LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Nerijus Paulauskas
PLYŠINIŲ JUNGČIŲ KANALŲ,
SUFORMUOTŲ IŠ KONEKSINO BALTYMO,
JAUTRUMO ĮTAMPAI MODELIAVIMAS IR
EKSPERIMENTINIS TYRIMAS
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
biofizika (02B)
Disertacija rengta 2010-2015 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete Medicinos akademijos Kardiologijos institute.
Mokslinis vadovas
prof. habil. dr. Feliksas Bukauskas (Ješiva universitetas, Alberto Einšteino medicinos koledžas (JAV), biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
Konsultantas
prof. dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto biofizikos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkas
prof. dr. Algimantas Kriščiukaitis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
Nariai:
dr. Gytis Baranauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B) prof. dr. Artūras Kašauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, fiziniai mokslai, biochemija – 04P)
prof. dr. Vaidotas Marozas (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, elektros ir elektronikos inžinerija – 01T) prof. dr. Gintautas Grabauskas (Mičigano sveikatos sistemos universitetas (JAV), biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)
Disertacija bus ginama viešame biofizikos mokslo krypties tarybos posėdyje 2015 m. rugpjūčio 25 d. 10 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Simpoziumų salėje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Nerijus Paulauskas
VOLTAGE SENSITIVE GATING OF
CONNEXIN BASED GAP JUNCTION
CHANNELS: MODELING AND
EXPERIMENTAL STUDIES
Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,
Biophysics (02B)
Dissertation has been prepared at the Institute of Cardiology of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2010-2015.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. habil. Feliksas Bukauskas (Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University (USA), Biomedical Sciences, Biophysics – 02B)
Consultant
Prof. Dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B)
Dissertation is defended at the Biophysics Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Algimantas Kriščiukaitis (Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B)
Members:
Dr. Gytis Baranauskas (Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B)
Prof. Dr. Artūras Kašauskas (Medical Academy, Lithuanian University of Health Sciences, Physical Sciences, Biochemistry – 04P)
Prof. Dr. Vaidotas Marozas (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Electrical and Electronic Engineering – 01T)
Prof. Dr. Gintautas Grabauskas (University of Michigan Health System (USA), Biomedical Sciences, Biophysics – 02B)
Dissertation will be defended at the open session of the Biophysics Research Council at 10 AM on the 25th of August 2015 in the Symposium Auditorium
TURINYS
SANTRUMPOS...7
ĮVADAS...8
Darbo tikslas ir uždaviniai...9
Darbo aktualumas ir naujumas...9
1. LITERATŪROS APŽVALGA...11
1.1. Plyšinės jungties struktūra ir funkcijos...11
1.2. Tarpląstelinės sąveikos per plyšines jungtis reguliavimas biocheminėmis ir biofizikinėmis priemonėmis...13
1.2.1. PJ sąveikos reguliavimas biocheminėmis priemonėmis...13
1.2.2. PJ sąveikos reguliavimas biofizikinėmis priemonėmis...14
1.2.3. Jungties įtampai jautrių vartų reguliavimas...14
1.2.4. Membranos įtampai jautrių vartų reguliavimas...15
1.2.5. Įtampai jautrių vartų reguliavimo mechanizmai...15
1.3. Įtampai jautrių vartų modeliai...17
1.3.1. Boltzmann lygties panaudojimas aprašant PJ atsidarymo-užsidarymo proceso savybes...17
1.3.2. Homotipinių PJ keturių būsenų atsidarymo-užsidarymo savybių modelis...17
1.3.3. Homotipinių ir heterotipinių PJ keturių būsenų atsidarymo-užsidarymo savybių modelis...19
1.3.4. Stochastinis PJ keturių būsenų atsidarymo-užsidarymo savybių modelis...21
2. TYRIMŲ METODIKA...23
2.1. Tyrimuose naudotos ląstelės, jų transfekcijos, koneksino baltymų ir kultivavimo sąlygos...23
2.2. Elektrofiziologinis registravimas...23
2.3. Fluorescencinis vaizdinimas...24
2.4. Duomenų apdorojimas ir statistinė analizė...24
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...26
3.1. Stochastinis 16 būsenų modelis...26
3.1.2. Imitavimas makroskopiniame lygmenyje...27
3.2. Modelių realizacijos ir jų savybės...28
3.3. Modelių parametrų įvertinimas...33
IŠVADOS...39 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS...40 MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS...47 PADĖKA...109 SUMMARY...110 CURRICULUM VITAE...115
SANTRUMPOS
4SM (angl. – 4 State Model) – 4 būsenų modelis 16SM (angl. – 16 State Model) – 16 būsenų modelis Cx (angl. – Connexin) – koneksinas
DNR – deoksiribonukleorūgštis gj – jungties laidumas
Gmin – makroskopinis liekamasis laidumas
GO (angl. – Global Optimization) – globalus optimizavimas Ij – jungties srovė
p0 – atviro kanalo tikimybė
pHi – viduląstelinis pH
PJ – plyšinė jungtis
VA, VB – A ir B puskanalio įtampa
Vj – jungties įtampa
Vm – membranos įtampa
γFo, γFr – greitų vartų atviros ir liekamos būsenos laidumai
γSo, γSc – lėtų vartų atviros ir uždaros būsenos laidumai
ĮVADAS
1952 metais Hodgkin ir Huxley naudodami naujai sukonstruotą įtampos-varžos (angl. – voltage-clamp) įrangą bei registruodami selektyvų Na+ ir K+
jonų pralaidumą kalmaro aksone pirmą kartą kiekybiškai aprašė membranos srovę ir jos įtaką laidumui bei sužadinimui nervinėse ląstelėse ir sukūrė stiprius kompiuterinio modeliavimo pagrindus biologijoje [21-24]. Hodgkin ir Huxley pateikė kiekybinį veikimo potencialo aprašymą, modeliuojantį nelinijinių sistemų elgseną, kuris buvo plačiai pripažintas. Jų atliktų darbų pagrindu buvo sukurta įvairių matematinių modelių apibūdinančių skirtingus fiziologinius procesus [52].
Plyšinės jungties (PJ) kanalai, kaip ir joniniai kanalai, yra selektyvūs įvairiems jonams. Jonų ir kitų molekulių mažesnių nei 1 kDa molekulinio svorio perdavimas tarp kaimyninių ląstelių yra reguliuojamas įtampos, bei kitų medžiagų įtakojančių PJ kanalų vartų funkcines savybes. PJ atlieka svarbią funkciją įvairiuose biologiniuose procesuose tokiuose kaip vystymasis, diferenciacija, ląstelių sinchronizacija, neuronų aktyvumas ir imuninis atsakas. Mutacijos jose yra siejamos su įvairiomis odos ligomis, kurtumo ligomis ir vystymosi anomalijomis.
Ankstesniuose darbuose buvo sukurtas PJ kanalų vartinių savybių keturių būsenų modelis, kuris įvertino tiktai greitus vartus [46]. Šio darbo metu buvo praplėstas ir sukurtas 16 būsenų modelis, kuris apibūdina greitų ir lėtų vartų laidumo gj priklausomybę nuo jungties įtampos Vj [45]. Šis modelis
tiksliau imituoja PJ kanalų gj-Vj priklausomybę ir leidžia detaliau analizuoti
homotipinių bei heterotipinių PJ kanalų funkcines savybes. Sukurtos modelio realizacijos suteikia galimybę tyrinėti PJ kanalus vienetinio kanalo lygmenyje (stochastinis modelis), kinetikoje (stochastinis ir dinaminis modelis) bei pusiausvyros būsenoje (diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modeliai). Sukurto modelio rezultatai buvo lyginti realaus eksperimento sąlygomis matuojant tarpląstelinės sąveikos laidumą HeLa ląstelėse, transfekuotose įvairių Cx DNR, normaliomis ir patologinėmis sąlygomis, bei naudojant globalaus optimizavimo algoritmus įvertinant modelio parametrus [43, 49, 53, 54].
Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas buvo sukurti PJ kanalų modelius biofizikinėms savybėms tirti ir patikrinti jų adekvatumą su fizinių eksperimentų duomenis.
Šiam tikslui pasiekti buvo iškelti tokie uždaviniai:
1. Sukurti 16 būsenų modelį įvertinantį greitų ir lėtų vartų funkcines savybes.
2. Sukurti skirtingas 16 būsenų modelio realizacijas (stochastinį, dinaminį, diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinių modelius) bei įvertinti jų savybes ir trūkumus.
3. Sukurti GO algoritmų realizacijas (Exkor, PloN, PloR) bei įvertinti jų savybes ir trūkumus.
4. Fiksuotos įtampos-varžos (angl. – patch-clamp) metodu išmatuoti tarpląstelinio ryšio srovę HeLa ląstelėse, išreiškiančiose Cx43 ir Cx45 koneksinus, normaliomis ir patologijos sąlygomis (priklausomai nuo pHi, metabolinių inhibitorių ir pan.) bei apdoroti
ir paruošti duomenis parametrų įvertinimui.
5. Įvertinti modelio parametrus panaudojant GO algoritmus ir ląstelių, transfekuotų įvairių Cx DNR, eksperimentų duomenis.
Darbo aktualumas ir naujumas
PJ kanalo įtampos reguliavimo charakterizavimui yra plačiai naudojama Boltzmann funkcija laikantis prielaidos, kad PJ kanalo vartai funkcionuoja nepriklausomai vienas nuo kito ir turi dvi būsenas: atvirą ir uždarą [20, 57]. Nors ši funkcija gana tiksliai atspindi homotipinių kanalų gj-Vj
priklausomybę, tačiau nelabai tinka heterotipinių kanalų priklausomybei charakterizuoti. Šiai problemai spręsti buvo pasiūlytas keturių būsenų modelis, kuriame kiekvienas iš PJ kanalo puskanalių funkcionuoja nepriklausomai vienas nuo kito ir turi dvi būsenas: atvirą ir liekamą [10].
Šiuo metu yra žinoma, kad PJ kanalo vartai yra išsidėstę nuoseklioje elektros grandinėje, todėl vartai yra jautrūs ne visai jungties įtampai Vj, o
ant jų krintančiai Vj įtampos daliai priklausomai nuo jų laidumų. Tai reiškia,
kad vartų įtampos reguliavimas priklauso nuo kiekvieno iš vartų laidumų [7]. Taip pat buvo parodyta, kad PJ kanaluose egzistuoja greiti (perėjimo
tarp būsenų laikas ~1 ms) ir lėti (perėjimo tarp būsenų laikas ~10 ms) įtampos reguliavimo mechanizmai, o PJ kanalas yra sudarytas iš 2 greitų ir 2 lėtų vartų. Greitų vartų laidumas kinta tarp atviros būsenos laidumo γFo ir
liekamos būsenos laidumo γFr, o lėtų vartų laidumas kinta tarp atviros
būsenos laidumo γSo ir pilnai uždaros būsenos laidumo γSc [6]. Šie laidumai
gali rektifikuoti, t. y. jų reikšmės priklauso nuo įtampos krentančios ant kiekvieno iš vartų. Buvo parodyta, kad ši priklausomybė yra eksponentinė [65].
Nei vienas iš anksčiau sukurtų modelių nesugebėjo įvertinti minėtų PJ kanalų savybių. Boltzmann funkcija PJ kanalų gj-Vj priklausomybei
charakterizuoti yra naudojama daugiau nei 30 metų, nors ji pakankamai gerai aprašo PJ kanalų gj-Vj priklausomybę, tačiau jos parametrai neatitinka
realių fizikinių dydžių. Šiame darbe aprašytas modelis įvertina Vj įtampos
pasiskirstymą tarp skirtingų vartų, greitų ir lėtų vartų įtampos reguliavimo mechanizmus bei jų rektifikacijas. Sukurtos modelio realizacijos suteikia galimybę tyrinėti PJ kanalus vienetinio kanalo lygmenyje (stochastinis modelis), kinetikoje (stochastinis ir dinaminis modelis) ir pusiausvyros būsenoje (diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modeliai). Plyšinių jungčių vartinių savybių modeliai turi daug parametrų aprašančių jų charakteristikas, todėl šiam uždaviniui išspręsti buvo automatizuotas 16SM parametrų įvertinimas panaudojant GO algoritmus.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
Plyšinės jungtys (PJ) yra atsakingos už tarpląstelinę sąveiką ir yra labai svarbios daugeliui biologinių procesų. PJ yra kanalus formuojančios struktūros, kurių pagrindinė funkcija yra užtikrinti elektrinę sąveiką tarp ląstelių, jonų mainus, antrinių signalinių molekulių, mažų metabolitų pernešimą tarp ląstelių. PJ yra formuojamos iš koneksino ir ineksino baltymų. Koneksinai formuoja tarpląstelinius PJ kanalus stuburiniuose gyvūnuose [16, 19]. Bestuburiuose gyvūnuose PJ kanalai yra suformuoti iš ineksinų, tai dar viena baltymų šeima struktūriškai artima koneksinams [6, 48]. Ineksinų suformuoti PJ kanalai turi stebėtinai panašias funkcines savybes kaip ir koneksinų suformuotos PJ. Baltymai su panašia amino rūgščių seka ineksinams buvo rasti stuburiniuose gyvūnuose, kurie yra vadinami paneksinais, tačiau jie formuoja tiktai puskanalius, bet neformuoja PJ [11, 30, 44, 47]. PJ leidžia sujungtoms ląstelėms perduoti elektrinius ir metabolinius signalus kurie gali veikti kaip tarpląstelinių molekulinių signalų mediatoriai [19]. Iki šiol yra nustatyta, kad koneksino šeimą sudaro 20 narių pelės ir 21 žmogaus genome, iš kurių 19 gali būti grupuojamos ortologinės sekos poros [55]. PJ kanalai skiriasi elektriniu laidumu, pralaidumu įvairioms cheminėms medžiagoms ir kanalų vartų jautrumu įtampai [19]. PJ atlieka svarbią funkciją įvairiuose biologiniuose procesuose tokiuose kaip vystymasis, diferenciacija, ląstelių sinchronizacija, neuronų aktyvumas ir imuninis atsakas [25, 61]. Koneksinų mutacijos yra siejamos su odos ligomis, kurtumo ligomis ir vystymosi anomalijomis [25-27, 29, 59] [36, 66].
Elektrinio ir molekulinio signalizavimo per PJ kanalus svarba yra plačiai pripažinta. Jonų ir kitų molekulių mažesnių nei 1 kDa molekulinio svorio perdavimas tarp kaimyninių ląstelių yra reguliuojamas įtampos, bei kitų medžiagų įtakojančių PJ kanalų vartų funkcines savybes. Visos PJ suformuotos iš koneksino baltymo yra jautrios jungties įtampos skirtumui tarp ląstelių Vj, ir tik keletas iš jų gali būti jautrūs membranos įtampos
skirtumui Vm [17, 39]. Papildomai PJ kanalai gali būti reguliuojami
cheminiais veiksniais tokiais kaip fosforilinimas, pH ir Ca2+ [41].
1.1. Plyšinės jungties struktūra ir funkcijos
Jungiantis ląstelėms yra suformuojamos PJ jungtys, kuriose priešingų ląstelių puskanaliai sudaro PJ kanalus. PJ gali turėti nuo kelių dešimčių iki
kelių tūkstančių kanalų. PJ kanalas sudarytas iš dviejų puskanalių (koneksonų), suformuotų iš šešių Cx subvienetų (koneksinų). Koneksinai žymimi CxN, kur Cx – koneksino trumpinys (angl. – Connexin), N nurodo jo molekulinę masę išreikštą kilodaltonais (kDa), pvz.: Cx36 – koneksinas, kurio molekulinė masė yra apytiksliai 36 kDa.
Tarpląstelinėje sąveikoje dalyvaujančios PJ gali būti homotipinės (abi ląstelės išreiškia tą patį Cx tipą), heterotipinės (abi ląstelės išreiškia skirtingus Cx tipus) ir heteromerinės (bent viena ląstelė išreiškia du ar daugiau Cx tipų) (1.1.1 pav.) [50]. Koneksinai pakeisdami konformaciją gali atidaryti arba uždaryti puskanalį. PJ kanalai gali skirtis elektriniu laidumu, pralaidumu įvairioms cheminėms medžiagoms ir jautrumu įtampai.
Yra žinoma, kad koneksinai turi keturis alfa spiralinius transmembraninius domenus (TM1-TM4), viduląstelinius N (Amino) ir C (Karboksi) baltymo galus, dvi išorines kilpas (E1, E2) ir citoplazminę kilpą (CL) (1.1.1 pav.) [37]. Remiantis Cx26 koneksino erdvine struktūra kanalo
1.1.1 pav. PJ kanalo struktūra
(A) Plyšinės jungties ir jo kanalo struktūra. Priešingų ląstelių puskanaliai susijungdami suformuoja PJ kanalą. Puskanalio koneksinai pakeisdami konformaciją gali uždaryti arba atidaryti puskanalį. (B) Koneksino topologinis modelis. Koneksinas sudarytas iš keturių transmembraninių domenų TM1-TM4, išorinių kilpų E1 ir E2, viduląstelinių N ir C galų bei citoplazminės kilpos CL. Modifikuota pagal [55].
ilgis siekia ~160 Å, maksimalus skersmuo ~90 Å, o kanalo angos skersmuo membranoje siekia ~10-15 Å. TM1, TM2 ir E1 yra arčiau kanalo angos, o TM3, TM4 ir E2 yra puskanalio išorėje ir sąveikauja su ląstelės išorine aplinka (1.1.2 pav.) [37]. Šeši išsaugoti cisteino likučiai formuoja tris vidinius molekulinius disulfido ryšius tarp E1 ir E2 kilpų, kurie stabilizuoja ląstelės išorinio regiono struktūrą. Mutacijos juose gali sukelti funkcinių PJ kanalų praradimą [12, 13, 28].
1.2. Tarpląstelinės sąveikos per plyšines jungtis reguliavimas biocheminėmis ir biofizikinėmis priemonėmis
Šiuo metu yra daromos prielaidos, kad PJ kanalų aktyvavimas arba blokavimas biocheminėmis ar biofizikinėmis priemonėmis gal padėti gydant cukrinį diabetą, insultą, vėžį, šizofreniją ir pan. [14, 15, 32]. Tarpląstelinis laidumas gj priklauso nuo šių faktorių: PJ kanalų skaičiaus, kanalo laidumo
ir atviros būsenos tikimybės.
1.2.1. PJ sąveikos reguliavimas biocheminėmis priemonėmis
Kanalo atsidarymo-užsidarymo procesus (angl. gap junction gating) bei
1.1.2 pav. Cx26 kanalo erdvinė struktūra
(A) PJ kanalo suformuoto iš Cx26 koneksino erdvinės struktūros vaizdas skersai membranos paviršiaus. (B) Cx26 koneksino vaizdas iš citoplazminės pusės. Modifikuota pagal [37].
atviros būsenos tikimybę galima reguliuoti farmakologinėmis medžiagomis, kurios skirstomos į kanalus uždarančias – blokatorius (pvz.: alkoholiai, lakūs anestetikai, jonai (Na+, Ca2+, Mg2+, H+), rūgštys (natrio acetatas, CO
2
dujos ir pan.) bei kanalus atidarančias – aktyvatorius (pvz.: amonio chloridas, forbolo esteriai, trimetilaminas ir pan.). Plačiausiai paplitęs blokatorius yra heptanolis ir oktanolis. Tačiau parodyta, kad ir kiti trumpagrandžiai bei ilgagrandžiai alkoholiai blokuoja PJ laidumą priklausomai nuo naudojamų audinių ar ląstelių tipo bei sąlygų. Taip pat pastebėta, kad alkoholio blokavimo poveikis priklauso nuo grandinės ilgio, kuo ilgesnė alkoholio grandinė, tuo mažesnės koncentracijos reikia norint sukelti blokuojantį poveikį. Tarpląstelinė sąveika kinta priklausomai nuo Ca2+, Mg2+ ar H+ jonų koncentracijos, kurių padidėjimas paprastai sąlygoja
tarpląstelinės sąveikos mažėjimą per PJ.
1.2.2. PJ sąveikos reguliavimas biofizikinėmis priemonėmis
Visi PJ kanalai suformuoti iš skirtingų koneksinų arba ineksinų kaip ir dauguma joninių kanalų, yra jautrūs įtampai. PJ laidumą gj galima reguliuoti
keičiant įtampą tarp citoplazmos ir ląstelės išorės (transmembraninė įtampa – Vm) arba tarp dviejų ląstelių citoplazmų (jungties įtampa – Vj). Padavus
įtampą į vieną arba abi ląsteles susidaro menamos izopotencinės linijos, kurios susidaro PJ kanalo centre ir kanalo sienelėje. Kai membranos įtampa bus lygi abiejose ląstelėse, tuomet elektrinis laukas E bus orientuotas visoje kanalo sienelėje. Kai Vm bus skirtinga abiejose ląstelėse susidaro jungties
įtampa Vj [7]. Vienetinio kanalo laidumas priklauso nuo koneksino izotipo.
Pavyzdžiui PJ kanalo suformuoto iš Cx36 vienetinio kanalo laidumas yra 10 pS [33, 56, 58], o Cx37 kanalo laidumas gali siekti net 300 pS [62]. Viso kanalo laidumas gali būti apskaičiuojamas naudojant puskanalių laidumus ir darant prielaidą, kad jie veikia nuoseklioje elektros grandinėje.
1.2.3. Jungties įtampai jautrių vartų reguliavimas
PJ kanalai gali būti reguliuojami jungties įtampa Vj, o kai kurie
koneksinai gali būti reguliuojami membranos įtampa Vm [1, 7, 17]. PJ
kanalų reguliavimas nuo Vj priklauso nuo kanalo koneksinų tipo, kurie
skiriasi jautrumu įtampai, kinetika ir užsidarymo poliškumu. Daugumos homotipinių PJ laidumas yra didžiausias kai jungties įtampa yra lygi 0 mV, ir laidumas mažėja simetriškai iki liekamojo laidumo kuris yra 20%-25% atviros būsenos laidumo. Tokiu būdu formuojama simetrinė varpo formos gj-Vj priklausomybė, o heterotipinės PJ yra charakterizuojamos
asimetrinėmis varpo formos gj-Vj priklausomybėmis. Bendra PJ kanalų
savybė yra ta, kad nusistovėjusios būsenos laidumas gj nemažėja iki 0 pS
didėjant Vj, bet pasiekia liekamąjį laidumą, kuris skiriasi nuo maksimalaus
gj laidumo ~5%-~40% priklausomai nuo Cx izoformos [7]. Įtampos
reguliavimo funkcijos yra mažai tyrinėtos, tačiau kai kuriuose koneksinuose gali sutapti su cheminiu reguliavimu nes citoplazminės kilpos CL sutrumpinimas pašalina jautrumą žemam pH ir įtampos reguliavimui [35, 51].
Ląstelėse išreiškiančiose Cx43 gaunama simetrinė gj-Vj priklausomybė
Vj=0 mV atžvilgiu dėl identiškų Vj jautrių vartų kiekviename puskanalyje
taip, kad kiekvienam Vj poliškumui PJ kanalų uždarymą galima priskirti
vienam arba kitam puskanaliui [7, 57]. Makroskopinis liekamasis laidumas Gmin atsiranda dėl lygiagretaus fiksuoto laidumo arba dėl vartų atsidarymo ir
užsidarymo perėjimo dažnio, susidarančio dėl nusistovėjusios atviro kanalo tikimybės p0>0.
1.2.4. Membranos įtampai jautrių vartų reguliavimas
PJ jautrumas Vj įtampai yra paplitęs tarp stuburinių ir bestuburių gyvūnų,
tuo tarpu Vm jautrumas yra retesnis tarp stuburinių gyvūnų. Vm
priklausomybė yra labiau paplitusi vabzdžių ineksinus išreiškiančiose ląstelėse ir labai retai aptinkama koneksinuose [7]. Vm jautrumas pirmą kartą
buvo aprašytas Chironomus seilių liaukose [40]. Šiuose tyrimuose buvo pastebėta, kad vienoda ir vienu metu vykstanti abiejų ląstelių hiperpoliarizacija privertė gj pasiekti maksimumą, tuo tarpu depoliarizacija
privertė gj nusileisti beveik iki 0 pS. Galiausiai buvo parodyta, kad
Drosophila melanogaster ir Aedes albopictus seilių liaukose egzistuoja sigmoidinė gj-Vm priklausomybę, kuri parodė didelį abiejų ląstelių gj
sumažėjimą laike [2, 63].
1.2.5. Įtampai jautrių vartų reguliavimo mechanizmai
Skirtingi įtampos reguliavimo mechanizmai pirmą kartą buvo pastebėti de novo PJ kanalų formavimesi po pradinio kontakto tarp dviejų vabzdžio ląstelių [8, 9]. Pirmi atsidarymai įvyko po ~30 s ir demonstravo lėtus jungties srovės perėjimus ~10-50 ms iš uždaros į atvirą būseną tęsiant greitą perėjimą ~1 ms iš atviros į liekamą būseną (1.2.5.1 pav.). Remiantis šiais eksperimentais autoriai padarė išvadą: PJ kanalai turi du skirtingus reguliavimo mechanizmus, greitą reguliuojamą Vj ir lėtą, kuris gali uždaryti
pilnai kanalą. Taip pat tolimesni tyrimai žinduolių ląstelėse parodė lėtų vartų reguliavimą jungties įtampa Vj [5-7, 17, 34, 62]. Du skirtingi reguliavimo
mechanizmai taip pat buvo parodyti nesuformuotuose puskanaliuose [61]. Greitų ir lėtų vartų reguliavimo mechanizmai gali turėti tą patį arba skirtingą poliškumą [4, 61]. Šie duomenys parodo skirtingų vartų reguliavimo mechanizmų egzistavimą ir jų išsidėstymą nuoseklioje elektros grandinėje (1.2.5.1 pav. B ir C). Yra manoma, kad greiti vartai įtakoja PJ kanalo laidumą prie mažesnių įtampų, o lėti vartai prie didesnių >50 mV, todėl lėti vartai yra ne visada matomi eksperimentuose (1.2.5.1 pav. D ir E).
1.2.5.1 pav. Greiti ir lėti vartai
(A) PJ vienetinių kanalų perėjimai Novikov ląstelėse išreiškiančiose Cx43 laike kanalų blokavimo su 100% CO2 ir atsiplovimo. (B-C) Schematinis greitų ir lėtų
vartų vaizdas. (D-E) Numanoma greitų ir lėtų vartų įtaka visam PJ kanalo laidumui. Modifikuota pagal [45] ir [7].
1.3. Įtampai jautrių vartų modeliai
1.3.1. Boltzmann lygties panaudojimas aprašant PJ atsidarymo-užsidarymo proceso savybes
Pirmasis modelis įtampai jautrių PJ kanalo vartų gj-Vj priklausomybei
charakterizuoti buvo pasiūlytas dar 1981 m. [20, 57], kuriame daroma prielaida, kad PJ kanalo vartai priklauso nuo viso kanalo įtampos Vj ir
uždaros būsenos vartų laidumas yra lygus 0 pS. Tuomet užsidarius vienam iš vartų, visa įtampa krenta ant uždarų vartų, o ant atvirų vartų ji yra lygi 0 mV. Perėjimai tarp būsenų yra priklausomi nuo kitų vartų, todėl šis modelis buvo pavadintas priklausomu modeliu. Šio modelio perėjimus galima pavaizduoti taip: uždara1 α1 β1atvira α2 β2uždara2
kur α1, α2, β1 ir β2 aprašo perėjimus tarp būsenų ir yra priklausomos nuo
jungties įtampos Vj.
Tie patys autoriai pasiūlė dar vieną modelį, kuriame daroma prielaida, kad kiekvienas iš PJ kanalo vartų priklauso nuo visos tarpląstelinės įtampos Vj nepriklausomai nuo jų būsenų. Šis modelis autorių buvo pavadintas
nepriklausomu modeliu [20, 57]. Modelio būsenų perėjimus galima pavaizduoti taip: uždara1 α1 β1atvira1 uždara2 α2 β2atvira2
kur α1, α2, β1 ir β2 aprašo perėjimus tarp būsenų ir yra priklausomos nuo
tarpląstelinės įtampos Vj.
1.3.2. Homotipinių PJ keturių būsenų atsidarymo-užsidarymo savybių modelis
Šis modelis aprašo PJ kanalų ir jų matematinio modeliavimo elektrofiziologiją. Dvigubo įtampos-varžos metodo taikymas ląstelių porų mėginiuose leidžia išsiaiškinti elektrines plyšinių jungčių bei jų kanalų savybes. Eksperimentų metu gauti duomenys vieno ir daugelio kanalų
lygyje leido apibendrinti PJ kanalo veikimo koncepciją.
Šis modelis sudarytas iš kanalo, kuris susideda ir dviejų nuosekliai sujungtų puskanalių (1.3.2.1 pav.). Kiekvienas puskanalis turi du skirtingus laidumus: γo ir γc. Kai puskanalis atidarytas, jo laidumas yra lygus γo,
uždaryto puskanalio atveju laidumas lygus γc. Kanalo funkcionavimas buvo
apibrėžtas keturiomis būsenomis: abu puskanaliai atidaryti – (HH), vienas puskanalis atidarytas kitas uždarytas – (HL) arba (LH) ir abu puskanaliai uždaryti (LL). Kanalui esant būsenoje (oc) arba (co), buvo laikoma, kad tai ta pati būsena. Šių būsenų neišskyrimas buvo didžiausias trūkumas modeliuojant homomerinius ir heterotipinius kanalus, kurie susideda iš puskanalių su skirtingomis elektrinėmis savybėmis [65].
Dėl to jis buvo modifikuotas darant prielaidą, kad puskanalis sudarytas ne iš vienų vartų, kuriam nustatomas bendras laidumas, o iš 6 vartų dar vadinamų subvartais (angl. – subgate) [64]. Tokiu būdu buvo imituojamas realus plyšinės jungties kanalas, kuriame 6 koneksinai pakeičiami modelyje į 6 subvartus.
Apibendrintas kanalo modelis naudojo įtampai jautrių vartų kitimą pereinant iš pagrindinės būsenos į uždarą. Priklausomai nuo įtampos poliškumo, vienas iš puskanalių pereina iš aukšto laidumo į žemo laidumo būseną ir atvirkščiai, tuo tarpu antras puskanalis lieka aukšto laidumo būsenoje. Ši elgsena modeliavo vieno kanalo varto būsenas (kiekviena vieno kanalo varto būsena vaizduoja vieno puskanalio vartų sužadinimą arba užsidarymą, kai kito puskanalio vartai yra nesužadinti arba atviri). Sužadintų vartų skaičius vaizduoja vieno kanalo varto būsenų skaičių. Vieno
1.3.2.1 pav. Rolfo Vogelio ir Roberto Veingarto PJ kanalo modelis
kanalo pagrindinė būsena žymima sub0, o uždara būsena – sub6 (1.3.2.2 pav.). Šiame paveiksle pavaizduoti du atvejai: pirmu atveju koneksinai Cx veikia nepriklausomai vienas nuo kito, antru atveju teigiama, kad koneksinai priklausomi vienas nuo kito.
1.3.3. Homotipinių ir heterotipinių PJ keturių būsenų atsidarymo-užsidarymo savybių modelis
Dar vienas modelis buvo pasiūlytas 2001 m. Jame daroma prielaida, kad
1.3.2.2 pav. PJ kanalo su 6 vartais puskanalyje schema
(A) Elektrinė schema kai koneksinai veikia nepriklausomai. (B) Elektrinė schema kai koneksinai veikia priklausomai. Modifikuota pagal [64].
kiekvienas puskanalis priklauso nuo įtampos krentančios ant viso kanalo. PJ kanalo perėjimus galima pavaizduoti šia schema:
Schemoje Ki(i = 1, 2, 3, 4) yra pusiausvyros konstantos kiekvienam
pereinamajam procesui aprašomos Boltzmann lygtimis. Kanalas gali užimti vieną iš keturių galimų būsenų: 1) O(oo) – abu vartai yra atviri 2) C1(co) –
kairys iš vartų yra uždaras, o dešinys yra atviras 3) C2(oc) – kur kairys iš
vartų yra atviras, o dešinys uždaras 4) C3(cc) – abu vartai yra uždari [10].
Pusiausvyros konstantos yra aprašomos Boltzmann lygtimis:
K1=eA1⋅(−V −V01)
K2=eA2⋅(V −V02)
K3=eA3⋅(−V −V03)
K4=eA4⋅(V −V04)
čia Ai yra įtampos jautrumo koeficientas, V0i – įtampa, prie kurios
laidumas pasiekia puse savo maksimalios reikšmės. Ženklai prie įtampos V yra neigiami K1 ir K3, bet teigiami K2 ir K4, nes vartai yra orientuoti kaip
1.3.4. Stochastinis PJ keturių būsenų atsidarymo-užsidarymo savybių modelis
Mūsų ankstesnių darbų metu buvo pasiūlytas 4SM, kuriame priešingai nei ankstesniuose modeliuose, vartų reguliavimas įtampa priklauso ne nuo visos Vj, bet VA ir VB, kur VA ir VB priklauso nuo Vj bei puskanalių A ir B
laidumų santykio, kuris savo ruožtu priklauso nuo vartų būsenos (oo, oc, co, cc). Kiekvienas jų funkcionuoja nepriklausomai ir gali būti dviejose būsenose: atviroje arba uždaroje [46]. Jungtis sudaryta iš N>>1 kanalų.
Per vieną modeliavimo žingsnį (sąlygiškai prilyginam 1 ms) kiekvienas puskanalis gali nepriklausomai pereiti iš atviros į uždarytą būseną su tikimybėmis P(Ao→c) ir P(Bo→c). P(Ac→o) ir P(Bc→o) yra perėjimo tikimybės iš
uždaros į atvirą būseną. Stacionarioje būsenoje Ac =K1·Ao , kur Ki(i = 1, 2)
yra pusiausvyros konstantos. Per laiko vienetą T vidutiniškai no→c kanalų
pereis iš o būsenos į c būseną ir no→c=Ao·T·P(Ao→c), kur Ao yra atidarytų
puskanalių skaičius. Per tą patį laiką nc→o kanalų pereis iš c būsenos į o
būseną ir nc→o=Ac·T·P(Ac→o), kur Ac yra uždarytų puskanalių skaičius.
Kadangi no→c=nc→o, iš to seka, kad P(Ac→o)=P(Ao→c)/K1.
Sakykime, kad P(Ac→o)+P(Ao→c)=κ, kur κ yra tikimybė, kad N·κ kanalų
pakeičia būseną kai K1=1. 1-κ yra tikimybė, kad kanalai išlieka toje pačioje
būsenoje. Tada P(Ac→o)·K1+P(Ac→o)=κ, P(Ac→o)=κ/(1+K1), P(Ao→c)=κ·K1/
(1+K1).
Tokiu principu veikiantis modelis gana tiksliai imituoja PJ kanalų atsidarymo-užsidarymo savybes. Modelis gali atkartoti eksperimentuose
matomą kinetiką kai per trumpas įtampos pakilimas gali praplėsti gj-Vj
priklausomybę kanalams nespėjant pasiekti pusiausvyros būsenos (1.3.4.1 pav. A ir B). Modelis gali gana tiksliai atkartoti homotipinių ir heterotipinių kanalų gj-Vj priklausomybes (1.3.4.1 pav. C ir D). Paveiksle galima matyti
imituojamus homotipinius Cx43/Cx43 kanalus bei heterotipinius Cx43/Cx45 ir Cx45/Cx43. Homotipiniuose kanaluose vartų poliškumas nėra matomas dėl priklausomybės simetriškumo, tačiau heterotipiniuose kanaluose poliškumo pokytis pakeičia vartų jautrumą priešingai įtampai (1.3.4.1 pav. D).
1.3.4.1 pav. Stochastinis keturių būsenų modelis
(A) Įtampos protokolas ir modelio imituota srovė. (B) gj-Vj priklausomybės gautos
trumpinant įtampos pakilimo laiką. (C) Parodo heterotipinių kanalų asimetrijos priklausomybę nuo vienetinio puskanalio laidumo. (D) Įtampos reguliavimas su skirtingais puskanalių poliškumais. Modifikuota pagal [46].
2. TYRIMŲ METODIKA
2.1. Tyrimuose naudotos ląstelės, jų transfekcijos, koneksino baltymų ir kultivavimo sąlygos
Eksperimentai buvo vykdomi naudojant HeLa ląsteles (žmogaus gimdos kaklelio vėžinės ląstelės) transfekuotas skirtingomis Cx izoformomis. Tyrimams buvo naudotos ląstelės stabiliai gaminančios laukinio tipo (wt, angl. – Wild Type) koneksinus sulietus C gale su žaliai floresuojančiu baltymu (EGFP) [60]. EGFP, HeLaCx47-EGFP ir HeLaCx36-EGFP transfektantai gauti naudojant pCx36HeLaCx36-EGFP-P, pCx47HeLaCx36-EGFP-P ir pCx36EGFP-P/M1-M14 plazmidinius vektorius [60] bei “Lipofectamine® 2000” (Life Technologies, Niujorkas, JAV). Transfekcija buvo atliekama laikantis gamintojo nurodymų. Stabilios ląstelių linijos atrinktos pagal EGFP fluorescensiją bei matomas PJ plokšteles. Ląstelės kultivuotos DMEM terpėje, turinčioje 10% jaučio vaisiaus serumo (FBS), penicilino/streptomicino mišinio (100 U/ml penicilino ir 100 μg/ml streptomicino; Gibco Laboratorines) ir puromicino 1 μg/ml (transfekuotų ląstelių palaikymui). HeLa ląstelių linijos turinčios wt mCx30.2, Cx36, Cx45, Cx47 ir Novikov ląstelių linija turinti viduląstelinį Cx43 buvo gautos iš dr. K. Willecke (Bonos universitetas, Gyvybės ir medicinos mokslų institutas, Bona, Vokietija) ir dr. R.G. Johnson (Minesotos universitetas, Genetikos ir ląstelių biologijos skyrius, St. Paul, Minesota, JAV). Visos ląstelės laikytos 5% CO2 inkubatoriuje mažiausiai 8 valandas prieš
elektrofiziologinius ir vaizdinimo eksperimentus. Detalesnė informaciją apie ląstelių transfekcijų procedūras rasite [3].
2.2. Elektrofiziologinis registravimas
Tuo pat metu vykdytai elektrofiziologinei ir fluorescencinei registracijai ląstelės buvo sėjamos ant dengiamųjų stiklelių, perkeliamos į eksperimentinę kamerą, įmontuotą ant invertuoto Olympus IX-70 mikroskopo platformos su vaizdo analizės sistema. Eksperimentai atlikti modifikuotame Krebs–Ringer (MKR) tirpale, susidedančiame iš: NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl2 (2 mM), MgCl2 (1 mM), gliukozės (5 mM),
piruvato (2 mM) ir HEPES (5 mM); tirpalo pH 7.4. „Patch“ pipetės buvo pripildytos tirpalo, susidedančio iš: KCl (140 mM), NaAsp (10 mM), MgATP (2 mM), MgCl2 (1 mM), CaCl2 (0,2 mM), EGTA (2 mM), HEPES
(5 mM); tirpalo pH 7,2; laisvojo [Ca2+]i =5×10−8 M. Ląstelės perfuzuotos
kambario temperatūroje su MKR tirpalu.
Eksperimentuose kur buvo tiriama viduląstelinio magnio jonų koncentracijos ([Mg2+]i) (0,01 - 10 mM koncentracijos) poveikis į
Cx36-EGFP PJ eliminavome MgATP ir keitėme MgCl2 koncentraciją vidiniame
“patch” tirpale. Laisvų jonų koncentracijos apskaičiavimui naudojome “Maxchelator” programą. Be minėtų komponentų kiekviename tirpale buvo 10 mM NaAsp, 5 mM TEA, 5 mM HEPES. Osmosiškumo skirtumai buvo subalansuoti naudojant skirtingas KCl koncentracijas bei tirpalai buvo titruojami su KOH iki pH = 7,2.
Tyrimai atlikti pasirinktose ląstelių porose naudojant dvigubą fiksuotos įtampos metodiką (angl. – dual whole cell patch-clamp). Eksperimento pradžioje abejuose ląstelėse buvo fiksuojama vienoda įtampa, V1=V2. Po to,
į vieną ląstelę paduodant ∆V1 įtampos impulsą, o antroje ląstelėje laikant
pastovią įtampą, buvo sukuriama tarpląstelinė įtampa, Vj=V1–V2=∆V1.
Antroje ląstelėje ∆Vj impulso registruojamas srovės pasikeitimas laiko
momentu yra lygus tarpląstelinei srovei, Ij=∆I2 . Tokiu būdu, gj=–Ij/Vj
(minusas nurodo, kad tarpląstelinė srovė registruojama antroje ląstelėje yra priešingos krypties nei pirmoje ląstelėje). Siekiant sumažinti varžos įtaką gj
matavimams, pipetės varža buvo palaikoma žemiau 3 MΩ. Signalai gauti ir analizuoti naudojant Dr. Trexler sukurtą programą ir A/D keitiklį (National Instruments, Austinas, Teksasas, JAV).
2.3. Fluorescencinis vaizdinimas
Ląstelių transfekuotų su koneksinais sujungtais su EGFP fluorescencijos signalais buvo gaunami naudojant “ORCA” skaitmeninę kamerą (Hamamatsu Corp., Niudžersis, JAV) valdoma “UltraVIEW” programos, skirtos vaizdinimui ir analizei (Perkin Elmer Life Sciences, Bostonas, Masačiusetsas, JAV). Tai leido atrinkti HeLaCx36-EGFP, HeLaCx36-EGFP ir kito tipo ląstelių poras formuojančias PJ plokšteles. Paprastai ląstelių poros be PJ plokštelių neturi elektrinio ryšio; gj yra aukštesnis ląstelių
porose turinčiose didesnes PJ plokšteles. EGFP sužadinimui ir emisijai buvo naudoti šviesos filtrai įmontuoti „Sutter“ filtrų karuselėje (LAMBDA 10-2).
2.4. Duomenų apdorojimas ir statistinė analizė
panaudota „Sigma Plot 10“ programa. Papildomam statistiniam įvertinimui buvo naudojamas „SPSS Statistics 17“ programinis paketas. Tiriamų parametrų matavimo reikšmių vidurkiai ir jų patikimumas buvo įvertintas taikant standartinį „SigmaPlot 10“ programinį paketą. Siekiant įvertinti PJ vartų atsidarymo-užsidarymo proceso pokyčius, eksperimentinės gj-Vj
priklausomybės buvo priderintos naudojant stochastinius keturių ir šešiolikos būsenų modelius atitinkamai 4SM ir 16SM [45, 46]. Skirtumai tarp vidurkių buvo statistiškai patikimi kai p<0,05.
Modelių realizacijos programinė įranga, skirta asmeniniams kompiuteriams, buvo kurta naudojant Microsoft .NET C# programavimo kalbą. Programinė įranga paskirstytoms skaičiavimo sistemoms buvo kurta naudojant C++ programavimo kalbą, kartu su MPI (angl. – Message Passing Interface) programavimo sąsaja [18].
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Stochastinis 16 būsenų modelis
Ankstesniame keturių būsenų modelyje (4SM, angl. – 4 State Model) [46] buvo daroma prielaida, kad kanalas gali užimti vieną iš keturių būsenų: oo – abu vartai atidaryti su laidumais γo1 ir γo2 atitinkamai, oc – vienas iš
vartų atidarytas su atitinkamais laidumais γo1 ir γc1, co – vienas iš vartų
atidarytas su atitinkamais laidumais γc1 ir γo1, cc – abu vartai uždaryti su
atitinkamais laidumais γc1 ir γc2. Perėjimai tarp būsenų yra aprašomi
panaudojant pusiausvyros konstantas Ki(i=1, 2, 3, 4) [46]. Šis modelis
aprašo tiktai greitus vartus, nors yra žinoma, kad PJ kanalas turi du greitus ir du lėtus vartus, todėl buvo svarbu praplėsti ankstesnį modelį, kad būtų galima tiksliau aprašyti PJ kanalo įtampos reguliavimo mechanizmus. 16 būsenų modelyje (16SM, angl. – 16 State Model) kiekvienas puskanalis turi po du vartus: greitą ir lėtą. Greitų vartų laidumas kinta tarp atviros būsenos laidumo γFo ir uždaros būsenos liekamojo laidumo γFr, o lėtų vartų laidumas
kinta tarp atviros būsenos laidumo γSo ir uždaros būsenos laidumo γSc=0 pS
[45].
3.1.1. Imitavimas vienetinio kanalo lygmenyje
Stochastinis 16SM modelis leidžia imituoti PJ kanalus kinetikoje. Kiekvienas kanalas imitacinėje sistemoje veikia nepriklausomai vienas nuo kito ir atsitiktinai gali pakeisti būsenas su atitinkamomis tikimybėmis [45]. Toks veikimo principas leidžia matyti vienetinių kanalų būsenų perėjimus. Cx43 ir Cx43-EGFP eksperimento imitavimas yra pavaizduotas 3.1.1.1 pav. kai Cx43-EGFP greitas vartas yra visą laiką atviras. Tokia schema (3.1.1.1 pav. A) funkcionuojantys kanalai leidžia atskirti vieno kanalo perėjimus kinetikoje. Kai vienas greitas vartas yra visą laiką atviras, o abiejų puskanalių lėto varto laidumai yra lygūs 0 pS, rezultate galima atskirti tris būsenas: abu kanalai atviri, vienas kanalas uždaras ir abiejų kanalų vienas arba abu lėti vartai yra uždari (3.1.1.1 pav. B ir C) [45].
3.1.2. Imitavimas makroskopiniame lygmenyje
Makroskopiniame lygmenyje imituojami kanalai pavaizduoti 3.1.2.1 pav. Stochastinis 16SM modelis leidžia imituoti ne tik gj-Vj priklausomybes, bet
ir priklausomybes nuo laiko kurios matomos eksperimentuose (3.1.2.1 pav. A, B ir C). Padavus staigų įtampos šuolį yra matomi PJ kanalų perėjimas iš atviros į uždarą būseną laike iki PJ pasieks pusiausvyros būseną. Taip pat modelis leidžia matyti papildomas priklausomybes, kurių negalima pamatyti eksperimentuose. Labai svarbi yra vartų perėjimų tikimybių priklausomybės, kurios leidžia matyti kokią įtaką atskirų vartų įtampos reguliavimas turi bendrai PJ kanalo gj-Vj priklausomybei. Pagal [7] lėti
vartai pradeda atsidarinėti prie didesnių įtampų, o greiti vartai prie mažesnių įtampų (3.1.2.1 pav. E). Lėtų vartų įtraukimas praplečia gj-Vj priklausomybę
lyginant su keturių būsenų modeliu [45]. 16SM per trumpo laiko uždavimas įtampos pakilimui taip pat praplečia gj-Vj priklausomybę kaip ir 4SM atveju
(3.1.2.1 pav. G, H, I ir J). Atitinkamai 16SM modelis gali įvertinti greitų ir lėtų vartų rektifikaciją registruojamą eksperimentuose (3.1.2.1 pav. D) [45].
3.1.1.1 pav. Vienetinio Cx43/Cx43-EGFP kanalo reguliavimas
jungties įtampa
(A) Cx43-EGFP ir Cx43 principinė elektrinė schema. (B) Eksperimentiniai srovės Ij
įrašai į paduotą įtampą. (C) Imituoti Vj ir Ij įrašai naudojant du PJ kanalus.
3.2. Modelių realizacijos ir jų savybės
Ankstesniuose tyrimuose buvo sukurtas 4SM bei šio darbo metu sukurtas 16SM, kurie aprašo PJ kanalų laidumo gj priklausomybę nuo jungties
įtampos Vj [45, 46]. Kiekvienam iš šių modelių laidumo nuo įtampos gj-Vj
priklausomybės skaičiavimui yra sukurtos keturios, skirtingais principais veikiančios, modelio realizacijos: stochastinis, dinaminis, diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modeliai. Stochastiniai modeliai leidžia imituoti PJ kanalų gj priklausomybę nuo laiko, kas sukelia problemų
3.1.2.1 pav. 3000 PJ kanalų įtampos reguliavimas
(A) Įtampos protokolas. (B) Srovės priklausomybė nuo laiko prie atitinkamos įtampos. (C) Laidumo priklausomybė nuo laiko. (D) Laidumo rektifikacijos priklausomybė nuo įtampos. (E) Atviros būsenos tikimybės priklausomybė nuo įtampos. (F) Laidumo priklausomybė nuo įtampos (apskritimai) ir puskanalių laidumo priklausomybės nuo įtampos (kreivės). (G) Įtampos protokolas. (H, I) Srovės ir laidumo priklausomybė nuo laiko. (J) Laidumo priklausomybė nuo įtampos prie skirtingų įtampos pakilimo laikų. Modifikuota pagal [45].
susijusių su ilgu skaičiavimo laiku, triukšmo lygiu bei gj-Vj priklausomybe,
kuri ne visada pasiekia nusistovėjusią būseną. Kai kuriems tyrimams kinetika nėra aktuali, todėl buvo sukurti PJ Markovo grandinių modeliai, kurie leidžia tiesiogiai apskaičiuoti nusistovėjusią gj-Vj priklausomybę ir
taip sumažinti skaičiavimo laiką bei panaikinti stochastiniuose modeliuose gaunamą triukšmą.
Stochastinis modelis (3.2.1 pav juodos kreivės) veikia atsitiktinai diskrečiame laike. Šiame modelyje gj-Vj priklausomybė yra gaunama
imituojant kanalų aibę, kurių kiekvienas veikia nepriklausomai vienas nuo kito, t. y. imituojama atsitiktinė kanalo elgsena. Toks principas leidžia tirti PJ kanalus vienetinio kanalo ir makroskopiniame lygmenyje [45]. Dinaminis modelis (3.2.1 pav. pilkos kreivės) veikia panašiai kaip ir stochastinis, tik jame kanalai neegzistuoja fiziškai ir jo veikimo laikas nepriklauso nuo kanalų skaičiaus, bei negeneruoja triukšmo rezultate. Jis skaičiuoja perėjimo tikimybes dinamiškai. Dinaminis modelis yra priklausomas nuo laiko ir kaip ir stochastinio modelio atveju ne visada gali pasiekti pusiausvyros būseną padavus per trumpą įtampos pakilimo laiką protokole. Šis modelis leidžia imituoti PJ kanalus tiktai makroskopiniame lygmenyje, tačiau skaičiavimo laiko atžvilgiu jis turi pranašumą lyginant su stochastiniu modeliu (3.2.1 ir 3.2.2 lentelė).
Kai kuriems atliekamiems tyrimams kinetika nėra aktuali, todėl buvo sukurti PJ Markovo grandinės modeliai, kurie leidžia paskaičiuoti nusistovėjusią gj-Vj priklausomybę ir taip sumažinti skaičiavimo laiką bei
visiškai panaikinti triukšmo lygį gaunamą stochastiniuose modeliuose. Taikant diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinių modelius (3.2.1 pav. mėlynos ir žalios kreivės) yra skaičiuojamos stacionarios tikimybės. Tai
3.2.1 pav. 4SM ir 16SM modelių palyginimas (N=1000)
(A) 4SM laidumo priklausomybės nuo jungties įtampos palyginimas. (B) 4SM srovės ir laidumo nuo laiko priklausomybės palyginimas. (C) 16SM laidumo priklausomybės nuo jungties įtampos palyginimas. (D) 16SM srovės ir laidumo nuo laiko priklausomybės palyginimas. Juodos kreivės vaizduoja stochastinį modelį, pilkos – dinaminį, mėlynos ir žalios kreivės vaizduoja diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modelius.
leidžia įvertinti nusistovėjusią gj-Vj priklausomybę nepriklausomai nuo
kanalų skaičiaus N. Nors diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinių stacionarių tikimybių skaičiavimo algoritmai skiriasi, jų gautos kreivės beveik identiškos. 4SM skirtumo tarp šių modelių nėra, tačiau 16SM laidumo priklausomybės nuo įtampos modulių skirtumas tarp jų neviršijo 1.4·10-13.
4SM homotipinių kanalų palyginimas pavaizduotas 3.2.1 pav. A ir B naudojant šiuos parametrus: A=0.1 mV-1, V
0=35 mV, γFo=1 pS, γFr=0.1 pS ir
Pr=0.05. Nors stochastinio ir dinaminio modelio sutapatint negalim dėl
stochastinio modelio atsitiktinumo, kuris prideda papildomą triukšmą rezultate, tačiau iš grafikų matoma, kad šie modeliai vizualiai sutampa. Kalbant apie diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modelius jų rezultatų sutapimas yra identiškas, modulių skirtumas tarp priklausomybių yra lygus 0.
16SM homotipinių kanalų palyginimas pavaizduotas 3.2.1 pav. C ir D naudojant šiuos parametrus: AF=0.12 mV-1, AS=0.12 mV-1, V0F=20 mV,
V0S=20 mV, γFo=1 pS, γSo=1 pS, γFr=0.1 pS, γSc=0.001 pS, PrF=0.05 ir
PrS=0.05. Kreivėse yra matoma, kad šie modeliai vizualiai sutampa, o
diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modelių sutapimas yra beveik identiškas, mažiausių kvadratų skirtumas tarp jų yra lygus 1.4·10-13.
Kreivių skirtumas tarp stochastinio ir Markovo grandinių modelių matomas 3.1.2.1 paveiksle susidaro dėl užduoto per trumpo įtampos pakilimo laiko protokole. Markovo grandinių modelių atveju per trumpas laikas neturi įtakos rezultatui, nes jie skaičiuoja nusistovėjusias tikimybes. Atitinkamai įtampos protokolas gali būti ženkliai sumažinamas, nes šie modeliai nepriklauso nuo laiko ir prie tos pačios įtampos laidumas bus visą laiką vienodas.
Modelių skaičiavimo laikai yra pateikti 3.2.1 ir 3.2.2 lentelėse. Dėl skirtingų veikimo principų jų tiesiogiai lyginti nekorektiška, nes stochastinis ir dinaminis modeliai aprašo sistemos kinetiką, o Markovo grandinės modeliai nusistovėjusią būseną. Iš įvertintų skaičiavimo laikų derėtų atkreipti dėmesį į tai, kad tolydaus laiko Markovo grandinės modelis veikia truputį greičiau nei diskretaus laiko modelis ir augant Markovo grandinės būsenų skaičiui skirtumas didėja. Dinaminis modelis skaičiuoja greičiausiai, tačiau jam reikia užduoti pakankamai ilgą laiko atžvilgiu įtampos protokolą, kad būtų galima apskaičiuoti nusistovėjusį laidumą. Dėl to skaičiuojant Markovo grandinių tikimybes skaičiavimus galima sutrumpinti nuo kelių iki
keliolikos kartų ir jie veiks daug greičiau nei dinaminis modelis.
3.2.1 lentelė. 4SM skaičiavimo laiko palyginimas (250000 kreipinių).
Nr. Stochastinis
(N=1000) Stochastinis(N=2000) Dinaminis Diskretauslaiko Tolydauslaiko
1. 56578 ms 111890 ms 937 ms 1515 ms 1484 ms 2. 56502 ms 111782 ms 968 ms 1453 ms 1468 ms 3. 56611 ms 112437 ms 953 ms 1499 ms 1515 ms 4. 56476 ms 111986 ms 937 ms 1531 ms 1484 ms 5. 56494 ms 111611 ms 952 ms 1452 ms 1468 ms Vidurkis: 56532.2 ms 111941.2 ms 949.4 ms 1490 ms 1483.8 ms
3.2.2 lentelė. 16SM skaičiavimo laiko palyginimas (250000 kreipinių).
Nr. Stochastinis
(N=1000) Stochastinis(N=2000) Dinaminis Diskretauslaiko Tolydauslaiko
1. 102235 ms 212736 ms 3124 ms 17828 ms 17656 ms 2. 102328 ms 204408 ms 3109 ms 17718 ms 17654 ms 3. 102358 ms 203409 ms 3109 ms 17827 ms 17749 ms 4. 102158 ms 203767 ms 3124 ms 17814 ms 17718 ms 5. 102359 ms 203892 ms 3109 ms 17781 ms 17656 ms Vidurkis: 102287.6 ms 205642.4 ms 3115 ms 17793.6 ms 17686.6 ms
Taip pat vertėtų paminėti tai, kad Markovo grandinių modelių skaičiavimo trukmė auga eksponentiškai didėjant būsenų skaičiui (3.2.2 pav. B). Dinaminis modelis yra mažiau priklausomas nuo būsenų skaičiaus, tačiau taip pat auga eksponentiškai. Tuo tarpu stochastinių modelių skaičiavimo trukmė auga tiesiškai. Plačiau apie Markovo grandinių modelių algoritmus bei jų sudėtingumus skaityti [49, 54].
3.3. Modelių parametrų įvertinimas
Pagrindinis šio darbo modelių kūrimo tikslas yra pagrįsti įvairias tarpląstelinių plyšinių jungčių veikimo prielaidas, pasinaudojant eksperimentiniais bei kompiuterinio modeliavimo rezultatais. Be to yra svarbu automatizuoti šį procesą ir pasinaudojant eksperimentiniais rezultatais įvertinti modelio parametrus. Modelio parametrų paieška yra labai svarbus uždavinys ji padėtų pagrįsti įvairias prielaidas ir surasti nežinomas reikšmes įvairiems kanalų tipams. Uždavinio esmę trumpai galima apibūdinti taip: tarkime turime eksperimentinius nufiltruotus duomenis ir reikia rasti imitacinio modelio parametrus su kuriais imitacijos ir eksperimento kreivių kvadratų arba modulių skirtumas bus mažiausias.
Parametrų optimizavimui pakanka stochastinio bei dinaminio modelio, nes jie realiau atspindi PJ funkcionavimą, tačiau jei optimizavimui kinetika nėra svarbi ir naudojami nusistovėjusios būsenos eksperimentiniai duomenys naudoti stochastinį arba dinaminį modelį yra neefektyvu. Visų pirma šiems modeliams reikia parinkti tokį įtampos protokolą, kad visą laiką būtų gaunama nusistovėjusi būsena. Tam tikslui įtampos protokolas yra ilginamas iki tol kol bus pasiekta nusistovėjusi būsena. Dėl to, vienos gj-Vj
priklausomybės arba iteracijos skaičiavimas pailgėja nuo kelių iki keliolikos kartų, ko pasekoje pailgėja ir globalios optimizacijos procesas, pvz. stochastinio 16SM parametrų įvertinimas gali užtrukti daugiau nei 10 val. Jei dinamika parametrų įvertinimui nėra svarbi, šiam uždaviniui efektyviau naudoti diskretaus ir tolydaus laiko Markovo grandinės modelius, kurių
3.2.2 pav. Skaičiavimo laiko priklausomybė nuo būsenų skaičiaus
(A) Stochastinio modelio skaičiavimo laiko priklausomybės nuo būsenų skaičiaus palyginimas naudojant skirtingą kanalų skaičių. (B) Dinaminio (mėlyna kreivė), diskretaus laiko (raudona kreivė) ir tolydaus laiko (žalia kreivė) skaičiavimo laiko priklausomybė nuo būsenų skaičiaus.
vykdymui nereikia laukti kol laidumo priklausomybė laike nusistovės, todėl kreipinių į modelį skaičius smarkiai sumažėja.
Parametrų optimizavimui buvo panaudoti jau egzistuojantys algoritmai (Monte Carlo, Bayes) bei sukurti nauji (Exkor, PloN, PloR). Tyrimai parodė, kad egzistuojantys algoritmai nebuvo tokie efektyvūs kaip Exkor algoritmas, kuris ir buvo plačiausiai naudojamas mūsų tyrimuose. Cx45 koneksino parametrų įvertinimo priklausomybės pavaizduotos 3.3.1 pav. surasti parametrai pavaizduoti 3.3.1 lentelėje. Šiems parametrams optimizuoti pakako <500 iteracijų (3.3.1 pav. B), kad pakankamai tiksliai atspindėtų eksperimentinius duomenis.
3.3.1 lentelė. PJ suformuotos iš Cx45 parametrai prie skirtingų pH
Nr. A1
(mV-1) (mV)V01 (pS)γo1 (pS)γr1 (mVA2-1) (mV)V02 (pS)γo2 (pS)γr2 N Mod.sk. R
1. 0.086 8 64 0.935 0.116 8 64 0.935 199 80145 0.992 2. 0.122 19.9 64 1.82 0.14 19.9 64 1.82 257 116955 0.997 3. 0.122 24 64 1.82 0.134 22.5 64 2.115 350 166899 0.998
3.3.1 pav. PJ suformuotos iš Cx45 koneksino parametrų įvertinimas
(A) gj-Vj priklausomybės modelio parametrų įvertinimas prie skirtingų pH
koncentracijų. Eksperimento (juodi taškai) ir diskretaus laiko Markovo grandinės (raudonos kreivės) GO proceso rezultatas. (B) GO modulių skirtumo priklausomybė nuo iteracijų skaičiaus. Juoda kreivė – modulių skirtumas prie kiekvienos iteracijos, raudona – optimalus modulių skirtumas.
Taip pat šio darbo metu buvo įvertinti eksperimentuose gautų Cx45 PJ kanalų gj-Vj priklausomybės prie skirtingų oktanolio koncentracijų [53],
naudojant stochastinį 4SM (3.3.2 pav.). Vienetinio kanalo laidumas buvo paimtas iš [42]. Iš surastų parametrų matome, kad jautrumas įtampai V0
mažėja, mažėjant oktanolio koncentracijai [53]. Naudojant Boltzmann lygtis eksperimentų rezultatų parametrų įvertinimui V0 gaunamas didesnis nei
4SM atveju, nes modelyje, skirtingai nei naudojant Boltzmann lygtis, vartai yra jautrūs ne visai Vj įtampai tačiau pasiskirsčiusiai įtampai tarp vartų.
4SM modelio dėka taip pat buvo paskaičiuotas funkcinių kanalų skaičius, kuris parodo funkcinių kanalų skaičiaus sumažėjimą didėjant oktanolio koncentracijai.
Panaudojant globalaus optimizavimo algoritmus bei stochastinį 16SM buvo įvertinami modelio parametrai homotipiniams Cx36 koneksinams (3.3.3 pav.) prie įvairių magnio koncentracijų, kurių rezultatai buvo pateikti [43]. Įvertintuose parametruose (3.3.2 lentelė) matomas ryškus greito varto VFo sumažėjimas, mažėjant Mg2+ koncentracijai, tuo tarpu lėto varto VSo liko
pastovus. Cx36 koneksinuose nebuvo pastebėta rektifikacija, todėl šiuo atveju ji nebuvo įvertinama. γFo, γFr ir γSo buvo paimti iš eksperimentinių
duomenų [31, 38]. Pagal tikimybių priklausomybes yra matoma, kad lėti vartai Cx36 veikia prie didelių Vj, todėl jie darė mažą įtaką viso PJ kanalo
gj-Vj priklausomybei.
3.3.2 pav. Cx45 PJ kanalo parametrų įvertinimas naudojant 4 būsenų stochastinį modelį
(A) Eksperimentinės ir modelio gj-Vj priklausomybės prie skirtingų oktanolio
koncentracijų. (B) Modelio parametrai surasti naudojant GO algoritmus. Modifikuota pagal [53].
3.3.2 lentelė. Stochastinio 16 būsenų modelio parametrai
Greiti vartai Lėti vartai
AF (mV-1) (mV)VFo (pS)γFo (pS)γFr (mV)RSr (mVAS-1) (mV)VSo (pS)γSo (pS)γSc Cx36 I 0.041 122 24 0.6 0.100 154 24 0 II 0.031 87 24 0.7 0.062 158 24 0 III 0.037 41 24 0.5 0.085 77 24 0 V 0.045 12 24 0.6 0.084 68 24 0 Cx47 I 0.30 40 220 11.2 296 0.99 131 220 0 II 0.20 34 220 7.0 322 0.10 124 220 0 III 0.14 27 220 6.2 272 0.09 103 220 0 V 0.16 21 220 6.2 210 0.11 86 220 0
3.3.3 pav. Cx36-EGFP reguliavimas Mg2+
(A, C) Laidumas kinta laike. (B, D) gj-Vj eksperimento ir stochastinio 16 būsenų
modelio priklausomybės naudojant GO surastus parametrus (3.3.2 lentelė). (E) Mg2+
koncentracija. (F) Normalizuotos gj-Vj priklausomybės prie skirtingų Mg2+
koncentracijų. (G, H, I) PJ kanalo tikimybių priklausomybės nuo įtampos prie atitinkamų koncentracijų. Modifikuota pagal [43].
Taip pat buvo įvertinami homotipinių PJ kanalų suformuotų iš Cx47 koneksino parametrai (3.3.2 lentelė) prie skirtingų Mg2+ koncentracijų (3.3.4
pav.) [43]. Pagrindinę įtaką Mg2+ koncentracijos pokytis daro greito varto
VFo, tuo tarpu jautrumo koeficientas AFo praktiškai nesikeičia. Pagal
tikimybių priklausomybes matoma, kad lėti vartai matuotame įtampos intervale neturėjo jokios įtakos gj-Vj priklausomybei, todėl Cx47 gali visai
neturėti lėtų vartų arba jie funkcionuoja prie didelių Vj įtampų prie kurių
3.3.4 pav. Cx47 reguliavimas Mg2+
(A) Normalizuotos gj-Vj priklausomybės kartu su stochastinio 16 būsenų modelio
priklausomybėmis gautomis įvertinus parametrus naudojant GO algoritmus (3.3.2 lentelė). (B) Mg2+ koncentracija. (C, D) Tikimybių priklausomybės prie atitinkamų
IŠVADOS
1. Naudojant 4SM, buvo galima parodyti, kad pokyčiai VFo gali
paaiškinti eksperimentuose fiksuotą pH moduliaciją Cx57 ir Cx45 koneksinuose. 16SM praplečia šias galimybes įskaitydamas 4 nuosekliai sujungtus vartus. Pateikti duomenys parodo, kad laipsniškas VSo sumažėjimas sumažina Gmin iki 0 bei susiaurina gj-Vj
priklausomybę [45].
2. 16SM parodė, kad γFr/γFo santykis yra ~4 kartus mažesnis nei
atitinkamas 4SM γr/γo santykis, kas parodo, kad greiti vartai daugiau
uždaro kanalo angą nei buvo nuspėta atsižvelgiant į γr/γo santykį. Tai
gali paaiškinti, kodėl nėra liekamos būsenos pralaidumo dažuose kurie prasiskverbia palikdami aukšto lygio elektrinį ryšį [45].
3. 16SM rektifikacija parodo, kad γr kinta didesniame intervale nei γo,
kas bent dalinai paaiškina būsenas registruotas vienetinio tarpląstelinio PJ kanalo lygmenyje [5, 8, 62]. Rektifikacija išreikšta homotipiniuose ir heterotipiniuose PJ kanaluose patvirtina gj,min
pakilimą PJ kanaluose išreiškiančiose Cx45 kai Vj>60 mV [45]. Ši
išvada sutampa su prieš tai atliktais tyrimais [46].
4. Eksperimentinių gj-Vj priklausomybių pritaikymas naudojant GO
algoritmus suteikia galimybę įvertinti kanalo parametrus, funkcionalių kanalų skaičių bei jo atviros būsenos tikimybės po-Vj
priklausomybę, kurių negalima išmatuoti naudojant eksperimentinius metodus.
5. Panaudojant tiesioginį 16 būsenų tikimybinį pasiskirstymą vietoj stochastinio galima apskaičiuoti gj-Vj priklausomybę tiesiogiai,
neįvertinant gj dinamikos kaip atsako į paduotą Vj protokolą, kas
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS
1. Bennett MV, Verselis VK. Biophysics of gap junctions. Semin Cell Biol. 1992. 3(1): 29-47.
2. Bukauskas F, Kempf C, Weingart R. Electrical coupling between cells of the insect Aedes albopictus. J Physiol. 1992. 448: 321-37. 3. Bukauskas FF, Bukauskiene A, Bennett MV, Verselis VK. Gating
properties of gap junction channels assembled from connexin43 and connexin43 fused with green fluorescent protein. Biophys J. 2001. 81(1): 137-52.
4. Bukauskas FF, Bukauskiene A, Verselis VK. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J Gen Physiol. 2002. 119(2): 171-85.
5. Bukauskas FF, Elfgang C, Willecke K, Weingart R. Biophysical properties of gap junction channels formed by mouse connexin40 in induced pairs of transfected human HeLa cells. Biophys J. 1995. 68(6): 2289-98.
6. Bukauskas FF, Peracchia C. Two distinct gating mechanisms in gap junction channels: CO2-sensitive and voltage-sensitive. Biophys J. 1997. 72(5): 2137-42.
7. Bukauskas FF, Verselis VK. Gap junction channel gating. Biochim Biophys Acta. 2004. 1662(1-2): 42-60.
8. Bukauskas FF, Weingart R. Multiple conductance states of newly formed single gap junction channels between insect cells. Pflugers Arch. 1993. 423(1-2): 152-4.
9. Bukauskas FF, Weingart R. Voltage-dependent gating of single gap junction channels in an insect cell line. Biophys J. 1994. 67(2): 613-25.
10. Chen-Izu Y, Moreno AP, Spangler RA. Opposing gates model for voltage gating of gap junction channels. Am J Physiol Cell Physiol. 2001. 281(5): C1604-13.
11. Chen J, Zhu Y, Liang C, Chen J, Zhao HB. Pannexin1 channels dominate ATP release in the cochlea ensuring endocochlear potential
and auditory receptor potential generation and hearing. Sci Rep. 2015. 5: 10762.
12. Dahl G, Levine E, Rabadan-Diehl C, Werner R. Cell/cell channel formation involves disulfide exchange. Eur J Biochem. 1991. 197(1): 141-4.
13. Dahl G, Werner R, Levine E, Rabadan-Diehl C. Mutational analysis of gap junction formation. Biophys J. 1992. 62(1): 172-80; discussion 180-2.
14. De Mello WC. Chemical communication between cardiac cells is disrupted by high glucose: implications for the diabetic heart. Exp Cell Res. 2015. 331(1): 232-8.
15. De Mello WC. Chemical Communication between Heart Cells is Disrupted by Intracellular Renin and Angiotensin II: Implications for Heart Development and Disease. Front Endocrinol (Lausanne). 2015. 6: 72.
16. Evans WH. Cell communication across gap junctions: a historical perspective and current developments. Biochem Soc Trans. 2015. 43(3): 450-9.
17. Gonzalez D, Gomez-Hernandez JM, Barrio LC. Molecular basis of voltage dependence of connexin channels: an integrative appraisal. Prog Biophys Mol Biol. 2007. 94(1-2): 66-106.
18. Gropp W, Lusk E, Doss N, Skjellum A. A high-performance, portable implementation of the MPI message passing interface standard. Parallel Comput. 1996. 22(6): 789-828.
19. Harris AL. Emerging issues of connexin channels: biophysics fills the gap. Q Rev Biophys. 2001. 34(3): 325-472.
20. Harris AL, Spray DC, Bennett MV. Kinetic properties of a voltage-dependent junctional conductance. J Gen Physiol. 1981. 77(1): 95-117.
21. Hodgkin AL, Huxley AF. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. J Physiol. 1952. 116(4): 473-96.
sodium conductance in the giant axon of Loligo. J Physiol. 1952. 116(4): 497-506.
23. Hodgkin AL, Huxley AF. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol. 1952. 117(4): 500-44.
24. Hodgkin AL, Huxley AF, Katz B. Measurement of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J Physiol. 1952. 116(4): 424-48.
25. Hu X, Ma M, Dahl G. Conductance of connexin hemichannels segregates with the first transmembrane segment. Biophys J. 2006. 90(1): 140-50.
26. Kamat PK, Kalani A, Metreveli N, Tyagi SC, Tyagi N. A possible molecular mechanism of hearing loss during cerebral ischemia in mice. Can J Physiol Pharmacol. 2015. 1-12.
27. Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, Lench NJ, Liang JN, Parry G, et al. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature. 1997. 387(6628): 80-3.
28. Levine E, Werner R, Dahl G. Cell-cell channel formation and lectins. Am J Physiol. 1991. 261(6 Pt 1): C1025-32.
29. Li L, Zhang W, Shi WY, Ma KT, Zhao L, Wang Y, et al. The enhancement of Cx45 expression and function in renal interlobar artery of spontaneously hypertensive rats at different age. Kidney Blood Press Res. 2015. 40(1): 52-65.
30. Maes M, Crespo Yanguas S, Willebrords J, Cogliati B, Vinken M. Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 2015.
31. Marandykina A, Palacios-Prado N, Rimkute L, Skeberdis VA, Bukauskas FF. Regulation of connexin36 gap junction channels by n-alkanols and arachidonic acid. J Physiol. 2013. 591(Pt 8): 2087-101.
32. Molica F, Meens MJ, Morel S, Kwak BR. Mutations in cardiovascular connexin genes. Biol Cell. 2014. 106(9): 269-93. 33. Moreno AP, Berthoud VM, Perez-Palacios G, Perez-Armendariz
EM. Biophysical evidence that connexin-36 forms functional gap junction channels between pancreatic mouse beta-cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005. 288(5): E948-56.
34. Moreno AP, Rook MB, Fishman GI, Spray DC. Gap junction channels: distinct voltage-sensitive and -insensitive conductance states. Biophys J. 1994. 67(1): 113-9.
35. Morley GE, Vaidya D, Samie FH, Lo C, Delmar M, Jalife J. Characterization of conduction in the ventricles of normal and heterozygous Cx43 knockout mice using optical mapping. J Cardiovasc Electrophysiol. 1999. 10(10): 1361-75.
36. Morton SK, Chaston DJ, Howitt L, Heisler J, Nicholson BJ, Fairweather S, et al. Loss of functional endothelial connexin40 results in exercise-induced hypertension in mice. Hypertension. 2015. 65(3): 662-9.
37. Nakagawa S, Maeda S, Tsukihara T. Structural and functional studies of gap junction channels. Curr Opin Struct Biol. 2010. 20(4): 423-30.
38. Nguyen LM, Pozzoli M, Hraha TH, Benninger RK. Decreasing cx36 gap junction coupling compensates for overactive KATP channels to restore insulin secretion and prevent hyperglycemia in a mouse model of neonatal diabetes. Diabetes. 2014. 63(5): 1685-97.
39. Nielsen MS, Axelsen LN, Sorgen PL, Verma V, Delmar M, Holstein-Rathlou NH. Gap junctions. Compr Physiol. 2012. 2(3): 1981-2035. 40. Obaid AL, Socolar SJ, Rose B. Cell-to-cell channels with two
independently regulated gates in series: analysis of junctional conductance modulation by membrane potential, calcium, and pH. J Membr Biol. 1983. 73(1): 69-89.
41. Oh S, Verselis VK, Bargiello TA. Charges dispersed over the permeation pathway determine the charge selectivity and conductance of a Cx32 chimeric hemichannel. J Physiol. 2008. 586(10): 2445-61.
42. Palacios-Prado N, Briggs SW, Skeberdis VA, Pranevicius M, Bennett MV, Bukauskas FF. pH-dependent modulation of voltage gating in connexin45 homotypic and connexin45/connexin43 heterotypic gap
junctions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. 107(21): 9897-902. 43. Palacios-Prado N, Hoge G, Marandykina A, Rimkute L, Chapuis S,
Paulauskas N, et al. Intracellular magnesium-dependent modulation of gap junction channels formed by neuronal connexin36. J Neurosci. 2013. 33(11): 4741-53.
44. Panchin Y, Kelmanson I, Matz M, Lukyanov K, Usman N, Lukyanov S. A ubiquitous family of putative gap junction molecules. Curr Biol. 2000. 10(13): R473-4.
45. Paulauskas N, Pranevicius H, Mockus J, Bukauskas FF. Stochastic 16-state model of voltage gating of gap-junction channels enclosing fast and slow gates. Biophys J. 2012. 102(11): 2471-80.
46. Paulauskas N, Pranevicius M, Pranevicius H, Bukauskas FF. A stochastic four-state model of contingent gating of gap junction channels containing two "fast" gates sensitive to transjunctional voltage. Biophys J. 2009. 96(10): 3936-48.
47. Penuela S, Bhalla R, Gong XQ, Cowan KN, Celetti SJ, Cowan BJ, et al. Pannexin 1 and pannexin 3 are glycoproteins that exhibit many distinct characteristics from the connexin family of gap junction proteins. J Cell Sci. 2007. 120(Pt 21): 3772-83.
48. Phelan P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochim Biophys Acta. 2005. 1711(2): 225-45.
49. Pranevicius H, Pranevicius M, Pranevicius O, Snipas M, Paulauskas N, Bukauskas FF. Continuous time Markov chain models of voltage gating of gap junction channels. Inf Technol Control. 2014. 2(43): 9. 50. Rackauskas M, Kreuzberg MM, Pranevicius M, Willecke K, Verselis VK, Bukauskas FF. Gating properties of heterotypic gap junction channels formed of connexins 40, 43, and 45. Biophys J. 2007. 92(6): 1952-65.
51. Revilla A, Castro C, Barrio LC. Molecular dissection of transjunctional voltage dependence in the connexin-32 and connexin-43 junctions. Biophys J. 1999. 77(3): 1374-83.
52. Schwiening CJ. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. J Physiol. 2012. 590(Pt 11): 2571-5.
