LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
LINAS VITKEVIČIUS
VAISTINĖS MELISOS (MELISSA OFFICINALIS L.)
ĮVERTINIMAS SUDĖTINIUOSE PREPARATUOSE PAGAL
ROZMARINO RŪGŠTIES KIEKĮ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Rūta Marksienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
VAISTINĖS MELISOS (MELISSA OFFICINALIS L.) ĮVERTINIMAS SUDĖTINIUOSE PREPARATUOSE PAGAL ROZMARINO RŪGŠTIES KIEKĮ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Rūta Marksienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas Linas Vitkevičius
Data Data
TURINYS
TURINYS ...3 SANTRAUKA ...4 SUMMARY ...5 SANTRUMPOS...6 SĄVOKOS ...7 ĮVADAS ...8DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...10
1.1. Vaistinė melisa (Melissa officinalis L.) ...10
1.2. Rozmarino rūgštis ...11
1.2.1. Biologinis rozmarino rūgšties poveikis ...12
1.2.2. Rozmarino rūgšties analizė...14
1.3. Kiti tiriamųjų preparatų sudėtyje esantys augalai ...16
1.3.1. Vaistinis valerijonas (Valeriana officinalis L.) ...16
1.3.2. Pipirmėtė (Mentha x piperita L.) ...17
1.3.3. Tikroji levanda (Lavandula angustifolia Mill.) ...18
1.3.4. Paprastasis apynys (Humulus lupulus L.)...18
1.3.5. Vaistinė šventagaršvė (Angelica archangelica L.)...19
1.4. Rinkoje esantys preparatai, į kurių sudėtį įeina vaistinė melisa ...20
2. TYRIMO METODIKA...21
2.1. Tyrimo objektai ...21
2.2. Tyrime naudota įranga ir medžiagos...22
2.3. Metodika ...22
2.3.1. Ekstrakcijos metodas ...22
2.3.2. Chromatografijos metodas ...23
2.3.3. Rozmarino rūgšties kokybinis nustatymas ...24
2.3.4. Rozmarino rūgšties kiekybinis nustatymas...24
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS...26
3.1. Augalinių žaliavų ekstraktai ...26
3.2. Augaliniai preparatai...30
3.3. Rezultatų aptarimas...33
4. IŠVADOS...35
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...36
SANTRAUKA
L. Vitkevičiaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. dr. R. Marksienė; Lietuvos sveikatos moklų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. - Kaunas.
VAISTINĖS MELISOS (MELISSA OFFICINALIS L.) ĮVERTINIMAS SUDĖTINIUOSE PREPARATUOSE PAGAL ROZMARINO RŪGŠTIES KIEKĮ
Darbo tikslas:
Įvertinti vaistinę melisą sudėtiniuose preparatuose pagal nustatytą rozmarino rūgšties kiekį. Darbo uždaviniai:
1. Atlikti literatūros apžvalgą apie vaistinę melisą, jos kaupiamus biologiškai aktyvius junginius ir tyrimo metodus, taikomus šių junginių įvertinimui
2. Parinkti ir pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką rozmarino rūgšties kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui vaistinėse augalinėse žaliavose ir sudėtiniuose preparatuose.
3. Atlikti rozmarino rūgšties nustatymą vaistinėse augalinėse žaliavose, įeinančiose į tiriamų preparatų sudėtį.
4. Nustatyti rozmarino rūgštį tiriamuosiuose sudėtiniuose preparatuose ir įvertinti ar rozmarino rūgštis gali būti pritaikyta kaip vaistinės melisos standartizavimo žymuo.
Metodika:
Tyrimo objektas – trys pasirinkti sudėtiniai preparatai („Neuromed“, „Persen“, „Magnis 24“) bei į jų sudėtį įeinantys augalai (Vaistinė melisa, vaistinis valerijonas, pipirmėtė, tikroji levanda, paprastasis apynys, vaistinė šventagaršvė).
Tyrimo objektuose esančios rozmarino rūgšties analizė atlikta naudojant ESC. Rozmarino rūgštis tiriamosiuose objektuose nustatyta remiantis rozmarino rūgšties standarto sulaikymo laiku ir ultravioletinės (UV) šviesos absorbcijos spektru. Kiekybinis rozmarino rūgšties įvertinimas atliktas gradavimo grafiko metodu.
Rezultatai:
Rozmarino rūgštis nustatyta ir kiekybiškai įvertinta preparatuose: „Neuromed“ (2,30±0,021 mg/ml), „Persen“ (7,458±0,055 mg/g) ir „Magnis 24“ (0,904±0,0146 mg/g). Iš tirtų vaistinių augalinių žaliavų (VAŽ), rozmarino rūgštis nustatyta: vaistinėje melisoje, tikrojoje levandoje (įeina į „Neuromed“ sudėtį) ir pipirmėtėje (įeina į „Persen“ sudėtį). Didžiausias rozmarino rūgšties kiekis nustatytas vaistinėje melisoje (15,10±0,195 mg/g), o levandoje ir pipirmėtėje nustatytas 5-6 kartus mažesnis rozmarino rūgšties kiekis (atitinkamai 2,854±0,122 mg/g ir 2,600±0,052 mg/g).
Išvados:
1. Atlikus literatūros analizę, parinkta ir pritaikyta ESC metodika rozmarino rūgšties kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui VAŽ ir sudėtiniuose preparatuose.
2. Rozmarino rūgštis identifikuota ir kiekybiškai įvertinta trijose augalinėse žaliavose: vaistinėje melisoje, tikrojoje levandoje, pipirmėtėje.
3. Rozmarino rūgštis identifikuota ir kiekybiškai įvertinta tirtuose sudėtiniuose preparatuose („Neuromed“, „Persen“, „Magnis 24“).
4. Dėl „Neuromed“ sudėtyje esančios tikrosios levandos, o dėl „Persen“ sudėtyje esančios pipirmėtės, šiuose preparatuose („Neuromed“ ir „Persen“) esančios vaistinės melisos negalima nustatyti pagal rozmarino rūgštį.
5. Vaistinės melisos kiekį pagal rozmarino rūgštį galima nustatyti preparate „Magnis 24“. Praktinės rekomendacijos:
SUMMARY
LEMON BALM (Melissa officinalis L.) EVALUATION IN COMPOSITE PREPARATIONS BASED ON THE DETECTED ROSMARINIC ACID CONTENT
Objective:
Evaluate the Lemon balm in composite preparations by the detected amount of rosmarinic acid.
Tasks:
1. Analyse literature about Lemon balm, its biologically active components and analysis methods used for these components.
2. Choose and adapt a HPLC analysis method for rosmarinic acid qualitive and quantitive analysis in herbs and composite preparations.
3. Analyse rosmarinic acid in herbs, which are the components of the chosen composite preparations.
4. Analyse rosmarinic acid in the chosen composite preparations and determine if rosmarinic acid can be used as a marker for Lemon balm standardization.
Methods:
The objects of analysis are: 3 composite preparations (“Neuromed”, “Persen”, “Magnis 24”) and plants which are in the preparations (Valeriana officinalis L., Melissa officinalis L., Mentha
piperita L., Lavandula angustifolia Mill., Humulus lupulus L., Angelica archangelica L.).
The analysis was carried out by using a HPLC method. Rosmarinic acid was identified according to the retention time and the UV absorbtion spectra of the rosmarinic acid standard. Quantitive analysis was done by using a calibration curve method.
Results:
Rosmarinic acid was identified and quantified in the preparations: “Neuromed” (2,30±0,021 mg/ml), “Persen” (7,458±0,055 mg/g) and “Magnis 24” (0,904±0,0146 mg/g). Out of the analysed herbs, rosmarinic acid was identified in: Melissa officinalis, Lavandula angustifolia (component ofį „Neuromed“) and Mentha piperita (component of „Persen“). The largest concentration of rosmarinic acid was determined in Melissa officinalis (15,10±0,195 mg/g). In Lavandula angustifolia and Mentha
piperita the rosmarinic acid concentration was 5-6 times lower (2,854±0,122 mg/g and 2,600±0,052
mg/g respectively). Conclusions:
1. A HPLC method was chosen and adapted for the qualitive and quantitive analysis of rosmarinic acid in herbs and composite preparations.
2. Rosmarinic acid was identified and quantified in these herbs: Melissa officinalis, Lavandula
angustifolia, Mentha piperita.
3. Rosmarinic acid was identified and quantified in the analysed preparations (“Neuromed”, “Persen”, “Magnis 24”).
4. Because of the rosmarinic acid identified in Lavender (component of “Neuromed”) and in Peppermint (component of “Persen”), rosmarinic acid can not be used as a standardization marker for Lemon balm in these preparations (“Persen” and “Neuromed”).
5. Rosmarinic acid can be used as a standardization marker for preparation “Magnis 24”. Practical recommendations:
SANTRUMPOS
CCL5 – chemokinų (CC tipo) ligandas 5 DMSO - dimetilsulfoksidas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija IDO – indoleamino 2,3-dioksigenazė IL-1β – interleukinas 1 beta
IL-6 – interleukinas 6 IL-12 –interleukinas 12
NF-κB - aktyvuotų B ląstelių branduolio faktorių kapa lengvosios grandinės sustiprintojas (angl. Nuclear factor kappa-light-chain-enchancer of activated B cells)
PGE2 – prostaglandinas E2 RR – rozmarino rūgštis
TNF – auglio nekrozės faktorius (angl. Tumor necrosis factor) UV - ultravioletinė
SĄVOKOS
HaCaT – aneuploidinių, nemirtingų žmogaus keratinocitų ląstelių linija, naudojama moksliniuose tyrimuose.
RAW 264,7 – nemirtingų ląstelių linija, išgauta iš pelių leukeminių ląstelių, naudojama moksliniuose tyrimuose.
Į
VADAS
Vaistinių preparatų kokybė yra vienas iš svarbiausių kriterijų norint užtikrinti preparatų saugumą ir efektyvumą. Tas pats būdinga ir augaliniams preparatams, tačiau kitaip nei sintetiniams preparatams, kurie dažniausiai turi tik vieną veikliąją medžiagą, augalai turi daug sudedamųjų dalių, kurių svarba norimam poveikiui ne visada yra aiški ir kurių nustatymas šiuolaikiniais analizės metodais yra sudėtingas. Augalinių žaliavų cheminės kokybės tikrinimas turėtų susidaryti iš vieno ar daugiau junginių, kurių augalas kaupia daugiausiai, identifikavimo ir kiekybininio įvertinimo [1]. Augalinių žaliavų kokybės tikrinimas yra svarbus ne tik dėl falsifikatų nustatymo, bet ir dėl gaminamų preparatų standartizavimo, nes veikliųjų medžiagų kiekiai augalinėje žaliavoje gali varijuoti.
Vaistinė melisa (Melissa officinalis L.) yra nuo seno vartojamas vaistinis augalas, naudotas nerimo, streso ir virškinamojo trakto problemų gydymui [2]. Šiuolaikinėje praktikoje, vaistinėse parduodamos melisos lapų arbatos bei sudėtiniai augaliniai preparatai, sudėtyje turintys vaistinės melisos ekstrakto ir skirti daugiausiai vartoti nerimo slopinimui ir miego gerinimui. Kaip ir visų augalų, taip ir melisos gydomąjį poveikį apsprendžia visa grupė veikliųjų junginių, tačiau pagrindinis gydomasis poveikis priskiriamas melisos eteriniui aliejui bei fenoliniams junginiams [3]. Vienas iš svarbiausių fenolinių junginių, randamų vaistinėje melisoje, yra rozmarino rūgštis (RR). Melisa kaupia sąlyginai daug (3-4 %) šio fenolinio junginio [1, 4, 5], o pagal Europos Farmakopėją, vaistinės melisos išdžiovinti lapai turi turėti mažiausiai 4,0 % hidroksicinamono darinių, išreikštų per rozmarino rūgštį [6], todėl RR yra vienas iš veikliųjų junginių, kurie gali būti naudojami melisos preparatų standartizavimui ir kokybės vertinimui.
Šiuo metu rinkoje esantys augaliniai vaistinės melisos preparatai dažniausiai yra sudėtiniai, savo sudėtyje turintys panašaus poveikio augalų (valerijono, apynių, pipirmėtės). Tai gali apsunkinti kiekybinį rozmarino rūgšties įvertinimą, todėl, atliekant preparato analizę, svarbu žinoti ar kitose, į sudėtį įeinančiose, vaistinėse augalinėse žaliavose nėra rozmarino rūgšties.
Temos aktualumas. Moksliniu požiūriu yra svarbu gebėti įvertinti augalinių preparatų kokybę, naudojant šiuolaikinius analizės metodus. Kokybės tikrinimas yra svarbus ne tik preparatų gamyboje, bet ir jau rinkoje esančių preparatų kokybės įvertinimui.
Tyrimo problema. Sudėtiniuose augaliniuose preparatuose, dėl panašių augalų kaupiamų veikliųjų junginių, gali būti sudėtinga įvertinti preparatuose esančias augalines žaliavas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Įvertinti vaistinę melisą sudėtiniuose preparatuose pagal nustatytą rozmarino rūgšties kiekį.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti literatūros apžvalgą apie vaistinę melisą, jos kaupiamus biologiškai aktyvius junginius ir tyrimo metodus, taikomus šių junginių įvertinimui.
2. Parinkti ir pritaikyti ESC metodiką rozmarino rūgšties kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui vaistinėse augalinėse žaliavose ir sudėtiniuose preparatuose.
3. Atlikti rozmarino rūgšties įvertinimą vaistinėse augalinėse žaliavose, įeinančiose į tiriamų preparatų sudėtį (vaistinėje melisoje, vaistiniame valerijone, vaistinėje šventagaršvėje, tikrojoje levandoje, paprastajame apynyje ir pipirmėtėje)
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vaistinė melisa (Melissa officinalis L.)
Morfologija ir paplitimas. Augalas priklauso lūpažiedžių (Lamiaceae) šeimai. Tai kvapni daugiametė žolė, užauganti iki 1 m aukščio, dažnai turi kelis stiebus, patrinus kvepia citrinomis. Stiebai briaunoti. Lapai 2-9 cm ilgio ir 1-5 cm pločio, kotuoti, kiaušiniški, karbuoti arba karbuotai dantyti, nukirstu širdišku arba apvaliu pamatu. Viršutinė lapų pusė tamsial žalia, apatinė – blyškiai žalsva. Liaukiniai plaukeliai išsidėstę viršutinėje lapo dalyje ir apatinėje ant lapo gyslų. Žiedai balti ar rausvi [2, 6, 36].
Auga vakarinėje Azijoje ir rytiniame Viduržemio jūros regione. Kultivuojamas centrinėje, rytinėje ir vakarinėje Europoje bei JAV [2].
Vaistinė žaliava ir cheminė sudėtis. Kaip žaliava naudojami melisos ir lapai, ir žolė. [4] Žaliava turi turėti ne mažiau kaip 4,0% hidroksicinamono rūgščių perskaičiuotų į rozmarino rūgštį. Kiekybinis nustatymas atliekamas spektrofotometrijos metodu prie 505 nm bangos ilgio pagal Europos farmakopėjoje aprašyta metodą [2].
Pagrindinė sudedamoji dalis yra hidroksicinamono rūgštys (rozmarino iki 6%, p-kumaro, kavos, chlorogeno rūgštys) ir eterinis aliejus (0,02-0,37%) sudarytas iš daugiau negu 40% monoterpenų bei daugiau negu 35% seskviterpenų. Svarbiausias terpenoidas yra citralis (izomerų neralio ir geranialio mišinys), citronelalis, geraniolis ir nerolis. Taip pat yra flavonoidų, taninų, triterpeninių rūgščių (ursolo ir olenolinės rūgšties) [2].
Panaudojimas. Vaistinė melisa ir jos produktai yra plačiai vartojami. Ji naudojama: kaip prieskonis, arbatų ruošiniuose, ingredientas kosmetikoje ir medicinoje. Augalas tradiciškai vartotas gydyti katarą, karščiavimą, pilvo pūtimą, galvos skausmą, gripą, dantų skausmą. Jis taip pat pasižymi raminančiu, antidepresiniu, antivirusiniu, antibakteriniu ir antispazminiu poveikias [3, 4, 36, 37, 38, 39].
Augalo terapinis poveikis yra pagrinde siejamas su jo kaupiamu eteriniu aliejumi, tačiau fenolinių junginių frakcija, ypač RR, irgi yra atsakingi. Fenoliniai junginiai suteikia melisai antioksidantines ir antivirusines savybes [4, 40].
Vaistinės melisos eterinis aliejus. Vaistinės melisos eterinis aliejus išgaunamas iš šviežių ar džiovintų žiedų, lapų, žolės, naudojant distiliavimą vandens garais ar cheminę ekstrakciją. Šis aliejus pasižymi šviežiu citrinos aromatu ir šviesiai gelsva spalva [36].
monoterpenų aldehidai citralis (geranialis ir neralis) ir citronelalis, seskviterpenai kariofilenas ir β-kariofileno oksidas. Monoterpenų alkoholiai nerolis, geraniolis ir citronelolis aptinkami mažesniais kiekiais. 6-metil-5-hepten-2-onas yra laikomas charakteringu melisos eterinio aliejaus komponentu. [41].
Tyrimuose nustatyti eterinio aliejaus komponentai bei jų kiekiai dažnai skiriasi. Tokie skirtumai gali atsirasti dėl skirtingų auginimo sąlygų, augalo vegetacijos periodo, naudojamų skirtingų augalo dalių ar dėl genetinių priežasčių [39, 41].
Dėl nedidelio sukaupiamo eterinio aliejaus kiekio, vaistinės melisos eterinis aliejus yra brangus. Tai skatina jo falsifikavimą. Melisos eterinio aliejaus kokybė yra tikrinama pagal citralį ir citronelalį, nustatant jų kiekius ar nustatant jų chirališkumą [3, 41, 42].
1.2. Rozmarino rūgštis
Rozmarino rūgštis (IUPAC pavadinimas: (2R)-2-[[(2E)-3-(3,4-Dihidroksifenil)-1-okso-2-propenil]]oksi]-3-(3,4-dihidroksifenil)propapiono rūgštis; struktūrinė formulė pavaizduota 1 pav.) yra natūraliai randamas fenolinis junginys, daugiausiai paplitęs Boraginaceae šeimos ir Lamiaceae šeimos
Nepetoideae pošeimio augaluose, kuris pirmą kartą grynas išskirtas iš Rosmarinus officinalis
(Kvapiojo rozmarino)[7]. Tai kieta kristalinė medžiaga, kurios lydymosi temperatūra 171-175 oC, ji tirpi etanolyje, dimetilsulfokside (DMSO) ar dimetilformamide iki apie 25 mg/ml koncentracijos [8].
RR yra plačiai naudojama nuo maisto priedų iki kosmetikos, be to, turi medicininį pritaikymą dėka savo antimikrobinio ir antioksidacinio poveikių [9]. Taip pat, RR pasižymi priešuždegiminiu, kepenų pažaidą mažinančiu, alergines reakcijas slopinančiu poveikiais [10]. Rozmarino rūgšties savybės skatina ieškoti daugiau jos pritaikymo galimybių, tokių kaip Alzheimerio ligos, kardiovaskulinių ligų, atopinio dermatito simptomų gydymui [7].
1.2.1. Biologinis rozmarino rūgšties poveikis
Priešuždegiminis rozmarino rūgšties poveikis. Ji gali apsaugoti odą nuo kenksmingo saulės UV šviesos poveikio. Žmogaus HaCaT keratinocitų ląstelėse, RR, esant koncentracijai 0,18-1,8 mg/ml, sumažina reaktyvių deguonies formų gamybą, kurią sukelia UV (295-315 nm) šviesa, bei sustabdo interleukino 6 (IL-6) sekreciją ir blokuoja apoptozę [11].
1-100 µM RR inhibavo indoleamino 2,3-dioksigenazės (IDO) ekspresiją ir aktyvumą interferono-γ stimuliuotose, iš pėlės kaulų čiulpų gautose, dentritinėse ląstelėse, susietą su nuo IDO priklausoma T ląstelių supresija. RR taip pat gali užslopinti interferono-γ sukeltą signalo perdavėjo ir transkripcijos aktyvatoriaus aktyvavimą [12].
Tyrime su pelėmis, kuriame oda buvo paveikta forbolio esteriu, 12-O—tetradekanoilforbol-13-acetatu, nustatyta, kad rozmarino rūgšties inhibuoja neutrofilų infiltracijos ir mieloperoksidazės aktyvumą bei sumažina tarpląstelinės adhezijos molekulės-1, kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulės-1 ir uždegiminio baltymo-2 koduojančių iRNR ekspresiją. [13]
RR, vartojama 5, 10 ir 20 mg/kg dozuotėmis, pasižymėjo priešuždegiminiu poveikiu pelėms, kurioms buvo su lipopolisacharidais sukelta ūmi plaučių pažaida. RR veikė slopindama užląstelinio signalų perdavimo kelius. Be to, pelėms, kurioms skirta RR prieš paveikimą su lipopolisacharidais, buvo mažesnė auglio nekrozės faktoriaus alfa (TNF-α), IL-6 ir interleukino 1β (IL-1β) gamybą ir bendras mažesnis kiekis uždegiminių ląstelių (įskaitant neutrofilus ir makrofagus) bronchoalveoliniame lavaže [14].
Antioksidacinis rozmarino rūgšties poveikis. Šis poveikis yra pagrinde siejamas su laisvųjų radikalų surišimu ir tuo sukelta ląstelių plazminės membranos stabilizacija ir apsauga nuo oksidacinio pažeidimo [15].
Rozmarino rūgšties vandeniniai ir etanoliniai (2,1±0,3 µM; 30 µg/ml) Prunella vulgaris (Paprastoji juodgalvė) ekstraktai žymiai sumažino lipopolisacharidų sukeltą prostaglandino E2 (PGE2) ir azoto oksido gamybą RAW 264,7 ląstelėse ir inhibavo lipopolisacharidų stimuliuotą ciklooksigenazės-2 ekspresiją [16].
RR (koncentracijos: 1, 5, 10 ir 20 µg/ml) sumažino intraląstelinį reaktyviųjų deguonies formų gamybą ir, inhibuodamas c-Jun-n-terminalinę kinazę bei ekstraląstelinių signalų reguliuojamą kinazę, padėjo mitochondrijos membranos potencialo atsistatymui. Ji taip pat padidino reaktyvumą glutationui ir natrio oksidazės dismutazei [17].
žmogaus dantenų fibroblastų ląstelėse, kuriose su lipopolisacharidais buvo sukeltas oksidacinis stresas ir uždegimas [18].
Antimikrobinis rozmarino rūgšties poveikis. RR, koncentracijomis iki 500mM, ir dodecilrosmarinatas, koncentracijomis nuo 0,00635 iki 12,8 mM, inaktyvuoja Staphylococcus
carnosus LTH1502. Jų antimikrobinis poveikis priklauso nuo terpės pH ir nuo medžiagų
koncentracijos [19].
RR, koncentracijomis nuo 0,3 iki 1,3 mg/ml, taip pat slopino ir baktericidiškai veikė prieš 8 patogenines bakterijas: Staphylococcus epidermidis 5001, Stenotrophomonas maltophilia,
Staphylococcus lugdunensis T26A3, Enterococcus faecalis C159-6, Pseudomona aeruginosa ATCC
27583, Corynebacterium T25-17, Mycobacterium smegmatis 5003 ir Staphylococcus warneri T12A12 [20].
Priešvirusinis poveikis. Tyrime RR buvo paveikta NaNO2, acetatiniame buferyje, ir po 5 ar
10 min. gauti mono- ir dinitrorosmarino rūgštys. Abi rūgštys padidino žmogaus imunodeficito viruso integrazės aktyvumą ir inhibavo viruso replikaciją žmogaus limfocitų MT-4 ląstelėse, nesukeldamos ląstelinio toksiškumo [21].
Japoniškojo encefalito virusu apkrėstų pelių gydomas su 25 mg/kg rozmarino rūgšties doze sumažino pelių mirtingumą iki 20 % lyginant su kontroline grupe. Apkrėstų pėlių serume ir smegenų skystyje buvo nustatyta padidėjusi TNF-α, IL-6, IL-8 ir chemokinų (CC tipo) ligando 5 (CCL5) koncentracija, kuri tiesiogiai susijusi su pelių mirtingumu [22].
RR taip pat gali žymiai sumažinti uždegiminių citokinų ir chemokinų, tokių kaip ciklooksigenazė-2, interleukinas 12 (12), TNF-α, TNF-γ, monocitų chemotaktinis baltymas-1 ir IL-6, gamybą, inhibuodama aktyvuotų B ląstelių branduolio faktorių kapa lengvosios grandinės sustiprintojo (NF-κB) fosforilinimą [23].
Neuroprotekcinis poveikis. RR yra efektyvi gydant neurodegeneracines ligas ir gerina kognityvines funkcijas. Vienama tyrime, 56 µM rozmarino rūgšties ženkliai sumažino ląstelių apoptozę ir reaktyvių deguonies formų gamybą, paveikus vandenilio peroksidu. RR taip pat žymiai slopino apoptozę skatinančio Bax baltymo ekspresiją, bet išlaikė normalų antiapoptozinio baltymo Bcl-2 kiekį žmogaus dopaminerginėse SH-SY5Y ląstelėse, paveiktose oksidacinio streso. Nustatytas jos indukcinis poveikis antioksidaciniui fermentui hemooksigenazei-1 [24].
RR (koncentracijomis nuo 10 iki 100 µM) gali padėti išvengti oksidacinio streso ir NF-κB baltymo komplekso translokacijos [25].
Tyrime su Alzheimerio ligos modelio transgeninėmis pelėmis (Tg2576), RR slopino β-amiloido plokštelių vystymasį ir įvairius agregacijos kelius [27].
1.2.2. Rozmarino rūgšties analizė
Rozmarino rūgšties nustatymui augalinėje žaliavoje reikia atlikti žaliavos ekstrakciją ir analizuoti gautąjį ekstraktą.
Ekstrakcija. Yra įvairūs galimi ekstrakcijos būdai, kurie skiriasi savo trūkme, naudojamais tirpikliais, proceso sudėtingumu bei naudojama įranga.
Paprasčiausias metodas yra maceracija, kada augaline žaliava laikoma ekstrahente ilgą laiko tarpą. Fenolinės rūgštys galima išekstrahuoti iš išdžiovintos ir susmulkintos žaliavos naudojant organinius tirpiklius, kaip etanolį, metanolį ir acetoną ir laikant savaitę 35-40 oC temperatūroje [28]. Gautasis ekstraktas koncentruotas rotaciniu garintuvu, o sausasis likutis ištirpintas acetonitrilę ir centrifuguotas 5000 rpm 10 min. ir gautasis skystis toliau analizuotas [28].
Maceruoti galima ir trumpiau. Norint ištirti fenolinius junginius augalinėje žaliavoje, žaliava ekstrahuota etilacetatu, distiliuotu vandeniu ir etanoliu (žaliavos ir tirpiklio santykis 1:10) ją laikant 10 val. kambario temperatūroje, retkarčiais pamaišant [29]. Tyriant paprastosios juodgalvės ekstrakto biologinį poveikį, ekstraktas gautas sudžiovintą ir susmulkintą žaliavą ekstrahuojant metanoliu 24 val., 60 oC, o gautąjį ekstraktą toliau gryninant [30].
Greitesnis metodas yra ekstrakcija naudojant ultragarso voneles, kurios pagreitina medžiagų ekstrakciją iš žaliavos. Rozmarino rūgšties kiekiui palyginti tarp notrelinių šeimos augalų, naudota vandens:metanolio:2-propanolio (kurių kiekviename buvo 0,085% o-fosforo rūgšties) (santykis 80:10:10) tirpiklių sistema. Susmulkinta žaliava užpilta tirpikliu ir ekstrahuota 30 min. ultragarso vonelėje, tada centrifuguota ir skystoji fazė nupilta, o kietasis likutis ekstrahuotas dar 2 kartus [5]. Tyriant fenolinių rūgščių kiekį bulvių gumbuose, susmulkinta žaliava ekstrahuota 0,5 % acto rūgšties tirpalu metanolyje, naudojant ultragarso vonelę 25 minutes [31]. Vaistinės melisos augalinės žaliavos kokybės įvertinimui, žaliava ekstrahuota su metanolio ir vandens mišiniu (80:20) 30 min. veikiant ultragarsu, o gautą suspensiją centrifuguojant, dekantuojant ir ekstrakciją kartojant dar 2 kartus [1]. Taigi, naudojant ultragarso vonelę, ekstrakcija trunka iki 30 min. kitaip negu maceruojant, kada ekstrakcija gali trūkti virš paros, todėl ekstrakcija ultragarsu yra geresnis metodas.
Dažniausiai naudojama 250 x 4,6 mm kolonėlė, užpildyta 5 µm dydžio C18 sorbento dalelėmis [1, 5, 28, 29, 31, 32, 33].
Vaistinės melisos žaliavos kokybės vertinimui naudota mobili fazė iš 0,05 % trifluoracto rūgšties metanolinio (A) ir vandeninio (B) tirpalų, kurių tekmės gradientas: 0-25 min. buvo linijinis 15-75% A; 25-30 min. izokratinis 75 % A; 30-35 min. linijinis 75-15 % A [1].
Rozmarino rūgšties identifikavimui vaistinio šalavijo ekstrakte naudota tirpiklių sistema iš 20 % metanolio ir 80 % vandeninio 0,25 % skrūzdžių rūgšties tirpalo, kuri po injekcijos 50 min. linijiškai kito iki 100 % metanolio [32].
Sudėtingesnė eliuentų sistema pritaikyta rozmarino rūgšties kiekio lyginimui notrelinių šeimos augaluose. Naudoti o-fosforo rūgšties 0,085 % tirpalai vandenyje (A), metanolyje (B) ir 2-propanolyje (C), kurių santykis pradžioje buvo 80:10:10, po 10 min. 70:15:15, o po 15 min. 60:20:20 [5].
Fenolinių rūgščių, esančių siauralapiame bazilike, atskyrimui naudota mobili fazė iš acetonitrilo (A) ir vandeninio 0,1 % acto rūgšties tirpalo (B), kurių tekėjimo gradientas buvo: 0 min. 10 % A; 5 min. 20 % A; 10 min. 40 % A; 15 min. 60 % A; 20 min. 80 % A [28].
Chromatografiniui raudonėlio, levandos ir melisos ekstraktų atskyrimui naudotas 2 % acto rūgšties vandeninis tirpalas (A) ir acetonitrilas (B), kurių kiekis pradžioje buvo 95 % A ir 5 % B, o po 10 min. pradėtas keisti: per 1 min. A kiekis sumažintas iki 90 %; per 9 min. A sumažėjo iki 60 %; per 10 min. A kiekis padidintas iki 80 %; per kitas 10 min. A sumažintas iki 60 %; po 5 min. A sumažėjo iki 0 % ir toks santykis tęstas iki pabaigos [29].
Fenolinių rūgščių kiekiui įvertinti naudota eliuentų sistema iš 0,5 % acto rūgšties tirpalo vandenyje (A) ir metanolio (B), o gradientų sistema buvo: 0 min. 95 % A; 40 min. 40 % A; 41 min. 10 % A; 55 min. 10 % A; 56 min. 95 % A [31].
Polifenolinių junginių, esančių miškinėje mėtoje ir vaistinėje melisoje, analizei naudota skrūzdžių rūgšties 1 % vandeninis tirpalas (A) ir metanolis (B), kurių santykiai (A:B) buvo: 0 min. 90:10; 10 min. 75:25; 20 min. 40:60; 30 min. 90:10 [34].
Fenolinių junginių nustatymui juodgalvėje naudoti eliuentai 1 % skrūzdžiū rūgštis (A) ir acetonitrilas (B), kurių kiekiai buvo: 0-10 min. 13 % B; 10-20 min. 41,5 % B; 20-25 min. 70 % B; 25-35 min. 10 % B [25-35].
Taigi, fenolinių junginių, kartu ir rozmarino rūgšties, analizei dažniausiai naudojama eliuentų sistema, kurioje laikui bėgant keičiamas tirpiklių santykis. Dažniausiai naudojami eliuentai: metanolis, acetonitrilas ir vandeniniai acto ar skrūzdžių rūgšties tirpalai.
Dažnai taikomas ESC UV-vis šviesos detektorius, kuris naudojamas nustatytos bangos ilgio šviesos absorbcijai matuoti [1, 28, 33]. Kitas detektorius, leidžiantis kartu išmatuoti ne tik šviesos absorbciją ties vienu bangos ilgiu, bet ir junginio absorbcijos spektrą, yra fotodiodų matricos detektorius, kuris yra parankesnis tiriant daug junginių turinčius mišinius, tokius kaip augalų ekstraktus [5, 31, 33, 34]. Sudėtingesnis ir brangesnis, bet leidžiantis tiksliau identifikuoti junginius, detektorius yra masių detektorius, kuris fiksuoja jonizuotų junginio molekulės dalių mases, kas leidžia jas, o kartu ir patį pirminį junginį, identifikuoti ir nenaudojant standartų. [29, 32].
1.3. Kiti tiriamųjų preparatų sudėtyje esantys augalai
1.3.1. Vaistinis valerijonas (Valeriana officinalis L.)
Morfologija ir paplitimas. Vaistinis valerijonas yra valerijoninių (Valerianaceae) šeimos augalas. Tai aukštas daugiametis augalas, kurio požeminė dalis sudaryta iš stataus šakniastiebio ir gausių šaknų. Antžeminė dalis – iš tuščio cilindriško stiebo, kuris gali užaugti iki 2 m aukščio. Stiebas yra nešakotas ar viršūnėje išsišakojantis. Lapai neporomis plunksniški, skroteliniai lapai ilgakočiai, o stiebiniai – bekočiai ar trumpakočiai. Žiedai yra išsidėstę netikruose skėčiuose, kvapnūs, balti ar rausvi. [43]
Valerijonas plačiai paplitęs vidutinių platumų ir subpoliarinėje klimato zonoje visame Eurazijos žemyne. Augalas randamas drėgnose miškuose, grioviuose, palei upes. Kaip medicininis augalas, vaistinis valerijonas kultyvuojamas Belgijoje, Anglijoje, rytinėje Europoje, Prancūzijoje, Vokietijoje, Nyderlanduose, Rusijoje ir JAV. [43]
Vaistinė žaliava ir cheminė sudėtis. Kaip žaliava naudojami valerijono šakniastiebis su šaknimis. [6, 43]
Išdžiovintoje žaliavoje turi būti mažiausiai 4 ml/kg eterinio aliejaus ir 0,17 % (m/m) seskviterpeninių rūgščių, išreiškštų valerijono rūgštimi. Eterinis aliejus kiekybiškai nustatomas atliekant distiliaciją, o seskviterpeninės rūgštys – atliekant skysčių chromatografiją pagal Europos farmakopėjoje nurodyras metodikas. [6]
dalys yra β-kariofilenas, valeranonas, valerenalis, valereninė rūgštis ir kiti seskviterpenoidai ir monoterpenai. [43]
Kita svarbi grupė junginių (sudaro 0,05-0,67 %) yra eilė neglikozidinių, biciklinių iritoidinių monoterpenų epoksi-esterių, žinomų kaip valepotriatai. Svarbiausieji yra valtratas ir izovaltratas, kurie paprastai sudaro daugiau negu 90 % valepotriatų frakcijos. Aptinkami ir mažesni kiekiai dihidrovaltrato, izovaleroksi-hidroksidihidrovaltrato, 1-acevaltrato ir kitokių valepotriatų. [43]
Panaudojimas. Vaistinis valerijonas nuo seno taikomas tradicinėje medicinoje. Jis pasižymi silpnu raminamuoju ir miegą skatinančiu poveikiu. Valerijono preparatai gali būti naudojami kaip švelnesnio poveikio alternatyva stipresniems raminamiesiems preparatams, tokiems kaip benzodiazepinai. Tradicinėje medicinoje valerijonas taip pat vartotas neuralgijų, epilepsijos, virškinamojo trakto spazmų gydymui. [43, 44]
1.3.2. Pipirmėtė (Mentha x piperita L.)
Morfologija ir paplitimas. Augalas iš lūpažiedžių (Lamiaceae) šeimos. Tai daugiametė žolė, užauganti iki 30-90 cm aukščio. Jos stiebas keturbriaunis, šakotas. Lapai priešiniai, kotuoti, pailgi, dantyti, tamsiai žalios spalvos. Žiedai violetinės spalvos, išsidėstę menturiškai ir sudaro varpas. Augalas yra stipraus specifinio kvapo ir šaldančio skonio. [2]
Pipirmėtė gamtoje nepaplitusi, o tik kultyvuojama. Plačiausiai kultyvuojama rytinėje ir šiaurinėje Europoje bei JAV. [2]
Vaistinė žaliava ir cheminė sudėtis. Kaip žaliava naudojami sveiki ar susmulkinti džiovinti pipirmėtės lapai. [2, 6]
Žaliava turi turėti ne mažiau kaip 12 ml/kg ir 9 ml/kg eterinio aliejaus, kurio kiekis nustatomas distiliacijos metodu, aprašytu Europos farmakopėjoje. [2, 6]
Pagrindinė pipirmėtės lapų sudedamoji dalis yra eterinis aliejus, kurio gali būti nuo 0,5 iki 4 %, ir kurio sudėtyje yra mentolas (30-55 %) ir mentonas (14-32 %). Mentolis paprastai randamas laisvoje alkoholinėje formoje bei nedideliais kiekiais kaip acetatas (3-5 %) ir valerato esteriai. Kiti eteriniame aliejuje randami monoterpenai yra: izomentonas (2-10 %), 1,8-cineolis (6-14 %), α-pinenas (1,0-1,5 %), β-pinenas (1-2 %), limonenas (1-5 %), neomentolis (2,5-3,5 %) ir mentofuranas (1-9 %). [2]
Pats augalas ir jo eterinis aliejus taip pat nuo seno vartotas tradicinėje medicinoje, o šiuo metu pipermėtės preparatai vartojami virškinamojo trakto problemoms, tokioms kaip dispepsija, pilvo pūtimas ar pilvo skausmas. Pipirmėtei priskiriamas ir raminantis poveikis.[2]
1.3.3. Tikroji levanda (Lavandula angustifolia Mill.)
Morfologija ir paplitimas. Tai lūpažiedžių (Lamiaceae) šeimos augalas. Tai aromatingas, 1-2 m aukščio puskrūmis. Jo šakos yra pilkai ar tamsiai rudos spalvos su ilgais, žiedynus turinčiais, ar trumpais, lapuotais ūgliais. Lapai linijiški ar linijiškai lancetiški. Žiedai susitelkę po 3-8 į retus menturius, kurie stiebo viršūnėje sudaro ilgas varpas. Žiedų taurelė 4-5 mm ilgio, su trumpais, bukais danteliais. Vainikėlis dvigubai ilgesnis už taurelę, šviesiai violetinės ar melsvos spalvos. [46]
Tikroji levanda natūraliai auga šiauriniame Viduržemio jūros regione. Ji kultyvuojama pietinėje Europoje ir Bulgarijoje, Rusijoje, JAV bei buvusioje Jugoslavijoje. [46]
Vaistinė žaliava ir cheminė sudėtis. Tikrosios levandos vaistinė augalinė žaliava yra žydėjimo metu surinkti ir išdžiovinti žiedai. [46]
Pagal Europos farmakopėją, žaliavoje turi būti mažiausiai 13 ml/kg eterinio aliejaus, gauto distiliacijos vandens garais metu. [6]
Žieduose randama 1-3 % eterinio aliejaus, kurio pagrindinės sudedamosios dalys yra: linalylacetatas (30-55 %) ir linaloolis (20-50 %). Taip pat aptinkamas β-ocimenas, 1,8-cineolis, kamforas ir kariofileno oksidas. [46]
Panaudojimas. Levandų aliejus yra gerai žinomas dėl savo kvapo. Jis plačiai taikomas parfumerijoje ir kosmetikoje. [47]
Augalas medicinoje vartojamas dėl jo raminančio, užmigti padedančio bei antispazminio poveikio. Pasižymi antioksidaciniu ir antibakteriniu poveikiu. [46]
1.3.4. Paprastasis apynys (Humulus lupulus L.)
maži, žaliai balsvi ar gelsvai žali, susitelkę pažastiniuose ar viršutiniuose šluoteliniuose žiedynuose. Piesteliniai žiedai kankorėžio formos, susitelkę trumpakotėse varpose. Žydi birželio-rugpjūčio mėnesiais. [46]
Vaistinė žaliava ir cheminė sudėtis. Kaip žaliava naudojami sudžiovinti apynių spurgai [46] Pagrindinės sudedamosios dalys yra kartumynai (15-25 %) esantys dervose. Dervos yra skirstomos į kietas (netirpios petroleteryje) ir minkštas. Lipofilinės minkštosios dervos sudarytos pagrinde iš α-rūgščių (pvz. α-humulenas ir panašūs humulonai) bei β-rūgščių (lupulonų). Pagrindinės minkštųjų dervų sudedamosios dalys yra humulonas ir lupulonas bei jų derivatai, kurie atitinkamai sudaro 2-10 % ir 2-6 % dervos. Kietoji derva sudaryta iš hidrofilinės frakcijos, δ-dervos, ir iš lipofilinės frakcijos, γ-dervos. Eterinis aliejus (0,3-1,0 %) sudarytas daugiausiai iš monoterpenų ir seskviterpenų, tokių kaip β-kariofilenas, farnezenas, humulenas ir β-mircenas. Eteriniame aliejuje yra pėdsakai 2-metilbut-3-en-2-olio, kurio kiekis laikant žaliavą didėja dėl humulonų ir lupulonų degradacijos. Kitos sudedamosios dalys yra chalkonas, ksantohumolis, prenilflavonoidai ir kiti flavonoidai (pvz. kemferolis, rutinas) bei taninai. [46]
Panaudojimas. Apyniai nuo seno yra vartojami nervinės įtampos bei nemigos gydymui [46]. Dėl kaupiamų kartumynų, apyniai tinka dispepsijos gydymui bei apetito žadinimui [46].
1.3.5. Vaistinė šventagaršvė (Angelica archangelica L.)
Morfologija ir paplitimas. Augalas priklauso skėtinių (Umbeliferae) šeimai. Tai dvimetis, kartais daugiametis augalas, pirmaisiais augimo metais išauginantis lapus, o antraisiais išaugina storą tuščiavidurį stiebą, galintį pasiekti iki 2 m aukštį [48]. Šaknis stambi, mėsinga, turinti daug pridėtinių šaknų [49]. Lapai 2-3 kartus plunksniški, lapeliai su dantytais ar pjūkliškais kraštais. Augalas žydi liepą, jo žiedai maži, bet gausūs, gelsvi ar žalsvi, susitelkę į didelius rutuliškus sudėtinius skėčius. Išaugina blyškiai gelsvus, pailgus vaisius. [48]
Šventagaršvė auga drėgnoje žemėje, netoli upių ar vandens telkinių [48, 49]. Manoma, kad augalas kilęs iš šiuolaikinės Sirijos teritorijos, tačiau laikui bėgant paplito į vėsesnio klimato zonas Europoje ir dabar gausiai randamas Šiaurės Europoje, Skandinavijoje [49].
α-terpineolio, cadineno, borneolio, α-kariofileno, bisabololio bei kitų mono- bei seskviterpenų. Kitos sudedamosios dalys: selimonas, archangelinas bei oksipeucedaninas. [49]
Panaudojimas. Šventagaršvė plačiai naudojama ne tik kaip medicininis augalas, bet ir kaip prieskonis maisto ruošimui. Jos skonis primena kadagio uogų skonį, todėl naudojamas džino gamyboje. Šventagaršvės sėklos dėl savo aromatingumo ir kartaus skonio vartojamos ir kitų alkoholinių gėrimų gamyboje, tokių kaip vermutas. [49]
Šventagaršvės šaknys yra naudojamos kaip pilvo pūtimą mažinanti, prakaitavimą bei diurėzę skatinanti, antiseptiniu poveikiu pasižyminti priemonė. Jos taip pat naudojamos ir kaip antidepresinė priemonė. Šaknys naudojamos leukodermos gydymui ir dantų preparatuose. Yra nustatytas šventagaršvės šaknų poveikis, skatinantis skrandžio ir kasos sekreciją. [49]
1.4. Rinkoje esantys preparatai, į kurių sudėtį įeina vaistinė melisa
Šiuo metu Lietuvos rinkoje yra šie preparatai, į kurių sudėtį įeina vaistinė melisa:
1. Arbatos. Arbatos gali būti sudarytos vien iš melisos lapų, supakuotos į arbatos maišelius ar palaidos. Arbatos gali būti ir sudėtinės, kaip pvz. Acorus arbatos „Neuro-1“ ir „Neuro-3“, kur vaistinės melisos lapai yra tik viena iš sudedamųjų dalių. „Neuro-1“ arbatoje be melisos lapų yra levandų žiedai, pasiflorų žolė ir pipirmėčių lapai, o „Neuro-3“ arbatoje yra valerijonų šaknys, pipirmėčių lapai ir apynių spurgai.
2. Skysti preparatai. Tai sirupai („Melisovit“), lašai („Neuromed“, „Valocordin Phyto“), geriamieji skysčiai („Iberogast“), vartojami per os. Šie preparatai yra sudėtiniai, vartojami nuo nervinių, kardiovaskulinių bei virškinamojo trakto sutrikimų. Juose vaistinė melisa įeina skystojo ekstrakto pavidalu.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektai
Tirti trys šiuo metu rinkoje esantys sudėtiniai preparatai, į kurių sudėtį įeina vaistinė melisa. Taip pat buvo tiriamos ir į preparatų sudėtį įeinančios VAŽ.
Vaistiniai preparatai:
1. „Neuromed“ geriamieji lašai (tirpalas). Tai tradicinis augalinis vaistinis preparatas, kurio indikacijos pagrįstos tik ilgalaikiu vartojimu, skirtas nestipriems nervinės įtampos simptomams mažinti, miegui gerinti bei virškinimo sutrikimams lengvinti. [51] Jo 1 ml yra 1 ml skystojo ekstrakto (1:2) iš Valeriana officinalis L.s.l., radix (vaistinio valerijono šaknų), Angelica
archangelica L. radix (vaistinių šventagaršvių šaknų), Melissa officinalis L. folium (vaistinių
melisų lapų), Humulus lupulus L. flos (apynių spurgų), Lavandula angustifolia Mill., flos (tikrųjų levandų žiedų), santykiu 6:4:5:2:3. Ekstrahentas – 70 % (V/V) etanolis. [51]
2. „Persen“ dengtos tabletės. Tai nereceptinis vaistinis preparatas, skirtas laikinos nedidelės nervinės įtampos mažinimui ir pasunkėjusio užmigimo lengvinimui. Vidutinė tabletės masė yra 0,400 g. Vienoje Persen tabletėje yra:
• 35 mg Valeriana officinalis L., radix (vaistinio valerijono šaknų) sausojo alkoholinio ekstrakto (4-7:1), ekstrahentas 70 % (V/V) etanolis;
• 17,5 mg Melissa officinalis L. folium (vaistinės melisos lapų) sausojo ekstrakto (3-6:1), ekstrahentas 50 % (V/V) etanolis;
• 17,5 mg Mentha x piperita L., folium (pipermėtės lapų) sausojo ekstrakto (3-6:1), ekstrahentas 40 % (V/V) etanolis. [51]
Maisto papildai:
1. „Magnis 24” kapsulės. Tai magnio ir vitamino B6 maisto papildas, kuris sudarytas iš dviejų skirtingų spalvų kapsulių, vienos kapsulės yra dramblio kaulo, o kitos mėlynos spalvos. Abiejų kapsulių sudėtis yra identiška, tik mėlynoje kapsulėje yra papildomai įdėta sausojo Melissa
officinalis L. lapų ekstrakto. Vienoje mėlynoje Magnis 24 kapsulėje yra: 1 mg (71 % RPN)
vitamino B6, 150 mg (40 % RPN) magnio ir 100 mg sausojo vaistinių melisų lapų ekstrakto [52].
Vaistinės augalinės žaliavos:
1. Džiovintos Valeriana officinalis L. (vaistinio valerijono) šaknys; 2. Džiovinti Melissa officinalis L. (vaistinės melisos) lapai;
4. Džiovinti Lavandula angustifolia Mill. (tikrosios levandos) žiedai; 5. Džiovinti Humulus lupulus L. (paprastojo apynio) spurgai;
6. Džiovintos Angelica archangelica L. (vaistinės šventagaršvės) šaknys.
2.2. Tyrime naudota įranga ir medžiagos
Naudota įranga:
1. „Waters 2695“ („Waters“, Milfordas, JAV) skysčių chromatografas;
2. ACE® 121-2546 250x4,6 mm, C18 efektyviosios skysčių chromatografijos kolonėlė; 3. „Waters 996 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV) fotodiodų matricos detektorius; 4. Ultragarso vonelė „Biosonic UC100“;
5. Membraniniai 0,22 µm porų dydžio PTFE filtrai („Frisentte“, Danija) Naudotos medžiagos:
1. 96 % etanolis („Stumbras“, Lietuva); 2. Distliuotas vanduo;
3. Metanolis („Sigma-Aldrich“, Vokietija) ;
4. Ledinė acto rūgštis („Sigma-Aldrich“, Vokietija);
5. Rozmarino rūgštis ≥ 98 % (HPLC) („Sigma-Aldrich“, Vokietija)
2.3. Metodika
2.3.1. Ekstrakcijos metodas
Augalinės žaliavos buvo ekstrahuojamos apie 0,2 g žaliavos praskiedžiant su 70 % (V/V) etanoliu iki 20 ml. Tada vykdant ekstrakciją ultragarso vonelėje 20 min., o po to gauti ekstraktai filtruoti ir chromatografuojami.
Skystasis „Neuromed“ preparatas buvo praskiestas su 70 % (V/V) etanoliu 50 kartų ir tada chromatografuojamas.
Preparato „Magnis 24“ dvi mėlynos spalvos kapsulės buvo išardytos, o jų turinys buvo ekstrahuotas su 20 ml 70 % (V/V) etanoliu, naudojant ultragarso vonelę 20 min. Gautasis ekstraktas filtruotas ir toliau analizuotas naudojant ESC.
Kiekvienas ekstraktas buvo gamintas ir tirtas 3 kartus.
2.3.2. Chromatografijos metodas
Rozmarino rūgšties nustatymui ir kiekybiniui įvertinimui pritaikytas fenolinių junginių nustatymui skirtas ESC metodas, kuris buvo optimizuotas ir standartizuotas fenolinių junginių nustatymui bulvių gumbuose [50]. Šis metodas buvo validuotas atsižvelgiant į Tarptautinės harmonizacijos konferencijos gairių nuorodas, įvertintas metodo specifiškumas (tiriamų junginių sulaikymo laikas ir UV absorbcijos spektras sutampa su standarto), linijiškumas (determinacijos koeficientai artimi vienetui), tikslumas (atkuriamumo ribos 96-103 %, rezultatų santykinis standartinis nuokrypis < 3 %), glaudumas (atsikartojamumo ir tarpinio preciziškumo rezultatų santykiniai standartiniai nuokrypiai neviršija 2 %) bei aptikimo ir nustatymo ribos [50]. Metodas pasirinktas, nes jis validuotas ir optimizuotas fenolinių junginių, įskaitant ir rozmarino rūgštį, įvertinimui.
Tyrimas buvo atliekamas naudojant ESC su fotodiodų matricos detektoriumi. Analizė atlikta su „Waters 2695“ („Waters“, Milfordas, JAV) chromatografu. Naudotas detektorius „Waters 996 PDA“ („Waters“, Milfordas, JAV).
Naudota ACE 121-2546 250 x 4,6 mm kolonėlė, užpildyta 5 µm C18 sorbentu. Gradientinė eliucija atlikta su dviem eliuentais: 0,5 % acto rūgšties vandeniniu tirpalu (A) ir metanoliu (B). Eliuentu gradientas pateiktas 1 lentelėje. Eliuentų tekėjimo greitis 1 ml/min. Chromatografija atlikta kambario temperatūros sąlygomis. Injekcijos tūris 10 µl.
1 lentelė. Gradientinės eliucijos sąlygos
Laikas (min) A kiekis (proc.) B kiekis (proc.)
0-40 95 5
40-41 40 60
41-55 10 90
2.3.3. Rozmarino rūgšties kokybinis nustatymas
Rozmarino rūgštis buvo nustatoma lyginant gautas chromatogramas su RR standarto chromatograma, pagal sulaikymo laiką ir UV šviesos absorbcijos spektrą. Rozmarino rūgšties standarto sulaikymo laikas buvo 32,8 min., o jos UV absorbcijos spektras pasižymėjo smailėmis ties 232 ir 329 nm bangos ilgiais (2 pav.).
2.3.4. Rozmarino rūgšties kiekybinis nustatymas
Kiekybinis rozmarino rūgšties įvertinimas atliktas pagal šviesos absorbcijos smailių plotus, esant RR absorbcijos maksimumui prie 329 nm bangos ilgio. Naudotas gradavimo grafiko metodas. Pagaminti aštuoni RR standarto tirpalai 70 % etanolyje, kurių koncentracijos buvo: 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,03125 mg/ml, 0,015625 mg/ml ir 0,0078125 mg/ml. Šie RR tirpalai buvo chromatografuojami. Pagal gautus rezultatus, nubriežtas gradavimo grafikas (3 pav.), kuris naudotas įvertinti rozmarino rūgšties koncentraciją tiriamuosiuose objektuose. Gauta formulė Y= X (2,31x107) (X – rozmarino rūgšties koncentracija mg/ml, Y – smailės plotas) (3 pav.), pagal kurią paskaičiuota rozmarino rūgšties koncentraciją, remiantis chromatografinės smailės plotu.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Augalinių žaliavų ekstraktai
Buvo tirtos 6 augalinės žaliavos (vaistinė melisa, vaistinis valerijonas, tikroji levanda, pipirmėte, paprastasis apynys, vaistinė šventagaršvė) ir jose buvo ieškoma rozmarino rūgšties. RR nustatyta lyginant gautas chromatogramas su rozmarino rūgšties standarto chromatograma.
Vaistinės melisos lapų ekstrakte nustatyta rozmarino rūgštis, nes chromatogramoje (4 pav.) nustatytas junginys, kurio sulaikymo laikas 32,8 min., ir kurio UV šviesos absorbcijos spektras turi maksimumą prie 329 nm bangos ilgio. Kiekybiniai rozmarino rūgšties įvertinimo rezultatai pateikti 2 lentelėje. Iš vidutiniškai 0,2012 g augalinės žaliavos pagamintame ekstrakte nustatyta 15,10 mg/g RR koncentracija.
2 lentelė. Rozmarino r. kiekis vaistinėje melisoje
Svėrimas Augalinės žaliavos masė (g)
Nustatyta koncentracija ekstrakte (mg/ml)
Apskaičiuota koncentracija augalinėje žaliavoje (mg/g)
1 0,2010 0,1508 15,005
2 0,2019 0,1512 14,978
3 0,2008 0,1539 15,329
Valerijono šaknų ir apynių spurgų ekstraktuose rozmarino rūgštis nebuvo nustatyta, tik jos pėdsakai (5 ir 6 pav.). Vaistinės šventagaršvės šaknų ekstrakte taip pat nerasta rozmarino rūgšties (7 pav.). Šios VAŽ netrukdo rozmarino rūgšties nustatymui sudėtiniuose preparatuose.
5 pav. Valerijono šaknų ekstrakto chromatograma
6 pav. Apynių spurgų ekstrakto chromatograma
Rozmarino rūgštis buvo nustatyta tikrosios levandos žiedų ir pipirmėtės lapų ekstraktuose (8 ir 9 pav.). Juose rozmarino rūgšties nustatyta mažiau negu melisoje. Rozmarino rūgšties kiekybinės analizės rezultatai nurodyti 3 lentelėje. Iš vidutiniškai 0,2044 g levandos žiedų pagamintame ekstrakte nustatyta 2,854 mg/g RR koncentracija, o iš vidutiniškai 0,2026 g pipirmėtės lapų pagamintame ekstrakte – 2,600 mg/g koncentracija. Abu augalai kaupia panašius kiekius rozmarino rūgšties, bet beveik 5-6 kartus mažiau negu vaistinė melisa.
Tirtųjų VAŽ rozmarino rūgšties kiekybinės analizės rezultatai apibendrinti 4 lentelėje.
7 pav. Šventagaršvės šaknų ekstrakto chromatograma
8 pav. Levandos žiedų ekstrakto chromatograma
3 lentelė. Rozmarino r. kiekis levandoje ir pipirmėtėje9 pav. Pipirmėtės lapų ekstrakto chromatograma
4 lentelė. Rozmarino r. kiekis tirtose vaistinėse augalinėse žaliavose
Vaistinė augalinė žaliava
Augalinės žaliavos masė
(g)
Analizės metu nustatyta rozmarino rūgšties koncentracija ekstrakte
(mg/ml)
Apskaičiuota rozmarino rūgšties koncentracija tirtoje
3.2. Augaliniai preparatai
Buvo tirti 3 preparatai: vienas tradicinis augalinis preparatas („Neuromed“), vienas nereceptinis vaistinis preparatas („Persen“) ir vienas maisto papildas („Magnis 24“). Maisto papildas „Magnis 24“ buvo vienintelis preparatas, kurio sudėtyje buvo tik viena augalinės kilmės žaliava, kiti 2 preparatai savo sudėtyje turėjo augalinės kilmės žaliavų mišinį.
Tradicinis augalinis vaistinis preparatas „Neuromed“ sudarytas iš 5 vaistinių augalinių žaliavų mišinio ekstrakto. Jo sudėtyje esanti levanda, kaip ir melisa, kaupia rozmarino rūgštį.
Atlikus chromatografiją, „Neuromed“ preparate buvo identifikuota rozmarino rūgštis pagal būdinga sulaikymo laiką (32,8 min.) ir UV šviesos absorbcijos spektrą (10 pav.). Kiekybinės analizės rezultatai pateikti 5 lentelėje, nustatyta rozmarino rūgšties koncentracija buvo lygi 2,3 mg/ml.
5 lentelė. Rozmarino r. kiekis „Neuromed“ preparate
Matavimas Tiriamas preparato kiekis (ml)
Nustatyta koncentracija praskiestame preparate (mg/ml) Apskaičiuota koncentracija preparate (mg/ml) 1 0,0461 2,305 2 0,0463 2,315 3 1 0,0455 2,275
Nereceptinis vaistinis preparatas „Persen“ sudarytas iš trijų augalinių žaliavų ekstraktų. Sudėtyje esanti pipirmėtė kaupia rozmarino rūgštį.
Preparate identifikuota rozmarino rūgštis (11 pav.) ir įvertinta jos koncentracija (rezultatai pateikti 6 lentelėje). 20 mililitrų 70 % etanolinis ekstraktas, pagamintas iš vidutiniškai 0,7286 gramų „Persen“ tablėčių masės (be dangalo). Nustatyta 7,458 mg/g rozmarino rūgšties koncentracija.
6 lentelė. Rozmarino r. kiekis „Persen“ preparate
Svėrimas Tiriamas preparato kiekis (g)
Nustatyta koncentracija preparato ekstrakte (mg/ml) Apskaičiuota koncentracija preparate (mg/g) 1 0,7339 0,2747 7,486 2 0,6892 0,2582 7,493 3 0,7628 0,2820 7,394
Maisto papildas „Magnis 24“ savo sudėtyje turi tik vieną VAŽ – vaistinę melisą.
Preparate „Magnis 24“ buvo identifikuota rozmarino rūgštis (12 pav.). Rozmarino rūgšties smailė atitinka smailę vaistinės melisos ekstrakte (13 pav.). RR buvo kiekybiškai įvertinta (7 lentelė). Dviejų kapsulių turinys (m = 0,9859 g) buvo ekstrahuotas su 20 ml 70 % etanoliu, o gautame ekstrakte nustatyta 0,891 mg rozmarino rūgšties (koncentracija 0,904 mg/g). Pagal preparato sudėtį, dviejose kapsulėse turėtų būti 200 mg melisos sausojo ekstrakto, tačiau nustatytas mažas rozmarino rūgšties kiekis verčia abejoti gamyboje naudoto ekstrakto kokybe. ESC metodu nebuvo nustatytos kitos preparate esančios medžiagos (magnio oksidas ir vitaminas B6).
1 0,9842 0,04383
12 pav. „Magnis 24“ preparato chromatograma
7 lentelė. Rozmarino r. kiekis „Magnis 24“ preparate
Svėrimas Tiriamas preparato kiekis (g)
Nustatyta koncentracija preparato ekstrakte (mg/ml) Apskaičiuota koncentracija preparate (mg/g) 1 0,9842 0,04383 0,8907 2 0,9921 0,04561 0,9195 3 0,9813 0,04421 0,9010
Kiekybinio rozmarino rūgšties kiekio nustatymo preparatuose abibendrinimas pateiktas 8 lentelėje.
3.3. Rezultatų aptarimas
Lyginant su literatūros šaltiniais, vaistinės melisos ir pipirmėtės augalinėse žaliavose nustatytos rozmarino rūgšties koncentracijos yra mažesnės negu tikėtasi. Vaistinėje melisoje nustatyta koncentracija buvo 15,10 ± 0,195 mg/g, nors pagal kitų tyrimų duomenis, rozmarino rūgšties koncentracija turėtų būti 30-40 mg/g [1, 4, 5]. Dvigubai mažesnis kiekis galėjo būti gautas dėl kitokios augalinės žaliavos kokybės, nes tyrime, kuriame buvo tiriama rozmarino rūgšties koncentracija vaistinės melisos žaliavose, gautose iš skirtingų tiekėjų, buvo pastebėta didelė (nuo 0,16 iki 49 mg/g) rozmarino rūgšties koncentracijos variacija, priklausanti nuo žaliavos kilmės [1].
Rozmarino rūgšties koncentracija pipirmėtės ekstrakte buvo 2,600 ± 0,052 mg/g. Kai kurių šaltinių duomenimis pipirmėtė kaupia apie 30 mg/g rozmarino rūgšties, nors konkrečių tyrimų rezultatai parodė, kad rozmarino rūgšties koncentracija itin priklauso nuo pipirmėtės augimo vietos –
8 lentelė. Rozmarino rūgšties kiekis tirtuose preparatuose
Preparatas
Tirtas preparato
kiekis
Analizės metu nustatyta rozmarino rūgšties koncentracija (mg/ml)
28 mg/g Irane ir 7,1 mg/g Lenkijoje [5, 53]. Didelis, 3-10 kartų, skirtumas galėjo būti dėl augalinės žaliavos kilmės vietos.
Levandos žiedų ekstrakte nustatyta rozmarino rūgšties koncentracija (2,85 ± 0,12 mg/g) yra panaši į kituose moksliniuose darbuose nustatytas koncentracijas. Irane auginta levanda kaupė 1,7 mg/g, o Rumunijoje atliktas tyrimas nustatė 3,75-4,74 mg/g rozmarino rūgšties koncentracijas tikrosios levandos žieduose [5, 54]. Toks rezultatas leidžia atmesti blogos ekstrakcijos tikimybę arba bent sumažina galimos įtakos gautiems rezultatams dydį. Galima teigti, kad melisoje ir pipirmėtėje nustatytos mažos rozmarino rūgšties koncentracijos dėl pačios augalinės žaliavos kokybės.
Tirtųjų vaistinės melisos sudėtinių preparatų „Neuromed“ ir „Persen“ sudėtyse yra augalų, dėl kurių negalima vertinti vaistinės melisos pagal analizės metu nustatyta rozmarino rūgštį.
„Neuromed“ sudėtyje esanti tikroji levanda ir „Persen“ sudėtyje esanti pipirmėtė, abi kaupia rozmarino rūgštį. Šios VAŽ trukdo sudėtiniuose preparatuose nustatyti vaistinę melisą pagal rozmarino rūgšties kiekį, todėl reikalinga pasirinkti kitą vaistinės melisos kaupiamą junginį, pagal kurį būtų galima ją standartizuoti. Šiuo metodu galima tik nustatyti bendrą rozmarino rūgšties kiekį.
4. IŠVADOS
1. Atlikus literatūros analizę, parinkta ir pritaikyta ESC metodika rozmarino rūgšties kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui VAŽ ir sudėtiniuose preparatuose.
2. Rozmarino rūgštis identifikuota ir kiekybiškai įvertinta trijose augalinėse žaliavose: vaistinėje melisoje (15,10±0,195 mg/g), tikrojoje levandoje (2,854±0,122 mg/g), pipirmėtėje
(2,600±0,052 mg/g). Rozmarino rūgšties nenustatyta vaistiniame valerijone, vaistinėje šventagaršvėje ir
paprastajame apynyje.
3. Rozmarino rūgštis identifikuota ir kiekybiškai įvertinta tirtuose sudėtiniuose preparatuose: „Neuromed“ (2,30±0,021 mg/ml), „Persen“ (7,458±0,055 mg/g), „Magnis 24“ (0,9037±0,0146 mg/g).
4. Dėl „Neuromed“ sudėtyje esančios tikrosios levandos, o dėl „Persen“ sudėtyje esančios pipirmėtės, šiuose preparatuose („Neuromed“ ir „Persen“) esančios vaistinės melisos negalima nustatyti pagal rozmarino rūgštį. Galima įvertinti tik bendrą rozmarino rūgšties kiekį.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Arceusz A, Wesolowski M. „Quality consistency evaluation of Melissa officinalis L. commercial herbs by HPLC fingerprint and quantitation of selected phenolic acids“. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 83 (2013) 215-220
2. World Health Organization Who Monographs on Selected Medicinal Plants Volume 2, 2004, prieiga per internetą: http://apps.who.int/medicinedocs/en;
3. Sari AS, Ceylan A. „Yield Characteristics and Essential Oil Composition of Lemon Balm
(Melissa officinalis L.) Grown in the Aegean Region of Turkey“.Turk J Agric For 26 217-224, 2002 4. Toth J, Mrlianova M, Tekelova D, Korcnova M. „Rosmarinic Acid – an Important Phenolic Active Compound of Lemon Balm (Melissa Officinalis L.)“. Acta Facult Pharm Univ Comenianae 2003;50:139-146.
5. Shekarchi M, Hajimehdipoor H, Saeidnia S, Gohari AR, Hamedani MP. „Comparitive study of rosmarinic acid content is some plants of Labiatae family“, Pharmacogn Mag. 2012 Jan-Mar; 8(29): 37-41
6. European Pharmacopoeia 7.0, Strassbourg, Council of Europe, 2011.
7. Kim GD, Park YS, Jin YH, Park CS. „Production and applications of rosmarinic acid and structurally related compounds“. Appl Microbiol Biotechnol (2015) 99:2083–2092
8. National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Database; CID=5281792, prieiga per internetą: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5281792
9. Lee J et al. „Rosmarinic acid as a downstream inhibitor of IKK-β in TNF-α-induced upregulation of CCL11 and CCR3“. British Journal of Pharmacology (2006) 148, 366–375
10. Fengxian Zhu, Zhongming Xu, Lina Yonekura, Ronghua Yang & Hirotoshi Tamura. „Antiallergic activity of rosmarinic acid esters is modulated by hydrophobicity, and bulkiness of alkyl side chain“, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2015)
11. Vostalova J, Zdarilova A, Svobodova A, „Prunella vulgaris extract and rosmarinic acid prevent UVB-induced DNA damage and oxidative stress in HaCaT keratinocytes“. Arch Dermatol Res 302:171–181 (2010)
12. Lee HJ, Jeong YI, Lee TH, Jung ID, Lee JS, Lee CM, Kim JI, Joo H, Lee JD, Park YM, „Rosmarinic acid inhibits indoleamine 2,3-dioxygenase expression in murine dendritic cells“. Biochem Pharmacol 73:1412–1421 (2007)
14. Chu X, Ci X, He J, Jiang L, Wei M, Cao Q, Guan M, Xie X, Deng X „Effects of a natural prolyl oligopeptidase inhibitor, rosmarinic acid, on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice“. Molecules 17:3586–3598 (2012)
15. Perez-Fons L, Garzon MT, Micol V. „Relationship between the antioxidant capacity and effect of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) polyphenols on membrane phospholipid order“. J Agric Food Chem 58:161–171 (2010)
16. Huang N, Hauck C, Yum MY, Rizshsky L,Widrlechner MP, McCoy JA, Murphy PA, Dixon PM, Nikolau BJ, Birt DF. „Rosmarinic acid in Prunella vulgaris ethanol extract i n h i b i t s lipopolysaccharide-induced prostaglandin E2 and nitric oxide in RAW 264.7 mouse macrophages“. J Agric Food Chem 57:10579–10589 (2009)
17. Kim DS, Kim HR, Woo ER, Hong ST, Chae HJ, Chae SW. „Inhibitory effects of rosmarinic acid on adriamycin-induced apoptosis in H9c2 cardiac muscle cells by inhibiting reactive oxygen species and the activations of c-Jun N-terminal kinase and extracellular signal-regulated kinase“. Biochem Pharmacol 70:1066–1078 (2005)
18. Zdarilova A, Svobodova A, Simanek V, Ulrichova J. „Prunella vulgaris extract and rosmarinic acid suppress lipopolysaccharideinduced alteration in human gingival fibroblasts“. Toxicol In Vitro 23:386–392 (2009)
19. Suriyarak S, Gibis M, Schmidt H, Villeneuve P, Weiss J. „Antimicrobial mechanism and activity of dodecyl rosmarinate against Staphylococcus carnosus LTH1502 as influenced by addition of salt and change in pH“. J Food Prot 77:444–452 (2014)
20. Abedini A, Roumy V, Mahieux S, Biabiany M, Standaert-Vitse A, Riviere C, Sahpaz S, Bailleul F, Neut C, Hennebelle T.„Rosmarinic acid and its methyl ester as antimicrobial components of the hydromethanolic extract of Hyptis atrorubens Poit. (Lamiaceae)“. Evid Based Complement Alternat Med 2013:604536 (2013)
21.Dubois M, Bailly F, Mbemba G, Mouscadet JF, Debyser Z,Witvrouw M, Cotelle P. „Reaction of rosmarinic acid with nitrite ions in acidic conditions: discovery of nitro- and dinitrorosmarinic acids as new anti-HIV-1 agents“. J Med Chem 51:2575–2579 (2008)
22. Winter PM, Dung NM, Loan HT, Kneen R, Wills B, Thu LT, House D, White NJ, Farrar JJ, Hart CA, Solomon T. „Proinflammatory cytokines and chemokines in humans with Japanese encephalitis“. J Infect Dis 190:1618–1626 (2004)
24. Lee HJ, Cho HS, Park E, Kim S, Lee SY, Kim CS, Kim do K, Kim SJ, Chun HS. „Rosmarinic acid protects human dopaminergic neuronal cells against hydrogen peroxide-induced apoptosis“. Toxicology 250:109–115 (2008)
25. Fallarini S, Miglio G, Paoletti T, Minassi A, Amoruso A, Bardelli C, Brunelleschi S, Lombardi G. „Clovamide and rosmarinic acid induce neuroprotective effects in in vitro models of neuronal death“. Br J Pharmacol 157:1072–1084 (2009)
26. Iuvone T, De Filippis D, Esposito G, D'Amico A, Izzo AA. „The spice sage and its active ingredient rosmarinic acid protect PC12 cells from amyloid-beta peptide-induced neurotoxicity“. J Pharmacol Exp Ther 317:1143–1149 (2006)
27. Hamaguchi T, Ono K, Murase A,Yamada M. „Phenolic compounds prevent Alzheimer's pathology through different effects on the amyloid-beta aggregation pathway“. Am J Pathol 175:2557–2565 (2009)
28. Shafqatullah, Khan R, Hassan W, Hussain A, Asadullah, Khalic-ur-Rehman, Ali J. „Development of HPLC method by UV-Vis detection for the quantification of phenolic acids in different Ocimum
sanctum Linn. extracts“, Pak. J. Pharm. Sci., Vol.27, No.5, September 2014, pp.1271-1275
29. Spiridon I, Colceru S, Anghel N, Teaca CA, Bodirlau R, Armatu A. „Antioxidant capacity and total phenolic contents of oregano (Origanum vulgare), lavender (Lavandula angustifolia) and lemon balm (Melissa officinalis) from Romania“, Nat Prod Res. 2011 Oct;25(17):1657-61
30. Psotova J, Kolar M, Soušek J, Švagera Z, Vičar J, Ulrichova J. „Biological Activities of Prunella
vulgaris Extract“, Phytother. Res. 17, 1082-1087 (2003)
31. Bražinskienė V, Ivanauskas L, Ražukas A. „Fenolinių rūgščių kiekis Lietuvoje išaugintų bulvių (Solanum tuberosum) gumbuose“, Medicinos teorija ir praktika, 2012 – T.18 (Nr.2), 154-157 p.
32. Bakota EL, Winkler-Moser JK, Berhow MA, Eller FJ, Vaughn SF. „Antioxidant Activity and Sensory Evaluation of a Rosmarinic Acid-Enriched Extract of Salvia officinalis“ Journal of Food Science vol. 80 Nr. 4:711-716 (2015)
33. Proestos C, Boziaris IS, Nychas GJE, Komaitis M. „Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants: Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity“, Food Chemistry 95 (2006) 664-671
34. Najafian S, Rowshan V. „Polyphenolic compounds of Mentha longifolia and Lemon Balm (Melissa officinalis L.) in Iran“, Intl. Res. J. Appl. Basic. Sci. Vol., 4(3), 608-612, 2013
35. Şahin S, Demir C and Malyer H. „Determination of phenolic compounds in (Prunella L). by liquid chromatography-diode array detection“. J. of Pharma. and Biomed. Anal., 55: 1227-1230 (2011)
37. Feliu-Hemmelmann K, Monsalve F, Rivera C. „Melissa officinalis and Passiflora caerulea infusion as physiological stress decreaser“. Int J Clin Exp Med 2013;6(6):444-451
38. Bounihi A, Hajjaj G, Alnamer R, Cherrah Y, Zellou A. „In Vivo Potential Anti-Inflammatory Activity of Melissa officinalis L. Essential Oil“. Advances in Pharmacological Sciences, Volume 2013, Article ID 101759, 7 pages. 2013.
39. Uyanik M, Gurbuz B. „Chemical Diversity in Essential Oil Compositions of Leaf, Herb and Flower in Lemon Balm (Melissa officinalis L.)“. Türk Tarım ve Doğa Bilimleri Dergisi 1(2): 210–214, 2014
40. Canelas V, da Costa CT. „Quantitative HPLC analysis of rosmarinic acid in extracts of Melissa
officinalis and spectrophotometric measurement of their antioxidant activities“. J. Chem. Educ., 2007,
84 (9), p 1502
41. Patora J, Majda T, Gora J, Klimek B. „Variability in the content and composition of essential oil from Lemon Balm (Melissa officinalis L.) cultivated in Poland“. Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Research, Vol. 60 No. 5 pp. 395-400, 2003.
42. Nhu-Trang TT, Casabianca H, Grenier-Loustalot MF. „Authenticity control of essential oils containing citronellal and citral by chiral and stable-isotope gas-chromatographic analysis“. Anal Bioanal Chem (2006) 386:2141–2152
43. World Health Organization Who Monographs on Selected Medicinal Plants Volume 1, p. 267-276, 1999, prieiga per internetą: http://apps.who.int/medicinedocs/en;
44. Ghafari S, Esmaeili S, Aref H, Naghibi F, Mosaddegh M. „Qualitative and Quantitative Analysis of Some Brands of Valerian Pharmaceutical Products“. Ethno-Med, 3(1): 61-64 (2009)
45. Verma RS et al. “Essential Oil Composition of Menthol Mint (Mentha arvensis) and Peppermint (Mentha piperita) Cultivars at Different Stages of Plant Growth from Kumaon Region of Western Himalaya”. Open Access Journal of Medicinal and Aromatic Plants Vol. 1(1): 13-18. 2010
46. World Health Organization Who Monographs on Selected Medicinal Plants Volume 3, 2007, prieiga per internetą: http://apps.who.int/medicinedocs/en;
47. Azar PA, Torabbeigi M, Sharifan A, Tehrani MS. „Chemical Composition and Antibacterial Activity of the Essential Oil of Lavandula angustifolia Isolated by Solvent Free Microwave Assisted Extraction and Hydrodistillation“. Journal of Food Biosciences and Technology, Islamic Azad University, Science and Research Branch, 1, 19-24, 2011
49. Bhat ZA, Kumar D, Shah MY. „Angelica archangelica Linn. is an angel on earth for the treatment of diseases“. Int J Nutr Pharmacol Neurol Dis 2011;1:36-50
50. Bražinskienė V. „Ekologinės ir intensyvios žemdirbystės įtaka bulvių gumbų antioksidacinių junginių kiekiui“. Daktaro disertacija, 2014
51. Preparatų „Neuromed“ ir „Persen“ charakteristikų santraukos. Prieiga per internetą: http://extranet.vvkt.lt/paieska/
52. Maisto papildo „Magnis 24“ informacinis lapelis. Prieiga per internetą: http://www.vaistai.lt/maisto-papildai/magnio-preparatai/maisto-papildas-magnis-24-kapsul%C4%97s-n60.html
53. Krzyzanowska J, Janda B, Pecio L, Stochmal A, Oleszek W. „Determination of Polyphenols in
Mentha longifolia and M. piperita Field-Grown and In Vitro Plant Samples Using UPLC-TQ-MS“.
Journal of AOAC Internation Vol. 94, No. 1, p. 43-50, 2011
