LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
IEVA GUDŢINSKAITĖ
LIETUVOJE AUGINAMŲ STAMBIAUOGIŲ SPANGUOLIŲ (VACCINIUM MACROCARPON AITON) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖS IR KIEKINĖS SUDĖTIES
ĮVAIRAVIMO TYRIMAS Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof.habil. dr. V. Janulis
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAI IR UŢDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10
1.1. Stambiauogių spanguolių Vaccinium macrocarpon Aiton (Ericaceae) paplitimas ir morfologiniai poţymiai. ... 10
1.2. Spanguolių vaisių fitocheminės sudėties tyrimai ... 12
1.3. Spanguolių vaisių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai ... 13
1.4. Antocianinų kokybinės ir kiekinės analizės metodai... 16
1.5. Spanguolių vaisių ir jų preparatų panaudojimas ... 18
1.6. Literatūros apţvalgos apibendrinimas ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 22
2.1. Tyrimo objektas ... 22
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 22
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ... 22
2.4. Tiriamųjų spanguolių ėminių paruošimas ... 23
2.5. Tyrimo metodai ... 24
2.5.1. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 24
2.5.2. Bendro antocianinų kiekio nustatymas ... 24
2.5.3. Bendro fenolinių jungini kiekio nustatymas ... 26
2.5.4. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas ... 26
2.5.5. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu ... 27
2.5.6. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas TFPH radikalų-katijonų surišimo metodu ... 28
2.5.7. Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP metodu ... 28
2.5.8. Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas CUPRAC metodu ... 29
2.5.9. Antioksidacinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas ... 29
2.6. Tyrimo duomenų analizė ... 30
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
3.1. Spanguolių vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 32
3.2. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas spanguolių vaisių ėminiuose ... 34
3.3. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas spanguolių vaisių ėminiuose ... 34
3.4. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas spanguolių vaisių ėminiuose... 35
3.5. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas stambiajuogių spanguolių vaisių ėminiuose ... 36
3.6. Stambiauogių spanguolių vaisių ėminių ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro nustatymas ... 37
3.7. Stambiauogių spanguolių vaisių ėminių kiekinės sudėties ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro koreliacinių ryšių įvertinimas ... 39
3.8. Stambiauogių spanguolių vaisių ėminių antocianinų kokybės ir kiekinės sudėties nustatymas ESC metodu ... 41
3.9. Stambiauogių spanguolių vaisių ėminių antocianinų kokybės ir kiekinės sudėties nustatymas UPLC-masių spektrometrijos metodu ... 44
3.10. Rezultatų apibendrinimas ... 47
4. IŠVADOS ... 49
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 52
SANTRAUKA
I. Gudţinskaitės magistro baigiamasis darbas / mokslinis vadovas Prof. habil. dr. V. Janulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Aiton) vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimo tyrimas.
Tyrimo objektas ir metodai: tirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų skirtingų veislių ('Baiwfay', 'Bergman', 'Bain', 'Drever', 'Holliston', 'Pilgrim', 'Searles', 'Woolman') spanguolių vaisių ėminiai. Kokybinė ir kiekinė spanguolių vaisių ėminių sudėties analizė atlikta taikant ESC ir UESC metodus.
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje auginamų spanguolių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti jų ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Darbo uţdaviniai: nustatyti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Aiton) vaisių ėminių antocianinų tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas. Ištirti skirtingų veislių stambiauogių spanguolių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinę sudėtį. Nustatyti skirtingų stambiauogių spanguolių veislių vaisių ėminių etanolinių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro. ESC metodu nustatyti skirtingų stambiauogių spanguolių veislių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp spanguolių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro. UESC–MS metodu nustatyti skirtingų stambiauogių spanguolių veislių vaisių ėminių kokybinę ir kiekinę sudėti.
Tyrimo rezultatai ir išvados: atlikus tyrimus nustatyta, kad tinkamiausios ekstrakcijos sąlgos: ekstrakcijos laikas – 40 min, etanolio koncentracija – 70 proc. (v/v), ultragarso vonelės galia 452W. Didţiausias nustatytas suminis kiekis: antocianinų 8,54±0,04 mg/g (p<0,05), flavonoidų 5,34±0,026 mg RE/g (p<0,05), fenolinių junginių 18,06±0,15 mg/g (p<0,05), proantocianidinų 10,55±0,26 mg EE/g (p<0,05). Atlikus antioksidacinio aktyvumo in vitro tyrimus, stipriausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas: ABTS metodu 'Baiwfay' veislės ėminių ištraukose (193,63±1,3 µmol TE/g), TFPH metodu 'Drever' veislės ėminių ištraukose (125,65±2,79 µmol TE/g). Stipriausias redukcinis aktyvumas nustatytas: FRAP metodu 'Bergman' veislės ėminių ištraukose (41,87±0,18 µmol TE/g), CUPRAC metodu 'Baiwfay' veislės ėminių ištraukose (493,86±21,33 µmol TE/g). Atlikus vaisių ėminių analizę ESC metodu, identifikuoti 16 junginių, tarp kurių dominavo malvidin-3-O-arabinozidas. Atlikus vaisių ėminių ištraukų analizę UESC metodu nustatyta, kad didţiausias suminis flavonolių grupės junginių kiekis (370,38±12,07
mg/g) nustatytas 'Searles' veislės ėminių ekstraktuose. Didţiausias suminis identifikuotų ir kiekiškai įvertintų junginių kiekis (519,53±25,12 mg/g) nustatytas 'Searles' veislės ėminiuos.
SUMMARY
The title of the master thesis: Qualitative and quantitative composition variability of phenolic compounds in American cranberry (Vaccinium macrocarpon Aiton) fruits grown in Lithuania
The object and methods of the research: the samples of fruits of cranberry cultivars, grown in Lithuania ('Baiwfay', 'Bergman', 'Bain', 'Drever', 'Holliston', 'Pilgrim', 'Searles', 'Woolman'), qualitative and quantitative composition variability was investigated, using HPLC and UHPLC methods.
The aim of the research: to determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds of fruits of cranberry, which was grow in Lithuania and to evaluate the antioxidant activity in vitro of their extracts.
The objectives of the research: to determine the extraction conditions of anthocyanins from the samples of fruits of American cranberry. To determine the quantitative composition of phenolic compounds in different cultivars of American cranberry. To determine the antioxidant activity in vitro in the samples of different cranberry cultivars. To determine the qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in different cultivar samples of American cranberry fruits by HPLC methodology. To evaluate correlation between cranberry fruit extract containing quantitative composition of total phenolic compounds and the antioxidant activity in vitro. To determine the qualitative and quantitative composition in different cultivar samples of American cranberry fruits by UHPLC methodology.
The results and conclusions of the research: the best extraction conditions for anthocianins were determined to be when extraction time is 40 min, ethanol concentration is 70%, ultrasovic bath power is 452W. The highest determined total amount of: anthocianins was 8,54±0,04 mg/g (p<0,05), flavonoids 5,34±0,026mg RE/g (p<0,05), phenolic compounds 18,06±0,15mg/g (p<0,05), proanthocianidins 10,55±0,26 mg EE/g (p<0,05). The strongest antioxidant activity determinated by ABTS method was in 'Baiwfay' cultivar (193,63±1,3 µmol TE/g), by TFPH method in 'Drever' cultivar (125,65±2,79 µmol TE/g), by FRAP method in 'Bergman' cultivar (41,87±0,18 µmol TE/g), by CUPRAC method in 'Baiwfay'cultivar (493,86±21,33 µmol TE/g). 16 componds have been determined by HPLC method in witch malvidin-3-O-arabinoside was the dominant one. Using UHPLC method was determined, that the highest total amount of flavonol group was found in 'Searles' cultivar (370,38±12,07 mg/g).
SANTRUMPOS
COX-1 – ciklooksigenazė-1; COX-2 – ciklooksigenazė-2; DC – dujų chromatografija;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; UESC – ultra efektyvioji skysčių chromatografija;
UV/VIS – ultravioletinės ir regimosios šviesos detektorius. ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); CV – variacijos koeficientas (coefficient of variation)
CUPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (Cupric ion reducing antioxidant capacity); DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas;
EE – (-)-epikatechino ekvivalentas
FRAP – geleţies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (Ferric reducing antioxidant power); GRE – galo rūgšties ekvivalentas;
TE – trolokso ekvivalentas;
TFPH – trifluorperazino dihidrochloridas; TPTZ – 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazinas; MS – masių spektrometrija;
APCI – atmosferos slėgio cheminė jonizacija (Atmospheric pressure chemical ionization); FAB – greitos atomų bombordacijos metodas (Fast atom bombardment);
VCAM-1 – kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulė 1(vascular cell adhesion molecule 1); ICAM-1 – intaceliulinė adhezijos molekulė-1(Intercellular Adhesion Molecule 1);
ĮVADAS
Augalinių vaistinių preparatų ir maisto papildų vartojimas per pastaruosius tris dešimtmečius ţenkliai išaugo, daugiau nei 80 proc. ţmonių pasauliniu mastu pasikliauja augalinių vaistinių preparatų veiksmingumu pirminėje sveikatos prieţiūroje [79]. Pasaulio sveikatos organizacijos teigimu, tradicinė medicina yra svarbi ir daţnai nuvertinama svaikatos prieţiūros dalis. 2013 m. priimtas dokumentas reglamentuoja tradicinės medicinos vartojimo strategiją 2014–2023 metams. Šios strategijos tikslas padėti šalims narėms išnaudoti tradicinės medicinos potencialų teigiamą indėlį ligų profilaktikoje ir gydyme bei skatinti saugų ir efektyvų tradicinės medicinos naudojimą [78].
Augalinėse vaistinėse ţaliavose yra nustatyta didelė įvairovė biologiškai aktyvių medţiagų. Spanguolių vaisiuose nustatyta organinių rūgščių (citrinų ir chinino), fenolinių rūgščių (chlorogeno ar p-kumaro), flavonoidų (miricetino ir kvercitino gliukozidai) [5]. Viena iš vyraujančių fenolinių junginių grupių yra antocianinai, kurie pastaruoju metu susilaukė didėjančio susidomėjimo dėl panaudojimo maisto pramonėje, neturinčio neigiamo poveikio organizmui [3]. Antocianinai yra vaisių ir darţovių sudedamoji dalis, kuri joms suteikia spalvų įvairovę. Identifikuota daugiau nei 635 antocianinų [4]. Nepaisant didelio antocianinų panaudojimo potencialo, farmacijos ir kosmetikos pramonės šakos intensyviai atlieka naujus tyrimus, ieškant būdų išlaikyti jų stabilumą ir padidinti ekstrakcijos išeigą [3].
Spanguolių vaisiuose nustatyti antocianinai, proantocianidinai, flavonoidai ir kiti fenoliniai junginiai. Tai viena vertingiausių uogų mūsų klimato zonoje. Vaistinė augalinė ţaliava: švieţi arba dţiovinti prinokę stambiauogių spanguolių vaisiai [5]. Medicinos praktikoje spanguolių vaisiai naudojami, kaip profilaktinė ir gydomoji priemonė šlapimo sistemos trakto uţdegimams. Spanguolių sultys, koncentruoti milteliai ar kapsulinės farmacinės formos gali uţkirsti kelią ir gydyti šlapimo takų infekcinius susirgimus. Fenoliniai junginiai yra plačiai paplitę gamtiniai antioksidantai [36], pasiţymintys įvairiapusiu biologiniu poveikiu ţmogaus organizmui [14], todėl vertinga atlikti spanguolių vaisių tyrimus.
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių vaisių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą ir įvertinti ėminių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
Darbo uţdaviniai:
1. Nustatyti Lietuvoje auginamų stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Aiton) vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygas.
2. Ištirti skirtingų veislių stambiauogių spanguolių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekinę sudėtį, UV–
regimosios šviesos spektrofotometrijos metodu.
3. Nustatyti skirtingų veislių stambiauogių spanguolių vaisių ėminių etanolinių ištraukų antioksidacinį aktyvumą in vitro.
4. ESC metodu nustatyti skirtingų veislių stambiauogių spanguolių vaisių ėminių antocianinų kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą.
5. UESC–MS metodu nustatyti skirtingų veislių stambiauogių spanguolių vaisių ėminių kokybinę ir kiekinę sudėtį.
6. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp spanguolių vaisių ėminių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo in vitro
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Aiton) paplitimas ir
morfologiniai poţymiai.
Karalystė: Augalai (Plantae)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Dilenijaţiedţiai (Dilleniidae) Šeima: Erikiniai (Ericaceae Juss) Gentis: Šilauogė (Vaccinium L.)
Rūšis: Stambiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpon Aiton) [53].
Spanguolės yra pelkių augalai. Lietuvoje natūraliai auga tik dvi jų rūšys, tai paprastoji spanguolė (Vaccinium oxycoccus L.) ir smulkiauogė spanguolė (Vaccinium microcarpum Turcz. ex Rupr.) [14]. Stambiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpon Aiton) yra kilusi ir natūraliai auga tik Šiaurės Amerikoje [5] ir rytinėse Kanados dalyse [13]. Spanguolynai veši ten, kur yra rūgštus dirvoţemis, gruntinio vandens lygis apie 30–60 cm, o viršutinis dirvos sluoksnis gerai vėdinamas, vėjas tik kartais uţneša smėlį, o ledas ir sniegas neleidţia augalams nušalti, augimo vieta turi būti saulėta [14]. Stambiauogės spanguolės gali būti randamos Arkanzaso kalnų regionuose, Ilinojaus, Šiaurės Karolinos ir Ohajo teritorijose, pelkėse, esančiose šiaurės rytų Jungtinių Amerikos Valstijų ir Didţiųjų eţerų regionuose [13]. Daugiau nei 90 proc. stambiauogių spanguolių vaisių viso pasaulio produkcijos yra uţauginama Jungtinių Amerikos Valstijų šiaurinėje dalyje ir Kanadoje, maţesnę produkcijos dalį sudaro Čilėje ir kitose šalyse uţauginti vaisiai [10].
Stambiauogė spanguolė yra daugiametis visţalis tvirtas krūmas, kuris gali augti iki 15 cm. aukščio, turintis šakniastiebius [5]. Augalo stiebas plonas ir gali būti su plaukeliais, tačiau tvirtesnis ir storesnis, nei Lietuvoje augančių spanguolės rūšių [14]. Stiebas gali būti dviejų rūšių: šliauţiantis (horizontalus) ir status (vertikalus) [14]. Šliauţiantys stiebai pasirodo jau pirmaisiais augimo metais iš viršūnių ar lapų paţastyse esančių pumpurų. Jie sparčiai auga (metinis prieaugis siekia nuo 20 iki 80 cm), greitai įsišaknija ir padengia krūmo augimo ploto paviršių [14]. Jie gali uţaugti iki 2 m. ilgio [13]. Statūs
stiebai išauga iš šliauţiančių ūglių lapų paţastinių pumpurų [14] ir gali uţaugti iki 715 cm bei sukrauti ţiedus, o vėliau vaisius [13].
Šaknys plonos, 1015 cm ilgio, lengvai išaugančios bet kurioje stiebo vietoje, jei ten uţtenka drėgmės [14]. Lapai paprasti [5], standūs, blizgantys [14], praţanginiai, bekočiai, siaurai elipsiniai, retai pailgos [5] ar ovalios formos [14], (5–) 710 (–18) mm ilgio ir (2–) 34 (–5) mm pločio su apvalėjančia viršūne [5], odiški, viršutinis paviršius ţalias, apatinis paviršinis blausus, aptrauktas apnašomis [5], kraštai šiek tiek lankstyti [13]. Jauni lapai šviesiai ţali, visiškai išsivystę yra tamsiai ţali, o rudenį po šalnų nusidaţantys tamsiai raudona spalva, kuri išlieka iki pavasario [14].
Stačiųjų ūglių viršūnėse antrojoje vasaros pusėje susiformuoja ţiediniai pumpurai, iš kurių geguţės mėnesį išauga jauni ūgliai su 215 ţiedų kekėmis. Spanguolės ţydi nuo birţelio vidurio iki liepos antrosios pusės, nors pavienių ţiedų pasitaiko ir rugpjūčio pradţioje [14]. Ţiedai yra blyškiai rausvos spalvos, beveik balti, su 610 mm. ilgio ţiedlapiais ir ţydi ţiedynuose, kuriuos sudaro nuo 2 iki 15 ţiedų [13].
Vaisius yra stambi uoga 920 mm skersmens, raudonos ar tamsiai burgundiškos, kartais beveik juodos spalvos [5]. Skonis rūgštus, minkštimas sausesnis uţ mūsų pelkėse augančių spanguolių [14]. Stambiauogių spanguolių vaisių spalva, dydis ir forma priklauso nuo veislės. Vaisiai prinoksta rugsėjospalio mėnesį [14].
Stambiauogių spanguolių vaistinė augalinė ţaliava daţniausiai yra dţiovinti jų vaisiai. Dţiovinti spanguolių vaisiai yra nuo tamsiai raudonos iki beveik juodos spalvos 7,011,5 mm pločio ir 1015 mm ilgio su švelniu, bet giliai raukšlėtu ir šiek tiek blizgiu paviršiumi. Vaisiaus pagrinde yra maţas randas, kur uoga buvo prisitvirtinusi prie stiebelio. Vaisių skerspjūvyje matyti, kad vaisiai yra suskirstyti į 4 kameras. Kameros yra atskirtos raudona, plona, permatoma septa ir kiekvienoje kameroje yra 15 sėklų. Kiekviena sėkla yra siaurai kiaušiniška su aštria viršūne, 12,7 mm ilgio ir vidutiniškai 1 mm pločio su nepermatomu baltu endospermu [5]. Vaisiaus egzokarpį sudaro antocianinų spalvos daugiakampės ląstelės su stora kutikule. Ląstelių grupės yra atskirtos gana stora, bespalve sienele. Mezokarpį sudaro didelės, sferinės, plonasienės ląstelės kuriose yra spiraliai susukti indai. Sėklų epidermį sudaro radialiai pailgos stačiakampės ląstelės, uţpildytos gleivėmis. Sienelės yra sutvirtintos U formos, storiausia siena yra išorinė. Uţ epidermio yra keletas daugiakampių ląstelių sluoksnių su stora, ruda, retkarčiais sustorėjusia sienele. Šios ląstelės yra 250350 m ilgio ir 80 m skersmens. Vidaus sluoksnis yra sudarytas iš suspaustų,
stačiakampių ląstelių su išilginėmis sienelėmis. Endospermas sudarytas iš maţų daugiakampių ir aliejaus turinčių ląstelių [5].
Per beveik 200 metų iš gamtoje augančių geriausių laukinių spanguolių formų, jas tarpusavyje kryţminant, išvesta apie 200 stambiauogių spanguolių veislių, tačiau pasaulyje populiariausios ir plantacijose plačiai auginamos tik kelios. Minimos ankstyvosios veislės yra tokios kaip: 'Early Black', 'Ben Lear', 'Black Veil', 'Le Munyon', 'Early Richard', 'Washington', 'Franklin', 'Bergman'. Vidutinio vėlyvumo: 'Howes', 'Stevens', 'Searles', 'Crowley'. Vėlyvosios veislės: 'Pilgrim' ir 'Beckwith'. Lietuvos valstybinis augalų veislių tyrimo centras patvirtina, kad veislės 'Ben lear', 'Pilgrim', 'Black Veil', 'Washington' ir 'Stevens' yra tinkamiausios auginti Lietuvos klimato sąlygomis [14].
1.2. Spanguolių vaisių fitocheminės sudėties tyrimai
Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos pateikiamais duomenimis stambiauogių spanguolių (Vaccinium macrocarpon Aiton) vaisių sudėtyje nustatytos organinės rūgštys: citrinų, chino rūgštys, obuolių, vyno, oksalo ir fumaro [10]; fenolinės rūgštys (chlorogeno ir p-kumaro) [5]. Vaisiuose nustatytos benzoinė, hidroksicinamono ir elago rūgštys [7]. Mokslinių tyrimų duomenimis, rūgščių koncentracija epidermyje ir audiniuose po juo yra didesnė nei audiniuose, kurie sudaro centrinę vaisiaus dalį [10]. Stambiauogių spanguolių vaisiuose nustatyta iki 10 proc. taninų, flavonolių (kvercetino, hiperozido, kemferolio, kemferolio-3-gliukozido, miricetino), flavan-3-olių ((+)-katechino ir (-)-epikatechino) [10]. Vyraujantys flavonoidai yra miricetino ir kvercetino glikozidai. Vieni iš svarbesnių biologiškai aktyvių junginių yra antocianinai. Cianidinas ir peonidinas yra nustatyti aglikonų pavidale. Antocianinų glikozidų cukrinę dalį sudaro gliukozė, arabinozė ir galaktozė. Cukrai daţniausiai prie aglikono jungiasi prie trečio anglies atomo [5]. Antocianinai yra labiausiai paplitusių gamtoje pigmentų grupė. Nustatyta 18 skirtingų antocianidinų ir 1520 kartų daugiau antocianinų [14]. Stambiauogių spanguolių vaisiuose vyraujantys antocianinai yra peonidin-3-O- galaktozidas, cianidin-3- galaktozidas ir cianidin-3-arabinozidas [14].
Spanguolių vaisiuose nustatytas retinolis [77], filochinonas, niacinas [14], askorbo rūgštis (46,9857,83 mg/100 g) [8], tokoferolis (1,561,50 mg/100 g), tiaminas (0,320,27 mg/100 g), riboflavinas (0,230,40 mg/100 g) ir piridoksinas [9], folio rūgštis [10], amino rūgštys [9]. Stambiauogių spanguolių vaisiuose nustatyti cukrai: gliukozė (7482 proc.), fruktozė (1624 proc.) ir maţi kiekiai sacharozės (<0,4 proc.) [12]. Vaisiuose nustatyta nedidelis riebalų kiekis, celiuliozės, hemiceliuliozės ir pektinų [10].
Atlikus stambiauogių spanguolių cheminės sudėties tyrimus nustatyta įvairių makro ir mikroelementų: fosforo (14 mg/100 g), kalio (2430 mg/100 g), kalcio (35 mg/100 g), magnio (37 mg/100 g), geleţies (0,160,40 mg/100 g), natrio (46 mg/100 g), aliuminio, cinko (0,02–0,04 mg/100 g), mangano (0,3–0,10 mg/100 g), azoto (10,4–65,0mg/100g) , vario (0,13–0,20 mg/100g)[11] ir jodo [14]. Makro ir mikroelementai svarbūs ţmogaus organizmui: kaulams, dantims, raumenims, hormonų funkcijoms, elektrolitų balansui, deguonies pasisavinimui [11]. Nustatyti nedideli kiekiai eterinio aliejaus, kurį sudaro 68 junginiai: α-terpineolis, cineolis, karvakrolis, limonenas, linalolis, kaurenas, pimaradienas ir manoiloksidas [13].
1.3. Spanguoliųvaisių fenolinių junginių ekstrakcijos metodai
Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija yra vienas svarbiausių etapų, norint kuo efektyviau išskirti norimus junginius iš augalinės ţaliavos [41]. Nors ekstrakcijos metodų yra daug, pasirinkti tinkamiausią būdą norimai medţiagai gauti yra sunku. Kai kurie fenoliniai junginiai, ypač antocianinai, yra labilios medţiagos, kurios yra jautrios pH, UV spinduliams ir temperatūros pokyčiams [41].
Fenolinių junginių ekstrakcija gali būti vykdoma iš švieţių, šaldytų ir dţiovintų augalinių ţaliavų mėginių. Daţniausiai ekstrakcija vykdoma ekstrahuojant susmulkintą augalinę ţaliavą, kuri yra gaunama ją malant, trinant ar homogenizuojant. Norint pilnai išekstrahuoti biologiškai aktyvius junginius iš augalinės ţaliavos, naudojami įvairūs ekstrahentai [80]. Ekstrakcijos išeiga priklauso nuo tirpiklio tipo, jo poliškumo, ekstrakcijos laiko ir temperatūros, ţaliavos ir ekstrahento santykio, pačios ţaliavos cheminės sudėties ir fizikinių savybių [80]. Vykdant ekstrakcijos procesą, išekstrahuojama balastinių medţiagų. Norint išgryninti ekstraktus, gali prireikti daugiau ţingsnių, pašalinant nereikalingus komponentus iš gautų ekstraktų [81].
Mokslinėje literatūroje aprašyta, kad spanguolių fenolinių junginių ekstrakcijai naudojami ekstrahentai yra metanolis, etanolis, acetonas, etilo acetatas ir jų mišiniai su su vandeniu [41]. Tinkamai parinktas tirpiklis lemia išekstrahuotų junginių kiekį ir ekstrakcijos greitį [83]. Metanolis daţniausiai naudojamas maţos molekulinės masės medţiagų ekstrakcijai. Didesnės molekulinės masės medţiagų ekstrakcijai tinkamesnis yra vandeninis acetono tirpalas. Etanolis yra daţniausiai naudojamas fenolinių junginių ekstrakcijai iš vaistinių augalinių ţaliavų [41]. Antocianinų ekstrakcijai iš augalinės ţaliavos daţniausiai naudojamas parūgštintas metanolis arba etanolis. Šie tirpikliai gerai tirpina ir stabilizuoja antocianinus. Ekstrahentų parūgštinimui naudojamos organinės rūgštys: skruzdţių, acto, citrinų, tartrato ir maţų koncentracijų mineralinės rūgštys: trifluoracto rūgštis, vandenilio chlorido rūgštis [83].
Ekstrakcijos išeiga priklauso nuo ekstrakcijos laiko ir temperatūros. Didėjant temperatūrai gali didėti biologiškai aktyvių junginių tirpumas, kisti tirpiklių klampa ir paviršiaus įtempimas [41]. Dauguma fenolinių junginių yra lengvai hidrolizuojami ir oksiduojami, todėl ilgas ekstrakcijos laikas ir aukšta temperatūra didina oksidacijos tikimybę, kuri maţina fenolinių junginių ekstrakcijos išeigą [81]. Dėl šių veiksnių, daţniausiai antocianinai ekstrahuojami 20–50°C temperatūroje. Esant aukštenei nei septyniasdešimt laipsnių temperatūrai, vyksta antocianinų struktūros pakitimai [83].
Ekstrakcijos išeigą didinantis kintamasis yra ekstrahuojamos augalinės ţaliavos dalelių dydis. Pastebėta, kad kuo smulkesnės tiriamojo mėginio dalelės, tuo didesnė ekstrakcijos išeiga, ekstrahuojant fenolinius junginius [41].
Tradiciniai ekstrakcijos metodai yra maceracija ir ekstrakcija Soksleto aparate [81]. Pastaraisiais dešimtmečiais buvo ištobulinta daug kitų metodų, tokių kaip mikrobangų, ultragarsinės ekstrakcijos, taip pat naudotos technologijos, paremtos suslėgtų skysčių naudojimu [41]. Plačiausiai naudojamas ekstrakcijos metodas yra maceracija [50]. Maceracijos metodas nėra sudėtingas, tačiau uţima daug laiko, todėl vis daţniau pasirenkami naujesni ekstrakcijos metodai. Huseyin ir kt. atliktame tyrime naudotas maceracijos metodas, ekstrahuojant spanguoles. Mokslininkai vaisių suspensiją ekstrahavo pasirinkę acetono, vandens ir acto rūgšties (70:29.5:0.5, v/v/v) buferinį tirpalą. Ekstrakcija tamsoje truko vieną valandą [50]. Maksimalus gautas antocianinų kiekis buvo 111 mg/kg [50].
Roopchand ir kt. atliktame bandyme tirta tirpiklio pH ir ekstrahuojamos ţaliavos santykio įtaka ekstrakcijos išeigai. Ekstakcijai naudotas vanduo arba 50 proc. etanolis, temperatūra – 80°C, tirpiklio ir
ţaliavos santykis – 10:1, ekstrakcijos laikas – 2 valandos. Nustatyta, kad tinkamiausios fenolinių junginių ekstakcijos sąlygos pasiektos esant pH 2, naudojant 50 proc. etanolį, esant 80°C temperatūrai, ekstrakciją vykdant 2 valandas, o tirpiklio ir ţaliavos santykiui esant 10:1 [51].
Mikrobangomis paremta ekstrakcija tai procesas, kurio metu naudojant mikrobangų energiją yra palengvinama biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija iš mėginio matricos [41]. Pagrindinis šio metodo privalumas yra trumpas ekstrakcijos laikas, kuris trunka nuo 10 iki 60 minučių ir reikalingas maţas tirpiklio kiekis, nuo 20 iki 50 ml [43]. Metodas daugiausiai naudojamas maţų fenolinių molekulių ekstrakcijai, kurios pasiţymi stabilumu ekstahuojant mikrobangomis esant temperatūrai iki 100°C. Kitiems fenoliniams junginiams, kurių molekulės yra didesnės ir nepatvarios aukštos temperatūros įtakai (pvz. antocianinai), šis ekstrakcijos metodas nėra tinkamas dėl galimų antocianinų molekulių struktūros
pakitimų [41]. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad efektyviausias ekstrakcijos procesas vyksta, kuomet mikrobangų daţnis yra 0,915 arba 2,45 GHz [43].
Zheng ir kt. atliktame tyrime, kuriame naudotas ekstrakcijos mikrobangomis metodas, nustatyta, kad medţiagos ir ekstrahento kiekių santykis yra svarbus kintamasis antocianinų ekstrakcijose, kuriam esant 1:34 g/ml, išeiga buvo didţiausia. Didţiausia ekstrakcijos išeiga pasiekta naudojant 55,5 proc. etanolį, ekstrahavus ėminius 7 minutes, 47°C temperatūroje. Maksimalus optimizuotų salygų ekstrakcijos metu gautas antocianinų kiekis 73,73 proc. [42].
Remiantis aptartais moksliniais duomenimis, ekstrakcija mikrobangomis gali būti taikoma antocianinų ekstrakcijai iš augalinių ţaliavų. Šio metodo pranašumai yra didelė išeiga, maţos laiko ir ekstrahentų sąnaudos, tačiau vienas didţiausių šio metodo trūkumų yra aukšta temperatūra, dėl kurios gali vykti biologiškai aktyvių medţiagų molekulių struktūros pakitimai [42].
Ekstrakcija ultra garso vonelėje nereikalauja sudėtingos įrangos, yra nebrangi, o ekstrakcijos išeiga didelė [41]. Ekstrakcijos laikas apie 10120 minučių [46]. Šis ekstrakcijos būdas gali būti naudojamas didelės ir maţos molekulinės masės medţiagų ekstrakcijai. Ekstrakcija ultragarso bangomis dar kitaip vadinama sonifikacija, ji yra paremta ekstrahentu sklindančių ultragarso bangų sukeliamu kavitacijos reiškiniu [45]. Proceso metu susiformuoja oro burbuliukai ir subliūkšdami sukelia fizinius, cheminius ir mechaninius poveikius ekstrahuojamai medţiagai. Dėl kavitacijos atsiranda biologinių membranų paţeidimas, kuris palengvina ekstrahuojamų komponentų atpalaidavimą ir perėjimą į ekstrahentą. Pagrindinis metodo privalumas ekstrahuojant antocianinus yra tai, kad metodą galima taikyti termalabilių junginių ekstrakcijai [41].
Zhang ir kt. atliktame tyrime, naudojant ultragarsinį ekstrakcijos metodą, tirta fenolinių junginių kiekio ekstrakcijos išeiga. Optimizavus ekstrakcijos procesą, didţiausia išeiga gauta esant temperatūrai 61,03 °C, ţaliavos ir ekstrahento santykiui – 1: 21,70 g/ml, ekstrahentu naudojant parūgštintą 70 proc. etanolį ir esant 400 W stiprio poveikiui ultragarsu. Metodo privalumai: didele išeiga, trumpas ekstrakcijos laikas, ţema temperatura [47].
Superkritinių ir subkritinių skysčių ekstrakcija yra inovatyvus ekstrakcijos metodas [84]. Suslėgtų skysčių ekstrakcijos metu yra naudojamas slėgis, kuris leidţia naudoti tirpiklius tirpalo formoje, esant temperatūrai aukštesnei, nei jų virimo temperatūra [41]. Atliekant ekstrakciją šiuo metodu ekstrahentu gali būti naudojami anglies dioksidas ar vanduo [85]. Naudojant anglies dioksidą, ekstrakcijos metu efektyviai ekstrahuojamos aukštai temperatūrai neatsparios medţiagos ir yra išvengiama jų skilimo
procesų [46]. Superkritinių skysčių ekstrakcija atliekama tamsioje beorėje aplinkoje, kur išvengiama molekulių suirimo ir oksidacijos procesų [41]. Superkritinių ir subkritinių skysčių ekstrakcijos metodai yra ekologiški, tačiau jiems atlikti yra reikalinga sudėtinga ir brangi aparatūra [85].
1.4. Antocianinų kokybinės ir kiekinės analizės metodai
Antocianinų analizė yra sudėtinga dėl šių medţiagų labilumo [41], jie yra plačiai paplitę gamtiniai antioksidantai [36], pasiţymintys įvairiapusiu biologiniu poveikiu ţmogaus organizmui [14], todėl aktualu kurti identifikavimo ir kiekinio nustatymo metodikas. Antocianinų kokybei nustatyti daţniausiai naudojami plonasluoksnės chromatografijos, ultravioletinės ir regimosios šviesos spektroskopijos, efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodai [54].
Pagrindiniai metodai, naudojami kokybiškai nustatyti antocianinus yra masių spektroskopija ir branduolių magnetinis rezonansas. Pastaruoju metu ESC–MS, APCI–MS, FAB–MS ar ESI–MS tapo daţnai naudojami identifikuojant antocianinus. Derinant šiuos metodus su masių spektroskopija, gaunami patikimiausi duomenys. Kitas tinkamas metodas yra branduolių magnetinis rezonansas. Atlikti tyrimai rodo, kad tai dar vienas tinkamas metodas antocianinų ir jų darinių identifikavimui. Branduolių magnetinis rezonansas gali būti labai naudingas nustatant įvairiems antocianinų reakcijos produktams [55].
ESC metodas yra tinkamas ne tik antocianinų identifikavimui, bet ir jų kiekiniam įvertinimui. Plačiai naudojami skirtingi detektoriai, kurie leidţia gauti išsamius duomenis [56]. Išnagrinėjus mokslinės literatūros duomenis galima teigti, kad daţniausiai naudojami detektoriai yra ultravioletinių ir regimosios šviesos spindulių, ultravioletinių spindulių absorbcijos ir masių spektrometrinis detektoriai. Naudojamas gradientinis eliuavimas, stacionarios fazės dalelių dydis daţniausiai yra 5 µm, naudojamas judrios fazės tėkmės greitis 0,8–1 ml/min Daţniausiai antocianinai detektuojami esant 520525 nm bangos ilgiui, bet galimi ir kiti absorbcijos maksimumai. Chromatografijai daţniausiai naudojamos 150 ar 250 mm ilgio ir 4,6 mm vidinio skersmens analitinės kolonėlės, kurias pateikiame lentelėje Nr. 1 nurodydami jų pavadinimus, charakteristiką ir kitus parametrus.
1. Lentelė. Antocianinų fitocheminės sudėties nustatymo ESC metodikos Chromatografinės Judri fazė Detektorius Tėkmės Šaltinis Detektoriaus
kolonėlės parametrai greitis bangos ilgis „LiChroCart125-4 RP-18“ 4x125 mm 5 µm dalelių dydis Vanduo, acetonitrilas ir skruzdţių rūgštis (81:9:10) UV 0,9 ml/min [6] 546 nm „Agilent PLRP-S“ 150x 4,6 mm 5 µm dalelių dydis A: acto rūgštis ir vanduo (10:90) B: metanolis, acto rūgštis, vanduo (60: 10:30) UV 0,8 ml/min [15] 530 nm „Zorbax SBC18“ 4,6 x 250 mm 5 µm dalelių dydis A: vandeninė 5 proc. skruzdţių rūgštis B: Metanolis MS/MS 1 ml/min [16] 520 nm „Eclipse XDR-C18“ 15cm. x 4,6 mm 5 µm dalelių dydis A: vanduo ir acto rūgštis (97:3) B: Metanolis UV 0,9 ml/min [19] 280 nm ir 360 nm „Tiidom Chemical“ 4,6 mm x 25 cm 10 µm dalelių dydis Metanolis ir
vandeninė acto rūgštis (37:10:53) UV 0,3 ml/min [24] 280nm „Polymer Labs PLRP-S “ 4,6 mm x25 cm 5 µm dalelių dydis A: 4 proc. fosforo rūgštis B: 100 proc. acetonitrilas UV 1,0 ml/min [27] 520 nm ir 260 nm
Norint kokybiškai ir kiekiškai įvertinti antocianinų sudėtį naudojama efektyvioji plonasluoksnė chromatografija. Metodas yra greitas ir galimas kaip alternatyva ESC metodui. Ant vienos plokštelės galima sutalpinti net iki 18 bandinių kartu su standartiniais tirpalais. Migracijos atstumas 70 mm, o laikas 30 min. [57].
UV ir regimosios šviesos spindulių absorbcijos spektrofotometrijos metodas gali būti naudojamas kiekiškai nustatant bendrą antocianinų kiekį spanguolių vaisių ėminiuose. Vienas plačiausiai taikomų yra pH diferencinis metodas. Tai greitas ir paprastas spektrofotometrinis metodas, pagrįstas antocianinų struktūros transformacijomis, kurios atsiranda kintant pH. Antocianinai turi savybę, jog pH esant 1,0 jų tirpalai turi rausvą spalvą, o pH esant 4,5, yra bespalviai. Abrorbcija matuojama esant 520 ir 700 nm bangos ilgiams. Metodo privalumas yra tai, kad šiuo metodu galima identifikuoti spanguolių ar kitų antocianinus kaupiančių vaistinių augalinių ţaliavų falsifikavimą dirbtiniais daţikliais. Metodo trūkumas, kad jo pagalba galima nustatyti tik bendrą antocianinų kiekį, o ne identifikuoti individualius junginius [58].
Norint identifikuoti ir kokybiškai nustatyti biologiškai aktyvius produktus, gali būti naudojami skirtingi metodai, tačiau daţniausiai ir plačiausiai naudojamas yra ESC metodas, kartu naudojant UV ir regimosios šviesos spindulių absorbcijos spektrofotometrijos ir masių spektrometrijos detekcijos instrumentus.
1.5. Spanguolių vaisių ir jų preparatų panaudojimas
Spanguolių vaisiai yra labai vertinga profilaktinė ir gydomoji priemonė, tačiau švieţios uogos yra vartojamos retai. Liaudies medicinoje spanguolių sultys vartojamos peršalus, kosint, sergant sąnarių ligomis ir gydant odos ligas [14]. Perdirbti spanguolių vaisiai yra plačiai vartojami maisto pramonėje, iš jų gaminamas kisielius, sirupai, sultys, trauktinės ar net vynas. Dėl antocianinų stabilumo, uogos gali būti naudojamos kaip ţaliava gaminant natūralius, nekenksmingus maisto daţus, kurie yra puiki alternatyva sintetiniams pašalinių poveikių turintiems daţikliams [14].
Spanguolių vasiai ir jų sultys, naudojami kaip profilaktinė ir gydomoji priemonė šlapimo sistemos trakto uţdegimams. Literatūroje ir praktikoje yra plačiai ţinoma, kad spanguolių sultys, koncentruoti milteliai ar kapsulinės farmacinės formos gali uţkirsti kelią ir gydyti šlapimo takų infekcinius susirgimus. Šį teigiamą efektą uţtikrina spanguolėse randami proantocianidinai, kurie neleidţia Escherichia coli bakterijoms adhezijos būdu prisitvirtinti prie uroepitelinių ląstelių, esančių
šlapimo takuose [37;38]. Dėl kaupiamų organinių rūgščių spanguolių vaisiai vartojami kaip profilaktinė priemonė nuo akmenų susidarymo šlapimtakiuose ir kepenyse [14].
Spanguolių vaisiai labai vertinami dėl didelio antioksidantų ir natūralių konservuojančių medţiagų kiekio, jie kaupia daug biologiškai svarbių medţiagų: antocianinų, proantocianidinų, flavonolių, fenolinių rūgščių. Šie junginiai pasiţymi antikanceroneninėmis, antimutageninėmis, antiradiacinėmis ir uţdegimą slopinančiomis savybėmis, saugo ląsteles nuo laisvųjų radikalų poveikio, lėtina senėjimo procesus, stiprina kraujagyslių kapiliarus, gydo ţaizdas, todėl naudojamos ir kosmetikos pramonėje. Dėl kaupiamų pektinų gebėjimo sugerti toksinus, radionuklidus, sunkiuosius metalus (šviną, gyvsidabrį, varį) yra vartojamos kaip profilaktinė priemonė apsisaugant nuo radiacijos ir apsinuodijimo sunkiaisiais metalais. Tyrimais įrodyta, kad spanguolių vaisiai slopina ir su skrandţio opa susijusių Helicobacter pylori bakterijų padermių veiklą, todėl spanguolių vaisių preparatai gali būti naudojami H.pylori baktrijų padermių sukeltų skrandţio opų gydyme [36]. Dėl savo cheminės sudėties spanguolių vaisiai gerina organizmo tonusą ir apetitą, skatina virškinimą, maţina ţalingą antibiotikų pašalinį poveikį, palaiko normalų kraujo krešėjimą, veikia kaulų regeneracijos procesus, todėl yra naudojami kaip funkcinis maistas [14]. Nustatytas teigiamas spanguolių vaisių biologiškai aktyvių junginių poveikis širdies ir kraujagislių ligų prevencijoje ir gydyme, apsaugant lipoproteinus nuo oksidacinio poveikio [36]. Nustatyta, kad hidroksicinamono rūgšties dariniai ir flavonoidai, išskirti iš spanguolių, gali ne tik sumaţinti lipoproteinų oksidaciją, bet ir jų mobilumą bei judrumą, tokiu būdu maţindami vieną iš svarbiausių faktorių aterosklerotinių procesų kaskadoje, t.y. maţo tankio lipoproteinųcholesterolio oksidaciją [36].
Antocianinų poveikis. Spanguolių vaisių fenoliniai junginiai yra natūralūs antioksidantai. Vaisiuose nustatyti antocianinai svarbi spanguolių vaisių biologiškaiaktyvių junginių grupė pasiţyminti gebėjimu apsaugoti lipidus nuo oksidacijos ir maţinti laisvųjų radikalų neigiamą poveikį. Hidroksilo ir metilo grupės B ţiede uţtikrina jų stabilumą bei reaktyvumą ir lemia jų antioksidacines savybes [18]. Antocianidinai turintys savo struktūroje cukrų molekules pasiţymi silpnesniu antioksidaciniu aktyvumu. Mokslinėje literatūroje aprašyti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad antocianidinų antioksidacinis poveikis buvo stipresnis, nei glikozidų, ši savybė paaiškina antocianinų gebėjimą surišti laisvuosius radikalus [33].
Antro tipo diabetas yra susijęs su išsiderinusia insulino sekrecija. Tai lemia lėtinę hiperglikemiją, padidėjusį oksidacinį stresą. Antocianinai maţina gliukozės kiekį kraujyje, laisvųjų radikalų susidarymą, didina insulino sekreciją [29]. Antro tipo diabetas yra susijęs su kasos β ląstelių disfunkcija [30]. Antioksidantinių fermentų ekspresija kasos salelėse yra labai maţa, jos yra lengvai paţeidţiamos oksidacinio streso. Antocianinų antioksidacinis poveikis apsaugo kasos β ląteles nuo oksidacinio streso
sukeliamų paţaidų [34]. Nesenai atlikti tyrimai rodo, kad antocianinai gali sumaţinti hepatinių lipidų akumuliaciją trim nepriklausomais mechanizmais: lipogenezės inhibavimu, maţinant Srebp1c, lipolizės skatinimu, indukuojant PPAR𝛼 aktyvumą ir maţinant oksidacinį stresą [31, 33].
Moksliniais tyrimais įrodyta, kad antocianinai yra biologiškai aktyvūs junginiai, maţinantys kraujagyslių ir širdies ligų riziką [21]. Tai lemia jų uţdegimą slopinantis poveikis, kuris siejamas su azoto monoksido (NO) susidarymo slopinimu [20]. Vienas svarbiausių etapų uţdegimo procese ir aterosklerozės vystimesi yra cirkuliuojančių monocitų adhezija prie kraujagyslių endotelio ląstelių. Tyrimų in vitro pagalba nustatyta, kad antocianinai dalyvauja monocitų adhezijoje. Antocianinai ir hidroksicinamono rūgštis geba sumaţinti TNF-a-sukeltą įvairių uţdegimo mediatorių gamybą [17].
Tyrimais nustatytas, antocianinų specifinį neurouţdegimą slopinantis poveikis. Neurouţdegimas yra apsauginis mechanizmas, skirtas apsaugoti centrinę nervų sistemą nuo infekcinių paţeidimų ir traumų. Dėl šio sutrikimo vystosi Parkinsono ir Alzhaimerio ligos. Fenoliniai junginiai apsaugo paţeistus neuronus, pagerina neuronų veiklą ir stimuliuoja neuronų regeneraciją [23]. Jie atlieka neuroprotekcines funkcijas kontroliuodami neuronų atsparumą neurotoksinams [20]. Antocianinai veiksmingai maţina iNOS ir COX-2 genų ir baltymų ekspresiją [33; 34].
Antocianinai maţina uţdegimą, turi teigiamą poveikį arterijų sienelėms dėl savo estrogeninio aktyvumo. Jie maţina cholesterolio, maţo tankio lipoproteinų ir trigliceridų kiekį, apsaugo nuo osteoporozės ir palengvina menopauzės simptomus [22]. Atlikus tyrimus nustatyta, kad estrogeninis antocianinų aktyvumas pasireiškia dėl jų gebėjimo jungtis prie estrogenų receptorių. Antocianinai geba sumaţinti angiotenzino II kiekį [17]. Jie inhibuoja fermentus, maţina padidėjusią citokinų sintezę, maţina kapiliarų pralaidumą ir trapumą, stiprina membranas, maţina išemiją ir kraujo spaudimą [21], apsaugo DNR nuo skilimo, inhibuoja trombocitų aktyvumą [33; 34].
Antocianinai pasiţymi antiproliferacinėmis savybėmis. Ląstelių proliferacija inhibuojama dėl antocianinų gebėjimo blokuoti įvairias ląstelės ciklo stadijas, veikiant ląstelių ciklą reguliuojančius baltymus [26]. Antocianinų priešvėţinis aktyvumas pasireiškia ir apoptozės indukcija. Jie sukelia apoptozę per abu, vidinį (didina mitochondrijų membranų potencialą, citochromo c atpalaidavimą ir nuo kaspazės priklausomų pro-apoptozinių baltymų moduliavimą) ir išorinį (moduliuoja FAS ir FASL ekspresiją, pasireiškiančią apoptoze), kelius [28]. Antocianinai pasiţymi angiogenezę slopinančiu poveikiu. Jie inhibuoja vandenilio peroksido ir auglio nekrozės faktorių VEGF ekspresiją epidermio keratinocituose ir maţina VEGF ir VEGF receptorių ekspresiją endotelio ląstelėse [33]. Antocianinai yra
svarbūs veţio prevencijai. Jie indukuoja ląstelių difereniaciją, kuri yra daug maţiau toksiška nei standartinė radiacija ar chemoterapija [25].
Antocianinai pasiţymi regėjimą gerinančiomis savybėmis, slopina trumpalaikę trumparegystę, maţina akies nuovargį, gerina akies adaptaciją tamsoje ir tinklainės aprūpinimą krauju, esant glaukomai. Antocianinai atpalaiduojančiai veikia krumplyno lygiuosius raumenis, kurie yra atsakingi uţ akomodaciją ir relaksaciją. Trumparegystės maţinimas pasireiškia endotelino-1B receptorių stimuliacija, NO sintezės skatinimu ir akies lęšiuko ploninimu. Akies adaptaciją antocianinai gerina skatindami rodopsino regeneraciją [33;34] .
Tyrimai rodo, kad antocianinai gali būti naudingi nutukimo prevencijai, nes reikšmingai maţina dėl riebaus maisto priaugtą svorį [35]. Efektas pasiektas dėl lipidų sintezės supresijos, sumaţėjusios gliukozės koncentracijos plazmoje, poveikio adipocitams ir adipocitokinų ekspresijos moduliavimo [34]. Antocianinai pasiţymi nutukimo sukeltų uţdegimų riebaliniame sluoksnyje slopinimu[33, 32].
1.6. Literatūros apţvalgos apibendrinimas
Spanguolių vaisiai kaupia įvairių grupių biologiškai aktyvius junginius, todėl jų ištraukos pasiţymi kompleksiniu veikimu. Mokslinėse publikacijose galima rasti išsamios informacijos apie stambiauogių spanguolių fitocheminę sudėtį ar galimą biologinį poveikį ţmogaus organizmui. Šio augalo vaisių preparatai pasiţymi priešvėţiniu, uţdegimą slopinančiu, antioksidaciniu poveikiais, todėl gali būti naudingi antro tipo diabeto, širdies ir kraujagyslių sistemos, akių ligų profilaktikai ir papildomam gydymui. Trūksta tyrimų apie stambiauogių spanguolių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties tyrimus. Atsiţvelgiant į tai, atlikti skirtingų veislių Lietuvos klimato sąlygomis auginamų stambiauogių spanguolių vaisių ėminių sudėties tyrimai.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Atliktiems tyrimams naudoti Lietuvos klimato sąlygomis 2017 metais uţaugintų skirtingų veislių stambiauogių spanguolių vaisių ėminiai. Stambiauogių spanguolių veislės: 'Baiwfay' , 'Holliston', 'Searles', 'Drever', 'Bergman', 'Woolman', 'Bain', 'Pilgrim'. Stambiauogių spanguolių vaisių ėminiai gauti iš Gamtos Tyrimų Centro Botanikos instituto. Ėminiai liofilizuoti Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filiale, Sodininkystės ir darţininkystės institute.
2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai
Tyrimo metu naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo ir atitiko visus jiems keliamus kokybės reikalavimus. Tyrimo metu naudota: etanolis 96 proc. (v/v) (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), Folin–Ciocalteu reagentas, natrio karbonatas, galo rūgštis, DMCA (p-dimetilaminocinamaldehidas), acto rūgštis, ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6-sulfoninė rūgštis), troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis), kalio persulfatas, vario (II) chlroridas, amonio acetatas, neokuproinas, natrio acetatas („Scharlau“, Sentmenatas, Ispanija), TPTZ(„Carl Roth“, Karlsrūjė, Vokietija), geleţies(III) chloridas heksahidratas („Vaseline-Fabrik Rhenania“, Bona, Vokietija), TFPH (trifluorperazino dihidrochloridas), sieros rūgštis, acetonitrilas („Sigma-aldrich“, Steinheimas, Vokietija), acto rūgštis („Lachner“, Neratovicas, Čekijos Respublika); (+)- katechinas, (-)-epikatechinas, luteolin-7-o-gliukozidas, procianidinas C1, procianidinas A2, floretinas, kemferolis, rutinas, hiperozidas, kvercitrinas, florizinas, avikuliarinas, neochlorogeno rūgštis, chlorogeno rūgštis, izoramnetinas, ferulo rūgštis, kavos rūgštis, galo rūgštis, vanilino rūgštis, p-kumaro rūgštis, vandenilio chlorido rūgštis, heksametilentetraminas, kalio chloridas, aliuminio chloridas („Sigma-Aldrich“, Šteinheimas, Vokietija), izoramnetin -3-O-gliukozidas (,,extra synthese“ Lionas, Prancūzija).
2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra
Spanguolių vaisiai liofilizuoti liofilizatoriuje „Zirbus“ („Zirbus technology GmbH“, Bad Grundas, Vokietija). Spanguolių vaisių ėminių smulkinimas atliktas „Retsch GM 200“ elektriniu malūnu („Retsch GmbH“, Hanas, Vokietija). Ţaliava sverta „Sartorius CP64-0CE“ elektrinėmis analitinėmis svarstyklėmis („Sartorius AG“, Getingenas, Vokietija). Spanguolių vaisių ėminių fenolinių junginių
ekstrakcija atlikta „Bandelin Sonorex Digital 10 P“ ultragarso vonelėje („Sigma-Aldrich“, Darmštatas, Vokietija), o filtravimas atliktas naudojant stiklo filtrą ir vakuuminį siurblį „2511 Dry Vacuum Pump/Compressor“ („Welch“, Skokie, JAV). Spektrofotometriniai tyrimai atlikti naudojant UV– regimosios šviesos spektrofotometrą „M550“ („Spectronic CamSpec“, Garfortas, Jungtinė Karalystė). Spanguolių vaisių ėminių antocianinų kokybinė ir kiekinė analizė atlikta naudojant „Waters 2695 Alliance“ skysčių chromatografą („Waters“,Milfordas, JAV), kartu su „Waters2998“ diodų matricos detektoriumi („Waters“,Milfordas, JAV). Spanguolių vaisių ėminių fenolinių rūgščių, flava-3-olių ir flavonolių analizė atlikta naudojant ultra efektyviūjį skysčių chromatografą ,,Acquity H-class" („Waters“,Milfordas, JAV), taikant masių spektrometrinį detektorių ,,Waters Xevo" („Waters“,Milfordas, JAV).
2.4. Tiriamųjų spanguolių ėminių paruošimas
Žaliavos paruošimas: tyrimams buvo naudotos Lietuvos klimato sąlygomis uţaugintos spanguolės. Stambiauogių spanguolių vaisiai uţsaldyti -35°C temperatūroje su oro cirkuliacija. Po to vaisiai liofilizuoti 0,01 mbar slėgyje, esant -85°C kondesatoriaus temperatūrai liofilizatoriuje „Zirbus“ („Zirbus technology GmbH“, Bad Grundas, Vokietija). Liofilizuoti vaisiai vėliau susmulkinti iki miltelių. Jų ėminiai laikyti sandariai uţdarytuose induose, tamsioje, sausoje vietoje.
Nuodžiūvio nustatymas: nuodţiūvis nustatytas nurodytu Europos farmakopėjos Ph.Eur.01/2008: 20232 metodu [88]. 1 g spanguolių vaisių miltelių dţiovintas 105°C temperatūroje, kol visiškai išgaruos lakieji junginiai ir drėgmė. Gauti duomenys perskaičiuoti absoliučiai sausai ţaliavai. Nuodţiūvis (proc.) skaičiuojamas naudojantis formule:
Χ= 𝑚 − 𝑚1
𝑚 × 100; proc. Čia:
m – ţaliavos masė prieš dţiovinimą (g); m1 – ţaliavos masė po dţiovinimo (g).
Etanolinių ištraukų paruošimas: tiksliai atsveriama 2,5g liofilizuotos spanguolių vaisių ţaliavos miltelių. Tikslus svėrinys perkeliamas į tamsaus stiklo buteliuką ir uţpilamas 30ml 70 proc. (v/v) etanoliu, sandariai uţdaromi ir perkeliami į ultragarso vonelę, kur yra ekstrahuojami 40min , esant 80 kHz daţniui ir 452 W galiai. Po ekstrakcijos filtruojama, naudojant vakuuminį siurblį. Prafiltruotos ištraukos
supilamos į 50 ml matavimo kolbutes ir uţpilama tirpiklio iki ribos. Gautos ištraukos supilamos į tamaus stiklo buteliukus ir sandariai uţdaromos. Prieš ESC analizę ištraukos filtruojamos per 0,22 µm porų dydţio membraninius filtrus „Carl Roth CmbH“ („Carl Roth CmbH & Co. KG“, Karlsrūjė, Vokietija).
2.5. Tyrimo metodai
2.5.1. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas
Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti naudotas UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis metodas, veikiant tiriamąjį ekstraktą aliuminio chlorido tirpalu rūgštinėje terpėje [39].
Tiriamojo tirpalo paruošimas: 0,2 ml tiriamojo tirpalo 5 ml matavimo kolbutėje sumaišoma su 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,1 ml 30 proc. (v/v) acto rūgšties tirpalo ir 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 min į kolbutę įpilama 0,4 ml 5 proc. Heksametilentetramino tirpalo ir praskiedţiama išgrynintu vandeniu iki ţymės.
Lyginamojo tirpalo paruošimas: 0,2 ml tiriamojo ekstrakto 5 ml kolbutėje sumaišoma su 2 ml 96 proc. (v/v) etanolio, 0,1 ml 30 proc. (v/v) actorūgšties tirpalo ir praskiedţiama išgrynintu vandeniu iki ţymės. Absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru, bangos ilgiui esant 407 nm, kuomet tiriamojo tirpalo sluoksnio storis 10 mm Naudojant 0,1–0,85 mg/ml koncentracijos etaloninius rutino tirpalus sudaromas kalibravimo grafikas (y=1,0258x+0,008, R2=0,9994). Bendras flavonoidų kiekis spanguolių vaisių ėminiuose išreikštas rutino ekvivalentu mg/g absoliučiai sausos ţaliavos.
2.5.2. Bendro antocianinų kiekio nustatymas
Bendram antocianinų kiekiui nustatyti naudotas UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis pH– diferencinis metodas. Šis metodas pagrįstas antocianinų spalvos kitimais skirtingo pH (1,0 ir 4,5) terpėse [40].
0,025 M kalio chlorido buferinio tirpalo paruošimas (pH 1,0): 1,86 g kalio chlorido ištirpinama 980 ml išgryninto vandens 1000 ml talpos matavimo kolboje. Buferinio tirpalo pH rodiklis iki pH 1,0 koreguojamas koncentruota vandenilio chlorido rūgštimi. Į matavimo kolbą pripilama išgryninto vandens iki ţymės. Pakartotinai patikrinamas buferinio tirpalo pH rodiklis.
0,4 M natrio acetato buferinio tirpalo paruošimas (pH 4,5): 54,43 g natrio acetato trihidrato ištirpinama 960 ml išgryninto vandens. Buferinio tirpalo pH rodiklis koreguojamas iki pH 4,5
koncentruota vandenilio chlorido rūgštimi. Gautas tirpalas perkeliamas į 1000 ml tūrio matavimo kolbą ir pripilama išgryninto vandens iki ţymės. Pakartotinai patikrinamas buferinio tirpalo pH rodiklis.
Tiriamojo tirpalo paruošimas: 0,625 ml spanguolių vaisių ištrauka perkeliama į 25 ml matavimo kolbutę ir praskiedţiama buferiniu tirpalu iki ţymės. Praskiedimo faktorius yra 40. Iš vieno bandinio atliekami du tokie praskiedimai: vienas su kalio chlorido buferiniu tirpalu (pH 1,0), kitas su natrio acetato buferiniu tirpalu (pH 4,5). Laikoma 15 min, kol nusistovės tirpalų pusiausvyra. Tirpalų šviesos absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru esant 520 nm ir 700 nm bangų ilgiui.
Lyginamasis tirpalas: išgrynintas vanduo. Naudojama 1 cm storio kvarcinė kiuvetė. Absorbcijos dydis (A) apskaičiuojamas pagal formulę:
pH4,5 700 520 pH1,0 700 520
-
A
)
-
(A
-
A
)
(A
A
Čia: A520(pH 1,0) – absorbcijos dydis esant 520 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=1,0; A700(pH 1,0) – absorbcijos dydis esant 700 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=1,0; A520(pH 4,5) – absorbicijos dydis esant 520 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=4,5; A700((pH 4,5) – absorbcijos dydis esant 700 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=4,5 Suminis antocianinų kiekis ekstrakte išreiškiamas cianidin-3-gliukozido ekvivalentu.
(mg/l) , 1 ε 1000 DF MW A X1
Čia: X1 – suminis antocianinų kiekis, mg/l;
MW – cianidin-3-gliukozido molekulinė masė (449,2 g/mol); A – praskiesto bandinio šviesos absorbcijos dydis;
DF – praskiedimo faktorius; čia: 40 (0,625 ml ekstrakto praskiedţiama buferiniu tirpalu iki 25 ml);
ε – cianidin-3- gliukozido molinis absorbcijos koeficientas, 26900; 1 – naudotos kvarcinės kiuvetės storis, cm.
(proc.) , 1000 m 0,001 100 V X X2 1
X1 – bendras antocianinų kiekis ištraukoje, mg/l;
X2 – antocianinų suminis kiekis ţaliavoje, proc.;
V – spanguolių vaisių ekstrakcijai paimtas ekstrahento tūris; čia: 25 ml 60 proc. (v/v) etanolis; M – analizei imtas bandinio kiekis (tiksli masė).
2.5.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudotas UV–regimosios šviesos spektrofotometrinis Folin–Ciocalteu metodas. Taikyta Borowska ir kt. straipsnyje aprašyta metodika [44].
Mėginio paruošimas: 0,2 ml etanolinės spanguolių vaisių ištraukos praskiedţiamos 4 ml 70 proc. (v/v) etanoliu. Iš praskiestos etanolinės spanguolių vaisių ištraukos imama 0,2 ml ir pridedami 5 ml 10 proc. Folin–Ciocalteu reagento, vėliau 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [44].
Lyginamojo tirpalo paruošimas: į 0,2 ml 70 proc. etanolio įpilama 5 ml 10 proc. Folin–Ciocalteu reagento ir 4 ml 7,5 proc. Na2CO3 tirpalo [44].
Tyrimo mėginiai 60 min laikomi tamsioje vietoje, esant kambario temperatūrai. Šviesos absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru esant 765 nm bangos ilgiui, kuomet tiriamojo tirpalo sluoksnis 10 mm. Kalibravimo grafikas sudaromas naudojant 0,25–4 mg/ml koncentracijos etaloninius galo rūgšties tirpalus (y=0,2029x−0,0052; R2=0,9802). Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas
pagal formulę: ∁=𝑥×𝑉𝑚
Čia: C – bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g;
X – galo rūgšties koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos ţaliavos masė, g.
Bendram proantocianidinų kiekio nustatymui naudota Heil ir kt. straipsnyje aprašyta bendro proantocianidinų kiekio nustatymo metodika [48]. Tyrimui imta 5 μl stambiauogių spanguuolių vaisių etanolinės ištraukos.
Mėginio paruošimas: 5 μl spanguolių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA reagento, ištirpinto parūgštintame etanolyje (9 dalys 96,3 proc. C2H5OH ir 1 dalis HCl konc.) [48].
Lyginamasis tirpalas: parūgštintas etanolis [48]. Šviesos absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru praėjus 5 minutėms nuo mėginio paruošimo, esant 640 nm bangos ilgiui, kuomet tiriamo tirpalo sluoksnio storis 10 mm.
Naudojant 0,125–1,3 mg/ml koncentracijos etaloninius (-)-epikatechino tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (𝑦=0,6352𝑥+0,0489; R2=0,9992). Bendras proantocianidinų kiekis apskaičiuotas
pagal formulę: ∁=𝑥×𝑉𝑚
Čia: C – bendras proantocianidinų kiekis, mg EE/g;
X – epikatechino koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo grafiką, mg/ml; V – pagamintos etanolinės ištraukos tūris, ml;
m – absoliučiai sausos ţaliavos masė, g.
2.5.5. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas ABTS radikalų–katijonų surišimo metodu. Taikyta metodika remiasi Tulio ir kt. straipsnyje aprašyta ištraukų antiradikalinio aktyvumo nustatymo ABTS metodika [49].
ABTS•+ motininio tirpalo paruošimas: 0,0548 g ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfoninė rūgšties) miltelių ištirpinami 50 ml išgrynintojo vandens tamsaus stiklo buteliuke. Į gautą tirpalą įberiama 0,0095 g K2S2O8. Pagamintas motininis 2 mmol/l ABTS tirpalas laikomas tamsoje 16 val, kol
vyksta oksidacijos–redukcijos reakcija, kurios metu susidaro ABTS•+ [49]. Susidaręs radikalas–katijonas kambario temperatūroje ir laikomas tamsoje, išlieka stabilus 2 paras.
Darbinio ABTS•+ tirpalo paruošimas: darbinis ABTS•+ gaunamas motininį tirpalą skiedţiant išgrynintuoju vandeniu, kol esant 734 nm bangos ilgiui, spektrofotometru išmatuotas 10 mm tirpalo sluoksnio šviesos absorbcijos dydis pasiekia 0,8±0,03 [49].
Mėginio paruošimas: 3 μl spanguolių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio ABTS•+ tirpalo. Bandinys laikomas tamsoje 30 min, ir spektrofotometru matuojamas mėginio šviesos absorbcijos dydis, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui, kuomet tiriamojo tirpalo sluoksnis 10 mm.
Lyginamasis tirpalas: išgrynintasis vanduo. Naudojant naudojant 8000–24000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (𝑦=0,00003𝑥−0,00360; R2=0,9714).
2.5.6. Antiradikalinio aktyvumo in vitro nustatymas TFPH radikalų–katijonų surišimo metodu. TFPH tirpalo paruošimas: 0,480 g TFPH miltelių tirpinama 10 ml išgrynintojo vandens [59]. Darbinio tirpalo paruošimas: 100 ml kolboje sumaišoma 0,5 ml motininio TFPH tirpalo su 0,1 ml K2S2O8 ir praskiedţiama iki 100 ml 4 mol/l H2SO4 tirpalu ir laikoma 15–20 min tamsoje [59].
Spektrofotometru išmatavus tirpalo šviesos absorbcijos dydį, bangos ilgiui eant 502 nm, jis turi būti 0,7±0,1, kuomet matuojamo tirpalo sluoksnio storis yra 10 mm.
Mėginio paruošimas: 10 μl spanguolių vaisių etanolinė ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio TFPH tirpalo ir laikoma 30 min tamsoje. Šviesos absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru bangos ilgiui esant 502 nm.
Lyginamasis tirpalas: 4 mol/l H2SO4 tirpalas [59].
Naudojant naudojant 2000–16000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (𝑦=0,0000371𝑥+0,1471727; R2
=0,9959). 2.5.7. Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas FRAP metodu.
Tyrimo metu naudota Celik ir kt. straipsnyje publikuota redukcinio aktyvumo nustatymo metodika [60]. Analizei paimta 5 μl spanguolių vaisių ištraukos.
Darbinio FRAP tirpalo paruošimas: sumaišoma A, B ir C tirpalai santykiu 10:1:1, kuomet: – A tirpalas – 300 mmol/l buferinis CH3COONa tirpalas. Prie 0,775 g CH3COONa pridėta 4 ml
ledinės acto rūgšties ir matavimo kolboje praskiesta išgrynintuoju vandeniu iki 250 ml;
– B tirpalas – 10 mmol/l TPTZ tirpalas. 0,0781 g TPTZ miltelių ištirpinta 40 mmol/l HCl parūgštintame išgrynintame vandenyje 25 ml matavimo kolbutėje;
– C tirpalas – 20 mmol/l FeCl3x6H2O vandeninis tirpalas. 0,1352 g FeCl3x6H2O ištirpinta
išgrynintajame vandenyje 25 ml kolbutėje [60].
Mėginio paruošimas: 10 μl spanguolių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml darbinio FRAP tirpalo ir laikoma 30 min tamsoje. Šviesos absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru bangos ilgiui esant 593 nm, kuomet tiriamojo tirpalo sluoksnio storis 10 mm.
Lyginamasis tirpalas: darbinis FRAP tirpalas.
Naudojant naudojant 400–24000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (y=0,0000166𝑥+0,000950; R2
=0,9926).
2.5.8. Redukcinio aktyvumo in vitro nustatymas CUPRAC metodu.
Tyrimui naudota Apak ir kt. straipsnyje aprašyta redukcinio aktyvumo nustatymo metodika [61]. Darbinio CUPRAC tirpalo paruošimas: sumaišoma A, B ir C tirpalai santykiu 1:1:1, kuomet: – A tirpalas – 10 mmol/l CuCl2 tirpalas. 0,085 g CuCl2 ištirpinta išgrynintame vandenyje 50 ml
kolbutėje;
– B tirpalas – 1 mmol/l CH3COONH4 buferinis tirpalas (pH=7). 0,0038 g CH3COONH4 ištirpinta
išgrynintame vandenyje 50 ml kolbutėje;
– C tirpalas – 7,5 mmol/l neokuproino etanolinis tirpalas. 0,078 g neokuproino ištirpinta 96 proc. (v/v) etanolio 50 ml kolbutėje [61].
Mėginio paruošimas: 5 μl spanguolių vaisių etanolinės ištraukos sumaišoma su 3 ml švieţiai paruošto darbinio CUPRAC tirpalo ir 30 min laikoma tamsoje. Absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru bangos ilgiui esant 450 nm, kuomet tiriamojo tirpalo sluoksnio storis 10 mm.
Lyginamasis tirpalas: darbinis CUPRAC tirpalas
Naudojant naudojant 2000–48000 μmol/l koncentracijos etaloninius trolokso tirpalus, sudaromas kalibravimo grafikas (𝑦=0,0000222𝑥−0,0132677; R2
=0,9995). 2.5.9. Antioksidacinio aktyvumo in vitro apskaičiavimas
Spanguolių ėminių ištraukų antioksidacinis aktyvumas apskaičiuotas pagal trolokso kalibravimo grafikus ir išreikštas trolokso ekvivalentu (μmol TE/g) absoliučiai sausai ţaliavai. Trolokso ekvivalentas (TE) atitinka trolokso kiekį (μmol), kuris tokiomis pačiomis tyrimo sąlygomis turi lygiai tokį patį
antioksidacinį aktyvumą, kaip 1 g augalinės ţaliavos. Tiriamųjų ištraukų antioksidacinis aktyvumas in vitro, išreikštas TE ekvivalentu (μmol TE/g), apskaičiuojamas pagal formulę:
𝑇𝐸 = 𝐴 + 𝑏 𝑎 × 1000×
𝑉𝑏𝑎𝑛𝑑(𝑚𝑙) 𝑚𝑏𝑎𝑛𝑑(𝑔)
A – bandinio šviesos absorbcijos dydis;
a – nuolydis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinio grafiko lygties;
Vband. – tiriamos augalinės ţaliavos ištraukos bandinio tūris (ml);
mband. – tiriamos augalinės ţaliavos atsvertas (tikslus) kiekis (g).
2.5.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika
Pritaikant mokslinėje literatūroje aprašytą validuotą ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, detekcijai naudojant masių spektrometrinį detektorių, atlikta fenolinių rūgščių, flavan-3-olių ir flavonolių grupių junginių kokybinė ir kiekinė analizė [63]. Antocianinų grupės junginių kokybinė ir kiekinė analizė atlikta pritaikius Europos farmakopėjoje aprašytą mėlynių vaisių antocianinų nustatymo metodiką [62]. Identifikuotų antocianinų grupės junginių kiekinė sudėtis nustatyta naudojantis penkių lygmenų etaloninių junginių kalibravimo grafikais. Delfinidin-3-O-galaktozidas, cianidin-3-O-galaktozidas, delfinidin-3-O-arabinozidas, cianidin-3-O-gliukozidas, petunidin-3-O-galaktozidas, petunidin-3-O-arabinozidas ir petunidinas išreikšti cianidin-3-O-gliukozido ekvivalentu; peonidinas, peonidin-3-O-galaktozidas, peonidin-3-O-gliukozidas ir peonidin-3-O-arabinozidas – peonidin-3-O-gliukozido ekvivalentu; malvidinas, malvidin-3-O-galaktozidas, O-arabinozidas ir malvidin-3-O-gliukozidas – malvidin-3-O-gliukozido ekvivalentu.
2.6. Tyrimo duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Excel 2016“ („Microsoft“, JAV) ir „SPSS Statistics 20“ („IBM“, JAV). Apskaičiuotas trijų pakartojimų aritmetinis vidurkis ir standartinis nuokrypis. Siekiant įvertinti kiekinės sudėties įvairavimą tarp ėminių,
apskaičiuotas variacijos koeficientas. Pritaikius vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA) įvertinta, ar skirtumai tarp lyginamųjų duomenų yra statistiškai reikšmingi. Konkretūs skirtumai tarp ėminių nustatyti pritaikius daugkartinio palyginimo Tjukio kriterijų. Duomenų koreliacijai įvertinti apskaičiuotas Pirsono koreliacijos koeficientas. Remiantis literatūra, |r|<0,3 koreliacinis ryšys laikytas labai silpnu, kai 0,3<|r|<0,5 silpnu, kai 0,5<|r|<0,7 vidutinio stiprumo, kai 0,7<|r|<0,9 stipriu, o kai 0,9<|r|≤1 labai stipriu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Spanguolių vaisių ėminių antocianinų ekstrakcijos sąlygų optimizavimas
Biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija yra vienas svarbiausių etapų, norint kuo efektyviau išskirti norimus junginius iš augalinės ţaliavos [41]. Norint gauti didţiausią spanguolių vaisių biologiškai aktyvių junginių išgavą, atlikome ekstrakcijos salygų optimizavimą. Tyrėme trijų pagrindinių parametrų įtaką ekstrakcijos išeigai. Pagrindiniai pasirinkti parametrai: etanolio koncentracija, ekstrakcijos trukmė ir ultragarso vonelės galia. Atlikus pirminius tyrimus su ,,Design–Expert‘‘ programa, nustatyta, kad ekstrakcijos laikas neturi statistiškai reikšmingos įtakos antocianinų išeigai. Dėl šios prieţasties ekstrakcijos laikas buvo pašalintas iš optimizacijos modelio ir pasirinkta didţiausią išeigą lėmusi laiko reikšmė – 40 min. Pasinaudojus ,,Design–Expert‘‘ programa buvo sudarytas paviršiaus atsako metodologijos dizainas, padedantis nustatyti optimalią etanolio koncentraciją ir ultragarso vonelės galią antocianinų ekstrakcijos išeigai. Tyrimo metu naudota nuo nuo 60 iki 80 proc. etanolio koncentracija. Ultragarso vonelės galia nuo 226 W iki 678 W. Antocianinų koncentracija ekstraktuose nustatyta spektrofotometriniu metodu.
Duomenis perkėlus į ,,Design–Expert‘‘ programą buvo gautas statistiškai reikšmingas antocianinų ekstrakcijos modelis (p=0,0188). Tiriamų ekstrakcijos parametrų įtaka antocianinų išeigai buvo pavaizduota sudarant paviršiaus atsako modelio grafiką (1 pav.). Trimačiame grafike pavaizduotas 3D paviršiaus plotas, rodantis etanolio koncentracijos ir ultragarso vonelės galios poveikį antocianinų išeigai. Antocianinų ekstrakcijos išeiga didėja didėjant etanolio koncentracijai iki 70 proc. Didėjant ultragarso vonelės galiai iki 452W antocianinų ekstrakcijos išeiga taip pat didėja. Tinkamiausios nustaytos antocianinų ekstrakcijos sąlygos iš stambiauogių spanguolių vaisių, kuomet antocianinų išeiga buvo didţiausia, buvo kuomet laikas – 40 min, etanolio koncentracija – 70 proc. (v/v) ir ultragarso vonelės galia – 452W. Pasiūlytas programos modelis pagal pasirinktus optimizacijos kriterijus tenkino 82,1 proc. Aukščiau aprašytos sąlygos pasirinktos tolimesniems ekstrakcijos proceso tyrimams.
1 pav. Trimatis atsako paviršiaus grafikas, vaizduojantis etanolio koncentracijos ir ultragarso vonelės galios įtaką antocianinų ekstrakcijos išeigai
Suminis antocianinų kiekis, atliekant ekstrakciją iš spanguolių vaisių tirtomis sąlygomis varijavo nuo 1,9 mg/g iki 4,3 mg/g, priklausomai nuo tiriamų parametrų lygio. Maksimali pasiekta išeiga buvo 4,3±0,36 mg mg/g (p<0,05), kuomet laikas – 40 min, etanolio koncentracija – 70 proc. (v/v) ir ultragarso vonelės galia – 452W.
Bendro antocianinų kiekio priklausomybę nuo etanolio koncentracijos ir ultragarso vonelės galios parodo kvadratinė lygtis.
𝑌 = −22,88706 + 0,60581 × Χ1+ 0,28932 × Χ2 − 4,06176 × 10−3× Χ12− 2,46544 × 10−3× Χ22
− 1,20000 × 10−3× Χ 1× Χ2
Y – bendras antocianinų kiekis (išeiga); X1 – etanolio koncentracija;
X2 – ultragarso galia.
Atlikus tyrimus su ,,Design–Expert‘‘ programa, nustatyta, kad tinkamiausios nustaytos antocianinų ekstrakcijos sąlygos iš stambiauogių spanguolių vaisių, kuomet antocianinų išeiga buvo
