LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
ANATOMIJOS INSTITUTAS
Lina Miknevičiūtė
SKIRTINGO CHEMINIO FENOTIPO NERVINIŲ LĄSTELIŲ
CITOARCHITEKTONIKA VIRŠUTINIUOSE KALNELIUOSE
Medicinos vientisųjų studijų programa
BAIGIAMASIS MAGISTRO DARBAS
Darbo vadovas
prof. dr. Dainius H. Pauža
2
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 3 2. SUMMARY ... 4 3. PADĖKA ... 5 4. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 55. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
6. SANTRUMPOS ... 6
7. SĄVOKOS ... 7
8. ĮVADAS ... 8
9. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
10. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
10.1 Viršutinių kalnelių anatomija ir fiziologija... 10
10.2 Viršutinių kalnelių neuronų ryšiai su kitomis CNS struktūromis ... 11
10.3 Viršutinių kalnelių neuronų skirtingi cheminiai fenotipai ... 12
10.3.1 Neuronai, kurių sudėtyje yra HuD baltymas ... 12
10.3.2 Neuronai, kurių sudėtyje yra azoto oksido sintazė (NOS) ... 13
10.3.3 Neuronai, kurių sudėtyje yra parvalbuminas ... 13
10.3.4 Neuronai, kurių sudėtyje yra somatostatinas ... 14
11. TYRIMO METODIKA ... 16
11.1 Tiriamojo gyvūno paruošimas ir tiriamosios medžiagos paėmimas... 16
11.2 Viršutinių kalnelių paruošimas ... 16
11.3 Mikropreparatų paruošimas su vibrotomu ... 17
11.4 Mikropreparatų paruošimas su kriomikrotomu ... 17
11.5 Imunohistocheminių reakcijų atlikimas ... 17
11.6 Preparatų mikroskopavimas ir vaizdų analizė ... 18
12. REZULTATAI ... 20
12.1. HuD-IR neuronų išsidėstymas viršutiniuose kalneliuose ... 20
12.2 NOS-IR neuronų išsidėstymas viršutiniuose kalneliuose ... 21
12.3 PV-IR neuronų išsidėstymas viršutiniuose kalneliuose ... 21
12.4 SST-IR neuronai ... 21
13. REZULTATŲ APTARIMAS ... 25
14. IŠVADOS ... 27
3
1. SANTRAUKA
Darbo autorius: Lina Miknevičiūtė
Darbo pavadinimas: Skirtingo cheminio fenotipo nervinių ląstelių citoarchitektonika viršutiniuose kalneliuose.
Darbo tikslas: Ištirti viršutinių kalnelių neuronų cheminius fenotipus ir citoarchitektoniką. Darbo uždaviniai: 1.Nustatyti keturkalnio VK neuronų imunoreaktyvumą RNR surišančiam baltymui HuD, neuroninei azoto oksido sintazei (nNOS), parvalbuminui (PV) ir somatostatinui (SST). 2. Įvertinti skirtingo cheminio fenotipo neuronų pasiskirstymą VK. 3. Įvertinti skirtingo cheminio fenotino neuronų kūnų formas ir dydžius.
Metodai: Šiame tyrime buvo naudojamos suaugusios žiurkės, iš kurių buvo paruošti VK skersiniai pjūviai. VK pjūviuose buvo atliktos imunohistocheminės reakcijos, siekiant nustatyti skirtingų cheminių fenotipų neuronų pasiskirstymą. Taikant fluorescentinę mikroskopiją, imunohistochemiškai vizualizuotos nervinės ląstelės buvo stebimos bei skaitmeniniu būdų fotografuojamos. Naudojant Photoshop programą, skaitmeniniai neuronų vaizdai buvo optimaliai paryškinami ir analizuojami vaizdų įvertinimo programomis AxioVision (Carl Zeiss, Gottingen, Vokietija) bei ImageJ (National Institutes of Health, JK).
Rezultatai: Žiurkės VK aiškiai išryškinti neuronų kūnai (NK) pasižymėjo imunohistocheminiu reaktyvumu (IR) HuD, nNOS ir PV baltymams. HuD-IR NK buvo nustatyti visuose VK sluoksniuose. NK, kurių sudėtyje yra nNOS, aptikti paviršiniame pilkajame, reginiame, tarpiniame bei giliajame pilkuosiuose sluoksniuose. PV-IR NK nustatyti paviršiniame pilkajame, reginiame ir tarpiniame pilkajame VK sluoksniuose. Išryškintų ląstelių kūno formos buvo įvairios: apvalios, ovalios ir trikampės. Šiame darbe mums nepasisekė aptikti SST-IR neuronų, kurie buvo nustatyti ankstesniuose kitų tyrėjų atliktuose tyrimuose. Nitrerginių ląstelių kūnų dydžio vidurkis 105.2 ± 14.8 µm2 sensoriniuose sluoksniuose, 117.7 ± 19.2 µm2 motoriniuose sluoksniuose. PV-IR NK
dydžio vidurkis 116.9 ± 28.2µm2, sensoriniuose sluoksniuose, 116.5 ± 25.2 µm2 motoriniuose
sluoksniuose.
Išvados: 1. Keturkalnio viršutiniuose kalneliuose aptinkami neuronai, kurių sudėtyje yra HuD, nNOS ir PV. 2. HuD-IR ląstelės lokalizuojasi visuose VK sluoksniuose, nNOS-IR - paviršiniame pilkajame, reginiame, tarpiniame ir giliajame pilkuosiuose VK sluoksniuose, o PV-IR - paviršiniame pilkajame, reginiame ir tarpiniame pilkajame VK sluoksniuose. 3. PV-IR ir nNOS-IR neuronų kūnai, paplitę tiek sensoriniuose, tiek ir motoriniuose VK sluoksniuose, yra maži ir vidutinio dydžio. 4. Visiems tirtiems antigenams imunoreaktyvių ląstelių kūnų formos ir jų cheminio fenotipo sąsajų nenustatėme.
4
1.
SUMMARY
The author of Master‘s thesis: Lina Miknevičiūtė
The title of Master‘s thesis: Cytoarchitectonic of the chemically different neuronal somata in the superior colliculi.
Aim: To evaluate the distribution of the chemically different neuronal somata (NS) in the rat superior colliculi (SC).
Objectives: 1. To determine immunoreactivity of NS for RNA binding protein HuD, neuronal nitric oxide synthase (nNOS), parvalbumin (PV) and somatostatin (SST) in SC. 2. To evaluate the distribution of the chemically different phenotype of NS in SC. 3. To assess the size and form of SC NS different in their chemical phenotype.
Methods: In order to determine the distribution of NS with different chemical phenotypes, the adult rats of the either gender were used. Immunohistochemical reactions for HuD, nNOS, PV, and SST antigens within NS were performed on transverse sections of the SC . The immunohistochemically stained NS were observed and digitally imaged using a fluorescence microscopy. Using Photoshop software, digital images of NS were optimally contrasted and analyzed with the image evaluation program AxioVision (Carl Zeiss, Gottingen, Germany) and ImageJ (National Institutes of Health, UK).
Results: The sharply visualized NS in the rat CS were immunohistochemically reactive (IR) for HuD, nNOS, and PV proteins. HuD-IR NS were detected in all SC layers. nNOS-IR NS distribute in superficial grey, optic, intermediate grey and deep grey SC layers. PV-IR NS were found in superficial grey, optic and intermediate grey layers. The body shapes of the distinct immunoreactive NS were diverse: round, oval, and triangular. In this work, we did not succeed in detection of the SST-IR NS that were identified in previous studies. Mean size of the nitrergic NS is 105.2 ± 14.8 µm2 in the sensory layers and 117.7 ± 19.2 µm2 in the motor layers. Mean size of PV-IR NS is 116.9 ± 28.2 µm2
in the sensory layers and 116.5 ± 25.2 µm2 in the motor layers of the rat SC.
Conclusions: 1. SC NS are immunoreactive for HuD, nNOS and PV . 2. HuD-IR NS are spread in all SC layers, nNOS-IR – in the superficial grey, optic, intermediate grey and deep grey layers, PV-IR - in the superficial grey, optic and intermediate grey layers. 3. PV-IR and nNOS-IR NS of both the sensory and the motor SC layers are small and medium in size. 4. The immunoreactive cell bodies are predominantly round and oval in shape that is not related to a chemical phenotype of NS.
5
2.
PADĖKA
Dėkoju šio darbo vadovui prof. Dainius H. Paužai už pagalbą ruošiant darbą bei vertingus patarimus. Taip pat dėkoju ir visai Anatomijos instituto bendruomenei už pagalbą tyrimo metu.
3.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Autorei interesų konflikto nebuvo.
4.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Tyrime naudoti audiniai buvo gauti iš gyvūnų, kurie buvo panaudoti pagal Valstybinės Maisto ir Veterinarijos Tarnybos leidimą Nr. G2-99, 2019-01-09.
6
5.
SANTRUMPOS
VK – viršutiniai kalneliai NK- nervinės ląstelės kūnas HuD – RNR surišantis baltymas NO – azoto oksidas
eNOS - endotelinė azoto oksido sintazė nNOS - neurininė azoto oksido sintazė iNOS – sužadinamoji azoto oksido sintazė
NADPH – nikotinamido adenino dinukleotiso fosfatas PV - parvalbuminas
SISF – somatotropino išsiskyrimą slopinantis faktorius SOM/SST - somatostatinas
PBS – Fosfatinis buferinis tirpalas PFA – paraformadehidas
7
6.
SĄVOKOS
Citoarchitektonika – ląstelių išsidėstymas centrinėje nervų sistemoje.
Fenotipas - ląstelės savybių (morfologinių, cheminių) visuma, atsirandanti jų individualaus vystymosi laikotarpiu ir kuri galimai atspindi tos ląstelės funkcinę reikšmę;
Imunoreaktyvumas - teigiama reakcija su antigenu.
Imunohistocheminės reakcijos – diagnostikos metodas, kuriuo nustatomas antigenas (specifinis baltymas) tiriamajame audinyje.
Propriorecepcija – dirginimų iš organizmo griaučių raumenų, sausgyslių ir sąnarių priėmimas ir pavertimas nerviniu impulsu.
Sakadai – greiti šuoliški abiejų akių judesiai, tarp kurių būna trumpos pauzės. Aferentinės nervinės skaidulos - įcentrinės nervinės skaidulos.
8
7.
ĮVADAS
Viršutiniai kalneliai (VK) yra žinduolių požievinis regos centras [1]. Jie yra sudaryti iš septynių sluoksnių, iš kurių trys paviršiniai formuoja juntamąją dalį, o keturi gilieji - motorinę. VK neuronai atlieka svarbų vaidmenį, reaguodami į potencialiai grėsmingus vaizdinius stimulus bei inicijuodami viso kūno motorinį atsaką, siekiant išvengti galimos grėsmės gyvūnui [7,8]. VK taip pat dalyvauja staigių akių judesių, vadinamų sakadais, valdyme [11]. Ši struktūra yra dažnas tyrimų objektas, vertinant tinklainės neuronų siunčiamų signalų tolimesnį perdavimą. Svarbi anatominė savybė yra ta, kad VK paviršiniai sluoksniai nervinius impulsus iš tinklainės gauna tiesiogiai. Kitas svarbus tyrimams aspektas yra tas, kad VK lokalizuojasi galvos smegenų paviršiuje ir yra nesudėtingai prieinama tyrėjams [43]. Taip pat VK yra viena iš nedaugelio CNS vietų, kurioje yra didelis kiekis aferentinių ir eferentinių aksonų bei didelė cheminė įvairovė nervinių ląstelių, besiskiriančių savo tiek savo morfologiją, tiek ir neurotransmiteriais [1]. Lietuvoje VK yra tiriami pagrinde fiziologų [44,51-53], tačiau jų neatsiejama dalis yra ir neuronų morfologiniai tyrimai. Šis tyrimas yra LMT finansuojamo projekto Nr P-MIP-19-138 “Viršutinių kalnelių neuronų tinklo reikšmė greitai atpažįstant sudėtingus vaizdus” dalis. Žvelgiant į šios temos aktualumą tarptautiniu mastu, reikia paminėti, kad VK neuronų cheminiai fenotipai buvo pradėti tyrinėti jau net prieš 50 metų [40]. Tačiau nepaisant gausių mokslinių stebėjimų, vis dar nėra pakankamai žinomos fiziologinės ir anatominės VK neuronų savybės bei ryšiai su kitomis CNS struktūromis [45]. Šiais laikais, turint geresnes technines galimybes, leidžiančias įvertinti skirtingų neuronų grupių pasiskirstymą bei morfologines savybes, galima detaliau išnagrinėti ir geriau suprasti VK svarbą formuojant tiek instinktyvias, tiek aukštesniąsias pažintines funkcijas [10, 24]. Šio tyrimo metu buvo vertinamas RNR surišančio baltymo HUD, neuroninės azoto oksido sintazės (nNOS), parvalbumino (PV) bei somatostatino (SST) pasiskirstymas VK. Tiksliai žinant kuriuose VK sluoksniuose aptinkamos šios specifinio cheminio fenotipo nervinės ląstelės, galima tinkamai suplanuoti ir įvykdyti kitus tyrimus, kuriais būtų siekiama nustatyti VK neuronų ryšius su kitomis CNS struktūromis ir galimas tų ryšių funkcijas reikšmes.
9
8.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti viršutinių kalnelių neuronų cheminus fenotipus ir citoarchitektoniką. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti keturkalnio viršutinių kalnelių neuronų imunoreaktyvumą RNR surišančiom baltymui HuD, neuroninei azoto oksido sintazei (nNOS), parvalbuminui (PV) ir somatostatinui (SST).
2. Įvertinti skirtingo cheminio fenotipo neuronų pasiskirstymą viršutiniuose kalneliuose. 3. Ištirti skirtingo cheminio fenotipo neuronų kūnų formas ir dydžius.
10
9.
LITERATŪROS APŽVALGA
9.1
Viršutinių kalnelių anatomija ir fiziologija
Viršutiniai kalneliai (VK) yra vidurinių smegenų porinė struktūra, žinduolių smegenyse atliekanti požievinio regos centro vaidmenį. Jie lokalizuojasi už gumburo ir kartu su apatiniais kalneliais sudaro keturkalnį, dar vadinamą vidurinių smegenų stogu (lot. tectum) [1,33]. VK yra sudaryti iš septynių sluoksnių, kurie gali būtų išskiriami į dvi funkcines dalis, tai į paviršinę juntamąją (sensorinę) ir giliąją judimąją (motorinę) [2]. Į paviršinę dalį impulsai sklinda tiesiogiai iš tinklainės ir regos žievės, todėl ji yra laikoma sensorine [3, 4]. Šią dalį sudaro trys pirmi viršutiniai VK sluoksniai: juosiantysis sluoksnis (lot. stratum zonale), paviršinis pilkasis sluoksnis (lot. stratum griseum
superficiale) ir reginis sluoksnis (lot. stratum opticum). Giliosios dalies sluoksniuose esantys neuronai
kontroliuoja kūno atsaką į vaizdinį stimulą, perduodami signalus į judinamąjį aparatą (raumenis), todėl ši dalis vadinama motorine [4]. Ją sudaro likę keturi VK sluoksniai: tarpinis pilkasis sluoksnis (lot.
stratum griseum intermediale), tarpinis smegeninis sluoksnis (lot. stratum album intermediale), gilusis
pilkasis sluoksnis (lot. stratum griseum profundum) ir gilusis smegeninis sluoksnis (lot. stratum album
profundum) [1, 5]. Svarbu paminėti, jog motorinė dalis taip pat gauna tiesioginius jutiminius signalus
iš somatosensorinės bei klausos-pusiausvyros sistemų [1].
Nors žinduolių smegenyse gauti regos signalai apdorojami pagrinde smegenų žievėje [6], VK atlieka svarbų vaidmenį orientavimosi ir akių judesių mechanizmuose [3].
1 pav. Viršutinių kalnelių skersinis pjūvis. C.P. – centrinė pilkoji medžiaga, A.K.- apatinis kalnelis. Adaptuota pagal [50].
11 Daugiajutiminės (multisensorinės) informacijos integracija VK leidžia formuoti viso kūno reakciją į vaizdinius stimulus, su kuriais gresia susidurimas. Tai yra itin svarbi funkcija, užtikrinanti galimybę išvengti potencialiai pavojingo susidūrimo su kliūtimi [7, 8]. Regos, klausos bei somatosensoriniai signalai VK iššaukia atsakus, perduodamus smegenų kamieno ir nugaros smegenų motoriniams neuronams [9]. Motorinis atsakas, pasireiškia žvilgsnio, galvos ar kūno pasukimu link grėsmę keliančio vaizdinio ir sudaro sąlygas organizmui laiku sureaguoti, kad išvengtų susidūrimo. Puiki šios funkcijos iliustracija pateikta 2011 metų apžvalginiame straipsnyje. Įsivaizduokite beisbolo žaidėją, kuris metė kamuoliuką atmušėjui. Kamuoliukui atsitrenkus į lazdą ir dideliu greičiu lekiant atgal tiesiai į metiką, žaidėjas staigiai reaguodamas jį pagauna. Vaizdas atgal skrendančio kamuoliuko, garsas kilęs jam atsimušus nuo lazdos bei žaidėjo kūno pozicija siunčia atitinkamai vaizdinį, garsinį bei proprioreceptorinį stimulą į VK. Multisensorinių signalų perdavimas ir motorinio atsako suformavimas VK leidžia žaidėjui išvengti galimos traumos bei pagauti kamuoliuką. Šį gana refleksyviai atrodantį elgesį generuoja sudėtingi neuronų ryšiai VK [10]. Įdomu tai, kad VK geba ne tik aptikti objektus aplinkoje, bet ir įvertinti jų keliamą grėsmę. Jei objektas yra jau žinomas ir nepavojingas, tai kilęs sujaudinimas VK yra greitai nuslopinamas, į tai net neįsitraukiant regos žievei [11].
Dar viena itin svarbi ir daug nagrinėta VK funkcija yra dalyvavimas sakadinių akių judesių valdyme. Sakadiniai akių judesiai yra staigūs abiejų akių žvilgsnio nukreipimai nuo vieno objekto prie kito [11]. Vidutiniškai žmogus atlieka 2-3 sakadus per sekundę [12]. Tarp sakadų būna trumpi fiksacijos periodai, trunkantys apie 200–250 milisekundžių [13]. Jų metu akys išlieka stabilios ir yra įsisavinama nauja vaizdinė informacija [14]. Žmonės bei dalis gyvūnų nemato vaizdo fiksuoto kaip paveikslo, mūsų akys juda regos lauke, sutikdamos įdomius objektus ir iš jų suformuoja erdvinį “vaizdąlapį” [34]. Viena iš šių judesių priežasčių yra tai, kad žmonių akyse centrinė tinklainės dalis, vadinama centrine duobute (lot. fovea centralis), atsakinga už geriausią regėjimo aštrumą, yra labai maža, apimantis tik apie 1-2 regos laipsnius. Staigiais akių judesiais siekiama sufokusuoti atskirus nedidelius aplinkos fragmentus į šią duobutę, kad būtų galima suformuoti aiškų bendrą aplinkos vaizdą [14,35].
9.2
Viršutinių kalnelių neuronų ryšiai su kitomis CNS struktūromis
Neuronų grandinės jungiančios VK su kitomis centrinės nervų sistemos (CNS) struktūromis yra plačiai pasklidusios ir siekia tiek požievines, tiek žievines sritis [3]. Pagrindiniai aferentinių skaidulų į sensorinius VK sluoksnius šaltiniai yra ragenos, tos pačios pusės pirminė regos žievė bei aplink išsidėstę pakaušinės skilties žievės neuronai. Kiti aferentiniai signalai ateina iš apatinio šoninio
12 kelinio branduolio (angl. ventral lateral geniculate nucleus), priedvejinio branduolio (angl.
parabigeminal nucleus), už tarpinių smegenų pagalvio (lot. pulvinar), prieš VK esančio priešstogio
(lot. pretectum) ir melsvosios dėmės (lot. locus coeruleus) neuronų. Eferentinių skaidulų iš paviršinių VK sluoksnių projekcijos priklauso nuo neuronų lokalizacijos sensorinėje dalyje. Dorsaliau esančios nervinės ląstelės siunčia aksonus į šoninį kelinį branduolį (angl. lateral geniculate nucleus), o ventraliau išsidėstę neuronai, paviršinio pilkojo sluoksnio apatinėje dalyje bei reginiame sluoksnyje, savo aksonus projektuoja į pagalvį (lot. pulvinar). Priešingai nei negausūs aferentiniai ir eferentiniai keliai sensoriniuose sluoksniuose, motorinės VK dalies neuronai aksonus gauna faktiškai iš visų galvos smegenų ir kai kurių nugaros smegenų dalių. Tarpinių ir giliųjų VK sluoksnių neuronų eferentiniai aksonai keliauja į įvairius CNS branduolius ir žievę, leisdamiesi į tiltą ir nugaros smegenis arba kildami į daugumą gumburo ir galinių smegenų pamato branduolių bei žievę [1].
Įdomi požievinių neuronų grandinių sąsaja su emociniu vaizdinio stimulo įvertinimu [3]. VK ryšiai su galinių smegenų pamato branduoliais turi svarbią reikšmę motorinio atsako intensyvumui. Su beždžionėmis atliktame tyrime buvo nustatyta, kad aukštesnės vertės ir galimo maisto asociacija iššaukia didesnį VK neuronų aktyvumą, nei tie vaizdiniai stimulai, kurių galima maistinė vertė buvo menka [15]. Kitas, taip pat su beždžionėmis atliktas tyrimas, aprašė VK sąsajos su limbine sistema svarbą. Straipsnyje pateikiami anatominiai įrodymai, nurodantys VK motorinio sluoksnio neuronų aksonų projekcijas į šoninę migdolo dalį. Šios jungtys užtikrina greitą vaizdinės informacijos perdavimą į emocijas valdančias smegenų sritis bei galimybę jas moduliuoti [16].
9.3
Viršutinių kalnelių neuronų skirtingi cheminiai fenotipai
9.3.1 Neuronai, kurių sudėtyje yra HuD baltymasHu baltymai yra RNR surišančių baltymų šeima, kurie yra susiję su nervų sistemos formavimuisi. Trys šių baltymų tipai, HuB, HuC ir HuD, yra aptinkami nervinėse ląstelėse, o ketvirtasis - HuR, sintetinamas visuose audiniuose [38].
HuD yra svarbus neuronų vystymosi laikotarpiu, šio baltymo sintezė aktyvėja ląstelių diferenciacijos ir brandos metu. Tačiau, net ir pilnai susiformavusioje CNS, galima aptikti sričių, kuriose šio baltymo sintezė yra aktyvi visą gyvenimą. Pavyzdžiui, hipokampo neuronuose HuD kiekiai padidėja po įvairių mokymosi ir atminties lavinimo užduočių. Tai nurodo šio baltymo galimą sąsają su neuronų sinaptiniu plastiškumu [38]. Kita svarbi HuD funkcija yra dalyvavimas nervų regeneracijoje. Pavyzdžiui, suspaudus sėdimąjį nervą, HuD baltymo kiekis padidėję nugarinio mazgo sensoriniuose neuronuose ir toks išlieka apie 3 savaites [39].
13 9.3.2 Neuronai, kurių sudėtyje yra azoto oksido sintazė (NOS)
Azoto monoksidas (NO) yra svarbi signalinė molekulė, kuri dalyvauja įvairiuose organizmo fiziologiniuose bei patologiniuose procesuose. NO yra gaminamas azoto monoksido sintazės (NOS), turinčios tris skirtingas izoformas: neuroninė (nNOS, NOS I), indukcinė (iNOS, NOS II) ir endotelinė (eNOS, NOS III). Visos NOS izoformos NO gamybai naudoja L-argininą, molekulinį O2 ir NADPH. Pirmosios atrastos eNOS gaminamas NO dalyvauja kraujagyslių išsiplėtimo ir jų sienelių apsauginiuose mechanizmuose. Indukcinės NOS aktyvaciją skatina citokinai ar kiti uždegiminiai veiksniai ir jos sukurtos signalinės molekulės moduliuoja įvairius uždegiminius simptomus, pavyzdžiui kraujagyslių išsiplėtimą ir kraujospūdžio sumažėjimą sepsinio šoko metu. Neuroninę NOS galima aptikti tiek centrinėje (CNS), tiek periferinėje (PNS) nervų sistemose. Šio fermento susintetintas NO dalyvauja centriniame kraujospūdžio valdyme, o periferijoje veikia kaip atipinis neurotransmiteris, kuris tarpininkauja žarnyno peristaltikos, kraujagyslių išsiplėtimo bei varpos erekcijos mechanizmuose [17].
Nervų sistemoje NO veikia šiek tiek kitaip nei tipiniai neurotransmiteriai. Jis pasižymi savybę retrogradiškai paveikti priešsinapsinę terminalę, nes gali būti išskiriamas per posinapsinę membraną. Kitas svarbus NO požymis yra galimybė moduliuoti signalo perdavimą, veikiant smegenų sinapsinį plastiškumą [18].
Neuronų, savo kūnuose turinčių NOS, pasiskirstymas po nervų sistemą ir jų morfologinės savybės labai varijuoja [19]. Vertinant VK sluoskniuose NOS imunoreaktyvių (NOS-IR) nervinių ląstelių išsidėstymą, literatūroje randami prieštaringi duomenys. Dalis straipsnių skelbia, kad nitrerginiai neuronai yra matomi viršutiniuose, sensoriniuose sluoksniuose [19–21], kiti tyrėjai juos aptiko tarpiniuose ir apatiniuose motoriniuose VK sluoksniuose [22, 23]. Didžioji dalis NOS-IR ląstelių turi mažą kūną ir labiausiai tikėtina, jog yra įterptiniai neuronai. Tik nedidelė dalis šių neuronų turi vidutinį ar didelį kūną. Remiantis jų dydžiu, morfologija ir pasiskirstymu, ši populiacija galimai yra eferentiniai neuronai, kurių ataugos įeina keturkalnio – tinklinio darinio nugaros smegenų laidą (angl. tectoreticular spinal tract) [23].
9.3.3 Neuronai, kurių sudėtyje yra parvalbuminas
Parvalbuminas (PV) yra kalcio jonus surišantis baltymas, kuris yra randamas skeleto raumenyse ir smegenyse [36]. PV daugiausia veikia kaip mobilūs citozoliniai Ca2 + buferiai. Jie daro įtaką tarpląstelinių Ca2 + signalų trukmei ir atlieka pagrindinį vaidmenį raumenų atpalaidavime po susitraukimo ir neuronų atsistatymo po sujaudinimo [37]. Visose iki šiol tirtose smegenų žievės srityse taip pat ir hipokampe bei dryžuotame kūne, PV yra išskirtinai tik GABAerginiuose neuronuose.
14 Žievėje GABAerginiai neuronai skleidžia greitai plintančius signalus ir tiesiogiai slopina neurono kūną ir proksimalinius dendritus. Šios ląstelės atlieka svarbų vaidmenį slopinančiose žievinėse ir požievinėse neuronų mikrograndinėse [24]. PV-turinčių neuronų kontroliuojamų procesų pažeidimas yra susijęs tokiais sutrikimais kaip autizmas ir šizofrenija. Tai nurodo PV svarbą aukštesniųjų pažintinių funkcijų mechanizmuose [25–28].
Tyrime su pelėmis buvo nustatyta, kad VK PV-IR neuronai skiriasi nuo kitose smegenų vietose esančių tokių pat ląstelių. VK šie neuronai yra heterogeniški, apimantys ir GABAerginius slopinančius ir glutamaterginius sužadinančius neuronus [24]. Jaudinamasis šių ląstelių poveikis siekia priedvejinį branduolį, kuris toliau perduoda stimulą į migdolą. Šios grandinės aktyvacija iššaukia baimės jausmą, pasireiškiantį pabėgimo arba sustingimo reakcija [29]. PV-IR ląstelių pasiskirstymas VK yra nustatytas pagrinde viršutiniuose, sensoriniuose sluoksniuose [5, 24, 30, 31], nors nedideli kiekiai randami ir viduriniuose [5, 30, 32]. Taip pat vienas tyrimas parodė, kad PV-IR neuronai buvo nustatyti ir giliajame pilkajame sluoksnyje [30]. Nors PV-IR neuronų dydžiai labai varijuoja, didžioji jų dalis turi gana mažus kūnus. Šių ląstelių formos taip pat labai įvairios: apvalios arba ovalios, žvaigždinės, vertikalios verpstės formos ir horizontalios [5, 30].
9.3.4 Neuronai, kurių sudėtyje yra somatostatinas
Maždaug prieš 50 metų mokslininkai atrado nedidelį 14 amino rūgščių ilgio peptidą, kuris sugeba užslopinti augimo hormonų išsiskyrimą pogumburyje. Jis buvo pavadintas somatotropino išskyrimą slopinančiu faktoriumi (SISF) arba somatostatinu (SOM ar SST). Gana greitai buvo išsiaiškinta, kad šis peptidas yra plačiai paplitęs įvairiose CNS ir PNS srityse, taip pat virškinamajame trakte bei kasoje ir skydliaukėje. Vėliau buvo nustatyta, kad SOM sintezė vyksta ir placentoje, inkstuose, tinklainėje bei imuninėse ląstelėse. Bendroji SST funkcija yra įvairių biologiškai aktyvių medžiagų išskyrimo slopinimas, pavyzdžiui augimo hormono, insulino ar gastrino. Tačiau nervų sistemoje šis peptidas veikia ir kaip neurotransmiteris ar neuromoduliatorius ir lokalizuojasi pagrinde GABAerginiuose neuronuose. Somatostatinas gali veikti tiek priešsinaptinę, tiek ir posinaptinę membraną ir moduluoti sujaudinimą bei neuronų atsaką. Neuronai, kurių sudėtyje yra SST, atlieka svarbų vaidmenį įtakodami nervų sistemos aktyvumą ir plastiškumą [40].
Somatostatinui imunoreaktyvios (SOM-IR) nervinės ląstelės pirmiausia buvo priskiriamos tik paviršiniams juntamiesiems VK sluoksniams. Vėliau buvo nustatyta, kad tik du trečdaliai šių ląstelių lokalizuojasi paviršiniame pilkajame ir reginiame sluoksniuose. Kita dalis aptinkama tarpiniame ir giliajame pilkuosiuose sluoksniuose [41, 42]. Beveik visi SOM-IR neuronai yra maži, nors gilesniuose
15 sluoksniuose jų kūnai didesni nei paviršiniuose. Dauguma ląstelių orientuotos savo ilgaja ašimi paraleliai VK paviršiui (horizontaliai), kitos orientuotos įstrižai ar vertikaliai [42].
16
10. TYRIMO METODIKA
10.1 Tiriamojo gyvūno paruošimas ir tiriamosios medžiagos paėmimas
Tirta medžiaga priklauso LMT finansuojamam projektui Nr. P-MIP-19-138 "Viršutinių kalnelių neuronų tinklo reikšmė greitai atpažįstant sudėtingus vaizdus". Tyrimui panaudotos suaugusios Wistar veislės žiurkės. Jos buvo gautos iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos vivariumo. Gyvūnai buvo eutanazuoti su anglies dioksido dujomis, tuomet atliekama torakotomija ir per kairįjį širdies skilvelį įvesta perfuzinė sistema. Perfusijai naudotas fiziologinis natrio chlorido tirpalas 0,01 M fosfatiniame buferyje (PBS; pH 7,4). Išplovus kraują, per tą pačią infuzijos sistemą buvo atliekama trumpa audinių fiksacija 4% paraformaldehido (PFA; pH 7,4) tirpalu.
Paruošus gyvūną, žirklėmis ties kaklu buvo atidalinama galva. Galvos smegenys buvo atveriamos, šalinant kaukolės kaulus paeiliui nuo nosiakaulio iki pakauškaulio. Išėmus galvos smegenis, pirmiausia buvo pašalinamos smegenėlės. Tuomet skalpeliu nupjaunamos pakaušinės smegenų skiltys ir atlaisvinamas priėjimas prie keturkalnio. Stebint stereoskopiniu mikroskopu vidurines smegenis, jos buvo atidalinamos skalpeliu (2 pav.).
10.2 Viršutinių kalnelių paruošimas
Atskirtos vidurinės smegenys buvo fiksuojamos 60 min 4% paraformaldehido tirpale. Po fiksacijos audiniai buvo plaunami 3 kartus po 10 min PBS. Paruošta medžiaga buvo dedama į 25% sacharozės ir 0,05% PBS tirpalą ir 24 val. laikoma šaldytuve (4℃). Sekančią dieną vidurinės smegenys buvo perkeliamos į Petri lėkštelę su PBS tirpalu ir, naudojant stereo-mikroskopą, skalpeliu
17 atliekamas pjūvis tarp viršutinių ir apatinių kalnelių. Atidalinta viršutinė vidurinių smegenų dalis buvo toliau naudojama tyrime.
10.3 Mikropreparatų paruošimas su vibrotomu
Dalis tyrime naudotos medžiagos toliau buvo apdorojama su vibrotomu. Viršutiniai kalneliai buvo klijuojami cianoakrilato klijais ant vibrotomo (Compresstome VF-700, Precisionary Instruments Inc., JAV) stalelio. Jiems tvirtai prilipus ant viršaus buvo užliejamas 1,5% 40-42°C agarozės tirpalas, paruoštas prieš pat procedūrą. Tirpalui sustingus buvo atpjaunami 100 µm storio pjūviai. Pjūviai buvo perkeliami į 0,05% natrio azido PBS tirpalu užpildytus šulinėlius, kuriuose tiriamoji medžiaga buvo laikoma iki imunohistocheminių reakcijų.
10.4 Mikropreparatų paruošimas su kriomikrotomu
Kita tyrime naudotos medžiagos dalis toliau buvo ruošiama kriomikrotomu. Pirmiausia, paruošti viršutiniai kalneliai buvo užšaldomi skystame azote, naudojant šaldomąją audinių terpę (Triangle Biomedical Sciences, JAV). Užšaldyti viršutiniai kalneliai buvo supjaustomi 50 µm storio pjūviais, naudojant kriomikrotomą CryoStar NX70 (Thermo Fisher Scientific, JAV). Pjūviai buvo perkeliami ant Superfrost Plus mikroskopavimo stikliukų (Menzel Glaser, Vokietija).
10.5 Imunohistocheminių reakcijų atlikimas
Prieš atliekant imunohistochemines reakcijas, visi preparatai buvo skalaujami PBS 3 kartus po 10 min. Tuomet 1 val. laikomi 5% normalaus asilo serumo PBS tirpale, kad būtų išvengta nespecifinio antikūnių jungimosi. Vėliau tiriamoji medžiaga buvo vėl 3 kartus po 10 min plaunama PBS. Paruošti pjūviai buvo inkubuojami pirminių antikūnių tirpale (1 lentelė) 24 val. 4 °C temperatūroje. Praėjus parai, tiriamoji medžiaga pirmiausia buvo plaunama 3 kartus po 10 min PBS ir tuomet inkubuojama antrinių antikūnu tirpale (1 lentelė) 2 val. kambario temperatūroje. Po procedūros pjūviai vėl plaunami 3 kartu po 10 min PBS.
18
1 lentelė. Tyrime naudoti pirminiai ir antriniai antikūnai
Antigenas Kilmė Tipas Skiedimas Tiekėjas Katalogo nr.
Pirminiai
nNOS Pelė Monokloninis 1:1000 Santa Cruz
Biotechnologya
sc-5302
Parvalbumin Triušis Polikloninis 1:1000 Abcamb ab11427
Somatostatin Triušis Polikloninis 1:500 Invitrogenc PA5-82678
HuC/HuD Pelė Monokloninis 1:1000 Molecular probesd
A-21271
Antriniai
PelėAF488 Asilas Polikloninis 1:300 Invitrogen A21202
TriušisFITC Asilas Polikloninis 1:100 Chemicone AP182F
a Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Teksasas, JAV b Abcam, Cambridge, Jungtinė Karalystė
c Invitrogen, Ltd., Paisley, Jungtinė Karalystė d Molecular probes, Leiden, Netherlands
e Chemicon International, Temecula, Kalifornija, JAV
10.6 Preparatų mikroskopavimas ir vaizdų analizė
Paruošta tiriamoji medžiaga buvo vertinama ir analizuojama Axiolmager Z mikroskopu su skaitmenine AxioCamMRm kamera ir Zen Black SP1 2010 programine įrangą (Carl Zeiss, Vokietija).Nuotraukos buvo atliekamos naudojant 5x, 10x ir 20x objektyvus. Iliustracijų ryškumas buvo optimaliai koreguojamas Photoshop CS6 programa (Adobe Systems, San Jose, JAV).
19 Morfometriniai ląstelių duomenys vertinti ImageJ (National Institutes of Health, JK) programine įranga. Viršutinių kalnelių sluoksniams bei greta lokalizuotų struktūrų atpažinimui buvo vadovaujamasi stereotaksiniu žiurkės smegenų atlasu [49].
20
11. REZULTATAI
12.1. HuD-IR neuronų išsidėstymas viršutiniuose kalneliuose
Visuose tirtuose VK pjūviuose buvo stebimi HuD-IR neuronai. Mūsų tyrimai patvirtino, kad šis baltymas yra sintetinamas nervinėse ląstelės, kurios buvo išsidėščiusios visuose VK sluoksniuose, bei ir centrinės pilkosios medžiagos neuronuose (3 pav.).
3 pav. Viršutinių kalnelių skersinius pjūvis, kuriame matosi imunohistocheminės reakcijos su HuD-IR neuronais. Punktyrine linija apibrėžtas ir priartintas vaizdas su IR neuronais yra
iš reginio sluoksnio. Suptrumpinimai: JS- juosiantysis sluoksnis, PPS- paviršinis pilkasis sluoksnis, RS- reginis sluoksnis, TPS- tarpinis pilkasis sluoksnis, TSS- tarpinis smegeninis sluoksnis, GPS- gilusis pilkasis sluoksnis, GSS- gilusis smegeninis sluoksnis, CPM- centrinė
21
12.2 NOS-IR neuronų išsidėstymas viršutiniuose kalneliuose
Visuose tirtuose pjūviuose buvo stebimi ryškiai imunoreaktyvūs nNOS baltymui neuronų kūnai. Nitrerginiai neuronai buvo aptikti tiek paviršiniuose jutiminiuose, tiek giliuosiuose motoriniuose VK sluoksniuose (4 pav.). Gausus nNOS turinčių nervinių ląstelių pasiskirstymas stebimas paviršiniame pilkajame sluoksnyje. Šios ląstelės yra pagrinde ovalios, o jų ataugos driekiasi horizontaliai skersiniame pjūvyje (4 pav. A, B). Pavienės trikampės bei nedideli telkiniai apvalių imunoreaktyvių ląstelių buvo aptikti tarpininiame sluoksniuose (4pav C, D) Reginiame sluoksnyje taip pat nustatyti pavieniai NOS-IR neuronai. (4 pav. E) Giliajame pilkajame sluoksnyje buvo aptikta gana gausiai išsidėsčiusios nitrerinės nervinės ląstelės. Jų forma - pagrinde apvali (4 pav. F). Nitrinerginių ląstelių kūnai sensoriniuose ir motoriniuose VK sluoksniuose yra mažo ir vidutinio dydžio. Paviršiniame pilkajame bei reginiame sluoksniuose pamatuotų neuronų kūnų plotai varijuoja nuo 74.2 iki 139.6 µm2, vidurkis 105.2 ± 14.8 µm2. Tarpiniame pilkajame bei giliajame pilkajame sluoksniuose nustatytas imunoreaktyvių ląstelių kūnų plotai įvairuoja nuo 76.9 iki 168.5 µm2, vidurkis
117.7 ± 19.2 µm2 (2 lentelė).
12.3 PV-IR neuronų išsidėstymas viršutiniuose kalneliuose
PV-IR neuronai buvo aptikti paviršiniuose jutiminiuose bei tarpiniame pilkajame VK sluoksniuose (5 pav.). Gausiai PV turinčių nervinių ląstelių buvo pastebėta paviršiniame pilkajame ir reginiame sluoksniuose. Ląstelių formos pagrinde ovalios ir apvalios, ataugos driekėsi įvairiomis kryptimis (5 pav. A, B, C, D). Taip pat PV-IR neuronų sankaupos buvo gausios ir tarpiniame pilkajame sluoksnyje. Čia ląstelių forma įvairi, nes buvo tiek ovalių, tiek ir labai negausių trikampio formos neuronų (5 pav E, F). Giliausiuose motoriniuose sluoksniuose, giliajame pilkajame bei giliajame smegeniniame, šio fenotipo nervinių ląstelių nepastebėta. PV-IR ląstelių kūnų plotai tiek sensoriniuose, tiek motoriniuose sluoksniuose yra mažo ir vidutinio dydžio. Paviršiniame pilkajame bei reginiame sluoksniuose įvertintų neuronų kūnų plotai varijuoja nuo 72.8 iki 221.6 µm2, vidurkis
yra 116.9 ± 28.2 µm2. Tarpiniame pilkajame sluoksnyje nustatytas imunoreaktyvių ląstelių kūnų plotai įvairuoja nuo 84.9 iki 195.1 µm2, vidurkis 116.5 ± 25.2 µm2 (2 lentelė).
12.4 SST-IR neuronai
Tyrimo metu VK SST-IR neuronų nebuvo rasta. Kadangi literatūroje yra nurodyta, kad šis peptidas buvo aptiktas tiek paviršiniuose, tiek giliuosiuose VK sluoksniuose, galima įtarti klaidingai
22 neigiamas imunohistochemines reakcijas tyrimo metu. Šio fakto priežastys galėtų būti įvairios, tiek įsigytų antikūnų neefektyvumas, tiek ir imunohistocheminių reakcijų atlikimo metu padarytos techninės klaidos. Kadangi somatostatinas yra svarbus moduliuojant nervų sistemos aktyvumą ir plastiškumą, tolimesni tyrimai, vertinantys šių neuronų paplitimą vidurinėse smegenyse ir galimą jų funkciją, būtų labai vertingi ir pagelbėtų aiškiau suvokti šio cheminio fenotipo neuronų reikšmę keturkalnio neuronų fiziologijoje.
2 lentelė. nNOS ir PV imunoreaktyvių nervinių ląstelių kūnų dydis
Neurocheminis fenotipas Viršutinių kalnelių sluoksniai Vertintų ląstelių skaičius Plotas µm2 (vidurkis) Standartinė paklaida Mažiausias matmuo Didžiausias matmuo nNOS-IR Sensoriniai: paviršinis pilkasis sluoksnis ir reginis sluoksnis 50 105.2 14.7 74.2 139.6 Motoriniai: tarpinis pilkasis sluoksnis ir gilusis pilkasis sluoksnis 50 117.7 19.2 76.9 168.5 PV-IR Sensoriniai: paviršinis pilkasis sluoksnis ir reginis sluoksnis 50 116. 9 28.2 72.8 221.9 Motoriniai: tarpinis pilkasis sluoksnis 50 116.5 25.2 84.9 195.1
23
4 pav. Imunoreakatyvūs nNOS neuronai viršutinių kalnelių skersiniame pjūvyje. A,B- paviršinis pilkasis sluoksnis, C,D- tarpinis pilkasis sluoksnis, E- reginis sluoksnis, F- gilusis
pilkasis sluoksnis. Sutrumpinimai: JS- juosiantysis sluoksnis, PPS- paviršinis pilkasis sluoksnis, RS- reginis sluoksnis, TPS- tarpinis pilkasis sluoksnis, TSS- tarpinis smegeninis
sluoksnis, GPS- gilusis pilkasis sluoksnis, GSS- gilusis smegeninis sluoksnis, CPM- centrinė pilkoji medžiaga, SV- smegenų vandentiekis. Balta punktyrine linija apibrauktos
trikampės formos ląstelė, geltona – ovalios formos ląstelės, raudona- apvalios formos ląstelės. Rodyklės nurodo neuronų ataugų driekimosi kryptis.
A
B
C
D
E
F
B A C D E FA
B
C
D
E
AF
B C D24
5 pav. Imunochistocheminės reakcijos su PV viršutinių kalnelių skersiniame pjūvyje. A, B- paviršinis pilkasis sluoksnis, C,D - reginis sluoksnis, E,F- tarpinis pilkasis sluoksnis. Sutrumpinimai: JS- juosiantysis sluoksnis, PPS- paviršinis pilkasis sluoksnis, RS- reginis sluoksnis, TPS- tarpinis pilkasis sluoksnis, TSS- tarpinis smegeninis sluoksnis, GPS- gilusis
pilkasis sluoksnis, GSS- gilusis smegeninis sluoksnis, CPM- centrinė pilkoji medžiaga, SV- smegenų vandentiekis.Balta punktyrine linija apibrauktos trikampės formos ląstelė,
geltona – ovalios formos ląstelės, raudona- apvalios formos ląstelės.
A
B
C
D
A B C D F EE
F
25
12. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiuo tyrimu buvo siekiama nustatyti ar viršutinių kalnelių neuronai savo sudėtyje turi RNR surišančio baltymo HuD, nitrinerginės azoto oksido sintazės (nNOS), parvalbumino (PV) ir somatostatino (SST) bei, kuriuose VK sluoksniuose šių cheminių fenotipų ląstelės yra išplit. HuD baltymas yra svarbus nervų sistemos brandai ir plastiškumui, o jo sintezė vyksta nervinėse ląstelėse [38]. Mūsų tyrimo rezultatai atitiko literatūroje aprašyta informaciją, kad HuD-IR neuronai lokalizuojasi visuose VK sluoksniuose taip pat ir centrinės pilkosios medžiagos neuronuose.
NO yra svarbi signalinė molekulė, kurios funkciją ir pasiskirstymą centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje aktyviai tiria tiek užsienio [17-23], tiek ir Lietuvos mokslininkai [46-48]. Analizuojant šios cheminės medžiagos turinčius VK neuronus, buvo patvirtinti anksčiau literatūroje paskelbti stebėjimai [19-23]. Mūsų tyrimais buvo patvirtintas nNOS turinčių neuronų paplitimas tiek paviršiniuose sensoriniuose, tiek giliuosiuose motoriniuose VK sluoksniuose. nNOS-IR ląstelių forma bei ataugų šakotumas yra kintantis. Paviršiniame pilkajame sluoksnyje šios ląstelės yra pagrinde ovalios ir jų ataugos nusidriekia lygiagrečiai VK paviršiui. Gilesniuose sluoksniuose buvo stebimi ir apvalios bei trikampio formos nNOS-IR neuronų kūnai. Imunoreaktyvių ląstelių kūnų dydžiai tiek paviršiniuose tiek giliuosiuose VK sluoksniuose yra maži ir vidutinio dydžio. Sensoriniuose sluoksniuose IR neuronų kūnų plotai varijuoja nuo 74.2 iki 139.6 µm2, vidurkis 105.2 ± 14.7 µm2. Motoriniuose sluoksniuose IR ląstelių kūnų plotai įvairuoja nuo 76.9 iki 168.5 µm2, vidurkis 117.7± 19.2 µm2.
Trečioji substancija, tirta mūsų tyrime, parvalbuminas yra labai svarbi, nes manoma, kad ji yra aptinkama išimtinai tik GABAerginiuose neuronuose, kurie yra susijęs su slopinančiais mechanizmais žievėje bei požievinėse nervinių ląstelių grandinėse [24]. Šiuo tyrimu gauti stebėjimai dalinai atitinka kitų autorių pranešimus [5, 24, 30-32], PV-IR neuronų kūnai buvo aptikti paviršiniuose sensoriniuose sluoksniuose bei tarpiniame pilkajame sluoksnyje. Visgi mes nustatėme, kad prieštaringai nei ankstesniame tyrime, PV-IR nervinės ląstelės nėra išsidėstę giliajame pilkajame sluoksnyje [30]. Ląstelių kūnai pagrinde ovalios ir apvalios formos, tačiau negausiai trikampio formos neuronų kūnų buvo aptikta reginiame bei tarpiniame pilkajame sluoksniuose. Tyrimo metu nustatyti imunoreaktyvių neuronų kūnų plotai yra nedideli. Sensoriniuose sluoksniuose IR neuronų kūnų plotai varijuoja nuo 72.8 iki 221.9 µm2, vidurkis yra 116.9 ± 28.2 µm2. Motoriniuose sluoksniuose IR ląstelių kūnų plotai įvairuoja nuo 84.9 iki 195.1 µm2, vidurkis 116.5 ± 25.2 µm2.
Ketvirtasis mūsų ieškotas nervinių ląstelių fenotipas, sintezuojantis somatostatiną, mūsų tyrime nebuvo rastas. Somatostatinas dalyvauja CNS plastiškumo ir aktyvavimo mechanizmuose [40]. Remiantis literatūra, galima numanyti, kad žiurkių VK somatostatiną sintezuojančių nervinių ląstelių turėtų būti. Todėl darome prielaidą, kad SST ląstelių nesuradimas galėjo būti dėl nesėkmingai
26 įvykusios imunocheminės reakcijos ar dėl komerciškai įsigytų nekokybiškų antikūnų prieš šį antigeną. Manytume, kad tolimesni tyrimai, vertinantys SST pasiskirstymą žiurkių VK, padėtų geriau suprasti šio peptide vaidmenį nervinių signalų moduliavime.
Šio tyrimo metu nustatyti duomenys gali būti naudingi tolimesniuose fiziologiniuose tyrimuose. Tiksliai žinant, kokio cheminio fenotipo neuronai aptinkami VK bei kuriuose sluoksniuose jie lokalizuojasi, įvairiais būdais, įskaitant optogenetinį, galima aktyvuoti ar slopinti atskiras neuronų populiacijas ir taip nustatyti jų įtaką VK funkcijose. Šiuo metu Lietuvoje atliekamas LMT finansuojamas projektas Nr P-MIP-19-138 “Viršutinių kalnelių neuronų tinklo reikšmė greitai atpažįstant sudėtingus vaizdus” vertina VK indėlį greitai apdorojant regos siunčiamus signalus. Šio tikslo realizavimui, tyrimui reikalingi išsamūs morfologiniai VK duomenys, įskaitant ir skirtingų cheminių fenotipų neuronų išsidėstymą VK.
27
13. IŠVADOS
1. Keturkalnio viršutiniuose kalneliuose aptinkami neuronai, kurių sudėtyje yra HuD, nNOS ir PV.
2. HuD-IR ląstelės paplitusios visuose VK sluoksniuose, nNOS-IR - paviršiniame pilkajame, reginiame, tarpiniame ir giliajame pilkajame VK sluoksniuose, o PV-IR - paviršiniame pilkajame, reginiame ir tarpiniame VK sluoksniuose.
3. PV-IR ir nNOS-IR neuronų kūnai, paplitę tiek sensoriniuose, tiek ir motoriniuose VK sluoksniuose, yra mažo ir vidutinio dydžio.
28
14. LITERATŪRA
1. Basso MA, May PJ. Circuits for Action and Cognition: A View from the Superior Colliculus. Annu Rev Vis Sci. 2017; 3:197–226.
2. Wolf AB, Lintz MJ, Costabile JD, Thompson JA, Stubblefield EA, Felsen G. An integrative role for the superior colliculus in selecting targets for movements. J Neurophysiol. 2015; 114:2118–2131. 3. Krauzlis RJ, Lovejoy LP, Zénon A. Superior colliculus and visual spatial attention. Annu Rev Neurosci. 2013; 36:165–182.
4. May PJ. The mammalian superior colliculus: Laminar structure and connections. Prog Brain Res. 2006; 151:321–378.
5. Jeong SJ, Kim HH, Lee WS, Jeon CJ. Immunocytochemical localization of Calbindin D28K, Calretinin, and parvalbumin in bat superior colliculus. Acta Histochem Cytochem. 2014; 47:113–123. 6. Leopold DA. Primary visual cortex: Awareness and blindsight. Annu Rev Neurosci. 2012; 35:91– 109.
7. Zurita H, Rock C, Perkins J, Apicella AJ. A Layer-specific Corticofugal Input to the Mouse Superior Colliculus. Cereb Cortex. 2018; 28:2817–2833.
8. Comoli E, Favaro PDN, Vautrelle N, Leriche M, Overton PG, Redgrave P. Segregated anatomical input to sub-regions of the rodent superior colliculus associated with approach and defense. Front Neuroanat. 2012; 6:1–19.
9. Wang L, McAlonan K, Goldstein S, Gerfen CR, Krauzlis RJ. A causal role for mouse superior colliculus in visual perceptual decision-making. bioRxiv. 2019; 40:3768–3782.
10. Gandhi NJ, Katnani HA. Motor functions of the superior colliculus. Annu Rev Neurosci. 2011; 34:205–231.
11. Lee KH, Tran A, Turan Z, Meister M. The sifting of visual information in the superior colliculus. Elife. 2020; 9:1–23.
12. Dandekar S, Ding J, Privitera C, Carney T, Klein SA. The Fixation and Saccade P3. PLoS One. 2012; 7:1–14.
13. Sereno SC, Rayner K. Measuring word recognition in reading: Eye movements and event-related potentials. Trends Cogn Sci. 2003; 7:489–493.
14. Provis J, Dubis A, Maddess T, Carroll J. Adaptation of the central retina for high acuity vision: Cones, the fovea and the avascular zone. Progress in Retinal and Eye Research. 2013;35:63-81.
15. Griggs WS, Amita H, Gopal A, Hikosaka O. Visual neurons in the superior colliculus discriminate many objects by their historical values. Front Neurosci. 2018; 12:1–15.
16. Elorette C, Forcelli PA, Saunders RC, Malkova L. Colocalization of tectal inputs with amygdala-projecting neurons in the macaque pulvinar. Front Neural Circuits. 2018; 12:1–12.
29 17. Förstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: Regulation and function. Eur Heart J. 2012; 33:829–837.
18. Garthwaite J. NO as a multimodal transmitter in the brain: discovery and current status. Br J Pharmacol. 2019; 176:197–211.
19. Chong PS, Poon CH, Fung ML, Guan L, Steinbusch HWM, Chan YS, Lim WL, Lim LW. Distribution of neuronal nitric oxide synthase immunoreactivity in adult male Sprague-Dawley rat brain. Acta Histochem. 2019; 121:151437.
20. Batista CMC, De Paula KC, Cavalcante LA, Mendez-Otero R. Subcellular localization of neuronal nitric oxide synthase in the superficial gray layer of the rat superior colliculus. Neurosci Res. 2001; 41:67–70.
21. Soares-Mota M, Henze I, Mendez-Otero R. Nitric oxide synthase-positive neurons in the rat superior colliculus: Colocalization of NOS with NMDAR1 glutamate receptor, GABA, and parvalbumin. J Neurosci Res. 2001; 64:501–507.
22. Scheiner C, Arceneaux R, Guido W, Kratz K, Mize R. Nitric oxide synthase distribution in the cat superior colliculus and co-localization with choline acetyltransferase. J Chem Neuroanat. 2000; 18:147–159.
23. Fuentes-Santamaria V, Alvarado JC, Stein BE, McHaffie JG. Cortex contacts both output neurons and nitrergic interneurons in the superior colliculus: Direct and indirect routes for multisensory integration. Cereb Cortex. 2008; 18:1640–1652.
24. Villalobos CA, Wu Q, Lee PH, May PJ, Basso MA. Parvalbumin and GABA microcircuits in the mouse superior colliculus. Front Neural Circuits. 2018; 12:1–16.
25. Lewis DA, Curley AA, Glausier JR, Volk DW. Cortical parvalbumin interneurons and cognitive dysfunction in schizophrenia. Trends Neurosci. 2012; 35:57–67.
26. Wöhr M, Orduz D, Gregory P, et al. Lack of parvalbumin in mice leads to behavioral deficits relevant to all human autism core symptoms and related neural morphofunctional abnormalities. Transl Psychiatry. 2015; 5:e525.
27. Hashemi E, Ariza J, Rogers H, Noctor SC, Martínez-Cerdeño V. The Number of Parvalbumin-Expressing Interneurons Is Decreased in the Medial Prefrontal Cortex in Autism. Cereb Cortex. 2017; 27:1931–1943.
28. Chatterjee, Nimrat Walker G. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis HHS Public Access. Physiol Behav. 2017; 176:139–148.
29. Shang C, Liu Z, Chen Z, Shi Y, Wang Q, Liu S, Li D, Cao P. A parvalbumin-positive excitatory visual pathway to trigger fear responses in mice. Science. 2015; (80- ) 348:1472–1477.
30 30. Lee JY, Jeong SJ, Jeon CJ. Parvalbumin-immunoreactive cells in the superior colliculus in dog: Distribution, colocalization with GABA, and effect of monocular enucleation. Zoolog Sci. 2014; 31:748–757.
31. Byun H, Kwon S, Ahn HJ, Liu H, Forrest D, Demb JB, Kim IJ. Molecular features distinguish ten neuronal types in the mouse superficial superior colliculus. J Comp Neurol. 2016; 524:2300–2321. 32. Baldwin MKL, Krubitzer L. Architectonic characteristics of the visual thalamus and superior colliculus in titi monkeys. J Comp Neurol. 2018; 526:1760–1776.
33. Haines D, Mihailoff G. Fundamental Neuroscience for Basic and Clinical Applications. 5th ed. 2018. p. 183-194, 286-305.
34. Peddie J. Augmented Reality: Where We Will All Live. 2017. p. 187.
35. Aagten-Murphy D, Bays PM. Functions of Memory Across Saccadic Eye Movements. Curr Top Behav Neurosci. 2019; 41:155-183.
36. Gebhart G, Schmidt R. Encyclopedia of Pain. 2nd ed. 2013. p.2818-2819.
37. 13. Cates M, Teodoro M, Phillips G. Molecular Mechanisms of Calcium and Magnesium Binding to Parvalbumin. Biophysical Journal. 2002;82:1133-1146.
38. Perrone-Bizzozero N. Role of HuD in nervous system function and pathology. Frontiers in Bioscience. 2019; S5:554-563.
39. Anderson KD, Merhege MA, Morin M, Bolognani F, Perrone-Bizzozero NI. Increased expression and localization of the RNA-binding protein HuD and GAP-43 mRNA to cytoplasmic granules in DRG neurons during nerve regeneration. Exp Neurol. 2003; 183:100–108.
40. Liguz-Lecznar M, Urban-Ciecko J, Kossut M. Somatostatin and somatostatin-containing neurons in shaping neuronal activity and plasticity. Front Neural Circuits. 2016; 10:1–15.
41. Harvey AR, Heavens RP, Yellachich LA, Sirinathsinghji DJS. Expression of messenger RNAs for glutamic acid decarboxylase, preprotachykinin, cholecystokinin, somatostatin, proenkephalin and neuropeptide Y in the adult rat superior colliculus. Neuroscience. 2001; 103:443–455.
42. Laemle, L. and Feldman, S. Somatostatin (SRIF)-like immunoreactivity in subcortical and cortical visual centers of the rat. The Journal of Comparative Neurology. 1985; 233(4), pp.452-462.
43. Oliveira A, Yonehara K. The Mouse Superior Colliculus as a Model System for Investigating Cell Type-Based Mechanisms of Visual Motor Transformation. Frontiers in Neural Circuits. 2018; doi: 10.3389/fncir.2018.00059.
44. Baranauskas G. Limited Spatial Spread Explains the Dependence of Visual Response Adaptation on Stimulus Size in Rat Superior Colliculus Neurons. Neuroscience. 2020; 451:60-78.
45. Farrow K, Isa T, Luksch H, Yonehara K. Editorial: The Superior Colliculus/Tectum: Cell Types, Circuits, Computations, Behaviors. Frontiers in Neural Circuits. 2019;13.
31 46. Navickaite I, Pauziene N, Pauza D. Anatomical evidence of non‐parasympathetic cardiac nitrergic nerve fibres in rat. Journal of Anatomy. 2020; 238:20-35.
47. Inokaitis H, Pauziene N, Rysevaite-Kyguoliene K, Pauza D. Innervation of sinoatrial nodal cells in the rabbit. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 2016; 205:113-121.
48. Pauziene N, Alaburda P, Rysevaite-Kyguoliene K, Pauza A, Inokaitis H, Masaityte A, Rudokaite G, Saburkina I, Plisiene J, Pauza D. Innervation of the rabbit cardiac ventricles. Journal of Anatomy. 2015; 228:26-46.
49. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 1st ed. Amsterdam: Academic Press/Elsevier; 2007.
50. Wurtz R, Albano J. Visual-Motor Function of the Primate Superior Colliculus. Annual Review of Neuroscience. 1980;3(1):189-226.
51. Bytautiene J, Baranauskas G. Rat superior colliculus neurons respond to large visual stimuli flashed outside the classical receptive field. PLOS ONE. 2017;12:e0174409.
52. Bytautiene J, Baranauskas G. Experimentally derived model shows that adaptation acts as a powerful spatiotemporal filter of visual responses in the rat collicular neurons. Scientific Reports. 2018;8.
53. Baranauskas G, Svirskis G, Tkatch T. Spatial synchronization of visual stimulus-evoked gamma frequency oscillations in the rat superior colliculus. NeuroReport. 2016;27:203-208.
