ŽLA-A ALELIŲ RYŠYS SU ŽPV INFEKCIJA IR GIMDOS KAKLELIO VĖŽIU Baigiamasis magistro darbas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Neringa Aleliūnienė

ŽLA-A ALELIŲ RYŠYS SU ŽPV INFEKCIJA IR GIMDOS KAKLELIO VĖŽIU Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Erika Skrodenienė

Kaunas, 2019 m.

TURINYS

SANTRAUKA ... .3

SUMMARY ... .5

PADĖKA, INTERESŲ KONFLIKTAS IR ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... .7

SANTRUMPOS ... .8

ĮVADAS ... .9

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1 Gimdos kaklelio vėžys... 11

1.2 Gimdos kaklelio vėžio epidemiologija ... 11

1.3 Gimdos kaklelio vėžio etiologija ... 13

1.3.1 Gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai ... 14

1.3.1.1 Egzogeniniai gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai ... 14

1.3.1.2 Endogeniai gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai ... 16

1.4 ŽLA ... 17

1.4.1 ŽLA genai, didinantys gimdos kaklelio vėžio išsivystymo riziką ... 18

1.4.2 ŽLA genai, mažinantys gimdos kaklelio vėžio išsivystymo riziką ... 19

1.5 Gimdos kaklelio vėžio patogenezė ... 21

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24

2.1 Tyrimo apimtis ... 24

2.2 Tyrimo metodai ... 24

2.2.1 Onkocitologinio gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu ... 24

2.2.1.1 Tepinėlio paruošimas ... 25

2.2.1.2 Tepinėlio mikroskopija ... 25

2.2.2 Žmogaus papilomos viruso aukštos rizikos genotipų nustatymas ... 26

2.2.3 Žmogaus leukocitų I klasės A antigeno nustatymas tiesioginiu sekai specifinių oligonukleotidų metodu... 27

2.3 Statistinė analizė ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

3.1 Tiriamųjų pasiskirstymas pagal citologinę diagnozę... 30

3.2 ŽLA-A alelių ryšys su gimdos kakelelio vėžiu ... 31

3.3 ŽLA-A alelių ryšys su ŽPV ... 36

IŠVADOS ... 41

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42

SANTRAUKA

Darbą atliko: Neringa Aleliūnienė.

Darbo pavadinimas: ŽLA-A alelių ryšys su ŽPV infekcija ir gimdos kaklelio vėžiu.

Tyrimo tikslas: Įvertinti ŽLA-A alelių ryšys su ŽPV infekcija ir gimdos kaklelio vėžiu.

Uždaviniai:

1. Nustatyti ŽLA-A alelių dažnį gimdos kaklelio vėžiu sergančioms ir sveikoms moterims.

2. Nustatyti ŽLA-A alelius didinančius ir mažinančius gimdos kaklelio vėžio riziką.

3. Nustatyti ŽLA-A alelių ryšį su ŽPV infekcija.

Metodai: Sveikoms ir sergančioms gimdos kaklelio vėžiu moterims buvo atliktas onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu, žmogaus papilomos viruso aukštos rizikos genotipų nustatymas ir žmogaus leukocitų antigenų I klasės A alelio nustatymas tiesioginiu sekai specifinių oligonukleotidų metodu.

Tyrimo objektas: Moterų, kurios lankėsi LSMU ligoninės Kauno klinikos Akušerijos ir ginekologijos klinikos konsultacijoje nuo 2017-08-01 iki 2018-10-31 dienos LSMUL KK Laboratorinės medicinos klinikoje atliktų klinikinių ir laboratorinių tyrimų duomenys.

Tyrimo rezultatai: Tyrime dalyvavo 44 (57,14 proc.) sveikos moterys, kurių amžiaus vidurkis buvo 49,07±11,29 ir 33 (42,86) moterys, sergančios gimdos kaklelio vėžiu, kurių amžiaus vidurkis buvo 54,64±13,96. Tiriamų moterų amžius skirtingose grupėse statistiškai reikšmingai nesiskyrė.

Moterims, sergančioms gimdos kaklelio vėžiu dažniausiai buvo nustatyti ŽLA-A*02 (16,9 proc.) ir ŽLA-A*03 (16,9 proc.) aleliai. Toliau sekė ŽLA-A*24 (9,1 proc.), ŽLA-A*11 (3,9 proc.), ŽLA-A*23 (3,9 proc.), ŽLA-A*30 (3,9 proc.), ŽLA-A*68 (3,9 proc.). Sveikoms moterims dažniausiai buvo nustatytas ŽLA-A*02 alelis (29,9 proc.). Taip pat dažniau buvo nustatyti ŽLA-A*03 (16,9 proc.) ir ŽLA-A*01 (10,4 proc.) aleliai. Toliau sekė ŽLA-A*24 (10,4 proc.), ŽLA-A*25 (6,5 proc.), ŽLA-A*11 (5,2 proc.) ir ŽLA-A*68 (5,2 proc.). ŽLA-A alelių dažnio skirtumas tarp sveikų ir sergančių gimdos kaklelio vėžiu moterų nebuvo statistiškai reikšmingas.

43 (55,84 proc.) tirtoms moterims buvo nustatyta ŽPV infekcija, o 34 (44,16 proc.) tirtoms

moterims ŽPV infekcija nustatyta nebuvo. Moterims, kurioms nustatyta ŽPV, dažniau buvo nustatytas

ŽLA-A*02 (23,4 proc.) alelis. Didesni dažniai nustatyti ir ŽLA-A*03 (22,1 proc.) bei ŽLA-A*01 (16,9

kurioms ŽPV nustatyta, dažniau nustatytas ŽLA-A*02 (23,4 proc.) alelis. Toliau sekė ŽLA-A*03 (11,7 proc.), ŽLA-A*01 (7,8 proc.), ŽLA-A*24 (7,8 proc.), ŽLA-A*11 (5,2 proc.). ŽLA-A alelių dažnio skirtumas tarp moterų, turinčių ŽPV infekciją ir jos neturinčių, nebuvo statistiškai reikšmingas.

Išvados:

1. Gimdos kaklelio vėžiu sergančioms moterims dažniausiai nustatyti aleliai buvo ŽLA-A*02 ir ŽLA- A*03. Sveikoms moterims dažniausiai nustatytas ŽLA-A*02 alelis.

2. ŽLA-A aleliai, didinantys ir mažinantys riziką išsivystyti gimdos kaklelio vėžį, nustatyti nebuvo.

3. Ryšys tarp ŽLA-A alelių ir ŽPV nenustatytas.

SUMMARY

Author. Neringa Aleliūnienė.

Title. Association of HLA-A alleles relation with HPV infection and cervical cancer.

Work aim. To appreciate the relation between HLA-A alleles, HPV and cervical cancer.

Tasks:

1. Identify HLA-A allele frequency in cervical cancer and healthy women.

2. Identify HLA-A alleles that increase and reduce the risk of cervical cancer.

3. Identify HLA-A allele association of HPV.

Methods. For healthy and cervical cancer women was performed an oncocytological cervical smear test using liquid based method, detection of high risk genotypes of human papillomavirus and detection of human leukocyte antigen class A allele by a direct sequence-specific oligonucleotide method. Statistical analysis of the survey data was performed by IBM SPSS Statistics 20 program. The statistically significant difference is considered to be p<0,05.

Objects. Women who visited LSMU Hospital Kaunas Clinics Clinic of Obstetrics and Gynecology from 2017-08-01 to 2018-10-31 clinical and laboratory data from LSMUL KK Laboratory Clinic.

Results. The study included 44 (57.14%) healthy women with a mean age of 49.07±11.29 and 33 (42.86%) women with cervical cancer with an average age of 54.64±13.96. There were no statistically significant differences in the age of the women in the study groups.

Among women with cervical cancer, HLA-A*02 (16.9%) and HLA-A*03 (16.9%) alleles were commonly identified. Higher frequencies were also found in HLA-A*24 (9.1%), HLA-A*11 (3.9%), HLA-A*23 (3.9 %), HLA-A*30 (3.9%), HLA-A*68 (3.9%). Among healthy women, HLA-A*02 (29.9%) was the most common. HLA-A*03 (16.9%), HLA-A*01 (10.4%), HLA-A*24 (10.4%), HLA- A*25 (6.5%), HLA-A*11 (5.2%) and HLA-A*68 (5.2%) alleles were also more frequently identified.

The difference in HLA-A allele frequency between healthy and cervical cancer women was not statistically significant.

Of the women investigated, 43 (55.84%) were HPV positive and 34 (44.16%) of HPV negative.

Among women HPV positive, the HLA-A*02 (23.4%) allele was commonly found. Higher frequencies

among HPV positive patient, the HLA*02 (23.4%) allele was commonly found. HLA-A*03 (11.7%), HLA-A*01 (7.8%), HLA-A*24 (7.8%) and HLA-A*11 (5.2%) alleles were also more frequently identified. The difference in HLA allele frequency among women HPV positive and negative was not statistically significant.

Conclusions:

1. The most common alleles were HLA-A*02 and HLA-A*03 in women with cervical cancer. The most common allele was HLA-A*02 in healthy women

2. HLA-A alleles have not shown to increase and reduce the risk of developing cervical cancer.

3. No associations were found between HLA-A alleles an HPV.

PADĖKA

Dėkoju baigiamojo magistro darbo vadovei doc. dr. Erikai Skrodenienei už visapusišką pagalbą rašant darbą bei Vaidai Didžiariekienei ir Irenai Mingailienei už pagalbą atliekant tyrimą.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui interesų konflikto nebuvo.

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

Tyrimas atliktas gavus LSMU Bioetikos centro leidimą Nr. BEC−LMB(M)−119, kuris

išduotas 2017-12-06.

SANTRUMPOS

AGUS – (angl. atypical glandular cells) atipinės nenustatytos kilmės liaukinio epitelio ląstelės.

ASC-US – (angl. atypical squamous epithelium of uncertain significance) atipinės nenustatytos kilmės plokščiojo epitelio ląstelės.

C – komplementas.

CIN – (angl. cervical intraepithelial neoplasia) gimdos kaklelio intraepitelinė neoplazija.

DNR – deoksiribonukleorūgštis.

FAS – (angl. cell surface death receptor) ląstelių paviršiaus mirties receptorius.

GS – galimybių santykis.

HSIL – (angl. high grade squamous intraepithelial lesion) žymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai.

HSV2  Herpes simplex-2 virusas.

IL – interleukinas.

INF-γ – interferonas gama.

LSIL – (angl. low grade squamous intraepithelial lesion) nežymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai.

MHC – (angl. major histocompatibility complex) pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas.

NILM – (angl. negative of intraepithelial or malignancy) nėra intraepitelinių pokyčių ar piktybinio naviko.

PGR – polimerazės grandininė reakcija.

PSO  Pasaulinė sveikatos organizacija.

SIL – (angl. squamous intraepithelial lesion) plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai.

SSO – sekai specifiniai oligonukleotidai.

TGF-β – (angl. tumor growth factor beta) beta navikų augimo faktorius.

TLR – (angl. Toll-Like Receptors) Toll tipo receptoriai.

TNF-α – (angl. tumor necrosis factor alpha) alfa navikų nekrozės veiksnys.

TNF-β – (angl. tumor necrosis factor beta) beta navikų nekrozės veiksnys.

ŽLA – (angl. human leukocyte antigen) žmogaus leukocitų antigenai.

ŽPV – (angl. human papillomavirus) žmogaus papilomos virusas.

ĮVADAS

Gimdos kaklelio vėžys yra ketvirtas dažniausiai moterims diagnozuojamas vėžys pasaulyje [1].

Nors daugiausiai sergamumo 100 000 gyventojų per metus atvejų registruojama mažiau išsivysčiusiose Afrikos šalyse [2], tačiau dar visai neseniai Lietuva pirmavo Europoje pagal susirgimų skaičių. Dabar galime sąlyginai pasidžiaugti, kad mūsų šalies rodikliai užima jau tik penktą vietą Europoje [3]. Tam reikšmės greičiausiai turėjo nuo 2004 m. Lietuvoje vykdoma gimdos kaklelio vėžio prevencinė programa. Net 80 proc. moterų galėtų pasveikti, jei vėžys ar ikivėžiniai pakitimai būtų nustatyti laiku [4]. Todėl labai svarbu, kad moterys dalyvautų šioje programoje, nes ankstyvose stadijose gimdos kaklelio vėžys nesukelia jokių simptomų.

Gimdos kaklelio vėžį ir ikivėžinius pakitimus dažniausiai sukelia žmogaus papilomos virusas (ŽPV) [58]. Šis virusas plita lytiniu keliu, tačiau tam, kad infekcija būtų ilgalaikė ir sukeltų gimdos kaklelio vėžį, turi dalyvauti daugiau veiksnių. Didelę reikšmę turi lytinio gyvenimo ypatumai, tokie kaip amžius, kuriame buvo pradėtas lytinis gyvenimas, lytinių partnerių skaičius, kontraceptinių preparatų vartojimas, didelis gimdymų ir abortų skaičius [917]. Iš išorinių veiksnių dar labai svarbus yra tabako rūkymas, nes prisideda prie ŽPV infekcijos sukeliamos kancerogenezės [911, 1316].

Daugelio ligų išsivystymui be išorinių veiksnių labai svarbūs ir endogeniniai veiksniai, kurie gali didinti riziką susirgti tam tikra liga arba kaip tik nuo jos apsaugoti. Vieni svarbiausių iš endogeninių veiksnių yra genetiniai veiksniai, kurie lemia tinkamą žmogaus imuninės sistemos funkcionavimą – žmogaus leukocitų antigenai (ŽLA). ŽLA dalyvauja antigenų (pvz. ŽPV) pateikime citotoksniams limfocitams ir limfocitams pagalbininkams, kurie dalyvauja priešvirusiniuose ir priešnavikiniuose imuniniuose procesuose. Esama duomenų, kad tam tikro ŽLA alelio turėjimas gali lemti polinkį sirgti įvairiomis ligomis arba priešingai – pasireikšti apsauginiu poveikiu nuo tos ligos [1821]. Tačiau duomenų apie ŽLA alelių reikšmę didinti ar mažinti polinkį susirgti gimdos kaklelio vėžiu yra nepakankamai.

Šiame darbe mes ieškojome ŽLA I klasės A lokuso alelių sąsajų su ŽPV infekcija ir gimdos

kaklelio vėžiu.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Įverinti ŽLA-A alelių ryšį su ŽPV ir gimdos kaklelio vėžiu.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti ŽLA-A alelių dažnį gimdos kaklelio vėžiu sergančioms ir sveikoms moterims.

2. Nustatyti ŽLA-A alelius, didinančius ir mažinančius gimdos kaklelio vėžio riziką.

3. Nustatyti ŽLA-A alelių ryšį su ŽPV.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Gimdos kaklelio vėžys

Gimdos kaklelio vėžys – tai piktybinis gimdos kaklelio epitelio navikas, atsirandantis gimdos kaklelyje, vėliau plintantis už gimdos kaklelio ribų į dubens audinius, bei metastazuojantis į kitus organus [5]. Gimdos kaklelio vėžio simptomai ligos pradžioje gali būti nereguliarus, tarpmenstruacinis ar po lytinių santykių pasireiškiantis kraujavimas; nugaros, kojų ar dubens skausmas; nuovargis, svorio netekimas, nors gali ir nepasireikšti jokių simptomų. Todėl šalyse, kuriose nėra gimdos kaklelio vėžio patikros programų ar jos vykdomos neaktyviai, ši liga nustatoma jau pažengusi ir išgyvenimo tikimybė būna nedidelė. Mokslininkų tegimu, beveik visos, gimdos kaklelio vėžiu sergančios, moterys galėtų pasveikti, jei pakitimai būtų nustatyti laiku [1, 4].

1.2 Gimdos kaklelio vėžio epidemiologija

Gimdos kaklelio vėžys yra vienas iš dažniausiai moterims diagnozuotų vėžio tipų visame

pasaulyje (užima ketvirtą vietą po krūties, kolorektalinio ir plaučių vėžio) [1]. Pagal pasaulinės vėžio

statistikos duomenis 2018 metais pasaulyje buvo nustatyti beveik 570 000 nauji gimdos kaklelio vėžio

atvejai (84 proc. naujų vėžio diagnozių pasaulyje) [2, 22]. Kaip matoma 1 paveiksle, daugiausiai (85

proc.) atvejų registruojama mažiau išsivysčiusiose šalyse. Jose sergamumas yra daugiau nei 20/100 000

gyventojų per metus – Pietų Afrikoje 43,1/100 000 gyventojų per metus, Rytų Afrikoje 40,1/100 000

gyventojų per metus, Vakarų Afrikoje 29,6/100 000 gyventojų per metus, Melanezijoje 27,7/100 000

gyventojų per metus, Vidurinėje Afrikoje 26,8/100 000 gyventojų per metus. Mažiausiai sergamumo

atvejų yra Vakarų Azijoje ir siekia tik 4,1/100 000 gyventojų per metus bei Australijoje ir Naujojoje

Zelandijoje, kurioje sergamumas yra 6,0/100 000 gyventojų per metus [2].

1 pav. Sergamumas gimdos kaklelio vėžiu pasaulyje 2018 metais pagal Pasaulio sveikatos organizaciją [2]

2018 metais pasaulyje buvo apie 311 000 mirties atvejų dėl gimdos kaklelio vėžio [22]. Kaip matoma 2 paveiksle, mirtingumas nuo gimdos kaklelio vėžio skirtingose pasaulio šalyse skiriasi daugiau nei 10 kartų. Australijoje ir Naujojoje Zelandijoje bei Šiaurės Amerikoje miršta mažiau nei 2/100 000 gyventojų per metus, o Rytų Afrikoje dėl gimdos kaklelio vėžio miršta net 30/100 000 gyventojų per metus [2].

2 pav. Mirtingumas nuo gimdos kaklelio vėžio pasaulyje 2018 metais pagal Pasaulio

sveikatos organizaciją [2]

2018 metais Europoje nustatyta apie 60 000 naujų gimdos kaklelio vėžio atvejų. Tai 6-asis dažniausiai pasitaikantis vėžys moterims Europoje. Kaip matoma 3 paveiksle, daugiausiai susirgimų nustatyta Baltijos ir Balkanų šalyse – >30/100 000 gyventojų per metus. Latvija užima pirmąją vietą visoje Europoje – 32,2/100 000 gyventojų per metus. Rytų Europoje sergamumas yra 22,5/100 000 gyventojų per metus, Vakarų Europoje – 9,6/100 000 gyventojų per metus, Šiaurės Europoje – 12,1/100 000 gyventojų per metus, Pietų Europoje – 11/100 000 gyventojų per metus. Visos Europos vidurkis 15,5/100 000 gyventojų per metus [3].

3 pav. Sergamumas gimdos kaklelio vėžiu 2018 metais Europoje [3]

Lietuvoje gimdos kaklelio vėžys yra antras moterims dažniausiai diagnozuojamas vėžys.

Higienos instituto Sveikatos informacijos centro, Lietuvos Sveikatos rodiklių duomenų bazės (SRS) duomenimis 2001–2012 metais sergamumas gimdos kaklelio vėžiu kito nežymiai. 2001 metais sergamumas buvo 28,3/100 000 gyventojų per metus. Pradėjus vykdyti prevencinę programą sergamumas padidėjo iki 32,3/100 000 gyventojų per metus. Vėlesniais metais sergamumas nežymiai mažėjo ir 2012 metais buvo 26,8/100 000 gyventojų per metus [23]. 2018 metais sergamumas buvo 26,6/100 000 gyventojų per metus (5 vieta Europoje) [3].

1.3 Gimdos kaklelio vėžio etiologija

Gimdos kaklelio vėžio etiologija nėra visiškai aiški. Žmogaus papilomos virusas (ŽPV) yra

vienas pagrindinių gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksnių, tačiau svarbūs ir kiti veiksniai. Tai gali būti

įvairūs infekciniai susirgimai, gyvenimo būdas, imuninės sistemos ypatybės ar genetiniai veiksniai

[511].

1.3.1 Gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai

1.3.1.1 Egzogeniniai gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai

Dažniausiai gimdos kaklelio vėžį sukelia žmogaus papilomos virusas [58]. ŽPV yra DNR virusas, priklausantis Papillomaviridae šeimai, kurią sudaro 5 pagrindinės gentys:

Alphapapillomaviruses, Betapapillomaviruses, Gammapapillomaviruses, Mupapillomaviruses ir Nupapillomavirus. ŽPV 16 ir 18 genotipai, sukeliantys intraepitelinę neoplaziją ir invazinę karcinomą, priklauso Alphapapillomaviruses genčiai, α7 ir α9 rūšims [24]. Pagal riziką sukelti gimdos kaklelio vėžį, ŽPV genotipai yra skirstomi į:

● mažos rizikos ŽPV genotipai (6, 11, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 61, 72, 73, 81);

● didelės rizikos ŽPV genotipai (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68) [25].

2008 metais Vokietijos virusologas prof. Harald zur Hausen gavo Nobelio premiją, nes 1983 metais nustatė, kad yra ryšys tarp didelės rizikos ŽPV infekcijos ir gimdos kaklelio vėžio išsivystymo [7]. 16 ir 18 ŽPV genotipai yra agresyviausi ir sukelia 70% visų gimdos kaklelio vėžio atvejų, likusius 30% sukelia kiti didelės rizikos ŽPV genotipai [6, 7]. Epiteliniuose gimdos kaklelio navikuose dažniausiai yra aptinkamas ŽPV 16 genotipas, o liaukiniuose – ŽPV 18 genotipas [15].

Infekcijos. Žmogaus papilomos viruso sukelta infekcija, bei kartu nustatytas infekuotumas Chlamydia Trachomatis, Herpes simplex-2 (HSV2) virusu labai padidina riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu [5, 13, 14, 26].

Chalmydia Trachomatis infekcijos įtaka didinant riziką išsivystyti gimdos kaklelio vėžiui manoma, kad yra susijusi su dviem mechanizmais. Dėl uždegiminio atsako į C. Trachomatis infekciją, padidėja citokinų, chemokinų, angiogeninių ir augimo faktorių ekspresija, susilpnėja ląstelinis imunitetas, atsiranda laisvųjų radikalų ir taip yra sutrikdomas imuninis atsakas ŽPV ir viruso pašalinimu.

Antras mechanizmas – C. Trachomatis pažeidžia gimdos kaklelio epitelio ląsteles ir taip palengvina žmogaus papilomos viruso patekimą į jas [27].

ŽPV ir Herpes simplex-2 virusai veikia sinergistiškai – HSV2 gali tiesiogiai sąveikauti su ŽPV

ir taip palengvinti jo integraciją ir amplifikaciją šeimininko ląstelėse – padidinti gimdos kaklelio vėžio

riziką. Šioms infekcijoms esant kartu, silpninamas vietinis imuninis atsakas ir tai leidžia išsivystyti

didesniems pažeidimams ląstelėse. Ląstelėse, pažeistose ŽPV 16 ir 18 genotipų, HSV2 gali paskatinti

kancerogenezę. Biologiniai eksperimentai įrodo, kad šio viruso genų produktai trukdo ląstelių ciklo

kontrolei, sukelia genetinių anomalijų kaupimąsi, lemia žmogaus genomo nestabilumą ir dalyvauja

piktybiniame ląstelių transformavime [28].

Lytinis gyvenimas. Moterims, anksti pradėjusioms lytinį gyvenimą (iki 16 metų) ŽPV infekcija nustatyta 36 proc. atvejų, o lytinį gyvenimą pradėjusioms vėliau – 27 proc. atvejų. Gimdos kaklelio gleivinė jaunesniame amžiuje yra lengviau pažeidžiama bei jautresnė lytiškai plintančioms infekcijoms, tarp jų ir ŽPV [17]. Gimdos kaklelio vėžys yra siejamas ir su lytinių partnerių skaičiumi. Moterims, turinčioms daug lytinių partnerių (≥5), yra 3–7 kartus didesnė rizika būti infekuotoms ŽPV ir susirgti gimdos kaklelio vėžiu [9, 12, 13, 16].

Rūkymas. Tabako dūmuose esantys kancerogenai (apie 4000) prisideda prie ŽPV infekcijos kancerogenezės. Nikotinas arba tabako dūmai sukelia DNR metiltrasferazių ekspresiją, yra metilinamas (išjungiamas) auglio slopinimo genas p16, bei slopinamas moters imunitetas virusinei infekcijai – mažėja T limfocitų, natūraliųjų kilerių, gimdos kaklelio epitelyje mažėja Langerhanso ląstelių, ko pasekoje organizmas sunkiau kovoja su ŽPV infekcija [911, 13-16, 29].

Kontraceptikų vartojimas. Vartojant oralinius kontraceptikus ilgiau nei 10 metų, rizika susirgti gimdos kaklelio vėžiu padidėja 4 kartus. Kontraceptiniuose preparatuose esantys estrogenai skatina ŽPV 16 tipo E6 ir E7 genų raišką, o šie genai sąlygoja gimdos kaklelio vėžio atsiradimą ir augimą [9-11, 13-16, 30].

Didelis gimdymų skaičius siejamas su laikinai vis padidėjančiu estrogenų kiekiu, kurie kaip anksčiau minėta, sąlygoja gimdos kaklelio vėžio vystymąsi [911, 1316].

Didelis abortų skaičius lemia gimdos kaklelio gleivinės traumavimą – dėl to padidėja ŽPV infekcijos tikimybė [911, 1316].

Socialinė padėtis. Skurdas yra stiprus veiksnys, kuris įtakoja prieigą prie švietimo, sveikatos

priežiūros paslaugų. Sergamumas ir mirtingumas nuo gimdos kaklelio vėžio visame pasaulyje

pastebimas didesnis ten, kur žmonės gyvena skurdžiau. Tai lemia sudėtingesnį švietimo ir sveikatos

paslaugų prieinamumą. Išsilavinimo lygis yra glaudžiai susijęs su dalyvavimu vėžio patikros

programose ir sąmoningumu lytinių santykių atžvilgiu [31].

1.3.1.2 Endogeniniai gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai

Imunosupresija, genetiniai imuniteto defektai. Esant susilpnėjusiam ar nepilnaverčiam imuniniam atsakui, organizmas nesugeba kovoti su ŽPV infekcija, virusas lieka persistuoti ir dėl to gali išsivystyti gimdos kaklelio vėžys [14, 15].

Citokinai. Tyrimai rodo, kad lėtinis uždegiminis atsakas yra labai susijęs su įvairių rūšių vėžio išsivystymu. Lėtinio uždegiminio atsako metu vyksta tarpląstelinė sąveika, kurią įtakoja įvairūs mediatoriai, tarp jų ir citokinai. Citokinai koordinuoja imunines reakcijas, dalyvauja tarpsisteminėje ir tarpląstelinėje, imuninės, endokrininės nervų sistemų veiklos tarpusavio sąveikoje. Pagal funkciją citokinus sąlyginai galima suskirstyti į 4 grupes:

1) hemopoetiniai faktoriai (interleukinas (IL)-3, IL-7, eritropoetinas), kurie stimuliuoja nesubrendusių kraujo ląstelių augimą ir brendimą;

2) natūralaus imuniteto reguliatoriai – prouždegiminiai citokinai (IL-1, IL-6, alfa navikų nekrozės faktorius (TNF-α), chemokinas, IL-8 ir kt.), dalyvauja nespecifinėse imuninėse reakcijose, esant infekcijai, jų pagrindiniai taikiniai – fagocitai, makrofagai, granulocitai;

3) citokinai, reguliuojantys specifines imunines reakcijas (IL-2, IL-4, beta navikų augimo faktorius (TGF-β) ir kt.), dalyvauja limfocitų aktyvacijoje, diferenciacijoje, augime;

4) citokinai, reguliuojantys uždegimines reakcijas, kurios išsivysto specifinio imuninio atsako procese (limfotoksinas, IL-5, IL-10, gama interferonas (INF-γ) ir kt.), jų funkcija yra aktyvuoti efektorines ląsteles (natūralius kilerius, makrofagus ir t. t.) [32].

Genų variacijos, koduojančios uždegiminius ir priešuždegiminius citokinus (IL-1, TNF, INF- γ, IL-1 receptoriaus antagonistas, IL-10) bei chemokinus (CXCL12), gali lemti pakitusią jų funkciją ar kiekį. Manoma, kad tai yra svarbu organizmo kovoje prieš ŽPV ir naviką [33].

Receptoriai. Ląstelių paviršiaus mirties receptorių (FAS) ir Toll tipo receptorių (TLR) genų polimorfizmas yra susietas su gimdos kaklelio vėžio išsivystymu [34].

Su antigenų pateikimu susiję genai. Normalus žmogaus leukocitų antigenų (ŽLA) ir kitų

baltymų, dalyvaujančių antigeno pateikime, funkcionavimas yra reikalingas antivirusiniam ir

priešnavikiniam imunitetui. Naviko išlikimas rodo, kad imuninės sistemos dalis, susijusi su antigeno

pateikimu, veikia netinkamai. Įvairūs tyrimai aprašo, kad tai dažniausiai vyksta dėl ŽLA antigenų

ekspresijos ar funkcijos sutrikimų [18, 19, 21]. ŽLA antigenus koduojančių genų mutacijos ar

polimorfizmas gali lemti ekspresijos trūkumą arba sumažėjusį gebėjimą atpažinti ir sunaikinti navikines ląsteles per citotoksinius T limfocitus (CD8+) [20].

1.4 ŽLA

Eksperimentiniai ir klinikiniai tyrimai rodo, kad imunologiniai ir genetiniai veiksniai atlieka svarbų vaidmenį su ŽPV susijusiomis infekcijomis. Stebimas padidėjęs su ŽPV susijusių ligų skaičius pacientams, sergantiems ląsteliniu imunodeficitu, rodo svarbų imuninio atsako vaidmenį kontroliuojant ŽPV infekciją. Efektyvus imuninis atsakas į ŽPV infekciją apsaugo nuo viruso išlikimo, kuris yra svarbus gimdos kaklelio vėžio išsivystymo veiksnys [35]. Genai, kurie dažniausiai susiję su ligos rezultatu, priklauso pagrindinei audinių suderinamumo komplekso (MHC) genų šeimai, kuri vadinama žmogaus leukocitų antigenu (ŽLA). ŽLA kompleksas lokalizuojasi 6 chromosomoje, trumpajame petyje (6p21). Šie genai koduoja baltymus, kurie yra svarbūs imuniniam atsakui [36].

ŽLA molekulės struktūriškai yra skirstomos į tris klases.

● ŽLA I klasės molekules sudaro alfa grandinė, labai polimorfinis glikoproteinas, koduojamas MHC 6 chromosomoje. Ši alfa grandinė nekovalentiškai jungiasi su beta-2 mikroglobulinu, nepolimorfiniu glikoproteinu, koduojamu 15 chromosomoje esančiu ne ŽLA geno. MHC A, B ir C regionuose koduojami ŽLA-A, B ir C antigenai. Šias molekules išskiria visos branduolį turinčios ląstelės. Jų funkcija yra pristatyti endogeninius antigenus citotoksiniams T limfocitams (CD8+).

● ŽLA II klasės molekules sudaro alfa ir beta grandinės, koduojamos MHC gene, D regione. Šiai klasei priklauso ŽLA-DR, ŽLA-DQ, ŽLA-DP antigenai. Šias molekules išskiria B limfocitai, makrofagai, kitos antigeną prezentuojančios ląstelės, aktyvuoti T limfocitai. Jų funkcija yra pristatyti egzogeninius antigenus T limfocitams pagalbininkams (CD4+).

● ŽLA III klasės genai koduoja komplemento (C) komponentus (C2, C4A, C4B, Bf) [37].

ŽLA I ir II klasės molekulės atlieka svarbų vaidmenį pateikiant ŽPV peptidus T limfocitams.

T limfocitų receptoriaus susijungimas su ŽPV peptidų – ŽLA kompleksu ir bendras stimuliuojantis signalas yra būtinas, norint aktyvuoti T limfocitų atsaką, o tai gali skirtis priklausomai nuo ŽLA tipo.

Optimalus peptidų pateikimas tiek I, tiek II klasės molekulėse yra reikalingas aktyviam pagalbiniam ir

efektoriniam T limfocitų atsakui į ŽPV [35]. Moksliniuose tyrimuose ieškoma ŽLA alelių, haplotipų ir

1.4.1 ŽLA genai, didinantys gimdos kaklelio vėžio išsivystymo riziką

ŽLA genai yra labai polimorfiški. Jų variaciją lemia demografiniai faktoriai bei geografinė vieta, kaip matoma 4 paveiksle [29].

4 pav. ŽLA-A*02 alelio paplitimo dažnis pasaulyje [52]

Tiriant ŽLA I klasės genus, buvo nustatyta, kad ŽLA-A*01:01 alelio dažnis yra reikšmingai didesnis tarp sergančiųjų gimdos kaklelio vėžiu, nei tarp sveikųjų [38, 39]. Gimdos kaklelio vėžiu sergančioms moterims buvo pastebėtas didesnis ŽLA-A*01:01–C*06:02, bei A*01:01–DRB1*07:01 haplotipų dažnis [39].

Ieškant sąsajų tarp ŽLA-B genų ir gimdos kaklelio vėžio, buvo nustatytas gimdos kaklelio vėžio

ryšys su ŽLA-B*15, ŽLA-B*51:01 ir ŽLA-B*07 aleliais. ŽLA-B*07 pripažintas kaip didelės rizikos

alelis gimdos kaklelio vėžio išsivystymui ir yra tikimybė, kad bus naudojamas kaip molekulinis gimdos

kaklelio vėžio žymuo [39, 40]. Apie ŽLA-B*07 alelio sukeliamą riziką buvo pranešta jau 1981 metais,

kai mokslininkas H. W. Bruinse su kolegomis tyrė seseris, sergančias gimdos kaklelio vėžiu ir turinčias

šį alelį. Jungtinėse valstijose taip pat buvo nustatyta, kad ŽLA-B*07 yra rizikos veiksnys, susietas su

gimdos kaklelio displazija. Jungtinėje Karalystėje atliktas tyrimas atskleidė, kad moterims, turinčioms

ŽLA-B*07 alelį, grėsė blogesnė ligos prognozė, nei jo neturinčioms. Be to, 31,8 proc. turinčiųjų ŽLA-

B*07 alelį, buvo nustatyta ir ŽPV 16 tipo sukelta infekcija [41].

Tiriant ŽLA-C genus, buvo pastebėta, kad ŽLA-C*06:02-DQB1*02:01 ir C*06:02- DRB1*07:01 haplotipų dažniai buvo statistiškai reikšmingai didesni tarp sergančiųjų gimdos kaklelio vėžiu, nei tarp sveikų moterų [39].

Tiriant ŽLA II klasės genus buvo nustatyta, kad ŽLA-DRB1*03, DRB1*04, DRB1*07:01, DRB1*13-2, DRB1*14, DRB1*15 aleliai susiję su padidėjusia gimdos kaklelio vėžio išsivystymo rizika [39, 40].

ŽLA II klasės DQB1*02:01, DQB1*0301, DQB1*0302, DQB1*0501, DQB1*0601 alelių dažniai buvo dažnesni tarp sergančių gimdos kaklelio vėžiu nei tarp sveikų moterų [39, 40].

ŽLA I ir II klasės aleliai, didinantys gimdos kaklelio vėžio riziką, pateikti 1 lentelėje.

1.4.2 ŽLA genai, mažinantys gimdos kaklelio išsivystymo riziką

ŽLA genai gali ne tik didinti susirgimo gimdos kaklelio vėžiu riziką, bet ir mažinti. Yra atlikta daugybė tyrimų, kurių metu nustatyta, kad ŽLA genai gali apsaugoti nuo gimdos kaklelio vėžio. Tiriant ŽLA I klasės genus, buvo nustatyta, kad ŽLA-A*11, A*30:01, A*33:03 alelių dažniai buvo statistiškai reikšmingai mažesni sergančiųjų gimdos kaklelio vėžiu grupėje. Šie aleliai buvo pripažinti kaip apsauginiai veiksniai nuo gimdos kaklelio vėžio [42, 43]. ŽLA-A*02 alelio apsauginė funkcija taip pat nustatyta ne vieno tyrimo metu [4345]. ŽLA-A*24 alelis buvo įvardintas kaip mažinantis riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu [40].

Vertinant ŽLA-B geną, apsauginė funkcija buvo susieta ir su ŽLA-B*35 aleliu [40]. 2018 metais Europoje atliktame tyrime nustatyta, kad ŽLA-C*01 homozigotinis alelis yra apsauginis faktorius nuo ŽPV 16 tipo, kuris dažniausiai sukelia gimdos kaklelio neoplaziją [46].

Vertinant ŽLA II klasės alelius, susijusius su gimdos kaklelio vėžiu, buvo nustatyta nemažai

ŽLA II klasės alelių, mažinančių gimdos kaklelio vėžio išsivystymo riziką. Didžiojoje Britanijoje ŽLA-

DQB1*0501 alelis buvo susietas su apsauginiu poveikiu [47]. Indijos mokslininkai, atlikę tyrimą, ŽLA-

DRB1*10 alelį bei DRB1*10-DQB1*0501 haplotipą susiejo su apsaugine nuo gimdos kaklelio vėžio

funkcija [40]. Kinijos mokslininkai sukūrė rizikos susirgti gimdos kaklelio vėžiu vertinimo modelį

atsižvelgiant į etiologiją ir žmogaus leukocitų antigenų alelius. Retrospektyvinio tyrimo metu buvo

nustatyta, kad ŽLA-DRB1*09012 ir ŽLA-DRB1*1201 aleliai yra susiję su mažėjančia rizika susirgti

vėžiu, buvo rečiau nustatyti ŽLA-DRB1*13:02:01, ŽLA-DRB1*04:06 ir ŽLA-DQB1*06:04:01 alelių dažniai nei kontrolinės grupės moterims [42].

Kelete tyrimų pastebėjus, kad ŽLA-DRB1*13 alelis siejamas su apsaugine funkcija, buvo atliktas išsamesnis tyrimas ir ŽLA-DRB1*13 alelis buvo patvirtintas kaip apsauginis ŽPV infekcijos veiksnys, o ŽLA-DRB1*15-DQB1*06 haplotipas susietas su apsauga nuo gimdos kaklelio vėžio [48].

ŽLA I ir II klasės aleliai, mažinantys gimdos kaklelio vėžio riziką, pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. ŽLA I ir II klasės aleliai didinantys ir mažinantys riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu.

Klasė Lokusas Alelis Didina

riziką susirgti

Mažina riziką susirgti

Literatūros šaltinis

I A A*01:01 + 38, 42

A*02 + 4345

A*11 + 39, 43

A*24 + 43

A*30:01 + 42

A*33:03 + 42

B B*07 + 3941

B*15 + 39, 40

B*35 + 40

B*51 + 39, 40

C C*01

(homozigotinis)

+ 46

C*06:02 + 39

II DRB1 DRB1*3 + 39, 40

DRB1*04 + 39, 40

DRB1*04: 06 + 42

DRB1*07:01 + 39, 40

DRB1*09012 + 39

DRB1*1201 + 39

DRB1*10 + 40

DRB1*13-2 + 39, 40

DRB1*13: 2: 01 + 42

DRB1*13 + 48

DRB1*14 + 39, 40

DRB1*15 + + 39, 40, 48

DQB1 DQB1*02:01 + 39, 40

DQB1*0301 + 39, 40

DQB1*0302 + 39, 40

DQB1*0501 + + 39, 40, 47

DQB1*0601 + 39, 40

DQB1*06:04:01 + 42

DQB1*06 + 48

1.5 Gimdos kaklelio vėžio patogenezė

Alphapapillomaviruses genties virusai turi evoliuciškai išsivysčiusius imunoinvazinius mechanizmus, leidžiančias susidaryti matomoms papilomoms. ŽPV virusai turi 8 baltymus, atsakingus už viruso replikaciją, trys iš jų gali sukelti neoplaziją. Nustatyta, kad E5 baltymai atlieka svarbų vaidmenį apoptozėje ir slopinant imuninį atsaką. E6 ir E7 veikia taip, kad būtų galima amplifikacija viršutiniame epitelio sluoksnyje. E6 taip pat turi onkogeninių savybių – suriša ir suskaido p53, ląstelinius baltymus, aktyvina telomerazę. E7 baltymai suriša ir susilpnina auglio slopintuvą, prisideda prie piktybiško progresavimo skatindamas genomo nestabilumą [8, 24].

ŽPV per gleivinės mikro pažeidimus infekuoja gimdos kaklelio bazines ląsteles ir įsitvirtina

ten kaip nuolatinė ilgalaikė infekcija. Užkrėstoms ląstelėms diferencijuojantis ir kylant link epitelio

paviršiaus sukeliama aukšto lygio viruso replikacija ir genų ekspresija. Virionai išsiskiria į paviršių ir

taip būna užtikrinama vis atsinaujinanti infekcija, kaip pavaizduota 5 paveiksle [49]. Prieš keletą metų

pripažintas svarbus žmogaus ir viruso genų metilinimo vaidmuo gimdos kaklelio vėžio molekulinėje

patogenezėje [50]. Metilo grupės prisijungimas genus veikia slopinančiai: nevyksta DNR transkripcija,

moteris, kurioms nustatyta CIN3 diagnozė, palyginus su moterimis, kurioms nustatyta trumpalaikė ŽPV infekcija [50, 52].

5 pav. ŽPV onkogeninė progresija [17]

Skiriami du dažniausi gimdos kaklelio vėžio tipai: plokščiųjų ląstelių karcinoma ir adenokarcinoma. Retesniais atvejais – adeno-plokščių ląstelių karcinoma, šviesių ląstelių karcinoma ir smulkialąstelinė karcinoma [53]. Gimdos kaklelis tiriamas citologiškai ir histologiškai, diagnozės aprašomos naudojant gimdos kaklelio intraepitelinės neoplazijos (CIN) ir plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai (SIL) terminus. Histologinė diagnozė CIN1, prilyginama citologinei diagnozei (Bethesdos sistema) LSIL, o CIN2 ir CIN3–HSIL, kaip matoma 2 lentelėje [54].

Nežymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai (LSIL) dažniausiai susiję su įvairių tipų ŽPV infekcija gimdos kaklelyje. Apie 60 proc. moterų, kurioms nustatyta LSIL, yra infekuotos didelės rizikos grupės ŽPV. Daugumai nežymūs pokyčiai gali išnykti savaime per 3 metus, tik 15–25 proc.

moterų per 2–4 metus iš nežymių išsivysto žymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai (HSIL).

Jei gimdos kaklelis infekuotas ŽPV 16 tipu, ląstelių pokyčiai iš nežymių į žymius vystosi daug greičiau,

nei esant kito tipo ŽPV infekcijai gimdos kaklelyje [4].

2 lentelė. Gimdos kaklelio pažeidimų klasifikacija [55, 56].

Displazija Histologinė diagnozė Citologinė diagnozė (Bethesdos sistema)

Norma Norma Norma/gerybiniai pokyčiai

(NILM) Nepiktybiniai ląstelių

pakitimai dėl traumos, infekcijos, hormonų poveikio ar radiacijos

Uždegiminė atipija Reaktyvūs pokyčiai

Nenustatytos reikšmės plokščio epitelio ląstelių

atipija

Atipija ASC–US

Nedidelio laipsnio

displazija CIN 1 LSIL

Didelio laipsnio displazija CIN 2 HSIL

Didelio laipsnio displazija CIN 3 HSIL

Vėžys Vėžys Vėžys

Nors ŽPV yra pagrindinis gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksnys, tačiau yra ir daugiau svarbių

veiksnių, tokių kaip ŽLA I ir II klasės aleliai. Todėl mes savo darbe nusprendėme panagrinėti ŽLA I

klasės A lokuso alelių ir gimdos kaklelio vėžio sąsajas Lietuvos moterims.

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1 Tyrimo apimtis

Į tyrimą buvo įtrauktos 77 moterys, kurios lankėsi LSMU ligoninės Kauno klinikos Akušerijos ir ginekologijos klinikos konsultacijoje nuo 2017-08-01 iki 2018-10-31 dienos. Iš jų 33 (42,86 proc.) buvo nustatytas gimdos kaklelio vėžys ir 44 (57,14 proc.) buvo sveikos (kontrolinė grupė). Visoms tiriamosioms buvo atliktas onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu, ŽPV aukštos rizikos genotipų nustatymas ir ŽLA I klasės A lokuso alelių nustatymas sekai specifinių oligonukleotidų metodu. Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje, gavus LSMU Bioetikos centro leidimą Nr.

BEC−LMB(M)−119.

2.2 Tyrimo metodai

2.2.1 Onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu

Medžiaga tyrimui buvo imama šepetėliu Cervex–Brush (Rovers Medical Devices, Olandija) su nuimama galvute iš gimdos kaklelio kanalo ir egzocervikinės dalies bei endocervikinės/transformacijos zonos.

Šepetėlis švelniai įkišamas į gimdos kaklelio kanalą ir sukamas gimdos kaklelio paviršiumi 5 kartus (pilnus ratus – 360°) pagal laikrodžio rodyklę – citologinė medžiaga vienu metu paimama iš išorinės ir vidinės gimdos kanalo sričių.

Šepetėlio galvutė su paimta citologine medžiaga buvo įdedama į indelį su skysta SurePath (BD, JAV) fiksuojančia terpe. SurePath terpė pagaminta 24 proc. etanolio pagrindu. Indelis su ėminiu buvo pristatytas į Laboratorinės medicinos kliniką kambario temperatūroje.

Iki ištyrimo ėminys buvo laikytas (15–30℃) temperatūroje ne ilgiau kaip 4 savaites.

2.2.1.1 Tepinėlio paruošimas:

Iš skystoje SurePath (BD, JAV) terpėje esančios medžiagos buvo paruošti tepinėliai ir nudažyti naudojant automatinę tepinėlių ruošimo ir dažymo sistemą PrepStain (TRIPATH IMAGING, BD, JAV).

1. Ruošiant tepinėlį citologinė gimdos kaklelio medžiaga leidžiama per tankio gradientą. Tokiu būdu nuo gimdos kaklelio epitelio ląstelių buvo pašalinamos gleivės, eritrocitai ir kitos priemaišos.

2. Paruoštų ląstelių nuosėdos buvo skiedžiamos buferiu ir tolygiai (vienu sluoksniu) paskleidžiamos ant objektinio stiklelio 13 mm skersmens apskritimo plote.

3. Paruošti tepinėliai buvo fiksuojami ir nudažomi Papanicolau dažymo metodu naudojant BD dažus (EA/OG Combo Stain, Hematoxylin Stain ir Alcohol Blend Rinse, TRIPATH IMAGING, BD, JAV). Nudažyti tepinėliai buvo išimti iš tepinėlių ruošimo ir dažymo sistemos ir traukos spintoje plauti izopropanoliu.

4. Nuplauti tepinėliai buvo sudėti į automatinį stiklelių dengimo prietaisą Leica CV5030 (Leica Biosystems, Vokietija).

5. Baigus dengimą tepinėliai buvo džiovinami traukos spintoje kambario temperatūroje.

2.2.1.2 Tepinėlio mikroskopija

Tepinėliai vertinami šviesiniu mikroskopu (Olympus CX41, Olympus, Japonija). Pirmiausiai tepinėlis apžiūrimas mažuoju padidinimu (10), įvertinama nusidažymo kokybė, tepinėlio kokybė, ląstelių kiekis ir jų pasiskirstymas. Vėliau visas tepinėlis mikroskopuojamas serpentino būdu (nuosekliai vertikalia ir horizontalia kryptimi) ir atidžiai apžiūrimas kiekvienas regos laukas. Aptikus pakitusių ląstelių, jos apžiūrimos mikroskopuojant didžiuoju padidinimu (40), esant reikalui ir imersine sistema (100).

Mikroskopuojami tepinėliai buvo vertinami pagal Bethesda sistemos (2014) kriterijus, kurie

pateikti 3 lentelėje, bei atlikta mikroskopijos rezultatų analizė.

3 lentelė. Citologinio gimdos kaklelio tepinėlio išvados pagal Bethesdą.

Citologinė diagnozė

Apibūdinimas

NILM intraepitelinių pakitimų nėra.

ASC-US nenustatytos reikšmės plokščio epitelio ląstelių atipija.

ASC-H atipinės plokščio epitelio ląstelės, galimi žymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai.

LSIL nežymūs intraepiteliniai plokščialąsteliniai pokyčiai.

HSIL žymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai.

Plokščialąstelinė karcinoma

2.2.2 Žmogaus papilomos viruso aukštos rizikos genotipų nustatymas

Tyrimui buvo naudojama dalis medžiagos iš onkocitologiniam gimdos kaklelio tepinėlio tyrimui imtos skystos terpės SurePath (BD, JAV).

Visoms tyrime dalyvavusioms moterims iš gimdos kaklelio nuograndų buvo išskirta žmogaus papilomos viruso (ŽPV) DNR, atliktas DNR amplifikavimas ir vizualizavimas, bei nustatytų aukštos rizikos ŽPV genotipų rezultatų analizė.

ŽPV viruso DNR buvo išskirta rankiniu būdu, silikogelio kolonėlių pagalba, naudojant QIAamp️, DNA Mini Kit (QIAGEN, JAV) rinkinį.

DNR amplifikacija atlikta naudojant termociklerį Rotar-Gene Q (QIAGEN, JAV), realaus laiko PGR.

Aukštos rizikos ŽPV genotipų nustatymas atliktas naudojant AmpliSenS ŽPV aukštos rizikos

genotipų titro FTR PGR (AmpliSenS️, Slovakija) rinkinį. ŽPV viruso genotipas buvo nustatytas naudojant

amplifikuotų produktų hibridizacijos − fluorescencijos aptikimą realiu laiku. Metodas pagrįstas vienu

metu vykstančių ŽPV genotipų 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 DNR fragmentų ir

betaglobino geno DNR fragmentų amplifikacija (daugialypė PGR) realiu laiku viename mėgintuvėlyje.

2.2.3 Žmogaus leukocitų antigeno I klasės A lokuso alelių nustatymas tiesioginiu sekai specifinių oligonukleotidų metodu

Tyrime dalyvavusioms moterims kraujas buvo paimtas į vakuuminę sistemą su EDTA (Vacutainer, BD, JAV), per 1,5 val nuo paėmimo pristatytas į laboratoriją, esant 18–25°C. Iki ištyrimo buvo laikomas užšaldytas -20ºC temperatūroje. Kraujas buvo centrifuguojamas 2500  g 10 min.

Iš leukocitų buvo išskirta DNR ir atliktas ŽLA-A alelių tipavimas.

DNR buvo išskirta rankiniu būdu, silikogelio kolonėlių pagalba, naudojant QIAamp, DNA Mini Kit (QIAGEN, JAV) rinkinį ir Thermomixer comfort (Eppendorf, Vokietija) termomikserį. Lizavimo buferiais buvo lizuojamos ląstelės, pašalinti membranos lipidai. Proteinazė K suardė ląstelės baltymus ir branduolio membranas bei pašalino histonus. Taip pat šis fermentas inaktyvavo nukleazes. Veikiant ribonukleazėms buvo suardyta RNR. Lizatas buvo sumaišytas su etanoliu ir perkeltas į silikogelio kolonėlę. Baltyminės liekanos, druskos, reagentai ir kitos priemaišos buvo pašalinamos naudojant gamintojo pateiktus buferinius tirpalus, o nukleorūgštys susirišo su stiklo pluošto filtru. DNR buvo nuplauta su eliucijos buferiniu tirpalu.

Amplifikacija buvo atlikta naudojant Labcycler (Sensoquest, Vokietija) termociklerį, realaus laiko PGR. Išskirtos DNR kiekis buvo nedidelis, todėl pagausintas reikiamo geno fragmentas, reikalingas tolesniam tyrimui. Buvo naudojami pradmenys, kurie atpažino norimo pagausinti fragmento pradžios ir pabaigos sekas ir prie jų prisijungė. DNR polimerazė užtikrino, kad vyktų naujos DNR grandinės sintezė, kuriai yra svarbi ir Mg

jonų koncentracija. Sumaišytas mėginys buvo dedamas į termociklerį, kuriame vyko denatūracija, pradmenų hibridizacija ir DNR fragmento pagausinimas.

ŽLA alelių tipavimas buvo atliktas naudojant Luminex (Luminex, JAV) analizatorių ir Lifecodes HLA-A eRES SSO (Immucor, JAV) ŽLA tipavimo rinkinį, kuriuo galima nustayti 21 dažniausiai paplitusį alelį, kurie nurodyti 4 lentelėje.

4 lentelė. Lifecodes HLA-A eRES SSO ŽLA tipavimo rinkiniu nustatomi aleliai.

ŽLA-A*01 ŽLA-A*11 ŽLA-A*25 ŽLA-A*30 ŽLA-A*33 ŽLA-A*43 ŽLA-A*69 ŽLA-A*02 ŽLA-A*23 ŽLA-A*26 ŽLA-A*31 ŽLA-A*34 ŽLA-A*66 ŽLA-A*74 ŽLA-A*03 ŽLA-A*24 ŽLA-A*29 ŽLA-A*32 ŽLA-A*36 ŽLA-A*68 ŽLA-A*80

SSO tipavimo procedūra pagrįsta pažymėto viengrandžio PGR produkto hibridizavimu su SSO

atsiliekančioje grandinėje, susidarė dvigrandis DNR produktas. Kiekvienas iš šių skirtingų zondų gali būti homogeniškas DNR gausinimo sekai, kuri yra unikali aleliniam genui arba alelinių genų grupei.

Zondų struktūra yra tokia, kad kiekvienas zondas hibridizavosi su komplementariąja sritimi, kuri amplifikuotoje DNR buvo arba ne. Be to, amplifikuota DNR hibridizavosi su viena ar daugiau konsensuso sekų, kurios buvo homogeniškos visų lokuso alelinių genų sekoms. SSO tipavimui galėjo turėti įtakos biologinės medžiagos tipas, gryninimo metodas ir genominės DNR kiekis bei vientisumas.

Dėl to zondo konsensuso seka gautas signalas galėjo būti naudingas kaip sėkmingai atliktų amplifikacijos ir hibridizacijos procedūrų indikatorius. Taip pat gautas zondo konsensuso sekos signalas galėjo būti naudojamas aleliniams genams specifinių zondų signalams normalizuoti ir hibridizavimo reakcijoje amplifikuotų produktų kiekio variacijoms pataisyti. Pagal SSO tipavimo rezultatus buvo atlikta rezultatų analizė buvo naudojama nustatant, ar amplifikuotoje DNR buvo tam tikros DNR sekos, ar ne, ir mėginyje identifikuojant galimus alelinius genus.

LIFECODES ŽLA-SSO tipavimo procedūrai zondai buvo jungiami prie „Luminex“ mikrosferų, skirtų naudoti su „Luminex“ instrumentu. Prie kiekvienos spalvos mikrosferos buvo jungiami skirtingi SSO zondai. Dėl to kelių zondų mišinyje keletą zondų buvo galima atskirti vieną nuo kito pagal ryšį su tam tikrų spalvų mikrosferomis. „Luminex“ instrumentu taip pat buvo įvertinti santykiniai paženklinto PGR produkto kiekiai, hibridizuojant su kiekviena „Luminex“ mikrosfera. Per LIFECODES analizę SSO zondai gavo santykinį signalą, kuris buvo panaudotas zondams priskiriant teigiamas arba neigiamas reakcijas amplifikuoto DNR mėginio atžvilgiu. Tai suteikia informacijos, reikalingos mėginio ŽLA fenotipui nustatyti.

Rezultatų įvertinimas. Patikrinama, kad kiekviename mėginyje SSO įvykių skaičius būtų ne mažiau kaip 60. Nustatoma, ar kiekvieno mėginio zondo nukleotidų sekos mišinio reikšmės yra didesnės nei jų minimalus fluorescencijos intensyvumo reikšmės mediana (MFI). Atimama kiekvieno zondo

“Background Control” (foninės kontrolės) reikšmė iš tų mėginių reikšmių, kurios sudaro pataisytų foninių duomenų grupę. Kiekvienam mėginiui padalijami kiekvieno zondo konsensuso sekos pataisyti duomenys iš atitinkamo zondo konsensuso sekos, sudarančios normalizuotą duomenų rinkinį.

𝑀𝐹𝐼 (𝑧𝑜𝑛𝑑𝑎𝑠) − 𝑀𝐹𝐼 (𝑡𝑢šč𝑖𝑎 𝑧𝑜𝑛𝑑𝑜 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙ė)

𝑀𝐹𝐼 (𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑠𝑢𝑠𝑜) − 𝑀𝐹𝐼 (𝑡𝑢šč𝑖𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑠𝑢𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑘𝑜𝑠 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙ė)

Kiekvieno zondo normalizuotos reikšmės užregistruojamos slenkstinių reikšmių lentelėje. Kai

užregistruojamos visos reikšmės, zondai hibridizuojami su taikiniais, palyginami su duomenimis,

pateiktais zondo hibridizavimo taikinių lentelėse. Kaip pateikiami rezultatai matoma 6 paveiksle.

6 pav. Grafinis Luminex ŽLA-A rezultatų atvaizdavimas [iš Laboratorinės medicinos klinikos, LSMU ligoninė Kauno klinikos archyvo].

Raudona spalva – teigiamos reakcijos, šiuo atveju būdingos ŽLA-A*03 ir A*11 aleliams, žalia spalva – neigiamos rekcijos,

♦ – ribinės reikšmės.

2.3 Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant IBM SPSS Statistics 20 programą. Kolmogorov–

Smirnov testu nustatyta ar kiekybinių kintamųjų skirstinys normalusis. Amžiaus vidurkiams palyginti

buvo naudotas Krusal–Walis testas. Kokybinių požymių ryšiui nustatyti buvo naudojamas Chi kvadrato

(χ

) testas, mažoms imtims taikytas Fišerio tikslusis testas. Analizuojant veiksnio įtaką ligai atsirasti,

skaičiuotas galimybių santykis (GS). Veiksnys laikytas reikšmingu, jei GS 95 proc. pasikliautinojo

intervalo (PI) mažiausia ir didžiausia reikšmės buvo mažesnės ar didesnės už 1. Statistiškai reikšmingas

skirtumas laikomas, kai p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Tiriamųjų pasiskirstymas pagal citologinę diagnozę

Į tyrimą buvo įtrauktos 77 moterys, kurios lankėsi LSMU ligoninės Kauno klinikos Akušerijos ir ginekologijos klinikos konsultacijoje nuo 2017-08-01 iki 2018-10-31 dienos. 33 moterims buvo nustatytas gimdos kaklelio vėžys. Į kontrolinę grupę 44 sveikos moterys buvo atrinktos pagal amžių.

Visų tiriamųjų amžius buvo nuo 25 iki 85 metų, amžiaus vidurkis 51,49±12,74 metų. Moterų pasiskirstymas pagal citologinę diagnozę pavaizduotas 7 paveiksle.

7 pav. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal citologinę diagnozę Tiriamųjų moterų amžiaus charakteristikos pateiktos 5 lentelėje.

5 lentelė. Tiriamųjų amžiaus charakteristika pagal citologinę diagnozę.

Citologinė diagnozė

Tiriamųjų skaičius n (proc.)

Jauniausias amžius,

metai

Vyriausias amžius,

metai

Vidurkis±SN,

metai p

Gimdos kaklelio

vėžys 33 (42,86) 30 85 54,64±13,96

0,106

Norma 44 (57,14) 25 78 49,07±11,29

Tyrime dalyvavusių moterų, sergančių gimdos kaklelio vėžiu ir sveikų moterų, amžius nesiskyrė.

42,86 proc.

57,14 proc. n=33 n=44

Gimdos kaklelio vėžys Norma

Mūsų tyrimo metu nustatytas gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų amžiaus vidurkis yra toks pats, kaip ir pateikiamas literatūroje. Nacionalinio vėžio instituto duomenimis, Lietuvoje gimdos kaklelio vėžiu dažniausiai suserga 4565 metų amžiaus moterys [57]. Amerikos vėžio draugijos pateikiamais duomenimis, Amerikoje gimdos kaklelio vėžys dažniausiai diagnozuojamas moterims, kurių amžiaus vidurkis 3544 metų [58]. PSO duomenimis pasaulyje gimdos kaklelio vėžiu dažniausiai suserga 4060 metų amžiaus moterys [10].

3.2 ŽLA-A alelių ryšys su gimdos kaklelio vėžiu

ŽLA-A alelių tyrimas buvo atliktas visoms tyrime dalyvavusioms moterims. Nustatytas ŽLA- A alelių dažnis tarp gimdos kaklelio vėžiu sergančių ir sveikų kontrolinės grupės moterų pateiktas 8 ir 9 paveiksluose.

Tarp sergančiųjų vėžiu, dažniausiai nustatyti buvo du aleliai: ŽLA-A*02 (16,9 proc.) ir ŽLA- A*03 (16,9 proc.). Toliau sekė ŽLA-A*24 (9,1 proc.), ŽLA-A*11 (3,9 proc.), ŽLA-A*23 (3,9 proc.), ŽLA-A*30 (3,9 proc.), ŽLA-A*68 (3,9 proc.) (8 pav.)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

14,3

16,9 16,9

3,9 3,9 9,1

0 1,3

2,6 3,9

0 2,6

0 0 0 0 0

3,9

0 0 0

Alelių pasiskirstymo dažnis, proc.

ŽLA-A aleliai

Tarp sveikų moterų dažniausiai buvo nustatytas ŽLA-A*02 alelis (29,9 proc.). Taip pat dažniau buvo nustatyti ŽLA-A*03 (16,9 proc.) ir ŽLA-A*01 (10,4 proc.) aleliai. Toliau sekė ŽLA-A*24 (10,4 proc.), ŽLA-A*25 (6,5 proc.), ŽLA-A*11 (5,2 proc.) ir ŽLA-A*68 (5,2 proc.) (9 pav.)

9 pav. ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis tarp sveikų kontrolinės grupės moterų

Literatūroje aprašomi tyrimai, kurių rezultatai iš dalies sutampa su mūsų tyrimo rezultatais.

Mūsų tyrime nustatyta, kad ŽLA-A*02 yra paplitęs dažniau nei kiti aleliai, literatūroje nurodoma, kad šis alelis labiausiai paplitęs yra šiaurės, rytų ir iš dalies centrinėje Europoje [59]. Tarp sergančių gimdos kaklelio vėžiu moterų dažnai nustatomas ŽLA-A*01 alelis [38]. Kontrolinėje grupėje esančioms moterims dažniau būna nustatomi ŽLA-A*02, ŽLA-A*11, ŽLA-A*24, ŽLA-A*30, ŽLA-A*33 aleliai [4245].

Atlikus tyrimą, ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis buvo palygintas tarp sergančių gimdos kaklelio vėžiu ir sveikų kontrolinės grupės moterų. Rezultatai pateikti 6 lentelėje.

0 5 10 15 20 25 30

10,4 29,9

16,9

5,2 2,6

10,4 6,5

3,9

0 0

3,9

1,3 1,3

0 0 0 1,3

5,2

0 0 0

Alelių pasiskirstymo dažnis, proc.

ŽLA-A aleliai

6 lentelė. ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis tarp sergančių gimdos kaklelio vėžiu ir sveikų kontrolinės grupės moterų.

ŽLA-A alelis

Visos N=77 n (proc.)

Sergančios gimdos kaklelio vėžiu

moterys N=33 n (proc.)

Kontrolinės grupės moterys

N=44 n (proc.)

χ

p GS

(95 proc. PI)

A*01 19 (24,7) 11 (14,3) 8 (10,4) 2,329 0,182 2,25 (0,78−6,46) A*02 36 (46,8) 13 (16,9) 23 (29,9) 1,256 0,356 0,59 (0,24−1,48) A*03 26 (33,8) 13 (16,9) 13 (16,9) 0,818 0,466 1,56 (0,60−4,02)

A*11 7 (9,1) 3 (3,9) 4 (5,2) –

1,000 1,00 (0,21−4,81)

A*23 5 (6,5) 3 (3,9) 2 (2,6) –

0,646 2,1 (0,33−13,35)

A*24 15 (19,5) 7 (9,1) 8 (10,4) 0,110 0,777 1,21 (0,39−3,76)

A*25 5 (6,5) 0 (0) 5 (6,5) –

0,067 −

A*26 4 (5,2) 1 (1,3) 3 (3,9) –

0,631 0,43 (0,04−4,30)

A*29 2 (2,6) 2 (2,6) 0 (0) –

0,180 −

A*30 3 (3,9) 3 (3,9) 0 (0) –

0,075 −

A*31 3 (3,9) 0 (0) 3 (3,9) –

0,256 −

A*32 3 (3,9) 2 (2,6) 1 (1,3) –

0,573 2,77 (0,24−31,97)

A*33 1 (1,3) 0 (0) 1 (1,3) –

1,000 −

A*66 1 (1,3) 0 (0) 1 (1,3) –

1,000 −

A*68 7 (9,1) 3 (3,9) 4 (5,2) –

1,000 1,00 (0,21−4,81)

–^#

– mažoms imtims taikytas tikslusis Fišerio testas

χ

– Chi kvadrato kriterijus

Tyrimo metu nustačius homozigotinius ŽLA-A alelius, jų dažniai buvo palyginti tarp sergančių gimdos kaklelio vėžiu ir kontrolinės grupės moterų. Rezultatai pateikti 7 lentelėje.

7 lentelė. Homozigotinių ŽLA-A alelių pasiskirstymo tarp citologinių diagnozių dažnis.

ŽLA-A alelis

Visos N=77 n (proc.)

Sergančios gimdos kaklelio vėžiu

moterys N=33 n (proc.)

Kontrolinės grupės moterys

N=44 n (proc.)

χ²

p GS

(95 proc. PI)

A*01 2 (2,6) 0 (0) 2 (2,6)

0,504 −

A*02 7 (9,1) 2 (2,6) 5 (6,5)

0,692 0,50 (0,91−2,77) A*03 3 (3,9) 1 (1,3) 2 (2,6)

1,000 0,66 (0,06−7,56)

A*11 1 (1,3) 1 (1,3) 0 (0)

0,429 −

A*24 1 (1,3) 0 (0) 1 (1,3)

1,000 −

A*68 1 (1,3) 1 (1,3) 0 (0)

0,429 −

#

– mažoms imtims taikytas tikslusis Fišerio testas χ

– Chi kvadrato kriterijus

GS – galimybių santykis PI – pasikliautinasis intervalas

ŽLA-A alelių dažnio skirtumas tarp sveikų ir sergančių vėžiu moterų nebuvo statistiškai

reikšmingas. Homozigotinių ŽLA-A alelių dažnis tarp sergančiųjų ir sveikųjų vėžiu taip pat statistiškai

nesiskyrė.

ŽLA-A alelis nėra plačiai ištirtas kaip darantis didelę įtaką didinant ar mažinant riziką susirgti

gimdos kaklelio vėžiu. Tačiau Kinijoje atliktame tyrime, palyginus moteris, sergančias gimdos kaklelio

vėžiu, ir moteris, esančias kontrolinėje grupėje, buvo nustatyta, kad ŽLA-A*01 dažniau pasireiškia

gimdos kaklelio vėžiu sergančioms moterims ir buvo pripažintas kaip didinantis riziką susirgti gimdos

kaklelio vėžiu [38]. Kitame tyrime taip pat buvo nustatyta, kad ŽLA-A*01 alelis yra dažnesnis moterims,

sergančioms gimdos kaklelio vėžiu, tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nustatyta nebuvo [39]. JAV

atliktame tyrime ŽLA-A*02 nustatytas dažniau sveikoms moterims ir šiam aleliui priskirtas mažinantis

riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu vaidmuo [44]. Japonijoje atliktame tyrime, kuriame dalyvavo

moterys, sergančios gimdos kaklelio vėžiu ir sveikos moterys kontrolinėje grupėje. HLA-A*02 alelis

buvo dažnesis tarp sveikų moterų. Buvo nustatytas mažinantis riziką ryšys tarp ŽLA-A*02 alelio ir

gimdos kaklelio vėžio [45]. Mūsų tyrime taip pat ŽLA-A*02 alelis dažniau nustatytas sveikoms

moterims, tačiau statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas. Tame pačiame Japonijoje atliktame

tyrime nustatyta, kad ŽLA-A*24 yra didinantis riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu [45]. Kinijos

mokslininkai nustatė, kad ŽLA-A*30 alelis yra dažniau paplitęs tarp sveikų moterų nei sergančių gimdos

kaklelio vėžiu, ŽLA-A*33 alelis taip pat nustatytas dažniau tarp sveikų moterų. Abu šie aleliai buvo

susieti su apsauginiu poveikiu nuo gimdos kaklelio vėžio [38]. Mūsų tyrime tokia tendencija nestebima

galimai dėl per mažos imties arba dėl geografinių alelių paplitimo skirtumų.

3.3 ŽLA-A alelių ryšys su ŽPV

Nustatant ŽLA-A alelių ryšį su ŽPV, tyrime dalyvavo 77 moterys, kurios lankėsi LSMU ligoninės Kauno klinikos Akušerijos ir ginekologijos klinikos konsultacijoje nuo 2017-08-01 iki 2018- 10-31 dienos. Buvo tirta 14 aukštos rizikos ŽPV genotipų. Atlikus tipavimą, moterys buvo suskirstytos į dvi grupes  ŽPV nustatyta (nustatytas bent 1 didelės rizikos ŽPV genotipas) ir ŽPV nenustatyta (nenustatytas nei vienas didelės rizikos ŽPV genotipas). Moterys pasiskirstė taip: 43 (55,84 proc.) buvo nustatyta ŽPV, 34 (44,16 proc.) ŽPV nenustatyta (kontrolinė grupė) (10 pav.).

10 pav. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal ŽPV

Tarp moterų, kurioms nustatyta ŽPV, dažniausiai nustatytas ŽLA-A*02 (23,4 proc.) alelis, didesni dažniai nustatyti ir ŽLA-A*03 (22,1 proc.) bei ŽLA-A*01 (16,9 proc.) aleliams. Toliau sekė ŽLA-A*24 (11,7 proc.), ŽLA-A*68 (5,2 proc.), ŽLA-A*11 (3,9 proc.), ŽLA-A*23 (3,9 proc.), ŽLA- A*30 (3,9 proc.) (11 pav.).

55,84 proc.

n=43 44,16 proc.

n=34

ŽPV nustatyta ŽPV nenustatyta

11 pav. ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis tarp moterų, kurioms nustatyta ŽPV

Tarp moterų, kurioms ŽPV nenustatyta, taip pat kaip ir tarp tų, kurioms ŽPV nustatyta, dažniausiai nustatytas ŽLA-A*02 (23,4 proc.) alelis. Toliau sekė ŽLA-A*03 (11,7 proc.), ŽLA-A*01 (7,8 proc.), ŽLA-A*24 (7,8 proc.), ŽLA-A*11 (5,2 proc.) (12 pav.).

0 5 10 15 20 25

7,8 23,4

11,7

5,2 2,6

7,8

3,9 3,9

0 0

3,9

1,3 1,3

0 0 0 0

3,9

0 0 0

Alelių paplitimo danis, proc.

ŽLA-A aleliai

0 5 10 15 20 25

16,9 23,4

22,1

3,9 3,9 11,7

2,6 1,3

2,6 3,9

0 2,6

0 0 0 0

1,3 5,2

0 0 0

Alelių pasiskirstymo dažnis, proc.

ŽLA-A aleliai

Nustačius ŽPV, buvo paskaičiuotas alelių pasiskirstymo dažnis tarp turinčiųjų ŽPV ir neturinčiųjų. Rezultatai pateikti 8 lentelėje.

8 lentelė. ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis tarp moterų, kurioms nustatyta ir nenustatyta ŽPV.

ŽLA-A alelis

ŽPV nustatyta N=43 n (proc.)

ŽPV nenustatyta N=34 n (proc)

χ2

p

A*01 13 (16,9) 6 (7,8) 1,618

A*02 18 (23,4) 18 (23,4) 0,936

A*03 17 (22,1) 9 (11,7) 1,449

A*11 3 (3,9) 4 (5,2)

0,693

A*23 3 (3,9) 2 (2,6)

1,000

A*24 9 (11,7) 6 (7,8) 0,130

A*25 2 (2,6) 3 (3,9)

0,650

A*26 1 (1,3) 3 (3,9)

0,316

A*29 2 (2,6) 0 (0)

0,500

A*30 3 (3,9) 0 (0)

0,251

A*31 0 (0) 3 (3,9)

0,082

A*32 2 (2,6) 1 (1,3)

1,000

A*33 0 (0) 1 (1,3)

0,442

A*66 1 (1,3) 0 (0)

1,000

A*68 4 (5,2) 3 (3,9)

1,000

–^#

– mažoms imtims taikytas tikslusis Fišerio testas

χ

– Chi kvadrato kriterijus

Atlikus tyrimą buvo paskaičiuotas ir homozigotinių ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis tarp moterų, kurioms nustatyta ir nenustatyta ŽPV. Rezultatai pateikti 9 lentelėje.

9 lentelė. Homozigotinių ŽLA-A alelių pasiskirstymo dažnis tarp moterų, kurioms nustatyta ir nenustatyta ŽPV.

ŽLA-A alelis

ŽPV nustatyta N=43 n (proc.)

ŽPV nenustatyta N=34 n (proc.)

χ

p

A*01H 1 (1,3) 1 (1,3) −

1,000

A*02H 3 (3,9) 4 (5,2) −

0,693

A*03H 1 (1,3) 2 (2,6) −

0,580

A*11H 1 (1,3) 0 (0) −

1,000

A*24H 1 (1,3) 0 (0) −

1,000

A*68H 1 (1,3) 0 (0) −

1,000

–^#

– mažoms imtims taikytas tikslusis Fišerio testas χ

– Chi kvadrato kriterijus

ŽLA-A alelių dažnio skirtumas tarp moterų, turinčių ŽPV ir jo neturinčių, nebuvo statistiškai reikšmingas. Homozigotinių ŽLA-A alelių dažnio skirtumas tarp moterų, kurioms nustatyta ir nenustatyta ŽPV, taip pat nesiskyrė.

Literatūroje pateikiama nedaug duomenų apie ŽLA-A ir ŽPV ryšį, tačiau Brazilijoje atliktame tyrime, kuriame dalyvavo moterys, sergančios gimdos kaklelio vėžiu ar turinčios ikivėžinių pakitimų ir sveikos moterys, buvo nustatyta, kad ŽLA-A*11-B*35-C*04-DRB1*01-DQA1*01-DQB1*05 haplotipas yra susijęs su apsaugine funkcija nuo ŽPV. Haplotipas ŽLA-A*01-B*08-C*07-DQB1*02 susijęs su apsauga nuo aukštos rizikos ŽPV genotipų ir ŽLA-A*01-B*08-C*07-DQB1*02 haplotipas  apsaugo nuo ŽPV 16 genotipo infekcijos [60].

Mūsų tyrime matoma atvirkštinė tendencija  ŽLA-A*01 alelis dažniau nustatytas ŽPV