LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
MAISTO SAUGOS IR KOKYBöS KATEDRA
DOVILö ČEMOLONSKYTö
YERSINIA ENTEROCOLITICA PAPLITIMAS KIAULIŲ BANDOSE
LIETUVOJE IR JŲ ATSPARUMAS ANTIMIKROBINöMS MEDŽIAGOMS
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: doc., dr. M. Malakauskas
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Yersinia enterocolitica paplitimas kiaulių bandose Lietuvoje ir jų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms“
1. Yra atliktas mano pačios:
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje:
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS
TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO
GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros ved÷jo vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretor÷s (- riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SUMMARY ... 4
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 6
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 8
1.1 Yersinia spp. biologin÷s savyb÷s ... 8
1.2 Y. enterocolitica bakterijų šaltiniai... 11
1.3 Lietuvos gyventojų sergamumas žarnyno infekcin÷mis ligomis... 13
1.3.1 Jersinioz÷s susirgimo statistika... 14
1.4 Y.enterocolitica aptikimo ir identifikavimo metodai... 16
1.4.1 PGR metodo esm÷ ir panaudojimo galimyb÷s ... 16
1.4.2 Daugin÷ PGR... 17
1.5 Bakterijų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms ... 18
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 20
2.1. Tyrimų objektas ... 20
2.2 M÷ginių pa÷mimas ... 20
2.3 Bakterijų kultūrų išskyrimas... 20
2.4 Polimeraz÷s grandin÷s reakcija ... 21
2.4.1 DNR paruošimas ... 21
2.4.2 Pradmenys, naudojami PGR reakcijoje ... 22
2.5 Yersinia enterocolitica atsparumo antibiotikams tyrimo darbo metodika... 22
2.5.1 Terp÷s su skirtingomis antibiotikų koncentracijomis ruošimas ... 22
2.5.2 Praskiedimų ruošimas ir s÷jimas ant terp÷s su antibiotiku ... 24
3. REZULTATAI ... 26
3.1 Yersinia enterocolitica paplitimas kiaulių bandose Lietuvoje ... 26
3.2 Yersinia enterocolitica antimikrobinių medžiagų atsparumui tyrimo rezultatai ... 27
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 32
4.1 Yersinia enterocolitica paplitimo kiaulių bandose rezultatų aptarimas... 32
4.2 Atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimo rezultatų aptarimas ... 32
IŠVADOS... 34
PASIŪLYMAI ... 35
PADöKA ... 36
SUMMARY
Dovil÷ Čemolonskyt÷
YERSINIA ENTEROCOLITICA INCIDENCE OF SWINE HERDS OF LITHUANIA AND THEIR ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY
Master thesis
Work instructor: doc. dr. M. Malakauskas Lithuanian University of Health Sciences Veterinary Academy
Faculty of Veterinary Medicine
Department of Food Safety and Animal Hygiene Kaunas, 2011
The coverage of the work 39 pages, 8 tables and 10 pictures.
The aim of the present work was to determine the prevalence of pathogenic Yersinia enterocolitica bacteria in slaughtered pigs from Lithuanian pig farms using multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) methodand to determine their antimicrobial resistance using 3 antimicrobial agents. A total of 105 microbiological samples (70 faecal samples and 35 carcass swab samples) were collected and examined from slaughtered pigs from seven different Lithuanian pig farms. Yersinia spp. bacteria were isolated using cold enrichment method (21days at 4ºC) in PMB broth with further planting on CIN agar. The results of our study showed that using multiplex PCR method pathogenic Yersinia spp. was found in slaughtered pig samples delivered from 6 of 7 (86%) different farms. Yersinia spp. were identified in 21 (30%) of faecal and in 7 (20%) of carcass swab samples respectively. Yersinia enterocolitica was more prevalent in faecal samples (19%) than in carcass swab samples (17%). All obtained isolates of Y. enterocolitica were identified as serotype O:3.
Using the reference agar dilution method, susceptibility to three antimicrobial agents (tetracycline, ciprofloxacin and ampicilin) was tested. The strains showed high MIC levels to tetracycline and all obtained isolates of Y. enterocolitica were resistant to ampicilin. The highest susceptibility was found to ciprofloxacin.
To our knowledge, no report of Yersinia spp. isolation and identification and antimicrobial susceptibility from slaughtered pigs from Lithuanian pig farms in Lithuania was made before. The results obtained in the present study could serve for future investigations of the Yersinia spp. infection.
SANTRUMPOS
DNR - Deoksiribonukleino rūgštis PBS - Fosfatinis druskos tirpalas PGR - Polimeraz÷s grandinin÷ reakcija
Daugin÷ PGR – daugin÷ polimeraz÷s grandinin÷ reakcija MSK – Minimali stabdanti koncentracija
EFSA – Europos Maisto saugos tarnyba
ĮVADAS
Patogenin÷s bakterijos užima svarbią vietą ekosistemoje. Jų rūšin÷ sud÷tis, paplitimo arealas, tarpusavio sąveika ir sąveika su makroorganizmu yra labai svarbus mokslinių tyrimų objektas, padedantis geriau susipažinti ir įvertinti patogeninių mikroorganizmų reikšmę. Šios žinios yra būtina sąlyga ligų profilaktikai ir gydymui (Ružauskas ir kt., 2002).
Yersinia enterocolitica - svarbus žarnyno negalavimų suk÷l÷jas daugeliui gyvūnų, o taip pat ir žmon÷ms. Patogenas plačiai paplitęs aplinkoje, įskaitant dirvožemį, vandenį, taip pat dažnai aptinkamas žinduolių virškinamajame trakte, dažniausiai kiaulių, galvijų, avių, net ir paukščių. Kiaul÷s laikomos pagrindiniu Y. enterocolitica rezervuaru. Patogenas daugiausia išskiriamas iš kiaulių tonzilių ir liežuvio, rečiau nuo skerdenos ir iš išmatų (Fredriksson – Ahomaa et al., 2006; Niskanen et al., 2008). Dažniausiai patogenin÷mis jersinijomis žmon÷s gali užsikr÷sti vartojant blogai termiškai apdorotą kiaulieną, kuri neretai skerdimo operacijų metu užteršiama fekalijomis ar skrandžio turiniu. Netgi vartojant maisto produktus, kurie prieš tai buvo atšaldyti (m÷są, pieną) yra tikimyb÷ susirgti, kadangi Y. enterocolitica paderm÷s gali išgyventi bei daugintis ir žemoje temperatūroje (- 4laipsn. C).
Y. enterocolitica gali sukelti įvairaus sunkumo žarnyno sutrikimus. Dažniausiai sukelia plonosios žarnos uždegimą, enterokolitą, parenteralines infekcijas, kurios gali progresuoti į sepsį (kraujo užkr÷timą). Dažniausiai tai pasitaiko vaikams arba pacientams, kurių nusilpusi imunin÷ sistema. ES bendras jersinioz÷s atvejų skaičius 2007 m. buvo 2,8/100000 (susirgimai/gyventojų skaičiui), tuo tarpu 2008 m. šis skaičius sumaž÷jo iki 1,8/100000. Nors jersinioz÷s susirgimų skaičius nuo 2004 m. ÷m÷ maž÷ti, tačiau skirtingose šalyse 2008 m. svyravo nuo 0,1/100000 Airijoje, iki 11,5/100000 Suomijoje, o Lietuvoje susirgimų skaičius užfiksuotas didžiausias – 15, 9/100000 (EFSA, 2010). Jersinioz÷s plitimą šalyje gali lemti ekonominiai, socialiniai, ekologiniai veiksniai, kuriuos labai svarbu išsiaiškinti bei išanalizuoti. Taip pat labai svarbu rinkti ir analizuoti duomenis apie šių patogenų atsparumą antimikrobin÷ms medžiagoms.
šalyse sugriežtintas antibiotikų naudojimas. Kaip augimo stimuliatorių antibiotikų naudojimas ES šalyse visiškai uždraustas.
DARBO NAUJUMAS. Naujausi duomenys rodo, kad Lietuvoje iki šiol atlikta tik keletas tyrimų apie Yersinia enterocolitica bakterijų išskyrimą ir identifikavimą iš Lietuvoje išaugintų ir paskerstų kiaulių, tuo tarpu tyrimai d÷l Yersinia enterocolitica bakterijų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms yra vieni pirmųjų. Manome, kad šio tyrimo rezultatai bus naudingi atliekant tolimesnius tyrimus, susijusius su patogeninių Yersinia enterocolitica bakterijų užsikr÷timo rizika kiaulienos grandin÷je ir galimomis prevencin÷mis priemon÷mis kiaulių fermose bei pad÷s racionaliau naudoti antimikrobines medžiagas gyvūnų gydymui.
DARBO TIKSLAS – nustatyti Yersinia enterocolitica bakterijų paplitimą Lietuvoje užaugintų kiaulių bandose ir skerdimo metu ant skerdenų bei įvertinti Yersinia enterocolitica atsparumą kai kurioms antimikrobin÷ms medžiagoms.
DARBO UŽDAVINIAI:
1. Nustatyti Yersinia enterocolitica paplitimą Lietuvoje užaugintų kiaulių skerdenoje ir jų išmatose.
2. Taikant daugin÷s polimeraz÷s grandin÷s reakciją (daugin÷ PGR) identifikuoti jersinijų serotipus.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Yersinia spp. biologin÷s savyb÷s
Yersinia spp., kurią sudaro dvylika rūšių (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. intermedia, Y. aldovae, Y. mollaretii, Y.bercovieri, Y. rohdei, Y. ruckeri and Y. aleksiciae) priklauso Enterobacteriaceae šeimai. Y. enterocolitica, Y. pestis ir Y. pseudotuberculosis – pagrindin÷s rūšys, sukeliančios žmonių susirgimus (EFSA, 2009). Y. pestis, sukeliantis marą n÷ra paplitęs Europoje ir šio patogeno plitimo kelias n÷ra susijęs su maistu. Y. enterocolitica ir Y. pseudotuberculosis plačiai paplitę Europoje ir yra tipiški enteropatogenai (plinta fekaliniu – oraliniu būdu) (Andreoletti et al., 2007).
Yersinia enterocolitica - gramneigiamos lazdel÷s formos bakterijos (1 pav.), kurios dauginasi 2°C–4°C temperatūroje. D÷l šių bakterijų sugeb÷jimo daugintis žemoje temperatūroje, jersinioz÷s dar vadinamos „šaldytuvų“ ligomis. Esant pakankamai dr÷gm÷s žemoje temperatūroje, bakterijos išlieka gyvybingos labai ilgai. Sausoje aplinkoje, ultravioletiniuose spinduliuose jersinijos žūva per 10 minučių, verdant per 40 sekundžių (http://www.nmvrvi.lt/lt/zoonozes/zarnyno.jersinioze/ prieiga per internetą 2010 m. rugpjūčio 9 d.).
1 pav. Yersinia enterocolitica nudažyta Gramo būdu
Yersinia enterocolitica gerai auga paprastoje terp÷je, o šių bakterijų išskyrimui daugiausia naudojamas cefsulodin – irgasan – novobiocino (CIN) agaras (Thisted Lambertz, Danielsson – Tham 2005) (2 pav.) Yersinia enterocolitica (enterokolitin÷s jersinijos) raugina sacharozę, sorbitolį, bet nefermentuoja melibioz÷s, rafinoz÷s, ramnoz÷s, gamina ureazę, ornitindekarboksilazę (1 lentel÷). Y enterocolitica kamienai suskirstyti į 5 biovarus ir traktuojami kaip atskiros rūšys: Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. bercovieri (biogrup÷ 3B); Y. mollaretii (biogrup÷ 3A), Y. rohdei (Bottone, 1999).
2 pav. Užaugusios jersinijų kolonijos ant CIN agaro
sorbitolį + celobiozę + inozitolį (+ / -) sacharozę + / - ramnozę - rafinozę - melibiozę -
Citratin÷ Simonso terp÷ - Fofeso ir Ploskauerio reaicija + / - Indolo susidarymas + / -
Lipaz÷ + / -
Pirazinamidaz÷ + / -
+ / - kintanti reakcija; (+ / -) – kintanti reakcija po ilgesnio augimo.
Y. enterocolitica patogeniškumo veiksniais laikomi adhezinai ir invazinai, padedantys įsitvirtinti prie žarnyno epitelio ir į jį įsiskverbti, mažamolekuliai baltymai, slopinantys baktericidinius veiksnius, ir enterotoksinas. Visi Y. enterocolitica kamienai turi visų enterobakterijų paviršinį antigeną, žiuželinį antigeną (žiuželų netenkama pakilus temperatūrai virš 35 °C). Pagal antigenų ypatumus skirstomi į serovarus. Infekcinius procesus dažniausiai sukelia O:3 ir O:9 serotipai (Masteikien÷, 2002).
Jersinioz÷ paplitusi visuose žemynuose, tačiau labiausiai paplitusi Europoje (2 lentel÷). Lietuvoje 2008 m. žarnyno jersinioze sirgo 530 žmonių. Dažniausiai sergama šaltuoju metų sezonu (http://www.nmvrvi.lt/lt/zoonozes/zarnyno.jersinioze/ prieiga per internetą 2010 m. rugpjūčio 09 d.).
2 lentel÷. Yersinia spp. paplitimas ir patogeniškumas Biotipas Serotipas Pavojingumas
žmon÷ms
Dažnumas Europoje
pYV HPI
4 O:3 P ++++ Taip Ne
2 O:9; O:5,27 P ++ iki +++ Taip Ne
3 O:9; O:5,27 P + Taip Ne
1B O:8; O:21; O:13; O:7 (ir kiti)
LP Apie 0 Taip Taip 5 O:3; O:2,3; O:
1,2,3
P Apie 0 Taip Ne
1A Daugelis (įskaitant O:8; O:5; O:7; O:13 ir
kitus)
NP ++++ Ne Ne
LP: labai patogeniškas, P: patogeniškas, NP: nepatogeniškas
Pagrinde jersinioze serga kūdikiai ir pagyvenę žmon÷s, kurių organizmo imunin÷ sistema yra silpnesn÷. Ligos inkubacinis periodas trunka 3 – 7 dienas. Liga gali pasireikšti karščiavimu, pilvo skausmais, viduriavimu, v÷mimu. Vyresniems vaikams ir suaugusiems žmon÷ms pilvo skausmai gali būti panašūs į apendicito simptomus. Tai pseudoapendicitas, dažnai painiojamas su tikruoju apendicitu. Jersinioz÷ gali trukti nuo 1 iki 3 savaičių. Dažniausios žarnyno jersinioz÷s komplikacijos gali būti sąnarių skausmai, odos b÷rimai. Reta, tačiau pasitaikanti Y. enterocolitica infekcijos komplikacija gali būti sepsis.
1.2 Y. enterocolitica bakterijų šaltiniai
Kiaul÷s ir kiauliena
Atspariomis ir žmon÷ms pavojingomis bakterijomis užsikr÷tę gyvūnai gali tapti rezerviniais jų šeimininkais (Orden et al., 2001). Kiaul÷s – pagrindin÷s Y. enterocolitica mikroorganizmų nešiotojos ir rezervuarin÷s šeiminink÷s (Platt - Samoraj et al., 2006; Niskanen et al., 2008). Jersinijos kiaulių organizmuose randamos tonzil÷se, limfiniuose mazguose, žarnyne bei išmatose. Serotipas O:3 dažnai aptinkamas kiaulienos skerdenoje, kadangi skerdena neretai užteršiama fekalijomis ar žarnų turiniu skerdimo operacijų metu. Žalia, termiškai neapdorota kiauliena gali būti viena iš pagrindinių Y. enterocolitica sukel÷jų šaltiniu (ypač O:3 serotipo).
Skerdimo metu kiaulienos skerdena bei valgomi kiaulienos subproduktai gali būti užteršti patogeniniais mikroorganizmais. Tolimesniuose skerdenos apdorojimo etapuose jersinijos gali dar labiau išplisti. Taigi naudojama skerdimo technika, bei skerdimo higiena gali tur÷ti didel÷s įtakos užteršimo jersinijomis lygiui (Andreoletti et al., 2007).
Terminis kiaulienos apdorojimas ir pasterizacija pašalina jersinioz÷s suk÷l÷jus, tačiau visada išlieka kryžminio produktų užteršimo pavojus (Lake, 2004)
Atrajotojai ir jų produktai
Moksliniai tyrimai parod÷, kad Y. enterocolitica (serotipas O:9) galimas galvijų skerdenoje. Norvegijoje ir Naujojoje Zelandijoje užfiksuoti Y. enterocolitica (serotipas O:2) protrūkiai ožių bandose. Naujojoje Zelandijoje Y. enterocolitica (serotipas O:3) išskirtas iš avių išmatų ir iš elnių (serotipai O:5,27 ir O:9).
jersinijomis (serotipas O:8). Užteršimas susijęs su higienos stoka – blogu pieno butelių išplovimu, sudedamųjų dalių užteršimu (gaminant šokoladinį pieną). Vienas toks jersinioz÷s protrūkis vartojant užterštą pasterizuotą pieną užfiksuotas Švedijoje 1988 metais. Protrūkis buvo susijęs su pieno pasterizavimui naudojamo vandens užteršimu jersinijomis (Andreoletti et al., 2007).
Naminiai paukščiai
Vokietijoje Y. enterocolitica serotipas O:3 ir serotipas O:9 izoliuoti nuo naminių paukščių. Tai vienintelis užfiksuotas kartas, kuomet patogenin÷s jersinijos izoliuotos nuo naminių paukščių nesant akivaizdžios galimyb÷s paukštienos užteršimui nuo kiaulių ar kitų gyvūnų (Andreoletti et al., 2007).
Daržov÷s
Daržov÷s gali būti užteršiamos jersinijomis transportuojant, taip pat daržovių saugyklose, kuriose yra graužikų. Termiškai apdorotas maistas taip pat gali būti užkr÷stas jersinijomis laikant jį kartu su užkr÷sta žalia m÷sa ar daržov÷mis.
Profilaktika – griežtai laikytis maisto produktų kulinarinio – terminio paruošimo taisyklių. Prieš naudojant daržoves reikia gerai nuvalyti, nuplauti vandeniu. Nuo šviežių kopūstų, ilgiau saugyklose laikytų daržovių pašalinti apipuvusius lapus. Taip pat būtina naikinti graužikus, tarp kurių išplitusios jersinijos (Masteikien÷, 2002).
Norvegijoje patogenin÷s Y. enterocolitica bakterijos išskirtos ir nuo salotų lapų naudojant Polimeraz÷s Grandinin÷s Reakcijos (PGR) metodą (Andreoletti et al., 2007).
Kiti šaltiniai
Y. enterocolitica (serotipas O:3) aptinkamas šunų ir kačių organizmuose ir jie gali būti enteropatogeninių jersinijų perneš÷jai. Graužikai taip pat platina patogenines jersinijas. Serotipai O:8 ir O:21 išskirti iš graužikų išmatų Japonijoje. Serotipas O:21 buvo izoliuotas nuo laukinių žiurkių blusų JAV.
1.3 Lietuvos gyventojų sergamumas žarnyno infekcin÷mis ligomis
Ūmios žarnyno infekcin÷s ligos – tai grup÷ ligų, plintančių per mikroorganizmais užkr÷stą maistą bei kontaktiniu būdu. Paskutinius 10 metų Lietuvoje sergamumas žarnyno ifekcin÷mis ligomis did÷ja ir vidutiniškai kasmet užregistruojama nuo 11 iki 20 tūkstančių susirgimo atvejų. Tačiau oficialioji statistika neatspindi realios situacijos, kadangi ne visi susirgę kreipiasi medicinos pagalbos, n÷ra tiriami mikrobiologiškai. Atskirų nozologinių ligų daugiamet÷s tendencijos yra panašios į Europos Sąjungos šalių tendencijas. Daugiausiai serga vaikai iki 6 metų amžiaus. Beveik du trečdaliai susirgusiųjų asmenų žarnyno infekcin÷mis ligomis užsikrečia namų aplinkoje ir nuo namuose paruošto maisto.
Maistu plintančių užkrečiamųjų ligų plitimą šalyje gali lemti ekonominiai, socialiniai, ekologiniai veiksniai, gyventojų demografiniai ir elgesio pokyčiai, tarptautinių kelionių, gyventojų migracijos bei komercijos suaktyv÷jimas, technologijų pl÷tra, mikroorganizmų prisitaikymas, jų kintamumas, naujų ligų atsiradimas, infekcinių ligų kontrol÷s nepaisymas ir kita.
Pastaraisiais metais Lietuvoje pasiekta nemaža pažanga maisto saugos srityje. Lietuvos Respublikos Maisto įstatymas nubr÷ž÷ ministerijų bei kitų institucijų atsakomyb÷s ribas politikos formavimo, įgyvendinimo bei maisto kontrol÷s srityse. Priimti svarbūs įstatymus lydintys aktai, numatantys rizikos analiz÷s veiksnių ir svarbių valdymo taškų (RVASVT) sistemos diegimą maisto tvarkymo įmon÷se. Nustatyta tvarka vykdomas neformalus maistą tvarkančių asmenų privalomas higienos žinių mokymas, per žiniasklaidą teikiama informacija visuomenei apie užkrečiamųjų ligų profilaktiką. Vis labiau tokia informacija gyventojams prieinama internetiniuose visuomen÷s sveikatos priežiūros institucijų tinklalapiuose.
Šalyje sukurta teisin÷ baz÷, reglamentuojanti užkrečiamųjų ligų epidemiologinę priežiūrą ir kontrolę. Lietuvos teis÷ šioje srityje harmonizuota su Europos teise. Be to, reglamentuotas tarpsektorinis bendradarbiavimas tarp visuomen÷s sveikatos priežiūros ir Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos institucijų maistu plintančių infekcijų kontrol÷s srityje.
Nuo 1996 metų Lietuvos gyventojų bendras sergamumas žarnyno infekcin÷mis ligomis tur÷jo tendenciją did÷ti. Šį did÷jimą iš esm÷s l÷m÷ kasmet did÷jantis sergamumas rotavirusiniu enteritu, kitomis virusin÷mis žarnyno infekcijomis. Sergamumo rodikliai kitomis bakterin÷mis žarnyno infekcijomis (jersinioze, kampilobakterioze) tendencijos maž÷ti netur÷jo.
Sergamumo steb÷senos rodikliai rodo, kad 70 proc. asmenų, susirgusiųjų žarnyno infekcin÷mis ligomis, 2009 metais užsikr÷t÷ namų aplinkoje, t.y. nuo namuose nesaugiai paruošto maisto ar nuo sąlyčio su ligoniu. Tik 10 proc. susirgusiųjų asmenų užsikr÷t÷ vaikų ugdymo įstaigose, maitinimo įstaigose, taip pat vartojimui paruoštu maistu, pirktu prekybos įmon÷se. 20 proc. asmenų užsikr÷timo vieta nebuvo išaiškinta (http://www.ulac.lt/downloads/ulac6_small.pdf prieiga per internetą 2011m. sausio 28d.).
1.3.1 Jersinioz÷s susirgimo statistika
Europos Sąjungos šalyse 2007 metais užregistruota 8,792 patvirtintų jersinioz÷s susirgimų. Pateikti duomenys rodo, kad susirgimų skaičius jersinioze nuo 2003 metų iki 2007 metų ES ÷m÷ maž÷ti (3 lentel÷).
3 lentel÷. Jersinioz÷s susirgimai Europoje 2003 – 2007 metais
Olandija - - Portugalija - - 3 6 Prancūzija - - 0 171 249 218 Rumunija - - Slovakija 74 71 1,3 82 63 78 - Slov÷nija 32 32 1,6 80 0 38 69 Suomija 480 480 9,1 795 638 686 646 Švedija 567 567 6,2 558 684 804 714 Vengrija 55 55 0,5 38 41 68 - Vokietija 4,987 4,987 6,1 5,161 5,624 6,182 6,571 Viso 8,795 8,792 2,8 8,984 9,508 10,213 10,086 Patvirtintų susirgimų akaičius 2005 – 2006, susirgimų (nepatvirtintų) skaičius 2003 – 2004 (EFSA, 2009).
Nuo 1994 metų Lietuvos gyventojų sergamumas Yersinia enterocolitica infekcija tur÷jo tendenciją did÷ti (4 pav.) (http://www.ulac.lt/uligos.php?pl=13&ppl=32 prieiga per internetą 2011 m. sausio 28 d.). 2009 metais jersinioze nuo namuose ruoštų ir vartotų žalių daržovių užsikr÷t÷ 256 (53,4 proc.) asmenys, nuo kiaulienos ir kitos m÷sos – 32 (6,7 proc.), 158 (32,9 proc.) apklaustų ligonių rizikos veiksniai nebuvo žinomi. (http://www.ulac.lt/downloads/ulac6_small.pdf prieiga per internetą 2011 m.sausio 28 d.).
Sergamumas Y. enterocolitica infekcija Lietuvoje 1994-2009 m.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 ro d ik li s 1 0 0 t ū k s t. g y v e n to jų
1.4 Y.enterocolitica aptikimo ir identifikavimo metodai
1.4.1 PGR metodo esm÷ ir panaudojimo galimyb÷s
Kaip rasti bakteriją ar virusą pra÷jus kelioms dienoms nuo infekcijos pradžios? Kaip nustatyti individo tapatybę, turint tik mažytę odos skiautelę, kraujo lašą ar vienintelį plauką? Kaip įrodyti, kad mamutas, gyvenęs Sibire prieš 40 000 metų, yra artimas šiuolaikiniams drambliams ne tik tuo, kad šis gigantas tur÷jo straublį ir iltis? Galiausiai kaip surasti adatą šieno kupetoje (“šieno kupeta”- individo genetin÷ informacija, “adata” – genas arba jo fragmentas)? Аtsakyti į šiuos klausimus padeda molekulin÷s biologijos metodai. Populiariausias ir plačiausiai taikomas – Polimeraz÷s Grandinin÷ Reakcija (PGR). Šis metodas ne tik padeda surasti “adatą šieno kupetoje”, bet ir per kelias valandas prigaminti dar visą “vežimą” tokių pat “adatų”. Pirmoji DNR sekų PGR paskelbta Saiki R. ir jo kolegų iš Cetus korporacijos, Žmogaus genetikos departamento Kalifornijoje 1985 metais. Šiame darbe, panaudojant DNR polimerazę – Klionovo fragmentą ir specifinius pradmenis buvo padaugintas beta-globino DNR fragmentas 220.000 kartų. PGR metodo atradimas suk÷l÷ tikrą revoliuciją molekulin÷s biologijos technologijų, taikomų biologijos bei medicinos mokslų tyrimuose, medicinin÷je diagnostikoje bei teismo medicinos, praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika, leidžianti padauginti DNR fragmentus nuo pikograminių iki mikrograminių kiekių. Žurnalas “Science” 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu metų mokslo įvykiu. PGR metodo autoriui K.Mullisui (JAV) 1993 metais paskirta Nobelio premija.
Tai ypač tikslus, greitas ir jautrus metodas. Iki šiol nebuvo tokio metodo, kuriam reiktų tiek mažai tiriamosios medžiagos. PGR pakanka kelių ląstelių. Kitas metodo privalumas – didelis specifiškumas. Reakcijos sąlygos sumodeliuojamos taip, kad būtų dauginamas tik ieškomas DNR fragmentas. Didžiulis metodo jautrumas kelia ir problemų: reikia labai saugotis, kad į reakcijos mišinį nepatektų šalutin÷s DNR priemaišos. Tod÷l tyrimams ir laboratorijoms, kuriose taikomas šis metodas, keliami labai aukšti reikalavimai. Kad reakcija vyktų sklandžiai, reikia labai tiksliai parinkti reakcijos sąlygas (temperatūrą, koncentracijas, ciklų kiekį ir trukmę), visi reagentai turi būti itin aukšto išvalymo laipsnio.
kiekiui. Min÷ti tyrimai gali pasitarnauti ir DNR analiz÷je, kuri gali būti klonuojama, nustatoma jos pirmin÷ struktūra (nukleotidų seka) ir lyginama su pasaulin÷mis duomenų baz÷mis. Taip gali būti nustatomas ne tik atskirų patogenų genotipų specifiškumas, bet ir jų paplitimas, šeimininkų ratas bei funkcionavimo gamtoje ypatumai.
Yra žinoma daugyb÷ PGR metodo modifikacijų, kurios naudojamos eksperimentin÷je biologijoje, medicinoje, mikrobiologijoje bei kitose srityse. Šiuolaikiniai PGR metodai įgalina atlikti P GR reakciją i n situ (galimi akronimai: „PCR in situ hybridization“, „in-cell PCR“, „direct and indirect ISPCR“, „PCR-driven ISH“, „Localized in situ amplification“ ir kt.) – pvz., ląstelių kultūroje, audinyje, vienoje ląstel÷je. Šiuo metodu galima nustatyti, pvz., kuri ląstel÷ kultūroje yra infekuota virusu. Yra sukonstruoti specialūs PCR garsintuvai, atlikti in situ PGR reakcijas (ant objektinių stiklelių).
1.4.2 Daugin÷ PGR
Gausinimo reakcija, kurios metu padauginami ne vienas, o keletas DNR sekų yra vadinama daugine PGR (nuo angl. “multiplex PCR“). Tokio tipo PGR leidžia sutaupyti eksperimentinio darbo ir laiko sąnaudas, nes į reakcijos mišinį yra dedamos kelios ar keliolika pradmenų porų. Daugin÷ PGR pakankamai dažnai naudojama ir mokslin÷je, ir medicinin÷s diagnostikos praktikoje. Daugin÷s PGR eksperimentai reikalauja ypatingo d÷mesio reakcijos sąlygų optimizacijai. Tai pradmenų koncentracija, PGR buferio sud÷tis, magnio chlorido ir nuleozidtrifosfatų (dNTP) koncentracijų balansas, DNR m÷ginio ir termostabilių polimerazių
koncentracija bei gausinimo režimas. S÷kminga dauginių PGR optimizacija padidina reakcijos jautrumą, specifiškumą, netolygų analizuojamų sričių gausinimo efektyvumą. Mokslin÷je literatūroje galima rasti pakankamai daug informacijos apie dauginių PGR sistemų panaudojimą virusų, bakterijų ir kitų infekcijų suk÷l÷jų nustatymui
1.5 Bakterijų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms
Infekcin÷s ligos visais laikais k÷l÷ didelę gr÷smę žmonių ir gyvūnų sveikatai, taigi antimikrobinių medžiagų panaudojimas, tokių kaip penicilinas (1940 m.), tapo reikšmingu laim÷jimu medicinoje. Antimikrobin÷s medžiagos tur÷jo daugiau teigiamos įtakos žmonių ir gyvūnų sveikatai nei bet kuris kitas medicinos atradimas. Tačiau laikui b÷gant buvo pasteb÷ta, kad bakterijos tampa atsparios antimikrobin÷ms medžiagoms (Ružauskas ir kt., 2007).
Nekontroliuojamas antibiotikų vartojimas (žmon÷s) ir naudojimas (gyvūnai) laikomas svarbiausiu veiksniu, lemiančiu atsparių mikroorganizmų atsiradimą ir plitimą (Acar, Röstel, 2001; Anon, 2006 – 2; Burch, 2005; Moreno et al., 2000; Beržanskyt÷ ir kt., 2004). Prad÷jus gaminti masiškai, antibiotikai tapo prieinami ne tik žmonių, bet ir gyvūnų gydymui bei ligų profilaktikai. Bakterijos palaipsniui tapo vis dažniau atsparesn÷s masiškai naudojamiems antibiotikams, o ir neretai joms būdingas dauginis atsparumas. Pastaruoju metu naujų antibiotikų kūrimas jau tampa ekonomiškai nenaudingas, tod÷l ieškoma racionalių antibiotikų naudojimo būdų tikintis, kad bakterijos ilgainiui praras įgytą atsparumą ir v÷l taps jautrios (Ružauskas ir kt., 2009).
Nors bakterijų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimai Lietuvoje atliekami jau seniai, mikroorganizmų atsparumo situacija šalyje ir kiek situacija šalyje yra problemin÷ n÷ra gerai žinoma. Iki šiol atlikti bakterijų atsparumo tyrimų duomenys nebuvo sisteminami, o atskirų laboratorijų tyrimų rezultatai dažniausiai pateikti tik tiesiogiai suinteresuotam ūkiui. Nors šia tema šalyje ir paskelbta mokslinių publikacijų, jos yra labai negausios, o resultatų sklaida neužtikrina pakankamos informacijos rezultatams apibendrinti.
neabejotinos lyder÷s pagal mažiausią bakterijų atsparumą, tod÷l galima teigti, kad imanti reikiamų priemonių, šią aktualią amžiaus problemą galima sumažinti.
2. TYRIMŲ METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimų objektas
Tyrimams buvo renkami m÷giniai nuo kiaulių skerdenų skerdimo metu, kiaulių išmatų bei skerdyklos aplinkos (nuograndos nuo sienų ir grindų) m÷giniai.
2.2 M÷ginių pa÷mimas
M÷giniai tyrimams buvo surinkti 2009 metų geguž÷s – rugs÷jo m÷nesiais iš skerdyklos iš 7 kiaulių bandų. Iš viso surinkta 105 m÷giniai, iš kurių 70 išmatų m÷giniai (po 10 išmatų m÷ginių iš vienos fermos), 35 skerdenos m÷giniai (po 5 skerdenos m÷ginius iš vienos fermos). Iš kiekvienos fermos paimta po 15 m÷ginių. Vienas išmatų m÷ginys buvo sudaromas iš penkių skirtingų gardo vietų šviežių išmatų. Išmatų m÷giniai buvo imami su steriliu plastikiniu šaukšteliu po 1 g iš skirtingų 5 gardo vietų. Vienas išmatų m÷ginys sudar÷ 5 g. Laboratorijoje išmatų m÷giniai buvo atskiedžiami 45 ml PMB tirpale (fosfato buferinis druskos tirpalas su 1% manitolio ir 0,15% tulžies druskų koncentracija). Skerdenos m÷giniai buvo imami po veterinarin÷s apžiūros, prieš m÷sos atšaldymą. M÷giniai buvo renkami su 7.5 × 7.5-cm dydžio steriliu audiniu (marle), kuris buvo prisotintas 0,1 % peptoniniu vandeniu, perbraukiant per skerdenos paviršių. Audinys su marle buvo įd÷tas į butelius į kuriuos buvo įpilta 90ml PMB skysčio. Transportuojant pavyzdžiai buvo laikomi šaltai ir buvo pristatyti į laboratoriją tą pačią dieną.
2.3 Bakterijų kultūrų išskyrimas
Surinkti m÷giniai buvo tiriami Maisto saugos ir kokyb÷s katedros laboratarijoje, Veterinarijos Akademijoje, Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitete.
2.4 Polimeraz÷s grandin÷s reakcija
2.4.1 DNR paruošimas
Atrinktų numanomų jersinijų padermių DNR buvo išskirta naudojant virimo metodą su steriliu 0,9 % NaCl tirpalu.
DNR, naudajamos PGR reakcijoje, paruošimui 1 kilpel÷ bakterijų kultūros buvo išmaišoma 1 ml 0,9 % NaCl tirpalo. M÷gintuv÷lis su bakterijų suspensija buvo gerai išmaišomas ir centrifuguojamas 2 minutes (8000 apsisukimų). Po to viršutin÷ skysčio dalis m÷gintuv÷lyje buvo nupilta. Procedūra buvo pakartota du kartus. V÷liau į m÷gintuv÷lį buvo prid÷ta 200 µl 0,9 % NaCl tirpalo. Gauta suspensija buvo kaitinama 95ºC 10 minučių termomikseryje, v÷liau buvo atšaldyta ant ledo. Atšaldžius m÷gintuv÷lio turinys buvo labai gerai išmaišytas ir išcentrifuguotas 3 minutes (14000 apsisukimų). Susidaręs viršutinis skystis perpiltas į kitą m÷gintuv÷lį. Taip paruošta DNR nedelsiant buvo naudojama PGR reakcijoje arba laikoma -20ºC šaldiklyje iki panaudojimo.
Yersinia spp identifikavimui buvo panaudotas sud÷tingas PGR metodas aprašytas Thisted Lambertz ir Danielsson-Tham (2005) su nedideliais pakeitimais. Buvo panaudota trumpesn÷ 9A-ail geno seka-TTA TCA ATT GCG TCT GTT AAT GTG TA-ir 10A-ail geno seka-ATC GAG TTT GGA GTA TTC ATA TGA, AG. Taip pat vietoj Pr2A-yst ir Pr2c-yst genų sekų mes panaudojome pradmenis atitinkančius genus YeI-16SrRNA (-ATA CCG CAT AAC GTC TTC G-) ir YeII-16SrRNA (-TTC TTC TGC GAG TAA CGT C-).
PGR metodui reik÷jo 25 µl kiekio m÷ginio, turinčio savyje 10 X reakcijos buferio (MBI Fermentas), 25 mM magnio chlorido (MBI Fermentas), 10 mM dNTP (MBI Fermentas), 5 U/µl Taq DNR polymeraz÷s (MBI Fermentas), 5 oµM kiekvieno iš oligonukleotido (Sigma Genosys, JAV) ir 6,9 µl išskirto DNR. PGR buvo atliekamas su PTC – 100 aparatu (MJ Research Inc., JAV). Panaudota 30 ciklų programa:
94°C – 3 minut÷s; 94°C – 30 sekundžių; 55°C – 60 sekundžių; 72°C – 60 sekundžių; 72°C – 5 minut÷s.
Vision LE GQ agaroz÷s gelį (MBI Fermentas). Gelis įvertintas panaudojant UV šviesą (Novoslavskij ir kt., 2010).
2.4.2 Pradmenys, naudojami PGR reakcijoje
4 lentel÷ Pradmenys, panaudoti Y. enterocolitica identifikavimui Pradmuo Genas taikinys Y. enteroco litica O:3 Y. enterocolitica O:9,O:8,O:5,27 DNR fragmen to dydis (bp) 11A-virF 12A-virF pYV-Plasmid + + 700 Thisted Lambertz ir kt., (2005) 9A-ail 10A-ail ail Gen chrom. + + 454 Strauch ir kt., (2007) rfbCa rfbCb O3-Antigen chrom. + - 405 Weynants ir kt. (1996) Ypf-20210-wzz Ypf-20538-wzz wzz Gen chrom. - - 418 Bogdanovitch ir kt . (2003) Yel-16SrRNA Yell-16SrRNA 16Sr DNA chrom. + + 328 Arnold ir kt. (2004)
2.5 Yersinia enterocolitica atsparumo antibiotikams tyrimo darbo metodika
2.5.1 Terp÷s su skirtingomis antibiotikų koncentracijomis ruošimas
Terp÷s naudojamos mikroorganizmų jautrumui ir atsparumui antibiotikams tirti pagaminimas aprašytas Habib (2009). Terp÷s gaminimui naudojome Mueller-Hinton agarą (4 pav.).
Reikiamą Mueller-Hinton agaro miltelių kiekį apsiskaičiavome pagal triskaitę taisyklę, t.y., jei ant talpos su Mueller-Hinton agaru buvo parašyta, jog 1 litrui terp÷s pagaminti reikia 38g miltelių, tai 50ml terp÷s pagaminti reik÷jo:
X = (38,0gx50ml)/1000ml=1,9g
4 pav. Mueller-Hinton agaras
Reik÷jo paruošti trijų skirtingų antibiotiko koncentracijų bazinius tirpalus: 10.000µg/ml, 1000µg/ml ir 100µg/ml. Pradžioje reik÷jo apskaičiuoti, kiek antibiotiko mg reik÷s, kad gautume 10.000µg/ml koncentracijos bazinį tirpalą pagal formulę:
Antibiotiko svoris, mg=(Tūris,ml x Bazinio tirpalo koncentracija, µg/ml)/Antibiotiko grynumas,µg/mg Pvz., jei nor÷jome paruošti 2ml 10.000µg/ml bazinio antibiotiko tirpalo, antibiotiko grynumas yra 850µg/mg, tai antibiotiko reik÷jo X,mg:
X= (2ml x 10.000µg/ml)/ 850µg/mg = 23,53 mg
2.5.2 Praskiedimų ruošimas ir s÷jimas ant terp÷s su antibiotiku
Paruoš÷me vieną eilę (20vnt.) vienkartinių 1,5 ml talpos m÷gintuv÷lių, apačioje atitinkamai išd÷st÷me 2 eiles po 20 vienkartinių m÷gintuv÷lių. Sunumeravome kiekvieną eilę m÷gintuv÷lių nuo 1 iki 20. Į kiekvieną m÷gintuv÷lį, esantį pirmoje eil÷je įpyl÷me po 1 ml PBS (Phosphate buffered saline). Pa÷mus vieną l÷kštelę su išaugusiomis bakterijomis surinkome 10µl kilpele nuo jos tiek bakterijų, kad būtų užpildytas kilpel÷s spindis. Šias bakterijas su kilpele perneš÷me į pirmosios eil÷s m÷gintuv÷lį su 1ml PBS ir išmaiš÷me (panaudodami „Vortex“ maišytuvą). Į kiekvieną antrosios eil÷s m÷gintuv÷lį įpyl÷me po 0,9 ml PBS ir 0,1 ml tirpalo iš atitinkamai kiekvieno pirmosios eil÷s m÷gintuv÷lio. T.y. antrosios eil÷s kiekviename m÷gintuv÷lyje susidar÷ po 1 ml tirpalo, sumaiš÷me.
3. REZULTATAI
3.1 Yersinia enterocolitica paplitimas kiaulių bandose Lietuvoje
Ištyrus 105 m÷ginius, surinktus iš 7 kiaulių bandų, patogenin÷s Yersinia enterocolitica bakterijos aptiktos 19 m÷ginių. (5 lentel÷).
5 lentel÷. Yersinia enterocolitica teigiami m÷giniai
M÷ginys M÷ginių skaičius Skaičius (%) teigiamų Y.enterocolitica m÷ginių Išmatų m÷giniai 70 13 (19) Skerdenos m÷giniai 35 6 (17) Viso 105 19 (18)
Visos izoliuotos Y. enterocolitica paderm÷s buvo O:3 serotipo. Patogenin÷s Yersinia enterocolitica bakterijos aptiktos šešiose iš septynių tirtų kiaulių bandų.
Ištirtose bandose Y. enterocolitica paplitimas svyravo 0% - 70% išmatų ir 0% - 60% skerdenos m÷giniuose.
Daugiausiai teigiamų Y. enterocolitica padermių nustatyta B kiaulių bandoje. Šioje bandoje 3 teigiamos paderm÷s identifikuotos išmatose ir 2 teigiamos paderm÷s skerdenoje. Po 4 teigiamas Y. enterocolitica padermes nustatyta C ir D kiaulių bandose. A ir F kiaulių bandose atitinkamai nustatytos 2 ir 1 teigiama paderm÷. Nei vienos teigiamos Y. enterocolitica paderm÷s nenustatyta E kiaulių bandoje.
Dalis išskirtų Yersinia enterocolitica padermių (26) panaudotos tolimesniuose bakterijų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimuose.
3.2 Yersinia enterocolitica antimikrobinių medžiagų atsparumui tyrimo
rezultatai
Antimikrobinių medžiagų atsparumo tyrimui buvo atrinktos 39 Y.enterocolitica paderm÷s, iš jų 13 išskirtų nuo kiaulių skerdenų, 13 – iš kiaulių išmatų ir 13 jersinijų padermių buvo gauta iš Respublikin÷s tuberkulioz÷s ir infekcinių ligų universitetin÷s ligonin÷s (VšĮ Vilniaus universiteto ligonin÷s Santariškių klinikų filialas), kurios buvo išskirtos iš jersinijoze sergančių žmonių klinikinių m÷ginių. Buvo tiriamas Y. enterocolitica padermių atsparumas trijų antimikrobinių medžiagų atžvilgiu: tetraciklino, ciprofloksacino ir ampicilino. Buvo nustatyta šių medžiagų MSK (mažiausia paderm÷s augimą slopinanti koncentracija) ir tyrimo rezultatai interpretuoti remiantis Klinikinio laboratorinių standartų instituto (CLSI, 2002) standartu, nustatant klinikinį padermių jautrumą (6 lentel÷).
7 lentel÷. Yersinia enterocolitica epidemiologinio jautrumo ribin÷s reikšm÷s Antimikrobin÷ medžiaga MSK, mg/ L (CLSI, 2002m.) J V A Tetraciklinas 4 8 ≥16 Ciprofloksacinas ≤1 ≥2 Ampicilinas ≤8 16 ≥32
J – jautri; V – vidutiniškai jautri; A – atspari
Y. enterocolitica atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms tirtas nuo mažiausios 0,125 mg/L koncentracijos iki 128 mg/L koncentracijos. Trisdešimt dvejoms jersinijų paderm÷ms nustatyta tetraciklino MSK buvo 2 mg/L, keturioms paderm÷ms - 4 mg/L, o trims paderm÷ms – 32 mg/L. Dvidešimt šešioms jersinijų paderm÷ms nustatyta ciprofloksacino MSK buvo <0,125 mg/L , dvylikai padermių 0,25 mg/L ir vienai padermei 0,5 mg/L. Tyrimuose panaudojant ampiciliną visoms tirtoms trisdešimt devynioms paderm÷ms MSK viršijo 128 mg/L koncentraciją (7 lentel÷).
8 lentel÷. Yersinia enterocolitica MSK, panaudojant tris antimikrobines medžiagas Antimikrobin÷
medžiaga
Minimali stabdanti koncentracija (MSK), mg/L
<0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 >128
Tetraciklinas 32 4 3
Ciprofloksacinas 26 12 1
Ampicilinas 39
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P a d e rm ių k ie k is , % TE AMP CIP Antimikrobin÷ medžiaga
Jautri Vidutiniškai jautri Atspari
TE – tetraciklinas, AMP – ampicilinas, CIP – ciprofloksacinas
7 pav. Kliniškai atsparių, vidutiniškai jautrių ir jautrių Y. enterocolitica, išskirtų iš skerdenos, išmatų ir žmonių, kiekis (%).
0 2 4 6 8 10 12 P a d e rm ių s k a ič iu s 1 2 4 8 16 32 64 MSK, mg/L
Skerdena Išmatos Paderm÷s, išskirtos iš žmonių
0 2 4 6 8 10 12 14 P a d e rm ių s k a ič iu s 32 64 >128 MSK, mg/L
Skerdena Išmatos Paderm÷s, išskirtos iš žmonių
9 pav. Ampicilino MSK reikšmių pasiskirstymas priklausomai nuo Y. enterocolitica išskyrimo šaltinio 0 2 4 6 8 10 12 P a d e rm ių s k a ič iu s <0,125 0,25 0,5 1 MSK, mg/L
Skerdena Išmatos Paderm÷s, išskirtos iš žmonių
Tetraciklinui Y. enterocolitica paderm÷s, išskirtos tiek iš skerdenos tiek ir iš išmatų, buvo vienodai jautrios. 10 skerdenos ir 10 išmatų m÷ginių MSK buvo 2 mg/L, 2 skerdenos ir 2 išmatų m÷giniams MSK buvo 4 mg/L ir 1 skerdenos ir 1 išmatų m÷ginio MSK >128 mg/L. Iš žmonių išskirtų jersinijų padermių MSK pasiskirst÷ taip: 12 padermių MSK buvo 2 mg/L ir 1 padermei MSK buvo >128 mg/L. (11 pav.).
Iš visų trijų šaltinių išskirtos jersinijų paderm÷s, tiek iš skerdenos, išmatų, tiek ir iš žmonių, pasižym÷jo vienodai dideliu atsparumu ampicilinui, kai šio antibiotiko MSK buvo didesn÷ kaip 128 mg/L (12 pav.).
4. REZULTATŲ APTARIMAS
4.1 Yersinia enterocolitica paplitimo kiaulių bandose rezultatų aptarimas
Kiaulių fermose ir skerdyklose paimtų m÷ginių užkr÷stumas Y. enterocolitica bakterijomis svyravo nuo 0% iki 70% išmatų ir nuo 0% iki 60% skerdenų m÷giniuose. Palyginti su kitais atliktais tyrimais patogeniškų Y. enterocolitica mikroorganizmų paplitimas gali svvyruoti 35 % - 70 % bandose ir 4 % - 100 % individualiose kiaul÷se (Robins – Browne, 1997).
Šiame tyrime daugin÷s PGR metodas buvo panaudotas aptikti ir identifikuoti patogenin÷ms Yersinia spp. (Thisted Lambertz, Danielsson – Tham, 2005). Pasinaudojant protokolu identifikuotos trys patogeninių Yersinia spp. grup÷s:
a) patogenin÷s Y. enterocolitica O:3,
b) patogenin÷s Y. enterocolitica serogrup÷s kitos negu O:3.
Visos aptiktos ir identifikuotos Y. enterocolitica paderm÷s buvo priskirtos O:3 serotipui. Kitų patogeninių Y. enterocolitica serotipų tyrimo metu neaptikta. Verta pamin÷ti, kad daugiau kaip 90% žmonių jersinioz÷s susirgimų yra sukeliami būtent Y. enterocolitica O:3 serotipo (The EFSA Journal, 2010).
Atliktas tyrimas parod÷ palygintį didelį (17%) Y. enterocolitica paplitimą ant kiaulių skerdenoje. Kiaulių skerdenų užkr÷stumo jersinijomis priežastis gal÷jo būti kryžminis užteršimas skerdimo procesų metu. Skerdimo technika bei skerdimo higiena gal÷jo tur÷ti įtakos užteršimo lygiui (Andersen, 1988). Taip pat tyrimui panaudoti didelio ploto skerdenų m÷giniai (20 x 30 cm) lyginant su kitais tokias tyrimais (Simonova et al., 2007) ir d÷l šios piežasties gal÷jo būti toks didelis skaičius teigiamų Yersinia skerdenos m÷ginių.
Gauti tyrimų rezultatai atskleid÷ palyginti didelį Yersinia spp. bakterijų paplitimą kiaulių fermose, o taip pat ir kiaulių skerdenų užkr÷stumą šiomis bakterijomis, kai kiauli÷s skerdžiamos iš užkr÷stų fermų. Mūsų žiniomis, tokie Yersinia spp. bakterijų tyrimai susiję su kiaulienos gamybos grandine Lietuvoje nebuvo daryti. Remiantis mūsų tyrimo rezultatais galime teigti, kad labai svarbūs ir aktualūs yra tolimesni Yersinia spp. paplitimo tyrimai siekiant įvertinti kiaulienos vaidmenį žmonių susirgimų jersinioze epidemiologijoje.
4.2 Atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimo rezultatų aptarimas
Atlikus bakterijų jautrumo antibiotikams tyrimus nustatyta, kad visos tirtos paderm÷s buvo atsparios ampicilinui (MSK >128 mg/L). Panašius rezultatus paskelb÷ Šveicarijos mokslininkai, kuomet iš 386 ištirtų Y. enterocolitica padermių 360 buvo atsparios ampicilinui (Baumgartner et al., 2006).
Šalyse, kur gyvulininkyst÷s pramon÷ yra pakankamai išvystyta, gana sunku rasti bakterijų, kurios nebūtų tur÷jusios kontakto su antimikrobin÷mis medžiagomis ir pasižym÷tų natūraliu rūšiniu jautrumu. Ampicilinas, nors ir plataus spektro aminopenicilinų grup÷s antibiotikas, vis d÷lto n÷ra toks veiksmingas gramneigiamoms bakterijoms, kaip kad gramteigiamoms. Be to, aminopenicilinai tiek žmon÷ms, tiek ir gyvūnams gydyti labai plačiai naudojami jau seniai (Ružauskas, 2009). Kitų tyr÷jų duomenys patvirtina, kad bakterijų atsparumas gali vystytis palaipsniui, ypač tuomet, kai gyvūnai nedidelį kiekį antimikrobinių vaistų gauna su pašarais (Kim et al., 2005).
Atlikus tyrimą nustatyta, kad 92 % tirtų Y. enterocolitica padermių buvo jautrios tetraciklinui ir minimali stabdanti koncentracija buvo 2 – 4 mg/L. Čekijoje (Simonova et al., 2008) atlikti tyrimai parod÷ panašius rezultatus. Jautrumas tetraciklinui siek÷ 80, 26 %, minimali stabdanti koncentracija – 1 – 4 mg/L. Žemesn÷ tetraciklino minimali stabdanti koncentracija gal÷jo būti d÷l fakto, kad tetraciklimas yra kaip alternatyva kiaulių klinikinio gastrito gydyme ir yra retai naudojamas (Simonova et al., 2008).
Taip pat tyrimas parod÷, kad visos ištirtos paderm÷s, nepriklausomai nuo išskyrimo šaltinio, buvo jautrios ciprofloksacinui, o minimali stabdanti koncentracija svyravo <0,125 – 0,5 mg/L ribose. Šveicarijoje Y. enterocolitica atsparumo ciprofloksacinui tyrimai parod÷ panašius kaip ir mūsų tyrimo rezultatus. Nei viena tirta paderm÷ nebuvo atspari ciprofloksacinui (Baumgartner et al., 2006).
IŠVADOS
1. Tyrimo metu nustatyta, kad Lietuvoje išaugintų kiaulių skerdenos užterštumas Yersinia enterocolitica yra 17 proc., išmatų užterštumas – 19 proc. Aukštas Yersinia enterocolitica paplitimas kiaulių skerdenose ir išmatose gali būti svarbus patogenų užsikr÷timo šaltinis žmon÷ms, ypač nesilaikant terminio apdorojimo reikalavimų, bei higienos taisyklių.
2. Visos 19 Yersinia enterocolitica paderm÷s priklaus÷ serotipui O:3, kuris dažniausiai nustatomas jersinioze sergančių žmonių klinikiniuose m÷giniuose.
PASIŪLYMAI
1. Siekiant geriau išsiaiškinti Y. etnerocolitica atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms vystymosi šalyje tendencijas ir d÷sningumus, reikalingi tolimesni moksliniai tyrimai, o taip pat turi būti prad÷ta formuoti antimikrobinių vaistų panaudojimo politika šalies mastu.
PADöKA
LITERATŪRA
1. Andreoletti O., Budka H., Buncic C., Colin P., Collins D., De Koeijer A., Griffin J., Havelaar A., Hope J., Klein G., Kruse H., Magnino S., López A. S., McLauchlin J., Nguyen – The Ch., Noeckler K., Noerrung B., Maradona M. P., Roberts T., Vågsholm I., Vavopdenbosch E. Monitoring and identification of human enterophatogenic Yersinia spp. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards. 2007. The EFSA Journal. 595. P 1 – 30.
2. Acar J., Röstel B. Antimicrobial resistance: an overview. Scientific and Technical Review of the OIE. 2001. T. 20. P. 797 – 810.
3. Ambrasien÷ D. Naujausių mokslinių pasiekimų biotechnologijos srityje mokslin÷ studija. http://molbio.vdu.lt/medziaga/Ambrasiene/AMBRASIENE-projektas%202007%2007%2023.pdf. Prieiga per internetą 2011 01 19.
4. Andersen J. K. Contamination of freshly slaughtered pig carcasses with human pathogenic Yersinia enterocolitica. Int. J. Food Microbiol. 1988. Vol. 7 (3). P 193 – 202.
5. Anon.: EFSA. 2004 Report on Zoonoses, zoonotic agents and antimicrobial resistance in EU. 2006 – 2.
6. Arnold T., Neubauer H., Nikolaou K., Roesler U., Hensel A. Identification of Yersinia enterocolitica in Minced Meat: A Comparative Analysis of API 20E, Yersinia Identification Kit and a 16S rRNA-based PCR Method. J. Vet. Med. 2004. Vol. 51. P. 23–27.
7. Baumgartner A., Küffer M., Suter D., Jemmi T., Rohner P. Antimicrobial resistance of Yersinia enterocolitica strains from human patients, pigs and retail pork in Switzerland. International Journal of Food Microbiology. 2006. 115. 110 – 114.
8. Beržanskyt÷ A., Šakelyt÷ R., Valint÷lien÷ R. Lietuvos gyventojų savigyda antibiotikais. Visuomen÷s sveikata. 2004. T. 4. P. 25 – 27.
9. Bogdanovich T., Carniel E., Fukushima H., Skurnik M. Use of O-antigen gene cluster-specific PCRs for the identification and O-genotyping of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis. J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41(11). P. 5103–12.
10. Bottone E. J. Yersinia Enterocolitica: overview and epidemiologic correlates.Microbes and Infections. 1999. 1. P 323 – 333.
11. Burch D. Problems of antibiotic resistance in the United Kingdom. In practise. 2005. T. 27. P. 37 – 43.
12. Conly J. M. Antimicrobial resistance – Judicious use in the key. Canadian Journal of Infectious Diseases and Medicine Microbiology. 2004. T. 15. P. 249 – 251.
14. Habib I., Miller W.G., Uyttendaele M., Houf K., Zutter L. Clonal population structure and antimicrobial resistance of Campylobacter jejuni in chiken meat from Belgium. American society for microbiology. 2009. Vol. 75. No. 13.
15.http://www.britannica.com/EBchecked/media/117302/Photomicrograph-of-Gram-stain-of-Yersinia-enterocolitica-the-causative-agent prieiga per internetą 2010 08 08.
16. http://www.ulac.lt/downloads/ulac6_small.pdf prieiga per internetą 2011 01 28. 17. http://www.ulac.lt/uligos.php?pl=13&ppl=32 prieiga per internetą 2011 01 28.
18. Kim L. M., Gray J. T., Harmon B. G., Jones R. D., Fedorka – Cray P. J. Susceptibility of Escherichia coli from growing piglets receiving antimicrobial feed additives. Foodborne Pathogens and Didease. 2005. T. 2. P. 304 – 316.
19. Lake R., Hudson A., Cressey P. Risk profile: Yersinia Enterocolitica in pork. A Crown Research institute. 2004. P 1 – 48.
20. Masteikien÷ R. R. Maisto produktų mikrobiologija. Kaunas. Technologija. 2002. 511.
21. Monnet D. L. Monitoring Antimicrobial Consumption in Denmark and Europe. Seminaras „Kova su antimikrobiniu atsparumu Europoje ir perspektyvos Lietuvoje“. Trakai, 2005 m. kovo 18d.
22. Moreno M. A., Dominguez L., Teshager T., Herrero I. A., Porrero M. C. Antibiotic resistance monitoring: the Spanish programme. The VAV Network. International Journal or Antimicrobial Agents. 2000. T. 14. P. 285 – 290.
23. Niskanen T., Laukkanen R., Fredriksson – Ahomaa M. and Korkeala H. Distribution of virF/lcrF – positive Yersinia pseudotuberculiosis Serotype O:3 at Farm Level. Zoonoses Public Health. 2008. Vol. 55. P. 214 – 221.
24. Novoslavskij A., Kabašinskien÷ A., Korkeala H., Malakauskas M. Prevalence of Yersinia Enterocolitica and Yersinia Pseudotuberculosis in slaughtered pigs within 5 months period in Lithuania. Veterinarija ir Zootechnika. Kaunas. 2010. T. 51 (73). P 30 – 35.
25. Orden J. A., Ruiz – Santa – Quiteria J. A., Cid D., Diez R., Martinez S., de la Fuente R. Quinolone Resistance in potentially pathogenic and non – pathogenic Esherichia coli strains isolated from healthy ruminants. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2001. T. 48. P. 421 – 424.
28. Robins – Browne R. M. Yersinia enterocolitica. 1997. P. 192 – 215. In Doyle M. P., Beuchat L. R. and Montville T. J. (ed), Food microbiology: fundamentals and frontiers. ASM Press, Washington, D.C.
29. Ružauskas M., Butrimait÷ – Ambrozevičien÷ Č., Kiudulas V. Patogeninių Escherichia coli bakterijų paplitimas Lietuvos kiaulių fermose. Veterinarija. 2002. ISNN. 1392 – 0200. Žem÷s ūkio mokslai. Nr. 4.
30. Ružauskas M., Pavilonis A., Šiugždinien÷ R., Sužied÷lien÷ E., Šeputinen÷ V., Virgailis M., Špakauskas V., Daugelavičius R. Iš žmonių ir gyvūnų išskirtų Escherichia Coli jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms palyginamasis įvertinimas. Veterinarija ir zootechnika. Kaunas. 2009. T. 48 (70). P 57 – 64.
31. Ružauskas M., Sužiedelien÷ E., Šepurien÷ V., Virgailis M., Šiugždinien÷ R., Daugelavičius R. Gyvūnin÷s kilm÷s E. Coli rūšies bakterijų fenotipinis atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms. Veterinarija ir zootechnika. Kaunas. 2007. T. 38 (60). P 61 – 67.
32. Scientific Report of EFSA on Technical specifications for harmonised national surveys on Yersinia enterocolitica in slaughter pigs. The EFSA Journal. 2009. 7 (11): 1374.
33. Simonova J., Borilova G and Steinhauserova I. Occurence of pathogenic strains of Yersinia Enterocolitica in pigs and their antimicrobial resistance. Bull. Vet. Inst. Pulawy. 2008. Vol. 52. P. 39 – 43.
34. Simonova J., Vázlerova M., Steinhauserova I. Detection of pathogenic Yersinia enterocolitica serotype O:3 by biochemical, serological, and PCR methods. Czech J. Food Sci. 2007. Vol. 25. P. 214 – 220.
35. The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents in the European Union in 2007, The EFSA Journal 2009, 223.
36. The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents in the European Union in 2008. The EFSA Journal. 2010. Vol. 1496.
37. Thisted Lambertz S., Danielsson – Tham M. – L. Identification and characterization ot pathogenic Yersinia Enterocolitica isolates by PCR anp Pulsed – Field gel electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71 (7). P. 3674 – 3681.
38. Tüll P. J. WHO-Euro and antimicrobial resistance. Seminaras „Kova su antimikrobiniu atsparumu Europoje ir perspektyvos Lietuvoje“.Trakai, 2005 m. kovo 18 d.
