARGC1A geno AA, AT ir TT genotipo ir kiaulių mėsinių savybių: šiltos skerdenos masės, skerdenos puselės ilgio, bekono puselės ilgio, nugaros raumens ploto, kumpio masės, lašinių storio, raumeningumo.
11 lentelė. PPARGC1A geno polimorfizmo įtaka kiaulių mėsinėms savybėms-1 (vidurkis ± standartinė paklaida). Statistiškai patikimai tarpusavyje besiskiriančių vidurkių nenustatyta.
Genotipas n Šiltos skerdenos masė, kg Skerdenos pusėlės ilgis, cm Bekono puselės ilgis, cm Nugaros raumens plotas, cm2 Kumpio masė, kg AA 14 74.56±0.27 95.99±0.71 70.35±3.66 41.29±1.48 12.12±0.14 AT 8 74.14±0.39 95.20±1.09 76.63±1.07 42.38±2.09 12.18±0.15 TT 18 74.29±0.27 95.96±0.60 70.68±2.49 40.31±1.32 12.04±0.10
12 lentelė. PPARGC1A geno polimorfizmo įtaka kiaulių mėsinėms savybėms-2 (vidurkis ± standartinė paklaida). Statistiškai patikimai tarpusavyje besiskiriančių vidurkių nenustatyta.
Genotipas n Lašinių storis, mm; 1 Lašinių storis, mm; 2 Raumeningumas, proc. AA 14 13.44±0.51 12.01±0.46 58.51±0.46 AT 8 13.00±0.46 11.63±0.68 59.04±0.64 TT 18 12.98±0.71 11.92±0.66 58.74±0.54
AA genotipo kiaulės (ţr. 12 lentelę) turėjo didţiausią lašinių storį lašinių taške 1 (13,44 mm) ir 2 (12,01 mm), lyginant su AT genotipo kiaulėmis – taške 1 (13,00 mm), taške 2 (11,63 mm) ir TT genotipo kiaulėmis – taške 1 (12,98 mm), taške 2 (11,92 mm), bei maţiausią raumeningumą procentais (58,51 proc.). Raumeningiausios buvo AT genotipo kiaulės (59,04 proc.).
Buvo ištirta asociacijos tarp PPARGC1A geno AA, AT ir TT genotipo ir kiaulių penėjimosi savybių - priesvorio per parą, pašarų sąnaudų 1 kg priesvorio, skerdimo amţiaus, skerdimo svorio (ţr. 13 lentelę).
Remiantis tirtais duomenimis (ţr. 13 lentelę) galime pastebėti, maţiausiai pašarų sunaudoja 1 kg svorio priaugti AA genotipo kiaulės (2,24 kg), daugiausiai TT (2,43 kg). Taip pat AA genotipo kiaulės vidutiniškai per parą priaugo daugiausiai (818,62 g). Tiriant kiaulių penėjimosi savybes buvo nustatyta, kad kiaulės turinčios AA genotipą vienam kilogramui svorio priaugti sunaudodavo 0,19 kg maţiau, pašarų negu TT genotipą turinčios kiaulės (P < 0,05). Taip pat AT genotipo kiaulės sunaudojo 0,14 kg maţiau pašaro 1 kg kūno svorio priaugti, negu TT genotipo kiaulės (P < 0,05).
3.3. TGFBR1 geno polimorfizmo tyrimai
TGFBR1 geno polimorfizmo asociacijos su mėsinėmis, penėjimosi ir reprodukcinėmis savybėmis planuotos tirti 40 Jorkšyrų veislės kiaulių grupėje. Siekiant eliminuoti kitų veiksnių įtaką ūkinėms savybėms individai tyrimui buvo atrinkti vienos veislės, vieno amţiaus, laikomos ir šeriamos vienodomis sąlygomis. Jorkšyrų veislėje radus tik vieną TGFBR1 geno alelį t.y. A alelį pas visus tirtus individus (AA genotipas), tyrimas buvo praplėstas Didţiųjų Baltujų x Danijos Landrasų mišrūnų kiaulių grupėje. DNR kiaulių mėginiai buvo atrinkti iš DNR banko (39 mėginiai). Papildomai buvo ištirti 39 mėginiai, tačiau taip pat identifikuotas tik TGFBR1 geno A alelis ir AA genotipas pas visus tirtus individus, todėl ištirti asociacijas tarp TGFBR1 geno polimorfizmo ir ūkinių savybių nebuvo galima.
14 lentelė. TGFBR1 geno alelių dažniai tirtoje kiaulių grupėje.
A alelio daţnis G alelio daţnis
1 (100 proc.) 0 (0 proc.)
Atlikus tyrimus buvo nustatyta: A alelio daţnis – 1, G alelio daţnis – 0 (ţr. 14 lentelę).
15 lentelė. TGFBR1 geno genotipų dažniai tirtoje kiaulių grupėje.
AA genotipo daţnis AG genotipo daţnis GG genotipo daţnis
1 (100 proc.) 0 (0 proc.) 0 (0 proc.)
4. REZULTATŲ APTARIMAS
PPARGC1A yra transkripcijos aktyvatorius, kuris reguliuoja genus, susijusius su energijos metabolizmu. Jis turi įtakos termogenezei, mitochondrijų biogenezei, adipogenezei ir raumenų skaidulų konversijai. PPARGC1A geno lokalizacija, funkcijų ir genetinė įvairovė daro jį geru kandidatu, atsakingu uţ kiaulių mėsines savybes ir skerdienos kokybę. anksčiau atlikti PPARGC1A kiaulių geno tyrimai, tiriantys jo rolę adipocitų diferenciacijoje ir jo įtaką riebalų atsidėjimui bei pasiskirstymą kiaulės organizme. Šis genas taip pat atlieka svarbią reikšmę kaip transkripcijos koaktyvatorius ir metabolizmo aktyvatorius (46).
Riebalinio audinio augimas yra kiekybinis bruoţas, reguliuojamas transkripcijos faktorių, įeinantis į adaptacinės termogenezės procesą ir mitochondrijų biosintezę. Vienas iš faktorių yra PPARGC1A geno baltymas, kuris yra branduolinio receptoriaus - PPARγ transkripcijos koaktyvatorius. Tai svarbus faktorius adipocitų diferenciacijos procese ir raumenų skaidulų tipų nustatyme. PPARGC1A stimuliuoja mitochondrijų biogenezę ir raumenų ląstelių kvėpavimą. Skatina genų, susijusių su organizmo temperatūros ir mitybos pokyčiais adaptacija, aktyvumą, adipogenezės reguliacijos mechanizmą. (44).
PPARGC1A genas atlieka daug funkcijų, kurios skiriasi, priklausomai nuo audinio, kuriame šis genas veikia. Buvo nustatytos kiaulų mRNR variacijos ne tik audiniuose, bet ir įvairiose ilgojo nugaros raumens lokalizacijose. Kol kas nedaug ţinoma apie šį multifunkcinį kiaulių geną ir galimus jo pritaikymus selekciniams ţymenims kiaulininkystėje, todėl reikalingi tolimesni tyrimai (43).
Mūsų tyrimų duomenimis, A alelio daţnis Jorkšyrų veislėje buvo - 0,45, T alelio daţnis buvo - 0,55, AA genotipą turėjo 35 procentai individų, AT - 20 procentų, TT - 45 procentai (ţr. 8, 9 lenteles).
Flisar su bendraautoriais (44) rado ryškų Cys430Ser polimorfizmo poveikį penėjimosi savybėms. Slovėnų landrasų kiaulių veislės populiacijoje storiausias lašinių storis buvo homozigotinių AA ir ploniausias homozigotinių TT, tačiau Didţiųjų baltųjų kiaulių veislėje šis ryšys buvo atvirkštinis. Polasik ir ir kt. (48) tyrime nustatyta, kad storiausi lašiniai buvo kiaulių su TT genotipu, bet skirtumas statistiškai nepatvirtintas. Kitas tyrimas parodė ryšio trūkumą tarp PPARGC1A geno polimorfizmo ir tarpraumeninių riebalų kiekio bei nugaros lašinių storio Landrasų, Diurokų ir Jorkšyrų veislės kiaulėse (43, 48). Kiti tyrimais įrodė, kad Cys430Ser susijęs su tarpraumeninių riebalų kiekiu (P ≤ 0,01), raumenų skaidulų plotu ir perimetru Tibeto veislės kiaulėse. Gyvūnai, turintys TT genotipą charakterizuojami kaip turintys daugiau tarpraumeninių riebalų (4,305), palyginus su AA (2,070) ir AT (2,816) genotipus turinčiais individais (49). Tai nebuvo vienintelis tyrimas, kuriame buvo analizuojamos raumenų skaidulų savybės. Kim su kolegomis (50) detaliau tyrė šias savybes, taip pat ir mėsos kokybę Jorkšyrų kiaulių veislėje ir atrado, kad Cys430Ser genotipas turėjo ţymios reikšmės I tipo raumenų skaidulų skaičiui (P ≤ 0,05) ir plotui (P ≤ 0,01), bei raumenų pH (P ≤ 0,001) ir spalvai (P ≤ 0,01). Naujausi tyrimai parodė, kad PPARGC1A geno polimorfizmas susijęs su pH ir virimo nuostoliu F2 Diurokų x Pietrėnų palikuonių ir su pH reikšmėmis Italijos didţiųjų baltųjų ir Italijos landrasų populiacijomis (P ≤ 0,05) (51).
Mūsų tyrimų duomenimis didţiausią lašinių storį turėjo AA genotipo kiaulės. AT genotipo kiaulių buvo didţiausias nugaros raumens plotas, kumpio masė ir raumeningumas (ţr. 11, 12 lenteles).
Stachowiak ir kiti mokslininkai (52) nustatė ryšį tarp Cys430Ser variacijų ir devynių penėjimosi savybių Lenkijos didţiųjų baltųjų, Lenkijos landrasų veislių ir 990-os kiaulių linijos. Gauti rezultatai parodė, kad PPARGC1A geno T/A polimorfizmo pasikeitimas susijęs su pašarų sąnaudomis 1 kg priesvorio Lenkijos didţiųjų baltųjų kiaulių veislėje (P = 0,02).
Mūsų tyrimo duomenimis taip pat buvo nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys tarp PPARGC1A geno T/A polimorfizmo ir pašarų sąnaudų. AA genotipo kiaulės turėjo maţiausias pašarų sąnaudas 1 kg priesvorio (P ≤ 0,05) (ţr. 13 lentelę).
SNP43_G aleliai dominavo Pietrėnų ir Sinclair kiaulių veislėse, o alelis SNP64_G buvo aptikta Meishan kiaulių veislėje, alelio daţnumas 0,27. Alelio daţnis SNP3_T = SNP43_G trijose miniatiūrinių veislių kiaulių svyravo nuo 0,17 Ossabaw veislėje iki 0,75 Yuctan ir 1 Sinclair veislėse. Tikėtina, kad trys miniatiūrinių kiaulių veislės turi skirtingą genetinę kilmę, dėl šio geno didelio alelių daţnių skirtumo tarp jų. Vidutinis TGFBR1 geno alelių daţnis SNP3_C = SNP43_A 7 vakarų veislių kiaulėse (Diurokų, Hempshirų, Hanfordo, Landrasų, didţiųjų baltųjų, Pietrėnų ir Jorkšyro) buvo 0,39, ir vidutiniškai 0,36 trijose miniatiūrinių kiaulių veislėse. Priešingai, daţnis buvo 0,92 Kinijoje kilusių Meishan kiaulių (2).
Mūsų TGFBR1 geno tyrime SNP64 buvo monomorfiškas - visose tirtose veislėse parodė tik A alelio buvimą ir AA genotipą (ţr. 14, 15 lenteles).
Tyrimai atlikti Amerikoje su komercinių veislių kiaulių populiacija atskleidė didelę TGFBR1 geno įtaką kiaulių mėsinėms ir reprodukcinėms savybėms. SNP3_TT genotipo gyvūnai turėjo didesnį nugaros plačiojo raumens plotą 2,13 cm2 (P < 0,022) nei gyvūnų turinčių SNP3_CC genotipą. Gyvūnai turintys SNP3_TT genotipą turi storesnį nugaros riebalų sluoksnį 1,39 mm (P < 0,0009), maţesnį raumeningumo procentą (P < 0,0023). Ryški įtaka taip pat buvo pastebėta tarp SNP3 ir riebalų kiekio (P < 0,075), tarpraumeninių riebalų kiekio (P < 0.087). Nuspręsta, kad su SNP64 dėl mėsinių ir penėjimosi savybių komercinių veislių populiacijoje nebuvo verta tęsti tyrimų, nes visos kiaulės buvo SNP64_AA genotipo (daţnis = 1).
Chen su bendraautoriais (2) gavo panašius kaip ir mūsų tyrimų rezultatus su TGFBR1, kadangi mes taip pat identifikavome tik A alelį ir AA genotipą.
IŠVADOS
1. Atlikus PPARGC1A geno tyrimus Lietuvoje veisiamoms Jorkšyrų veislės kiaulėms buvo identifikuoti trys genotipai: homozigotinį AA genotipą turėjo 35 procentai kiaulių, heterozigotinį AT 20 procentų kiaulių ir homozigotinį TT genotipą 45 procentai kiaulių. A alelis pasireiškė 0.45 daţniu, T alelis - 0.55 daţniu.
2. Vertinant PPARGC1A geno įtaką penėjimosi savybėms nustatyta, kad AA genotipo kiaulės sunaudoja maţiau pašaro 1 kg svorio priaugti, negu TT genotipą turinčios kiaulės (P < 0,05) ir jų didţiausias priesvoris per parą, lyginant su TT ir AT genotipo kiaulėmis.
3. PPARGC1A geno heterozigotinės AT genotipo kiaulės turėjo geresnes mėsines savybes (bekono puselės ilgis, nugaros raumens plotas, kumpio masė, raumeningumas proc.) nei AA ir TT genotipo kiaulės, bet statistiškai reikšmingų asociacijų nenustatyta. Geresnės mėsinės savybės galėjo pasireikšti dėl heterozės efekto, kada poţymiai geriau išreikšti, kai organime yra ir recesyvinis ir dominantinis geno aleliai.
4. Atlikus TGFBR1 geno tyrimus Jorkšyrų ir Didţiųjų Baltujų x Danų Landrasų mišrūnų populiacijoje buvo nustatytas tik vienas genotipas – AA (100 proc.). Alelis A pasireiškė daţniu - 1, alelis G daţniu – 0.
5. Kadangi TGFBR1 genas rastas monomorfiškas tirtoje kiaulių grupėje, tolimesni tyrimai dėl TGFBR1 geno polimorfizmo asociacijos su kiaulių mėsinėmis, penėjimosi ir reprodukcinėmis savybėmis nebuvo vykdomi.
LITERATŪRA
1. Kamiński S, Help H, Brym P, Ruść A, Wójcik E. SNiPORK–A Microarray of SNPs in Candidate Genes Potentially Associated with Pork Yield and Quality–Development and Validation in Commercial Breeds. Animal biotechnology. 2008;19(1):43-69.
2. Chen K, Hawken R, Flickinger GH, Rodriguez-Zas SL, Rund LA, Wheeler MB, Schook LB. Association of the porcine transforming growth factor beta type I receptor (TGFBR1) gene with growth and carcass traits. Animal biotechnology. 2012;23(1):43-63.
3. Jacobs K, Rohrer G, Van Poucke M, Piumi F, Yerle M, Barthenschlager H, Peelman LJ. Porcine PPARGC1A (peroxisome proliferative activated receptor gamma coactivator 1A): coding sequence, genomic organization, polymorphisms and mapping. Cytogenetic and genome research. 2006;112(1-2):106-113.
4. Groenen MA, Archibald AL, Uenishi H, Tuggle CK, Takeuchi Y, Rothschild MF, Li S. Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution. Nature. 2012;491(7424):393-398.
5. Band GDO, Guimarães SEF, Lopes PS, Peixoto JDO, Faria DA, Pires AV, Gomide LADM. Relationship between the Porcine Stress Syndrome gene and carcass and performance traits in F2 pigs resulting from divergent crosses. Genetics and Molecular Biology. 2005;28(1):92-96.
6. Cho ES, Park DH, Kim BW, Jung WY, Kwon EJ, Kim CW. Association of GHRH, H-FABP and MYOG polymorphisms with economic traits in pigs. J. Anim. Sci. 2009;22:307-312.
7. Pierzchała M, Pareek CS, Urbański P, Goluch D, Kamyczek M, Różycki M, Kurył J. Study of the differential transcription in liver of growth hormone receptor (GHR), insulin-like growth factors (IGF1, IGF2) and insulin-like growth factor receptor (IGF1R) genes at different postnatal developmental ages in pig breeds. Molecular biology reports. 2012;39(3):3055-3066.
8. Burgos C, Galve A, Moreno C, Altarriba J, Reina R, García C, López-Buesa P. The effects of two alleles of IGF2 on fat content in pig carcasses and pork. Meat science. 2012;90(2):309-313.
10. Ciobanu DC, Bastiaansen JWM, Lonergan SM, Thomsen H, Dekkers JC, Plastow GS, Rothschild MF. New alleles in calpastatin gene are associated with meat quality traits in pigs. Journal of animal science. 2004;82(10):2829-2839.
11. Chen CC, Chang T, Su HY. Genetic polymorphisms in porcine leptin gene and their association with reproduction and production traits. Crop and Pasture Science. 2004;55(6):699-704.
12. Boucher D, Palin MF, Castonguay F, Gariépy C, Pothier F. Detection of polymorphisms in the ovine leptin (LEP) gene: Association of a single nucleotide polymorphism with muscle growth and meat quality traits. Canadian journal of animal science. 2006;86(1):31-35. 13. de Oliveira Peixoto J, Facioni Guimaraes SE, Savio Lopes P, Soares M, Vieira Pires A,
Barbosa G, De Almeida e Silva M. Associations of leptin gene polymorphisms with production traits in pigs.Journal of Animal Breeding and Genetics. 2006;123(6):378-383. 14. Kim KS, Lee JJ, Shin HY, Choi BH, Lee CK, Kim JJ, Kim TH. Association of melanocortin
4 receptor (MC4R) and high mobility group AT‐hook 1 (HMGA1) polymorphisms with pig growth and fat deposition traits. Animal genetics.2006;37(4):419-421.
15. Jokubka R, Maak S, Kerziene S, Swalve HH. Association of a melanocortin 4 receptor (MC4R) polymorphism with performance traits in Lithuanian White pigs. Journal of Animal breeding and Genetics. 2006;123(1):17-22.
16. Stinckens A, Luyten T, Bijttebier J, Van den Maagdenberg K, Dieltiens D, Janssens S, Buys N. Characterization of the complete porcine MSTN gene and expression levels in pig breeds differing in muscularity. Animal genetics. 2008;39(6):586-596.
17. Silveira AC, Braga TF, Almeida JF, Antunes RC, Freitas PF, Cesar AS, Guimarães EC. PIT1 gene polymorphism in Pietrain and Large White pigs after divergent selection. Genet. Mol. Res. 2009;8:1008-1012.
18. Nie Q, Fang M, Xie L, Zhou M, Liang Z, Luo Z, Zhang X. The PIT1 gene polymorphisms were associated with chicken growth traits. BMC genetics. 2008;9(1):20.
20. Yang H, Xu ZY, Lei MG, Li FE, Deng CY, Xiong YZ, Zuo B. Association of 3 polymorphisms in porcine troponin I genes (TNNI1 andTNNI2) with meat quality traits. Journal of applied genetics. 2010;51(1):51-57.
21. He XP, Xu XW, Zhao SH, Fan B, Yu M, Zhu MJ, Liu B. Investigation of Lpin1 as a candidate gene for fat deposition in pigs.Molecular biology reports. 2009;36(5)1175-1180. 22. Chai J, Xiong Q, Zhang PP, Shang YY, Zheng R, Peng J, Jiang SW. Evidence for a new
allele at the SERCA1 locus affecting pork meat quality in part through the imbalance of Ca2+ homeostasis. Mol. Biol. Rep. 2010;37:613-619.
23. Kopecny M, Stratil A, Van Poucke M, Bartenschlager H, Geldermann H, Peelman LJ. PCR-RFLPs, linkage and RH mapping of the porcine TGFB1 and TGFBR1 genes. Anim Genet 2004;35(3):253–255.
24. Shimanuki S, Mikawa A, Miyake Y, Hamasima N, Mikawa S, Awata T. Structure and polymorphism analysis of transforming growth factor beta receptor 1 (TGFBR1) in pigs. Biochem Genet. 2005;43(9–10):491–500.
25. Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 2003;113(6):685–700.
26. Loeys BL, Chen J, Neptune ER, et al. A syndrome of altered cardiovascular, craniofacial, neurocognitive and skeletal development caused by mutations in TGFBR1 or TGFBR2. Nat Genet. 2005;37(3):275–281.
27. Su YH, Ma MY, Xiong YZ. Genetic location of body composition traits in pigs. Yi Chuan 2004; 26(2):163–166.
28. Nii M, Hayashi T, Mikawa S. Quantitative trait loci mapping for meat quality and muscle fiber traits in a Japanese wild boar x Large White intercross. J Anim Sci 2005;83(2):308– 315.
29. Grindflek E, Moe M, Taubert H, Simianer H, Lien S, Moen T. Genome-wide linkage analysis of inguinal hernia in pigs using affected sib pairs. BMC genetics. 2006;7(1):25. 30. Karlskov-Mortensen P, Bruun CS, Braunschweig MH, et al. Genome-wide identification of
31. Mohrmann M, Roehe R, Knap PW, Looft H, Plastow GS, Kalm E. Quantitative trait loci associated with AutoFOM grading characteristics, carcass cuts and chemical body composition during growth of Sus scrofa. Anim Genet. 2006;37(5):435–443.
32. Wimmers K, Fiedler I, Hardge T, Murani E, Schellander K, Ponsuksili S. QTL for microstructural and biophysical muscle properties and body composition in pigs. BMC Genet. 2006;7(1):15.
33. Sanchez MP, Iannuccelli N, Basso B, Bidanel JP, Billon Y, Gandemer G, Milan D. Identification of QTL with effects on intramuscular fat content and fatty acid composition in a Duroc× Large White cross. BMC genetics. 2007;8(1):55.
34. Yang G, Ren J, Li S. Genome-wide identification of QTL for age at puberty in gilts using a large intercross F2 population between White Duroc x Erhualian. Genet Sel Evol. 2008;40(5):529–539.
35. Guo YM, Lee GJ, Archibald AL, Haley CS. Quantitative trait loci for production traits in pigs: a combined analysis of two Meishan x Large White populations. Anim Genet 2008;39(5):486–495.
36. Ren DR, Ren J, Xing YY. A genome scan for quantitative trait loci affecting male reproductive traits in a White Duroc x Chinese Erhualian resource population. J Anim Sci 2009;87(1):17–23.
37. Li HK, Kuo TY, Yang HS, Chen LR, Li SS, Huang HW. Differential gene expression of bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 during in vitro maturation of porcine oocytes and early embryos. Anim Reprod Sci 2008;103(3–4):312– 322.
38. Paradis F, Novak S, Murdoch GK, Dyck MK, Dixon WT, Foxcroft GR. Temporal regulation of BMP2, BMP6, BMP15, GDF9, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2 and TGFBR1 mRNA expression in the oocyte, granulosa and theca cells of developing preovulatory follicles in the pig. Reproduction. 2009;138(1):115–129.
39. Désautés C, Bidanel JP, Milan D, Iannuccelli N, Amigues Y, Bourgeois F, Mormede P. Genetic linkage mapping of quantitative trait loci for behavioral and neuroendocrine stress response traits in pigs. Journal of Animal Science. 2002;80(9):2276-2285.
41. Hanrahan JP, Gregan SM, Mulsant P. Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovis aries). Biol Reprod. 2004;70(4):900–909.
42. Chen K, Rund LA, Beever JE, Schook LB. Isolation and molecular characterization of the porcine transforming growth factor beta type I receptor (TGFBR1) gene. Gene. 2006; 384:62–72.
43. Erkens T, Bilek K, Van Zeveren A, Peelman LJ. Two new splice variants in porcine PPARGC1A. BMC research notes. 2008;1(1):138.
44. Flisar T, Kunej T, Kovač M, Dovč P. Effect of PPARGC1 gene on backfat thickeness in pigs. Acta agriculturae Slovenica. 2006;88(1):11-18.
45. Kunej T, Wu XL, Berlic TM, Michal JJ, Jiang Z, Dovc P. Frequency distribution of a Cys430Ser polymorphism in peroxisome proliferator‐activated receptor‐gamma coactivator‐1 (PPARGC1) gene sequence in Chinese and Western pig breeds. Journal of Animal Breeding and Genetics. 2005;122(1):7-11.
46. Puigserver P, Spiegelman BM. Peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α (PGC-1α): transcriptional coactivator and metabolic regulator. Endocrine reviews. 2003;24(1):78-90.
47. Margeta V, Frajman P, Kralik G, Dovč P. Determination of PPARGC1 Cys 430Ser polymorphism and MHS genotype in Croatian autochtonous pig breeds. Acta Agraria Kaposváriensis. 2006;10(2):333-339.
48. Polasik D, Głodek A, Rybarczyk A. An analysis of PPARGC1A gene polymorhism in relation to carcass quality in pig hybrid fatteners. Acta Sci. Pol., Zootechnica. 2013;12(4):71–78.
49. Liu Y, Foulkes AS. Latent variable modeling paradigms for genotype-trait association studies. Biometrical Journal. 2011;53(5):838–854.
51. Gandolfi G, Cinar MU, Ponsuksili S, Wimmers K, Tesfaye D, Looft C, Jüngst H, Tholen E, Phatsara C, Schellander K, Davoli R. Association of PPARGC1A and CAPNS1 gene polymorphisms and expression with meat quality traits in pigs. Meat Sci. 2011;89(4):478-485.
