I
1. INTRODUZIONE e SCOPO DELLA TESI_______________________Pag.1
1.1 Premessa________________________________________________Pag.1 1.1.1 Ruolo delle carnitine nel metabolismo dei mitocondri_______Pag.1 1.1.2 Importanza della spettrometria di massa nella_____________Pag.4
diagnosi precoce di malattie ereditarie nei neonati
1.1.3 Disfunzioni mitocondriali e malattie neurodegenerative______Pag.7 - Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA)____________________Pag.7 - Morbo di Parkinson_________________________________Pag.10 - Morbo di Alzheimer_________________________________Pag.10 1.2 Potenziale ruolo delle acilcarnitine e delle dicarbossil _____________Pag.12
acilcarnitine come biomarker delle malattie neurodegenerative
- Acilcarnitine______________________________________Pag.12 - Dicarbossil acilcarnitine____________________________Pag.13 1.3 Scopo di questo lavoro di tesi_________________________________Pag.17
2. SINTESI DI CARBOSSIACILCARNITINE DI____________________Pag.20 FORMULA GENERALE 3 MARCATE ISOTOPICAMENTE
2.1 Studio retrosintetico_______________________________________Pag.21 2.1.1 L’esterificazione di Steglich___________________________Pag.24 2.2 Lavoro effettuato_________________________________________Pag.26
2.2.1 Esterificazione della L-carnitina (1a)____________________Pag.26 e del suo analogo deuterato (7)
2.2.2 Preparazione dell’acido ______________________________Pag.30 12-butossi-12-ossododecanoico (6b)
2.2.3 Preparazione dell’acido 6-butossi-6-ossoesanoico (6a)______Pag.36 2.2.4 Preparazione del 4-butossi-2-(12-butossi-_________________Pag.39
12-ossododecanoilossi)-N,N,N-trimetil-4-ossoobutan- 1-ammonio cloruro ((R)-O-(11-carbossiundecanoil) carnitina cloruro, 3c) e del
4-butossi-2-(12-butossi-12-ossododecanoilossi)-N-(2H3
-metil)-N,N-dimetil-4-ossobutan-1-ammoniocloruro ((R)-O-(11-carbossiundecanoil)-[N-metil-2H3 ]-carnitina cloruro, 3b)
II
2.2.5 Preparazione del 4-butossi-2-(6-butossi-___________________Pag.44 6-ossoesanoilossi)-N-(2H3-metil)-N,N-dimetil-4-
ossobutan-1-ammonio cloruro ((R)-O-(5-carbossipentanoil)-
[N-metil-2H3]-carnitina cloruro, 3a)
3. ANALISI MEDIANTE SPETTROMETRIA DI MASSA____________Pag.47
3.1 Lo Screening neonatale_____________________________________Pag.47 3.1.1 Metodo ESI/MS/MS e preparazione _____________________Pag.48
dei campioni per Screening neonatale
3.1.2 Il Neutral Loss (NL), il Precursor Ion ____________________Pag.50 Scan (Prec) e il Multiple Reaction Monitoring (MRM)
3.2 Messa a punto del metodo FIA-ESI-MS/MS____________________Pag.51 3.2.1 Ottimizzazione dei parametri di _________________________Pag.51
composto e dei parametri di sorgente
3.3 Analisi degli spot di sangue di pazienti adulti____________________Pag.58
CONCLUSIONI_______________________________________________Pag.67
RINGRAZIAMENTI___________________________________________Pag.69
4. PARTE SPERIMENTALE_____________________________________Pag.70
4.1 Generalità_________________________________________________Pag.70 4.2 Sintesi degli standard marcati_________________________________Pag.72
- Preparazione della L-carnitina n-butil estere_____________________Pag.72 - Preparazione della 2H3-L-carnitina n-butil estere__________________Pag.72
- Preparazione dell’acido dodecandioico mono-n-butil estere_________Pag.73 - Preparazione dell’acido esandioico mono-n-butil estere____________Pag.75 - Preparazione del 4-butossi-2-(12-butossi-12-ossododecan__________Pag.76
oilossi)-N,N,N-trimetil-4-ossoobutan-1-ammonio
cloruro ((R)-O-(11-carbossiundecanoil) carnitina cloruro, 3c)
- Preparazione del 4-butossi-2-(12-butossi-12-ossododecan___________Pag.78 oilossi)-N-(2H3-metil)-N,N-dimetil-4-ossobutan-1-
III
ammonio cloruro ((R)-O-(11-carbossiundecanoil)-[N-metil-2H3]carnitina cloruro, 3b)
- Preparazione del 4-butossi-2-(6-butossi-_______________________Pag.78 6-ossoesanoilossi)-N-(2H3-metil)-N,N-dimetil-4-
ossobutan-1-ammonio cloruro ((R)-O-(5-carbossipentanoil)-[N-metil-2
H3]carnitina cloruro, 3a)
4.3 Diluizione degli standard marcati_______________________________Pag.79 per screening in ESI-MS/MS
4.4 Preparazione dei campioni da spot______________________________Pag.80 di sangue per screening in ESI-MS/MS
