MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
DOVILĖ ČIČELYTĖ
GELIO SU BIČIŲ PIENELIU SUDĖTIES PARINKIMAS IR
VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc., dr. Gailutė DrakšienėLIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU
Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis
2015-...-...
GELIO SU BIČIŲ PIENELIU SUDĖTIES PARINKIMAS IR
VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc., dr. Gailutė Drakšienė
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė ... Dovilė Čičelytė
2015-...-... 2015-...-...
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 8 SĄVOKOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1 Bičių pienelio apibūdinimas ... 12
1.2.1 Bičių pienelio sudėtis ... 12
1.2.2 Bičių pienelio savybės ... 14
1.2.3 Bičių pienelis kaip dermatologinių preparatų sudedamoji dalis ... 14
1.3 Propolio apibūdinimas ... 15 1.3.1 Propolio sudėtis ... 15 1.3.2 Propolio savybės ... 16 1.4 Medaus apibūdinimas ... 16 1.4.1 Medaus sudėtis ... 16 1.4.2 Medaus savybės ... 17 1.5 Tween 80 apibūdinimas ... 17 1.6 Euxyl PE 9010 apibūdinimas ... 18 1.6.2 Euxyl PE 9010 savybės ... 18 1.7 Gelių apibūdinimas... 19 1.7.1 Karbomerai ... 20 1.7.2 Karbopolių savybės ... 20
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22
2.1 Tyrime naudotos medžiagos ir aparatūra ... 22
2.1.1 Tyrime naudotos medžiagos ... 22
2.1.2 Tyrime naudota aparatūra ... 22
2.2 Metodai ... 23
2.2.1 Gelių gamyba tiesioginiu metodu ... 23
2.2.2 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 23
2.2.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 24
2.2.4 pH reiškmės nustatymas ... 24
2.2.5 Šaldymo – šildymo ciklas ... 24
2.2.7 Viskozimetrinis klampos tyrimas ... 25
2.2.8 Mikrobiologinis nesterilių produktų vertinimas (bendras gyvų aerobų skaičius) ... 25
2.2.9 Statistinė analizė ... 26
3. REZULTATAI ... 27
3.1 Gelių su bičių pieneliu sudėties sudarymas ir gamyba ... 27
3.2 Gelių su bičių pieneliu juslinių savybių vertinimas ... 28
3.3 Suminio fenolinių junginių kiekio vertinimas geliuose su bičių pieneliu. ... 30
3.4 Spektrofotometrinis antioksidacinio aktyvumo tyrimas naudojant DPPH reagentą... 32
3.5 Pagamintų gelių pH reikšmės vertinimas ... 34
3.6 Gelių stabilumo vertinimas taikant šaldymo – šildymo ciklą ... 35
3.7 Gelių su bičių pieneliu klampos vertinimas ... 37
3.8 Centrifugavimas ... 39
3.9 Mikrobiologinis gelių su bičių pieneliu tyrimas ... 39
4. IŠVADOS ... 41
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42
SANTRAUKA
D. Čičelytės magistro baigiamasis darbas „Gelio su bičių pieneliu sudėties parinkimas ir vertinimas“/ mokslinė vadovė doc., dr. G. Drakšienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Tyrimo tikslas – parinkti gelio su bičių pieneliu sudėtį ir įvertinti pagalbinių medžiagų įtaką
gelio kokybei.
Uždaviniai: Ištirti bičių pienelio (BP), propolio etanolinio ekstrakto bei medaus įtaką gelio
stabilumui. Nustatyti suminio fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo pokyčius į gelius įmaišius medų bei propolio ekstraktą. Mikrobiologiškai įvertinti pagamintų gelių atitinkimą farmakopėjos reikalavimams.
Metodika. Gelių stabilumas vertintas atliekant pH reikšmės matavimus, viskozimetrinį
klampos tyrimą, šaldymo-šildymo ciklą bei centrifugavimą. Siekiant įvertinti gelių stabilumą laiko atžvilgiu tyrimai kartoti tris kartus: pagaminus gelius, praėjus mėnesiui bei praėjus trims mėnesiams po pagaminimo. Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas taikant Folino -Ciocalteu metodą pagal galo rūgšties ekvivalentą. Antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas spektrofotometriškai naudojant DPPH radikalą. Mikrobiologinis tyrimas atliktas taikant farmakopėjinį nesterilių produktų vertinimą.
Rezultatai. Gelių pH reikšmės bei klampos pokyčiai laiko atžvilgiu statistiškai nereikšmingi
(p>0,05). Geliai su liofilizuotu BP statiškai reikšingai (p<0,05) klampesni nei su šviežiu BP. Didinant propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją gelių klampa mažėja (p<0,05). Nustatyta, kad geliuose su liofilizuotu BP fenolinių junginių kiekis didesnis. Kontroliniame mėginyje su liofilizuotu BP fenolinių junginių kiekis siekia 0,12 ± 0,004 mg/g kai tuo tarpu su šviežiu BP 0,09 ± 0,004 mg/g. Didinant propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją fenolinių junginių kiekis statiškai reikšmingai (p<0,05) didėja. Gelyje su šviežiu BP ir 1 proc. propolio ektrakto suminis fenolinių junginių kiekis 16 kartų didesnis nei kontroliniame mėginyje, tokia fenolinių junginių kiekio didėjimo tendencija pastebima ir geliuose su liofilizuotu BP. Geliai su liofilizuotu BP pasižymi iki 9 proc. didesniu antioksidaciniu aktyvumu nei geliai su šviežiu BP, skirtumas statistiškai reikšmingas (p<0,05). Didinant propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją antioksidacinis aktyvumas proporcingai didėja. Geliai su 1 proc. propolio ekstrakto atitinka farmakopėjinio mikrobiologinio tyrimo reikalavimus.
Išvados: Gaminant polimerinius gelius gali būti naudojamas tiek šviežias tiek liofilizuotas
BP. Didinant propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją proporcingai didėja fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis akyvumas. Atsižvelgint į atliktus tyrimus optimalu į gelių sudėtį kaip pagalbines medžiagas įtraukti 4 proc. medaus bei 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto.
SUMMARY
D. Čičelytė. Gel‘s with royal jelly composition selection and evaluation, master's thesis / supervisor doc., dr. Gailutė Drakšienė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy. Kaunas, 2015.
The aim of survey – to select the composition of gel with royal jelly and evaluate excipients
influence to the quality of the gel.
Tasks: To investigate royal jelly (RJ), propolis ethanolic extract and honey influence to the stability gel. Determine the total phenolic compound content and antioxidant activity changes in gels by the addition of honey and propolis ethanolic extract . Microbiologically evaluate gels compliance with pharmacopoeia requirements.
Methods: Gel stability was evaluated by measuring the pH value, viscosity, cooling-heating cycle and centrifugation. In order to assess the stability of the gels changes over time tests repeated after one month and three months. Total phenolic compounds were determined by Folin Ciocalteu method expressed in gallic acid equivalents. Antioxidant activity was determined by spectrophotometry using DPPH radical. Microbiological test was carried out using non-sterile products pharmacopoeial assessment Ph. Eur. 01/2008:20612.
Results: Gel pH value and viscosity changes over time were not significant (p> 0.05). Gels
with lyophilised RJ were more viscous than gels with fresh RJ (p <0.05). Increasing the concentration of propolis ethanolic extract gel viscosity decreases (p <0.05). It was found that gels with lyophilised RJ contains more phenolic compounds. In the control gel with lyophilised RJ total phenolic content was 0.12 ± 0.004 mg / g while in the control gel with fresh RJ 0.09 ± 0.004 mg / g. Increasing the concentration of propolis ethanolic extract phenolic compounds increment is significant (p <0.05). Total phenolics content in gel containing fresh RJ and 1 percent of propolis ethanolic extrac is 16 times higher than in the control gel. Gels with lyophilised RJ shows up to 9 percent higher antioxidant activity than gels with fresh RJ (p <0.05). Increasing the concentration of propolisethanolic extract antioxidant activity increases exponentially. Gels with 1 percent. of propolis ethanolic extract comply with pharmacopoeial microbiological testing requirements.
Conclusions: Polyacrylic acid polymer gels can be produced using fresh and lyophilized RJ.
Increasing the concentration of propolis ethanolic extract total phenolic content and antioxidant activity increases exponentially. According the studies carried out the optimal gel composition include 4 percent of honey and 1 percent of propolis ethanolic extract.
Padėka
Už suteiktas darbo sąlygas ir pagalbą atliekant farmacijos magistro baigiamąjį darbą ‚,Gelių su bičių pieneliu optimalios sudėties parinkimas ir vertinimas“ dėkoju Vaistų technologijos ir Socialinės farmacijos darbuotojams.
Dėkoju UAB „Medicata Filia“ už suteiktas reikalingas medžiagas, bei pagalbą atliekant magistro baigiamąjį darbą.
SANTRUMPOS
°C – laipsniai pagal Celcijų
10-HDR - 10-hidroksi-2-deceninė rūgštis BP – Bičių pienelis
Da - daltonas
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas Eur. Ph. – Europos farmakopėja g – gramai
K – kontrolinis gelis su bičių pieneliu KOH – kalio hidroksidas
KSV – kolonijas sudarantys vienetai LBP – liofilizuotas bičių pienelis M – medus
min – minutė
MK – kontrolinis gelis su bičių pieneliu ir medumi ml – mililitrai
Na2CO3 – natrio karbonatas NaOH – natrio hiroksidas nm – nanometrai
P – propolis
Pa·s – paskalsekundė pav – paveikslas proc – procentai
rpm – (angl. revolutions per minute) apsisukimai per minutę Tween 80 – polioksietilen (20) - sorbitano monooleatas
SĄVOKOS
Adhezija - vandens molekulių savybė lipti prie polinių (turinčių krūvį) paviršių. Liofilizacija – šaldytų medžiagų džiovinimas vakuume.
Karbomeras – tai didelės molekulinės masės akrilo rūgšties polimerai, kurie skersiniais ryšiais sujungti su cukrų polialkenilo eteriais arba polialkoholiais.
ĮVADAS
Bičių pienelis ( angl. Royal jelly) – tai klampi, balsvai gelsva žele primenanti medžiaga, išskiriama bitės darbininkės galvoje esančių hipofaringinės bei apatinio žandikaulio liaukų [1–7]. Jį iš medaus ir žiedadulkių gamina 5-12 dienų amžiaus bitės darbininkės [8]. Farmakologinės savybės siejamos su bičių pienelio ( BP ) sudėtyje esančiomis biologiškai aktyviomis medžiagomis: baltymais, riebiosiomis rūgštimis, bei fenoliniais junginiais. Dėl savo unikalios sudėties bei farmakologinių savybių BP yra bene labiausiai vertinamas iš visų bičių produktų. Bičių pienelis plačiai naudojamas įvairių kremų gamyboje kadangi jis pasižymi antioksidacinėmis [9–18], žaizdų gijimą skatinančiomis [1,6,11,13,19–24] bei odos regeneraciją skatinančiomis [25] savybėmis. Taip pat literatūroje [1,6,11,13,19–24] teigiama, kad bičių pienelis pasižymi žaizdų gijimą skatinačiomis savybėmis.
Geliai, pagaminti naudojant poliakrilo rūgšties polimerą Carbopol® Ultrez™ 21, pasižymi geromis organoleptinėmis savybėmis, juos patogu vartoti. Taip pat šis polimeras pasižymi gera elektrolitų tolerancija ir yra suderinamas su daugeliu sudedamųjų dalių [26–28]. Gelio sudėtyje didžiają dalį sudaro vanduo. Bičių pienelis gerai tirpus vandenyje, todėl gali būti įterpiamas į gelio pagrindą.
Kosmetikos bei dermatologinių preparatų sudėtyje dažnai aptinkamas medus, kadangi jis pasižymi odą drėkinančiomis bei minkštinančiomis savybėmis [29]. Taip pat medus pasižymi antioksidacinės [16,30–32], priešuždegiminės [16,31] ir žaizdų gijimą skatinančios savybėmis [21,32– 39].
Siekiant išvengti sintetinių konservantų ir pagaminti kiek įmanoma natūralesnį preparatą kaip antimikrobinė medžiaga parinktas propolio etanolinis ekstraktas. Mokslinėje literatūroje [40,41] teigiama, kad propolis gali būti naudojamas kaip natūralus konservantas. Propolio ekstraktas yra netirpus vandenyje, tačiau į gelių sudėtį įvedus tirpumą gerinančią medžiagą, Tween 80, ši problema išsprendžiama. Be to propolis pasižymi priešuždegiminėmis [9,15,16,42–44], antioksidacinėmis [9,14–16,42–45], skausmą malšinančiomis [43], žaizdų gijimą skatinančiomis [43] bei daugeliu kitų naudingų savybių. Gelio sudėtyje esantis medus ir propolis papildo bei sustiprina bičių pienelio savybes.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Pagaminti poliakrilo rūgšties polimerinių gelių mėginius su šviežiu ir liofilizuotu bičių pieneliu, kaip pagalbines medžiagas naudojant medų ir propolio etanolinį ekstraktą, įvertinti jų kokybę bei pateikti optimalią gelio sudėtį.
Darbo uždaviniai
1. Remiantis moksline literatūra parinkti gelio su bičių pieneliu sudėtį ir pagaminti gelius su šviežiu ir liofilizuotu bičių pieneliu, kaip pagalbines medžiagas naudojant propolio etanolinį ekstraktą, medų ir poliakrilo rūgšties polimerą (Carbopol® Ultrez™ 21).
2. Įvertinti šviežio ir liofilizuoto bičių pienelio, propolio etanolinio ekstrakto bei medaus įtaką gelių stabilumui atliekant fizikinius tyrimus.
3. Nustatyti suminį fenolinų junginių kiekį geliuose. Įvertinti pagalbinių medžiagų įtaką suminiam fenolinių junginių kiekiui.
4. Įvertinti gelių antioksidacines savybes. Įvertinti pagalbinių medžiagų įtaką antioksidaciniam aktyvumui.
5. Atlikti nesterilių produktų mikrobiologinį tyrimą ir įvertinti rezultatų atitikimą farmakopėjos reikalavimams.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Bičių pienelio apibūdinimas
Bičių pienelis ( angl. Royal jelly) – tai klampi, balsvai gelsva žele primenanti medžiaga, išskiriama bitės darbininkės galvoje esančių hipofaringinės bei apatinio žandikaulio liaukų [1–7]. Dėl savo unikalios sudėties bei farmakologinių savybių bičių pienelis (BP) yra bene labiausiai vertinamas iš visų bičių produktų. Jį iš medaus ir žiedadulkių gamina 5-12 dienų amžiaus bitės darbininkės [8]. Avilyje BP yra maistas, kuriuo bičių darbininkių ir tranų lervutės maitinamos 2-3 dienas, o bitė motinėlė bičių pieneliu maitinama visą gyvenimą [4,5,7,13,46–48]. Dėl tokios mitybos bitė motinėlė yra apie 40 proc. ilgesnė ir 60 proc. sunksnė už bites darbininkes. Be to bitės motinėlės gyvenimo trukmė taip pat ženkliai ilgesnė, ji gyvena 4-5 metus kai tuo tarpu bitės darbininkės vos 30-40 dienų [4,5,46].
Bičių pieneliui būdingas rūgščiai aštrus kvapas ir saldžiarūgštis skonis. Išvaizda, skonis bei kvapas yra svarbūs kokybės rodikliai. Bėgant laikui BP tamsėja, skonis tampa aitrus, kvapas nemalonus [3,4,25]. Siekiant išlaikyti bičių pienelio aktyvumą jis dažnai maišomas su medumi, toks mišinys gali būti laikomas kambario temperatūroje [46,47]. Taip pat siekiant užtikrinti BP stabilmą jis gali būti liofilizuojamas.
1.2.1 Bičių pienelio sudėtis
Bičių pienelis sudarytas iš baltymų, amino rūgščių, organinių rūgščių, sterolių, fenolinių junginių, cukrų bei mineralinių medžiagų [19,47,49]. Bičių pienelio, kaip ir kitų bičių produktų, cheminė sudėtis nėra pastovi. BP sudėtis bei kokybė priklauso nuo vietos, kurioje pastatytas avilys, nuo netoliese augančių augalų, nuo klimato bei oro temperatūros bei daugelio kitų priežasčių [17,48]. Bičių pienelyje taip pat galima aptikti ir žiedadulkių, pagal kurias galima nustatyti bičių pienelio geografinę kilmę [4].
Šviežio ir liofilizuoto bičių pienelio cheminė sudėtis skiriasi nežymiai, tačiau medžiagų kiekių skirtumas ženklus. Liofilizuotas bičių pienelis yra koncentruotas, veikliųjų medžiagų jame tris kartus daugiau nei šviežiame bičių pienelyje (1 lentelė).
1 lentelė. Šviežio ir liofilizuoto BP sudėčių palyginimas [4,17,25,49]
Medžiaga Kiekis procentais šviežiame bičių pienelyje
Kiekis procentais liofilizuotame bičių pienelyje Vanduo 60 – 70 < 5 Lipidai 3 – 8 8-19 10-hidroksi-2-deceninė rūgštis > 1.4 > 3.5 Baltymai 9 – 18 27-41 Angliavandeniai 7 – 18 - Fruktozė 3 -13 - Gliukozė 4 – 8 - Sacharozė 0.5 – 2.0 - pH 3.4 - 4.5 3.4 – 4.5
Bičių pienelio farmakologinės savybės siejamos su jo sudėtyje esančiomis biologiškai aktyviomis medžiagomis: baltymais, riebiosiomis rūgštimis, bei fenoliniais junginiais.
Baltymai sudaro didžiają bičių pienelio sausųjų medžiagų masės dalį. Apie 70 proc. bičių pienelyje aptinkamų baltymų yra tirpūs vandenyje. Laisvos amino rūgštys sudaro vos 0,6 – 1,5 proc., daugiausiai aptinkama prolino, lizino, glutamo rūgšties, β-alanino, fenilalanimo, aspartato bei serino [25,49].
Lipidai sudaro apie 8 proc. sausos BP masės. Laisvosios riebalų rūgštys sudaro apie 80-90 proc. visų lipidų. Dauguma bičių pienelyje aptinkamų riebalų rūgščių pasižymi gana neįprasta struktūra, tai mono- ir dihidroksi rūgštys bei dikarboksi rūgštys su 8-10 specifiškai išsidėsčiusių anglies atomų [49]. Svarbiausia riebalų rūgštis - 10-hidroksi-2-deceninė rūgštis (10-HDA), tai nesočioji riebalų rūgštis, kuri yra atsakinga už BP aktyvumą, pasižymi antibakteriniu veikimu [25,49].
BP aptinkamas platus vitaminų spektras. Daugiausiai aptinkama riboflavino, niacino, tiamino bei folio rūgšties. Taip pat aptinkami nedideli kiekiai pantoteno rūgšties, bei vitamino C pėdsakai. Riebaluose tirpių vitaminu, A, D, E ir K – bičių pienelio sudėtyje nepastebėta [25].
1.2.2 Bičių pienelio savybės
antimikrobinės [1,2,9–11,13,14,16,17,19–21,25,47,51–56]; antidiabetinės [25];
antioksidacinės [9–18]; antireumatinės [11,25];
imunomoduliacinės [10,13,19,24,25,51];
kolageno atstatyma skatinančiosir odą saugančios [24,25]; kraujodarą skatinančios [25];
priešuždegiminės [9–14,17,20]; priešvėžinės [9,11–15,17,20,25,57]; regeneraciją skatinantčios [25]; tonizuojančios [4,12,13,19,33,47,58];
Žaizdų gijimą skatinantis poveikis [1,6,11,13,19–24]; atmintį gerinančios [11];
senėjimo procesus lėtinančios savybės [13,14,20];
Ir k.t. savybės.
1.2.3 Bičių pienelis kaip dermatologinių preparatų sudedamoji dalis
Antioksidacinės, antibakterinės, priešuždegiminės bei kitos naudingos savybės lemia platų bičių pienelio naudojimą kosmetikos bei odos priežiūros preparatų gamyboje. Dermatologiniuose preparatuose dažniausiai aptinkama bičių pienelio koncentracija siekia vos 0,05-1 proc. Tokie preparatai atgaivina, jaunina odą, skatina regeneraciją [6].
Taip pat dermatologiniai preparatai su bičių pieneliu gali būti naudojami nudegimų, žaizdų bei kitokių odos pažeidimų gydymui. Bičių pienelis taip pat veikia priešuždegimiškai bei mažina tinimą [13]. Atliktas tyrimas su pelėmis parodė, kad kasdien bičių pienelio tirpalu veikiamas odos įpjovimas gijo žymiai greičiau lyginant su kontroliniu druskos tirpalu (p<0,05) [20].
1.3 Propolio apibūdinimas
Propolis, dar žinomas kaip bičių pikis, dervinga medžiaga, bičių surenkama nuo įvairių augalų pumpurų bei žievės [9,59,60]. Bičių pikis kieta, gabalėlių ar smulkių kruopelių pavidalo medžiaga. Propolio spalva priklauso nuo augalų iš kurių surinktas ir gali varijuoti nuo geltonos iki tamsiai rudos ar net žalios spalvos. Pavyzdžiui nuo beržų surinktas propolis būna žalsvas, nuo topolių – rausvas. Pikis pasižymi maloniu, būdingu dervai, pušų ar tuopų pumpurams, medui kvapu. Skonis – kartus, deginantis. Propolio savybės priklauso nuo jo botaninės kilmės bei metų laiko kada jis buvo surinktas [59].
Avilyje propolis naudojamas plyšiams užklijuoti, todėl dažnai vadinamas bičių klijais
(angl. bee glue) [16,21,60]. Liaudies medicinoje dėl antimikrobinių, priešuždegiminių ir k.t. savybių
propolis naudojamas kaip žaizdų gijimą skatinanti bei dezinfekuojanti medžiaga. Propolio biologiškai aktyvias savybes lemia jo sudėtyje esantys fenoliniai junginiai [59].
1.3.1 Propolio sudėtis
Propolyje identifikuojama daugiau nei 300 junginių. Tokia cheminių junginių įvairovė priklauso nuo propolio botaninės kilmės ir regiono kuriame jis surinktas. Didžiąją dalį propolio ( 50-55 proc.) sudaro dervos, taip pat randama apie 30 proc. vaško, 10 proc. eterinių aliejų bei 5 proc. žiedadulkių bei kitų organinių medžiagų [44,54].
Propolio ekstraktuose dažniausiai randamos cheminių junginių grupės: fenoliniai junginiai (flavonoidai, fenolinės rūgštys ir jų esteriai); alifatinės rūgštys ir jų esteriai;
aromatinės rūgštys ir jų esteriai; terpenoidai [59].
Taip pat propolyje randama vitaminų (A, B1, B2, B6, C, E, pantoteno rūgšties bei nikotino rūgšties). Aptinkama mineralinių medžiagų, tokių kaip: Mn, Zn, Cu, Ni, Co, P, K, S, Na, Fe ir Mg [59].
1.3.2 Propolio savybės
antimikrobinės [9,15,16,21,41–44,60]; antiokcidacinės [9,14–16,42–45]; antivirusinės [42–44]; imunomoduliacinės [9,43,44]; priešuždegiminės [9,15,16,42,43] priešvėžinės [9,15,16,42–44] skausmą malšinančios savybės [43]; žaizdų gijimą skatinančios savybės [43].1.4 Medaus apibūdinimas
Medus tai klampi, saldi medžiaga, kurią bitės gamina iš nuo augalų surinkto nektaro. Avilyje, dalis nektare esančios drėgmės išgaruoja, subrandintame meduje drėgmės kiekis siekia ne daugiau nei 17 proc. [8]. Medaus kvapas, skonis bei cheminė sudėtis labai priklauso nuo augalų iš, kurių medus yra surinktas. Spalva gali varijuoti nuo beveik baltos iki tamsiai rudos. Pavyzdžiui liepų medus yra šviesus, gelsvas, o miško medus – tamsiai rudas. Skonis saldus, miško medaus skonis gali būti saldžiai aitrus. Kvapas saldus, primena propolį. Medus plačiai naudojamas kaip liaudies medicinos priemonė peršalimo ligų gydymui, organizmo stiprinimui, kaip žaizdas dezinfekuojanti ir gijimą skatinanti priemonė [32].
1.4.1 Medaus sudėtis
Medaus sudėtyje aptinkama per 200 cheminių junginių. Didižiają dalį ( apie 80 proc.) sudaro angliavandeniai. Iš jų fruktozė sudaro apie 38 proc., gliukozė 31 proc., sacharozė 1 proc., o baltyminės medžiagos siekia vos 0,7 proc. [8]. Taip pat meduje aptinkama organinių rūgščių (oksalo, pieno, obuolių, vyno, citrinos), aminorūgščių (prolino, fenilalanino), hidroksiaminų, vitaminų B1, B2, B3, B6,
C, H, K, E, A, PP, hormonų, fermentų, mineralinių medžiagų bei mikroelementų. Medaus, kaip ir kitų bičių produktų, sudėtis labai priklauso nuo regiono, klimato bei botaninės įvairovės.
1.4.2 Medaus savybės
antimikrobinės [8,16,21,32,37–39,51,61]; antioksidacinės [16,30–32];
antivirusinės [16];
imunomoduliacinės [16,33]; odą drėkinančios savybės [29]; odą minkštinančios savybės [29]; priešuždegiminės [16,31];
priešvėžinės [16];
žaizdų gijimą skatinančios savybės [21,32–39].
1.5 Tween 80 apibūdinimas
Tween 80, dar žinomas kaip polisorbatas 80 ar polioksietilen(20)-sorbitano monooleatas, kurio molekulinė masė siekia 1310 Da. Sudarytas iš etileno oksido, sorbitolio ir oleino rūgšties. Cheminė struktūra pateikta 2 pav.
Tai paviršiaus aktyvumo medžiaga plačiai naudojama kosmetikos bei maisto pramonėje. Tween 80 gerina aliejų, baltymų ir kitų medžiagų tirpumą vandenyje, naudojamas kaip emulsiklis gaminant aliejus-vandenyje tipo emulsijas [62].
Tween 80 savybės:
Netoksiškas, žmogui letali dozė daugiau nei 15g/kg vartojant per os; bespalvis ir bekvapis todėl nekeičia produkto juslinių savybių [63];
1.6 Euxyl PE 9010 apibūdinimas
Euxyl PE 9010 yra kosmetikos pramonėje plačiai naudojamas skystas konservantas. Jo pagrindą sudaro fenoksietanolis 3 pav. ir etilheksilglicerolis 4 pav. Šis konservantas pasižymi plataus spektro poveikiu, veikia bakterijas, mielių ir pelėsių grybelius.
Euxyl PE 9010 yra atsparus hidrolizei, temperatūros bei pH reikšmės pokyčiams. Aktyvumas išlieka kai pH reikšmė svyruoja iki 12. Šis konservantas pasižymi geru tirpumu įvairiose terpėse net ir esant žemai temperatūrai [64].
3 pav. Fenoksietanolio cheminė struktūra [64].
4 pav. Etilheksilglicerolis cheminė struktūra [64]
1.6.2 Euxyl PE 9010 savybės
Gerai suderinamas su daugeliu kosmetikos sudedamųjų dalių; neturi įtakos gaminamo produkto spalvai;
gerai suderinamas su įvairiomis druskomis;
naudojant gamintojo rekomenduojamas koncentracijas yra netoksiškas; pasižymi plačiu antimikrobiniu spektru [64].
1.7 Gelių apibūdinimas
Europos farmakopėja gelius apibrėžia kaip preparatus, kurių pagrindą dažniausiai sudaro vanduo, glicerolis ar propilenglikolis. Kaip gelifikuojanti medžiaga dažniausiai naudojamas krakmolas, celiuliozės dariniai, karbomerai ar magnio-aliuminio silikatai.
Geliai gali būti gaminami naudojant natūralius bei sintetinius polimerus. Polimeriniai geliai tai skysta- kieta sistema. Netirpi kieta matrica vandenyje brinksta ir dėl susidariusių kryžminių jungčių formuoja trimatį tinklą [28]. Susidomėjimas geliniais pusiau kietais preparatais auga. Lyginant gelius, kremus ir tepalus pastebėta, kad vaistinė medžiaga geriau absorbuojama iš gelinių dermatologinių prepatatų [65].
Geliai kurių pagrindą sudaro vanduo vadinami hidrogeliais. Hidrogeliai tai kryžminėmis jungtimis (angl. cross-linked) sujungtas polimerinis tinklas gebantis savo poringoje struktūroje sulaikyti sąlyginai didelį kiekį vandens. Gebėjimas sulaikyti vandenį labai priklauso nuo hidrogelių struktūros, ypač nuo hidrofilinių grupių ( amino, karboksilo ir hidroksilo) buvimo polimero grandinėje. Hidrogeliuose polimeriniai tinklai susijungia kryžminėmis jungtimis ir sudaro trimatę struktūra [27,66]. Tinklinė struktūra sudaryta iš homopolimerų ar kopolimerų. Polimerai yra netirpūs, vandenyje jie brinksta [66].
Dėl unikalių hidrogelių fizinių savybių jie plačiai naudojami kaip pagrindas gaminant trandermalinius preparatus. Poringa hidrogelių struktūra lemia vaistinės medžiagos sulaikymą gelio matricoje. Vaistinės medžiagos išskyrimo greitis prilauso nuo vaistinės medžiagos molekulių difuzijos per gelio tinklą koeficiento. Hidrogeliai gali būti naudojami kaip depo forma užtikrinanti vietinį poveikį, didelę vaistinės medžiagos koncentraciją ir lėtą jos išskyrimą. Jei vaistinė medžiaga geba prasiskverbtį pro odą – geliai gali sukelti ir sisteminį poveikį. Hidrogeliai suderinami su daugeliu komponentų [27].
1.7.1 Karbomerai
Karbomerai – akrilinės rūgšties polimerai kryžmnėmis jungtimis sujungti su polialkenilo eteriu ar divinilo glikoliu. Tai anijoniniai polimerai, kurie gelifikuojasi tik neutralizuoti. Organiniai aminai (pavyzdžiui trietilaminas) bei šarmai ( NaOH, KOH) gali būti naudojami neutralizacijai. Neretai poliakrilo rūgšties polimerai vadinami firminiu pavadinimu – karbopoliais ( angl. Carbopol).
Karbopoliai tai vandenyje netirpi hidrofilinė medžiaga. Vandenyje šie polimerai brinksta formuodami koloidinę, gleives primenančią dispesiją.
5 pav. Poliakrilo rūšties polimero struktūra [67].
Karbopoliai labai gerai sugeria vandenį. Brinkstant vandenyje karbopolių tūris padidėja iki 1000 kartų, o diemetras iki 10 kartų. Kai pH reikšmės ribos yra nuo 4,0 iki 6,0 – gaunama gelinė konsistensija. Karbopolių lydymosi temperatųra – 105°C. Sauso karbomero grandinės yra susisukusios į spirales, tačiau sąlytyje su tirpikliu grandinės lėtai išsileidžia sudarydamos polimero tinklą [68].
1.7.2 Karbopolių savybės
Karbomerai plačiai naudojami farmacijos ir kosmetikos pramonėje. Karbomerai pasižymi tokiais privalumais kaip:
pasiekiama didelė klampa naudojant mažas karbomero koncentracijas [26,28];
platčiu klampos intervalu, leidžiančiu pagaminti įvairios konsistencijos gelius [26,28]; suderinamumu su daugeliu komponentų [26–28];
geru temperatūriniu stabilumu [26,28];
geromis organoleptinėmis savybėmis ir priimtinumu pacientams [26,28]; patogiu vartojimu [28];
alternatyva riebalinio pagrindo pusiau kietiems preparatams [28]; nesudėtinga gamybos technologija [69];
Karbopoliai dažnai naudojami gaminant transderminius, rektalinius, akių, nosies gelinius preparatus. Fizikinės karbopolinių gelių savybės leidžia geliams prisitaikyti ir išlikti vartojimo vietoje [26].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Tyrime naudotos medžiagos ir aparatūra
2.1.1 Tyrime naudotos medžiagos
Bičių pienelis ( Bienen – Voigt und Warnholz, Vokietija);
Liofilizuotas bičių pienelis (Bienen – Voigt und Warnholz, Vokietija); Carbopol® Ultrez™ 21 (Lubrizol, JAV);
Propolio skystas ekstraktas MDF ( Medicata Filia, Lietuva); Medus (Medicata Fialia, Lietuva);
Glicerolis ≥ 98,0 % (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija); Euxyl PE 9010 (Schülke&Mayr GmbH, Vokietija);
Tween 80 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
Folin-Ciocalteu reagentas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija); Galo rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija);
2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH) radikalas (Sigma – Aldrich, Vokietija); Etanolis (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva);
Sabouraud agaras (Liofilchem, Italija); Sojos agaras (Liofilchem, Italija);
Buferinis peptono vanduo (Liofilchem, Italija);
2.1.2
Tyrime naudota aparatūra
pH-metras Cyberscan pH/mV/oC Meter (EUTECH INSTRUMENTS, Nyderlandai);
centrifuga 3-18 KS (Sigma, Vokietija);
viskozimetras AlphaL (Fungilab,Ispanija);
spektrofotometras Halo DB-20 (Dynamica, Jungtinė Karalystė);
termostatas ( Memmert, Vokietija);
2.2 Metodai
2.2.1 Gelių gamyba tiesioginiu metodu
Pagrindo gamyba:
Išgrynintas vanduo supilamas į indą, 5-10 ml vandens paliekama bičių pienelio ir medaus tirpinimui. Reikiamas kiekis (0,9 proc.) Carbopol® Ultrez™ 21 karbomero miltelių atsargiai paskleidžiamas vandens paviršiuje ir palaukiama kol milteliai išbrinks. Gautas mišinys maišomas, neutralizuojamas 18 proc. natrio hidroksido tirpalu iki pH reikšmės 7,5-8, kuri nustatoma pH-metru Cyberscan pH/mV/oC Meter (Eutech Instruments, Nyderlandai). Į gautą gelio pagrindą įmaišoma 5 proc. glicerolio.
Medžiagų įterpimas į gelio pagrindą:
Į gautą pagrindą, atsižvelgiant į receptūrą nurodytą 2 lentelėje, įmaišoma tirpumą gerinanti medžiaga (Tween 80). Į kontrolinius mėginius, kuriuose propolio nėra, vietoj tirpumą gerinančios medžiagos įmaišomas konservantas (Euxyl 9010). Bičių pienelis tirpinamas likusiame vandenyje, jei gelio sudėtyje yra medaus jis tirpinamas kartu su pieneliu. Nuolat maišant gautas tirpalas atsargiai supilamas į gelio pagrindą. Mėginiuose su propoliu, etanolinis propolio ektraktas įmaišomas gamybos pabaigoje. Nuolat maišant atsargiai sulašinamas reikiamas propolio ektrakto kiekis, maišoma iki homogeninio gelio susidarymo.
Dar kartą vertinama gelio pH reikšmė, jei reikia įlašinami keli lašai 18 proc. natrio hidroksido tirpalo. Pagaminto gelio pH reikšmė 6 – 6,5.
2.2.2 Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Suminis Fenolinių junginių kiekis geliuose nustatytas naudojant Folin-Ciocalteau metodą [42,70,71]. Pirmiausiai paruošti tiriamieji tirpalai 1g gelio tirpinant 10 ml etanolio. 1 ml gauto tirpalo 25 ml matavimo kolbutėje sumaišytas su 9 ml distiliuoto vandens ir 1ml Folin-Ciocalteau reagento, supurtyta. Praėjus 5 min įpilta 10 ml 7 proc. natrio karbonato (Na2CO3) tirpalo ir vandens iki 25 ml ribos. Po 30 min absorbcija matuota spektrofotometru esant 750 nm bangos ilgiui. Fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas pagal galo rūgšties kalibracinę kreivę ir išreikštas mg/g.2.2.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu
Gelių su bičių pieneliu antioksidainis aktyvumas buvo nustatomas naudojant 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH) radikalą [11,52]. Tyrimo metu buvo naudojami tie patys tiriamieji tirpalai kaip ir suminio fenolinių junginių kiekio nustatymui, kurie aprašyti skirsnyje 2.2.2.
1 ml tiriamojo tirpalo sumaišyta su 4 ml 0,004 proc. etanolinio DPPH radikalo tirpalo. Gautas mišinys laikytas tamsoje, kambario tempertūroje. Praėjus 60 min absorbcija matuota spektrofotometru esant 517 nm bangos ilgiui. Antiokcidacinis aktyvumas buvo apskaičiuotas pagal trolokso kalibracinę kreivę ir išreikštas procentais.
2.2.4 pH reiškmės nustatymas
Vertinant gelių pH reikšmę pasvertas 2g gelio mėginys stiklinėlėje užpilamas 20 ml distiliuoto vandens. Stikline lazdele maišoma, kol gelis visiškai ištirpsta. Gauto tirpalo pH matuojamas pH-metru Cyberscan pH/mV/oC Meter (EUTECH INSTRUMENTS, Nyderlandai). Matavimai kartojami tris kartus, po kiekvieno matavimo pH-metro elektrodai plaunami distiliuotu vendeniu. Matavimai atlikti 3 kartus: pagaminus gelius, praėjus mėnesiui bei trims mėnesiams po pagaminimo. Kiekvienas matavimas kartojamas 3 kartus, rezultatai pateikiami išvedus aritmetinius vidurkius.
2.2.5 Šaldymo – šildymo ciklas
Į 2 ml tūrio mėgintuvėlius dedamas vienodas kiekis tiriamųjų gelių. Tiriama po tris kiekvieno gelio mėginius. Mėgintuvėliai su geliais parą laikomi šaldiklyje ( - 180C). Vėliau parą laikomi kambario temperatūroje. Gelių stabilumas vertinamas nustatant atsiskyrusios fazės kiekį (g) ir apskaičiuojamas remiantis formulę:
𝐶 =𝑎 × 100 𝑚
C – atsiskyrusios vandens fazės kiekis (proc.) a – vandeninės fazės kiekis (g)
2.2.6 Centrifugavimas
Gelių su bičių pieneliu centrifugavimas buvo atliekamas naudojant „Sigma 3-18 KS“ (Vokietija) centrifuga. 2 ml talpos mėgintuvėliai užpildyti geliais, kiekvienu geliu užpildyta po du mėgintvėlius. Centrifuguota 3000 apsisukimų per minutę greičių 5 min, 25 0C temperatūroje. Tyrimas vykdytas tris kartus: pagaminus gelius, praėjus mėnesiui bei praėjus trims mėnesiams po pagaminimo. Po centrifugavimo mėgintuvėliai su gelių mėginiais kruopščiai apžiūrėti, atsiradę pokyčiai ( fazių atsiskyrimas) pažymėti lentelėje.
2.2.7 Viskozimetrinis klampos tyrimas
Gelių klampos buvo matuojamos viskozimetru AlphaL (Fungilab,Ispanija ). Prieš pradedant matuoti klampą, geliai buvo gerai išmaišomi stikine lazdele. Klampa matuota naudojant L4 suklį, kuris panardintas į tiriamąjį gelį iki žymos. Nustatytas suklio apsisukimų skaičius – 5 rpm (apsisukimų per minutę). Matavimai atlikti esant kambario temperatūrai (25°C). Kiekvieno mėginio klampa matuota tris kartus, rezultatai pateikiami išvedus aritmetinius vidurkius.
2.2.8
Mikrobiologinis nesterilių produktų vertinimas (bendras gyvų aerobų
skaičius)
Tyrimas atliktas pagal farmokipėjinę Ph. Eur. 01/2008:20612 metodiką. Tyrimas atliekamas mikrobiologijos laboratorirjoje, laminare. Siekiant išvengti tiriamojo produkto atsitiktinio mikrobinio užteršimo naudojami įrankiai bei tirpalai sterilizuojami autoklave.
Tiriamojo mėginio ruošimas
Tiriamieji geliai gerai išmaišomi stikline lazdele, atsverti 0,5 g gelio gelių mėginiai ištirpinami 5 ml buferinio natrio chlorido-peptono tirpalo (pH 7). 1 ml gauto tirpalo perkeliama į 10 ml buferinio natrio chlorido-peptono tirpalo (pH 7). Gaunamas skiedimas 1*102.
Tiesioginio pasėlio ant agaro paviršiaus metodas
Naudojamos 9 cm Petri lėkštelės į kurias pilama po 15-20 ml suskystintos mitybinės terpės bakterijoms auginti (mitybinė terpė B) bei grybeliams auginti (mitybinė terpė C), kurių temperatūra nedidesnė nei 450C. Terpei sustingus jos paviršiuje paskleidžiama po 1ml tiriamojo tirpalo. Bakterijoms auginti skirtos terpės 5 dienas kultivuojamos termostate 30-35 0C temperatūroje, grybeliams auginti skirtos terpės - 5 dienas 20-25 0C temperatūroje.
Filtravimo pro membraną metodas
Mėginių, kurių sudėtyje yra konservuojančių medžiagų tyrimas atliekamas filtravimo pro membraną metodu. Naudojami celiuliozės nitrato membraniniai filtrai, kurių porų skersmuo nedidesnis kaip 0,45 mm. Po 1 ml tiriamojo tirpalo filtruojama pro du membraninius filtrus. Siekiant išplauti konservuojančią medžiagą ( Euxyl PE 9010) filtras plaunamas tris kartus, kaskart sunaudojant apie 100 ml sterilaus buferinio natrio chlorido – peptono tirpalo (pH7). Filtrai sėjami į Petri lėkšteles su mitybinėmis terpėmis. Vienas į mitybinę terpę skirtą auginti bakterijoms (mitybinė terpė B), kitas į grybeliams auginti skirtą terpę ( mitybinė terpė C). Inkubuojama 5 dienas laikantis tokių pat sąlygų kaip ir tiesioginio pasėlio ant agaro paviršiaus būdu paruošti mėginiai.
Rezultatų vertinimas
Bakterijų skaičiumi laikomas standžioje mitybinėje terpėje B išaugusių kolonijas sudarančių vienetų (KSV) vidurkis. Grybelių skaičiumi laikomas standžiojoje mitybinėje terpėje C išaugusių KSV vidurkis.
Bendras gyvybingų aerobų skaičius yra bakterijų ir grybelių skaičių suma. Dermatologinių preparatų mikrobiologinis užteršimas neturi viršyti 102 mikroorganizmų 1ml tiriamojo tirpalo.
Farmakopėjos straipsnyje nurodomos mikrobinio užterštumo ribos aiškinamos taip: - 102 mikroorganizmų: didžiausia priimtina riba: 5 x 102 .
2.2.9 Statistinė analizė
Gauti duomenys apdoroti naudojant programinį statistinių duomenų paketą IBM SPSS Statistics 22 for Windows. Analizuotas imties aritmetinis vidurkis, vidurkio standartinis nuokrypis.
3. REZULTATAI
3.1 Gelių su bičių pieneliu sudėties sudarymas ir gamyba
2 lentelė. Gelių su bičių pieneliu sudėtys
Gelis Bičių pienelis (proc.) Karbomeras (Ultrez™ 21) (proc.) Glicerolis (proc.) Medus (proc.) Etanolinis propolio ekstraktas (proc.) Euxyl PE 9010 (proc.) Tween 80 (proc.) Vanduo (proc.) Su švieži u b iči ų p ie n el iu K 1 0,9 5 0,05 93,0 P 0,2 1 0,9 5 0,2 0,3 92,6 P 0,35 1 0,9 5 0,35 0,525 92,2 P 0,5 1 0,9 5 0,5 0,75 91,9 P 1 1 0,9 5 1 1,5 90,6 M 1 0,9 5 4 0,05 89 M P 0,2 1 0,9 5 4 0,2 0,3 88,6 M P0,35 1 0,9 5 4 0,35 0,525 88,2 M P 0,5 1 0,9 5 4 0,5 0,75 87,9 M P 1 1 0,9 5 4 1 1,5 86,6 Su liof ili zu ot u b iči ų p ie n e liu K 1 0,9 5 0,05 93,0 P 0,2 1 0,9 5 0,2 0,3 92,6 P 0,35 1 0,9 5 0,35 0,525 92,2 P 0,5 1 0,9 5 0,5 0,75 91,9 P 1 1 0,9 5 1 1,5 90,6 M K 1 0,9 5 4 0,05 89 M P 0,2 1 0,9 5 4 0,2 0,3 88,6 M P0,35 1 0,9 5 4 0,35 0,525 88,2 M P 0,5 1 0,9 5 4 0,5 0,75 87,9 M P 1 1 0,9 5 4 1 1,5 86,6
* P (0,2; 0,35; 0,5; 1) – nurodo propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją geliuose M – geliai, kurių sudtyje yra 4 proc. medaus
K – kontrolinis mėginys su šviežiu ar liofilizuotu bičių pieneliu MK – kontrolinis mėginys su bičių pieneliu ir medumi
Tyrimo metu geliai buvo gaminami naudojant šviežią ir liofilizuotą bičių pienelius. Siekiant įvertinti šviežio ir liofilizuoto BP skirtumus bei galimybę įterpti į gelinius preparatus pagaminti skirtingų sudėčių mėginiai. Iš viso pagaminta 20 gelių, po 10 gelių naudojant 1 proc. šviežio ir liofilizuoto BP.
Kaip gelifikuojanti medžiaga pasirinktas poliakrilo rūgšties polimeras Carbopol® Ultrez™ 21 (Lubrizol,Vokietija). Naudojant šį polimerą pagrindo gamyba nesudėtinga, brinkimo laikas siekia vos 5-10 min. Taip pat šis polimeras suderinamas su daugeliu sudedamųjų dalių bei pasižymi gera elektrolitų tolerancija, o pagaminti preparatai pasižymi geromis organoleptinėmis savybėmis. Be to gelių gamyba naudojant Carbopol® Ultrez™ 21 polimerą yra ekonomiška, didelė produkto klampa pasiekiama naudojat mažą polimero koncentraciją. Atsižvelgiant į gamintojo rekomendacijas gelių gamybai buvo naudojama 0,9 proc. poliakrilo rūgšties polimero [72]. Glicerolis buvo parinktas dėl drėkinančių, odą apsaugančių savybių, taip pat dėl gebėjimo sulaikyti drėgmę [73]. Šių komponentų kiekis išliko vienodas visuose geliuose.
Propolis – biologiškai aktyvi medžiaga pasižyminti stipriu antimikrobiniu veikimu [9,16,21,74]. Propolis gali būti naudojamas kaip natūralus konservantas [40,41]. Taip pat jis pasižymi priešuždegiminėmis, analgetinėmis, antimikrobinėmis bei dar daugeliu savybių. Siekiant įvetinti propolio antimikrobines savybes ir parinkti optimaliausią propolio kiekį, gelių gamyboje naudotos skirtingos etanolinio propolio ekstrakto koncentracijos (0,2; 0,35; 0,5; 1 proc.). Kadangi propolio etanolinis ekstraktas yra netirpus vandenyje, kaip tirpumą gerinanti medžiaga naudotas polioksietilen (20)-sorbitano monooleatas(Tween 80) [43,63].
Siekinat įvertinti propolio antimikrobinį aktyvumą buvo pagaminti geliai naudojant sintetinį konservantą (Euxyl PE 9010). Naudojant gamintojo rekomenduojamas koncentracijas ( 0,5-1 proc.), Euxyl PE 9010 yra netoksiškas [64]. Taip pat šis konservantas yra bespalvis, praktiškai bekvapis, nekeičia pagamintų gelių juslinių savybių.
Medus į gelių sudėtį įtauktas, kadangi jis pasižymi odą drėkinančiomis bei minkštinančiomis savybėmis [29]. Taip pat medus papildo bičių pienelio antiokcidacines, regeneracines bei antimikrobines savybes [21,39,47,51]. Gelių sudėtyje naudota 4 proc. medaus, kadangi 3-4 proc. medaus jau pasižymi antimikrobiniu veikimu [51].
3.2 Gelių su bičių pieneliu juslinių savybių vertinimas
Pagaminti geliai buvo kruopščiai apžiūrėti, įvertintos juslinės savybės: spalva, homogeniškumas, kvapas bei drumstumas. Gelių juslinės savybės aprašytos 3 lentelėje.
Gelių juslinės savybės pakartotinai vertintos praėjus mėnesiui bei trims mėnesiams po pagaminimo. Pastebėti pokyčiai pažymėti 4 lentelėje.
3 lentelė. Gelių su bičių pieneliu juslinės savybės.
Savybė
Homogeniškumas Vienalytis, be matomų pakitimų.
Spalva Rusva*, spalvos internsyvumas priklauso nuo propolio etanolinio ekstrakto konsentracijos.
Kvapas Malonus, būdingas propoliui*
Skaidrumas Geliai skaidrūs
*Kontroliniai mėginiai bespalviai ir praktiškai bekvapiai. 4 lentelė. Gelių su bičių pieneliu juslinių savybių pokyčiai bėgant laikui.
Gelis
Pagaminus Po 1 mėn. Po 3 mėn. Homog e n išku m as Spa lva K va p as Ska id ru m as Homog e n išku m as Spa lva K va p as Ska id ru m as Homog e n išku m as Spa lva K va p as Ska id ru m as Su švieži u b iči ų p ie n e liu K + + + + + + + + + + + + P 0,2 + + + + + + + + + + + P 0,35 + + + + + + + + + + + P 0,5 + + + + + + + + + + + + P 1 + + + + + + + + + + + + M + + + + + + + + + + + + M P 0,2 + + + + + + + + + + + M P0,35 + + + + + + + + + + + M P 0,5 + + + + + + + + + + + + M P 1 + + + + + + + + + + + + Su liof ili zu ot u b iči ų p ie n e liu K + + + + + + + + + + + + P 0,2 + + + + + + + + + + + P 0,35 + + + + + + + + + + + P 0,5 + + + + + + + + + + + + P 1 + + + + + + + + + + + + M + + + + + + + + + + + + M P 0,2 + + + + + + + + + M P0,35 + + + + + + + + + M P 0,5 + + + + + + + + + + + M P 1 + + + + + + + + + + + +* „“ žymima, jei gelis neatitinka išsikeltų reikalavimų, nurodytų 5 lentelėje.
Lyginant gelių su šviežiu ir liofilizuotu BP juslines savybes pastebima, kad geliai su šviežiu BP yra stabilesni nei su liofilizuotu BP. Geliuose su šviežiu BP pastebimas tik nežymus drumstumas praėjus trims mėnesiams po pagaminimo. Kai tuo tarpu geliuose su liofilizuotu BP pastebima ir spalvos pokyčių.
Pokyčiai atsiranda geliuose su 0,2 proc. bei 0,35 proc. etanolinio propolio ekstrakto, praėjus trims mėnesiams po pagaminimo pastebimas nežymus drumstumas. Propolio ekstrakto koncentraciją padidinus iki 0,5 proc. geliai išlieka skaidrūs. Geliuose su bičių pieneliu bei su bičių pieneliu ir medumi optimalus etanolinio propolio ekstrakto kiekis yra 0,5 proc.
Lyginant gelius su liofilizuotu BP bei su liofilizuotu BP ir medumi pastebėta, kad stabilesni geliai, kurių sudėtyje medaus nėra. Geliuose su liofilizuotu BP ir 0,2 bei 0,35 proc. propolio praėjus trims mėnesiams po pagaminimo pastebimas nežymus drumstumas. Propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją padidinus iki 0,5 proc. geliai išlieka skaidrūs. Tuo tarpu geliuose su liofilizuotu BP , medumi bei 0,2 ir 0,35 proc propolio jau po 1 mėn. pastebimas drumstumas. Praėjus trims mėnesiams tuose pačiuose geliuose pastebimas ir spalvos ( gelio spalva netolygi, tamsesnė) pokytis. Praėjus trims mėnesiams drumstumas pastebimas ir gelyje su liofilizuotu BP, medumi ir 0,5 proc. propolio ekstrakto.
Tyrimu nustatyta, kad geliuose su šviežiu BP, šviežiu BP ir medumi bei liofilizuotu BP optimali propolio etanolinio ekstrakto koncentracija yra 0,5 proc. Geliai su liofilizuotu BP ir medumi mažiau stabilūs, norint užtikrinti geras juslines gelio savybes reikalingas 1 proc. propolio.
3.3 Suminio fenolinių junginių kiekio vertinimas geliuose su bičių pieneliu.
Lyginant suminį fenolinių junginių kiekį geliuose su šviežiu ir liofilizuotu BP pastebimas statistiškai reikšmingas skirtumas ( p<0,05). Geliuose su liofilizuotu BP fenolinių junginių kiekis net iki 13 proc. didesnis. Didinant propolioetanolinio ekstrakto koncentraciją matomas reikšmingas (p<0,05) suminio fenolinių junginių kiekio didėjimas. Lyginant kontrolinį mėginį bei gelį su šviežiu bičių pieneliu bei 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto matoma, kad fenolinių junginių kiekis padidėjo 16 kartų. Geliuose su liofiliuotu bičių pieneliu pastebima tokia pat suminio fenolinių junginių kiekio didėjimo tendencija. Didinant propolio ekstrakto koncentraciją fenolinių junginių kiekis proporcingai didėja.
6 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio priklausmybė nuo propolio koncentracijos (n=3)
K- kontroliniai geliai (be etanolinio propolio ekstrakto)
* p<0,05 kontrolinis gelis su šviežiu BP vs kontrolinis gelis su liofilizuotu BP ** p<0,05 kontroliniai geliai vs geliai su 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto
Meduje taip pat yra fenolinių junginių, tačiau žymiai mažiau nei propolyje. Medaus įterpimas į gelį didina suminį fenolinių junginių kiekį, tačiau šis pokytis nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05). Kontroliniame mėginyje su šviežiu bičių pieneliu suminis fenolinių junginių kiekis siekia 0,09 mg/g, kai tuo tarpu gelyje su šviežiu BP ir medumi 0,14 mg/g. Mėginiuse su liofilizuotu BP atitinkamai 0,12 mg/g ir 0,18 mg/g. Suminis fenolinių junginių kiekiai į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus pateikti 5
5 lentelė. Suminio fenolinių junginių kiekio palyginimas į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus (n=3)
Gelis
Su šviežiu bičių pieneliu Su liofilizuotu bičių pieneliu Suminis fenolinių junginių kiekis (mg/g) Suminio fenolinių junginių kiekis į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus (mg/g) Suminis fenolinių junginių kiekis (mg/g) Suminio fenolinių junginių kiekis į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus (mg/g) K 0,088 ± 0,004 0,140 ± 0,002* 0,119 ± 0,004 0,182 ± 0,002* P 0,2 0,531 ± 0,014 0,575 ± 0,004 0,550 ± 0,001 0,599 ± 0,004 P 0,35 0,705 ± 0,006 0,771 ± 0,001 0,748 ± 0,002 0,773 ± 0,004 P 0,5 0,903 ± 0,004 0,945 ± 0,006 0,955 ± 0,003 0,992 ± 0,005 P 1 1,372 ± 0,001 1,412 ± 0,004 1,474 ± 0,002 1,484 ± 0,006
* p>0,05 kontroliniai geliai vs kontroliniai geliai su medumi
Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis (1,48 ± 0,006 mg/g) nustatytas gelyje su liofilizuotu bičių pieneliu, 1 proc. propolio ir 4 proc. medaus.
3.4 Spektrofotometrinis antioksidacinio aktyvumo tyrimas naudojant DPPH
reagentą
Lyginant gelių su šviežiu ir su liofilizuotu bičių pieneliu nustatytas statistiškai reikšmingas (p<0,05) skirtumas. Gelių su liofilizuotu bičių pieneliu antioksidacinis aktyvumas 0,83– 9 proc. didesnis nei gelių su šviežiu bičių pieneliu. Aktioksidacinio aktyvumo skirtumą lemia liofilizuoto ir šviežio bičių pienelio sudėties skirtumai.
Didžiausią įtaką gelių antioksidaciniam aktyvumui daro propolis. Kontroliniuos mėginiuose antioksidacinis aktyvumas siekia vos 1 proc. geliuose su šviežiu bičių pieneliu ir 2,3 proc. su liofilizuotu BP. Didinant propolio koncentraciją antioksidacinis aktyvumas didėja. Geliuose su šviežiu BP ir 0,2 proc. propolio antioksidacinis aktyvumas siekia 18,3 proc., su liofilizuotu BP 19,9 proc. Su 1
proc. propolio antioksidacinis aktyvumas siekia 34 proc. su šviežiu BP ir 34,3 proc. su liofilizuotu BP. Bičių pienelis pasižymi antioksidaciniu veikimu, tačiau jis nėra ryškus. Propolis pasižymi sipriu antioksidaciniu veikimu, kuris priklauso nuo fenolinių junginių [59]. Didinant propolio koncentraciją gelių antioksidacinės savybės stiprėja. Pokytis yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
7 pav. Gelių su bičių pieneliu antioksidacinio aktyvumo priklausomybe nuo propolio koncentracijos (n=3).
K- kontroliniai geliai (be etanolinio propolio ekstrakto)
* p<0,05 kontrolinis gelis su šviežiu BP vs kontrolinis gelis su liofilizuotu BP ** p<0,05 kontroliniai geliai vs geliai su 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto
6 lentelė . Antioksidacinio aktyvumo pokytis į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus
Gelis
Su šviežiu bičių pieneliu Su liofilizuotu bičių pieneliu Antioksidacinis aktyvumas (proc.) Antioksidacinis aktyvumas į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus (proc.) Antioksidacinis aktyvumas (proc.) Antioksidacinis aktyvumas į gelių sudėtį įtraukus 4 proc. medaus (proc.) K 1,077 ± 0,107 2,872 ± 0,134* 2,321 ± 0,163 3,973 ± 0,202* P 0,2 18,311 ± 0,171 20,567 ± 0,171 19,999 ± 0,192 21,225 ± 0,053 P 0,35 18,435 ± 0,222 20,105 ± 0,092 20,034 ± 0,453 21,136 ± 0,202 P 0,5 28,314 ± 0,192 28,669 ± 0,081 28,598 ± 0,081 29,415 ± 0,081 P 1 34,034 ± 0,215 34,816 ± 0,053 34,319 ± 0,187 35,367 ± 0,163 * p>0,05 kontroliniai geliai vs kontroliniai geliai su medumi
Medus statistiškai reikšmingai (p<0,05) padidina gelių antiokcidacines savybes. Gelio su šviežiu BP antiokcidacinis aktyvumas siekia vos 1 proc., o gelio su šviežiu BP ir medumi 2,8 proc. Geliuose su liofilizuotu BP atitinkamai 2,3 proc., o su medumi 3,9 proc. Geliuose su propolio etanoliniu ekstraktu medus taip didina antioksidacinį aktyvumą, tačiau pokytis nėra toks ryškus kaip kontroliniuose mėginiuose.
Į gelius su bičių pieneliu įmaišius propolio ir medaus antioksidacinės savybės stiprėja. Visos šios medžiagos pasižymi antioksidacinėmis savybėmis ir veikdamos kartu viena kitą papildo. Stipriausiu antioksidaciniu veikimu pasižymi gelis su liofilizuotu bičių pieneliu, medumi bei 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto.
3.5 Pagamintų gelių pH reikšmės vertinimas
Siekiant įvertinti gelių stabilumą pH reikšmės buvo vertinamos tris kartus: pagaminus gelius, praėjus vienam mėnesiui bei praėjus trims mėnesiams po pagaminimo. PH pokyčiai pateikti 7
7 lentelė. Gelių su bičių pieneliu pH reikšmės (n=3).
Gelis Su šviežiu bičių pieneliu Su liofilizuotu bičių pieneliu
Pagaminus Po 1 mėn. Po 3 mėn. Pagaminus Po 1 mėn. Po 3 mėn. K 6,31 ± 0,010 6,31 ± 0,020 6,29 ± 0,020 6,28 ± 0,026 6,28 ±0,023 6,27 ±0,030 P 0,2 6,26 ± 0,021 6,25 ± 0,025 6,25 ±0,025 6,26 ± 0,023 6,24 ±0,025 6,21 ±0,030 P 0,35 6,27 ± 0,010 6,27 ± 0,025 6,25 ±0,025 6,31 ± 0,026 6,29 ±0,032 6,27 ±0,035 P 0,5 6,25 ± 0,015 6,23 ± 0,015 6,23 ±0,025 6,32 ±0,015 6,31 ±0,025 6,29 ±0,025 P 1 6,28 ± 0,015 6,27 ± 0,015 6,27 ±0,025 6,25 ±0,023 6,25 ±0,025 6,22 ±0,025 M 6,27 ± 0,015 6,26 ± 0,010 6,26 ±0,015 6,30 ± 0,015 6,30 ± 0,020 6,29 ±0,040 M P 0,2 6,34 ± 0,021 6,31 ±0,015 6,28 ±0,015 6,34 ±0,021 6,27 ±0,015 6,15 ±0,035 M P 0,35 6,28 ± 0,015 6,25 ±0,015 6,23 ±0,010 6,31 ±0,026 6,25 ±0,026 6,16 ±0,040 M P 0,5 6,35 ± 0,015 6,34 ±0,010 6,31 ±0,015 6,33 ±0,020 6,27 ±0,020 6,20 ± 0,032 M P 1 6,36 ± 0,031 6,34 ±0,031 6,34 ±0,010 6,25 ±0,026 6,23 ±0,031 6,16 ±0,035
Lyginant pagamintų gelių pH reikšmes su reikšmėmis gautomis praėjus trims mėnesiams po pagaminimo statistiškai reikšmingų pokyčių nėra (p>0,05). Šiuo atveju bičių pienelio parinkimas didelės reikšmės pagamintų gelių pH reikšmei neturi.
7 lentelėje matoma, kad didžiausias pH reikšmės pokytis matomas geliuose su liofilizuotu BP, medumi bei propolio etanoliniu ekstraktu. Praėjus trims mėnesiams po pagaminimo gelio su liofilizuotu BP, medumi ir 0,2 proc. propolio ektstrakto pH reikšmė sumažėjo nuo 6,34 iki 6,15 (2,9 proc.), su 0,35 proc. propolio ekstrakto pH reikšmė sumažėjo nuo 6,31 iki 6,16 (2,3 proc.), su 0,5 proc. propolio ekstrakto pH sumažėjo nuo 6,33 iki 6,32 (2 proc.), o su 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto – nuo 6,25 iki 6,16 (1,4 proc). Tyrimu nustatyta kad pH reikšmės stabilumui geliuose diždiausią įtaką daro propolio etanolinio ekstrakto koncentracija, tačiau šie rezultatai nėra statistiškai patikimi p>0,05.
3.6 Gelių stabilumo vertinimas taikant šaldymo – šildymo ciklą
Pagal 8 lentelėje pateiktus duomenis matyti, kad didžiausias vandens kiekis ( 5 proc.) atsiskyrė gelyje su liofilizuotu bičių pieneliu, medumi ir 0,2 proc. propolio etanolinio ekstrakto. Šis
mėginys nestabiliausias. Gelyje su šviežiu BP medumi ir 0,2 proc propolio ekstrakto atsiskyrė 3 proc. vendens, o gelyje su liofilizuotu BP ir 0,2 proc. propolio atsiskyrė 3,5 proc. vandens. Fazių
atsiskyrimas pastebėtas po trijų šaldymo – šildymo ciklų.
Matoma, kad geliai su liofilizuotu BP mažiau atparūs temperatūros pokyčiams, fazių atsiskyrimas pastebėtas 2 mėginiuose. Propolio etanolinio ekstrakto koncentraciją padidinus iki 0,35 proc., vandens fazės atsiskyrimas po trijų šaldymo – šildymo ciklų nepasireiškė. Propolis teigiamai veikia gelių stabilumą temperatūros pokyčiams.
8 lentelė. Šaldymo-šildymo ciklo įtaka gelių stabilumui
Gelis
Atsiskyrusios vandens fazės kiekis (proc.) Šaldymo-šildymo ciklo numeris
1 2 3 S u švi ež iu b iči ų p ieneli u K P 0,2 P 0,35 P 0,5 P 1 M M P 0,2 3,0 M P0,35 M P 0,5 M P 1 S u li ofil izuotu b ičių p ie n eli u K P 0,2 3,5 P 0,35 P 0,5 P 1 M M P 0,2 M P0,35 5 M P 0,5 M P 1
3.7
Gelių su bičių pieneliu klampos vertinimas
8 paveiksle matoma, kad gelių su šviežiu ir su liofilizuotu bičių pieneliu klampų skirtumai yra statistiškai reikšmingi (P<0,05). Gelių su liofilizuotu BP klampa 11,6 - 27,7 proc. didesnė nei gelių su šviežiu bičių pieneliu. Toks akivaizdus skirtumas atsiranda, kadangi liofilizuotas BP yra sausa medžiaga ir jos įterpimas į gelį didina gelio klampą.
8 pav. Gelių su bičių pieneliu klampos palyginimas (n=3)
K- kontroliniai geliai (be etanolinio propolio ekstrakto)
* p<0,05 kontrolinis gelis su šviežiu BP vs kontrolinis gelis su liofilizuotu BP ** p<0,05 kontroliniai geliai vs geliai su 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto *** p<0,05 kontrolinis gelis vs kontrolinis gelis su medumi
Taip pat nustatyta , kad didžiausią įtaką gelių klampai daro propolio etanolinis ekstraktas. 8
paveiksle pateikiamos gelių klampos naudojant skirtingas propolio koncentracijas. Didinant propolio
koncentraciją pastebimas statistiškai reikšmingas gelių klampos mažėjimas (P<0,05). Gelis su šviežiu BP 1 proc. propolio ekstrakto yra 25 proc. mažiau klampus nei kontrolins mėginys. Ši tendencija pastebima tiek geliuose su šviežiu BP tiek su liofilizuotu BP. Medaus įvedimas į gelių sudėtį mažina klampą (P<0,05). Pastebėta kad kontrolinis mėginys su šviežiu BP yra 27,8 proc. klampesnis nei kontrolinis mėginys su šviežiu BP ir medumi. Mėginys su liofilizuotu BP atitinkamai 14,3 proc. klampesnis už gelį su medumi.
9 lentelė. Gelių su šviežiu ir liofilizuotu bičių pieneliu klampos pokytis laiko atžvilgiu (n=3)
Gelis
Su šviežiu bičių pieneliu Su liofilizuotu bičių pieneliu Pagaminto gelio klampa (mPa·s) Klampa (mPa·s) praėjus 3 mėn po pagaminimo Pagaminto gelio klampa (mPa·s) Klampa (mPa·s) praėjus 3 mėn po pagaminimo K 79641 78702 89698 88600 P 0,2 78364 76266 88348 87441 P 0,35 75329 73814 87046 86817 P 0,5 72558 71393 86636 85086 P 1 66254 65845 84589 83442 M K 78592 76794 87707 86615 M P 0,2 74530 73462 85684 83954 M P0,35 71602 70374 84388 82898 M P 0,5 70297 69119 82400 81171 M P 1 62839 61631 79503 78397
Siekiant įvertinti gelių klampos pokyčius laiko atžvilgiu klampa buvo dar kartą matuota praėjus 3 mėnesiams po gelių pagaminimo. Tyrimo rezultatai pateikti 9 lentelėje. Matoma, kad laikui bėgant visų mėginių klampa nežymai sumažėjo, tačiau šis pokytis nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05).
3.8 Centrifugavimas
10 lentelė. Gelių stabilumo vertinimas centrifugavimo metodu (n=2)
Gelis
Su šviežiu bičių pieneliu Su liofilizuotu bičių pieneliu Pagaminus Po 1 mėn. Po 3 mėn. Pagaminus Po 1 mėn. Po 3 mėn. K + + + + + + P 0,2 + + + + + + P 0,35 + + + + + + P 0,5 + + + + + + P 1 + + + + + + M K + + + + + + M P 0,2 + + + + + + M P0,35 + + + + + + M P 0,5 + + + + + + M P 1 + + + + + +
* „+“ žymimi homogeniški geliai.
Centrifugavimo metodu vertintas gelių homogeniškumas. Tyrimas kartotas tris kartus: pagaminus gelius, praėjus mėnesiui bei praėjus trims mėnesiams po pagaminimo. Tyrimo metu nepastebėta jokių nestabilumo požymių. Visi mėginiai tiek prieš centrifugavimą tiek po jo išliko homogeniški. Visi geliniai preparatai tiek iš karto po pagamino tiek praėjus trims mėnesiams buvo stabilūs.
3.9 Mikrobiologinis gelių su bičių pieneliu tyrimas
11 lentelė. Gelių su bičių pieneliu mikrobiologinis tyrimas
Gelis
Su šviežiu bičių pieneliu Su liofilizuotu bičių pieneliu Bakterijų skaičius Grybelių skaičius Bendras Bakterijų skaičius Grybelių skaičius Bendras Kontrolė** N* N N N N N K <1*102 <1*102 <1*102 <1*102 <1*102 <1*102 P 0,2 9*102 3,1*103 4*103 1,1*103 4,0*103 5,1*103 P 0,35 2*102 1,9*103 2,1*103 4*102 2,4*103 2,8*103 P 0,5 <1*102 1*103 1*103 <1*102 1,3*103 1,3*103 P 1 <1*102 1*102 1*102 <1*102 4*102 4*102 PM kontrolė** N N N N N N M <1*102 <1*102 <1*103 <1*102 <1*102 <1*103 M P 0,2 1*103 3,7*103 4,7*103 1,3*103 4,6*103 5,9*103 M P0,35 4*102 2,5*103 2,9*103 5*102 3,3*103 3,8*103 M P 0,5 <1*102 1,3*103 1,3*103 <1*102 1,9*103 1,9*103 M P 1 <1*102 3*102 3*102 <1*102 5*102 5*102
* „N“ – žymimos mikroorganizmų kolonijos, kurių neįmanoma suskaičiuoti.
** Kontroliniai mėginiai be konservanto, paruošti filtravimo pro membraną metodu.
Farmakopėjos straipsnyje ( Farmacinių preparatų mikrobiologinis tyrimas) nurodyta, kad dermatologinių preparatų mikrobiologinis užteršimas neturi viršyti 102 mikroorganizmų 1ml tiriamojo mėginio. 11 letelėje pateikti gyvų matomų mikroorganizmų skaičiai.
Lyginant gelius su šviežiu ir su liofilizuotu BP matoma, kad geliuose su šviežiu BP mikrobinis užterštumas yra mažesnis atitinkamai 2*102 ir 4*102 ( geliuose su 0,35 proc. propolio ekstrakto ). Tokia tendencija pastebima visuose gelių mėginiuose.
Didinant propolio etanolinio ekstrakto koncetraciją pastebimas mikroorganizmų skaičiaus mažėjimas. Geliuose su bičių pieneliu ir 0,2 proc propolio bendras aerobų skaičius 4*103 , su 0,35 proc propolio ekstrakto - 2,1*103, su 0,5 proc. propolio ekstrakto - 1*103, o su 1 proc. propolio ekstrakto - 1*102. Tokia tendencija pasebima ir geliuose su liofilizuotu bičių pieneliu.
Geliai, kuriuose propolio etanolinio ekstrakto koncentracija siekia nuo 0,2 iki 0,5 proc. farmakopėjos reikalavimų neatitinka (mikrobiologinis užterštumas didesnis nei 5*102). Optimali propolio etanolinio ekstrakto koncentracija, pasižyminti pakankamu antimikrobiniu veikimu, yra 1 proc.
Kontroliniuose mėginiuose, iš kurių buvo pašalintas konservantas (Euxyl PE 9010), mikroorganizmų suskaičiuoti nepavyko. Mikrobinis užterštumas buvo per didelis. Mėginiuose, iš kurių konservantas nebuvo pašalintas mikrobinio užšterštumo požymių nepastebėta.
Geliuose su bičių pieneliu antimikrobinėmis savybėmis pasižyminčių medžiagų buvimas yra būtinas. Atliktas tyrimas parodė, kad 1 proc. propolio etanolinio ekstrakto arba 0,5 proc. Euxyl PE 9010 gelius apsaugo nuo mikrobinio užteršimo.
