Šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeliamų infekcinių ligų diagnostika naudojant polimerazės grandininę reakciją

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Vita Misiūnaitė

Šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeliamų infekcinių

ligų diagnostika naudojant polimerazės grandininę

reakciją

Polymerase Chain Reaction Based Diagnosis of Adenovirus

and Parvovirus Infections

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeliamų infekcinių ligų diagnostika naudojant polimerazės grandininę reakciją“

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Vita Misiūnaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Vita Misiūnaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

Algirdas Šalomskas

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Saulius Petkevičius

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os)

vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

TURINYS

1.1.1 1 tipo adenovirusas. Infekcinis šunų hepatitas ... 10

1.1.2 Klinikiniai infekcinio hepatito požymiai ... 11

1.1.3 Mišrios infekcijos ... 12

1.1.4 Patologiniai pakitimai infekcinio hepatito atveju ... 13

1.1.5 2 tipo adenovirusas. Infekcinis laringotracheitas ... 14

1.1.6 Infekcinio laringotracheito klinikiniai požymiai ... 15

1.2 ŠUNŲ PARVOVIRUSAS ... 15

1.2.1 Parvovirusinio enterito klinikiniai požymiai ... 16

1.3 ADENOVIROZIŲ IR PARVOVIROZIŲ DIAGNOSTIKA ... 17

1.3.1 Klinikiniai požymiai, klinikinis tyrimas, morfologiniai ir biocheminiai kraujo rodikliai ... 17

1.3.2 Greitieji testai antigenų/ antikūnų nustatymui ... 18

1.3.3 Imunohistochemija ... 18

1.3.4 Viruso izoliavimas ... 18

1.3.5 Hemagliutinacija ... 18

1.3.6 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodas ... 19

1.4 VAKCINAVIMAS NUO ADENOVIROZIŲ IR PARVOVIROZIŲ.IMUNITETO TRUKMĖ ... 19

1.4.1 Vakcinų tipai ... 19

1.4.2 Negyvų vakcinų taikymo ypatumai ... 20

1.4.3 Gyvų vakcinų taikymo ypatumai ... 21

1.4.4 Imuniteto trukmė ... 22

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 23

2.2.1 Mėginių paruošimas tyrimams ... 26

2.2.2 Adenovirusų I ir II tipo bei parvovirusų nustatymas PGR metodu ... 27

3. REZULTATAI ... 30

3.1 VIRŠKINAMOJO TRAKTO (VT) SUTRIKIMAI ĮVAIRIOSE SMULKIŲ GYVŪNŲ KLINIKOSE ... 30

3.2 KLINIKINIŲ MĖGINIŲ DĖL ADENOVIRUSŲ IR PARVOVIRUSŲ TYRIMO REZULTATAI ... 31

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 37

IŠVADOS ... 41

PADĖKA ... 42

SANTRAUKA

Šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeliamų infekcinių ligų diagnostika naudojant polimerazės grandininę reakciją

Vita Misiūnaitė Magistro baigiamasis darbas

Šunims virškinimo trakto sutrikimus gali sukelti adeno ir parvovirusai, jų sukeliami simptomai gali būti panašūs. Apie šunų parvovirusus Lietuvoje duomenų nedaug, o publikacijų apie šunų adenovirusus, epidemiologinę situaciją iš viso nėra.

Tyrimas atliktas LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje ir Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Buvo ištirti 90 mėginių PGR metodu: seilių ir išmatų mėginiai iš klinikinius požymius, būdingus šunų adenovirozėms ar parvovirozėms, turinčių šunų (n=73) bei mėginiai iš prieglaudoje gyvenančių šunų (n=17).

Šio darbo tikslas buvo laboratoriniais metodais diagnozuoti šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeltas infekcijas ir ištirti jų epidemiologinius ypatumus.

Darbo uždaviniai: išsiaiškinti, kokių dažniausiai pasitaikė šunų virškinamojo trakto susirgimų, kurie buvo diagnozuoti šunims įvairiose smulkių gyvūnų klinikose; PGR metodu ištirti šunų I ir II tipo adenovirusus (CAV-1, CAV-2) ir parvovirusus (CPV) surinktuose mėginiuose iš klinikinius požymius turinčių šunų ir iš prieglaudoje gyvenančių šunų. Išsiaiškinti, ar amžius, vakcinacija, kontaktas su kitais šunimis bei laikymo sąlygos turi įtakos užsikrėtimui šunų CAV-1, CAV-2 ir CPV.

Tyrimo rezultatai ir išvados: 2014 m. vasaros‒rudens laikotarpiu šunims, dažniausiai, buvo diagnozuojami: kepenų nepakankamumas (27,95 proc.), gastritas (16,77 proc.) ir hepatitas (14,28 proc.). Pirmą kartą Lietuvoje PGR metodu nustatyti CAV-1 ir CAV-2. Visais atvejais (n=10) šunų adenovirusai buvo aptikti mėginiuose kartu su CPV. CPV buvo nustatyti 54 mėginiuose. Jaunesni nei 7 mėn. šunys sirgo dažniau nei vyresni , (p<0,05). Nevakcinuoti ir turėję kontaktą su kitais šunimis šunys sirgo dažniau (p<0,01). Laikymo sąlygos ligos pasireiškimui neturėjo įtakos (p>0,05). Mėginiuose iš prieglaudoje gyvenusių šunų nebuvo aptikti ieškomi virusai.

SUMMARY

Polymerase chain reaction based diagnosis of adenovirus and parvovirus infections Vita Misiūnaitė

Master‘s Thesis

Canine adenoviruses as well as parvovirus are able to induce digestive tract disorders. The clinical symptoms of both viruses are quiete familiar. In Lithuania studies of parvoviruses have been done, however there have never been any publicated article about canine adenoviruses and epidemiological situation of adenoviruses.

The research was done in LUHS VA Veterinary pathobiology department and In Microbiology and virology institute. Totally 90 samples of saliva and feaces were analized using PCR. 73 samples were collected from dogs with clinically signs of adenovirus or parvovirus infection. Other 17 samples were taken from dogs that had been living in animal shelter.

The aim of this study: to diagnose canine adenoviruses and parvoviruses caused infections using laboratory methods, determine epidemiological situation of adenoviruses.

The subjectives of the study are: to determine the most common diagnosed digestive tract disorders in dogs; to ascertain the exixtence of adenovirus type 1 and type 2 and parvovirus in samples from clinically unhealthy and shelter dogs; to determine if the age, vaccination, contacts with other dogs and the way of animals keeping had impact on prevalence of infection.

The results and conclusions: during 2014 summer‒autum time the most common digestive tract disorders were liver failure (27.95 %), gastritis (16.77 %) and hepatitis (14.28 %). In Lithuania it was for the very first time when adenovirus type 1 and type 2 were founded in dogs using PCR method. In all the cases (n=10) adenovirusus were not detected alone, in all cases it was mixed infection with parvoviruses. Canine parvovirus was found in 54 cases. The age of the dog had influence on manisfestation of the virus diseases. Young dogs (1‒6 months) were found sick more frequent than older dogs (≥7 months), (p<0.05). Non-vaccinated dogs that had been in contact with other dogs were found sick more frequent (p<0.01). The conditions of keeping were not associated with the illnes (p>0.05). There were no positive PCR results in samples from shelter dogs.

SANTRUMPOS

Ag – antigenas; bp – bazinės poros;

CAV-1 – Šunų adenovirusas 1 tipo (canine adenovirus 1); CAV-2 - Šunų adenovirusas 2 tipo (canine adenovirus 2); CPV – šunų parvovirusas (canine parvovirus);

DIK - diseminuota intravaskulinė koaguliopatija; DNR – deoksiribonukleorūgštis;

Ig – imunoglobulinas;

IŠH – infekcinis šunų hepatitas; MA – motininiai antikūnai; n – imties dydis;

p – patikimumo rodmuo;

PGR – polimerazės grandininė reakcija; PI – paisikliautinis intervalas;

ŠPV – šunų parvovirusas;

ĮVADAS

Šunų adenovirusai yra dviejų tipų: 1 tipo adenovirusas ir 2 tipo adenovirusas. Dėl šunų vakcinacijos šių virusų sukeliamos ligos nėra dažnos, bet vis pasitaiko protrūkių (1). Adenovirusas 1 pirmą kartą nustatytas 1947-ais metais, jis yra plačiai geografiškai paplitęs, infekcijos įrodymų rasta tarp įvairių šuniniams priskirtų gyvūnų. Šis virusas sukelia sunkią ir kartais mirtiną ligą ne tik naminiams šunims, bet ir kitiems šuniniams. Adenovirusas 2 tipo pirmą kartą nustatytas 1961-ais metais (2), jis yra siejamas ne tik su viršutinių kvėpavimo takų infekcijomis, šunidžių kosuliu, bet ir su virškinamojo trakto pažeidimais (3). Šie virusai tarpusavyje yra glaudžiai susiję antigenetiškai ir genetiškai (4).

Šunų parvovirusas yra plačiai žinomas pasaulyje, jis sukelia šunims ūmų hemoraginį enteritą ir miokarditą šunims. Parvovirusas, kaip šunų patogenas, nustatytas vėlyvais 1970-ais metais. Virusas yra vienas iš svarbiausių patogeninių virusų šunims (5,6). Yra nustatyti trys parvoviruso variantai. Lietuvoje vyrauja antrojo tipo virusas (CPV 2a) (7).

Šunis nuo šių ligų padeda apsaugoti vakcinacija, jei ji atliekama tinkamu laiku ir laikomasi revakcinacijos protokolų. Dažniausiai naudojamos daugiakomponentės vakcinos, kurių sudėtyje, be kitų komponentų, yra gyvų nusilpnintų adenoviruso 2 tipo ir parvoviruso virusų (8).

Gyvūnai adenovirusais užsikrečia tiesioginio kontakto būdu arba netiesiogiai: per užkrėstas seiles, šlapimą, išmatas ar kvėpuojamojo trakto išskyras. Gyvūnai, kurie išgyvena po infekcijos, nešioja ir išskiria CAV-1 su kūno skysčiais, tokiais kaip nosies išskyros, šlapimas. Su šlapimu virusas išskiriamas mažiausiai nuo šešių iki devynių mėnesių ar net 11 mėnesių po infekcijos. Šunų adenoviruso 2 perdavimo būdas yra oro lašelinis (2,9). Parvovirusu šunys taip pat gali užsikrėsti tiek tiesioginio, tiek netiesioginio kontakto metu. Parvovirusas platinamas per išmatas 7–12 dienų, bet galimas ir daug ilgesnis viruso išskyrimas (10). Šiomis ligomis dažniausiai serga jauni gyvūnai, tačiau gali sirgti įvairaus amžiaus, lyties šunys, o parvovirusiniu enteritu net vakcinuoti šunys (11).

Darbo tikslas: laboratoriniais metodais diagnozuoti šunų adenovirusų ir parvovirusų sukeltas infekcijas ir ištirti jų epidemiologinius ypatumus.

Darbo uždaviniai:

1. Išsiaiškinti, kokių dažniausiai pasitaikė šunų virškinamojo trakto susirgimų, kurie buvo diagnozuoti šunims įvairiose smulkių gyvūnų klinikose.

2. PGR metodu ištirti šunų I ir II tipo adenovirusus surinktuose mėginiuose iš klinikinius požymius turinčių šunų ir iš prieglaudoje gyvenančių šunų.

3. PGR metodu ištirti šunų parvovirusus surinktuose mėginiuose iš klinikinius požymius turinčių šunų ir iš prieglaudoje gyvenančių šunų.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Šunų adenovirusai

Adenovirusai priklauso Adenoviridae šeimai, Mastadenovirus genčiai, jie yra dvigrandžiai, deoksiribonukleorūgštis koduojantys, neišsivystę, ikosaedro formos virusai, kurių genomo dydis vyrauja tarp 26–45 kbp (17). Šunų adenovirusai yra dviejų serotipų: šunų adenovirusas 1 (CAV-1) bei šunų adenovirusas 2 (CAV-2). Šie serotipai yra glaudžiai susiję antigenetiškai (18) ir genetiškai (75 proc. nukleotidų sutampa) (19,20). Nepaisant jų panašumų, jie lengvai atskiriami panaudojant restrikcijos endonukleazes bei DNR hibridizaciją (21–23). Šiems virusams taip pat būdingas skirtingas gebėjimas agliutinuoti kraujo ląsteles bei skirtingas tropizmas ląstelėms. CAV-1 atpažįsta kraujagyslių endotelio ląsteles, kepenų bei inkstų parenchimines ląsteles, kaip viruso replikacijos taikinius. Tuo tarpu CAV-2 daugiausiai replikuojasi kvėpuojamojo trakto ląstelėse ir nedideliais kiekiais virškinamojo trakto epitelyje (24,25).

Svarbus faktorius virusams perduoti yra laukinė fauna. Lapės yra vienos tų gyvūnų, kurios puikiai prisitaiko prie miesto aplinkos ir gali užkrėsti naminius šunis ne tik parazitais, bet ir adenovirusais. Naminiai šunys dažnai netiesiogiai, o kartais ir tiesiogiai, susiduria su lapių šlapimu, išmatomis. Jungtinėje Karalystėje 2016 m. atliktame tyrime (26) įrodoma, kad CAV-1 paplitimas laukinėje faunoje nebuvo tinkamai įvertintas ankstesniais tyrimais. PGR metodu CAV-1 DNR buvo aptikta 18,8 proc. tirtųjų lapių.

1.1.1 1 tipo adenovirusas. Infekcinis šunų hepatitas

Infekcinis šunų hepatitas (IŠH) – sisteminė liga, kurią sukelia šunų adenovirusas 1. Tai taip pat svarbus patogenas lapėms, vilkams, kojotams, skunkams, Eurazijos ūdroms bei meškoms (26). Šunims virusas sukelia ne tik ūmų kepenų uždegimą, bet taip pat gali sukelti kvėpavimo ar akių ligas (17). IŠH sukeliantis virusas anksčiau buvo žinomas, kaip epizootinis lapių encefalitas, pirmą kartą nustatytas Šiaurės Amerikoje sidabrinėms lapėms 1925 metais. Kaip naminių šunų liga ji pirmą kartą apibūdinta 1947 metais Amerikoje (27). Vėliau virusas, kaip IŠH sukėlėjas, buvo išskirtas bei susilpnintas, naudojant šunų bei kiaulių ląstelių linijas, ir panaudotas vakcinų gamybai (28,29).

pasireiškimo. Abu variantai dažnesni tarp šuniukų. Taip pat liga gali pasireikšti kaip ūmus hepatitas (29,30).

CAV-1 replikuojasi kraujagyslių endotelio ląstelėse ir hepatocituose ir taip sukelia ūmų nekrotizuojantį hemoraginį hepatitą. Ligos eiga sunkesnė jauniems gyvūnams (29,31). Perdavimas vyksta tiesioginio kontakto būdu, iš gyvūno gyvūnui, arba netiesiogiai: per užkrėstas seiles, šlapimą, išmatas ar kvėpuojamojo trakto išskyras. Gali pernešti ir ektoparazitai (32). Gyvūnai, kurie išgyvena po infekcijos, nešioja ir išskiria CAV-1 su kūno skysčiais, tokiais kaip nosies išskyros, šlapimas. Su šlapimu virusas išskiriamas mažiausiai nuo šešių iki devynių mėnesių ar net vienuolika mėnesių po infekcijos (9). Inkubacinis periodas ūmaus susirgimo atveju yra 4–9 dienos (17), 4–6 dienos po užkrato prarijimo bei 6–9 dienos po tiesioginio kontakto su infekuotu šunimi (33).

1.1.2 Klinikiniai infekcinio hepatito požymiai

Gyvūnams dažnai būna asiptominė infekcija arba pasireiškia lengvas tonzilitas (32). Visgi susirgus kliniškai infekciniu šunų hepatitu pasireiškia bendri daugeliui ligų simpomai. Tačiau karščiavimas (>40˚C) yra vienas pirmųjų klinikinių požymių, kuris tęsiasi 1–6 dienas ir dažniausiai yra dvifazis (16). Atsiranda anoreksija, skausmas pilvo srityje, letargija, sutrikusi orientacija, padažnėjęs kvėpavimas, gali būti traukuliai, padidėjęs troškulys, vėmimas ir/ar diarėja, kuri kartais būna su krauju (34). Taip pat pastebima ryški hiperemija ar petechijos burnos gleivinėje. Tonzilės gali būti pastebimai padidėjusios. Tachikardija gali pasireikšti karščiavimo periodu. Taip pat gali būti pastebima poodinė edema galvos, kaklo ir liemens srityse. Nepaisant kepenų dalyvavimo ligos patogenezėje, daugeliu ūmių klinikinių atvejų gelta nėra pastebima (16). Taip pat gali pasireikšti ragenos drumstumas, žinomas kaip klasikinė ,,mėlynoji akis”, kuri atsiranda dėl imuninių kompleksų formavimosi, ragenos endotelio pažeidimo ir ragenos pabrinkimo (35). „Mėlynoji akis“ dažniausiai atsiranda po pasveikimo praėjus 1– 3 savaitėms. Abipusis ragenos drumstumas dažniausiai praeina savaime. Lengvais ligos atvejais trumpalaikis ragenos drumstumas gali būti vienintelis ligos požymis. Be viso to, gali atsirasti ir intersticinis nefritas, kurio atsiradimą sąlygoja imuninių kompleksų formavimasis ir kaupimasis glomerulų kapiliarų sienelėse (16,30,35,36). Taip pat šunims gali išsivystyti bronchopneumonija, konjuktyvitas, fotofobija (29,37). Mirtingumas nuo šios ligos siekia 10–30 procentų visų atvejų (38). Kartu sergant šunų koronavirusine infekcija, šunų maru ar šunų parvovirusiniu enteritu, ligos eiga gali pasunkėti, o mirtingumo dažnis – padidėti (39–41).

išsiliejus kraujui. Ataksija, parezės taip pat gali būti pasekmė dėl kraujo išsiliejimo smegenų kamiene (31).

Ligai būdingas DIK sindromas. Kraujo krešėjimo laikas tiesiogiai koreliuoja su ligos sunkumu ir tai yra pasekmė diseminuotos intravaskulinės koaguliopatijos, kuri atsiranda dėl kraujagyslių endotelio pažeidimo, kuris siejasi su kepenų veiklos sutrikimu. Kepenys negeba staigiai paleisti ir pakeisti suvartotų kraujo krešėjimo faktorių. Gali būti sunku sukontroliuoti kraujavimą, nes pailgėja protrombino susidarytmo laikas, būna atsiradusi trombocitopenija ir padidėjęs kiekis fibrino irimo produktų. Kraujavimas akivaizdžiausiai pasireiškia aplink pieninius dantis ir sukelia savaimines hematomas (16,38).

Taip pat pasireiškia leukopenija (< 2000 ląstelių/µl), kai sumažėja neutrofilų kiekis. Leukopenija dažniausiai pasireiškia karščiavimo fazės metu. Leukopenijos laipsnis yra kintantis ir koreliuoja su ligos sunkumu. Padidėjęs kiekis serumo transaminazių būdingas labai sunkioms ligos formoms, kai ūmiai pažeidžiamos kepenų ląstelės. Proteinuria (albuminurija) ganėtinai dažnai pasireiškia ir gali lengvai pasiekti didesnes nei 50 mg/dL ribas dėl imuninio atsako sukelto glomerulonefrito (31).

1.1.3 Mišrios infekcijos

Klinikiniai požymiai gali varijuoti. 2001 metais publikuotame Pratelli ir kitų tyrėjų atvejo analizės straipsnyje nurodoma, kad Baryje, Italijoje gyvūnų prieglaudoje, pasireiškus infekcinio hepatito ir koronavirusinės infekcijos protrūkiui per 7–8 dienas nugaišo 20 iš 30 prieglaudoje buvusių šuniukų, kuriems buvo pasireiškę klinikiniai simptomai. Nė vienas iš sirgusių šuniukų nebuvo vakcinuotas, o juos atsivedusios patelės buvo vakcinuotos nereguliariai. Protrūkio metu pasireiškė tokie simptomai: stiprus enteritas, kartais su krauju. Netrukus po to, kai jie pateko į šunidę, nė vienas šuniukas nevėmė. Iš penkiolikos šuniukų, kuriems buvo atliktas klinikinis tyrimas, visiems buvo pasireiškusi leukopenija, dehidracija, skausminga pilvo sritis bei nenoras judėti. Išgyvenusiems šuniukams po maždaug dešimties dienų nuo enterito pradžios pasireiškė įvairaus laipsnio dehidracija, kuri tęsėsi 1–3 savaites. Trims šuniukams pasireiškė bilateralinis keratitas, ,,mėlynoji akis“, kvėpavimo sutrikimai, kosulys bei padažnėję kvėpavimas. Sunki enterito forma buvo dėl dvigubos infekcijos (38).

Protrūkio, kai buvo nustatytas šunų infekcinis hepatitas ir šunų maras vienu metu, iš 20 šuniukų 2–3 mėn. amžiaus 11 nugaišo. Visi jie karščiavo, viduriavo, vėmė, turėjo kvėpavimo sutrikimų, bėgo pūlingos išskyros iš akių bei buvo pastebėti neurologiniai sutrikimai (drebulys, traukuliai). Šešiems iš išgyvenusių šuniukų, pasireiškė vienpusis arba dvipusis ragenos drumstumas.

Kito protrūkio metu buvo nustatyti šunų infekcinio hepatito bei šunų parvovirusinio enterito virusai. Protrūkio metu keturiems 3–9 mėn. amžiaus šunims pasireiškė depresija, karščiavimas ir viduriavimas su krauju. Visi šunys nugaišo po trijų dienų nuo pirmųjų požymių pasireiškimo. Visi šunys buvo skiepyti nuo pagrindinių šunų infekcinių ligų.

Ketvirto protrūkio metu buvo nustatytas šunų infekcinis hepatitas kartu su koronavirusine infekcija. Du šunys, 3 mėn. biglis bei 3,5 mėn. Labradoro retriveris, buvo importuoti iš Vengrijos į Italiją, skiepyti nuo pasiutligės bei parvovirusinio enterito, infekcinio hepatito, šunų maro bei leptospirozės. Simptomai pasireiškė po dviejų dienų nuo importavimo. Bigliui – letargija, traukuliai, šlapimo nelaikymas bei gastroenteritiniai simptomai ir kvėpavimo sutrikimai, kurie praėjo per 20 dienų. Labradoro retriveriui pasireiškė anoreksija, šviežias kraujas išmatose, vėmimas, traukuliai, šuo nugaišo po penkių dienų nuo pirmųjų požymių pasireiškimo (39). Tuo tarpu 2011 metais paskelbtame M.D.Duarte ir kitų tyrėjų atvejo analizės straipsnyje apžvelgiamas 56 dienų amžiaus Jorkšyro terjero gaišimas dėl ūmios šunų adenoviruso 1 sukeltos infekcijos Aveiro mieste, Portugalijoje. Šuniuko motina nebuvo vakcinuota. Šuniukas buvo vakcinuotas vieną kartą 42 dienų vakcina, skirta šunims vakcinuoti nuo šunų maro ir parvovirusinio enterito. Klinikiniai simptomai pasireiškė prieš dienas iki gaišimo. Šuniukui pasireiškė anoreksija, letargija, pilvos srities skausmas, vėmimas ir viduriavimas, ragenos edema, hipotermija (33 °C), gleivinės išblyškusios. Gyvūnas buvo gydomas, tačiau būklė negerėjo, tęsėsi viduriavimas su krauju bei krito kūno temperatūra, kol šuo pateko į komą (42).

1.1.4 Patologiniai pakitimai infekcinio hepatito atveju

Hepatocitų nekrozė sukelia kepenų spalvos pokyčius – kepenys tampa margos. Kepenų dydis gali būti nepakitęs arba jos gali būti pabrinkusios. Tulžies pūslės sienelė dažniausiai pabrinkusi ir sustorėjusi. Čiobrialiaukės edema taip pat gali būti randama. Pilkšvai balti židinukai gali būti matomi ant inkstų žievės (39), pasireikšti plaučių daugybiniai sukietėjimai bei bronchopneumonijos požymiai (29,43). Akių pažeidimams būdinga išplitusi ragenos edema ir drumstumas (17).

1.1.5 2 tipo adenovirusas. Infekcinis laringotracheitas

Infekcinis laringotracheitas – adenovirozė, kurią sukelia adenovirusas 2. Ji apibūdinama kaip nepastebima ar lengva kvėpavimo takų infekcija. 2010 metais publikuotame S.S.Yoon ir kitų mokslininkų straipsnyje nurodoma, kad šis virusas nėra taip smarkiai paplitęs, palyginus su kitais virusais, kurie sukelia kvėpavimo takų ligas (44), tačiau adenovirusas 2 tipo yra nurodomas, kaip vienas iš pagrindinių veiksnių, sukeliančių plačiai paplitusį infekcinį tracheobronchitą, geriau žinomas kaip šunidžių kosulys (45). Jungtinėse Amerikos Valstijose 2015 m. atliktame tyrime siekiant nustatyti šunų infekcinių kvėpavimo takų patogenų paplitimą tarp asimtominių gyvūnų, laikomų prieglaudose, rezultatai parodė, kad net 12,5 proc. šunų buvo aptiktas CAV-2 patogenas PGR metodu. Tyrimas parodė, kad neįvertinami kliniškai sveiki šunys, kaip potencialūs infekcinių kvėpavimo takų patogenų nešiotojai (46). Šunų adenovirusas 2 taip pat yra siejamas su enterito pasireiškimu (47,48). Jis buvo aptiktas šunų, kurie turėjo neurologinius sutrikimus, smegenyse, (49).

Šis virusas pirmą kartą nustatytas Kanadoje 1961 metais šunims, kurie sirgo laringotracheitu. Buvo išskirta viruso padermė Toronto A26/61, kuri buvo apibūdinta kaip adenovirusas ir buvo susieta su šunų adenovirusu 1. Vėliau struktūriniai ir antigeniniai skirtumai buvo pastebėti ir viruso padermė Toronto A26/61 buvo priskirta kaip atskiras šunų adenoviruso prototipas, pavadintas šunų adenovirusu 2 (2). Šunų adenoviruso 2 tipui jautrūs daugelis žinduolių. Nepaisant maždaug 100 tūkst. metų kohabitacijos tarp žmonių ir šunų, šunų adenovirusas 2 nebuvo žinomas, kad kirstų tarprūšinį barjerą. Jis negali daugintis žmogaus ląstelėse (50). Laukinės gamtos gyvūnai gali būti kaip infekcijos šaltinis naminiams šunims. Antikūnų prieš adenovirusą 2 paplitimas tarp Europos rudųjų lapių (Vulpes vulpes) Australijoje buvo 23,3 procentai. Žymus skirtumas buvo tarp lapių geografinio pasiskirstymo, metų laiko ir amžiaus (51). Tuo tarpu antikūnų paplitimas tarp Salinių lapių (Urocyon littoralis) Normandijos salose, Kalifornijoje buvo 97 procentai. Šunų adenoviruso 2 antikūnai taip pat aptikti sausumos mėsėdžių ir jūros žinduolių kraujyje Aliaskoje bei Kanadoje, pastebėti juodųjų lokių (Ursus

americanus), kiaunių žuvautojų (Martes pennanti), baltųjų lokių (Ursus maritimus), vilkų (Canis lupus), jūrų vėplių (Odobenus rosmarus) ir Šiaurinius jūrų liūtų (Eumetopias jubatus) (52–54)

Šunų adenovirusas 2 plinta lašeliniu būdu per orą. Virusas replikuojasi bronchiolių epitelio Klara (neturinčiose cilijų) ląstelėse, paviršinėse nosies gleivinės ląstelėse, ryklėjė, tonzilių kriptose, trachėjos gleivinės ląstelėse ir bronchų peribronchinėse liaukose, esančiose antro tipo alveolinėse epitelio ląstelėse. Virusas taip pat gali būti išskirtas iš retrofaringinių ir bronchinių limfinių mazgų, taip pat iš skrandžio ar žarnų audinių.

Viruso replikacijos pikas yra 3–6 dienos po infekcijos. Vėliau viruso dauginimasis staigiai sulėtėja dėl greitai atsirandančių antikūnų. Šunų adenovirusas 2 dažniausiai jau neaptinkamas praėjus devynioms dienoms po infekcijos (2).

1.1.6 Infekcinio laringotracheito klinikiniai požymiai

Kvėpavimo sutrikimo simptomai siejami su bronchų epitelio pažeidimu. Gali atsirasti nekrotizuojantis bronchitas ar bronchiolitas ir obliteruojantis bronchiolitas. Intersticinė pneumonija siejama su antro tipo alveolinių ląstelių infekcija. Šunims, paveiktiems vien tik šunų adenoviruso 2, retai pasireiškia staigūs klinikiniai požymiai, vis dėlto plaučių pažeidimai gali būti ryškūs. Kai kartu įtraukiami kiti bakteriniai ar virusiniai sukėlėjai, gali išsivystyti infekcinis tracheobronchito kompleksas – šunidžių kosulys (2). Kvėpavimo sutrikimai, atsirandantys dėl bronchiolių epitelio pažeidimo, pasireiškia karščiavimu, giliu sausu ir garsiu kosuliu, vandeningomis išskyromis iš nosies, faringitu bei tonzilitu (55,56). Šis virusas gali sukelti virusinę pneumoniją pats vienas, bet dažniausia pasižymi imunosupresiniu poveikiu, kuris pasireiškia padidėjusiu plaučių jautrumu bakterinėms infekcijoms. Todėl išsivysto mišri infekcija (57).

1.2 Šunų parvovirusas

Šunų parvovirusas (ŠPV) priklauso Parvoviridea šeimai, Parvovirus genčiai ir yra priskirtas į unikalią Feline panleukopenia virus rūšį kartu su kačių panleukopenijos virusu, audinių enterito virusu ir meškėnų parvovirusu (58). ŠPV genetiškai ir antigenetiškai nėra susijęs su šunų minutės virusu, anksčiau žinomo kaip šunų 1 tipo parvovirusas, kuris sukelia naujagimių šuniukų mirtį. Dabar minutės virusas įtrauktas į Bocavirus gentį kartu su galvijų parvovirusu ir žmonių bocavirusu (59).

yra labai atsparūs aplinkoje, nes jie ypač atsparūs pH ir temperatūrų skirtumams bei atsparūs riebalų tirpikliams, tripsinui ir daugeliui dezinfektantų (60,61).

Virusas plinta per išmatas, užsikrečiama fekaliniu oraliniu būdu arba gali patekti per nosį (29). Plinta per užkrėstus paviršius (grindys, batai, šunų žaislai ir pan.), lengvai plinta su užkrėstais šuns plaukais, per pėdas (6). Virusas naujagimio bei jaunų ir suaugusių šunų greitai dalijasi hemopoetinio ar žarnyno audinių ląstelių branduoliuose (60). ŠPV, kaip taikinius replikacijai, atpažįsta žarnų kriptas, limfoidinius organus, tačiau virusas gali išplisti į visus audinius, net ir smegenis. Inkubacinis periodas tiek ekspermentiniu būdu sukėlus ligą, tiek natūraliai po užsikrėtimo svyruoja tarp 4 ir 14 dienų. Viruso išskyrimas į aplinką prasideda prieš kelios dienos pradėjus pasireikšti klinikiniams požymiams, progresyviai mažėjant po užsikrėtimo praėjus 3–4 savaitėms (62–64). Po patekimo į organizmą virusas dauginasi virškinamojo trakto limfiniuose audiniuose ir infekuoti leukocitai jį išplatina į plonųjų žarnų kriptų epitelį, dėl to sukeliama diarėja. Leukocitų daugiausiai cirkuliuojančių ir susijusių su audiniais, limfocitų infekavimas sukelia ūmią limfopeniją, dažnai susijusią su neutropenija (65). Dviejų–trijų savaičių seroneigiamiems šuniukams ŠPV gali replikuotis širdies ląstelėse ir tokiu būdu sukelti mirtiną miokarditą. Vis dėlto ši forma retai pastebima, nes beveik visi šuniukai yra apaugoti motininių antikūnų (MA) (64).

Visgi, sunki klinikinė ligos forma, dažniausiai, pasireiškia šunims, jaunesniems nei 6 mėnesių amžiaus, taip pat suaugusiems šunims, kurių imuninė sistema yra nepakankama. Veislės predispozicija ir ligos sezoniškumas yra siejami su geografiniais skirtumais (65,66). Mirtingumas gali būti labai didelis, net iki 70 proc. šuniukų tarpe. Tačiau suaugusių šunų tarpe, dažniausiai, nesiekia net 1 proc. (6,61,66).

1.2.1 Parvovirusinio enterito klinikiniai požymiai

nepastebi. Vėmimas ir viduriavimas sukelia dehidraciją ir hipovoleminį šoką, kuris smarkiai sumažina audinių aprūpinimą krauju. Matomos išblyškusios gleivinės, kapiliarų prisipildymo greitis > 2 sekundės, tachikardija, silpnas femoralinis pulsas, hipotenzija bei šaltos galūnės (67). Kartu pasireiškiančios plaučių infekcijos gali sukelti kvėpavimo nepakankamumą (60).

Vertinant hemogramą, beveik visada pasireiškia leukopenija, kai baltųjų kraujo kūnelių kiekis nukrenta žemiau 2000–3000 vnt./µL. Jei leukopenija neišsivysto ligos pradžioje, tai daugeliu atveju vėliau pasireiškia ypač sunki leukopenija, išsivystanti per 72 valandas dėl viruso sukeltos leukocitų žūties. Dėl limfinio audinio pažeidimo kartu pasireiškia viruso sukelta limfopenija. Neutrofilija gali pasireikšti dėl oportunistinių bakterijų sukeltos infekcijos. Dėl kraujo plokštelių išnaudojimo–išsivysto trombocitopenija. Subklinikinės infekcijos formos yra dažnai aptinkamos daugiausiai šuniukams, kurių motininių antikūnų kiekis sumažėjęs, ir suaugusiems šunims (60,69).

Dėl dehidracijos ir sutrikusios kraujo perfuzijos vystosi priešinkstine azotemija, hipokalemija dėl anoreksijos, vėmimo ir viduriavimo, hipoalbuminemija dėl padidėjusio gastrointestinalinio trakto pralaidumo, hipoglikemija gali pasireikšti taip pat dėl anoreksijos ir galimo sepsio (67).

Pagrindiniai patomorfologiniai požymiai šunims, kurie gaišta nuo ŠPV: dehidracija, ascitas, šviesesnės spalvos skeleto raumenys, kepenys, šviesesni inkstai (70), pripildyta tulžies pūslė, matomas hemoraginis gastroentroenteritas, padidėja mesenteriniai limfiniai mazgai bei Pejerio plokštelės. Gali būti pastebimas miokarditas (6,29,71).

1.3 Adenovirozių ir parvovirozių diagnostika

1.3.2 Greitieji testai antigenų/ antikūnų nustatymui

Lietuvoje kol kas nėra paklausūs ir populiarūs greitieji testai adenovirusams nustatyti. Nėra ir duomenų apie šį susirgimą Lietuvoje. Tačiau šiuo metu rinkoje galima įsigyti „Anigen Rapid CDV/CAV Ag“ maro ir adenovirusų nustatymo testą šunims, nustatymui naudojamos išskyros ir akių, seilės. Parvovirusams nustatyti galima įsigyti antigenus ar antikūnus aptinkančių greitųjų testų. Parvovirusams nustatyti dažniausiai naudojamos išmatos. Beje, jie nustato ne tik parvoviruso, bet ir korona viruso antigenus (74).

1.3.3 Imunohistochemija

Tai greitas ir patikimas parvovirusinės infekcijos diagnozavimo metodas (75). Tačiau dažniausiai atliekamas po nugaišus gyvūnui. Metodas sunkiai pritaikomas klinikinėje praktikoje (76). Adenoviruso 2 tipo nustatymui iš organų imunihistocheminis metodas yra pranašesnis už PGR metodą (44). Visgi adenovirusų 1 tipo nustatymui imunohistochemija patikima tiek pat, kiek PGR (77).

1.3.4 Viruso izoliavimas

Atliekama tik specialiose laboratorijose, reikalauja specialios įrangos, personalo, užtrunka ilgai. Šiuo metodu aptikti parvovirusus sudėtinga, kadangi galimi klaidingai neigiami rezultatai. Šio metodo mažas jautrumas ir juo galima aptikti virusą tik pirmomis infekcijos dienomis, nepriklausomai nuo to, ar infekcija sukelta eksperimentiniu, ar natūraliu būdu (3,6,63). Adenovirusų izoliavimui reikalingas bent 3 dienų laikotarpis. Taip pat viruso izoliavimo metodas nėra pakankamai jautrus, nes jam atlikti reikalingi didesni kiekiai viruso nei nustatant PGR metodu (1).

1.3.5 Hemagliutinacija

1.3.6 Polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodas

Teigiama, kad PGR metodas yra vienas patikimiausių diagnostinių metodų, kuris pasižymi dideliu jautrumu ir specifiškumu siekiant nustatyti šunų parvovirusus išmatų mėginiuose (7). Skirtingų studijų metu (80,81) atlikti tyrimai adenovirusų 1 tipo nustatymo iš išmatų PGR metodu buvo sėkmingi. Tačiau 2016 m. atliktame tyrime nepavyko aptikti viruso PGR metodu išmatose, todėl buvo keliama hipotezė, kad, galbūt, išmatose galėjo būti tam tikrų PGR inhibitorių. Yra sukurti pradmenys šunų adenovirusų nustatymui, kuriuos naudojant be papildomų tyrimų pagal susidariusio produkto dydį atskiriamas CAV-1 nuo CAV-2 (1).

1.4 Vakcinavimas nuo adenovirozių ir parvovirozių. Imuniteto trukmė

Skiepai suteikia patikimą apsaugą, yra susiję su minimalia rizika. Jie turėtų būti kaip dalis įprastinių prevencinių priemonių. Gyvenimo tarpsnis, laikymo sąlygos, galimi rizikos faktoriai ir sveikatos būklė turėtų būti visada įvertinami, kai sudaromas vakcinacijos protokolas (69). Remiantis Vakstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos suteikta informacija, 2015 m. Lietuvoje buvo sunaudotos 123850 vnt. šunims skirtos vakcinos, skirtos kitų, ne pasiutligės, infekcinių ligų prevencijai. Oficialių duomenų apie Lietuvoje vyraujantį šunų skaičių nėra. Valstybiniu mastu nėra atliekami jokie kiti tyrimai, susiję su šunų infekcinėmis ligomis, išskyrus pasiutligę.

1.4.1 Vakcinų tipai

Per paskutinius beveik šešis dešimtmečius reikšminga pažanga pasiekta kuriant vakcinas. Du pagrindiniai vakcinų tipai, kurie šiuo metu yra naudojami, apima neinfekcines ir infekcines vakcinas.

Nesukeliančios infekcijos vakcinos–tai vakcinos, kurių sudėtyje yra inaktyvuoti, negyvi, įprasti ar rekombinuoti subvienetai, plazmidinė DNR, taip pat toksoidinės. Infekcinės vakcinos–tai atenuotos, avirulentinės, modifikuotos gyvos vakcinos, gyvos rekombinantinės vakcinos. Plataus pasirinkimo galimybė užtikrina veterinarams rinktis ir naudoti vienkomponentes ar daugiakomponentes vakcinas (69,82,83).

Lietuvoje veterinarinių vaistų registre registruojamos ir gyvos, ir negyvos vakcinos šunims imunizuoti nuo parvovirozių ir adenovirozių (84). Beveik visos komercinės vakcinos, skirtos šunų infekcinių ligų prevencijai, yra daugiakomponentės. Dažniausiai į sudėtį įeina šunų maro virusas, šunų parvovirusas-2, šunų adenovirusas-2, šunų paraonfluenza virusas, Leptospira canicola bei Leptospira

icterohaemorrhagiae. Šie produktai dažnai pavadinami „7 ligų vakcinos“, nes šunų adenovirusas-2

Sudėtingais tyrimais atskleista, kad šiuo metu naudojamos vakcinos nuo šunų parvovirozės, savo sudėtyje turinčios ŠPV-2 ar ŠPV-2b variantus, užtikrina apsaugą prieš visus natūralius variantus, įskaitant ir ŠPV-2c (11,44,85,86).

Jei lyginsime infekcines ir neinfekcines vakcinas, matysime, kad negyvos vakcinos šunims sukelia dažniau nepalankias sistemines ar vietines reakcijas. Šie šalutiniai poveikiai gali būti sukelti antigeno, adjuvanto, serumo ar ląstelinių proteinų ar kaip kombinacijos visų į vakciną įeinančių komponentų. Tačiau negyvos vakcinos yra stabilesnės, kadangi jos neinfekuoja šeimininko ląstelių (87). Tuo tarpu infekcinės vakcinos nėra stabilios. Gamintojai jas, dažniausiai, pateikia liofilizuotas – išdžiovintas miltelių pavidalu. Vos tik sumaišytos su skiedikliu, jos tampa nestabilios ir pradeda prarasti savo veiksmingumą, todėl labai svarbu, kad po sumaišymo su skiedikliu vakcina būtų panaudota per 60 minučių. Jei vakcina per šį laiką nepanaudojama, ją reikia utilizuoti.

Iš esmės, visos vakcinos yra saugios ir tik mažas procentas vakcinuotų šunų, nepriklausomai nuo vakcinos tipo, susiduria su šalutiniais poveikiais (8,88,89).

1.4.2 Negyvų vakcinų taikymo ypatumai

Inaktyvuotos (negyvos vakcinos) neinfekuoja šeimininko ir nesukelia naujų antigenų gamybos. Taigi, jos privalo turėti pakankamą kiekį antigenų, kad imunizuotų šeimininką. Tačiau vien antigenas nesugeba atitinkamai imunizuoti šuns organizmo, todėl daugelis vakcinų savo sudėtyje turi adjuvantus. Pagalbinėms medžiagoms priklauso įvairios medžiagos, kurios taip pat, kaip antigenas, stimuliuoja uždegiminį atsaką ir užtikrina stipresnį imuninį atsaką į antigeną. Kartu antigenas ir adjuvantas yra sukurti tam, kad stimuliuotų apsauginį imuniteto atsaką (90,91). Šio tipo vakcinos dažnai laikomos saugiausiomis vakcinomis, nes imunizuojantis agentas (virusas) yra negyvas t.y. negali tapti vėl virulentiškas bei sukelti ligos, nuo kurios turėtų apsaugoti. Vis dėlto reikia suprasti, kad padidinto jautrumo reakcijos yra būdingesnės naudojant šias vakcinas nei infekcines (gyvas vakcinas) (92–94). Kadangi šio tipo vakcinose esantys agentai negali infekuoti ar daugintis, jie privalo būti naudojami parenteraliai (po oda ar į raumenis), šio tipo vakcinos negali būti skirtos tiesiai ant gleivinių paviršiaus ( pvz., intranazaliniai ). Neinfekcinės vakcinos, visų pirma, stimuliuoja sisteminį humoralinį imunitetą (imunuglobulinai M [IgM] ir G [IgG]) ir ribotai arba visai nestimuliuoja ląstelinio imuniteto. Tai priklauso nuo antigeno ir adjuvanto (8).

dozių užsitęsia daugiau nei 6 savaites, rekomenduojama šunį revakcinuoti skiriant dvi dozes su 2–6 savaičių pertrauka, tokiu būdu užtikrinant, kad susiformuos imunitetas. Išimtis–pasiutligės vakcina. Minimali amžiaus riba, skiepijant negyva vakcina, yra rekomenduojama ne mažiau 12 savaičių, kadangi vakcinos poveikis gali būti blokuojamas motininių antikūnų. Šuniukams našlaičiams ar tokiems, kurie galbūt, nėra gavę krekenų, pirmoji dozė gali būti skiriama, kai jie yra 6 savaičių. Rekomenduojama vakcinacija vyresnių nei 12 savaičių šuniukų, nes natūrali gyvūno imuninė sistema yra labiau subrendusi bei padidėjusio jautrumo reakcijų tikimybė mažesnė (29,82).

Suaugusio gyvūno revakcinacija turėtų būti atliekama 12 mėnesių intervalu. Šuo, kuris praleido revakcinaciją arba buvo revakcinuotas praėjus daugiau nei 12 mėnesių, neužsitikrina tokios imuninės apsaugos (metais), kuri galėtų būti, jei būtų skiepijama infekcine vakcina. Todėl yra tikimybė, kad viena neifekcinės vakcinos dozė nebus pajėgi sukelti tinkamo imuninio atsako. Tai atsitinka dėl imunologinės „atminties“ stygiaus. Tokiais atvejais gali reikėti dviejų dozių su 2–6 savaičių pertrauka. Vis dėlto nėra ištirta, koks turi būti laiko intervalas, kuris nuorodytų, ar reikalinga viena, ar dvi vakcinos. Tai priklauso nuo vakcinos, imuninio atsako, laiko, praėjusio nuo paskutinės vakcinacijos, bendro kiekio vakcinų dozių, kurios buvo gautos per šuns gyvenimą (69).

1.4.3 Gyvų vakcinų taikymo ypatumai

Infekcinės vakcinos privalo infekuoti šeimininko ląsteles, kad imunizuotų. Vakcinoje esantys virusai yra atenuoti ir ligos nesukels. Šios vakcinos yra pačios efektyviausios, jos užtikrina tokius pačius imuniteto tipus (ląstelinį, humoralinį, sisteminį ir vietinį), kurie susiformuoja ir natūraliu būdu (pvz., imunitetas po infekcijos ar susirgimo) (8,91,95).

Po infekcinės vakcinos panaudojimo, jei nebuvo MA, imunitetas susiformuoja per 4 ±3 dienas. Aksčiausiai formuojasi imunitetas šunų maro virusui – per 1–2 dienas. ŠPV imunitetas susiformuoja per 3 dienas, o šunų adenovirusams per 5–7 dienas (96,97). Visgi yra nedidelis procentas šunų, kuriems būdingas genetinis negebėjimas išvystyti imuninio atsako į ŠPV vakcinas (1/1000) ar į maro vakciną (1/5000). Šie šunys apibūdinami kaip „neatsakantieji“. Imunologinis neatsakomumas yra nulemtas genetinių faktorių.

Jei šuniukas gauna tik pirmąją vakciną būdamas 6–8 savaičių amžiaus, bet nebūna revakcinuojamas iki 12 ar 14 savaičių amžiaus, rekomenduojama vėl naudoti dvi vakcinas mažiausiai 2 savaičių intervalu. Tačiau jei šuniukas gauna pirmąją vakciną 6 – 8 savaičių ir praleidžiama revakcinacija ikitol, kol šuniukas būna vyresnis nei 14 savaičių, užtenka vienos dozės, kad vakcina imunizuotų šuniuką (29).

1.4.4 Imuniteto trukmė

Imuniteto trukmė, vakcinavus gyvomis daugiakomponentėmis vakcinomis, yra daugiametė. Net jeigu serumo antikūnų titras yra nustatomas kaip per žemas, imunologinė atmintis (T – ir B-limfocitai) yra nepertraukiama. Taigi dėl to viena infekcinės vakcinos dozė suaugusiam šuniui yra pakankama, nepaisant praėjusio laiko nuo paskutinės vakcinos (98–100).

Imuniteto trukmė skiepijant negyvomis vakcinomis (dažniausiai ir vienkoponentėmis) yra ribota. Revakcinaciją atlikti rekomenduojama kas metus. Tai negalioja pasiutligės vakcinai, nes ji yra labai imunogeniška, ypač dėl joje esančių adjuvantų (8,98,101).

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Darbas atliktas 2014–2016 metais LSMU VA Veterinarinės patobiologijos katedroje ir Mikrobiologijos ir virusologijos institute.

Per šį laikotarpį buvo surinkti, apibendrinti ir išanalizuoti duomenys apie šunų virškinamojo trakto ligų pasireiškimą smulkių gyvūnų klinikose įvairiuose Lietuvos rajonuose. Duomenys buvo renkami iš įvairių smulkių gyvūnų klinikų, juose pateikti 2014 metais vasaros‒rudens metu fiksuoti virškinamojo trakto susirgimai. Profilaktiniai apsilankymai nebuvo įtraukiami į bendrą gyvūnų skaičių. Iš viso tyrimo metu buvo ištirta 90 šunų mėginiai. Buvo pasirinkta surinkti mėginius iš šunų, kurie turėjo tris ir daugiau klinikinius požymius, būdingus adenovirozėms ar parvovirozei. Klinikiniai mėginiai (n=73) surinkti 2014–2016 metų laikotarpiu iš įvairių smulkių gyvūnų veterinarijos klinikų Kaune ir Kauno apskrityje. Kiti 17 mėginių surinkti „LESĖ“ Kauno gyvūnų prieglaudoje. Gyvūnų prieglaudoje buvo surinkti mėginiai iš šunų, apie kurių vakcinaciją nuo infekcinių ligų nebuvo informacijos, surinkti atsitiktine tvarka. Gyvūnai, gyvenantys prieglaudoje, neturėjo klinikinių požymių. Toks pasirinkimas yra grindžiamas tuo, kad beglobiai šunys literatūroje įvardijami kaip potencialūs virusų nešiotojai, turintys didesnę riziką sirgti infekcinėmis ligomis dėl prastesnių higieninių sąlygų, neaiškios vakcinacijos istorijos ir artimo kontakto su kitais gyvūnais (105). Mėginiai buvo imami naudojant vatos tamponėlius: vienas mėginys imamas tiesiai iš rectum (išmatų), kitas–iš burnos ertmės (seilių) arba buvo imamas tiesiog išmatų mėginys (1-3 g).

Gyvūnų amžius buvo fiksuojamas mėnesiais, o gyvūnai suskirstyti į 3 grupes (1 lentelė). Tirtųjų grupėje amžiaus vidurkis buvo 13 mėnesių. Jauniausias gyvūnas buvo 1,5 mėn., o vyriausias – 9 metų. amžiaus. Gyvūnai buvo sugrupuoti į tris grupes: nuo 1 iki 3 mėnesių, nuo 4 iki 6 mėnesių, 7 mėnesių ir vyresni. Toks grupavimas pasirinktas atsižvelgiant į vakcinacijai rekomenduojamą amžių. Literatūroje nurodoma, kad pirmoji vakcina turėtų būti skiriama 6–9 savaičių šuniukams (8,93), todėl pirmąją grupę sudarė 1–3 mėn. amžiaus gyvūnai. Tokiu būdu vyresni, 4–6 mėn. amžiaus šuniukai, jau turėtų turėti pilną vakcinacijos istoriją, o 7 mėnesių ir vyresni jau turėtų būti užsitikrinę pilną apsaugą nuo infekcinių ligų. Visi šunys, gyvenę prieglaudoje, buvo vyresni nei 6 mėn. amžiaus.

1 lentelė. Gyvūnų sugrupavimas į amžiaus grupes (mėnesiais).

Eil. nr. Amžius Gyvūnų skaičius

1. 1-3 34

2. 4-6 25

Laboratoriniai tyrimai buvo atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Gauti rezultatai išanalizuoti ir šunų adenovirų ir parvovirusų atžvilgiu.

Statistinė analizė atlikta naudojantis Microsoft „Excel“ 2010 programa, veterinarinės epidemiologijos statisnių tyrimų apskaičiavimo programa „Epitools Epidemiological calculators“ (http://epitools.ausvet.com.au/content.php?page=home). Siekiant nustatyti duomenų priklausomybę vieno kintamojo atžvilgiu nuo kito, buvo taikytas Chi-kvadrato testas. Apskaičiuotos procentinės išraiškos, apskaičiuoti pasikliautiniai intervalai. Gauti rezultatai laikomi patikimais, jei reikšmingumo lygmuo buvo mažesnis nei 0,05 (p<0,05).

2.1 Mėginių rinkimas

Klinikoje mėginiai buvo imami iš šunų, kurie jau turi klinikinius požymius, būdingus šunų infekciniam hepatitui, infekciniam šunų laringotracheitui ar parvovirusiniam enteritui. Buvo vertinama sveikatos būklė, atliekamas klinikinis tyrimas. Esant galimybėms, buvo atlikti kraujo ir išmatų tyrimai. Naudojant greituosius testus (n=32) (,,Anigen“ firmos CPV Ag/CCV Ag), kurie skirti parvo ir koronavirusų antigenų išmatose nustatymui, buvo tikslinama diagnozė. Tyrimai atlikti vadovaujantis gamintojo instrukcija. Papildomai buvo renkama informacija apie gyvūno vakcinaciją, kontaktą su kitais gyvūnais ir laikymo sąlygas.

Sergantiems gyvūnams, atlikus klinikinį, papildomus diagnostinius tyrimus, įvertinus duomenis apie vakcinaciją bei laikymo sąlygas, buvo nustatoma diagnozė.

Prieglaudoje buvo renkami mėginiai atsitiktine tvarka iš šunų, kurie nėra vakcinuoti arba nėra informacijos apie ankstesnę vakcinaciją. Visi šunys laikomi bent po du gyvūnus viename narve. Bendrai patalpoje buvo laikoma 15–20 šunų.

Mikrobiologijos ir virusologijos institutą. Į institutą mėginiai buvo nugabenti per 30–60 minučių nesinaudojant šaltkrepšiu.

2 lentelė. Klinikiniai požymiai, kurias remiantis buvo renkami mėginiai (29,33,73,106).

Infekcinis hepatitas

Infekcinis tracheobronchitas, laringotracheitas (šunidžių

kosulys)

Parvovirusinis enteritas

Kūno temperatūra aukšta ~ 400 _C. Anoreksija, apatija, troškulys.

Garsus paroksizminis (staigus epizodinis) šaižus, sausas kosulys.

Letargija, anoreksija, depresija, hipersalivacija.

Leukopenija, trombocitopenija. Proteinurija.

Po kosulio priepuolių atsiranda springimas ir žiaukčiojimas.

Pakilusi kūno temperatūra. Dehidracija.

Konjuktyvitas, serozinės išskyros iš nosies ir akių.

Kosulys sukeliamas švelniai palpuojant gerklas ar trachėją.

Diarėja su/ ar be kraujo, pilvo srities skausmas.

Anoreksija. Padidėjęs kapiliarų

prisipildymo greitis. Skausminga pilvo sritis, vėmimas.

Viduriavimas su/ ar be kraujo.

Gali būti komplikacija į sisteminę infekciją: ryškūs simptomai, aukšta kūno temperatūra, pūlingos išskyros iš nosies, akių, depresija, anoreksija.

Panašu į šunų marą, bronchopneumoniją.

Tachikardija, silpnas pulsas, septinis šokas.

Intensyvi hiperemija, petechijos burnos gleivinėse. Spontaninė hematoma aplink dantis.

Sutrikęs kraujo krešėjimas.

Leukopenija, limfopenija, neutropenija.

↓Na. ↓K. ↓Cl.

Padidėjusios tonzilės. ↑AST, ↑ALT.

Hipoalbuminemija. Tachikardija.

Poodinė galvos, kaklo ir krūtinės, pilvo edema.

2.2 Molekulinės biologijos tyrimas – polimerazės grandininė reakcija (PGR)

2.2.1 Mėginių paruošimas tyrimams

Į sterilų mėgintuvėlį pilama 0,5 ml buferinio tirpalo. Vatos tamponėlis įdedamas į mėgintuvėlį su tirpalu. Kiekvienas to paties gyvūno mėginys (išmatų ir seilių) dedamas į skirtingą mėgintuvėlį. Taip paruošti mėgintuvėliai palaikomi kambario temperatūroje 10 min. Vėliau mišinys maišomas 1 min. naudojant elektroninę maišyklę (3000 aps./min.). Sumaišius imamas specialus 1,5 ml mėgintuvėlis ir į jį įpilama 10 µl iš išmatų mėginio ir 10 µl iš seilių mėginio. Toks 20 µl mišinys yra paruoštas DNR išskyrimo etapui.

Deoksiribonukleorūgštys (DNR) buvo išskiriamos naudojant Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit #K0721 rinkinį. Išskyrimas atliekamas vadovaujantis gamintojo instrukcija, A protokolu:

į mėgintuvėlį su 20 µl tiriamo mėginio įpilama 180 µl specialaus virškinamojo tirpalo (Digestion Solution) ir 20 µl proteinazės K (Proteinase K) tirpalo. Mėgintuvėlis yra vartomas tarp pirštų, kad tirpalai tolygiai susimaišytų.

Taip paruošti mėgintuvėliai dedami į termomikserį ir inkubuojami 56 °C 15 minučių.

Išėmus iš termomikserio į mėgintuvėlius dedama 20 µl RNazė A (RNase A) tirpalas. Mišinys pavartomas ir inkubuojamas kambario temperatūroje 10 min.

Į turimą mišinį dedama 200 µl lizuojančio tirpalo (Lysis Solution). Mėgintuvėliai vartomi 15 s, kol susidaro homogeniškas mišinys.

Į gautą mišinį dedama 400 µl 50 proc. etanolio ir vėl sumaišoma vartant.

Mėgintuvėlio turinys perpilamas į specialius GeneJET genomic DNA Purification mėgintuvėlius, kurie sudaryti iš dviejų dalių. Viršutinė dalis nuo apatinės dalies atskirta filtru. Perkėlus turinį į specialius mėgintuvėlius, viskas centrifuguojama 6000 x g jėga 1 min. Nucentrifugavus išmetama apatinė mėgintuvėlio dalis su prasifiltravusiu mišiniu. Viršutinė mėgintuvėlio dalis yra perdedama į naują 2 ml talpos surenkamąjį mėgintuvėlį.

Į viršutinę mėgintuvėlio dalį pilama 500 µl pirmojo plovimui skirto buferio (Wash Buffer I). Centrifuguojama 1 min. 8000 x g.

Nusifiltravęs mišinys iš surenkamojo mėgintuvėlio yra išpilamas. Viršutinė dalis su filtru grąžinama angal į surenkmąjį mėgintuvėlį.

Nucentrifugavus pašalinama apatinė mėgintuvėlio dalis, o viršutinė dalis perdedama į naują 1.5 ml mėgintuvėlį.

Į mėgintuvėlio centrą lašinama 100 µl DNR išplovimui iš filtro reikalingo buferinio tirpalo (Elution Buffer). Inkubuojama 2 min. kambario temperatūroje, po inkubacijos centrifuguojama 1 min. 8000 x g.

Išskirta DNR iškart naudojama polimerazės grandininei reakcijai atlikti.

2.2.2 Adenovirusų I ir II tipo bei parvovirusų nustatymas PGR metodu

Buvo atliekama paprasta polimerazės grandininė reakcija. Adenovirusų nustatymo reakcijai buvo naudojami pradmenys, kurie buvo pasirinkti remiantis R.L. Hu ir kt. (2001) publikuotu straipsniu (1). Naudojant būtent šiuos pradmenis, užtenka vienos poros pradmenų identifikavimui tiek CAV-1, tiek CAV-2. Virusai nustatomi pagal susidariusio produkto dydį. Pradmenų rinkinys, skirtas parvoviruso VP1/VP2 genų amplifikacijai, buvo panaudotas parovirusų aptikimui mėginiuose (107). Pradmenų sekos pateiktos 3 ir 4 lentelėse.

3 lentelė. Oligonukleotidinių pradmenų sekos ir produktų dydžiai CAV-1 ir CAV-2 nustatymui.

Pradmenys Sekos (5'  3') Pozicija Produkto

dydis

HA1 GCG GCT GAA CAT TAT TAC CTT

GTC 770-791 CAV-1 1387-1408 CAV-2 508 bp – CAV-1; 1030 bp – CAV-2.

HA2 CCT AGA GCA CTT CGT GTC CGC TT 1274-1253 CAV-1

2413-2392 CAV-2 4 lentelė. Oligonukleotidinių pradmenų sekos ir produktų dydžiai parvovirusų nustatymui.

Pradmenys Sekos (5'  3') Pozicija Produkto

dydis pCPV-2N (F) TGA GCT GCA TTT AGT TAG TTT

TGA 3188-3211

442 bp pCPV-2N (R) TGT TTG CCA TGT ATG TGT TAG TCT 3607-3630

Reakcijos mišinį adenovirusų nustatymui (45 μl) sudarė:

5 μl PGR buferinio tirpalo (10 Mm Tris- HCl [Ph 8,3] 50 Mm KCl, 1,5 Mm MgCl2, UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva);

5 μl MgCl2 (25 mM), (UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva);

2 µl dNTP mix (2.5 mM kiekvieno, UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva); 20 pmol HA1: 5'-GCG GCT GAA CAT TAT TAC CTT GTC-3';

20 pmol HA2: 5'-CCT AGA GCA CTT CGT GTC CGC TT-3';

0.5 µl Hot Star Taq polimerazė (2.5 U, UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva). Reakcijos eiga, trukmė bei ciklų skaičius yra pateikti 5 ir 6 lentelėse.

5 lentelė. PGR etapai adenovirusų nustatymui.

Etapas Temperatūra, C˚ Trukmė, min. Ciklų skaičius

Pradinė denatūracija 95 5 1 Denatūracija 94 0.5 35 Hibridizacija 58 1 Grandinės ilginimas 72 1 Galutinis grandinės ilginimas 72 7 Atvėsinimas 20 - 1

6 lentelė. PGR etapai parvovirusų nustatymui.

Etapas Temperatūra, C˚ Trukmė, min. Ciklų skaičius

Pradinė denatūracija 95 5 1 Denatūracija 94 0.5 30 Hibridizacija 50 1 Grandinės ilginimas 72 1 Galutinis grandinės ilginimas 72 7 Atvėsinimas 20 - 1

Į 10 μL PGR DNR produkto buvo lašinama 2 μL dažų (DNA Gel Loading Dye (6X), UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva), pipetuojant sumaišoma ir lašinama į agarozės gelyje ,,šukomis” padarytas duobutes. Įlašinamas molekulinės masės markeris (UAB ,,Thermo Fisher Scientific Baltics”, Lietuva). Toks paruoštas agarozės gelis dedamas į vonelę su TAE 1X tirpalu ir atliekama elektroforezė. Elektroforezės trukmė 40 min. Rezultatai analizuojami ultravioletinėje šviesoje. Rezultatai, kaip teigiami, interpretuojami, kai matomas produkto dydis adenovirusams buvo 508 bp (CAV-1) ir 1030 bp (CAV-2), o parvovirusams – 442 bp.

3. REZULTATAI

3.1 Virškinamojo trakto (VT) sutrikimai įvairiose smulkių gyvūnų klinikose

Analizuojant duomenis iš smulkių gyvūnų klinikų, buvo siekiama išsiaiškinti, kokie buvo dažniausiai nustatomi VT šunų susirgimai ir kokia jų dalis yra priskiriama virusiniams susirgimams. Iš viso tiriamuoju laikotarpiu buvo registruota 640 susirgusių šunų. Iš visų registruotų šunų 161 šuniui buvo nustatytas VT sutrikimas. VT sutrikimai sudarė 25,15 proc. visų susirgimų, dėl kurių šunys buvo atvesti į kliniką. Virusiniams susirgimams buvo priskirta 14 atvejų, tai sudarė 9 proc. visų VT susirgimų arba tik 2 procentus visų susirgimų, dėl kurių buvo kreiptasi į veterinarijos klinikas (7 lentelė).

7 lentelė. Virškinamojo trakto sutrikimai įvairiose smulkių gyvūnų klinikose, užregistruoti 2014 m.

vasarą-rudenį.

Rajonas

Bendras tirtų šunų

skaičius

VT sutrikimai Virusiniai VT sutrikimai

Bendras skaičius VT, proc. Bendras skaičius Virusiniai VT sutrikimai, proc. VT sutrikimai proc. iš visų tirtų šunų. Vilniaus 112 15 13,39 3 20 2,67 Kauno 383 114 29,76 8 7,01 2,08 Šiaulių 39 9 23,07 2 22,22 5,12 Klaipėdos 42 4 9,52 0 0 0 Alytaus 64 19 29,68 1 5,26 1,56 Iš viso: 640 161 25,16 14 8,69 2,18

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 he pa ti ta s ke pe nų ne pa ka nka m um as he pa topa ti ja ga st ri ta s ga st roe nt er it as ent er it as kol it as ent er oko li ta s vi rus ini ai V T sus ir gi m ai VT susirgimai S er gan či ų š u n ų s k ai či u s Vilniaus raj. Kauno raj. Šiaulių raj. Klaipėdos raj. Alytaus raj. enterito, 2,34 proc. gastroenterito, 2,18 proc. virusinių VT sutrikimų, 2,03 proc. enterokolito, 0,78 proc. kolito ir 0,47 proc. enteropatijų dalį visų susirgimų, lyginant su visais į klinikas atvestais sergančiais šunimis.

1 pav. VT susirgimai skirtinguose Lietuvos rajonuose esančiose smulkių gyvūnų klinikose 2014

m. vasarą-rudenį.

3.2 Klinikinių mėginių dėl adenovirusų ir parvovirusų tyrimo rezultatai

Tyrimo metu buvo ištirta 90 mišrių (išmatų arba išmatų ir seilių) mėginių. Tyrimo imtį sudarė 73 mėginiai (81 proc.) iš šunų, kurie turėjo klinikinius požymius, būdingus infekciniam šunų hepatitui ar/ir parvovirusianiam enteritui, ar/ir infekcinis laringotracheitui. Kiti 17 mėginių (19 proc.) buvo paimti iš šunų, kurie laikomi gyvūnų prieglaudoje, šie gyvūnai neturėjo klinikinių požymių.

Atlikus PGR tyrimą, teigiama reakcija gauta 60 proc. atvejų, o neigiama reakcija - 40 proc. atvejų (2 pav.).

PGR rezultatai (n=90)

54 36

Rastas patogenas Nerastas patogenas

2 pav. PGR analizės metu gauti rezultatai patogenų atžvilgiu, šunų skaičius.

Iš teigiamų 54 rezultatų 44 atvejais (81 proc.) nustatytas parvovirusas, 10 atvejų (19 proc.)– mišrūs patogenai. Atitinkamai 9 atvejais (17 proc.) buvo nustatytas adenovirusas 1 ir parvovirusas bei 1 atvejis (2 proc.) – adenovirusas 2 kartu su parvovirusu (3 pav.).

Nepasitaikė nė vieno atvejo, kurio metu būtų rastas šunų adenovirusas 1 tipo ar šunų adenovirusas 2 tipo, kaip pavieniai patogenai. Aptikti adenovirusai 1 tipo, tiek adenovirusas 2 tipo buvo nustatyti mėginiuose kartu su parvovirusu.

81 proc. 17 proc.

2 proc.

CPV CPV+CAV1 CPV+CAV2

3 pav. Nustatytų virusų pasiskirstymas procentais.

Daugiausiai vakcinuotų buvo 4–6 mėn. amžiaus, tai sudarė 52 proc. toje amžiaus grupėje esančių šuniukų. Šioje amžiaus grupėjė 36 proc. buvo vakcinuoti vieną kartą, 16 proc. buvo vakcinuoti du ar daugiau kartų, o 48 proc. šuniukų buvo visiškai nevakcinuoti.

1–3 mėn. amžiaus grupėje 6 proc. šuniukų buvo vakcinuoti vieną kartą, 3 proc. buvo vakcinuoti du ar daugiau kartų, o 71 proc. šuniukų niekada nebuvo vakcinuoti.

Tarp 7 mėn. ir vyresnių šunų tarpe 7,7 proc. buvo vakcinuoti tik kartą, 61,5 proc. vakcinuoti 2 ar daugiau kartus, o nevakcinuotų niekada 13,8 proc. (4 pav.) .

4 pav. Skirtingo amžiaus šunų vakcinacijos istorija.

5 pav. Teigiamų rezultatų pasiskirstymas skirtingose amžiaus grupėse.

Mišri infekcija, kai mėginyje buvo nustatyti du virusai, pasitaikė tiek 1–3 mėn., tiek 4–6 mėn. amžiaus grupėse.

1–3 mėn. amžiaus grupėje, iš visų nustatytų teigiamų atvejų 74 proc. buvo rastas parvovirusas bei 26 proc., kai mėginyje buvo aptikti parvovirusas ir 1 tipo adenovirusas.

Vyresnio amžiaus šunų grupėje, 4–6 mėn., iš viso teigiamų atvejų buvo 88,0 proc. (PI 5,76-38,24 proc.). Šioje tirtųjų gyvūnų grupėje iš visų teigiamų atvejų 86 proc. buvo parvovirusui teigiami atvejai. 9 proc. aptikti buvo parvovirusas su adenovirusu 1 tipo, o 5 proc. teigiamų atvejų mėginyje buvo nustatyti parvovirusas ir adenovirusas 2 tipo.

Grupėje ≥7 mėn. amžiaus visi teigiami atvejai buvo parvoviruso atžvilgiu (PI -3.07-13.07 proc.). Be to, šioje grupėje esantys šunys sirgo rečiau nei jaunesni (p<0,05).

Toliau buvo vertinama laikymo sąlygų, kontakto su kitais šunimis, vakcinacijos ir laiko po vakcinacijos įtaka parvovirusinių ir adenovirusinių infekcijų pasireiškimui.

Tirti gyvūnai buvo laikomi skirtingomis sąlygomis. Taip pat vieni iš jų iki klinikinių požymių pasireiškimo turėjo kontaktą su kitais gyvūnais, o kiti – ne.

Vertinant kontaktą su kitais šunimis, 61 šuo (83,56 proc.) turėjo kontaktą su kitais šunimis, 12 šunų (16,43 proc.) neturėjo kontakto. Iš šių 73 tirtųjų gyvūnų 46 atvejais (75,40 proc.) šunys turėjo ir klinikinius požymius, ir buvo nustatytas bent vienas iš virusų.

Iš 12 šunų, kurie turėjo klinikinius požymius, bet neturėjo kontakto su kitais šunimis, 8 atvejais (66,66 proc.) buvo nustatyti virusai, o 4 atvejais (33,33 proc.) buvo neigiami rezultatai virusų atžvilgiu. Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad kontaktas su kitais gyvūnais turėjo labai stiprų ryšį su viruso aptikimu klinikinius požymius turinčio šuns mėginyje (p< 0,01).

Išanalizavus vakcinacijų istorijas šunų, kurie turėjo klinikinius požymius, nustatyta, jog iš viso buvo vakcinuoti 32 šunys, 40 šunų nevakcinuoti, o apie vieną šuns vakcinaciją nebuvo informacijos. Teigiama PGR reakcija virusų atžvilgiu buvo nustatyta 14 (43,75 proc.) šunų iš 32 vakcinuotų. Virusai nustatyti 39 (97,5 proc.) nevakcinuotiems šunims. Atitinkamai 18 (56,3 proc.) iš 32 vakcinuotų ir vienam nevakcinuotam (2,5 proc.) iš 40 šunų PGR reakcija buvo neigiama virusų atžvilgiu. Atlikus statistinę analizę, paaiškėjo, kad ryšys tarp vakcinacijos ir teigiamos PGR reakcijos virusų atžvilgiu, yra statistiškai labai reikšmingas (p< 0,01).

Atsižvelgiant į laiką, praėjusį nuo paskutinės atliktos vakcinos injekcijos, ir aptiktus PGR metu patogenus, buvo tik vienas atvejis, kada tarp vakcinos suleidimo, klinikinių požymių pasireiškimo ir PGR metu nustatyto parvoviruso buvo praėjusi tik 1 diena. Visais kitais atvejais buvo praėję daugiau nei 10 dienų nuo vakcinos suleidimo.

Toliau buvo analizuojami skirtingi tyrimo metodai diagnozei nustatyti.

Palyginus PGR metodu gautus rezultatus su gydytoju nustatytomis arba įtariamomis diagnozėmis, paiškėjo, kad ne visada buvo tinkamai nustatyta diagnozė net esant labai panašiems simptomams.

Iš klinikinius požymius, panašius į parvovirusinį enteritą, turinčių šunų (n=68), 33 šunims buvo atliktas greitasis antigenų testas. Iš šių 33 šunų, kuriems buvo atliktas testas, buvo nustatyti 25 parvovirusui teigiami atvejai (75,76 proc.), 8 atvejais (24,24 proc.) testas buvo neigiamas.

8 lentelė. PGR ir greitojo antigenų nustatymo testo palyginimas. Greitasis testas Auksinis standartas Antigenų testas teigiamas Antigenų testas

neigiamas Iš viso

PGR teigiama 24 5 29

PGR neigiama 1 3 4

Palyginus klinikinius požymius turėjusių šunų greitojo parvoviruso nustatymui naudojamo testo rezultatus su PGR būdu gautais rezultatais, paaiškėjo, kad tiek greitieji testai, tiek PGR metodas, esant klinikiniams požymiams, aptinka virusus patikimai (p<0,05).

Iš tų pačių 68 šunų, kuriems buvo pasireiškę klinikiniai parovovirusinei infekcijai būdingi požymiai, 51 (75 proc.) atveju buvo nustatytas parvovirusas PGR metodu, o 17 atveju (25 proc.) PGR buvo neigiama.

Diagnozuojant parvovirozę iš klinikinių požymių, teisinga diagnozė buvo nustatyta 79,41 proc. atvejų.

Iš klinikinius požymius turinčių šunų keturi šunys buvo įtariami sergantys infekciniu hepatitu. Palyginus PGR rezultatus ir įtartus infekcinio hepatito atvejus, dvi diagnozės buvo patvirtintos molekuliniais metodais. Iš šių keturių šunų dviem buvo aptikti mišrūs patogenai: 1 tipo adenovirusas ir parvovirusas. Dar vienam šuniui buvo nustatytas tik parvovirusas, o kito šuns mėginyje neaptikta nieko.

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Tyrimo duomenimis, virškinamojo trakto ligos yra aktualios Lietuvoje. Tiek CAV-1 ar CAV-2, tiek CPV pažeidžia virškinamąjį traktą, todėl buvo analizuojami smulkių gyvūnų veterinarijos klinikų pateikti duomenys apie į kliniką atvedamų sergančių gyvūnų (n=640) skaičių bei virškinamojo trakto sutrikimus (n=161). 2014 m. nustatyta, kad jie sudarė 25 proc. visų tose klinikose fiksuojamų susirgimų tiriamuoju laikotarpiu. Daugiausiai buvo nustatomos kepenų patologijos. Kepenų funkciniai pakitimai taip pat būdingi ir CAV-1 bei CPV infekcijoms. Tuo tarpu 2014 m. publikuotame straipsnyje apie ligų paplitimą Anglijoje buvo nurodoma, jog įvarios enteropatijos sudarė 17,8 proc., o bendrai VT ligos sudarė 29,5 proc. iš visų šunų susirgimų. Infekcinėms ligų paplitimas buvo 10 proc. (108). Yra aprašyta atvejų, kai CAV-1 antigenai buvo aptikti šunims, turintiems įvairius kepenų uždegimo požymius (77). Literatūroje yra teigiama, kad dažniausiai nustatomi patys pagrindiniai kepenų fermentai: šarminė fosfatazė (ALP), alaninaminotransferazė (ALT), aspartataminotransferazė (AST), γ-gliutamiltransferazė (GGT), tačiau neįprastai pakilęs kepenų fermentinis aktyvumas yra dažniau nustatomas nei pačios kepenų ligos (109). Platus spektras nehepatinių sutrikimų gali turėti įtakos kepenų fermentų aktyvumui. Sharon A. Center 2007 m. atliktame tyrime su 100 šunų, kuriems buvo įtartos kepenų ligos, remiantis padidėjusiu kepenų fermentų aktyvumu, po kepenų biopsijos paaiškėjo, jog nė vienas gyvūnas neserga kepenų ligomis (110). Todėl lieka neaiškios tikros priežastys, galbūt galima daryti prielaidas ir dėl virusinių ligų. Mūsų tyrimai parodė, kad virusiniai VT sutrikimai tesudarė 2 proc. Tačiau reikia atkreipti dėmesį į tai, jog Lietuvoje plačiausiai naudojami greitieji testai yra skirti parvovirusų ir koronavirusų, rečiau rotavirusams, šunų maro diagnostikai. O adenovirusų diagnostikai tik neseniai rinkoje atsirado greitieji testai.

Paskutinių metų duomenimis, parvovirusinė infekcija yra dažna liga ir vis dar turėtų kelti susirūpinimą, kadangi virusas aptinkamas ir kliniškai sveikiems šunims (7,13). Mūsų tyrimo metu parvovirusai PGR metodu buvo nustatyti 73,97 proc., 1 tipo adenovirusas nustatytas 12,32 proc., o 2 tipo adenovirusas – 2,73 proc. visų šunų, kurie turėjo klinikius požymius. Todėl galime teigti, kad veterinarijos gydytojai praktikai nepakankamai rimtai vertina šiuos klinikinius požymius ir neatlieka išsamesnių tyrimų, kadangi adenovirusai buvo nustatyti 12 atvejų, nors įtarimas buvo tik 4 atvejais, iš kurių tik dvi diagnozės buvo patvirtintos PGR metodu.

Lietuvoje gyvenančius šunis. Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos duomenimis, Lietuvoje nėra atliekami tyrimai nei parvovirusų, nei adenovirusų, nei kitų infekcinių ligų, nuo kurių dažniausiai vakcinuojami šunys, kadangi tai nėra zoonozės.

Nors ištyrus 17 mėginių, atsitiktinai paimtų iš prieglaudoje gyvenančių šunų, nė vienas teigiamas PGR rezultatas nebuvo gautas, tačiau literatūroje nurodoma, kad didesnė tikimybė užsikrėsti infekcinėmis ligomis yra didelėse šunų populiacijose, kur vakcinacija nėra sistemingai vykdoma. Taip pat dėl prastų higienos sąlygų ir aplinkos užterštumo virusais yra didesnė virusų pernešimo tikimybė (3,67).

Ištyrus visus mėginius PGR metodu buvo gauti 54 teigiami rezultatai. Tačiau nebuvo nustatytas nei vienas mėginys, kuriame vyrautų tik CAV-1 ar CAV-2. Visais atvejais, kai buvo nustatytas CAV-1 (n=9) bei CAV-2 (n=1), virusas buvo randamas mėginyje, kuriame taip pat yra ir CPV. Literatūroje aprašyti atvejai, kai pasireiškia mišri infekcija, randami keli skirtingi patogenai, tokie kaip maro, toksoplazmozės, mikoplazmozės, CAV-1, CAV-2, CPV, vieno gyvūno organizme (15,57).

Atlikto tyrimo metu PGR metodu buvo nustatytas vienas teigiamas parvoviruso atvejis, kai po vakcinos suleidimo buvo praėjusi tik viena diena. Šuo turėjo neryškius simptomus, kurie pasireiškė kitą dieną po pirmosios vakcinacijos. Literatūroje nurodoma, kad gyvi nusilpninti CPV virusai gali replikuotis vakcinuotų šunų kraujyje ir žarnų gleivinėje, nepriklausomai nuo to, kad tai nenatūralus (injekcija į raumenis ar paodį) viruso patekimas į organizmą. Tai sukelia viremiją ir viruso išskyrimą su išmatomis. Dėl tokių aplinkybių CPV ar jo DNR aptinkamas vakcinuotų šunų išmatose gali būti klaidingas teigiamas rezultatas. Dėl to būna nustatoma klaidinga ligos diagnozė, kurią tikriausiai sukelia kitas patogenas (111). Kitų autorių duomenimis, CPV gali būti aptinkamas išmatose po paros laiko nuo vakcinacijos, kai vakcinacija atliekama į paodį (99). Galbūt galima daryti prielaidą, kad šuo jau buvo infekuotas prieš vakcinaciją arba tai buvo šalutinis vakcinos poveikis, o virusas aptiktas dėl anksčiau įvardintų galimų priežasčių.

Iš visų tirtųjų šunų keturiems šunims klinikiniais tyrimais buvo diagnozuotas infekcinis hepatitas. Dviem atvejais diagnozė buvo patvirtinta PGR metodu. Kitais atvejais (n=7) buvo nustatytas 1 tipo adenovirusas, nors infekcinis hepatitas nebuvo įtartas. Visais atvejais, kada buvo nustatytas CAV-1, tame pačiame mėginyje buvo nustatytas ir parvovirusas.