LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Rūta Andrijauskaitė
CITOKINŲ (INF-β, INF-γ ir IL-1β) IR GIMDOS KAKLELIO VĖŽIO SĄSAJOS Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovė Doc. Dr. Erika Skrodenienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3
SUMMARY ... 5
PADĖKA, INTERESŲ KONFLIKTAS, BIOETIKOS CENTRO LEIDIMAS ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ...10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...12
1.1 Gimdos kaklelio vėžys ...12
1.2 Gimdos kaklelio vėžio paplitimas ...12
1.3 Gimdos kaklelio vėžio etiologija ir patogenezė ...13
1.4 Citokinų reikšmė gimdos kaklelio vėžio vystymuisi ...15
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ...21
2.1 Tyrimo apimtis ...21
2.2 Tyrimo metodai ...21
2.2.1 Onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu ...21
2.2.2 Žmogaus papilomos viruso aukštos karcinominės rizikos genotipų nustatymas PGR metodu ...23
2.2.3 Citokinų nustatymas, naudojant Luminex technologiją ...24
2.3 Statistinė analizė ...26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...28
3.1 Kontingento charakteristika ...28
3.2 Citokinų koncentracijos kitimas ...30
IŠVADOS ...36
LITERATŪROS SĄRAŠAS ...37
3
SANTRAUKA
Darbą atliko: Rūta Andrijauskaitė.
Darbo pavadinimas: Citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) ir gimdos kaklelio vėžio sąsajos. Tyrimo tikslas: Nustatyti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) ir gimdos kaklelio vėžio sąsajas. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ryšį su gimdos kaklelio vėžiu.
2. Įvertinti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų sąsajas su gimdos kaklelio vėžio stadijomis. 3. Nustatyti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ryšį su tiriamųjų amžiumi.
Tyrimo objektas: Į tyrimą buvo įtrauktos 81 moteris, iš kurių 33 sirgo gimdos kaklelio vėžiu ir 48 buvo sveikos. Tiriamųjų amžius varijavo nuo 25 iki 85 metų.
Metodika: Tyrime dalyvavusioms sergančioms gimdos kaklelio vėžiu ir sveikoms moterims buvo atliktas onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu, žmogaus papilomos viruso aukštos rizikos genotipų nustatymas PGR metodu bei citokinų nustatymas, naudojant Luminex technologiją. Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant SPSS programinį paketą. Duomenys buvo vertinami kaip statistiškai patikimi ir reikšmingi, kaip < α = 0,05.
Tyrimo rezultatai: Tyrime dalyvavo 33 (40,74 proc.) gimdos kaklelio vėžiu sergančios moterys, jų amžiaus vidurkis buvo 49,94±10,85 ir 48 (59,26 proc.) sveikos moterys, jų amžiaus vidurkis buvo 55,09±13,47. Gimdos kaklelio vėžiu sergančių ir sveikų moterų amžius nesiskyrė..
Mūsų tyrime nebuvo nustatyti skirtumai tarp tirtų citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ir gimdos kaklelio vėžiu sergančių bei sveikų moterų.
Tyrimo metu nustatytos IFN-β koncentracijos medianos tarp skirtingos (I – IV) stadijos gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų nesiskyrė, atitinkamai 102,88 (95,71–108,85) pg/ml, 98,10 (83,77– 108,85) pg/ml, 93,32 (78,99–100,49) pg/ml ir 101,68 (88,55–102,88) pg/ml. Taip pat nustatytos IFN-γ koncentracijos medianos tarp skirtingos (I – IV) stadijos gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų nesiskyrė
nesiskyrė, atitinkamai 1695,5 (1693,1–1704,0) pg/ml, 1766,0 (1712,5–1785,4) pg/ml, 1785,4 (1756,2–1802,4) pg/ml ir 1773,3 (1746,5–1785,4) pg/ml. Tyrimo metu nustatyros IL-1β koncentracijos
medianos tarp skirtingos (I – IV) stadijos gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų nesiskyrė, atitinkamai 114,67 (110,30–121,23) pg/ml, 166,04 (131,06–173,69) pg/ml, 149,65 (149,65–164,95) pg/ml, 171,51 (164,95–173,69) pg/ml.
4 Savo tyrime nustatėme, jog INF-γ koncentracija tiesiogiai koreliuoja su gimdos kaklelio vėžio stadijom. Nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys (r = 0,402, p = 0,034). Koreliacija tarp INF-β ir IL-1β koncentracijos su gimdos kaklelio vėžio stadijomis nenustatyta.
Mūsų tyrime nebuvo nustatyti reikšmingi skirtumai tarp tirtų citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ir tyrime dalyvavusių gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų amžiaus. Taip pat nebuvo nustatyti skirtumai tarp INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų ir tyrime dalyvavusių sveikų moterų amžiaus. Išvados:
1. Gimdos kaklelio vėžiu sergančių ir sveikų moterų citokinų INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijos nesiskyrė.
2. INF-γ koncentracija didėja sunkėjant gimdos kaklelio vėžio stadijai. INF-β ir IL-1β koncentracijų skirtumai skirtinguose gimdos kaklelio vėžio stadijose nebuvo nustatyti.
3. INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų skirtumai tiek tarp gimdos kaklelio vėžiu sergančių, tiek tarp sveikų moterų skirtinguose amžiaus grupėse nebuvo nustatyti.
5
SUMMARY
Author: Rūta Andrijauskaitė.
Title: Associations between Cytokines (INF-β, INF-γ, and IL-1β) and Cervical Cancer.
Work aim: To determine the association between cytokines (INF-β, INF-γ, and IL-1β) and cervical cancer. Tasks:
1. To determine the relationship between cytokine (INF-β, INF-γ, and IL-1β) concentrations and cervical cancer.
2. To determine the relationship of cytokine (INF-β, INF-γ, and IL-1β) concentrations with the stages of cervical cancer.
3. To determine the correlation between cytokine (INF-β, INF-γ, and IL-1β) concentrations and the subject's age.
Methods: The study included an oncocytological examination of a liquid-based cervical smear in cervical cancer patients and healthy women, PCR detection of high-risk human papillomavirus genotypes, and cytokine detection using Luminex technology. Statistical analysis was performed using the SPSS software package. Data were assessed as statistically significant and significant at p < α = 0.05.
Objects: The study included 81 women, 33 of whom had cervical cancer, and 48 were healthy. The age of women varies between 25 and 85 years.
Results: The study included 33 (40.74%) women with cervical cancer, with a mean age of 49.94±10.85 and 48 (59.26%) healthy women, with a mean age of 55.09±13.47. The mean age of the women in the study did not differ.
In our study, no differences were found between the concentrations of the tested cytokines (INF-β, INF-γ,and IL-1β) and cervical cancer patients and healthy women.
In the study was no difference in median level of IFN-β at different stages of cervical cancer 102.88
(95.71–108.85) pg/ml, 98.10 (83.77–108.85) pg/ml, 93.32 (78.99–100.49) pg/ml and 101.68 (88.55–102.88) pg/ml. In the study was no difference in median level of IFN-γ at different stages ofcervical
cancer 1695.5 (1693.1–1704.0) pg/ml, 1766.0 (1712.5–1785.4) pg/ml, 1785.4 (1756.2–1802.4) pg/ml and 1773.3 (1746.5–1785.4) pg/ml. In the study was no difference in median level of IL-1β at different stages of cervical cancer 114.67 (110.30–121.23) pg/ml, 166.04 (131.06–173.69) pg/ml, 149.65 (149.65–164.95) pg/ml, 171.51 (164.95–173.69) pg/ml.
6
In our study we found that INF-γ levels directly correlates with the stages of cervical cancer (r = 0.402, p = 0.034). No correlation was found between INF-β and IL-1β concentrations with
cervicalcancer stages.
In our study, no significant differences were found between the concentrations of tested cytokines (INF-β, INF-γ, and IL-1β) and the age of women with cervical cancer. There were also no differences between the concentrations of INF-β, INF-γ and IL-1β and the age of healthy women in the study.
Conclusions:
1. Concentrations of cytokines INF-β, INF-γ and IL-1β did not differ between women with cervical cancer and healthy women.
2. INF-γ levels increase with worsening of the cervical cancer stage. Differences in INF-β and IL-1β concentrations at different stages of cervical cancer were not detected.
3. No differences in INF-β, INF-γ, and IL-1β concentrations were observed between cervical cancer and healthy women in different age groups.
7
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju savo baigiamojo magistro darbo vadovei doc. dr. Erikai Skrodenienei už visapusišką pagalbą, kantrybę ir patarimus rašant magistro darbą.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Darbo autoriui interesų konflikto nebuvo.
BIOETIKOS CENTRO LEIDIMAS
Tiriamasis magistro darbas atliktas gavus LSMU Bioetikos centro leidimą Nr. BEC–LMB(M)–300, kuris buvo išduotas 2019-02-21.
8
SANTRUMPOS
AGC-NOS AIS ASC-H ASC-US CD CIN CIS DNR GKV HSIL IL INF-α INF-β INF-γ LED LSIL MCH MFI miRNR NILM NK PGR PSO RNR SCC– nenustatytos reikšmės atipinės liaukinio epitelio ląstelės
– endocervikinė adenocarcinoma in situ (angl. Adenocarcinoma in situ)
– galimi žymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai (angl. atypical squamous cells cannot exclude HSIL)
– nenustatytos reikšmės atipinės plokščiojo epitelio ląstelės (angl. atypical squamous cells of undetermined significance)
– ląstelės žymuo (angl. cluster of differentiation)
– gimdos kaklelio intraepitelinė neoplazija (angl. cervical intraepithelial neoplasia) – karcinoma in situ
– deoksiribonukleorūgštis – gimdos kaklelio vėžys
– žymūs plokščiojo epitelio ir intraepiteliniai pokyčiai (angl. high-grade squamous intraepithelial lesions)
– interleukinas – interferonas alfa – interferonas beta – interferonas gama
– šviesos diodai (angl. light emitting diode)
– nežymūs plokščiojo epitelio intraepiteliniai pokyčiai (angl. low-grade squamous intraepithelial lesions)
– vidutinis hemoglobino kiekis eritrocite – minimalus fluorescencijos intensyvumas – mikro ribonukleino rūgštis
– nėra intraepitelinių pokyčių ar piktybinio naviko (angl. negative for intraepithelial lesions or malignancy)
– natūralieji kileriai
–polimerazinė grandininė reakcija (angl. Polymerase chain reaction)
– pasaulinė sveikatos organizacija (angl. World Health Organisation (WHO)) – ribonukleino rūgštis
9 TGF-β TNF TNF-α TNF-β TNF-γ ŽPV
– transformuojantis augimo faktorius beta (angl. tumor growth factor beta) – naviko nekrozės faktorius (angl. tumor necrosis factor)
– naviko nekrozės faktorius alfa (angl. tumor necrosis factor alpha) – naviko nekrozės faktorius beta (angl. tumor necrosis factor beta) – naviko nekrozės faktorius gama (angl. tumor necrosis factor gama) – žmogaus papilomos virusas (angl. human papilloma virus)
10
ĮVADAS
Pasaulyje gimdos kaklelio vėžys yra viena aktualiausių onkologinių ligų, kuri sudaro 6,6 proc. visų moterų vėžinių susirgimų. Nors ši liga dažniau siejama su silpnai ekonomiškai išsivysčiusiomis šalimis, Lietuvoje gimdos kaklelio vėžys užima ketvirtą vietą pagal moterų sergamumą, po krūties, odos bei gimdos kūno piktybinių navikų [3–5, 9]. Tai jaunų 30–60 metų amžiaus moterų liga [47]. Siekiant sumažinti sergamumą bei mirtingumą nuo gimdos kaklelio vėžio yra skiriama daug dėmesio jo ištyrimui, tyrimų metodų tobulinimui, prevencinių priemonių taikymui, taip pat gerinamas ankstyvas ligos diagnozavimas bei kuriami inovatyvius gydymo metodai [69].
Viena iš pagrindinių gimdos kaklelio vėžio išsivystymo priežasčių yra žmogaus papilomos virusas (ŽPV) [4, 10]. Didžiausią riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu kelia ŽPV 16 ir 18 tipai [9]. Virusas plinta lytiniu keliu, todėl ŽPV užsikrėtimo tikimybė priklauso nuo lytinio gyvenimo ypatumų: ankstyvo lytinio gyvenimo pradžios, partnerių skaičiaus bei jų infekuotumo ŽPV [15, 16]. Kad išsivystytų gimdos kaklelio pažeidimai infekcija turi būti ilgalaikė. Yra išskiriami ir kiti veiksniai, kurie padidina onkogeninių mutacijų riziką: ilgas hormoninių kontraceptinių priemonių naudojimas, rūkymas, mikroelementų kiekis organizme [13, 17, 18, 21, 47]. Taip pat įtakos ikivėžiniams procesams turi paveldimumas bei chromosomų lygmens paklaidos [11, 50].
Uždegimas, kuris atsiranda po virusinės infekcijos, daro įtaką gimdos kaklelio vėžio vystymuisi. Infiltruotos imuninės ląstelės ir jų sekretuojami citokinai (interleukinai, hemopoetinai, interferonai, navikų nekrozės faktorius ir chemokinai) įvairiai veikia piktybines ląsteles [22]. Šios baltyminės kilmės medžiagos, esančios naviko mikroaplinkoje, gali ne tik slopinti, bet ir aktyvinti vėžinių ląstelių dalijimąsi, proliferaciją bei ligos progresavimą t.y. metastazavimą į kitus organus [13, 23].
Sergant gimdos kaklelio vėžiu, supratus citokinų atliekamas funkcijas ir išmanant jų koncentracijų kitimus, citokinai gali būti informatyvus ir patogus sekimo žymuo. Citokinų tyrimai iš periferinio kraujo leistų stebėti onkologinės ligos eigą bei gydymo efektyvumą [12]. Mechanizmų susijusių su uždegiminiais bei vėžiniais procesais supratimas gali paskatinti novatoriškus gimdos kaklelio vėžio gydymo metodus [22, 28–32].
11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) ir gimdos kaklelio vėžio sąsajas. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ryšį su gimdos kaklelio vėžiu.
2. Įvertinti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų sąsajas su gimdos kaklelio vėžio stadijomis. 3. Nustatyti citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ryšį su tiriamųjų amžiumi.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Gimdos kaklelio vėžys
Gimdos kaklelio vėžys – tai piktybinis ploksčialąstelinio epitelio arba gimdos kaklelio kanalo liaukinio epitelio navikas, kuris išsivysto iš ikinavikinių ląstelinių pokyčių, kurių metu vyksta nekontroliuojama pakitusių ląstelių proliferacija [1].
Plokščialąstelinis epitelinis piktybinis navikas sudaro didžiąją dalį (apie 90 proc.) visų gimdos kaklelio vėžio atvejų, rečiau nustatomi liaukinio epitelio piktybiniai pakitimai, vadinami adenokarcinoma (apie 10 proc.). Retais atvejais yra aptinkamas adenoplokščialąstelinis arba smulkialąstelinis navikas [2, 42].
1.2 Gimdos kaklelio vėžio paplitimas
Pasaulyje gimdos kaklelio vėžys užima ketvirtą vietą tarp dažniausiai pasitaikančių vėžio formų ir sudaro 6,6 proc. visų moterų vėžinių susirgimų. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, 2018 m. pasaulyje gimdos kaklelio vėžiu sirgo apie 570 000 moterų. Dėl šios ligos kasmet pasaulyje miršta 265 000 moterų. Apie 90 proc. mirčių nuo šios onkologinės ligos yra registruojama neišsivysčiusiose ir besivystančiose šalyse [3–5].
Europoje gimdos kaklelio vėžys yra antroje vietoje po krūties vėžio. Kasmet registruojama apie 33 000 naujų susirgimo atvejų. Lyginant moterų mirtingumą nuo šios onkologinės ligos Centrinėje ir Rytų Europoje fiksuojama daugiau mirties atvejų nei Vakarų Europoje. Didžiausias sergamumas ir mirtingumas stebimas Rumunijoje, Lietuvoje, Bulgarijoje, Serbijoje bei Moldovoje, o mažiausias – Šveicarijoje, Maltoje, Suomijoje ir Kipre [6, 7]. Moterų sergančių gimdos kaklelio vėžiu amžiaus vidurkis – 47 metai [8].
Tarp Lietuvos moterų ši piktybinė onkologinė liga užima ketvirtą vietą pagal moterų sergamumą, po krūties, odos bei gimdos kūno piktybinių navikų [9, 52]. Nacionalinėje vėžio profilaktikos ir kontrolės 2004–2025 metų programoje teigiama, kad mirtingumas nuo gimdos kaklelio vėžio augo 13,5 proc. nuo 2003 iki 2010 metų. „Lietuvos vėžio registro duomenimis, kasmet Lietuvoje gimdos kaklelio vėžys nustatomas nuo 400 iki 500 moterų, o mirtingumas siekia 10 atvejų 100 000 moterų“ [3].
13 1.3 Gimdos kaklelio vėžio etiologija ir patogenezė
Gimdos kaklelio vėžio išsivystymui įtakos turi paveldimumas bei chromosomų lygmenyje atsiradę pakitimai. Daugumai moterų, kurios serga gimdos kaklelio vėžiu yra nustatomas žmogaus papilomos virusas (ŽPV) [1, 4, 11]. Tai Papillomaviridae šeimos virusas neturintis apvalkalo, pasižymintis dvigrande, žiedine, uždaro tipo deoksiribonukleorūgšties (DNR) grandine. Šis virusas odoje bei gleivinėje sukelia nekontroliuojamą ląstelių proliferaciją [1, 12]. ŽPV dažniausiai būna perduodamas lytiniu keliu [45]. ŽPV infekcija yra viena iš labiausiai paplitusių lytiškai plintančių infekcijų visame pasaulyje. Didžioji dalis seksualiai aktyvių moterų per savo gyvenimą bus užsikrėtusios ŽPV, tačiau dauguma ŽPV infekcijų išnyksta per dvejus metus [13, 45]. Nustatyta, kad vienas didžiausių įtaką susirgti gimdos kaklelio vėžiu darančių veiksnių yra ŽPV infekcija. Net apie 99 proc. įvairių gimdos kaklelio vėžio formų atvejų yra susiję su ŽPV infekcija [20, 43]. Šiuo metu yra išskiriama daugiau nei 200 ŽPV tipų, kurie kelia riziką susirgti vėžiniais susirgimais. Nustatyta, jog apie 40 ŽPV tipų gali sukelti skirtingus infekcinius procesus: infekcijas odoje bei lytinių organų gleivinėje, dėl jų išsivysto gerybinės odos papilomos, taip pat sukelia ikivėžinius ir piktybinius gimdos kaklelio epitelio pakitimus [14]. Šio viruso sukelta liga priklauso nuo ŽPV tipo. Gimdos kaklelio piktybinio naviko išsivystymui įtakos turi ŽPV aukštos rizikos tipų infekcijos [12]. Didžiausią riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu kelia ŽPV 16 ir 18 tipai [9]. Dažniausiai virusas į moters organizmą patenka lytiniu keliu, todėl šio viruso užsikrėtimo tikimybė priklauso nuo lytinių partnerių skaičiaus (didelis lytinių partnerių skaičius 3–7 kartus didina tikimybę užsikrėsti ŽPV) bei lytinio gyvenimo pradžios (pradėjus lytinį gyvenimą gyventi ankstesniame amžiuje padidėja užsikrėtimo rizika). Tyrimais nustatyta, kad daugiau kaip 80 proc. seksualiai aktyvių moterų tam tikru gyvenimo laikotarpiu bus užkrėstos lytiniu keliu plintančiu ŽPV [15, 16]. Skiriami ir kiti veiksniai, padidinantys onkogeninių mutacijų riziką: ilgas kontraceptinių priemonių naudojimas, rūkymas.
Yra nustatyta, kad hormoninių kontracepcijos priemonių vartojimas yra potencialus veiksnys gimdos kaklelio vėžio išsivystymui [13, 47]. Vėžinių pakitimų riziką didina ilgą laiką vartojami kontraceptikai bei dažnas lytinių partnerių keitimas. Stebima tendencija, jog moterys, kurios yra infekuotos ŽPV ir vartojo oralinius kontraceptikus, turi didesnę tikimybę susirgti gimdos kaklelio vėžiu [17]. Rizikos didėjimas yra siejamas su kontraceptinių priemonių vartojimo trukme: pastebėta, kad trumpesnis oralinių kontraceptikų vartojimas nei penkeri metai nedidina piktybinių navikų išsivystymo rizikos. Tačiau kontraceptinius preparatus vartojant ilgesnį laikotarpį, vėžio išsivystymo rizika didėja iki 5 kartų. Jei apsaugos priemonės yra vartojamos ilgiau nei 10 metų, didėja gimdos kaklelio neoplazijos tikimybė, keturis kartus didėja invazinio vėžio ir tris kartus karcinomos in situ tikimybė [6, 18]. Mechanizmas, padedantis paaiškinti ryšį tarp oralinių kontraceptikų vartojimo ir gimdos kaklelio vėžio išsivystymo rizikos, yra tas,
14 kad estrogenai ir progestogenai gali sąveikauti su hormonų receptoriais, esančiais gimdos kaklelio audinyje. Ši sąveika turi įtakos tolimesniam ŽPV infekcijos vystymuisi. Manoma, kad lytiniai steroidiniai hormonai padidina ŽPV onkogenų raišką, stimuliuodami naviko slopintuvų genų skilimą ir stiprindami virusinės DNR gebėjimą transformuoti ląsteles ir sukelti kancerogenezę [13].
Yra nustatyta, jog cigarečių rūkymas gali didinti plokščialąstelinio gimdos kaklelio karcinomos atsiradimo riziką nuo dviejų iki keturių kartų [15, 19]. Tai siejama ne tik su ilgu ir aktyviu rūkymu, bet ir su tabako dūmais, esantys aplinkoje. Tabake esančios medžiagos, gimdos kaklelio kancerogenezę gali paveikti dviem būdais: pirmasis – cigaretėse esantis tabakas ir jo pagrindinis metabolitas kotoninas, tiesiogiai veikia gimdos kaklelio gleivinės ląstelių DNR. Antrasis – rūkant organizme susidaro medžiagų apykaitos produktai: aromatiniai policikliniai angliavandeniai, aromatiniai aminai, kurie taip pat veikia gimdos kaklelio gleivinę [20]. Atsisakius šio žalingo įpročio, dažnu atveju yra stebimas gleivinės pažeidimų išnykimas dėl to rūkymas yra nepriklausomas gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksnys [10, 21].
Atlikus įvairius tyrimus, susijusius su mikroelementų koncentracijomis bei naviko progresavimu, gauti rezultatai parodė, kad mažas folio rūgšties, vitamino A, vitamino E ir kitų mikroelementų kiekis yra susijęs su gimdos kaklelio vėžio rizika. Nustatyta, kad mažas folio rūgšties kiekis gali padidinti gimdos kaklelio vėžio riziką, taip pat pastebėta, kad folio rūgšties koncentracijos padidėjimas koreliuoja su sumažėjusia ląstelių proliferacija ir padidėjusia apoptoze moterų gimdos kaklelio vėžio ląstelių linijose [22, 44]. Vitaminas E yra gerai žinomas lipidų peroksidacijos slopiklis ir galingas antioksidantas, kuris apsaugo ląsteles nuo oksidacinių DNR pažeidimų bei mutagenezės ir taip apsaugo nuo kai kurių navikų atsiradimo. Atliktų tyrimų rezultatai parodo, kad vitamino E vartojimas ir šio vitamino kiekis kraujyje turi reikšmingą atvirkštinį ryšį su gimdos kaklelio naviko rizika, t.y. didelis vitamino E kiekis yra reikšmingai susijęs su sumažėjusia gimdos kaklelio neoplazijos rizika [4]. Taip pat buvo nustatyta atvirkštinė koreliacija tarp α-karotino bei β-karotino kiekio ir gimdos kaklelio vėžio t.y. didelis šių antioksidantų kiekis maiste ar koncentracija kraujo serume mažina gimdos kaklelio vėžio išsivystymo riziką [21].
Buvo pastebėta, jog moterų gimdymo skaičius turi sąsajų su gimdos kaklelio vėžio išsivystymu. Moterims, kurios yra gimdžiusios 3 ar daugiau kartų ši onkologinė liga yra diagnozuojama dažniau [20]. Neštumo metu moters organizme vyksta hormonų pusiausvyros pokyčiai, kurie turi įtakos gimdos kaklelio vystymuisi [20, 43]. Padidėjusi gimdos kaklelio vėžio išsivystymo galimybė yra siejama ir su nutrauktu neštumu [46].
Iš kai kurių atliktų tyrimų yra pastebėta, jog moterys, kurioms buvo diagnozuota chlamidinė infekcija turi didesnę riziką susirgti gimdos kaklelio vėžiu. Atlikti tyrimai rodo, kad Chlamydia genties
15 bakterijos gali padėti ŽPV progresuoti gimdos kaklelyje, o tai gali padidinti gimdos kaklelio vėžio riziką [47].
Invazinio gimdos kaklelio vėžio vystymasis galimas trim būdais: kai ikinavikiniai pokyčiai nustatomi gimdos kaklelio išorinės dalies ląstelėse, kai yra gimdos kaklelio kanalo pakitimų (displazijų) arba aptinkami preinvaziniai pakitimai (carcinoma in situ). Dažniausiai esant šiems ląstelių pakitimų atvejams (apie 70 proc.) invazinis gimdos kaklelio vėžys išsivysto per 12–15 metų, tačiau praktikoje pasitaiko atvejų kai ši onkologinė liga progresuoja per vienerius metus. Gimdos kaklelio naviko progresavimas prasideda, kai jis perauga bazinę membraną, skiriančią gimdos kaklelio gleivinę ir įauga į gimdos kaklelio stromą. Progresuojant gimdos kaklelio vėžiui jis metastazuoja per limfinę sistemą, metastazės nustatomos sritiniuose limfmazgiuose, o metastazuojant per kraują – metastazės kituose organuose ir kauluose [2].
1.4 Citokinų reikšmė gimdos kaklelio vėžio vystymuisi
Navikinių ląstelių augimas – patologinis procesas vykstantis organizme, kurio metu yra sutrikdoma imuninės sistemos pusiausvyra. Kaip vystysis navikinis procesas, priklauso nuo daugelio veiksnių: navikinių ląstelių signalo priėmimo ir perdavimo, jų sąveikos su imuninės sistemos ląstelėmis bei imunokompetentinių ląstelių aktyvumo kovojant su navikinėmis ląstelėmis. Citokinų mišinys, kuris yra naviko mikroaplinkoje, gali ne tik stabdyti, bet ir skatinti navikinių ląstelių dauginimąsi ir naviko augimą, palengvinti metastazavimą ir naviko invaziją į greta esančius organus [23].
Citokinai – tai grupė tirpių baltyminės kilmės medžiagų, kurios reguliuoja, specifines ir nespecifines imunines sistemos reakcijas. Citokinai yra skirstomi į interleukinus (IL), hemopoetinus, interferonus (INF), navikų nekrozės faktorius (TNF), chemokinus [24, 25]. Šių medžiagų veikimo spektras yra labai platus: aktyvina arba slopina hemopoezę, uždegimo, imuninių, tame tarpe ir navikinių ląstelių, augimą, kontroliuoja jų proliferaciją ir diferenciaciją, brendimą, migraciją, funkcinį aktyvumą bei daro įtaką apoptozei [23, 25]. Citokinus, skirtingai nei hormonus, sintetina ir išskiria tik suaktyvintos imuninės ląstelės (makrofagai, T ir B limfocitai, putliosios ląstelės). Kadangi šios medžiagos veikia labai mažu atstumu, jų poveikis pasireiškia šalia sintezės vietos, dėl to citokinai gali veikti ir juos sintezuojančias ląsteles [24]. Citokinų klasifikacija pagal funkcinį aktyvumą ir sintezės vietą pateikta 1 lentelėje [24, 26, 27].
16
1 lentelė. Citokinų klasifikacija
Pagal funkcinį aktyvumą
Hemopoetiniai faktoriai IL-3, IL-7, IL-9, IL-11, eritropoetinas; Prouždegiminiai citokinai – dalyvauja
nespecifinio imuniteto reakcijose, darydami įtaką apoptozei
IL-1, IL-6, TNF- α, chemokinai, IL-8, IL-15, IL-18;
Kontroliuojantys specifinio imuniteto reakcijas – citokinai dalyvauja limfocitų diferenciacijoje bei aktyvacijoje
IL-2, IL-4, TNF-β, IL-13;
Reguliuojantys uždegimines reakcijas IL-5, IL-10, INF-γ; Dalyvaujantys priešvėžiniuose procesuose TNF, LTα, IL-27; Pagal sintetinimo vietą
Leukocitų mediatoriai Interleukinai
Limfocitų mediatoriai Limfokinai
Šios baltyminės kilmės medžiagos, esančios naviko mikroaplinkoje, gali ne tik slopinti, bet ir aktyvinti navikinių ląstelių dalijimąsi, proliferaciją bei ligos progresavimą t.y. metastazavimą į kitus organus [13]. Yra pastebima, kad citokinai, kuriuos išskiria ląstelės, esančios naviko mikroaplinkoje, veikia parakriniškai (gr. para – šalia) navikines ląsteles bei didina šių ląstelių atsparumą chemoterapiniams vaistams. Dėl šių priežasčių citokinai yra geras diagnostinis vėžio žymuo, nustatomas iš periferinio kraujo tyrimo [12]. Citokinų sintezės vietos bei funkcijos pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Citokinų sintezės vieta bei funkcijos [23–25, 27, 28]
Citokinas Citokiną produkuojančios ląstelės
Veikimo spektras
IL-1 Makrofagai, monocitai, sintezėje gali dalyvauti limfocitai, fibroblastai, endotelinės, epitelinės ląstelės.
Dalyvauja imunoreguliaciniuose procesuose, skatina CD4+ limfocitų proliferaciją, B limfocitų augimą ir diferenciaciją, indukuoja IL-2 produkciją, skatina NK ląstelių sąveiką su navikinėmis ląstelėmis, slopina navikinių ląstelių proliferaciją, skatindamas IL-12 sintezę.
17 IL-2 CD4+ T limfocitai (apie
90 proc.) bei CD8+ T limfocitai (apie 10 proc.)
Po antigeno atpažinimo aktyvina T limfocitų klonų proliferaciją t.y. veikia ląsteles, kurios jį sintetina– autokrininis poveikis, taip pat reguliuoja NK ląstelių bei B limfocitų proliferaciją ir stimuliuoja antikūnų sintezę IL-4 Putliosios ląstelės ir
makrofagai
Slopa makrofagų gebėjimą sintetinti prouždegiminius citokinus, dalyvauja alerginių reakcijų vystymesi ir jų reguliacijoje, skatina antinavikinį makrofagų aktyvumą. IL-6 Limfocitai, hepatocitai,
endotelinės ir
mezenchiminės ląstelės, taip pat ir navikinės ląstelės,
Reguliuoja imuninį atsaką: kaip nespecifinio imuniteto mediatorius stimuliuoja ūmios fazės baltymų sintezę hepatocituose taip sukeldamas ūmios fazės atsaką, o specifinių reakcijų metu indukuoja IL-2 produkciją, B limfocitų proliferaciją, diferenciaciją bei virtimą plazminėmis ląstelėmis, imunoglobulinų sekreciją. IL-7 Fibroblastai, kaulų čiulpų
stromos ląstelės bei makrofagai.
Inicijuoja hemopoezę bei aktyvina monocitus, jog šie sintetintų citokinus.
IL-8 Monocitai, makrofagai ir endotelinės ląstelės.
Aktyvinti neutrofilus uždegimo metu.
IL-10 Makrofagai, T limfocitai. Slopina T limfocitų proliferaciją ir funkcinį aktyvumą, taip pat makrofagų ir monocitų aktyvumą taip pat slopindamas ląstelines imunines reakcijas, skatina B limfocitų proliferaciją ir IgM ir IgA sintezę.
IL-12 Makrofagai, dendritinės ląstelės.
Dalyvauja nesubrendusių T limfocitai diferenciacijoje, taip pat skatina citokinų IL-6, IL-15, IL-18, TNF-α sintezę, aktyvuoja makrofagų citotoksiškumą.
Il-18 Indukuojamas stresiniais signalais.
Indukuoja interferoną-γ (IFN-γ), kuris aktyvina reakcijas prieš bakterines bei virusines infekcijas taip pat žadina priešnavikinį atsaką.
IL-23 Dendritinės ląstelės. Aktyvina makrofagus TNF-γ sintezei ir skatina angiogenezę. IL-23 yra svarbus navikiniame procese: kai kuriais atvejais gali skatinti navikų augimą, kitais – veikia prieš naviką.
18 TNF-α Monocitai ir makrofagai,
NK ląstelės bei T limfocitai.
Reguliuoja homeostazę, skatina uždegimines reakcijas į bakterines, virusines, parazitines infekcijas, taip pat dalyvauja vietinėse uždegiminėse reakcijose, didina kraujagyslių pralaidumą, skatina žaizdų gijimą, gali sukelti ląstelių apoptozę, dėl to yra citotoksiškas nemažam kiekiui navikinių ląstelių. Taip pat dalyvauja kontroliuojant ŽPV, tam tikrais atvejais dalyvauja navikų nekrozėje, kitais atvejais gali skatinti navikų augimą. TNF-β Mitogenų aktyvinti
T limfocitai, bet gali ir kitos ląstelės kaip: fibroblastai, endotelio ar epitelio ląstelės
Šis citokinas yra citotoksiškas vėžinėms ląstelėms, slopina angiogenezę, skatina kai kurių citokinų raišką bei metabolinius procesus ląstelėse
TGF-β T limfocitai, makrofagai ir navikinės ląstelės.
Slopina ląstelių (normalių ir vėžinių) dauginimąsi, diferenciaciją, indikuoja jų apoptozę.
INF-α Leukocitai ir kitos imuninės ląstelės.
Atlieka antivirusinę funkciją, tiesiogiai slopina navikines ląsteles, teigiamai prisideda prie NK ląstelių reguliacijos. INF-β Dažniausiai sintetina
fibroblastai, bet gali ir kt. imuninės ląstelės.
Skatina navikinių ląstelių žūti ir uždegiminius procesus.
INF-γ CD4+ T limfocitai, NK ląstelės.
Aktyvuoja makrofagus, gerina antigeno pateikimą T limfocitams, sukelia T limfocitų diferenciaciją ir proliferaciją, aktyvina neutrafilus ir NK. pasižymi nestipriu priešnavikiniu poveikiu, imuninio atsako efektorinis citokinas
Yra pastebėta, jog sergant gimdos kaklelio vėžiu citokinų koncentracijų kitimas gali būti informatyvus stebėjimo žymuo, kontroliuojant onkologinės ligos gydymą. IL-6 indukuoja mielominių ląstelių proliferaciją, daro įtaką gimdos kaklelio, tiesiosios žarnos bei inkstų piktybinių navikų augimui [23, 29, 30]. IL-6 koncentracija koreliuoja su bloga gimdos kaklelio vėžio prognoze [28]. IL-10 koncentracijos padidėjimas siejamas su bloga gimdos kaklelio vėžio prognoze ir naviko progresavimu. IL-12 pasižymi priešnavikiniu poveikiu sergant plaučių vėžiu. Nustatyta, jog IL-12 koncentracija mažėja, esant gimdos kaklelio karcinomai. Išplitus metastazėms yra pastebima, IL-12 prouždegiminio citokino
19 koncentracijos periferiniame kraujyje padidėjimas [23]. Yra duomenų, kurie leidžia manyti, jog INF-α gali turėti įtakos prieš gimdos kaklelio vėžį suaktyvindamas ląstelių apoptozę [31]. INF-γ koncentracija gimdos kaklelio vėžio atveju dažnai sumažėja, taip pat nustatyta, kad TGF-β yra susijęs su naviko augimu [32].
Interleukinas-1 – tai prouždegiminis citokinas, uždegiminio proceso mediatorius, reguliuojantis kūno temperatūrą, dėl to dar gali būti vadinamas endogeniniu pirogenu [24]. Yra išskiriamos dvi šio interleukino formos: IL-1α ir IL-1β. Daugelis navikinių ląstelių turi sugebėjimą sintetinti šį interleukiną, ir tai lemia navikų proliferaciją [1]. IL-1α dėl koncentracijų kitimo esant navikui gali būti vertingas biologinis žymuo, prognozuojant gimdos kaklelio vėžio gydymą [28, 33]. Nors IL-1 citokinai vaidina svarbų vaidmenį imunitete ir audinių atstatyme, jų nereguliuojama išraiška dažnai susijusi su autoimuninėmis ir uždegiminėmis ligomis. Todėl IL-1 šeimos interleukinų koncentracijas griežtai reguliuoja transkripcijos mechanizmai [34].
Interferonus – ląstelės pradeda sintetinti ir išskirti, kai į organizmą patenka patogeninės kilmės medžiagos: virusai, bakterijos, parazitai bei pradėjus formuotis navikams. INF silpnina patogeninių ląstelių veikimą slopindamas jų dauginimąsi bei aktyvindamas imuniniame atsake dalyvaujančias ląsteles. Taip pat skatina užkrėstų ar navikinių ląstelių atpažinimą bei didina sveikų ląstelių atsparumą. Šie baltymai vieni pirmųjų iš citokinų buvo sėkmingai panaudoti įvairių ligų gydymo tikslais [23, 24, 35, 41]. INF-α daro priešvėžinį poveikį slopindamas ląstelių dauginimąsi, skatindamas ląstelių apoptozę ir (arba) slopindamas onkogeno ekspresiją [36, 37]. Kitas mechanizmas, per kurį pasireiškia interferonų antivirusinis poveikis, yra mikro ribonukleino rūgštis (miRNR) ekspresijos moduliavimas. Be to, onkogeninių virusų atveju šių citokinų sukeltas miRNR raiškos sutrikimas gali pasireikšti priešvėžiniu poveikiu. MiRNR yra mažos, nekoduojančios, labai koncentruotos RNR, galinčios po transkripcijos reguliuoti ląstelių funkcijas. Daugelio miRNR ekspresija yra blogai sureguliuojama įvairių vėžio rūšių atvejais: padidėjęs onkogeninių miRNR kiekis arba sumažėjęs onkosupresoriaus miRNR ekspresija gali sukelti ląstelių dauginimąsi, invaziją ir metastazes [35].
Interferonas-β – tai baltyminės kilmės medžiagos dažniausiai sintetinamos fibroblastuose, kurių molekulinė masė yra apie 20 kDa. Dažniausiai šis citokinas yra minimas išsėtinės sklerozės eigos stebėsenoje ir gydyme [24]. Tačiau taip pat prisideda prie vėžinių ląstelių reguliacijos t.y. skatina jų žūtį [27].
Interferonas-γ – tai baltymai, kurių molekulinė masė siekia 25 kDa. Šie baltymai yra sintetinami tik T limfocituose, dėl to dar yra vadinami T limfocitų imuniniu interferonu. INF-γ yra taikomas gydymo tikslais sergant lėtine granuliomatoma ar piktybine osteoporoze [24]. Šis citokinas vaidina svarbų vaidmenį ne tik organizuojant įgimtą ir adaptyvų imuninį atsaką prieš virusus, bakterijas ir navikus, bet taip pat
20 skatinant patologinius uždegiminius procesus susijusius su nėštumu, nutukimu, alergijomis, autoimuninėmis ligomis bei vėžiu. Palaipsniui augančiuose navikuose INF-γ skatina adaptacinio atsparumo būseną [35, 38, 39]. Šis citokinas ne tik kontroliuoja naviko pradžią ir progresavimą, bet ir formuoja naviko imunogeniškumą bei skatina naviko ląstelių augimą [40]. Iš anksčiau atliktų tyrimų yra žinoma, kad šis citokinas skatina molekulių raišką naviko ląstelėse, dėl ko didėja piktybinių ląstelių imunogeniškumas. IFN-γ pasižymi priešvėžiniu poveikiu: slopina navikinių ląstelių proliferaciją bei skatiną jų apoptozę. Didesnės IFN-γ koncentracijos chemoterapijai atsparių pacienčių kraujyje taip pat gali būti siejamos su stipresniu priešvėžiniu imuniniu atsaku [54].
21
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrimo apimtis
Darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Laboratorinės medicinos klinikoje, gavus LSMU Bioetikos centro leidimą 2019-02-21 Nr. BEC–LMB(M)–300.
Tyrime dalyvavo 81 moteris, kurios lankėsi LSMU ligoninės Kauno klinikos Akušerijos ir ginekologijos klinikos konsultacijoje. Jų amžiaus vidurkis buvo 51,74±12,23 metai. Į tyrimą pakviestos 33 (40,74 proc.) moterys, kurioms nustatytas gimdos kaklelio vėžys. 48 (59,26 proc.) sveikos moterys buvo pakviestos, kaip kontrolinė grupė. Visoms tyrime dalyvavusioms moterims buvo atliktas onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu, ŽPV aukštos karcinominės rizikos genotipų nustatymas PGR metodu ir citokinų nustatymas taikant Luminex technologiją.
2.2 Tyrimo metodai
2.2.1 Onkocitologinis gimdos kaklelio tepinėlio tyrimas skystos terpės metodu
Ėminio paėmimas ir laikymas.
Ėminiai buvo imami naudojant endocervikalinį šepetėlį-šluotelę Cervex – Brush (Rovers Medical Devices, Olandija). Šis šepetėlis skirtas paimti medžiagą iš gimdos kaklelio kanalo ir egzocervikinės/transformacijos zonos.
Šepetėlis buvo švelniai kišamas į gimdos kaklelio kanalą ir sukamas 5 ratus (360°) pagal laikrodžio rodyklę. Ilgieji šluotelės šereliai buvo įvedami į endocervikinį kanalą taip, kad šluotelės trumpieji šereliai kontaktuotų su išorine gimdos kaklelio dalimi. Tokiu būdu citologinė medžiaga buvo paimta iš egzocervikinio ir endocervikinio kanalo sričių. Šepetėlio galvutė buvo nuimama ir įdedama į indelį su Sure Path (BD, JAV) skysta transportine terpe, kuri pagaminta 24 proc. etanolio pagrindu. Šepetėlio galvutė buvo paliekama indelyje, iki tepinėlio ruošimo. Ėminiai transportinėje terpėje iki tyrimo buvo saugomi kambario temperatūroje.
Tepinėlio ruošimas ir dažymas.
Gimdos kaklelio citologiniai tepinėliai buvo ruošiami iš skystos Sure Path (BD, JAV) terpės pusiau automatiniu būdu, naudojant Prep Stain (Tripath Imaging, BD, JAV) automatinę tepinėlių ruošimo ir dažymo sistemą. Pirmiausia skysta terpė su paimtais ėminiais buvo homogenizuojama 15±5 s
22 3000 aps./min. greičiu ant Multi – Vial Volvexer (Tripath Imaging, BD, JAV) horizontalaus maišytuvo. Vėliau naudojant Prep Mate (Becton Dickinson, JAV) sistemą su švirkšto tipo pipete 8 ml citologinės gimdos kaklelio medžiagos buvo išpilstytos į centrifuginius mėgintuvėlius, kuriuose buvo 4 ml tankio gradiento. Ląstelių suspencijos su tankio gradientu buvo centrifuguojamos (centrifuga Rotina 46, Vokietija) 2 kartus: pirmąjį 2 min. 200 aps./min. greičiu, antrąjį 10 min. 800 aps./min. Po centrifugavimo buvo pašalintos gleivės, eritrocitai, leukocitų perteklius bei kitos priemaišos. Paruoštos ląstelės, naudojant automatinę tepinėlių ruošimo ir dažymo sistemą Prep Stain (Tripath Imaging, BD, JAV), buvo tolygiai (vienu sluoksniu) paskleidžiamos 13 mm objektinio stiklelio plote. Po to tepinėliai buvo fiksuojami ir dažomi Papanicolau dažymo metodu, naudojant dažus (EA/OG Combo Stain, Hematoxylin Stain, BD, JAV). Traukos spintoje nudažyti tepinėliai buvo plaunami izoproponoliu. Gimdos kaklelio citologiniai tepinėliai buvo dengiami automatiniu stiklelių dengimo prietaisu Leica CV5030 (Leica Biosystems, Vokietija). Baigus dengimą tepinėliai buvo džiovinami traukos spintoje kambario temperatūroje.
Mėginio tyrimas.
Gimdos kaklelio citologiniai tepinėliai buvo vertinami šviesiniu mikroskopu Olympus CX41 (Olympus, Japonija). Iš pradžių tepinėliai buvo apžiūrimi mažuoju padidinimu (10), siekiant įvertinti nusidažymo kokybę, tepinėlio kokybę, ląstelių kiekį ir jų pasiskirstymą. Tada nuosekliai ir atidžiai vertikalia ir horizontalia kryptimis (serpantino būdu) buvo apžiūrimi visi regos laukai. Aptiktos neaiškios ar pakitusios ląstelės buvo apžiūrimos mikroskopuojant didžiuoju padidinimu (40), o esant reikalui ir įmersine sistema (100).
Rezultatų įvertinimas.
Gimdos kaklelio citologinių tepinėlių rezultatai buvo pateikti, kai skystos terpės citologiniuose preparatuose plokščiojo epitelio ląstelių buvo ne mažiau kaip 5000 r/l. Tepinėlių tyrimo rezultatai buvo pateikti remiantis 2014 metų BETHESDOS sistema, kuri pateikta 3 lentelėje [10].
3lentelė. BETHESDOS sistema
Citologinė diagnozė Apibūdinimas
NILM nėra intraepitelinių pokyčių ar piktybinio naviko
ASC-US nenustatytos reikšmės atipinės plokščiojo epitelio ląstelės ASC-H galimi žymūs plokščialąsteliniai intraepiteliniai pokyčiai LSIL nežymūs plokščiojo epitelio intraepiteliniai pokyčiai HSIL žymūs plokščiojo epitelio ir intraepiteliniai pokyčiai
23
SCC plokščialąstelinė karcinoma
AGC-NOS nenustatytos reikšmės atipinės liaukinio epitelio ląstelės AIS endocervikinė adenocarcinoma in situ
Adenokarcinoma
2.2.2 Žmogaus papilomos viruso aukštos karcinominės rizikos genotipų nustatymas PGR metodu
Ėminio paėmimas ir laikymas.
Ėminiai tyrimui buvo imami į Sure Pathterpę (BD, JAV). Iki tyrimo ėminiai buvo saugomi šaldytuve (+2 – +8)°C temperatūroje.
Metodo esmė.
Visoms tyrime dalyvavusioms moterims aukštos karcinogeninės rizikos ŽPV tipai buvo nustatyti iš gimdos kaklelio nuograndų medžiagos. Ėminiai buvo ištirti dėl 14 aukštos rizikos ŽPV tipų – 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, naudojant AmpliSenS ŽPV aukštos rizikos genotipų titro FTR PGR (AmpliSenS️, Slovakija) bei DNR išskyrimo QIAamp DNR Mini and Blood Mini (QIAGEN, JAV) rinkinius. Tyrimo metodas pagrįstas vienu metu vykstančia aukštos rizikos ŽPV genotipų DNR fragmentų ir β – globino geno DNR fragmento amplifikacija (dauginis PGR) realiu laiku viename mėgintuvėlyje. Šio geno DNR fragmentas buvo naudojamas kaip kokybės kontrolė genominei DNR nustatyti PGR metodu. Kiekvienas ŽPV genotipas buvo nustatomas atskirame fluorescenciniame kanale. Naudojant kompiuterinę įrangą buvo sukurtas temperatūros profilis Rotor Gene Q (QIAGEN, JAV), kuris paremtas gamintojo reikalavimais. PGR pagausinimui naudota speciali programa, atliktų ciklų skaičius pateiktas 4 lentelėje.
4 lentelė. Tyrimo metu PGR sąlygos
Veiksmas Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius
Laikymas 95 15 min 1 1 ciklo vykdymas 95 5 s 5 60 20 s 72 15 s 2 ciklo vykdymas 95 5 s 40 60 20 s 72 15 s
24 Rezultatų vertinimas.
Rezultatų analizė buvo atliekama naudojant realaus laiko PGR instrumento programinę įrangą ir matuojant fluorescencijos signalo susikaupimą keturiuose kanaluose:
ŽPV genotipų 16, 39, 33, 58 DNR amplifikacijos produkto signalas aptinkamas FAM fluoroforo kanale.
ŽPV genotipų 31, 45, 35, 52 DNR amplifikacijos produkto signalas aptinkamas JOE fluoroforo kanale.
ŽPV genotipų 18, 59, 68, 66 amplifikacijos produkto signalas aptinkamas JOE fluoroforo kanale. ŽPV genotipų 56 ir 51 ir endogeninės vidinės kontrolės (β – globulino geno fragmento)
amplifikacijos produktų signalas aptinkamas Cy5 fluoroforo kanale.
Kokybinė analizė: signalas tam tikrame kanale esančiame mėgintuvėlyje buvo laikomas teigiamu, jeigu atitinkama fluorescencijos kaupimosi kreivė kirto ribinę liniją. Šio signalo charakteristika buvo ribos ciklas – ciklas, atitinkantis fluorescencijos kreivės ir ribos linijos susikirtimo tašką. Ribos ciklų vertes, taip pat jų buvimą ar nebuvimą, analizavo programinė įranga, AmpliSens su ŽPV AKR genotipų titru Microsoft Excel formatu, automatiškai interpretuodama rezultatus.
Kiekybinė analizė: kalibravimo kreivė automatiškai buvo atidedama pagal ribines Ct vertes ir žinomas kalibratorių vertes ir taip buvo apskaičiuojamos žmogaus DNR bei kiekvieno aptikto ŽPV DNR koncentracijos (kopijos). Rezultatų apskaičiavimas bei analizė buvo atliekami automatiškai, naudojant programinę įrangą AmpliSens su ŽPV AKR genotipų titru Microsoft Excel formatu.
2.2.3 Citokinų nustatymas, naudojant Luminex technologiją
Ėminiopaėmimas ir laikymas.
Veninis kraujas buvo paimtas į vakuuminę sistemą be priedų ir per 1,5 val. nuo paėmimo buvo
pristatytas į laboratoriją, esant 18–25°C temperatūrai. Kraujas buvo centrifuguojamas 15 min., 1800–2000 g. Naudojant Pastero pipetę serumas buvo atskiriamas nuo eritrocitų ir tyrimas atliekamas iš
karto arba iki tyrimo atlikimo atskirtas serumas užšaldomas -20°C temperatūroje. Tyrimui nebuvo naudojami mikrobiologiškai užteršti, hemolizuoti, lipeminiai ir termiškai paveikti serumai.
Metodo esmė.
Analizuojamų citokinų INF-β, INF-γ ir IL-1β nustatymui buvo naudojama Luminex (Luminex Corporation, JAV) technologija ir speciali kompiuterinė programa.
25 72 tyrime dalyvavusioms moterims buvo nustatytos INF-β ir INF-γ koncentracijos, 74 tiriamosioms IL-1β koncentracijos.
Tyrimo metu vykstančios reakcijos yra paremtos antigeno ir antikūno sąveika, kuri vertinama pagal fermento, prisijungusio prie vieno iš komponentų, aktyvumą. Tyrimo metu naudojamos plokštelės buvo padengtos antigenams specifiškais antikūnais. Mikrodalelės, standartai ir mėginiai pipete buvo supilstyti į šulinėlius, imobilizuoti antikūnai susijungė su antigenais, kurie šiuo atveju yra tiriamieji INF-β, INF-γ ir IL-1β. Po kiekvieno inkubavimo buvo atliekamas plovimas, kurio metu buvo pašalinamos nesusirišusios molekulės bei reagentų perteklius. Po to į kiekvieną šulinėlį buvo įdedamas biotinu žymėtas antikūnų mišinys, specifiškas tiriamiems antigenams. Po plovimo, kad pasišalintų nesujungti biotinu žymėti antikūnai, į kiekvieną šulinėlį buvo įdedama streptavidino – fikoeritrino konjugato (Streptavidino – PE), kuris jungėsi su šiais antikūnais. Paskutinio plovimo metu buvo pašalintas nesusijungęs Streptavidio –PE, o mikrodalelės vėl suspenduojamos buferiniame tirpale. Analizatoriuje esantis magnetas fiksavo ir laikė mikrodaleles, o du spektriškai atskiri šviesos diodai (LED) jas apšvietė. Vienas LED švytėjimas sužadino dažus ir leido identifikuoti mikrodaleles, o antrasis nustato iš Streptavidiną – PE gaunamo signalo dydį, kuris yra tiesiogiai proporcingas su mikrodalelėmis surištų antigenų kiekiui. Kiekvienas šulinėlis buvo atvaizduojamas CCD kamera.
Citokinų nustatymas.
Pagal gamintojo nurodytas instrukcijas buvo paruošti reagentai.
Į kiekvieną plokštelės šulinėlį buvo įpilama mėginio.
Į šulinėlius buvo įpilama konjuguotų antikūnų mišinio ir paliekama inkubacijai 2 val. ant purtyklės 800 aps./min., kambario temperatūroje.
Po inkubacijos buvo atliekamas plovimas, kurio metu buvo pašalinamas perteklinis skystis, naudojant plovimo buferį. Plovimas kartojamas 3 kartus.
Į šulinėlius buvo įpilama biotininių antikūnų mišinys. Plokštelė buvo uždengiama ir paliekama inkubuotis 1 valandą ant purtyklės 800 aps./min., esant kambario temperatūrai.
26 Į šulinėlius buvo įpilama streptavidino – fikoeritrino konjugato (Streptavidino – PE) ir palieka inkubacijai 30 min. ant purtyklės 800 aps./min., kambario temperatūroje.
Į šulinėlius buvo pilamas plovimo buferis ir paliekama inkubacijai 2 min. ant purtyklės 800 aps./min., kambario temperatūroje.
Gauti rezultatai buvo vertinami per 90 min., naudojant Luminex (Luminex Corporation, JAV) technologiją.
Rezultatų apskaičiavimas.
Nustatant tiriamųjų citokinų kiekį, gauti rezultatai buvo vertinami naudojant kalibracinę kreivę, kuri gaunama matuojant skirtingos koncentracijos standartinių tirpalų šviesos emisiją. Pagal tai buvo apskaičiuojami trijų kartų praskiedimai kitiems lygiams. Po to buvo sudedami kiekvieno standartinio ir tiriamojo mėginio rezultatai ir atimamas minimalus fluorescencijos intensyvumo (MFI) reikšmės vidurkis. Kiekvienam tiriamajam citokinui rezultatas buvo apskaičiuojamas remiantis neigiamos kontrolės signalu.
Naudojantis kompiuterine įranga buvo sukurta kiekvieno tiriamojo citokino standartinė kreivė. Duomenų analizei buvo naudojama penkių taškų (5-PL) kreivė.
Jei tiriamieji mėginiai buvo praskiesti, tai iš kalibracinės kreivės nustatyta koncentracija buvo dauginama iš skiedimo koeficiento.
2.3 Statistinė analizė
Tyrimo metu gauti duomenys buvo apdoroti naudojant Microsoft Office Excel 2016 metų programą, statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant SPSS (angl. Statistical Package for the Social Sciences) 23 versiją. Kintamieji buvo suskirstyti į kiekybinius bei kokybinius ir atitinkamai pritaikyti analizės metodai. Kiekybinių kintamųjų pasiskirstimas pagal normalųjį (Gauso) skirstinį buvo patikrinamas naudojant Kolmogorov– Smirnov testą. Dviejų nepriklausomų populiacijų vidurkių lyginimui buvo naudojamas t-testas (angl. Independent samples t-test). Kokybinių kintamųjų ryšiui nustatyti buvo naudojamas Chi kvadrato (χ2) testas. Rezultatų, kurie netenkino normalumo sąlygos, medianų palyginimui buvo naudojamas neparametrinis Kruskal – Wallis testas (angl. Kruskal – Wallis H Test). Ryšio stiprumui tarp dydžių nustatyti buvo skaičiuojamas Spirmeno koreliacijos koeficientas (angl. Spearman's rank correlation coefficient). Jis įgyja reikšmes nuo -1 iki 1, kur teigiama koreliacija rodo tiesioginę
27 priklausomybę, o neigiama – atvirkštinę priklausomybę. Duomenys buvo vertinami kaip statistiškai patikimi ir reikšmingi, kai p < α = 0,05.
28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Kontingento charakteristika
Tyrime dalyvavo 81 moteris, kurių amžius varijavo nuo 25 iki 85 metų, amžiaus vidurkis buvo 51,74±12,23 metų. Pagal amžių moterys buvo suskirstytos į grupes (5 lentelė).
5 lentelė. Sergančių ir sveikų moterų pasiskirstymas amžiaus grupėse
Iš viso, n (proc.) Sergančios GKV moterys, n (proc.) Sveikos moterys, n (proc.) Am žiau s gr u p ė 18 - 39 10 (12,3) 3 (3,7) 7 (8,6) 40 - 49 28 (34,6) 10 (12,3) 18 (22,3) 50 - 59 24 (29,6) 8 (9,8) 16 (19,8) > 60 19 (23,5) 12 (14,9) 7 (8,6) Viso 81 (100) 33 (40,7) 48 (59,3) n – tiriamųjų skaičius; GKV – gimdos kaklelio vėžys.
33 tyrime dalyvavusios moterys sirgo gimdos kaklelio vėžiu (GKV) ir 48 tiriamosios buvo sveikos (6 lentelė).
6 lentelė. Tiriamųjų moterų amžiaus ir ŽPV charakteristikos
Požymis Sergančios GKV moterys Sveikos moterys p Skaičius, n (proc.) 33 (40,74) 48 (59,26) Amžiaus vidurkis ± SN, metai 49,94±10,85 55,09±13,47 0,05 ŽPV nustatyta 33 (100) 10 (20,8) 0,001 ŽPV nenustatyta 0 38 (80,2) ŽPV nustatyta amžiaus vidurkis ± SN, metai 49,97±11,54 0,330 ŽPV nenustatyta moterų amžiaus vidurkis ± SN, metai - 52,55±11,88
GKV – gimdos kaklelio vėžys; n – tiriamųjų skaičius; SN – standartinis nuokrypis; p – reikšmingumo lygmuo; ŽPV – žmogaus papilomos virusas.
Mūsų tyrime dalyvavusių sergančių gimdos kaklelio vėžiu ir sveikų moterų amžius nesiskyrė – atitinkamai 49,44±10,85 ir 55,09±13,47 metai (p = 0,05). Nagrinėjant PSO pateiktus duomenis pasaulyje
29 gimdos kaklelio vėžiu dažniausiai suserga 40–60 metų amžiaus moterys [3]. Amerikos vėžio draugijos pateiktais duomenimis, Amerikoje gimdos kaklelio vėžys dažniausiai nustatomas 35–44 metų amžiaus moterims [20]. Pagal Lietuvos Nacionalinio vėžio instituto pateiktus duomenis, mūsų šalyje gimdos kaklelio vėžiu dažniausiai serga 45–65 metų amžiaus moterys [52].
Visoms tyrime dalyvavusioms moterims buvo atliktas ŽPV tyrimas. Iš 81 tiriamųjų 43 (53,08 proc.) moterims buvo nustatytas žmogaus papilomos virusas. ŽPV dažniau buvo nustatytas gimdos
kaklelio vėžiu sergančioms, nei sveikoms moterims, atitinkamai 100 ir 20,8 proc. p = 0,001.
Moterų, kurioms nustatyta ir nenustatyta ŽPV, amžius nesiskyrė, atitinkamai 49,97±11,54 ir 52,55±11,88 metai, p = 0,330 (6 lentelė). Literatūroje yra aprašoma, jog ŽPV infekcija dažniausiai nustatoma moterims, esančioms 46–50 metų amžiaus grupėje [59]. Šis amžius yra premenopauzinis laikotarpis, kurio metu sumažėja estrogeno kiekis bei vyksta menstruacinio ciklo pasikeitimai. Dėl šių priežasčių galimai moterys, esančios 46–50 metų amžiaus grupėje, tampa imlesnės ŽPV infekcijai [60].
Mūsų tyrimo metu 20 (24,7 proc.) moterų buvo nustatyti ŽPV 16 ir / arba 18 tipai. Remiantis PSO skelbiamais duomenimis 16 bei 18 ŽPV tipai didžiausi gimdos kaklelio vėžio rizikos veiksniai [43]. Vilniaus universiteto Biotechnologijos ir Onkologijos instituto mokslininkai, savo tyrime nustatė, kad labiausiai paplitęs ŽPV tipas, tarp tyrime dalyvavusių 824 lietuvių, buvo 16 (42,3 proc. moterų kurioms nustatytas ŽPV) [52]. Nagrinėjant kitų autorių pateiktus duomenis sergant gimdos kaklelio vėžiu ŽPV 16 tipas aptinkamas nuo 52 proc. iki 67 proc. tiriamųjų [61].
Tyrime dalyvavusių GKV sergančių moterų pasiskirstymas pagal gimdos kaklelio vėžio stadijas pavaizduotas 1 paveiksle.
χ2 = 12,959; p = 0,164; χ2 – Chi – kvadratas; p – reikšmingumo lygmuo.
1 pav. Moterų pasiskirstymas pagal gimdos kaklelio vėžio stadijas
3 (9,1 proc.)
17 (51.5 proc.) 7 (21,2 proc.)
6 (18,2 proc.)
30 Didžiausia tyrime dalyvavusių moterų grupė sirgo II stadijos gimdos kaklelio vėžiu (51,5 proc.), o mažiausia grupė buvo – sergančiųjų I stadijos GKV (9,1 proc.). Gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų pasiskirstymas pagal gimdos kaklelio vėžio stadijas reikšmingai nesiskyrė (p = 0,164).
3.2 Citokinų koncentracijos kitimas
Visų tyrime tirtų citokinų koncentracijos neatitinka normaliojo (Gauso) skirstinio (p = 0,001). INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų charakteristika pagal tiriamąsias grupes pateikta 7 lentelėje.
7 lentelė. INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų charakteristika pagal tiriamąsias grupes
Tiriamoji grupė n Vidurkis ± SN Mediana (25–75
procentilės) p INF-β, pg/ml Sergančios GKV moterys 41 102,17±14,08 99,07 (83,77–107,66) 0,872 Sveikos moterys 31 97,93±22,94 98,10 (88,55–102,88) INF-γ, pg/ml Sergančios GKV moterys 44 1818,2±67,3 1766,01 (1712,5–1787,2) 0,740 Sveikos moterys 28 1719,1±50,9 1763,58 (1705,2–1785,4) IL-1β, pg/ml Sergančios GKV moterys 45 159,44±30,27 164,95 (127,79–171,51) 0,149 Sveikos moterys 29 140,50±29,37 154,02 (110,30–168,23)
n – tiriamųjų skaičius; p – reikšmingumo lygmuo; SN – standartinis nuokrypis; GKV – gimdos kaklelio vėžys.
Mūsų tyrime nebuvo nustatyti reikšmingi skirtumai tarp tirtų citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ir tyrime dalyvavusių gimdos kaklelio vėžiu sergančių ir sveikų moterų grupių.
Genų nulemtos savybės, tokios kaip uždegiminių citokinų gamyba, gali turėti įtakos gimdos kaklelio vėžio kancerogenezei [57]. Išskiriami citokinai gali ne tik slopinti, bet ir aktyvinti signalinius kelius, kuriais ląstelės skatina naviko augimą ir plitimą [23]. Interleukinų ir interferonų gamyba naviko mikroaplinkoje gali užkirsti kelią efektoriaus atsakui, taip pat gali tarpininkauti su imuninėmis ląstelėmis kovoje prieš navikines ląsteles [55]. Citokinai, veikdami įvairiais signaliniais keliais, gali lemti ne tik ligos eigą, bet ir gydymo efektyvumą [23]. Literatūroje nurodoma, kad interferonai silpnina navikinių ląstelių veikimą slopindami jų dalijimąsi ir aktyvindami imuniniame atsake dalyvaujančias ląsteles. Taip pat skatina vėžinių ląstelių atpažinimą bei didina sveikų ląstelių atsparumą [35, 41]. Moksliniuose tyrimuose galima rasti duomenų, kad INF-γ koncentracijos gimdos kaklelio pažeidimų turinčių moterų grupėje didesnės, nei
31 sveikų moterų grupėje, atitinkamai 34,9 ir 4,7 proc., p < 0,01 [62]. Kito tyrimo duomenimis moterims, turinčioms gimdos kaklelio pažeidimus, IFN-γ koncentracijos lygis buvo ženkliai mažesnis, nei sveikoms moterims [67]. Kitų mokslininkų darbuose, buvo nustatytas IFN-γ koncentracijos padidėjimas moterims, kurioms nustatyta ŽPV infekcija (p <0,05). Pasak tyrimo autorių IFN-γ koncentracija gali priklausyti nuo ŽPV infekcijos tipo [68]. Jiexin Zhang tyrimo metu santykinai didesnės IFN-γ koncentracijos buvo nustatytos ŽPV 16 nei ŽPV 18 tipui [65].
Įvairių šalių mokslininkų tyrimuose buvo nustatyta, kad IL-1β veikimas turi įtakos ŽPV infekcijos išlikimui bei esant didesnėms IL-1β koncentracijoms yra palankesnės sąlygos vystytis gimdos kaklelio vėžiui [63, 66]. Nianfeng Qian tyrimo duomenimis vidutinė IL-1β koncentracija gimdos kaklelio vėžiu sergančioms moterims (42,19±31,55 pg/ml) buvo žymiai didesnė nei sveikų moterų grupėje (34,86±22,68 pg/ml, p = 0,002) [64].
INF-β koncentracijos ir gimdos kaklelio vėžio stadijų skirstinys pateiktas 2 paveiksle.
p = 0,650, p – reikšmingumo lygmuo.
2 pav. INF-β koncentracijos ir gimdos kaklelio vėžio stadijų skirstinys
Tyrimo metu nustatytos IFN-β koncentracijų medianos skirtingose gimdos kaklelio vėžio stadijose nesiskyrė, atitinkamai 102,88 (95,71–108,85) pg/ml, 98,10 (83,77–108,85) pg/ml, 93,32 (78,99–100,49) pg/ml ir 101,68 (88,55–102,88) pg/ml.
Kitų mokslininkų atliktų tyrimų metu, buvo nustatyta, kad IFN-β pasižymi labai stipriu navikinių ląstelių augimo slopinimu bei sukelia apoptozę in vitro ir in vivo [56]. Mūsų tyrimo metu buvo tikimąsi nustatyti IFN-β koncentracijų pokyčius, bet skirtumai galėjo būti nenustatyti dėl per mažos tiriamųjų imties.
INF-γkoncentracijos ir gimdos kaklelio vėžio stadijų skirstinys pateiktas 3 paveiksle. 88 90 92 94 96 98 100 102 104 I II III IV IN F -β ko n ce n tr a ci ja , pg/ m l
32 p = 0,067, p – reikšmingumo lygmuo.
3 pav. INF-γ koncentracijos ir gimdos kaklelio vėžio stadijų skirstinys
Mūsų tyrime nustačius IFN-γ koncentracijų medianas skirtinguose gimdos kaklelio vėžio stadijose jos nesiskyrė, atitinkamai 1695,5 (1693,1–1704,1) pg/ml, 1766,0 (1712,5–1785,4) pg/ml, 1785,4 (1756,2–1802,4) pg/ml ir 1773,3 (1746,5–1785,4) pg/ml.
Kitų šalių mokslininkų tyrimų duomenimis INF-γ turi savybę palaipsniui augančiuose navikuose skatinti adaptacinį atsparumą [35, 38, 39]. Šis citokinas ne tik kontroliuoja naviko progresavimą, bet ir formuoja jo imunogeniškumą [40]. Mūsų tyrime, yra stebimaINF-γ koncentracijos augimo tendencija, sunkėjant gimdos kaklelio vėžio stadijai.
IL-1β koncentracijos ir gimdos kaklelio vėžio stadijų skirstinys pateiktas 4 paveiksle.
p = 0,122; p – reikšmingumo lygmuo.
4 pav. IL-1β koncentracijos ir gimdos kaklelio vėžio stadijų skirstinys
1640 1660 1680 1700 1720 1740 1760 1780 1800 I II III IV IN F -γ ko n ce n tr a ci ja , pg/ m l
Gimdos kaklelio vėžio stadijos
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 I II III IV IL -1 β ko n ce n tr a ci ja , pg/ m l
33 Tyrimo metu nustatytos IL-1β koncentracijų medianos skirtinguose gimdos kaklelio vėžio stadijose jos nesiskyrė, atitinkamai 114,67 (110,30–121,23) pg/ml, 166,04 (131,06–173,69) pg/ml, 149,65 (149,65–164,95) pg/ml, 171,51 (164,95–173,69) pg/ml.
Literatūroje yra aprašoma navikinių ląstelių savybė sintetinti IL-1β. Teigiama, jog jis lemia navikų proliferaciją [1]. Taip galima paaiškinti didesnes IL-1β koncentracijas sunkesnėse gimdos kaklelio vėžio stadijose. Kitų tyrimų duomenimis IL-1β gali stabdyti gimdos kaklelio vėžio vystymąsi ankstyvosiose ligos stadijose [58]. Ankščiau atliktų tyrimų pateiktais rezultatais padidėjusi IL-1β koncentracija buvo siejama su progresuojančiu gimdos kaklelio vėžiu. Tačiau pasak tyrimo autorių negalima vertinti IL-1β koncentracijų kitimo ir gimdos kaklelio vėžio progresavimo neįvertinus ligos eigos [64].
INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų priklausomybė nuo gimdos kaklelio vėžio stadijos pateikta 8 lentelėje.
8 lentelė. INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų priklausomybė nuo gimdos kaklelio vėžio stadijos
INF-β INF-γ IL-1β
GKV stadijos
r -0,022 0,402 0,297
p 0,908 0,034 0,118
n 31 28 29
r – koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo; n – tyrimų skaičius; GKV – gimdos kaklelio vėžys.
Savo tyrime nustatėme, jog INF-γ koncentracija tiesiogiai koreliuoja su gimdos kaklelio vėžio stadijomis, nustatytas statistiškai reikšmingas ryšys (r = 0,402, p = 0,034). Esant sunkesnei gimdos kaklelio vėžio stadijai yra nustatoma didesnė INF-γ koncentracija. Koreliacija tarp INF-β ir IL-1β citokinų koncentracijos su gimdos kaklelio vėžio stadijomis nenustatyta.
Gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų charakteristika pateikta 9 lentelėje.
34
9 lentelė. INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų charakteristika pagal amžiaus grupes, gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų grupėje
Amžiaus grupė n Vidurkis ± SN Mediana (25–75 procentilės) p
INF-β pg/ml 18-39 3 98,90±13,58 102,88 (93,32–106,46) 0,687 40-50 10 94,76±17,92 93,32 (78,99–107,66) 50-60 6 99,29±13,66 100,49 (83,77–110,05) >60 12 102,09±32,06 98,10 (88,55–102,88) INF-γ pg/ml 18-39 3 1756,2±41,5 1761,1 (1736,8–1778,1) 0,551 40-50 8 1740,1±51,5 1733,2 (1693,1–1792,7) 50-60 6 1783,0±52,0 1778,1 (1766,0–1790,3) >60 11 1745,7±52,2 1746,5 (1734,4–1783,0) IL-1β pg/ml 18-39 3 173,69±50,84 164,95 (146,37–196,64) 0,291 40-50 8 144,73±35,92 148,56 (110,30–176,97) 50-60 7 157,45±20,62 162,76 (155,11–169,32) >60 11 153,03±26,38 167,14 (137,62–171,51) p – reikšmingumo lygmuo; n – tyrimų skaičius; SN – standartinis nuokrypis.
Mūsų tyrime nebuvo nustatyti reikšmingi skirtumai tarp tirtų citokinų (INF-β, INF-γ irIL-1β) koncentracijų ir tyrime dalyvavusių gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų amžiaus.
Gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų priklausomybė nuo moterų amžiaus pateikta 10 lentelėje.
10 lentelė. INF-β, INF- γ ir IL-1β koncentracijų priklausomybė su gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų amžiumi
INF-β INF-γ IL-1β
Amžius
r 0,007 0,004 0,054
p 0,970 0,984 0,783
n 31 28 29
r – koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo; n – tyrimų skaičius.
Savo tyrime nustatėme, kad INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijos ir tyrime dalyvavusių gimdos kaklelio vėžiu sergančių moterų amžius nekoreliavo.
Sveikų moterų INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų charakteristika pagal amžiaus grupes pateikta 11 lentelėje.
35
11 lentelė. INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų charakteristika pagal amžiaus grupes, sveikų moterų grupėje
Amžiaus grupė N Vidurkis ± SN Mediana (25–75 procentilės) p
INF-β pg/ml 18-39 5 94,29±7,08 93,35 (93,33–100,49) 0,589 40-50 18 100,49±15,55 98,10 (88,55–102,88) 50-60 12 95,91±15,37 93,33 (83,77–106,46) >60 6 98,90±12,61 102,88 (88,55–107,66) INF-γ pg/ml 18-39 6 1763,1±31,2 1769,6 (1739,2–1787,8) 0,281 40-50 17 1783,7±89,5 1775,7 (1766,0–1785,4) 50-60 15 1723,4±46,6 1702,8 (1685,8–1773,3) >60 6 1768,0±14,9 1766,0 (1756,2–1785,4) IL-1β pg/ml 18-39 7 145,90±22,21 154,02 (132,16–160,57) 0,584 40-50 17 145,53±34,04 162,76 (110,30–169,32) 50-60 15 136,52±27,08 129,97 (111,39–162,76) >60 6 153,29±30,88 161,67 (132,16–171,51) p – reikšmingumo lygmuo; n – tyrimų skaičius; SN – standartinis nuokrypis.
Mūsų tyrime nebuvo nustatyti skirtumai tarp tirtų citokinų (INF-β, INF-γ ir IL-1β) koncentracijų ir tyrime dalyvavusių sveikų moterų amžiaus.
Sveikų moterų INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų priklausomybė nuo moterų amžiaus pateikta 12 lentelėje.
12 lentelė. INF-β, INF- γ ir IL-1β koncentracijų priklausomybė nuo sveikų moterų amžiaus
INF-β INF-γ IL-1β
Amžius
r 0,030 -0,243 0,018
p 0,853 0,111 0,909
n 41 44 45
r – koreliacijos koeficientas; p – reikšmingumo lygmuo; n – tyrimų skaičius.
Tyrimo metu nustatėme, kad INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijos ir tyrime dalyvavusių sveikų moterų amžius nekoreliavo.
Tikėtina, kad savo tyrime nenustatėme INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų skirtumų tarp sergančių gimdos kaklelio vėžiu ir sveikų moterų dėl per mažos tiriamųjų imties.
36
IŠVADOS
1. Gimdos kaklelio vėžiu sergančių ir sveikų moterų citokinų INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijos nesiskyrė.
2. INF-γ koncentracija didėja sunkėjant gimdos kaklelio vėžio stadijai. INF-β ir IL-1β koncentracijų skirtumai skirtinguose gimdos kaklelio vėžio stadijose nebuvo nustatyti.
3. INF-β, INF-γ ir IL-1β koncentracijų skirtumai tiek tarp gimdos kaklelio vėžiu sergančių, tiek tarp sveikų moterų skirtinguose amžiaus grupėse nebuvo nustatyti.
37
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Haverkos HW, Haverkos GP and O’Mara M. Co-carcinogenesis: Human Papillomaviruses, Coal Tar Derivatives, and Squamous Cell Cervical Cancer. 2017. Nov16;8:2253.
2. Jayasingh E, Mariarputham G, Stephen A. Nominated Texture Based Cervical Cancer Classification, 2015. p 10.
3. Europos gimdos kaklelio vėžio prevencijos savaitė. [elektroninis išteklius]. Užkrečiamų ligų ir AIDS centras; 2018 [žiūrėta 2019 m. spalio 28 d.]. Prieiga per internetą:
http://www.ulac.lt/naujienos/pranesimai-spaudai/europos-gimdos-kaklelio-vezio-prevencijos-savaite-sumazink-savo-rizika
4. Xiaoli H, Saisai L, Zhou L, Zhao M, Zhu X. Effect of vitamin E supplementation on uterine cervical neoplasm: A meta-analysis of case-control studies. 2017. Published: August 22;12(8):e0183395. 5. Cervical cancer. Early diagnosis and prevention [Internet]. WHO; 2019 [cited 2019 November 07].
Available from:https://www.who.int/cancer/prevention/diagnosis-screening/cervical-cancer/en/
6. Baker A. The availability of data on risk factors associated with cervical cancer. 2014; Alban Med J 2:83-91.
7. Ferlay J, Steliarova-Foucher E, Lortet-Tieulent J, Rosso S, Coebergh JWW, Comber H, et al. Cancer incidence and mortality patterns in Europe: Estimates for 40 countries in 2012. Eur J Cancer. 49:1374-403, 2013.
8. Small W. Jr, Bacon MA, Bajaj A, Chuang LT, Fisher BJ, Harkenrider MM et al. Cervical cancer: A global health crisis. Cancer 2017;123(13):2404-12.
9. Gimdos kaklelio vėžys [elektroninis išteklius].Nacionalinis vėžio institutas; 2019 [žiūrėta 2019 m. birželio 6 d.]. Prieiga per internetą: https://www.nvi.lt/ikiveziniai-pokyciai-ir-gimdos-kaklelio-vezys/
10. Nayar R, Wilbur DC. The Pap Test and Bethesda 2014. Acta Cytologica 2015;59:121-132
11. Mehta AM, Mooij M, Branković I, Ouburg S, Morré SA, Jordanova ES. Cervical Carcinogenesis and Immune Response Gene Polymorphisms: A Review. J Immunol Res 2017; 8913860.
12. Kurman RJ, Carcangiu ML, Herrington CS, Young R.H. World Health Organization Classification of Tumors. Int J Gynecol Pathol. 2016 Jan; 35(1): 78–81.
13. Roura E, Travier N, Waterboer T, Sanjosé S, Bosch FX, Pawlita M, Pala V,et al. The Influence of Hormonal Factors on the Risk of Developing Cervical Cancer and Pre-Cancer: Results from the EPIC Cohort. 2016 Jan 25;11(1):e0147029.
