• Non ci sono risultati.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Condividi "4. INTERESŲ KONFLIKTAS"

Copied!
39
0
0

Testo completo

(1)

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS

HISTOLOGIJOS IR EMBRIOLOGIJOS KATEDRA

Ieva Šmitaitė

SMULKIALĄSTELINIO PLAUČIŲ VĖŽIO LĄSTELIŲ ELGSENOS ANT VIŠČIUKO EMBRIONO CHORIOALANTOJINĖS MEMBRANOS YPATUMAI BEI LĄSTELIŲ

UŽSODINIMO METODŲ VERTINIMAS

Baigiamasis magistrinis darbas

Magistrinio darbo vadovė: dr. Rūta Vosyliūtė

Kaunas, 2021

(2)

TURINYS

1. SANTRAUKA ...3

2. SUMMARY ...5

3. PADĖKA ...7

4. INTERESŲ KONFLIKTAS ...7

5. SANTRUMPOS...8

7. SĄVOKOS...9

6. ĮVADAS...10

8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...11

9. LITERATŪROS APŽVALGA...12

9.1. Smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgsena ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos ...12

9.2. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) savybės...14

9.3. Skirtingi ląstelių užsodinimo ant CAM būdai ir jų palyginimas...15

10. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ...18

10.1. Literatūros analizė...18

10.2. Kiaušinių inkubavimas ir langelių atvėrimas ...18

10.3. Tiriamosios grupės ...20

10.4. CAM preparatų paruošimas...21

10.5. Statistinė duomenų analizė...22

11. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...23

11.1. In vivo biomikroskopija...23

11.2. Morfologinis CAM vertinimas...27

11.2.1. CAM storis ...27

11.2.2. Kraujagyslių skaičius ...29

12. IŠVADOS ...34

13. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS...35

14. LITERATŪROS SĄRAŠAS ...36

(3)

3

1. SANTRAUKA

Darbo autorė: Ieva Šmitaitė

Darbo pavadinimas: Smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgsenos ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos ypatumai bei ląstelių užsodinimo metodų vertinimas.

Darbo tikslas: Išnagrinėti smulkialąstelinės plaučių karcinomos ląstelių elgsenos ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos ypatumus bei įvertinti chorioalantojinės membranos reakciją į navikinėms ląstelėms užsodinti naudojamas priemones.

Tyrimo uždaviniai: 1) Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgseną ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM). 2)Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie skirtingus ląstelių užsodinimo ant CAM metodus ir juos palyginti. 3) Įvertinti ir palyginti chorioalantojinės membranos struktūros pokyčius naudojant želatininę kempinėlę su ir be 20 μl kolageno kaip ląstelių užsodinimo metodus ant CAM.

Darbo metodika: Literatūros analizei apie smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgseną ant CAM bei skirtingus ląstelių užsodinimo ant CAM metodus buvo analizuoti 36 literatūros šaltiniai.

Mokslinių straipsnių paieška buvo atlikta elektroninėse bibliografinėse mokslinių tyrimų bazėse PubMed, Wiley Online Library, ScienceDirect. Praktinei magistrinio darbo daliai naudoti apvaisinti vištų kiaušiniai (n꓿19) buvo inkubuoti 37,7 °C temperatūroje, santykinė oro drėgmė – 60 %. 7–tą tyrimo dieną ant embrionų CAM buvo užsodinta želatininė kempinėlė su arba be 20 μl kolageno. Ant kontrolinės grupės CAM niekas nebuvo sodinta. Dvyliktą dieną membranos buvo nuimtos bei preparatai paruošti mikroskopiniam vertinimui. Mikroskopinio tyrimo metu vertintas membranos storis bei kraujagyslių skaičius. Duomenys vertinti naudojant GraphPad Prism 8.4.3 statistinę programą.

Rezultatai: Nustatyta, kad tiek ant CAM užsodinta želatininė kempinėlė, tiek kempinėlė su 20 μl kolageno pritraukė kraujagysles, kurios išsidėstė kaip dviračio rato stipinai aplink kempinėles. Jau 3–

čią užsodinimo parą matosi įaugimas į membranos sluoksnius. Vertinant membranas buvo gautas statistiškai reikšmingas skirtumas, kad CAM po želatinine kempinėle buvo 9 kartus storesnė už kontrolinę grupę (p<0,0001). Tuo tarpu membrana po kempinėle su 20 μl kolageno už kontrolinę grupę buvo storesnė 10,5 karto (p<0,0001). Tiek kempinėlė, tiek kempinėlė su 20 μl kolageno sukėlė didesnę CAM neoangiogenezę negu kontrolinėje grupėje (p=0,0025 ir p=0,0043 atitinkamai).

Išvados: 1) Smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelės skatina CAM neoangiogenezę, membrana po ląstelėmis storėja. 2) Ex–ovo metodas tinkamas įvertinant vėžinių ląstelių įtaką platesniam CAM paviršiui, o norint silpnesnio medžiagos, naudojamos ląstelių užsodinimui, sukelto neoangiogeninio atsako, naudojama polivinilchloridas, poliuretanas, želatininė kempinėlė. 3) CAM storis po želatinine kempinėle būna 283,6±191,5 μm, po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno būna 341,3±257,2 μm,

(4)

stebima neoangiogenezė – želatininės kempinėlės grupėje susiformavo iki 80 naujų kraujagyslių, o želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno grupėje iki 73 kraujagyslių.

Praktikinės rekomendacijos: Įvertinti, kad naudojant viščiuko embriono CAM metodą, sukelta neoangiogenezė ir CAM sustorėjimas gali įvykti dėl ląstelių užsodinimui naudojamų medžiagų.

(5)

5

2. SUMMARY

Author: Ieva Šmitaitė

Title: Behaviour Characteristics of Small–Cell Lung Cancer Cells on Chick Embryo Chorioallantoic Membrane and Evaluation of Cell Seeding Techniques.

Aim: To analyse behaviour of small–cell lung carcinoma cells on chick chorioallantoic membrane ant to evaluate chorioallantoic membrane reaction using different cell seeding techniques.

Objectives: 1) To analyse scientific literature about behaviour of small–cell lung cancer cells on chick embryo chorioallantoic membrane (CAM). 2) To analyse scientific literature about different cell seeding techniques on CAM and to compare them. 3) To analyse and compare structural chick embryo CAM changes using gelatin sponge with and without 20 μl of collagen as cell seeding techniques.

Research methodology: For literature analysis 36 publications were analysed about behaviour of small–cell lung carcinoma cells on chick embryo chorioallantoic membrane and different cell seeding techniques. Electronic bibliographic scientific literature databases were used, such as PubMed, Wiley Online Library, ScienceDirect. For a practical part of this study, fertilised chicken eggs (n꓿19) were incubated at 37,7oC and 60 % humidity. On the 7th day of the study, gelatin sponges with or without 20 μl of collagen were seeded on embryo CAM. Control group was without any material seeded on it. On the 12th day membranes were removed ant prepared for microscopic evaluation. During microscopic evaluation thickness of membranes and their blood vessel count were measured. Data were analyzed with GraphPad Prism 8.4.3 program.

Results: It was determined that around gelatin sponge with or without 20 μl collagen blood vessels were arranged in a spoked–wheel manner. On the 3rd day of implantation, sponges started to grow into membrane. There was a statistically significant difference between control group and gelatin sponge group in the thickness of membranes – in the gelatin sponge group membranes were 9 times thicker (p<0,0001). In the gelatin sponge with 20 μl of collagen group membranes were 10,5 times thicker than control group (p<0,0001). Both gelatin sponges with and without 20 μl of collagen caused stronger neoangiogenesis then control group did (p=0,0025 and p=0,0043 respectively).

Conclusions: 1) Small–cell lung cancer cells increase CAM thickness and neoangiogenesis. 2) When analyzing what impact cancer cells have on a wider CAM surface, the best method to use is Ex–

ovo. If it is important to have a minimal neoangiogenesis caused by a cell seeding material, then polyvinylchloride, polyurethane or gelatin sponge should be used. 3) CAM thickness under gelatin sponge is 283,6±191,5 μm and under gelatin sponge with 20 μl of collagen – 341,3±257,2 μm. At most

(6)

80 new vessels formed in gelatin sponge group, whereas in the gelatin sponge with 20 μl of collagen group, there were 73 new vessels at most.

Practical recommendations: Keep in mind that when using chick embryo chorioallantoic membrane model, neoangiogenesis and thickened CAM can be caused by a material used for cell seeding.

(7)

7

3. PADĖKA

Didelis ačiū baigiamojo magistrinio darbo vadovei dr. Rūtai Vosyliūtei už pagalbą, patarimus ir didelę kantrybę.

Taip pat esu dėkinga Rūtai Curkūnavičiūtei, Mildai Juknevičienei, Eligijai Damanskienei už tyrimo metodikos apmokymus bei patarimus.

4. INTERESŲ KONFLIKTAS

Autorių interesų konflikto nebuvo.

(8)

5. SANTRUMPOS

CAM Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana (angl. Chicken embryo chorioallantoic membrane)

FGF–2 Fibroblastų augimo faktorius 2 (angl. fibroblast growth factor–2)

HIF–1α Hipoksiją indukuojantis veiksnys–1α (angl. hypoxia inducible factor–1 alpha) PSO Pasaulio sveikatos organizacija (angl. World health organization)

NSCLC Nesmulkialąstelinė plaučių karcinoma (angl. Non-small-cell lung carcinoma) SCLC Smulkialąstelinė plaučių karcinoma (angl. Small-cell lung carcinoma)

TGFβ1 Transformuojantis augimo faktorius β1 (angl. transforming growth factor beta 1)

VEGF–A Kraujagyslių endotelio augimo faktorius–A (angl. vascular endothelial growth factor–A)

(9)

9

6. SĄVOKOS

Chorioalantojinė membrana – ekstraembrioninė membrana, einanti ties neląsteline lukšto membrana, atsirandanti alantojo mezodermos sluoksniui susiliejus su choriono mezodermos sluoksniu.

Heterofilai – viščiuko embriono ląstelės, atitinkančios žinduolių neutrofilinius granulocitus, dalyvaujančios uždegiminiuose procesuose.

Neoangiogenezė – procesas, kurio metu susidaro naujos kraujagyslės.

(10)

7. ĮVADAS

Plaučių vėžys yra vienas labiausiai paplitusių onkologinių susirgimų ne tik Lietuvoje, bet ir visame pasaulyje. Pagal Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) statistiką, 2018 metais buvo diagnozuota apie 2,1 milijonas naujų šios ligos atvejų. Plaučių vėžys taip pat sąlygoja daugiausia mirčių iš visų onkologinių susirgimų – 1,8 milijonus per metus [1].

2018 metų Lietuvos duomenimis, tarp vyrų bei moterų buvo nustatyti 1644 plaučių vėžio atvejai, mirė 1363 žmonės. Tais metais tai buvo antra pagal dažnį onkologinė liga bei pirma pagal mirčių skaičių [2].

Plaučių vėžio morfologinė diagnostika paremta 2015 metų PSO plaučių navikų klasifikacija.

Pagal šią klasifikaciją, morfologiškai plaučių vėžys skirstomas į dvi pagrindines grupes – nesmulkiųjų (NSCLC) ir smulkiųjų ląstelių plaučių karcinomą (SCLC). Nesmulkiųjų ląstelių plaučių vėžys yra pati dažniausia forma ir sudaro 80% visų plaučių vėžio atvejų. Neuroendokrininiai navikai sudaro apie 20 % plaučių vėžio atvejų, dažniausia yra smulkiųjų ląstelių karcinoma – 15 % visų plaučių vėžio atvejų [3,4].

Smulkiųjų ląstelių plaučių vėžys formuojasi iš neuroendokrininių ląstelių pirmtakų. Jis greitai auga, yra jautrus chemoterapijai ir radioterapijai, tačiau greitai išsivysto atsparumas gydymui. Navikas diagnozuojamas vėlai – tik trečdaliui pacientų diagnozuojama dar neišplitusi stadija [5].

Vėžinių ląstelių tyrimams dažnai naudojamas viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelis. Viščiuko embrionas yra apsuptas keturiomis ekstraembrioninėmis membranomis:

amnionu, trynio maišu, alantoju ir seroza. Vystymosi metu alantojo mezodermos sluoksnis susilieja su choriono mezodermos sluoksniu ir suformuoja chorioalantojinę membraną. Tokiame dvigubame sluoksnyje pradeda formuotis kraujagyslių tinklas [6]. Toks itin vaskuliarizuotas apvalkalas yra reikšmingas embriono vystymuisi ir ypač tinkamas eksperimentams atlikti, vertinti vėžinių ląstelių sukeltą neoangiogenezę – naujų kraujagyslių formavimąsi, invazyvumą bei metastazavimo ypatybes.

Įvairiuose straipsniuose, kuriuose aprašomi bandymai su CAM, yra naudojami skirtingi ląstelių užsodinimo būdai – želatininės kempinėlės, silikoniniai žiedai, insertai, filtriniai popieriai bei kiti būdai.

Tai priklauso nuo autorių pripratimo, resursų ir kitų veiksnių. Tačiau vis dar keliama diskusija, kuris būdas geriausias tiek ląstelių prisitvirtinimo, tiek CAM reakcijos sukėlimo atžvilgiu.

(11)

11

8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Išnagrinėti smulkialąstelinės plaučių karcinomos ląstelių elgsenos ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos ypatumus bei įvertinti chorioalantojinės membranos reakciją į navikinėms ląstelėms užsodinti naudojamas priemones.

Uždaviniai:

1. Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgseną ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM).

2. Išanalizuoti mokslinę literatūrą apie skirtingus ląstelių užsodinimo ant CAM metodus ir juos palyginti.

3. Įvertinti ir palyginti chorioalantojinės membranos struktūros pokyčius naudojant želatininę kempinėlę su ir be 20 μl kolageno kaip ląstelių užsodinimo metodus ant CAM.

(12)

9. LITERATŪROS APŽVALGA

9.1. Smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgsena ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos

Smulkiųjų ląstelių plaučių karcinoma (SCLC) yra agresyvus neuroendokrininės kilmės navikas, kuris per trumpą laiką padvigubėja bei anksti metastazuoja. Ligai dar neišplitus, vidutinis pacientų išgyvenamumas siekia tik 15–20 mėnesių. Apie 95 % šio naviko atvejų sudaro rūkantys arba anksčiau rūkę pacientai. SCLC būdingas greitas augimas, jis yra jautrus chemoterapijai bei radioterapijai, tačiau labai greitai išsivysto rezistencija, todėl ligai recidyvavus, gydymą parinkti būna sudėtingiau. Gydymas priklauso nuo vėžio stadijos, išplitimo, chemoterapijos toksiškumo, paciento fizinės būklės bei gretutinių ligų [5].

Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) modelis (1 pav.) yra plačiai taikomas tiriant įvairių lokalizacijų vėžio invazyvumą, metastazavimą bei angiogenines savybes, taip pat vertinant naviko jautrumą chemoterapijai. To priežastis yra metodo prieinamumas, pigumas, greitas membranos augimas bei paties embriono neišsivysčiusi imuninė sistema [7]. Imuninė sistema nepradeda formuotis iki antros viščiuko embriono gyvenimo savaitės. T limfocitai embriono užkrūčio laukoje gali būti aptikti 11–tą, B limfocitai Fabricijaus maišelyje matomi 12–tą vystymosi dieną, o 18–tą dieną, viščiuko embriono imuninė sistema tampa pilnai išsivysčiusi ir funkcionuojanti [7,8,9]. Jeigu eksperimentai užsitęsia po 15–tos dienos, gali būti sukelta nespecifinė imuninė reakcija, skatinanti angiogenezę, kurią sunku diferencijuoti nuo implantuoto naviko sukeltų pakitimų [7].

1 pav. Viščiuko embrionas kiaušinyje apsuptas CAM (adaptuota pagal Nicole Dunker ir Verena Jendroseek, 2019) [10]

(13)

13 CAM apvaisintame kiaušinyje susidaro, kai 4-tą embriono vystymosi dieną, alantojaus mezodermos sluoksnis susijungia su išoriniu choriono mezodermos sluoksniu. Pati membrana histologiškai sudaryta iš trijų gemalinių lapelių – viršutinio – ektodermos, vidurinio – mezodermos ir apatinio – endodermos [11,12]. Ektoderma yra prisitvirtinusi prie kiaušinio lukšto ir yra sudaryta iš kelių sluoksnių epitelinių ląstelių. Mezoderma sudaryta iš stromos ir kolageninių skaidulų (jungiamojo audinio), kuriame yra kraujagyslių ir smulkių kapiliarų, einančių iki endodermos, kuri sudaryta iš plokščiųjų ląstelių.

Lietuvoje CAM metodas taip pat plačiai taikomas. Straipsnyje L. Šlekienė ir kt. aprašo smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgseną ir jų reakciją į antiepilepsinį vaistą – valproinę rūgštį.

Buvo pastebėta, kad ant CAM augantys reguliarios formos navikai gali skirtingai sąveikauti su chorioalantojinės membranos lapeliais. Esant invazyviam navikui, mezenchima sustorėja, o navikas tampa aiškiai į ją įsiterpęs. Kita navikų dalis daugiausia augo ant viršutinio lapelio sluoksnio – ektodermos, kuri yra erozavusi, navikas išplitęs į mezenchimą. Trečioji grupė – navikas augo neinvazyviai, o pati CAM sustorėjusi ir iš šonų apaugusi patį naviką [13]. Manoma, kad mezenchima po implantu sustorėja dėl naviko savybių bei dėl nespecifinės uždegiminės reakcijos.

Ant CAM persodintas smulkialąstelinis plaučių vėžys bei ląstelių kultūros membranoje gali įsitvirtinti jau pirmąją užsodinimo dieną. Pastebėta, kad naviko augimo kreivė pradeda eksponentiškai didėti nuo 4–tos iki 10–tos viščiuko embriono inkubacijos dienos, tačiau 14-17 dienomis, kreivė išsilygina [14]. Taip yra dėl to, kad CAM endotelio ląstelės yra mitoziškai aktyviausios iki 10–tos vystymosi dienos, o paskui aktyvumas greitai mažėja [9]. Greitam naviko augimui reikia adekvačios kraujotakos, todėl jis negali užaugti daugiau kaip 0,93±0,29 mm skersmens prieš prasidedant greitam kraujagyslių augimui bei naviko vaskuliarizacijai [15]. Paprastai tik 2–5–tą užsodinimo dieną stebimas padidėjęs vėžinių ląstelių kraujagyslių tinklas [16]. Tik praėjus 24 valandoms po šio kraujagyslių tinklo išsivystymo, navikas pradeda greitai augti ir per 7 dienas pasiekia 8,0±2,5 mm skersmenį. Tačiau implantavus naviką, didesnį negu 1 mm, jis nekrozuodavo dar nepasiekus greitos angiogenezės stadijos [15].

Pastebėta, kad ant CAM užsodinus sveiko donoro audinio preparatą, membranos kraujagyslės sudaro anastomozes su jau egzistuojančiomis preparato kraujagyslėmis ir taip užtikrina kraujotaką. Tuo tarpu ant CAM užsodinus donoro vėžines ląsteles, skatinama CAM neoangiogenezė bei navikas kraujotaką gauna iš CAM naujai suformuotų kraujagyslių [16]. Todėl matoma, kad neoangiogenezė yra būdinga tik vėžinėms ląstelėms, bet ne paprasto nepiktybinio audinio transplantatams.

Vertinant ant CAM augančio naviko svorį, užsodinus ant CAM 20–30 μl navikinių ląstelių, priklausomai nuo jų kilmės, proliferacinio pajėgumo, pirminiai navikai gali užaugti iki 500–600 mg svorio per 6–7 paras [17].

(14)

Lietuvoje atlikto tyrimo metu, ant viščiuko embriono CAM užsodinus glioblastomos vėžines ląsteles, buvo stebimas gerai susiformavęs dviračio stipinų formos kraujagyslinis tinklas, einantis link naviko [18]. Tai rodo, kad vėžinės ląstelės sukelia plika akimi matomą angiogeninį poveikį. Toks kraujagyslių išsidėstymas link užsodintos navikinės masės būdingas ir kitų lokalizacijų vėžinėms ląstelėms, taip pat ir gerybinei gerklų papilomatozei [19] ar užsodinus įvairias biologines medžiagas [20], todėl galima daryti prielaidą, kad smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių transplantatai skatintų tą patį kraujagyslių išsidėstymą.

Vertinant histologiškai, smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelės ant CAM būna išsidėsčiusios nereguliariai, branduoliai apvalūs arba ovalo formos, stebimos kariokinezės – ląstelės branduolio dalijimasis [13]. Pasikeičia ir chorioalantojinė membrana, esanti šalia naviko. Ji pasidaro storesnė, keratinizuojasi, proliferuoja fibroblastocitai [21].

Dar vieno Lietuvoje daryto tyrimo metu buvo vertinta smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgsena ant CAM su ir be natrio valproato. Tyrimo metu nustatyta, kad kontrolinėje grupėje ant membranos užsodinus vėžines ląsteles be vaisto, CAM sustorėjo iki 509.2±184 μm po naviku bei iki 139.1±138.4 μm šalia naviko. Tyrimo metu taip pat buvo vertinta, ar užsodinus naviką ant viščiuko embriono CAM, navikas išlaikys savo ląstelių charakteristiką. Nustatyta, kad išliko aktyvios mitozės, ląstelės migravo nuo pradinio naviko vietos į periferiją. Taip pat buvo išlikusi CD56 (nervinių ląstelių prisitvirtinimo molekulė, angl. Neural cell adhesion molecule, neuroendokrininės kilmės bei kai kurių limfominių navikų imunohistocheminis žymuo) ekspresija [22].

Vėžinės ląstelės, užsodintos ant CAM, gali metastazuoti. Šis procesas vyksta, kai ląstelės įsiskverbia į mezenchimą bei ten esančias kraujagysles ir su krauju patenka į besiformuojančius embriono organus. Kadangi imuninė sistema dar nėra pilnai susiformavusi, į kraujotaką patekusios ląstelės dažniausiai nebūna pažeistos ir gali saugiai nukeliauti į viščiuko organus bei ten prisitvirtinti [21]. Po kelių parų, navikinės ląstelės gali būti identifikuojamos tolimesnėje CAM dalyje, embriono plaučiuose, smegenyse, kepenyse bei kituose vidaus organuose. Jeigu buvo užsodintos labai agresyvaus vėžio ląstelės, jau po kelių parų galima stebėti akimis matomas naviko metastazes įvairiuose organuose [9].

9.2. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) savybės

Viena iš CAM savybių, darančių šį modelį tokį patrauklų studijuojant navikines ląsteles, yra greitas membranos paviršiaus ploto augimas. Jis 6–tą vystymosi parą būna apie 6 cm2 ir per aštuonias dienas užauga iki 65 cm2 [16]. Kita naudinga savybė yra membranos aktyvumas, kuris iki 10–tos apvaisinimo dienos būna sparčiausias, todėl ir navikinės ląstelės, užsodintos iki 8–10–tos dienos,

(15)

15 labai greitai auga ir kraujagyslės, kurios glaudžiai susijusios su embriono deguonies apykaita. Taip sparčiai kraujagyslės vystosi iki 11–tos dienos ir paskui greitai praranda augimo aktyvumą [15]. Savo galutinę formą CAM kraujagyslės pasiekia 18–tą vystymosi dieną prieš viščiukui išsiritant [21].

Pastebėta, kad endogeninis fibroblastocitų augimo faktorius (angl. fibroblast growth factor–2, FGF–2) chorioalantojinėje membranoje padidėja nuo 6–tos iki 18–tos vystymosi dienos, didžiausią koncentraciją pasiekdamas 10–14–tą dienomis. Panašiu metu savo piką pasiekia ir kraujagyslių endotelio augimo faktorius–A (angl. vascular endothelial growth factor–A, VEGF–A). Šio faktoriaus didžiausia koncentracija būna 7–9–tą bei 11–12–tą embriono vystymosi paromis. Kitų kraujagyslių augimo faktorių, tokie kaip hipoksiją indukuojančio veiksnio–1α (angl. hypoxia inducible factor–1 alpha, HIF–1α), VEGF, VEGF receptoriaus–2 koncentracijų didėjimas 11–tą embriono vystymosi dieną taip pat koreliuoja su spartesne angiogeneze [21].

4–tą dieną, visos CAM kraujagyslės būna panašios į kapiliarus, sudarytus iš vieno ląstelių sluoksnio ir neturinčios pamatinės membranos. 8–tą dieną kapiliarai jau turi pamatinę membraną, tačiau tik 10–12–tą dienomis, jie stebimi arčiau paviršiaus, prie chorioninio epitelio. Šiuo metu, kraujagyslės jau būna diferencijavusios į venules bei arterioles, sudarytas iš kelių ląstelių sluoksnių ir aplink save turinčias daugiau jungiamojo audinio [15].

Lietuvoje atlikto tyrimo duomenimis, ant CAM užsodinus glioblastomos vėžines ląsteles, membranos storis padidėja ne tik po naviku, bet ir apie 1 cm aplink naviką. 48 valandos po užsodinimo, membrana sustorėja 2 kartus, lyginant su kontroline grupe, po 72 valandų – 4 kartus, o po 120 valandų – 5 kartus. Taip pat pastebėta CAM epitelio proliferacija bei didesnė vaskuliarizacija. Autorių teigimu, navikas ant membranos gali išgyventi 6 dienas, nes CAM po 120 valandų pradeda džiūti ir navikas nebegauna pakankamo maitinimo [23].

Kita priežastis, darantį šį tyrimo metodą patrauklų – iki 17–os paros, viščiuko embriono smegenų centras, susijęs su skausmo suvokimu, nėra išsivystęs, todėl daugelyje šalių šis modelis nereikalauja bioetikos komiteto leidimo atlikti biomedicininį tyrimą su gyvūnais, tarp jų ir Lietuvoje [16].

9.3. Skirtingi ląstelių užsodinimo ant CAM būdai ir jų palyginimas

Viščiuko embrionas laboratorinėmis sąlygomis gali būti auginamas dviem būdais – ex–ovo ir in–ovo. Ex–ovo būdu viščiuko embrionas auginamas ne kiaušinyje, o kitame tam skirtame indelyje, pvz., Petri lėkštelėje, o in–ovo – embrionas iš kiaušinio neišimamas. Šie metodai turi savų privalumų bei trūkumų. Vienas didžiausių ex–ovo modelio trūkumas yra prastesnis embrionų išgyvenamumas, kuris skirtingais literatūros duomenimis, gali siekti 15–90 %, kai tuo metu in–ovo išgyvenamumas 85–95 % [24,25]. Naik ir kt. pabandė surasti metodą, kuriuo ex–ovo embrionų išgyvenamumas prilygtų in–ovo.

(16)

Straipsnyje nurodoma, kad embriono auginimas Petri lėkštelėje yra neveiksmingas metodas ir viščiukų išgyvenamumas yra mažiausias, siekiantis tik 15–25%. Autoriai nustatė, kad tinkamiausi auginimui yra plastikiniai puodeliai su 6–7 cm skersmeniu. Tada išgyvenamumas prilygsta in–ovo ir siekia 85–90 %.

Taip yra todėl, kad embriono paviršiaus įtempis būna mažesnis negu Petri lėkštelėje ir rečiau plyšta [24].

Dar vienas ex–ovo modelio trūkumas yra didesnė embriono infekcijos rizika, todėl pasirinkus šį modelį, reikia laikytis griežtų higienos reikalavimų, lašinti antibiotikus bei sterilizuoti lėkšteles, kuriose bus laikomi embrionai, su 70 % etanolio tirpalu [26].

Ex–ovo yra tinkamas modelis, jeigu norima ant vieno embriono auginti kelis mėginius, kadangi yra didesnis matymo laukas, taip pat norint stebėti naviko arba tiriamosios medžiagos poveikį platesniam CAM plotui. Ex–ovo pranašesnis ir vertinant angiogenezę, kadangi in–ovo modelyje yra padaromas tik mažas langelis [27].

Naudojant in–ovo modelį, reikėtų atkreipti dėmesį į pažaidą membranai, kurią galima padaryti ruošiant langelio atvėrimą. Langelis atveriamas 3–čią vystymosi parą, kadangi vėliau CAM gali būti prilipusi prie kiaušinio lukšto. Atverinėjant langelį, dulkės nuo kiaušinio lukšto gali nusėsti ant membranos ir sukelti uždegiminį atsaką. Tai turės įtakos angiogenezei ir bus sunku vertinant rezultatus suprasti, ar gauti rezultatai rodys uždegiminio atsako sukeltus požymius, ar navikinių ląstelių [28].

Yra įvairių būdų, kaip navikines ląsteles užsodinti ant CAM, kad jos geriau prisitvirtintų.

Naudojamos želatininės kempinėlės, filtriniai diskai, silikoniniai žiedai, kolageno kempinėlės, matrigelis ir kiti metodai [24].

Buvo pastebėta, kad angiogenezei turi įtakos tam tikros medžiagos, naudojamos ląstelėms užsodinti, savybės. Medžiagos su lygiu (polivinilchloridai, poliuretanai) arba teigiamai įkrautu paviršiumi pasižymi antiangiogeninėmis savybėmis, o tuo tarpu medžiagos su šiurkščiu pavišiumi (kolagenas, elastinės membranos) arba su rūgštiniais komponentais, sąlygoja stipresnį angiogeninį CAM atsaką [20].

Želatininė kempinėlė yra vienas iš patikimiausių navikinių ląstelių užsodinimo metodų. Viena iš priežasčių yra ta, kad ji sukelia mažesnę nespecifinę uždegiminę CAM reakciją, lyginant su kitais metodais. Be to, naujos kraujagyslės gali augti vertikaliai į kempinėlės angas ir taip būti atskiriamos nuo jau prieš tai egzistavusių [28]. Nespecifinės uždegiminės reakcijos atsakas būna mažiau tikėtinas, jeigu ląstelės būna užsodinamos ankstyvu embriono vystymosi laikotarpiu, kai imuninė sistema būna neaktyvi [16]. Vienoje studijoje Ozcetin ir kt. palyginę matrigelį su želatinine kempinėle nustatė, kad pastaroji yra efektyvesnė, nes geriau prilimpa prie CAM ir navikinės ląstelės nenuslysta. Be to, tyrimui užtekdavo mažiau ląstelių, kad susiformuotų pakankamo dydžio navikas [29].

Naudojant metilceliuliozės diskus yra pasiekiamas lėtas pro– ir anti– angiogeninių faktorių išsiskyrimas, todėl jie labai tinka vertinant šių faktorių terapinę reikšmę. Tačiau šis metodas turi ir

(17)

17 pat diskai patys gali sukelti angiogenezę [7]. Taip veikia ir matrigelis. Jo sudetyje yra lamininas bei augimo faktoriai, kurie gali skatinti kraujagyslinių tubulių formavimąsi [28,30].

Labai efektyvūs kolageniniai implantai, kurie yra geresni už matrigelį, filtrinius diskus, želatinines kempinėles ir kitus metodus. Taip yra dėl to, nes kolagenas yra natūraliai randamas stromoje.

Per 2–4 dienas nuo implantavimo, kolageną infiltruoja naujai susiformavusios kraujagyslės, todėl jas lengva atskirti nuo prieš tai egzistavusių [28].

Kolagenas greitai integruojasi į CAM gemalinius lapelius. Per 48 valandas jis jau būna įsiliejęs į ektodermą, tampa mezodermos dalimi. Po 2 valandų nuo implantacijos pasirodo ląstelės, dalyvaujančios uždegiminiuose procesuose. Pirma heterofilai (atitinka žinduolių neutrofilinius granulocitus), paskui monocitai/makrofagocitai, kurie išskiria pro– ir anti– angiogeninius faktorius [28].

Vertinant filtrinio popieriaus savybes, buvo pastebėta, kad simetriška jo architektonika sąlygoja mažesnį uždegiminį atsaką bei tolygesnį studijuojamų ląstelių pasiskirstymą [20].

Visi šie ląstelių sodinimo metodai yra svarbūs ir pritaikomi atsižvelgiant į eksperimento modelį bei laukiamus rezultatus. Ex–ovo metodas taikomas, kai norima įvertinti vėžinių ląstelių įtaką platesniam paviršiui ar sodinant kelis mėginius ant vienos viščiuko embriono chorioalantojinės membranos. Jeigu norima silpnesnio medžiagos, naudojamos ląstelėms užsodinti, sukelto angiogeninio atsako, naudojamas polivinilchloridas, poliuretanas, želatininė kempinėlė.

(18)

10. TYRIMO METODIKA

10.1. Literatūros analizė

Literatūros analizei apie smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgseną ant CAM bei skirtingus ląstelių užsodinimo ant CAM metodus buvo analizuoti 36 literatūros šaltiniai. Mokslinių straipsnių paieška buvo atlikta kompiuterinėse bibliografinėse mokslinių tyrimų bazėse PubMed, ScienceDirect, Wiley Online Library. Paieškai buvo naudojami raktiniai žodžiai: „chorioallantoic membrane“, „CAM“,

„chick embryo“, „small–cell lung cancer“, „cell seeding methods“ arba jų deriniai.

10.2. Kiaušinių inkubavimas ir langelių atvėrimas

Šiame tyrime buvo naudoti apvaisinti Cobb–500 veislės vištų kiaušiniai, atvežti iš Lietuvos Dovainonių paukštyno, esančio Kaišiadorių rajone. Kiaušiniai buvo laikomi inkubatoriuje, esančiame Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Histologijos ir embriologijos katedros laboratorijoje (2 pav.).

2 pav. Vištų kiaušiniai laikomi inkubatoriuje esant 37,7 °C temperatūrai bei 60 proc.

santykinei oro drėgmei

Geriausios inkubavimo sąlygos pasirinktos iš literatūroje aprašomų viščiuko embrionų auginimo protokolų. Temperatūra buvo 37,7 °C, santykinė oro drėgmė – 60 % [31]. Šios sąlygos buvo palaikomos visą eksperimento laiką. Per pirmas 72 valandas nuo eksperimento pradžios, inkubatoriuje

(19)

19 buvo įjungtas automatinis kiaušinių vartymas. Po trijų parų jis buvo išjungtas ir pradėtas langelių atidarymas.

Prieš atidarant langelius, kiaušinių lukštai buvo dezinfekuoti 70 % etilo alkoholio tirpalu.

Bukasis kiaušinio galas buvo praduriamas sterilia adata ir ištraukta apie 1-2 ml kiaušinio baltymo, kad langelių atidarymo metu embrionas būtų saugus, nes ištraukus šiek tiek baltymo, membrana nusileidžia ir neprilimpa prie lukšto. Pradurta vieta užklijuota sterilia plėvele.

Su mechaniniu greitaeigiu grąžtu, kiaušinio lukšte buvo padaryti 1 cm2 kvadratiniai langeliai (3 pav.) ir vizualiniu būdu įvertintas embriono gyvybingumas – stebėtas embriono besivystančios širdies plakimas.

3 pav. Pro kiaušinyje atvertą langelį matomas besiformuojantis viščiuko embrionas

Viščiukų embrionai su plakančia širdimi ir besiformuojančiu kraujagyslių tinklu buvo uždengiami permatoma plastikine plėvele ir padėti į inkubatorių (4 pav.). Negyvybingi embrionai ir neapvaisinti kiaušiniai buvo iš eksperimento pašalinami.

4 pav. Permatoma plastikine plėvele užklijuotas atvertas langelis

(20)

10.3. Tiriamosios grupės

Magistrinio darbo metu buvo nuspręsta įvertinti viščiuko embriono chorioalantojinės membranos struktūros pokyčius naudojant skirtingus galimus ląstelių užsodinimo metodus. Iš viso tyrimui naudota 19 apvaisintų vištos kiaušinių.

Tiriamosios grupės:

1) Kontrolinė grupė (n꓿5) – ant viščiuko embriono CAM jokios medžiagos nedėta;

2) Ant CAM uždėta tik želatininė kempinėlė. Tirta membrana po želatinine kempinėle (n꓿7) ir šalia jos (n꓿9);

3) Uždėta želatininė kempinėlė su 20 μl kolageno, tirta membrana po želatinine kempinėle (n꓿7) ir šalia jos (n꓿9).

Naudojant mikroskopą Olympus SZX16 (Olympus Corporation, Japonija), kad būtų įvertinti membranos struktūros pokyčiai, buvo fotografuojama Olympus DP72 (Olympus Corporation, Japonija) skaitmenine kamera kontrolinės grupės mėginiai ir mėginiai su ant CAM užsodinta želatinine kempinėle (9–tą, 10–tą, 11–tą, 12–tą eksperimento dienomis) 3.2x ir 5x padidinimais (5 pav.).

Viščiuko embrionas 12–tą eksperimento parą buvo numarintas 4 % formaldehido tirpalu. CAM dalis, kurioje yra prisitvirtinusi želatininė kempinėlė arba CAM be kempinėlės (kontrolė), buvo iškerpama ir dedama į Petri lėkštelę su formaldehido tirpalu. Membrana fotografuojama tais pačiais padidinimais tiek iš vidinės, tiek iš išorinės CAM pusių.

5 pav. Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana fotografuojama 3.2x ir 5x

(21)

21 10.4. CAM preparatų paruošimas

Tiriamųjų grupių kiaušinius, nufotografavus in vivo biomikroskopijos tyrimui, CAM buvo nuimtos ir paruoštos tolimesniam morfologiniam ištyrimui pagal protokolą (1 lentelė).

1 lentelė. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos preparatų paruošimo protokolas

Eilės nr. Trukmė Aprašymas

1. 24 val. Iškirptos ir nuimtos CAM laikomos 4 % formaldehido tirpalo indelyje.

2. 6 val. CAM sudedamos į biopsines kasetes ir plaunamos po tekančio vandens srove.

3. 12 val. CAM dehidratuojama 70 % etilo alkoholio tirpale.

4. 1 val. CAM laikoma 80 % etilo alkoholio tirpale.

5. 1 val. CAM laikoma 96 % etilo alkoholio tirpale.

6. Membranos išimamos iš biopsinių kasečių ir apkarpomos.

7. 1 val. CAM sudedamos į kasetes ir laikomos chloroformo bei 96 % etilo alkoholio tirpale (1:1).

8. 1 val. CAM laikoma chloroforme, kad sukietėtų.

9. 1 val. CAM laikoma parafine su chloroformu (1:1) 64 °C temperatūroje termostate.

10. 1 val. Membrana laikoma indelyje su parafinu.

11. 1 val. Membrana laikoma antrame indelyje su parafinu.

12. CAM įstatomos į liejimo formelę ir užpilamos parafinu.

13. Parafino blokai šaldomi ant -10 °C temperatūros šaldymo plokštės (Pfm Medical AG, Kiolnas, Vokietija) iki kol bus pakankamai kieti pjovimui.

14. Mikrotomu (Leica microsystems RM2155, Vokietija) blokai pjaustomi 3 µm storio pjūviais ir dedami į 37 °C temperatūros vandens vonelę (Leica

microsystems HI 1210, Vokietija).

15. Atpjautos membranos uždedamos ant objektinio stiklelio.

16. Preparatai dedami ant šildymo plokštės, kad pjūviai prikibtų prie objektinio stiklelio.

17. Preparatai sudėti į termostatą (ECOCELL , LSIS-B2V/EC55, Vokietija) ir laikomi 37 °C temperatūroje.

Atlikus preparato paruošimą pagal protokolą (1 lentelė) buvo atliekamos dažymo procedūros.

Dažant preparatus, pirmiausia buvo pašalinamas parafinas – preparatai buvo laikomi ksilene per naktį.

Kitą dieną preparatai perkelti į kitus indelius su ksilenu ir laikomi po 5 minutes. Preparatai rehidratuoti

(22)

2 kartus po 2 min. izopropanolio alkoholio tirpalu ir 1 kartą 2 min. laikant 96 % etilo alkoholio tirpale.

Kelias minutes plauti po tekančio vandens srove etilo alkoholiui pašalinti. Preparatai buvo laikomi 5 min. Majerio hematoksiline, hematoksilinas išplautas tekančio vandens srove 1 minutę, 30 sekundžių laikoma 37 mM amonio vandenyje, hematoksilino dažams užfiksuoti. 1 min. plauta po tekančio vandens srove. Preparatai perkelti į eozino dažus 2 minutėms, tada jie vieną minutę buvo plaunami. Galiausiai vyko histologinės medžiagos dehidratavimas ir skaidrinimas. Dehidratuota po 5 kartus įmerkiant į izopropilo alkoholį ir į du indelius su 96 % etilo alkoholio tirpalu. Preparatai skaidrinti ksilenu laikant 2 kartus po 5 minutes. Tada uždengti dengiamaisiais stikleliais naudojant histologinius klijus (6 pav.).

Preparatai analizuoti ir fotografuoti Olympus BX40F4 šviesiniu mikroskopu (Olympus Corporation, Japonija) su Olympus XC30 skaitmenine kamera, naudojant CellSensDimention 1.9 Digital Imaging Software (Olympus Corporation of the America, JAV) kompiuterinę programą. Fotografuota CAM dalis po želatinine kempinėle bei šalia jos iš abiejų pusių (iš viso 3 nuotraukos) ir kontrolinės grupės CAM (1 nuotrauka). Su minėta kompiuterine programa matuota CAM kraujagyslių skaičius bei membranos storis viename regėjimo lauke 4x padidinimu.

6 pav. Nudažyti ir paruošti preparatai

10.5. Statistinė duomenų analizė

Tiriamųjų grupių lyginimui buvo išvedami duomenų vidurkiai naudojant Microsoft Office Excel 2013 programą, apskaičiuojama vidutinė standartinė paklaida. Vertinant CAM kraujagyslių skaičiaus ir membranų storių skirtumą skirtingose tiriamųjų grupėse, dviejų grupių palyginimui buvo taikytas neparametrinis Mann – Whitney U testas, naudojant GraphPad Prism 8.4.3 statistinę programą.

Statistiškai reikšmingais laikyti skirtumai, kai p < 0,05.

(23)

23

11. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

11.1. In vivo biomikroskopija

Viščiuko embriono chorioalantojinė membrana turi platų bei greitai besivystantį kraujagyslių tinklą, todėl ji plačiai naudojama kaip modelis navikų augimui, jų angiogenezei, invazijai, metastazėms bei vaistų poveikiui navikinėms ląstelėms tirti. Šiame tyrime 7–tą embriono vytymosi parą ant CAM buvo užsodinta želatininė kempinėlė su arba be 20 μl kolageno. 9–12–tą paromis atlikta in vivo biomikroskopija bei 12–tą parą membrana buvo nuimta morfologiniam ištyrimui.

7 pav. pavaizduotos biomikroskopijos nuotraukos CAM kontrolinėse grupėse (n=5). Matomos netaisyklingai išsidėsčiusios kraujagyslės, tolygiai maitinančios visą chorioalantojinės membranos plotą.

7 pav. CAM biomikroskopija 9–12 viščiuko embriono vystymosi parą kontrolinėse grupėse (n=5). A – 9 para, B – 10 para, C – 11 para, D – 12 para. Skalė – 2 mm.

8 pav. pateikiamos 9–12 parų CAM biomikroskopijos nuotraukos su užsodinta želatinine kempinėle be kolageno, padidintos 3.2 karto. Pateikiamuose vaizduose matome, kad jau antrą dieną po

A B

C D

(24)

užsodinimo (8 pav., A), želatininė kempinėlė pritraukė naujai susiformavusias kraujagyles, kurios aplink ją išsidėsto kaip rato stipinai. 10–tą ekperimento parą (3–čią parą po užsodinimo), – naujų kraujagyslių tinklas storėja bei tankėja. Nuo 11–tos paros, stebimas kempinėlės dydžio sumažėjimas bei smulkių kraujagyslių įaugimas (8 pav., C). Tai rodo kempinėlės įaugimą į chorioalantojinę membraną. Paskutinę eksperimento dieną matoma, kad kraujagyslės, lyginant su 9–ta para, yra labiau sustorėjusios, jų tinklas tankesnis (8 pav., D).

8 pav. Ant CAM užsodintos želatininės kempinėlės biomikroskopija 9–12 viščiuko embriono vystymosi parą. A – 9 para, B – 10 para, C – 11 para, D – 12 para.

A–D – trumpos rodyklės žymi kempinėlės pritrauktas kraujagysles, stora rodyklė žymi kempinėlę.

C ir D – trikampiu žymimas kraujagyslių tinklas ant kempinėlės, jai įaugus į CAM. Skalė 2 mm

9 pav. pateikiamos 9–12 parų CAM biomikroskopijos nuotraukos su užsodinta želatinine kempinėle su 20 μl kolageno, padidintos 3,2 karto. Iš nuotraukų matoma, kad pritrauktų kraujagyslių yra panašiai kaip kempinėlės be kolageno grupėje. Kempinėlė jau 10–tą eksperimento parą (9 pav., B) pradeda įsiterpti į CAM ir 11–tą parą matoma, kad kempinėlės dydis aiškiai sumažėjęs, lyginant su 9–ta bei 10–ta užsodinimo paromis.

A B

C D

(25)

25 9 pav. Ant CAM užsodintos želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno biomikroskopija 9–12 viščiuko

embriono vystymosi parą. A – 9 para, B – 10 para, C – 11 para, D – 12 para.

A–D – trumpos rodyklės žymi kempinėlės pritrauktas kraujagysles, stora rodyklė žymi kempinėlę.

B–D – trikampiu žymimas kraujagyslių tinklas ant kempinėlės, jai įaugus į CAM. Skalė 2 mm

10 paveiksle pavaizduotos kontrolinės, želatininės kempinėlės bei kempinėlės su 20 μl kolageno grupių chorioalantojinės membranos, nuimtos 12–tą eksperimento parą. Matome, kad grupėse su kempinėle buvo pritrauktos kraujagyslės, kurios išsidėstė kaip rato stipinai aplink želatinines kempinėles su arba be kolageno (10 pav., C, D, E, F). Kitoje membranos pusėje galime pamatyti pritrauktas po kempinėle kraujagysles (10 pav., D, F). Šiose dviejose grupėse, kraujagyslių skaičius mažai skiriasi. Kontrolinėje grupėje yra mažesnis kraujagyslių tinklas, jos išsidėsčiusios neorganizuotai (10 pav., A, B).

A B

C D

(26)

10 pav. 12-tą embriono parą nuimtos CAM. A – kontrolinės grupės išorinės pusės CAM, B – kontrolinės grupės vidinės pusės CAM, C – želatininės kempinėlės grupės išorinės pusės CAM, D – želatininės kempinėlės grupės vidinės pusės CAM, E – želatininės kempinėlės su 20 μl kolagenu grupės

išorinės pusės CAM, F – želatininės kempinėlės su 20 μl kolagenu grupės vidinės pusės CAM. C–F – trumpa rodyklė žymi želatininės kempinėlės pritrauktas kraujagysles, storos rodyklė žymi kempinėlę.

Skalė 1 mm

Literatūros duomenimis, panašus stipininis kraujagyslių ratas susidaro ir grupėse, kuriose buvo naudojamos vėžinės ląstelės. Toks kraujagyslių išsidėstymas būdingas mielominės ligos [32], neuroblastomos [33], inkstų karcinomos [34] bei kitų navikų augimui ant CAM. Todėl matoma, kad chorioalantojinė membrana angiogenezės požiūriu į želatininę kempinėlę reaguoja panašiai, kaip į

A B

C D

E F

(27)

27 naviką. Todėl ateityje vertinant eksperimentų duomenis, kuriuose naudojamos ląstelės, reiktų atsižvelgti ir į medžiagos, naudojamos ląstelių užsodinimui, daromą poveikį CAM.

11.2. Morfologinis CAM vertinimas

11.2.1. CAM storis

Nudažius CAM buvo vertinamas jos storis bei kraujagyslių skaičius. 11 pav. pavaizduotas tiriamųjų grupių chorioalantojinių membranų storių skirtumas, vertinant vizualiai. Kontrolinės grupės (11 pav., A) CAM yra aiškiai plonesnė, negu grupių, kuriose buvo užsodinta želatininė kempinėlė su arba be 20 μl kolageno (11 pav., B, C). Taip pat kontrolinėje grupėje kraujagyslės pilnai neišsivysčiusios, jų spindis labai nedidelis, tuo tarpu grupėse su kempinėle, spindis aiškiai matomas, platus (11 pav. B, C).

11 pav. CAM, dažytos hematoksilinu ir eozinu. A – kontrolinės grupės membrana, B – želatininės kempinėlės grupė, C – želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno grupė;

žk – želatininė kempinėlė, m – mezenchima, k – kraujagyslė, ce – choriono epitelis, ae – alantojaus epitelis, žvaigždutė – želatininės kempinėlės užsodinimo vieta.

Skalė 200 µm

žk

m

m ce

ce

ce

ae ae

ae m

A B

C

k

k

k

(28)

12 paveiksle pateikti membranos storio skirtumai tirtose grupėse. Kontrolinėje grupėje minimalus CAM storis buvo 13,5 μm, o maksimalus – 72,8 μm, membranos po želatinine kempinėle grupėje – minimalus – 30,2 μm, maksimalus – 691,4 μm, membranos, esančios šonuose nuo želatininės kempinėlės grupėje minimalus – 13,8 μm, maksimalus – 396,1 μm, membranos po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno grupėje minimalus – 18,2 μm, maksimalus – 853,0 μm, membranos, esančios šonuose nuo želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno grupėje minimalus – 12,9 μm, maksimalus – 384,9 μm.

Lyginant kontrolinę grupę su membranos po želatinine kempinėle grupe, buvo gautas statistiškai reikšmingas skirtumas, kad CAM po kempinėle buvo 9 kartus storesnė už kontrolinę grupę (p<0,0001).

Tuo tarpu membrana po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno už kontrolinę grupę buvo storesnė 10,5 karto ir tai taip pat buvo statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,0001). Tarpusavyje lyginant membranos po želatinine kempinėle bei membranos po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno grupes, reikšmingas skirtumas nebuvo gautas (p=0.4586). Tačiau, lyginant membranos, esančios šonuose nuo želatininės kempinėlės bei membranos, esančios šonuose nuo želatininės kempinėlės su 20 μl kolagenu grupės, buvo nustatyta, kad pastarosios grupės membranų storis buvo reikšmingai didesnis (p=0.0155).

(29)

29 Šlekienė ir kt. atliko tyrimą, kuriame vertino smulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių elgseną ant CAM su ir be natrio valproatu ir nustatė, kad kontrolinėje grupėje ant membranos užsodinus vėžines ląsteles be vaisto, CAM sustorėjo iki 509.2±184 μm po naviku bei iki 139.1±138.4 μm šalia naviko [20].

Mūsų atlikto tyrimo rezultatai panašūs – membranos storis po želatinine kempinėle be kolageno 283,6

±191,5 μm, CAM storis po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno yra 341,3±257,2 μm. Tuo tarpu šonuose nuo želatininės kempinėlės be kolageno yra 92,9±87.9 μm, o membranos storis iš šonų nuo želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno yra 124,2±96,8 μm.

Chorioalantojinės membranos sustorėjimas siejamas su naujų kraujagyslių atsiradimu. Ant chorioalantojinės membranos užsodinama želatininė kempinėlė ar kita medžiaga sąlygoja nespecifinę uždegiminę reakciją, todėl pritraukiamos kraujagyslės bei vyksta neoangiogenezė. CAM su krauju gauna daugiau maisto medžiagų, todėl jos mezoderma storėja. Šis efektas stipriausiai matomas chorioalantojinės membranos dalyje po užsodinta medžiaga ir silpnėja tolstant nuo jos [35].

Iš gautų rezultatų matome, kad kontrolinės grupės membranos storis skiriasi nuo grupių, kuriose buvo naudojamos želatininės kempinėlės – membrana sustorėjo 9–10,5 kartus. Želatininė kempinėlė sukelia CAM reakciją net ir be vėžinių ląstelių, todėl ateityje tiriant įvairių navikų angiogenines savybes naudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį, reikėtų į tai atsižvelgti.

11.2.2. Kraujagyslių skaičius

Vertinant tiriamųjų grupių CAM kraujagysles jos buvo skaičiuojamos viename regėjimo lauke žiūrint pro Olympus BX40F4 (Olympus Corporation, Japonija) šviesinį mikroskopą. 13 pav., A matyti, kad kontrolinėje grupėje kraujagyslių skaičius buvo daug mažesnis negu želatininių kempinėlių grupėse (13 pav., B, C).

(30)

13 pav. CAM kraujagyslių skaičiaus skaičiavimas tirtose grupėse. A – kontrolinės grupės membrana, B – želatininės kempinėlės grupė, C – želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno grupė.

Skalė – 200 μm

Kontrolinėje grupėje mažiausias kraujagyslių skaičius buvo 5, o didžiausias – 12; CAM po želatinine kempinėle mažiausias – 16, didžiausias – 80; šonuose nuo želatininės kempinėlės mažiausias kraujagyslių skaičius – 11, didžiausias – 21; po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno mažiausias skaičius – 13, didžiausias – 73; šonuose nuo želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno mažiausias skaičius – 11, didžiausias – 30 (2 lentelė).

A B

C

(31)

31 2 lentelė. Kraujagyslių skaičius tiriamosiose grupėse

Tiriamoji grupė Mažiausias kraujagyslių skaičius, vnt

Didžiausias kraujagyslių skaičius,

vnt

Kraujagyslių skaičiaus vidurkis, vnt

Kontrolė 5 12 7,4±2,9

Želatininė kempinėlė 16 80 43,1±22,2

Iš šonų nuo želatininės kempinėlės

11 21 15,7±3,7

Želatininė kempinėlė su 20 μl kolageno

13 73 44,2±22,7

Iš šonų nuo želatininės kempinėlės su 20 μl

kolageno

11 30 18,2±7,1

Vertinant neoangiogenezę (14 pav.) kontrolinėje grupėje su membranos po želatinine kempinėle grupe, nustatyta statistiškai reikšmingas skirtumas tarp sukeltos neoangiogenezės (p=0,0025).

Taip pat statistiškai reikšmingas (p=0,0043) skirtumas gautas tarp kontrolinės bei membranos po želatinine kempinėle su 20 μl kolagenu grupių. Tačiau tarp membranos po želatinine kempinėle bei membranos po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno grupių nebuvo nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p=0,9452). Nors ir iš šonų nuo želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno grupėje buvo gauta statistiškai reikšmingai storesnės membranos negu iš šonų nuo želatininės kempinėlės grupėje, šis skirtumas nebuvo reikšmingas lyginant minėtų grupių neoangiogenezę (p=0,5581).

(32)

14 pav. Naujų kraujagyslių skaičius tirtose grupėse

Angiogeninį poveikį turi ne tik ant CAM užsodintos vėžinės ląstelės, bet ir kitos medžiagos be ląstelių. Manoma, kad pačios chorioalantojinės membranos ekstraląstelinis matriksas išskiria medžiagas, skatinančias kraujagyslių formavimąsi, tokias kaip FGF–2 (angl. fibroblast growth factor–2), VEGF (angl. vascular endothelial growth factor) bei TGFβ1 (angl. transforming growth factor beta 1) [20].

Angiogeninį atsaką gali sukelti beląstelinis matriksas iš smegenų, aortos, šlaunikaulio, stemplės bei kitų organų [21].

Haag ir kt. nustatė, kad 8–tą vystymosi dieną ant CAM užsodinus beląstelinį trachėjos matriksą, per keturias dienas ši medžiaga pritraukia panašų kraujagyslių ratelį aplink save, kaip ir želatininė kempinėlė šioje studijoje. Taip pat suskaičiuota, kad trachėjos matriksas sukėlė CAM angiogenezę – susiformavo 25±3 naujos kraujagyslės [36].

Iš atliktų tyrimų galima pastebėti, kad neoangiogenezei sukelti, nebūtina ant CAM užsodinti vėžines ląsteles. Kraujagyslės gali pradėti formuotis dėl nespecifinio uždegiminio atsako arba dėl CAM ekstraląstelinio matrikso išskiriamų angiogeninių medžiagų [20].

(33)

33 15 pav. pavaizduotos kempinėlės grupės CAM mezenchimoje susidariusios kraujagyslės.

Matoma susiformavęs kraujagyslių endotelis ir spindis, juose esantys viščiuko embriono eritrocitai su branduoliais.

15 pav. Viščiuko embriono chorioalantojinės membranos kraujagyslės kempinėlės grupėje.

Rodyklė žymi kraujagysles. Skalė 20 µm

Šiame tyrime buvo nustatyta, kad želatininė kempinėlė su arba be 20 μl kolageno ne tik skatina chorioalantojinės membranos storėjimą, bet ir naujų kraujagyslių vystymąsi. Tai rodo, kad kituose tyrimuose, kuriuose buvo naudojamos vėžinės ląstelės, neoangiogenezė galėjo įvykti ne tik dėl vėžinių ląstelių savybių, bet ir dėl medžiagų, naudojamų ląstelių užsodinimui, sukeltos nespecifinės uždegiminės reakcijos.

(34)

12. IŠVADOS

1. Išanalizavus mokslinę literatūrą apie ant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos (CAM) užsodintas smulkiųjų ląstelių plaučių vėžio (SCLC) ląsteles ir jų elgsenos ypatumus buvo pastebėta, kad SCLC skatina CAM neoangiogenezę, membrana po užsodintomis ląstelėmis storėja.

2. Išanalizavus mokslinę literatūrą apie skirtingus ląstelių užsodinimo ant CAM metodus ir juos palyginus buvo pastebėta, kad ex–ovo metodas taikomas, kai norima įvertinti vėžinių ląstelių įtaką platesniam CAM paviršiui ar sodinant kelis mėginius ant vienos viščiuko embriono chorioalantojinės membranos, o jeigu norima silpnesnio medžiagos, naudojamos ląstelių užsodinimui, sukelto angiogeninio atsako, naudojamas polivinilchloridas, poliuretanas, želatininė kempinėlė. Vieni iš patikimiausių metodų yra želatininė kempinėlė bei kolageniniai implantai.

3. Įvertinus chorioalantojinės membranos struktūros pokyčius naudojant skirtingus galimus ląstelių užsodinimo metodus buvo pastebėta, kad želatininė kempinėlė gali sukelti CAM pokyčius. CAM storis po želatinine kempinėle be kolageno buvo 283,6±191,5 μm, CAM storis po želatinine kempinėle su 20 μl kolageno buvo 341,3±257,2 μm, stebima neoangiogenezė – želatininės kempinėlės grupėje susiformuoja iki 80 naujų kraujagyslių, o želatininės kempinėlės su 20 μl kolageno grupėje iki 73 kraujagyslių.

(35)

35

13. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Atlikto tyrimo metu buvo analizuota viščiuko embriono chorioalantojinės membranos reakcija į želatininę kempinėlę su arba be 20 μl kolageno. Paprastai, naudojant kempinėlę, tiriamos vėžinės ląstelės, vertinama jų sukelta CAM reakcija, neoangiogenezė, invazyvumas bei metastazavimo ypatumai. Nustatyta, kad CAM reakcija įvyksta naudojant tik želatininę kempinėlę be vėžinių ląstelių, todėl ateityje atliekant bandymus su ląstelėmis bei naudojant viščiuko embriono chorioalantojinės membranos modelį, rekomenduojama atkreipti dėmesį, kad sukelta neoangiogenezė ir sustorėjusi CAM gali įvykti ir dėl reakcijos į medžiagą, naudojamą ląstelėms užsodinti.

(36)

14. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. World health organization. Latest global cancer data: Cancer burden rises to 18.1 million new cases and 9.6 million cancer deaths in 2018. Press release No263. 2018. [cituota 2020-03-18].

Prieiga per: who.int/cancer/PRGlobocanFinal.pdf

2. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018:

GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.

CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394. [cituota 2019-11-15]. Prieiga per: . https://acsjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.3322/caac.21492

3. Zemaitis M, Bajoriunas V, Basevicius A, Cesas A, Dobrovolskiene L, Jarusevicius L, et al.

Plaučių vėžio diagnostikos ir gydymo rekomendacijos. Medicinos spaudos namai. 2018. [cituota 2019-11-15]. Prieiga per: http://www.pulmoalerg.lt/wp-admin/admin- post.php?action=preview_document&post_id=600

4. Kalemkerian GP, Akerley W, Bogner P, Borghaei H, Chow LQM, Downey RJ. Small Cell Lung Cancer. J Natl Compr Canc Netw. 2013;11(1):78–98. [cituota 2019-11-23]. Prieiga per:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3715060/

5. Früh M, Ruysscher DD, Popat S, Crino L, Peters S, Felip E. Small-cell lung cancer (SCLC):

ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology.

2013;24(6):99–105. [cituota 2019-11-17]. Prieiga per:

https://www.annalsofoncology.org/article/S0923-7534(19)31548-0/fulltext

6. Ribatti D. The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane in the Study of Angiogenesis and Metastasis. Springer. 2010;1-124. [cituota 2021-05-07]. Prieiga per:

https://www.springer.com/gp/book/9789048138432

7. Nowak-Sliwinska P, Segura T, Iruela-Arispe ML. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 2014;17(4);779–804. [cituota 2019-12- 08]. Prieiga per: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4583126/

8. Jankovic BD, Isakovic K, Lukic ML, Vujanovic NL, Petrovic S, Markovic BM. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology.

1975;29(3):497–508. [cituota 2019-12-19]. Prieiga per:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1445979/

9. Ribatti D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Exp Cell Res. 2014;328(2):314–324. [cituota 2020-01-29]. Prieiga per:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0014482714002572?via%3Dihub

Riferimenti

Documenti correlati

Siekiant įvertinti ar informacijos apie genetinius tyrimus suteikimas skirtingais kiaušidžių vėžio tyrimo ir gydymo etapais turi įtakos pacienčių aktyvumui, atliekant

LSMUL KK Odos ir venerinių ligų klinikoje atliktų gliukokortikoidų (n= 30) ir Europos standartinio rinkinio alergenų lopo mėginių (ALM) rezultatai pacientams sergantiems

Pritariančių ir nepritariančių teiginiui “Mokymasis kartu su kitais sveikatos bei socialinės priežiūros studentais / specialistais padės man geriau suprasti

Tyrimo objektas - LSMUL KK Širdies chirurgijos skyriuje 2015 – 2017 m. operuotų pacientų, kuriems diagnozuotas mediastinitas po širdies operacijos, medicininė dokumentacija.

Tyrimo uždaviniai: Palyginti pacientų, gydytų surfaktanto “Curosurf” 88-150 mg/kg ir 151-200 mg/kg dozėmis dėl kvėpavimo sutrikimo sindromo, ankstyvuosius

Tirti 174 pacientai taikant AQLQ (asthma quality of life questionnaire), kuris skirtas vertinti pacientų gyvenimo kokybei, ACT (asthma control test) rodantis astmos kontrolės lygį

Norint pasiekti geriausių juosmens srities išvaržų chirurginio gydymo rezultatų, reikia surasti prognostinius veiksnius, kuriems esant chirurginis gydymas turėtų didžiausią

O Naylor MD, Coburn KD, Kurtzman ET ir kiti (2010) komanda grįstą sveikatos priežiūrą įvardijo kaip sveikatos priežiūros paslaugas, teikiamas individams, šeimoms