LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakulktetas
Ieva Mineikytė
Leptino geno C3469T polimorfizmo įtaka kiaulių
produktyvumo poţymiams
Influence of leptin gene C3469T polymorphism on
production traits in pigs
Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: Doc. Dr. Nijolė Pečiulaitienė
2 DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Leptino geno C3469T polimorfizmo įtaka kiaulių produktyvumo poţymiams“.
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Ieva Mineikytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Ieva Mineikytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ INSTITUTE
(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 10 DARBO TIKSLAS: ... 11 DARBO UŢDAVINIAI: ... 11 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
1.1. Leptinas ir jo struktūros ypatumai ... 12
1.2. Leptino genas ir vieno nukleotido polimorfizmai (VNP) ... 14
1.3. Leptino receptorius ir signalo perdavimas ... 16
1.4. Signalo perdavimas centrinėje nervų sistemoje ... 18
1.5. Leptino vaidmuo adipogenezėje ... 20
2. TYRIMO MEDŢIAGOS IR METODAI ... 22
2.1. Tyrimų schema ... 22
2.2. Mėginiai ir jų surinkimas ... 23
2.3. Skerdimo duomenys ... 23
2.4. DNR išskyrimas, koncentracijos bei švarumo nustatymas ... 24
2.5. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)... 25
2.6. Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFLP) reakcija su HinfI restriktaze ... 25
2.7. Elektroforezė ... 25
2.8. Statistinė analizė ... 26
3. REZULTATAI ... 27
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 34
4.1. LEP geno C3469T polimorfizmo genotipų ir alelių daţnių įvertinimas ir paplitimas tirtose kiaulių veislėse ... 34
4.2. LEP geno C3469T polimorfizmo poveikio tirtų kiaulių produktyvumo poţymiams įvertinimas ... 35
IŠVADOS: ... 39
REKOMENDACIJA ... 41
4 SANTRAUKA
LEPTINO GENO C3469T POLIMORFIZMO ĮTAKA KIAULIŲ PRODUKTYVUMO POŢYMIAMS
Darbo autorė: Ieva Mineikytė
Darbo vadovė: Doc. Dr. Nijolė Pečiulaitienė
Magistro baigiamojo darbo moksliniai tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Veterinarijos fakultete, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute, 2012 – 2014 metais.
Darbo apimtis: 49 puslapiai. Darbe pateikta: 5 lentelės, 5 paveikslai.
Darbo tikslas: Įvertinti Leptino geno C3469T polimorfizmo įtaką produktyvumo poţymiams tiriamosiose kiaulių mišrūnų veislėse.
Darbo uţdaviniai:
1. Nustatyti tiriamoje kiaulių populiacijoje esančius Leptino geno C3469T polimorfizmo alelių daţnius.
2. Nustatyti tiriamoje kiaulių populiacijoje esančius Leptino geno C3469T polimorfizmo genotipų daţnius.
3. Įvertinti Leptino geno C3469T polimorfizmo įtaką kiaulių produktyvumo poţymiams. Metodikos: Iš kiaulių šerių mėginių išskirta genominė DNR ir padauginta PGR metodu, o gauti PGR produktai inkubuoti su HinfI restriktaze, kuri esant C3469T VNP mutacijai, specifiškai skelia PGR produktą. Genotipai nustatyti atlikus PGR-RFLP mėginių elektroforezę agarozės gelyje ir įvertinus specifinį ruoţelių išsidėstymą UV šviesoje.
Išvados: Ištyrus LEP geno C3469T polimorfizmo alelių ir genotipų įvairovę tirtoje kiaulių populiacijoje, nustatyti visi trys genotipai ir jų daţniai: TT daţnis 0,900, TC daţnis 0,088, CC genotipo daţnis 0,013. Taip pat T ir C alelių daţniai, atitinkamai 0,944 ir 0,056. Nagrinėjant kiaulių mišrūnų veisles atskirai, pastebima panaši alelių daţnių tendencija. Nustatyta genotipų įtaka dviems produktyvumo poţymiams tai kumpio masei, kur TT genotipo kumpio masė maţdaug 0,6 kg didesnė nei genotipo TC (p = 0,043). Ir lašinių storiui ties 6 – 7 šonkauliu, kur TC genotipo lašinių storis ties 6 – 7 šonkauliu 5 mm buvo storesnis (p = 0,031). Nustatyta, kad produktyvumo poţymiams įtakos turėjo keturi genetiniai veiksniai: veislė didţiausią įtaką darė bekono puselės ilgiui (42,33 proc., p < 0,001), maţiausią lašinių storiui ties 6 – 7 šonkauliu (15,12 proc., p < 0,01), kuilys darė įtaką kiaulių amžiui esant 100 kg svorio (40,48 proc., p < 0,001) bei pašarų sąnaudoms
5 1 kg priesvorio (41,35 proc., p < 0,001), veiksnys genotipas x kuilys didţiausia įtaka pasiţymėjo visai kiaulių skerdenos išeigai (21,46 proc., p < 0,001) bei maţiausia be galvos skerdenos svoriui (12,74 proc., p < 0,05), veislė x kuilys didţiausią poveikį darė kiaulių pašarų sąnaudoms 1 kg priesvorio (22,63 proc., p < 0,001), maţiausias poveikis buvo nustatytas kiaulių amžiui esant 100 kg (9,63 proc., p < 0,05). Dėl ryškaus kiekvieno genotipo imties skirtumo, atliekant statistinę analizę buvo sunkiau įvertinti tiriamo C3469T polimorfizmo įtaką produktyvumo poţymiams. Tikslesni rezultatai būtų gauti, jei skaičiuojant statistinius rodiklius, būtų paimtos vienodos visų genotipų imtys, ypač homozigotinių variantų. Tada aiškiau būtų matoma C alelio įtaka.
6 SUMMARY
INFLUENCE OF LEPTIN GENE C3469T POLYMORPHISM ON PRODUCTION TRAITS IN PIGS
The author: Ieva Mineikytė
Supervisor: Doc. Dr. Nijolė Pečiulaitienė
The research of master thesis was performed at Lithuanian university of health sciences, Veterinary academy, Faculty of Veterinary medicine, Institute of Biology systems and genetics, during the period of 2012 – 2014.
Structure: 49 pages. There are 5 tables and 5 figures included.
The aim: To evaluate influence of leptin gene C3469T polymorphism on production traits in tested pig hybrids.
Tasks:
1. To determine allele frequencies of leptin gene C3469T polymorphism in tested pig population.
2. To determine genotype frequencies of leptin gene C3469T polymorphism in tested pig population.
3. To evaluate influence of leptin gene C3469T polymorphism on production traits.
Methods applied: DNA was extracted from pig bristle samples, fallowing PCR amplification. The aplicons were incubated with HinfI restrictase, which cuts DNA at specific site if C3469T SNP mutation is present. The genotypes were determined after performing PCR-RFLP electrophoresis in agarose gel and evaluating band pattern in UV light.
Results: While examining the diversity of alleles and genotypes in tested pig population, three genotypes were determined and their frequencies estimated: TT with frequency 0,900, TC with frequency 0,088 and CC with frequency 0,013. Also frequencies of alleles T and C were estimated, 0,944 and 0,056 respectively. The same trend was observed in every pig hybrid breed separately. The influence of genotypes was determined on two production traits, that is ham weight, where TT genotype was observed to be 0,6 kg heavier than TC (p = 0,043). And the second one – fat content at 6 – 7 rib, where TC genotype was observed to be 5 mm fattier than TT (p = 0,031). Four genetic influence factors were determined. Breed factor influenced length of bacon half (42,33 %, p < 0,001) and fat content at 6 – 7 rib (15,12 %, p < 0,01). Boar factor influenced age at 100 kg weight (40,48 %, p < 0,001) and feed expenditure for 1 kg makeweight (41,35 %, p < 0,001). Genotype x boar factor had influence on carcass yield (21,46 %, p < 0,001) and carcass weight without head
7 (12,74 %, p < 0,05). Finally, breed x boar factor had influence on feed expenditure for 1 kg makeweight (22,63 %, p < 0,001) and age at 100 kg weight (9,63 %, p < 0,05). Because of the major differences in sample sizes of genotypes it was difficult to properly evaluate the influence of C3469T SNP on production traits. Therefore, more accurate results would be obtained if sample sizes of each genotype would be taken equally, especially those of homozygotes. Then the influence of C allele would be seen more clearly.
8 SANTRUMPOS
A2845T – vieno nukleotido polimorfizmas: T nukleotido pakeitimas į A 2845 pozicijoje; acyl-CoA – oksidazė;
AgRP – su agouti genu susijęs baltymas;
aMSH – a melanocitus stimuliuojantis hormonas; ARC – lankiškasis pogumburio branduolys; C – citozinas arba C alelis;
C3469T – vieno nukleotido polimorfizmas: T nukleotido pakeitimas į C 3469 pozicijoje; cAMP – ciklinis adenozino monofosfatas;
KART – kokainu ir amfetaminu reguliuojamas transkriptas; CIS – citokinų indukuojamos sekos;
CNS – centrinė nervų sistema;
Da – masės vienetas išreiškiantis baltymo molekulinę masę (Daltonas);
db/db – nutukusių pelių fenotipas, kuriose nesukeliamas atsakas į leptino baltymą; DMN – dorsomedialinis pogumburio branduolys;
ELOVL6 – desaturazė; EPO – eritropoetinas;
G-CSF – granuliocitų kolonijų stimuliavimo faktorius; GH – augimo hormonas;
Glu100 – glutamo rūgštis 100 – joje pozicijoje; HinfI – restrikcijos fermentas;
IGFB3 – insulino augimo faktorių prijungiantis baltymas 3 IL – interleukinas;
IRS – insulino receptoriaus substrato baltymas; JAK – Janus kinazė;
LEP (OB) – leptino genas;
LEPR (DB) – leptino receptoriaus genas; LIF – leukemijos inhibicijos faktorius; MC3R – melanokortino 3 receptorių; MC4R – melanokortino 4 receptorių;
mRNR – matricinė (informacinė) ribonukleininė rugštis; NPY – neuropeptidas Y;
9 PGR – polimerazės grandininės reakcijos metodas;
PI 3-kinazė – fosfoinozitido 3-kinazė (lipidų kinazė); POMC – propiomelanokortinas;
proc. – procentai;
Ras- MAPK – mitogeno aktyvinamos baltymų kinazės signalo perdavimo kelias; RFLP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmų tyrimo metodas;
SH2 – baltymo domenas atpaţįstantis fosfotirozinus liekanas; SOCS – citokinų signalo supresoriai;
STAT – transkripcijos faktorius; Stearoyl-CoA – desaturazė; T – timinas arba T alelis;
VMN – ventrikuliomedialinis pogumburio branduolys; VNP/SNP – vieno nukleotido polimorfizmas;
10 ĮVADAS
Kiauliena pagal suvartojimą uţima antrą vietą pasaulyje, todėl keliami vis didesni reikalavimai šių dienų kiaulininkystei. Vartotojai labiausiai vertina liesą, sultingą, aukštos biologinės vertės mėsą, pasiţyminčią geromis kulinarinėmis savybėmis (Jukna ir kt., 2009). Mėsos biologinė vertė priklauso nuo maistinių, organoleptinių charakteristikų ir kaloringumo. Pastaruoju metu vis didesnis dėmesys skiriamas sveikai mitybai. Nemaţai ţmonių turi antsvorį, todėl didėja širdies ir kraujagyslių ligų atsiradimo rizika, nes kraujagyslės uţkemšamos riebalais ir cholesteroliu. Cholesterolis ţmogaus organizme atsiranda dviem būdais: jį sintetina ţmogaus kepenys arba gaunamas valgant gyvūninius produktus (Jeong ir kt., 2011). Tad norint, kad cholesterolio koncentracija ţmogaus kraujyje būtų normali, reikia riebius pieno ir mėsos produktus keisti liesais (Murphy, Karen J. ir kt., 2012).
Tam tikroms dietoms, kurios efektyviai padeda maţinti svorį, priklauso baltymų dietos, kur pagrindinis baltymų šaltinis yra liesa raudona mėsa (Noakes M. ir kt., 2005; Murphy, Karen J. ir kt., 2012). Nors kiauliena labiausiai vartojama mėsa visame pasaulyje, tik gana neseniai pradėta tirti jos vartojimo įtaka ir svarba sveikatai. Kiauliena yra puikus baltymų, vitaminų bei mineralų šaltinis, o pastarųjų metų tyrimai rodo, jog liesa kiauliena teigiamai veikia širdies kraujagysles bei metabolizmą (Wycherley ir kt., 2010).
Leptinas yra hormonas dalyvaujantis riebalų metabolizmo kelyje ir įtakojantis jų kiekį kiaulienoje. Todėl mes savo tyrimų objektu pasirinkome kiaulių leptino geną. Tai nutukimo geno produktas, gaminamas riebalinėse ląstelėse. Atlikti tyrimai su ob/ob pelėmis parodė, jog papildomos leptino injekcijos maţina kūno riebalų kiekį bei svorį. Leptino įtakotas svorio maţėjimas ob/ob pelėse taip pat lėmė cholesterolio pernešimą iš adipozės audinio į kepenis ir jo eliminavimą per tulţį (Hyogo ir kt., 2002). Šiuolaikiniai molekulinės genetikos metodai nesunkiai identifikuoja kiaulių genotipus ir mėsos kokybę apsprendţiančius genus, kurie įtakoja mėsos riebalų ir raumenų kiekį bei marmuringumą. Todėl vartotojai turi galimybę kiaulieną pasirinkti pagal savo skonį ir sveikatą.
Augant kokybiškos mėsos rinkos paklausai siekiama veisti kiaules su pageidaujamais produktyvumo poţymiais, tokiais kaip augimo greitis, pašarų suvartojimas, raumeningumas (Jukna ir kt., 2007). Pagrindinis dėmesys kreipiamas didinant kiaulių produktyvumą, penėjimosi ir mėsines savybes, bei pačią mėsos kokybę (Jukna ir kt., 2007).
Genų kandidatų analizė yra vienas iš būdų tirti gyvulių genomą. Pagrindinis tikslas yra nustatyti individualius genus siejamus su ekonominės reikšmės poţymių pasireiškimu (Peixoto ir kt., 2009).
11 Per pastaruosius keletą metų leptino genas buvo intensyviai tyrinėjamas naminiuose gyvuliuose. Leptinas veikia smegenyse – perduoda signalą apie maisto medţiagų statusą organizme, įtakoja maitinimosi elgseną, metabolizmą ir energijos balansą (Campfield ir kt., 1995). Leptinas, fiziologinių ir endokrininių mechanizmų pagalba, gali įtakoti organizmo augimą ir audinių struktūrą. Todėl, leptino gene aptinkami polimorfizmai yra potencialūs genetiniai markeriai nusakantys tokius poţymius kaip augimo greitis ir pašaro suvartojimas (Peixoto ir kt., 2006).
Daug tyrimų atlikta tiriant leptino geno vieno nukleotido polimorfizmų (VNP) įtaką ekonomiškai naudingiems poţymiams kiaulėse ir kituose gyvuliuose. Tačiau dabartinė literatūra apie tai gana skirtinga, o kartais netgi prieštaringa. Tam įtakos gali turėti analizuojamos skirtingos kiaulių veislės arba tos pačios veislės skirtingos genetinės linijos. Todėl vertinti rezultatus reikia atsargiai, nes kiekybinių poţymių variacija gali būti sukelta kelių genų sąveikos, bei įtakota aplinkos faktorių (Peixoto ir kt., 2009).
Dėl leptino fiziologinių funkcijų, LEP genas turi būti analizuojamas kaip genas kandidatas įtakojantis kiaulienos skerdenos kokybę (Barb ir kt., 2001).
DARBO TIKSLAS:
Įvertinti Leptino geno C3469T polimorfizmo įtaką produktyvumo poţymiams tiriamosiose kiaulių mišrūnų veislėse.
DARBO UŢDAVINIAI:
1. Nustatyti tiriamoje kiaulių populiacijoje esančius Leptino geno C3469T polimorfizmo alelių daţnius.
2. Nustatyti tiriamoje kiaulių populiacijoje esančius Leptino geno C3469T polimorfizmo genotipų daţnius.
12 1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Leptinas ir jo struktūros ypatumai
Leptino genas (LEP) koduoja 16 kDa masės hormoną leptiną, kurio pavadinimas kilo iš graikų kalbos ţodţio „leptos“ – lieknas. Leptinas pagrinde gaminamas baltajame adipozės audinyje ir cirkuliuoja kraujo plazmoje, jo amino rūgščių seka tarp rūšių yra gana panaši. Artimiausias ţmonių leptino homologas rastas šimpanzėse, kur amino rūgščių seka skiriasi tik 73 – ioje pozicijoje (Zhang ir kt., 2005).
Struktūriniai duomenys leptiną priskiria augimo hormonų keturių spiralių citokinų pošeimiui. Šiam pošeimiui prilauso granuliocitų kolonijų stimuliavimo faktorius (G-CSF), augimo hormonas (GH), eritropoetinas (EPO), interleukinai (IL) ir leukemijos inhibicijos faktorius (LIF) (Ouyang ir He, 2003).
Yra ţinoma, kad leptino sintezę bei sekreciją reguliuoja keletas hormonų ir kitų veiksnių. Šie veiksniai skirstomi pagal poveikį leptino mRNR molekulėms: inhibitoriniai maţina, o sekreciją skatinantys didina leptino mRNR gamybą. Teigiamai mRNR koncentraciją veikia insulinas, noradrenalinas ir steroidiniai hormonai (Zhang ir kt., 2005). Gliukokortikoidai tiesiogiai veikia adipozės audinį ir leptino sintezei bei sekrecijai sukelia stimuliacinį efektą (Zhang ir kt., 2005). Prie inhibitorinių veiksnių priskiriamos cAMP molekulės (Zhang ir kt., 2005).
Mutacijos leptiną koduojančiame gene, veikia leptino ekspresiją, o kartu įtakoją nutukimą, nevaisingumą ir diabetą (Zhang ir kt., 1997). Geną veikia dviejų tipų mutacijos. Pirmosios metu, nukleotidų sekoje pirma laiko įterpiamas stop kodonas, ko pasekoje susidaro trumpesnis ir nefunkcionalus baltymas. Antroji mutacija veikia promotoriaus regioną, o to rezultatas – transkripcijos nebuvimas, todėl baltymas visai nesintetinamas (Flier J.S., 1995).
Spiralinių citokinų šeimos nariai skiriasi vienas nuo kito, nerandama jokios sekų homologijos tarp šios šeimos narių. Jiems būdingos keturios spiralės, kurios susilanksto aukštyn-aukštyn-ţemyn-ţemyn principu (Zhang ir kt., 1997).
Laukinio tipo leptinas agreguoja, todėl jo neįmanoma sukristalizuoti, tačiau mutantinė forma pasiţymi kitokiomis savybėmis (Zhang ir kt., 1997). Mutantinė forma leptinas E100 skiriasi viena amino rūgštimi 100 – oje pozicijoje. Čia glutamo rūgštis pakeista triptofanu. Glu100 išsidėsčiusi baltymo paviršiuje ir kontaktuoja su tirpikliu. Šios rūgšties pakeitimas triptofanu sumaţina hidrofobines sąveikas ir palengvina kristalizaciją. Kristalizuojant leptino mutantinę formą buvo nustatyta leptino struktūra.
13 Leptinas sudarytas iš keturių antiparaleliai išsidėsčiusių spiralių, kiekviena jų 5-6 vijų ilgio. Hidrofobinė zona paraleli spiralių gniutului ir formuojama iš spiralių, kurios išsidėsčiusios viena priešais kitą, liekanų. Dvi kilpos jungia spirales A ir B bei C ir D, trumpa kilpa jungia spirales B ir C (Zhang ir kt., 1997) (1 Pav.).
1 pav. Leptino molekulės A, B, C, D ir E spiralių erdvinis išsidėstymas (http://people.mbi.ucla.edu/yeates/153AH_2009_project/brumbaugh.html, prieiga per internetą 2014-04-20).
Labai svarbus leptino maţasis spiralinis segmentas E, kuris išsidėstęs CD kilpoje priešais visą spiralinį gniutulą. E spiralė yra deformuota ir beveik statmena (87°) likusiai molekulės daliai. Leucinas 104, 107, 110, 114, ir valinas 113 E spiralėje veikia kaip hidrofobinė kepurė paslepianti lipofilines BD struktūros dalis (Zhang ir kt., 1997).
Nors disulfidinės jungtys tarp citokinų nėra labai koncervatyvios, pasirodo, jog leptino molekulėje esantis vienintelis disulfidinis tiltelis yra būtinas molekulės citokininiam susilankstymui (Madej ir kt., 1995). Cisteino liekanos 96 ir 146 pozicijose sudaro šią jungtį. Jungtis kontaktuoja su tirpikliu ir todėl D spiralę ties paskutine vija pasuka 36° kampu link CD kilpos, taip sudaroma kilpa
14 D spiralėje. Abi cisteino liekanos yra labai koncervatyvios, ir mutacijos šiose srityse keičia baltymo aktyvumą, tiksliau baltymas tampa neaktyvus. Tai parodo, kad disulfidinis tiltelis ir susidariusi D spiralės kilpa yra būtini komponentai taisyklingam baltymo susilankstymui ir receptoriaus prijungimui (Zhang ir kt., 1997).
1.2. Leptino genas ir vieno nukleotido polimorfizmai (VNP)
Leptinas veikia smegenyse – perduoda signalą apie maisto medţiagų statusą organizme, įtakoja maitinimosi elgseną, metabolizmą ir energijos balansą (Campfield ir kt., 1995). Leptinas, fiziologinių ir endokrininių mechanizmų pagalba, gali įtakoti organizmo augimą ir audinių struktūrą. Todėl, leptino gene aptinkami polimorfizmai yra potencialūs genetiniai markeriai nusakantys tokius poţymius kaip augimo greitis ir pašaro suvartojimas (Peixoto ir kt., 2006).
Per pastaruosius keletą metų leptinas buvo intensyviai tyrinėjamas naminiuose gyvuliuose. Daug tyrimų atlikta tiriant leptino geno vieno nukleotido polimorfizmų (VNP) ryšius su ekonomiškai naudingais poţymiais kiaulėse ir kituose gyvuliuose. Van der Lende ir kt. (2005) apţvelgdami LEP geno polimorfizmų-fenotipų ryšį nurodė, kad kiaulių LEP genas siejamas su pašaro suvartojimu, vidutiniu dienos prieaugiu, skerdenos kokybe (nugaros riebalų sluoksnio storiu) ir reprodukcijos poţymiais. Jiang ir Gibson (1999) ištyrė C3469T VNP Landrasų kiaulių veislėje, kuris siejamas su nugaros riebalų sluoksnio storiu, kur mutantinis C alelis būdingas storesnio riebalų sluoksnio fenotipui. Kennes ir kt. (2001) nustatė ryšį tarp C3469T VNP ir pašarų suvartojimo Landrasuose, taip pat ryšį tarp A2845T VNP ir amţiaus, kada svoris siekia 100 kg. Ramsay ir kt. (1998) nustatė maţdaug 306% (P < 0,05) didesnes leptino koncentracijas riebių kiaulių kraujo serume, nei tokio paties amţiaus liesose kiaulėse.
Dabartinė literatūra apie VNP įtaką produktyvumo poţymiams gana skirtinga, o kartais netgi prieštaringa. Tam įtakos gali turėti analizuojamos skirtingos kiaulių veislės arba tos pačios veislės skirtingos genetinės linijos. Todėl vertinti rezultatus reikia atsargiai, nes kiekybinių poţymių variacija gali būti sukelta kelių genų sąveikos, bei įtakota aplinkos faktorių (Peixoto ir kt., 2009). Dėl leptino fiziologinių funkcijų, LEP genas turi būti analizuojamas kaip genas kandidatas įtakojantis kiaulienos skerdenos kokybę (Barb ir kt., 2001).
Genų kandidatų analizė yra vienas iš būdų tirti gyvulių genomą. Pagrindinis tikslas būtų nustatyti individualius genus siejamus su ekonominės reikšmės poţymių pasireiškimu (Peixoto ir kt., 2009). Individualių genų identifikacija padeda vykdyti rinkos paklausą atitinkančią selekciją.
15 LEP genas atrastas 1994 metais ob/ob pelėse, todėl senesnėje literatūroje dar ţymimas kaip OB genas. Pelės pasiţymėjo stipriai išreikštais nutukimo poţymiais (Zhang ir kt., 1994). Kiaulių LEP genas rastas 18 – chromosomos q13–q21 regijone (Neuenschwander ir kt., 1996). Jis sudarytas iš trijų egzonų ir dviejų intronų (Bidwell ir kt., 1997), o koduojantis regionas formuojamas iš antro ir trečio egzono. Palyginamieji tyrimai parodė aukštą homologiją tarp kiaulių ir ţmogaus, bei kiaulių ir pelių LEP genų sekų. Ši homologija tarp ţinduolių reiškia, kad struktūrinė LEP geno dalis yra evoliuciškai koncenrvatyvi (Peixoto ir kt., 2006).
Kiaulių leptino gene rasti ir apibūdinti septyni polimorfizmai C867T, A1112G, C3469T, G3714T, A2845T, T3996C, ir G2728A (Kennes ir kt., 2001). Geriausiai apibūdintas VNP yra mutacija trečiame egzone - C3469T, aptinkama su HinfI restriktaze (Stratil ir kt., 1997). Nors šio polimorfizmo C/T pakeitimas nesukelia jokio pokyčio amino rūgščių sekoje, tyrėjai neatmeta C3469T VNP įtakos transkripto stabilumui ir transliacijos efektyvumui (Jiang ir Gibson, 1999). VNP gali paveikti baltymo ekspresiją sukėlęs mRNR stabilumo pokytį (Capon ir kt., 2004; Liu ir kt., 2009).
Peixoto ir kt., (2006) ištyrė tuos pačius LEP geno polimorfizmus ir palygino su tam tikrų ekonomiškai naudingų poţymių pasireiškimais F2 kartos skirtingų veislių kiaulėse. TT genotipo kiaulės, turinčios C3469T mutaciją, turėjo didţiausią svorį būdamos 21, 42, 63 ir 77 dienų amţiaus. Tačiau heterozigotinio genotipo CT kiaulės turėjo didţiausią vidutinį dienos prieaugį ir pašaro įsisavinimą būdamos 77 – 105 dienų amţiaus.
Genotipo pasireiškimas priklauso ir nuo lyties, nes LEP geno ekspresija patinuose ir patelėse skiriasi. Pavyzdţiui, ţmonėms lytis turi didelę reikšmę: moters organizmas išskiria tris kartus daugiau leptino nei vyrų, lyginant su ta pačia kūno riebalų mase (Martin ir kt., 2002). Patinuose leptino lygis krenta pasiekus lytinio brendimo laikotarpį. Pasirodo, kad testosteronas sugeba inhibuoti leptino sintezę, o estrogenas ją stimuliuoja.
Leptino receptoriaus (LEPR) geno polimorfizmai taip pat domina mokslininkus dėl jų galimos įtakos fiziologiškai ir ekonomiškai vertingiems poţymiams. Chen ir kt. (2004) atrado reikšmingą ryšį tarp leptino receptoriaus genotipų ir vados dydţio Diurokų ir Jorkšyrų veislėse, taip pat ryšį su pašaro įsisavinimu Diurokuose ir nugaros riebalų sluoksnio storiu Landrasų ir Jorkšyrų kiaulių veislėse.
Literatūros duomenys apie genotipų ryšį su produktyvumo poţymiais daţnai yra prieštaringi. Tai gali būti siejama su analizuotų veislių genetinių linijų skirtumais.
Dvi hipotezės gali paaiškinti genotipo – poţymio ryšį. Pirmoji teigia, kad įtakos turi kito geno VNP, kuris turėtų būti tikroji prieţastis aiškinanti išreikštų poţymių pasireiškimo variaciją (Peixoto ir kt., 2006). Toje pačioje 18 – oje chromosomoje neuropeptidą Y koduojančio geno lokusas
16 (18q24) randamas šalia LEP geno (18q13–21). Neuropeptidas Y veikia priešingai leptinui, o jo genas manoma taip pat yra genas kandidatas lemiantis mėsos kokybę. LEP genas taip pat gali būti sukibęs su kitu lokusu, kuris vėl gi įtakoja mėsos kokybę. Tai insulino augimo faktorių prijungiantis baltymas 3 (IGFB3). Abu buvo rasti 18 – os chromosomos q24 pozicijoje. Jei ši hipotezė teisinga, LEP polimorfizmai galėtų tarnauti kaip netiesioginiai markeriai aptinkant tikrąją poţymių variacijos prieţastį (Peixoto ir kt., 2006).
Atroji iškelta hipotezė teigia apie klaidingai teigiamą ryšį tarp genotipų ir dominančių poţymių. Tokios hipotezės viena iš prieţasčių būtų ribotas kiekis atliktų tyrimų su kai kuriais genotipais. (Peixoto ir kt., 2006).
1.3. Leptino receptorius ir signalo perdavimas
Leptinas yra nutikimo geno obese (LEP arba OB) produktas, kuris pagrinde sintetinamas baltajame adipozės audinyje. Jis cirkuliuoja plazmoje kaip 16 kDa molekulinės masės baltymas, o jo koncentracijos plazmoje yra proporcingos kūno riebalų visumai. Anatominiai ir funkciniai duomenys rodo, jog leptinas veikdamas smegenyse reguliuoja energijos balansą. Leptinas pasiekia smegenis per specifinio transporto mechanizmą (Banks ir kt., 1996), pasitelkiant receptorių veikimą pereina kraujo-smegenų barjerą, arba petenka su smegenų skysčiu (Schwartz ir kt., 1996a).
Leptino receptorius yra koduojamas diabetes (LEPR arba DB) geno. Alternatyvaus LEPR mRNR karpymo metu generuojamos šešios šio receptoriaus izoformos (LEPRa-f) (Lee ir kt., 1996; Wang ir kt., 1998; Martin S. S. ir kt., 2008). Šios leptino receptoriaus izoformos turi vienodus ląstelės išorėje esančius ligandą prijungiančius domenus N-gale, bet skiriasi C-gale. Leptino receptorių izoformos yra membraniniai receptoriai ir skirstomos į dvi kategorijas, išskyrus LEPRe. Pirmajai priklauso trumposios formos LEPRa, LEPRc, LEPRd ir LEPRf, kurios turi 30–40 amino rūgščių citoplazmines liekanas. Trumpųjų LEPR formų funkcija maţiau ţinoma, nors manoma jog jos atsakingos uţ leptino pernešimą per kraujo-smegenų barjerą ir cirkuliuojančio LEPR ekstraląstelinio domeno produkciją, kuris jungiasi su leptinu (Münzberg ir kt., 2005).
Antrajai kategorijai priklauso LEPRb izoforma – ilgoji, kuri turi prailgintą citoplazminį domeną (302 amino rūgščių liekanos), jame randami įvairūs motyvai, reikalingi sąveikai su kitais baltymais ir signalo perdavimui. Daugiausia ţinoma apie LEPRb, kuris itin ekspresuojamas hipotalamuse, ir tai vienintelė izoforma, kuri aktyvuoja signalo perdavimą Janus kinazėmis ir transliacijos sistemą (JAK/STAT) (Martin S. S. ir kt., 2008). LEPRb izoforma yra pagrindinė reguliuojant nutikimą. Šios izoformos nebuvimas, kurį sukelia priešlaikinis stop kodono įterpimas į
17 LEPRb mRNR transkriptą, lemia nutukusių pelių db/db fenotipą (Chen ir kt., 1996). Leptino receptorius priskiriamas I klasės citokinų receptorių superšeimai (Ihle, 1995). Signalo perdavimas pavaizduotas 2 – ame paveiksle.
LEPRe skiriasi nuo kitų izoformų, nes neturi transmembraninio domeno (Lee ir kt., 1996), todėl jis yra cirkuliacinis receptorius. Sekretuojama forma yra arba alternatyviai karpytos mRNR produktas (pvz.: grauţikų LEPRe, kurį sudaro pirmieji 14 LEPR egzonų), arba membraninių LEPR formų proteolitinio skaldymo produktas (Münzberg ir kt., 2005). LEPRe turi tik ląstelės išorėje esantį domeną, kuriuo prisijungia cirkuliuojantį leptiną ir taip reguliuoja jo koncentraciją kraujyje (Ge H. ir kt., 2002).
2 pav. Leptino indukuotas signalo perdavimas ląstelėje.
LEPRb turi ląstelės išorėje esantį ligandą prijungiantį domeną, transmembraninį domeną, ir citoplazminį (signalą siunčiantį) domeną (Tartaglia L. A. ir kt., 1997; Taga T. ir kt., 1997). Kaip ir kiti citokinų receptoriai, LEPRb nepasiţymi fermentiniu aktyvumu, bet signalą siunčia per nekovalentinę sąveiką su tirozino kinaze JAK2 (Ihle J. N. ir kt., 1995; Taniguchi T. ir kt., 1995; Kloek C. ir kt., 2002). Prisijungus ligandą, prasideda receptoriaus konformaciniai pokyčiai, įjungiamas viduląstelinis fosforilinimo mechanizmas (Tartaglia L. A. ir kt., 1997; Devos R. ir kt.,
18 1997; Couturier C. ir kt., 2003). Kai leptinas prisijungia prie LEPRb, aktyvuojama JAK2 ir abu baltymai yra fosforilinami. Taip indukuojama keletas siganalo perdavimo kelių. JAK signalo perdavime dalyvauja insulino receptoriaus substrato baltymai (IRS) ir fosfoinozitido 3-kinazės (PI 3-kinazė) p85 subvienetas (Myers ir White, 1996).
Transkripcijos faktoriai STAT taip pat gali būti aktyvinami JAK, po citokinų receptoriaus aktyvacijos. Daugelis citokinų aktyvuoja Ras–MAPK (mitogeno aktyvinamos baltymų kinazės) signalo perdavimo kelią, kai indukuojamas SHC baltymo fosforilinimas (Ihle, 1995). Signalo perdavimui svarbūs ir citokinų indukuojami inhibitoriai tokie kaip CIS (citokinų indukuojamos sekos) ir SOCS-1-3 (citokinų signalo supresoriai). SOCS turi SH2 domeną, kuris prisijungia prie fosforilintų tirozino liekanų JAK ir taip slopina signalo perdavimą (Kile ir Alexander, 2001).
Trumposios LEPR izoformos neperduoda signalo, nes neindukuoja fosforilinimo grandinės, kadangi neturi JAK prijungiančio motyvo. Nors yra duomenų, kad LEPRa izoforma aktyvuoja MAPK (Yamashita ir kt., 1998). Hepatocituose, neturinčiuose LEPRb, leptinas veikia kaip antagonistas gliukagono indukuojamame cAMP koncentracijos didinimui (Zhao ir kt., 2000). LEPRa ir LEPRc intensyviai ekspresuojamos smegenų kapiliaruose (Hileman ir kt., 2002) ir manoma transportuoja leptiną per kraujo-smegenų berjerą (Tartaglia ir kt., 1995; Banks ir kt., 1996; Hileman ir kt., 2002).
Kaip ir kitų I klasės citokinų receptorių superšeimos narių, leptino receptoriaus aktyvacija sukelia STAT 1, 3 ir 5 tirozino fosforilinimą in vitro (Harvey J. ir kt., 2003). Leptinas taip pat indukuoja SOCS-3 mRNA ekspresiją pogumburyje (Bjorbaek ir kt., 1998), taigi kontroliuoja signalo perdavimą transkripcijos lygyje (Bjorbaek ir kt., 2000). Nustatyta, kad dėl leptino receptoriaus įtakos lipidų kinazė PI 3-kinazė aktyviai veikia periferinėse ląstelėse: insuliną išskiriančiose ląstelėse (Harvey ir kt., 2000a), hepatocituose (Zhao ir kt., 2000) ir miocituose (Berti ir kt., 1997). Periferinėse ląstelėse leptino receptorius aktyvina ir Ras-MAPK signalo perdavimo kelią (Harvey J. ir kt., 2003). Leptino ir insulino signalų perdavimo keliai yra susiję. Leptinas palengvina insulino veikimą hepatiniame gliukozės metabolizme (Aiston ir Agius, 1999; Harvey ir kt., 2000b). Leptinas taip pat susilpnina insulino indukuotą IRS-1 tirozino fosforilinimą ir daro įtaką gliukoneogenezei ţmogaus kepenų ląstelėse (Cohen ir kt., 1996).
1.4. Signalo perdavimas centrinėje nervų sistemoje
Centrinėje nervų sistemoje leptinas veikia neuronus, kurie reguliuoja cirkuliuojančių hormonų lygį (skydliaukės hormonų, lytinių steroidų, augimo hormonų) (Elmquist J. K. ir kt., 1999;
19 Inui A., 1999; Huo L. ir kt., 2004). Leptino poveikis šiems pogumburio neuronams taip pat reguliuoja autonominės nervų sistemos aktyvumą. Leptinas tiesiogiai veikia T ląsteles, kurios turi LEPRb receptorius, todėl daro poveikį imuninei sistemai (Lord G. M. ir kt., 1998).
Centrinėje nervų sistemoje esantis pogumburis yra pagrindinė leptino veikimo vieta, kur kontroliuojamas maisto ir energijos suvartojimas. LEPRb ekspresuojamas pogumburio branduoliuose: lankiškajame (ARC), ventrikuliomedialiniame (VMN) ir dorsomedialiniame (DMN). Kitos smegenų vietos, kuriose ekspresuojamas LEPRb yra smegenų kamienas ir hipokampas (Münzberg ir kt., 2005).
Stipriausi signalai aptinkami ARC branduolyje (Harvey J. ir kt., 2003). ARC yra pogumburio centras, kuriame leptino periferiniai signalai pakeičiami į neuroninius, ir to pasekoje keičiama individo elgsena vartojant maistą bei kinta kūno masė (Harvey J. ir kt., 2003). Lankiškajame branduolyje taip pat gausu neuropeptidų kurie dalyvauja CNS anaboliniame ir kataboliniame efektorinio veikimo keliuose (Elmquist ir kt., 1998b). Leptinas veikia dviejų kategorijų neuronus ARC branduolyje. Pirmieji sintetina neuropeptidą Y (NPY) ir su agouti genu susijusį baltymą (AgRP), kiti sintetina propiomelanokortiną (POMC) (Elmquist J. K. ir kt., 1999; Schwartz M. W. ir kt., 2000). LEPRb/POMC neuronuose POMC yra perdirbamas, kad gamintų a melanocitus stimuliuojantį hormoną (aMSH), kuris sukelia anoreksigeninį (apetitą maţinantį) signalą aktyvuodamas melanokortino 4 receptorių (MC4R) ir melanokortino 3 receptorių (MC3R) (Münzberg ir kt., 2005). LEPRb stimuliuoja POMC sintezę ir aktyvuoja bei depoliarizuoja LEPRb/POMC neuronus (Schwartz M. W. ir kt., 2000; Cowley M. A. ir kt., 2001). NPY yra oreksigeninis (apetitą keliantis) hormonas, kuris taip pat slopina centrines, LEPRb reguliuojamas, augimo ir reprodukcijos ašis. AgRP yra aMSH/MC4R antagonistas ir endogeninio MC4R inhibitorius. Leptinas per LEPRb inhibuoja NPY/AgRP neuronus ir slopina šių neuropeptidų ekspresiją (Münzberg ir kt., 2005).
Taigi, LEPRb sukeliami signalai stimuliuoja anoreksigeninių neuropeptidų gamybą ir slopina oreksigeninių peptidų produkciją (Münzberg ir kt., 2005). Priešingai, sumaţėjęs leptino aktyvumas stimuliuoja apetitą slopindamas anoreksigeninių ir didindamas oreksigeninių peptidų sintezę. Pelėse, kurios neprodukuoja leptino (ob/ob) arba kuriose nesukeliamas atsakas į leptiną (db/db), padidėja NPY/AGRP mRNA koncentracija ir sumaţėja POMC/KART mRNA (Harvey ir kt., 2003).
Taigi, ARC branduolys perteikia informaciją apie organizmo energijos atsargas. Šie pirminiai neuronai (ARC branduolyje) palaipsniui inervuoja antrinius neuroninius centrus, kur sukuriamas sotumo ir adipozės signalas. Antriniuose neuronų centruose – uţpakalinėse smegenyse – patekęs signalas papildomai apdorojamas ir toliau siunčiamas į nugaros neuronus ir į periferinius organus.
20 Leptino indukuoti genų transkripcijos pokyčiai per JAK-STAT3 signalo perdavimo kelią sukelia anoreksigeninius pokyčius. Tačiau, leptinas taip pat turi stiprų poveikį ARC neuronams. Elektrofiziologiniais tyrimais nustatyta, kad į gliukozę reaguojančių neuronų subpopuliacija, kuriuose pašalinus gliukozę sukeliama neuroninė hiperpoliarizacija, taip pat inhibuojama leptino (Spanswick ir kt., 1997).
1.5. Leptino vaidmuo adipogenezėje
Kiaulės yra biomedicininės reikšmės gyvuliai tiriant nutukimą ir su nutukimu siejamas ligas. Tačiau, labai maţai ţinoma apie adipogenezę kiaulėse. Adipozės audinio susidarymo, adipogenezės, proceso metu vyksta preadipocitų proliferacija ir jų diferencijacija iki subrendusių adipocitų (Samulin ir kt., 2009). Diferencijacijos procesas charakterizuojamas ląstelės morfologiniais pakitimais ir yra reguliuojamas transkripcijos faktorių, kurie buvo ištirti keliose gyvūnų rūšyse: pelėse (Mus musculus), kiaulėse (Sus scrofa), galvijuose (Bos taurus) ir ţmonėse (Rosen ir Spiegelman, 2000). Taip pat intensyviai tyrinėjami adipocitų išskiriami hormonai adipokinai (Ronti ir kt., 2006; Rabe ir kt., 2008; Molina ir kt., 2009).
Adipozės audinys yra pagrindinis organas reguliuojant organizmo energijos homeostazę (Rosen ir Spiegelman, 2006). Riebalų rūgštys yra esterifikuojamos ir kaupiamos kaip triacilgliceroliai arba β oksidacijos procese panaudojamos energijai gauti, priklausomai nuo organizmo energetinių poreikių. Viduląstelinės riebalų rūgštys gali būti modifikuojamos vykdant elongacijos arba desatūracijos procesus. Šios modifikacijos vyksta dar prieš esterifikaciją (Samulin ir kt., 2009). ELOVL6 ir Stearoyl-CoA desaturazės yra svarbūs fermentai susidarant mononesočiosioms riebalų rūgštims. ELOVL6 ilgina sočiąsias ir mononesočiąsias riebalų rūgštis 12–16 anglies atomų grandine (Moon ir kt., 2001; Matsuzaka ir kt., 2002). Stearoyl-CoA desaturazė katalizuoja ilgųjų grandinių riebalų rūgščių desatūraciją delta-9 padėtyje, ko pasekoje susidaro cis-7- heksadekanoinė rūgštis ir oleino rūgštis (Enoch ir kt., 1976). Ląstelės viduje esančios riebalų rūgščių grandinės gali būti trumpinamos β oksidacijos metu peroksisomose ir mitochondrijose. Oksidacijos greitį peroksisomose slopina acyl-CoA oksidazė 1, kuri pirmiausia oksiduoja vidutinio ilgio, paskui ilgas ir labai ilgų grandinių riebalų rūgštis. To pesekoje, peroksisomose β oksidacija vyksta nepilnai, acilinti riebiųjų rūgščių produktai gali būti pernešami į mitochondrijas tolesnei oksidacijai (Samulin ir kt., 2009).
Nors adipogenezė pirmiausia priklauso nuo transkripcijos faktorių veikimo, ląstelėje vykstančios riebiųjų rūgščių modifikacijos taip pat turi didelės reikšmės adipocitų vystymuisi
21 (Samulin ir kt., 2009). Nustatyta, kad riebalų rūgščių elongacija ir desatūracija skatina lipogenezę pelėse (Sampath ir kt., 2007), o riebalų rūgščių oksidacijos procesai suaktyvėja adipogenezės metu pelėse, kiaulėse ir ţiurkėse (Prunet-Marcassus ir kt., 1999; Okuno ir kt., 2008; Luo ir kt., 2008).
Mitochondrijų funkcijų pakitimai sukelia lipidų metabolizmo proceso sutrikimus ir triacilglicerolio kaupimąsi keliuose ląstelių tipuose (Heilbronn ir kt., 2004; Vankoningsloo ir kt., 2005). Genai koduojantys mitochondrijų kvėpavimo grandinės komponentus įtakoja lipidų sandėliavimą (McKay ir kt., 2003).
Kiaulių adipocitai pasiţymi dideliu lipogeniškumu. Nustatyta, kad LEP geno ekspresija padidėja ląstelių proliferacijos metu. LEP geno koduojamas baltymas leptinas nereguliuoja transkripcijos (Ppara, Pparg ir C/ebpa) faktorių ekspresijos, kurie dalyvauja adipogenezėje, tačiau šis baltymas turi įtakos reguliuojant genų ekspresiją, kurie susiję su lipidų mobilizacija, lipogeneze, energijos eikvojimu ir apoptozės procesais (Zhang ir kt., 2008). Leptino injekcijos kiaulių preadipocituose padidina mitochondrijų oksidacijos fermentų ekspresiją (Luo ir kt., 2008) ir maţina riebalų rūgščių esterifikacijos proceso intensyvumą (Ramsay ir kt., 2004). In vitro tyrimuose nustatyta, kad baltymo kiekis reikalingas ląstelių proliferacijai sukelti yra kur kas didesnis nei natūraliai cirkuliuojantis organizme. Ţiurkių organizme cirkuliuojančios leptino koncentracijos kinta priklausomai nuo amţiaus bei nutukimo ir varijuoja tarp 5–50 ng/mL (Wagoner ir kt., 2006). Panašūs cirkuliuojančio baltymo kitimai rasti ţmonėse (Considine ir kt., 1996) ir kiaulėse (Cameron ir kt., 2000; Amills ir kt., 2008).
22 2. TYRIMO MEDŢIAGOS IR METODAI
2.1. Tyrimų schema
Magistrinio darbo tiriamosios dalies schema pateikta 3 – iame paveiksle.
3 pav. Tyrimų schema.
DNR išskyrimas iš šerių svogūnėlių Mėginių surinkimas
DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas
LEP geno padauginimas polimerazės grandininės reakcijos metodu (PGR)
Polimorfizmo identifikavimas restrikcinių ilgio polimorfiškumo tyrimo metodu (RFLP)
Polimorfizmų analizė Gelio dažymas etidžio bromidu
Frakcionavimas horizontalios elektroforezės metodu agarozės gelyje
23 2.2. Mėginiai ir jų surinkimas
Molekuliniams tyrimams buvo naudoti kiaulių šerių mėginiai. Mėginiai analizei surinkti Valstybinėje kiaulių veislininkystės stotyje (Jadvimpolio kaimas, Baisiogla, Radviliškio rajonas, Lietuva) (4 pav.). Iš viso surinkti 80 – ies kiaulių šerių pavyzdţiai, o toliau sekantys genetiniai tyrimai atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje esančiame Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute (Tilţės g. 18, Veterinarijos akademija, Korpusas Nr. 5, Kaunas, Lietuva), 2012 – 2014 metų laikotarpyje.
4 pav. Mėginių rinkimas Valstybinėje kiaulių veislininkystės stotyje.
Tirta populiacija sudaryta iš trijų mišrūnų veislių: Jorkšyrų x Landrasų mišrūnų (N = 21), Jorkšyrų x Landrasų x Landrasų mišrūnų (N = 34) ir Didţiųjų baltųjų x Landrasų x Landrasų mišrūnų (N = 25).
2.3. Skerdimo duomenys
Skerdimo duomenys buvo gauti iš Valstybinės kiaulių veislininkystės stoties. Baigus kontrolinį penėjimą, apskaičiuotas kiaulių amţius dienomis nuo atsivedimo iki 100 kg masės bei vidutinis priesvoris per parą ir pašarų sąnaudos kilogramui priesvorio kontrolės metu.
Prieš realizuojant (skerdţiant) ultragarsiniu prietaisu „Piglog 105“ (Piglog 105 Users Guide, 1991), dviejuose taškuose nustatytas lašinių storis: 7 cm į šoną nuo nugaros vidurio tarp 3 ir 4 juosmens slankstelio (Fat1) ir 10 cm nuo paskutinio šonkaulio galinio krašto link galvos, 7 cm link
24 papilvės nuo vidurinės nugaros linijos tarp paskutinių 3 ir 4 šonkaulių (Fat2). Taške Fat2 nustatytas
nugaros raumens storis, ir pagal šiuos duomenis apskaičiuotas raumeningumas.
Kontrolinių skerdimų metu nustatyta šiltos skerdenos masė (be vidaus organų, galvos, kojų ir uodegos) šimto gramų tikslumu. Apskaičiuota šiltos skerdenos su galva, kojomis ir vidaus riebalais išeiga. Ji parodo skerdimo nuostolius. Skerdenos išeiga apskaičiuota pagal formulę:
a – šiltos skerdenos su galva, kojomis ir vidaus riebalais masė (kg); s – gyvos kiaulės masė (kg).
Apskaičiuota skerdenos be galvos, kojų ir vidaus riebalų išeiga. Tai šiltos skerdenos be kojų, galvos, vidaus riebalų masės santykis su gyvos kiaulės mase, išreikštas procentais.
Skerdenas atvėsinus (praėjus 24 val.) buvo nustatytas skerdenos ir bekono puselės ilgis, lašinių storis mm (ties 6–7 krūtinės šonkauliu, ties 10 šonkauliu, ties paskutiniuoju šonkauliu, ties paskutiniuoju juosmens slanksteliu).
Kontrolinis skerdimas vykdomas, atsiţvelgiant į Valstybinės gyvulių veislininkystės prieţiūros tarnybos prie Ţemės ūkio ministerijos viršininko 2003 m. rugpjūčio 21 d. įsakymą Nr.1A-42 „Dėl grynaveislių ir hibridinių kiaulių produktyvumo bei jų genetinės vertės nustatymo metodų patvirtinimo“.
2.4. DNR išskyrimas, koncentracijos bei švarumo nustatymas
DNR išskyrimui buvo naudojama metodika su Chelex dervomis. Kiekvienam mėginiui paruošti buvo kerpami 6 – 10 kiaulių šerių svogūnėliai, ir toliau į epndorfinį mėgintuvėlį pridedama lizavimo mišinio, susidedančio iš 200 μl Chelex, 7,5 μl DTT ir 10,7 μl proteinazės K. Mėgintuvėliai 30s vorteksuojami, centrifuguojami 10s 13500 aps/min greičių ir paliekami 56°C termostate 45 minutes. Po to išimami ir nustamas DNR švarumas bei koncentracija.
Genominės DNR koncentracija ir švarumas buvo nustatomi spektofotometru, ruošiant 100μl skiestos DNR tirpalą: į kiuvetę pilama 10μl koncentruotos DNR ir 90μl distiliuoto vandens. DNR kiekis nustatomas matuojant tirpolo optinį tankį prie 260nm ilgio bangos, o švarumas išmatavus optinių tankių 260nm/280nm santykį.
𝒂 ∗ 𝟏𝟎𝟎 𝒔
25 2.5. Polimerazės grandininė reakcija (PGR)
PGR reakcijos bendras vieno mėgintuvėlio tūris buvo 50μl (20μl genominės DNR ir 30 μl paruošto PGR mišinio). Prieš PGR reakciją, buvo vykdoma DNR inaktyvacija. Tam mėgintuvėliai su 20 μl DNR buvo 10 min kaitinami termocikleryje (Applied Biosystems, GeneAmp® PCR System 2700), 94°C temperatūroje. Po to toliau ruošiami PGR reakcijai, pridedant po 30 μl paruošto PGR mišinio. PGR mišinys vienam mėgintuvėliui susideda iš: 11,5 μl distiliuoto vandens, 5 μl buferio, 3 μl MgCl, 5 μl dNTP, 2 μl pradmens OB1, 2 μl pradmens OB2, 0,5 μl BSA ir 1 μl Taq polimerazės (Taq DNA polymerase (recombinant), 5 u/ μl, 100 u). PGR reakcijos sąlygos:
pradinė denatūracija 94°C – 3 min;
denatūracija 94°C – 45 s;
anilinimas 61°C – 45 s;
DNR sintezė 72°C – 45 s;
sintezės uţbaigimas 72°C – 5 min.
Reakcijai naudoti pradmenys OB1 (5’ – CGATAATTGGATCACATTTCT – 3‘) ir OB2 (5‘ – TGCAGTCTGTCTCCTCCAAA – 3‘). PGR metu amplifikuoto produkto dydis – 152 bp.
2.6. Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (RFLP) reakcija su HinfI restriktaze Restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo reakcija vykdyta 20 μl bendrame mėgintuvėlio tūryje su restriktaze HinfI (10 u/μl, 2000 u). 10 μl PGR produkto sumaišyta su 7,5 μl distiliuoto vandens, 2 μl buferio R (10x Buffer R su BSA 1ml) ir 0,5 μl HinfI restriktaze. Po to mėgintuvėliai vorteksuojami ir centrifiguojami 10s 13500 aps/min greičių, galiausiai paliekami termostate, 37°C temperatūroje, 16 – ai valandų. Po restrikcijos gauti fragmentų ilgiai: T alelis – 152 bp ilgio fragmentas, C – alelis du, 84 ir 68 bp ilgio fragmentai.
2.7. Elektroforezė
Elektroforezė buvo vykdoma 3% agarozės gelyje, 40 minučių prie 110 V įtampos. Į pirmą takelį automatine pipete įleidţiami 3 μl markerio (GeneRuler 100 bp, DNA Ladder 0,1 μg/μl). Į kitus gelio šulinėlius leidţiama po 10 μl PGR produkto po karpymo HinfI restriktaze kartu su 5 μl daţų (6x Loading dye solution). Rezultatai gelyje išryškinti ir nufotografuoti ultravioletinėje šviesoje su Bio-Imaging Systems (MiniBIS Pro) aparatu.
26 2.8. Statistinė analizė
Statistinė analizė atlikta statistiniu paketu SPSS 20 ir skaičiuokle Excel. Buvo apskaičiuoti lyginamų grupių tiriamųjų savybių vidurkiai ir vidurkių paklaidos. Įvertinti vidurkių skirtumo patikimumui skaičiuotas Stjudento statistinis kriterijus. Veiksnių (genotipas, veislė, kuilys) įtaka įvertinta daugiafaktorinės dispersinės analizės metodu.
Tirtai populiacijai apskaičiuoti genotipų ir alelių daţniai, taip pat įvertinta įtaka tokiems poţymiams kaip: visos šiltos skerdenos svoris ir išeiga bei šiltos skerdenos be galvos svoris ir išeiga; amžius esant 100 kg; priesvoris per parą; pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio; skerdenos puselės ilgis; bekono puselės ilgis; nugaros raumens plotas; kumpio masė; lašinių storis: ties 6-7 šonkauliu , ties 10 šonkauliu, už paskutinio šonkaulio, ties paskutiniu juosmens slanksteliu; pigloto duomenys: lašinių storis 1 taške, lašinių storis 2 taške, raumens storis, raumeningumas.
27 3. REZULTATAI
Leptino geno C3469T polimorfizmo analizė buvo atlikta 80 – čiai kiaulių, priklausančių trims mišrūnų veislėms: Jorkšyrų x Landrasų mišrūnams, Jorkšyrų x Landrasų x Landrasų mišrūnams ir Didţiųjų baltųjų x Landrasų x Landrasų mišrūnams.
Buvo aptikti abu aleliai, T ir C, taip pat visi galimi genotipų variantai. Gelio elektroforezės PGR-RFLP vaizdas pateiktas 5 – ame paveikslėlyje, matomi visi trys genotipų variantai: TT, TC ir CC.
5 pav. Leptino geno HinfI C3469T polimorfizmo vaizdas po polimerazės grandininės
reakcijos – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo (PGR-RFLP) analizės 3% agarozės gelyje. T alelis - 152 bp fragmentas, C alelis – 84 ir 68 bp fragmentai. M – markerio takelis (M = 100 bp); TT genotipas – 1, 2, 3, 5, 6, 7 ir 9 takeliai; TC genotipas – 8 ir 10 takeliai; CC genotipas – 4 takelis.
Po amplifikacijos gauto produkto dydis buvo 152 bp. Atlikus reakcija su HinfI, gauti trijų ilgių fragmentai: T alelis – 152 bp ilgio fragmentas, C – alelis du, 84 ir 68 bp ilgio fragmentai.
Toliau 1 - oje lentelėje pateikti apskaičiuoti genotipų daţniai tirtose kiaulių mišrūnų veislėse. Daţniausiai pasitaikantis genotipas buvo TT, jis nustatytas 72 - uose gyvuliuose 0,900 daţniu. Iš 21 - o Jorkšyrų x Landrasų mišrūno, šį genotipą turėjo 19, o jo daţnis buvo 0,905. Jorkšyrų x
28 Landrasų x Landrasų mišrūnų veislėje šis genotipas fiksuotas 0,971 daţniu ir nustatytas 33 - uose gyvuliuose. Galiausiai, TT genotipas Didţiųjų baltųjų x Landrasų x Landrasų mišrūnų veislėje fiksuotas 0,800 daţniu, 20 - yje gyvulių.
TC ir CC genotipai buvo aptikti rečiau. CC genotipas rastas tik viename Jorkšyro x Landraso mišrūne. Šioje veilėje CC genotipo daţnis sudarė 0,048, o bendras jo daţnis tirtoje imtyje buvo 0,013.
TC genotipas buvo šiek tiek daţnesnis nei CC, rastas visose trijose mišrūnų kiaulių veislėse, tirtoje populiacijoje jis aptiktas 7 - iuose gyvuliuose, o jo daţnis buvo 0,088. Jorkšyrų x Landrasų ir Jorkšyrų x Landrasų x Landrasų kiaulių mišrūnų veislėse, šį genotipą turėjo po vieną gyvulį,
atitinkamai 0,048 ir 0,029 daţniu. Didţiųjų baltųjų x Landrasų x Landrasų mišrūnuose šis genotipas pasitaikė daţniausiai, nustatytas penkiose kiaulėse, o jo daţnis 0,200.
1 lentelė. LEP geno genotipų daţniai tirtose kiaulių mišrūnų veislėse.
Veislė N TT Daţnis TC Daţnis CC Daţnis
Jorkšyrai x Landrasai 21 19 0,905 1 0,048 1 0,048 Jorkšyrai x Landrasai x Landrasai 34 33 0,971 1 0,029 0 0,000 Didţiosios baltosios x Landrasai x
Landrasai
25 20 0,800 5 0,200 0 0,000
Viso: 80 72 0,900 7 0,088 1 0,013
Tyrimų rezultatai parodė, kad T alelis tirtoje kiaulių populiacije paplitęs labiau nei alelis C. T alelio daţnis 0,944, tuo tarpu C alelis tirtoje kiaulių populiacijoje fiksuotas 0,056 daţniu. Nagrinėjant kiaulių mišrūnų veisles atskirai, pastebima panaši tendencija. Jorkšyrų x Landrasų mišrūnų veislėje T ir C aleliai buvo fiksuoti atitinkamai 0,929 ir 0,071 daţniu. Jorkšyrų x Landrasų x Landrasų kiaulių mišrūnų veislėje, situacija labai panaši, T alelis fiksuotas didţiausiu 0,985 daţniu, o C alelio daţnis buvo 0,015. Didţiųjų baltųjų x Landrasų x Landrasų kiaulių mišrūnuose T alelis fiksuotas maţiausiu, o C alelis didţiausiu daţniu, atitinkamai 0,900 ir 0,100. Rezultatai pateikti 2 – oje lentelėje.
29 2 lentelė. LEP geno alelių daţniai tirtose kiaulių mišrūnų veislėse
Veislė N T Daţnis C Daţnis
Jorkšyrai x Landrasai 21 39 0,929 3 0,071 Jorkšyrai x Landrasai x Landrasai 34 67 0,985 1 0,015 Didţiosios baltosios x Landrasai x Landrasai 25 45 0,900 5 0,100 Viso: 80 151 0,944 9 0,056
Heterozigotiškumo analizėje (3 lentelė) nustatyta, kad bendras tirtos populiacijos faktinis heterozigotiškumas buvo maţesnis nei teorinis, o tai rodo maţą genetinę įvairovę, tačiau rezultatas nėra statistiškai reikšmingas. Heterozigotiškumo rodiklis taip pat įvertintas ir kiekvienos veislės viduje.
Jorkšyrų x Landrasų kiaulių mišrūnų veislėje faktinis heterozigotiškumas gautas maţesnis nei teorinis, o rezultatas statistiškai patikimas. Jorkšyrų x Landrasų x Landrasų mišrūnų veislėje faktinis heterozigotiškumas nustatytas toks pat kaip teorinis, tačiau rezultatas nėra statistiškai reikšmingas. Tik, vienintelėje Didţiųjų baltųjų x Landrasų x Landrasų kiaulių mišrūnų veislėje faktinis heterozigotiškumas buvo didesnis nei teorinis, tačiau rezultatas nėra statistiškai patikimas.
3 lentelė. LEP geno heterozigotiškumo įvertinimo lentelė
Toliau atliekant statistinę analizę vieno paršo duomenys, su TT genotipu, buvo išbrokuoti, todėl skaičiavimams naudota imtis buvo N = 79. Statistiškai įvertinta kiekvieno genotipo įtaka kiaulių produktyvumo poţymiams, apskaičiavus vidurkius su standartine paklaida bei reikšmingumo koeficientus (4 lentelė).
Veislė H faktinis H teorinis p reikšmė (χ2)
Jorkšyrai x Landrasai 0,048 0,133 0,013 (8,629)
Jorkšyrai x Landrasai x Landrasai 0,029 0,029 0,996 (0,008) Didţiosios baltosios x Landrasai x Landrasai 0,200 0,180 0,857 (0,309) Viso: 0,088 0,106 0,290 (2,474)
30 4 lentelė. Genotipų įtaka kiaulių produktyvumo poţymiams.
Poţymis TT (N = 72) TC (N = 7) CC (N = 1) p Šilta skerdiena Visa Svoris, kg 74,3±0,14 74,5±0,62 76,4 0,753 Išeiga, % 74,3±0,11 74,5±0,6 76 0,692 Be galvos ir t. t. Svoris, kg 70,3±0,14 70,5±0,62 72,4 0,753 Išeiga, % 70,4±0,13 70,4±0,63 72 0,915 Amţius esant 100 kg, d 178,1±1,63 178,8±4,71 181,3 0,906 Priesvoris per parą, kg 780,8±11,91 735,5±40,04 917 0,261 Pašaršų sąnaudos 1 kg priesvorio 2,3±0,03 2,3±0,11 2,36 0,657 Skerdenos puselės ilgis, cm 96,1±0,39 95,9±0,95 98,4 0,831
Bekono puselės ilgis 77,6±0,47 79±0,98 80 0,354
Nugaros raumens plotas, cm2 40,6±0,79 38,9±1,45 37,8 0,499
Kumpio masė, kg 12,1±0,09 a 11,5±0,31 b 12,7 0,043 Lašinių storis, mm Ties 6-7 šonkauliu 16,7±0,69 a 21,7±2,28 b 16,8 0,031 Ties 10 šonkauliu 14,6±0,56 16,5±1,95 12,8 0,344 Uţ paskutinio šonkaulio 14,4±0,47 16,5±2,58 16,8 0,237
Ties paskut. Juosm. Slankst. 11±0,42 13,7±1,52 10,8 0,060 Piglogo duomenys Lašinių storis 1 taške, mm 13±0,29 13,6±0,61 12 0,582 Lašinių storis 2 taške, mm 11,8±0,26 12,7±0,68 13 0,313 Raumens storis, mm 51,6±0,79 51,4±1,53 51 0,950 Raumeningumas, % 58,6±0,28 57,9±0,52 58,4 0,450 a,b
– genotipai, tarp kurių nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas.
Statistiškai reikšmingų rezultatų nustatyta buvo labai maţai. Genotipo įtaka su aukštu patikimumo koeficientu nustatyta tik dviems poţymiams: kiaulių kumpio masei ir lašinių storiui
ties 6 – 7 šonkauliu. Kumpio masės poţymio TT genotipo vidurkis gautas 12,1 ± 0,09, TC genotipo
31 statistiškai reikšmingas, su patikimumo lygmeniu 0,043. Lašinių storiui ties 6 – 7 šonkauliu poţymiui TT genotipo vidurkis apskaičiavus buvo 16,7 ± 0,69, TC genotipo 21,7 ± 2,28. Taigi, TC genotipo kiaulių lašinių storis ties 6 – 7 šonkauliu 5 mm storesnis, šis skirtumas taip pat statistiškai reikšmingas, o patikimumo lygmens vertė 0,031.
Toliau, statistiškai įvertinta genetinių veiksnių įtaka kaiulių produktyvumo poţymiams (5 lentelė). Patikrinti tokie įtakos veiksniai: genotipo įtaka, veislės įtaka, kuilio įtaka, genotipo x veislės įtaka, genotipo x kuilio įtaka, veislės x kuilio įtaka. Vertinant genotipo x veislės x kuilio veiksnį jokios įtakos produktyvumo poţymiams neaptikta, todėl šie duomenys į lentelė neįtraukti.
5 lentelė. Genetinių veiksnių įtaka kiaulių produktyvumo poţymiams.
Poţymis\Veiksnys Genotip as Ve isl ė Ku il ys Genotip as x Ve isl ė Genotip as x Ku il ys Ve isl ė x Ku il ys Šilta skerdiena Visa Svoris, kg 5,09 6,65 14,48 0,12 12,74 * 2,38 Išeiga, % 5,67 9,06 15,57 0,42 21,46 *** 7,11 Be galvos ir t. t. Svoris, kg 5,09 6,65 14,48 0,12 12,74 * 2,38 Išeiga, % 3,44 7,30 14,54 0,17 14,32 ** 1,52 Amţius esant 100 kg, d 0,18 25,69 *** 40,48 *** 0,29 1,99 9,63 * Priesvoris per parą, kg 5,22 3,32 16,98 0,19 0,36 6,10 Pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio 0,61 7,84 41,35
***
0,13 3,15 22,63 *** Skerdenos puselės ilgis, cm 1,04 16,56
**
7,45 1,68 9,24 4,11
Bekono puselės ilgis 2,89 42,33 ***
3,10 1,81 3,26 3,45
Nugaros raumens plotas, cm2 1,13 6,92 18,60 0,12 3,53 3,96
Kumpio masė, kg 7,38 2,39 6,87 3,61 1,21 6,92 Lašinių storis, mm Ties 6-7 šonkauliu 8,12 15,12 ** 6,67 0,18 1,34 11,37 * Ties 10 šonkauliu 1,95 8,83 9,39 1,29 2,09 13,77 *
32 5 lentelės tęsinys. Poţymis\Veiksnys Genotip as Ve isl ė Ku il ys Genotip as x Ve isl ė Genotip as x Ku il ys Ve isl ė x Ku il ys Lašinių storis, mm Uţ paskutinio šonkaulio 2,83 3,25 9,90 5,11 3,51 7,67 Ties paskut. Juosm. Slankst. 5,97 3,19 9,43 0,52 2,99 12,43 * Piglogo duomenys Lašinių storis 1 taške, mm 0,88 4,17 6,44 1,68 0,95 16,13 ** Lašinių storis 2 taške, mm 2,33 6,24 11,09 0,19 1,75 17,11 ** Raumens storis, mm 0,02 3,34 9,62 1,76 2,20 2,87 Raumeningumas, % 0,96 5,61 5,50 0,35 1,12 11,68 * *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Kiaulių genotipo veiksnys statistiškai reikšmingai neįtakojo nė vieno produktyvumo poţymio. Tikrinant kiaulių veislės veiksnio įtaką išsiskyrė keturi rezultatai. Aukšto patikimumo lygmeniu (p < 0,001) įvertinti poţymiai: amžius esant 100 kg ir bekono puselės ilgis, atitinkamai įtakoja 25,69 proc. ir 42,33 proc. Vidutinis patikimumo lygmuo (p < 0,01) nustatytas poţymiams: kiaulių skerdenos puselės ilgis ir lašinių storis ties 6 – 7 šonkauliu, įtakoja atitinkamai 16,56 proc. ir 15,12 proc.
Kuilio veiksnio įtaka nustatyta dviems produktyvumo poţymiams su aukštu patikimumo lygmeniu (p < 0,001), tai amžius esant 100 kg ir pašarų sąnaudos 1 kg priesvorio. Šio veiksnio įtaka buvo atitinkamai 40,48 proc. ir 41,35 proc.
Toliau patikrintos įvairios veiksnių kombinacijos. Skaičiuojant genotipo x veislės veiksnio įtaka, statistiškai reikšmingų rezultatų negauta. Tuo tarpu, vertinant genotipo x kuilio veiksnį, gauti keturi patikimi rezultatai. Ţemiausias patikimumo lygmuo (p < 0,05) nustatytas kiaulių skerdenos svoriui visam bei be galvos ir t. t., veiksnio įtaka vienoda – 12,74 proc. Vidutiniu patikimumo lygmeniu (p < 0,01) minėto veiksnio įtaka įvertinta kiaulių šiltos skerdenos be galvos ir t. t. išeigos poţymiui. Veiksnys šį poţymį įtakoja 14,32 proc. Aukščiausiu patikimumo lygmeniu (p < 0,001) įvertinta visos kiaulių skerdenos išeiga. Genotipo x kuilio veiksnys šį poţymį įtakoja 21,46 proc.
33 Galiausiai apskaičiuota veislės x kuilio veiksnio įtaka. Čia statistiškai reikšmingų rezultatų gauta daugiausiai, net aštuoni. Ţemiausias patikimumo lygmuo (p < 0,05) nustatytas penkiems poţymiams: kiaulių amžiui esant 100 kg, lašinių storiui ties 6 – 7 šonkauliu, lašinių storiui ties 10 šonkauliu, lašinių storiui ties paskutiniu juosmens slanksteliu ir raumeningumui. Minėto veiksnio įtaka atitinkamai 9,63 proc., 11,37 proc., 13,77 proc., 12,43 proc., ir 11,68 proc. Vidutinis patikimumo lygmuo nustatytas (p < 0,01) dviems produktyvumo poţymiams, tai lašinių storis 1 taške ir lašinių storis 2 taške. Veiksnio įtaka įvertinta atitinkamai 16,13 proc. ir 17,11 proc. Na, o veisknio įtaka su aukščiausiu patikimumo lygmeniu nustatyta pašarų sąnaudoms 1 kg priesvorio poţymiui – 22,63 proc.
Amžiaus esant 100 kg poţymį įtakojo net trys veiksniai, tai veislė, kuilys ir veislė x kuilys. Tačiau didţiausią įtaką darė kuilys. Šio veiksnio įtaka poţymiui buvo 14,79 proc. didesnė nei veislės ir 30,85 proc. didesnė nei veislės x kuilio.
Pašarų sąnaudų 1 kg priesvorio poţymį įtakojo du veiksniai, tai kuilys ir veislė x kuilys. Čia ir vėl kuilio įtaka buvo didesnė, net 18,72 proc.
Lašinių storio ties 6 – 7 šonkauliu poţymį įtakojo taip pat du veiksniai – veislė ir veislė x kuilys, bet veislės veiksnio įtaka buvo 3,75 proc. didesnė.
34 4. REZULTATŲ APTARIMAS
4.1. LEP geno C3469T polimorfizmo genotipų ir alelių daţnių įvertinimas ir paplitimas tirtose kiaulių veislėse
Tirtoje kiaulų populiacijoje buvo nustatyti LEP geno C3469T polimorfizmo abu aleliai T ir C bei visų įmanomų kombinacijų genotipai. Tiesa, apskaičiavus daţnius, buvo stebimas nevienodas genotipų ir alelių pasiskirstymas.
Analizuojant kiaulių LEP geno C3469T polimorfizmo genotipus, gauti rezultatai atskleidė, jog populiacijoje dominuojantis genotipas buvo TT – N = 72, o kitų genotipų variantų aptikti vos keli: TC – N = 7, CC – N = 1. Dėl ryškaus kiekvieno genotipo imties skirtumo, atliekant statistinę analizę buvo sunkiau įvertinti tiriamo C3469T polimorfizmo įtaką produktyvumo poţymiams. Tikslesni rezultatai būtų gauti, jei skaičiuojant statistinius rodiklius, būtų paimtos vienodos visų genotipų imtys, ypač homozigotinių variantų. Tada aiškiau būtų matoma C alelio įtaka.
Daţniausiai pasitaikantis TT genotipas buvo nustatytas 0,900 daţniu. CC genotipas rastas tik viename mišrūne 0,013 daţniu, o TC genotipo daţnis buvo 0,088.
Kitų mokslininkų, tyrusių C3469T polimorfizmo įtaką kiaulių produktyvumo poţymiams, atliktų darbų rezultatai gana panašūs lyginant su mūsų, tai yra, taip pat nustatyta, kad dominuojantis populiacijos genotipas TT, o CC genotipas labai retas, arba kai kuriais atvejais jo išvis nepavyksta aptikti. Borges ir Goulart (2002) genotipavo 80 Didţiųjų baltųjų kiaulių ir gavo genotipų daţnius TT – 0,825, TC – 0,175, o CC genotipas nebuvo nustatytas. Tame pačiame darbe tiriant 53 Pjetrėnų veislės kiaules, genotipų pasiskirstymą gavo: TT – 0,906, TC – 0,075 ir CC – 0,019. Silveira, A. C. ir kt. (2008) moksliniame darbe buvo genotipuota 112 kiaulių, priklausančių dviems veislėms: Pjetrėnų ir Didţiųjų baltųjų. Čia genotipų daţniai buvo TT – 0,875, TC – 0,125, o CC genotipas tirtoje gyvulių grupėje neaptiktas. Stępień-Poleszak ir kt. (2009) tiriamoje L990 kiaulių populiacijoje taip pat aptiko tik du iš trijų galimų genotipų: TC ir TT. Didţioji dalis kiaulių turėjo TT genotipą (0.88), o heterozigotų daţnis buvo 0,12. Kitokius rezultatus gavo Amilis. M. ir kt. (2008), savo darbe ištyrę 320 Landrasų veislės kiaulių ir nustatę, kad tirtos populiacijos genotipų daţniai buvo TT – 0.521, TC – 0.398, CC – 0.081. Na, o Rybarczyk A. ir kt. (2010) pranešime, ištyrus 126 PIC mėsinių mišrūnų veislės kiaulių, visiems gyvuliams nustatytas tik TT genotipas. Kad CC genotipas retas, paţymi ir kiti darbai kur jo daţnis svyruoja tarp 0 ir 0,02 Lenkijos Landrasuose, Pjetrėnuose ir Didţiosiose baltosiose kiaulėse (Kuryl ir kt., 2003; Szydlowski ir kt., 2004).
35 Taigi, galime tvirtai teigti jog C alelio paplitimas yra labai maţas. Šiame atliktame tyrime T alelio daţnis kiaulių populiacijoje buvo 0,944, tuo tarpu C alelis tirtoje gyvulių grupėje tik 0,056. Panašius alelių daţnius: T alelio 0,94 ir C alelio 0,06, nustatė Stępień-Poleszak ir kt.(2009) tyrėjai. C alelis ţemu daţniu taip pat rastas Diurokių, Landrasų ir Jorkšyrų kiaulių veislėse (Kennes ir kt., 2001). Kolodziej, A. ir kt. (2009) savo darbe nustatė, kad T alelio daţnis buvo 0,9, o C alelio daţnis 0,1.
Nagrinėjant tirtos kiaulių grupės heterozigotiškumą, nustatyta jog bendras faktinis heterozigotiškumas yra maţesnis uţ bendtrą teorinį, o tai rodo maţą genetinę įvairovę. Šį rezultatą paremia ir apskaičiuoti alelių daţniai, kur matomas labai ţemas C alelio pasireiškimas.
4.2. LEP geno C3469T polimorfizmo poveikio tirtų kiaulių produktyvumo poţymiams įvertinimas
Statistinė analizė vertinant kiaulių genotipo įtaką buvo apsunkinta dėl nevienodo genotipų pasiskirstymo. Tačiau, vis tiek buvo gauti statistiškai reikšmingi skirtumai dviems kiaulių produktyvumo poţymiams, tai kumpio masei ir lašinių storiui ties 6 – 7 šonkauliu. Kiaulių kumpio masės poţymio TT genotipo vidurkis gautas 12,1 ± 0,09, TC genotipo 11,5 ± 0,31. TT genotipo kumpio masė maţdaug 0,6 kg didesnė nei genotipo TC ir šis skirtumas statistiškai reikšmingas, su patikimumo lygmeniu 0,043. Lašinių storiui ties 6 – 7 šonkauliu poţymiui TT genotipo vidurkis apskaičiavus buvo 16,7 ± 0,69, TC genotipo 21,7 ± 2,28. Taigi, TC genotipo lašinių storis ties 6 – 7 šonkauliu 5 mm storesnis, šis skirtumas taip pat statistiškai reikšmingas, o patikimumo lygmens vertė 0,031. Mūsų gauti rezultatai patvirtina, kad C alelis siejamas su padidėjusiu riebalų atsidėjimu kiaulių organizme, o kuo didesnis riebalų kiekis mėsoje, tuo didesnis ir cholesterolio kiekis, kuris yra svarbus vartotojo sveikatai. Tuo tarpu, TT genotipas pasiţymi geresnėmis mėsinėmis savybėmis, didţiausiu raumeningumu, todėl tokia mėsa yra vertingesnė sveikos mitybos atţvilgiu.
Nagrinėjant kitų autorių darbus, galima rasti, jog šio polimorfizmo įtaka taip pat menkai aptinkama, tai yra, statistiškai reikšmingas ryšys su genotipu nustatomas vos keliems produktyvumo poţymiams. Šios mutacijos ryšys su dominančiais kokybės rodikliais buvo ištirtas daugelyje kiaulių veislių, o gauti rezultatai gana kontraversiški.
Krenkowa ir kt. (1999) atliktame tyrime rado jog TT genotipas, lyginant su TC genotipu, siejamas su padidėjusiu augimo greičiu. Kulig ir kt. (2001) paţymėjo, jog Landrasų veislės gyvuliai su TC genotipu buvo charakterizuojami didesniu kiaulių mėsingumu nei TT genotipo.
Tačiau, Szydlowski ir kt. (2004) nerado jokio ryšio tarp LEP C3469T polimorfizmo genotipų ir bet kurio iš augimo bei riebumo poţymių, tirtų 120 Lenkijos kiaulių Landrasų populiacijoje, nors
