KONEKSINO 36 PLYŠINIŲ JUNGČIŲ VALDYMAS LIPOFILINIAIS JUNGINIAIS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Alina Marandykina

KONEKSINO 36 PLYŠINIŲ JUNGČIŲ VALDYMAS LIPOFILINIAIS JUNGINIAIS

IR VIDULĄSTELINIO MAGNIO JONAIS

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

biologija (01B)

Kaunas, 2013

Disertacija rengta 2008–2012 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos institute.

Mokslinis vadovas

prof. dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lietuvos sveikatos mokslų universite- tas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)

Konsultantas

prof. habil. dr. Feliksas Bukauskas (Alberto Einšteino medicinos koledžas,

Ješivos universitetas (JAV), biomedicinos mokslai, biofizika – 02B)

3

TURINYS

SANTRUMPOS ... 5

ĮVADAS ... 8

MOKSLINIO DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS ... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1. Plyšinių jungčių bendrosios charakteristikos ... 13

1.1.1. Plyšines jungtis formuojantys koneksinai. Koneksinų genų nomenklatūra ... 13

1.1.2. Plyšinių jungčių struktūra ... 14

1.1.3. Plyšinių jungčių gyvavimo ciklas ... 17

1.2. Svarbiausios plyšinių jungčių funkcijos ... 18

1.2.1. Koneksinų 36, 45 ir 47 paplitimas organizme, jų raiška skirtinguose audiniuose bei specializuota funkcija ... 19

1.2.1.1. Plyšinės jungtys centrinėje nervų sistemoje ... 20

1.2.1.1.1. Centrinės nervų sistemos patologijos ir koneksinai ... 23

1.2.1.2. Plyšinės jungtys širdyje ... 23

1.2.1.2.1. Širdies koneksinų funkcijų tyrimai in vivo ... 25

1.2.1.2.2. Koneksinai ir širdies patologijos ... 26

1.2.1.3. Plyšinės jungtys kraujagyslių sistemoje ... 27

1.2.1.3.1. Kraujagyslių sistemos koneksinų funkcijų tyrimai in vivo ... 27

1.2.1.3.2. Kraujagyslių ligos ir koneksinai ... 28

1.2.1.4. Plyšinės jungtys sekrecijos sistemoje – β-β ląstelių elektrinis ryšys ... 29

1.3. Plyšinių jungčių reguliacija – biocheminė ir biofizikinė pusės ... 31

1.3.1. Plyšinių jungčių farmakologija ... 31

1.3.1.1. Alkoholiai ... 33

1.3.1.2. Riebalų rūgštys ... 34

1.3.1.3. Lakūs anestetikai ... 34

1.3.1.4. Antimaliariniai vaistai ... 35

1.3.1.5. Arilaminobenzoatai ... 36

1.3.1.6. Vandenilis ir viduląstelinis pH. Molekuliniai veikimo mechanizmai ... 37

1.3.1.7. Magnio jonų įtaka ... 39

1.3.2. Plyšinių jungčių reguliacija jungties įtampa ... 40

1.3.2.1. Du plyšinių jungčių reguliavimo jungties įtampa mechanizmai – ,,greitasis“ ir ,,lėtasis“ ... 41

1.3.2.2. „Greitųjų“ ir „lėtųjų“ vartų atsidarymo-užsidarymo mechanizmo esminiai veiksniai molekuliniame lygmenyje ... 43

1.3.2.3. Plyšinių jungčių vartų imitaciniai modeliai ... 47

1.4. Pagrindinių anestetikų jungimosi vietos jonų kanaluose ir sąsajos su plyšinėmis jungtimis ... 49

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 52

2.1. Ląstelių linijos ir kultivavimo sąlygos ... 52

2.2. Kasos β ląstelių išskyrimas ir kultivavimas ... 52

2.3. Elektrofiziologinis registravimas ... 53

2.4. Fluorescencinis vaizdinimas ... 54

2.5. Cheminių medžiagų paruošimas ir pritaikymas ... 54

2.5.1. Jaučio serumo albumino cheminė modifikacija ... 55

2.6. Koneksino 36 mutantų konstravimas ... 56

4

2.7. Duomenų apdorojimas ir statistinė analizė ... 58

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 59

3.1. Koneksinų 36 ir 47 plyšinių jungčių elektrinio laidumo bei vartų atsidarymo- užsidarymo reguliacija lipofilinėmis medžiagomis ir dvivalenčiais jonais ... 59

3.1.1. Koneksino 36 plyšinių jungčių funkcinis efektyvumas ... 59

3.1.2. Plyšinių jungčių vartų atsidarymo-užsidarymo reguliacija alkoholiais ... 60

3.1.3. Plyšinių jungčių vartų atsidarymo-užsidarymo reguliacija jaučio serumo albuminu ... 64

3.1.4. Viduląstelinės arachidono rūgšties koncentracijos reguliavimas ... 66

3.1.5. Nuo arachidono rūgšties priklausomo koneksino 36 plyšinių jungčių blokavimo reguliacija naudojant heksanolį ... 69

3.1.6. Jaučio serumo albumino ir alkoholių poveikis kasos β ląstelėse ... 71

3.1.7. Koneksinų izoformų jautrumo jaučio serumo albuminui ir alkoholiams skirtumai ... 72

3.1.8. pH įtaka alkoholių 36 plyšinių jungčių laidumą reguliuojančiam poveikiui ... 73

3.1.9. Koneksino 36 plyšinių jungčių elektrinio laidumo ir vartų atsidarymo- užsidarymo reguliacija viduląstelinio magnio jonais ... 75

3.1.10. Koneksino 47 plyšinių jungčių elektrinio laidumo ir vartų atsidarymo- užsidarymo reguliacija viduląstelinio magnio jonais ... 79

3.1.11. Viduląstelinio magnio jonų poveikis vienetiniams koneksino 47 kanalams ... 81

3.2. Plyšinių jungčių domenų, atsakingų už pagrindinių anestetikų prisijungimą, nustatymas ... 82

3.2.1. Koneksinų 36, 45 ir 47 cisteinų ir histidinų modifikacija ... 82

3.2.2. Koneksino 36 cisteinų, esančių TM2, TM4 ir CL srityse, funkcinė analizė ... 84

3.2.2.1. Koneksino 36 modeliavimas ir mutantų konstravimas... 84

3.2.2.2. Cisteinų vaidmuo pagrindiniais anestetikais reguliuojant koneksino 36 plyšinių jungčių elektrinį laidumą ... 88

3.2.2.3. Cisteinų vaidmuo jungties įtampa reguliuojant koneksino 36 plyšinių jungčių vartus ... 93

4. APIBENDRINIMAS ... 98

4.1. Koneksinų 36, 45 ir 47 plyšinių jungčių reguliacija lipofilinėmis medžiagomis, magnio jonais ir jungties įtampa ... 98

4.2. Struktūrinių koneksino 36 domenų, svarbių pagrindinių anestetikų prisijungimui, paieška ... 102

IŠVADOS ... 108

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 110

MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS ... 132

PRIEDAI ... 136

PADĖKA ... 146

5 SANTRUMPOS

ACh – acetilcholinas

AChR – acetilcholino receptorius

AH – parametras, charakterizuojantis puskanalio

(„greitųjų“ vartų) atsidarymo tikimybės (Po,H) statumo pokyčius, priklausomai nuo VH; parametras naudojamas S4SM modelyje

AF and AS – parametrai, charakterizuojantys „greitųjų“ ir ,,lėtųjų“ vartų atsidarymo tikimybių statumo pokyčius, priklausomai nuo įtampos; parametrai naudojami S16SM modelyje

aHC – plyšinės jungties puskanalis

αMHC promoter – α miozino sunkiosios grandinės promotorius AR – arachidono rūgštis

BAPTA – 1,2-bis(o-aminofenoksi)etano-N,N,N',N'-tetraacto rūgštis CB1 – kanabinoidų receptorius 1

CHD – 1,2-cikloheksandionas

Cn – alkoholių grandinę sudarančių anglies atomų skaičius CNS – centrinė nervų sistema

cPLA2 – citozolinė fosfolipazė A2

Cre recombinase – fermentas, katalizuojantis rekombinaciją tarp dviejų loxP vietų

cSrc – citoplazminė tirozino kinazė Cx – koneksinas, Cxs – koneksinai del – DNR sekos iškrita

DMSO – dimetilsulfoksidas EC – endotelio ląstelės

EC50 – koncentracija, reikalinga sukelti pusę maksimalaus stimuliuojamojo poveikio

EGFP – žaliai fluorescuojantis baltymas EDTA – etilendiamino tetraacto rūgštis EGTA – etilenglikolio tetraacto rūgštis

ERK2, ERK5 – ląstelės išorės signalo aktyvuota kinazė 2 ir 5 ET – endoplazminis tinklas

FBS – jaučio vaisiaus serumas

Fγ – vienetinio kanalo fluorescencija FJP – fluorescencija, tenkanti ploto vienetui FT – bendras fluorescencijos intensyvumas

GABAA – gama aminosviesto rūgšties A (GABA-A ) receptorius GIRK1-2 – G baltymo aktyvinami heteromeriniai kalio kanalai gj – plyšinių jungčių elektrinis laidumas

gj,ss – nusistovėjęs plyšinių jungčių elektrinis laidumas GlyR – glicino receptorius

γF,open ir γS,open – ,,greitųjų“ ir ,,lėtųjų“ vartų atviros būsenos laidumai;

parametrai naudojami S16SM modelyje

γF,res ir γS,closed – ,,greitųjų“ ir ,,lėtųjų“ vartų liekamųjų (uždarytų) būsenų laidumai; parametrai naudojami S16SM modelyje γopen – atviros būsenos vienetinio kanalo laidumas γres – vienetinio kanalo liekamasis laidumas

6

γres,H – puskanalio (,,greitųjų“ vartų) liekamosios būsenos

laidumas; parametras naudojamas S4SM modelyje γo,H – puskanalio (,,greitųjų“ vartų) atviros būsenos laidumas;

parametras naudojamas S4SM modelyje

HEPES – 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfoninė rūgštis 5-HT3R – 5-hidroksitriptamino (serotonino) receptorius 3A IC50 – koncentracija, reikalinga sukelti pusę maksimalaus

blokuojamojo poveikio Ij – jungties srovė

JSA – jaučio serumo albuminas

JSA-CHD – jaučio serumo albuminas, modifikuotas 1,2- cikloheksandionu

K – plyšinių jungčių funkcinis efektyvumas

kDa – kilodaltonas

KI mouse – įveiklinta pagal atitinkamą geną pelė KO mouse – išveiklinta pagal atitinkama geną pelė

LCCA – ilgą anglies atomų grandinę turintys alkoholiai

(ilgesni nei C6–7)

LDLR – mažo tankio lipobaltymų receptorius

LoxP sekos – specifinės 34 bp DNR sekos, kurias sudaro: 8 bp šerdinė seka (ties kuria vyksta rekombinacija), kurią supa dvi invertuotos 13 bp pasikartojančios sekos

MAFF – metilarachidonilfluorofosfonatas

[Mg²⁺]i – viduląstelinio magnio laisvųjų jonų koncentracija [Mg²⁺]p – laisvųjų magnio jonų koncentracija elektrodų pipečių

vidiniame tirpale

mGluR – metabotropinis glutamato receptorius MKR – modifikuotas Krebs-Ringer buferinis tirpalas MLC2v promoter – miozino lengvosios grandinės 2v promotorius MTSEA – 2-aminoetil metantiosulfonato hidrobromidas

NBS – N-bromosukcinimidas

NF – funkcinių kanalų skaičius No – atidarytų kanalų skaičius

NT – bendras plyšinių jungčių (kanalų) skaičius PGR – polimerazės grandininė reakcija

PJ – plyšinės jungtys

pLGIC – ligandais valdomų pentamerinių jonų kanalų šeima Po – atidarytos būsenos plyšinės jungties tikimybė (visi keturi vartai atidaryti); parametras naudojamas S16SM

modelyje

Po,H – puskanalio (,,greitųjų“ vartų) atsidarymo tikimybė;

parametras naudojamas S4SM modelyje

PoF,α ir PoF,β – α ir β puskanalių ,,greitųjų“ vartų atsidarymo tikimybės;

parametrai naudojami S16SM modelyje

PoS,α ir PoS,β – α ir β puskanalių ,,lėtųjų“ vartų atsidarymo tikimybės;

parametrai naudojami S16SM modelyje PUFA – polinesočiosios riebalų rūgštys

SCCA – trumpą anglies atomų grandinę turintys alkoholiai S4SM – stochastinis keturių būsenų modelis

7

S16SM – stochastinis šešiolikos būsenų modelis

TEA – trietanolaminas

VF,o and VS,o – ,,greitųjų“ ir ,,lėtųjų“ vartų įtampa, prie kurios jų atsidarymo tikimybės lygios 0,5; parametrai naudojami

S16SM modelyje

Vo,H – įtampa, tenkanti plyšinių jungčių puskanaliui

(,,greitiesiems“ vartams) prie kurios jo atsidarymo tikimybė (Po,H) yra 0,5; parametras naudojamas S4SM modelyje Vj – jungties įtampa

Vm – transmembraninis potencialas VSMC – kraujagyslių lygiojo raumens ląstelės

8

ĮVADAS

Plyšinės jungtys (PJ) yra dvylikos subvienetų oligomerinės struktūros, kurias, susijungiant gretimoms ląstelėms, formuoja du puskanaliai, sudaryti iš šešių koneksino (Cx) subvienetų. Atsižvelgiant į PJ puskanalių subvienetų sandarą, išskiriamos homotipinės (kanalą sudaro du puskanaliai sudaryti iš to paties Cx tipo) ir heterotipinės (kanalą sudaro du puskanaliai, sudaryti iš skirtingų Cxs) PJ. Tuo tarpu puskanaliai gali būti homomeriniai ir heteromeriniai, t.y. sudaryti iš daugiau nei vieno tipo Cx [1].

PJ užtikrina elektrinį ir metabolinį ryšį tarp daugumos bestuburių ir stuburinių organizmų audinių ląstelių. PJ elektrinis ryšys yra būtinas tokiems gyvybiškai svarbiems biologiniams procesams kaip sinapsinio signalo perdavimo pagreitinimas, sinchronizuoto elektrinio ir mechaninio atsako koordinavimas, raumenų ląstelių funkcionavimas, embriono vystymasis, morfogenezė, ląstelių diferenciacija, suaugusių ląstelių proliferacijos ir migracijos kontrolė bei sekrecija normaliomis ir patologinėmis sąlygomis [2]. PJ metabolinis ryšys užtikrina mažų jonų, aminorūgščių, metabolitų, cAMF, IP

, 5-HT, siRNR, miRNR ir mažų peptido molekulių pernašą per kanalo pórą, kurią reguliuoja jungties įtampa (V

) [3].

Kaip ir daugelio kitų membraninių jonų kanalų atveju, erdvinės PJ struktūros identifikacija yra sudėtinga ir apima kompleksinius elektroninės mikroskopijos, rentgeno spindulių difrakcijos, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopijos ir atominės jėgos mikroskopijos metodus [4].

Nauji (2009 m.) PJ struktūros rentgeno spindulių kristalografijos tyrimai leido išaiškinti Cx26 erdvinę struktūrą, o tai savo ruožtu leido geriau suprasti PJ vartų reguliacijos (atsidarymą-užsidarymą) jungties įtampa ir cheminiais junginiais procesus [5]. Prof. F. Bukausko vadovaujamos laboratorijos mokslininkai (Ješivos Universiteto Alberto Einšteino medicinos koledžas, Neuromokslų katedra, Niujorkas, JAV) pirmą kartą parodė, kad PJ valdo jungties įtampai (V

) jautrūs „greitieji“ ir ,,lėtieji“

vartai [6, 7]. „Greitųjų“ vartų mechanizmas sąlygoja greitą atidaryto kanalo būsenos perėjimą liekamosios būsenos link (< 1–2 ms), tuo tarpu „lėtųjų“

vartų mechanizmas pilnai uždaro kanalą – vyksta lėtas atidaryto kanalo arba

jo liekamosios būsenos perėjimas link pilnai uždarytos kanalo būsenos (> 10

ms). Taip pat PJ yra reguliuojamos vandenilio jonais (H

), dvivalenčiais

katijonais (Ca

, Mg

ir pan.), dėka potransliacinių modifikacijų bei plačiu

cheminių junginių spektru [1]. PJ vartų savybės yra vienos sudėtingiausių,

todėl analizuojant jų valdymą įtampa ir cheminiais junginiais naudojami

stochastiniai keturių ir šešiolikos būsenų modeliai (S4SM ir S16SM) [8, 9].

9

PJ reguliacija atsidarant arba užsidarant kanalams yra svarbi esant normalioms ir patologinėms sąlygoms. Cxs yra vieni iš farmakologinių taikinių gydant drebulį, epilepsiją, širdies aritmiją, vėžį ir insultą [10–14].

Pavyzdžiui, parodyta, kad PJ blokavimas širdies išemijos metu yra vienas iš veiksnių, sukeliančių aritmijos atsiradimą [15, 16], tuo tarpu elektrinio ryšio pagerinimas naudojant antiaritminius peptidus (pavyzdžiui, GAP-134) didina širdies laidumo greitį bei sumažina aritmijos riziką [17]. PJ elektrinio ryšio padidėjimas slopina vėžio vystymąsi [18]. Epilepsijos atveju PJ blokavimas turi antikonvulsinį poveikį [19, 20]. PJ elektrinio ryšio sustiprinimas sergant II tipo cukriniu diabetu pagerina insulino sekreciją [21, 22]. Tokiu būdu cheminių junginių praktinis pritaikymas leidžia tirti PJ fiziologinę svarbą bei kanalų struktūros funkcinę reikšmę ir kurti naujus vaistus.

Šiame darbe tyrėme cheminių junginių ir magnio jonų įtaką PJ, sudarytoms iš Cx36, Cx45 ir Cx47. Šie Cxs yra svarbūs CNS (Cx36, Cx45 ir Cx47), sekrecijos (Cx36 ir Cx45), širdies ir kraujagyslių sistemoms (Cx45). Moksliniuose tyrimuose ne kartą buvo parodyta Cx36 svarba užtikrinant CNS ir sekrecijos sistemų funkcijas [23–28], todėl yra svarbu nustatyti šio Cx reguliavimo mechanizmus normos ir patologijos sąlygomis.

Eksperimentiškai įvertinome savitą Cx36 PJ reguliaciją alkoholiais.

Dažnai moksliniuose darbuose alkoholiai yra skirstomi į trumpagrandžius (metanolis-heksanolis) ir ilgagrandžius (heptanolis ir ilgesni) [29, 30].

Heptanolis yra tarpinis tarp trumpagrandžių ir ilgagrandžių alkoholių.

Priešingai nei kitiems Cxs, trumpagrandžiai alkoholiai (iki heptanolio) sukelia Cx36 PJ elektrinio laidumo padidėjimą, tuo tarpu ilgesni alkoholiai (oktanolis-dekanolis) blokuoja elektrinį ryšį. Taip pat alkoholiai veikia Cx36 PJ vartų reguliaciją jungties įtampa bei funkcinių kanalų skaičių. Dėl šios priežasties nuodugniau analizavome Cx36 vartų reguliacijos mechanizmą naudojant trumpagrandžius alkoholius. Taip pat tyrėme kito lipofilinio junginio, arachidono rūgšties (AR), poveikį Cx36 ir parodėme jaučio serumo albumino (JSA) ir AR tarpusavio sąveikos įtaką Cx36 PJ laidumui. Bandėme išsiaiškinti, ar trumpagrandžiai alkoholiai galėtų antagonizuoti AR elektrinio ryšio slopinimo mechanizmą. Vykdytiems tyrimams pasirinkome modelinę HeLa ląstelių liniją, taip pat aukščiau aprašyti tyrimai buvo pakartoti pelės kasos Langerhanso salelių β ląstelėse.

Mūsų tyrimai apibūdino Cx36 PJ kanalų būklę ramybės sąlygomis, atskleidė naują Cx36 reguliavimo būdą in vivo bei leido geriau suprasti insulino sekrecijos reguliavimą β ląstelėse.

Lygiagrečiai įvertinome viduląstelinio magnio jonų ([Mg

]

) įtaką Cx36

ir Cx47 PJ reguliacijai. Žinoma, kad išemijos (širdies ir smegenų),

hipoksijos, epilepsinių priepuolių metu ir esant šizofrenijai stipriai didėja

10

[Mg

]

koncentracija bei mažėja ATF lygis [31–34], tačiau ūminio miokardo infarkto, širdies nepakankamumo, Parkinsono ir Alzheimerio ligų atvejais – [Mg

]

mažėja [35–37]. Smegenų traumos metu [Mg

]

koncentracija taip pat sumažėja ~ 50 % ir išlieka keletą dienų [38–40]. Visi aukščiau apibendrinti [Mg

]

pokyčiai yra pakankami, kad veiksmingai moduliuotų PJ laidumą. Šiame etape įvertinome [Mg

]

poveikį Cx36 ir Cx47 elektriniam ryšiui ir vartų atsidarymo-užsidarymo procesui bei sąsajas su normos ir patologijos sąlygomis.

Paskutinis tyrimų etapas buvo įvertinti galimą(as) pagrindinių anestetikų

prisijungimo kišenę(es) Cx36 baltyme. Lyginant su pentameriniais ligandais

valdomais kanalais (pLGIC), vis daugiau randama įrodymų apie PJ kanalų

transmembraninių domenų (TM) vaidmenį formuojant alkoholių

prisijungimo kišenę(es). Tokiu būdu, atsižvelgdami į Cx36 išskirtinę

reguliaciją alkoholiais ir izofluranu, palyginus su kitais Cxs, ir unikalių

cisteinų buvimą TM2 ir TM4 (cisteinas iš dalies unikalus) domenuose,

iškėlėme hipotezę, kad TM domenai galėtų formuoti pagrindinių anestetikų

prisijungimo kišenę(es). Iki šiol sukaupta daug duomenų apie PJ elektrinio

ryšio reguliaciją pagrindiniais anestetikais (įskaitant lakiuosius anestetikus

(izofluraną) ir alkoholius). Daugumoje atvejų izofluranas ir alkoholiai yra

laikomi klasikiniais PJ blokatoriais. Todėl šiame darbe, specifiškai

apkeičiant TM domenų ir viduląstelinės CL kilpos cisteinus kitomis

aminorūgštimis, įvertinome Cx36 PJ elektrinio ryšio ir vartų atsidarymo-

užsidarymo proceso pokyčius bei sąsajas su galima(omis) alkoholių

prisijungimo kišene(ėmis). Gauti duomenys glaudžiais siejasi su kitų autorių

duomenimis [41–48], aprašančiais įtampa ir ligandais valdomų

pentamerinių kanalų reguliaciją pagrindiniais anestetikais bei jų

prisijungimo vietas. Taigi gauti rezultatai turi potencialiai svarbią reikšmę,

kaip vienas pirmųjų tyrimų, bandant identifikuoti PJ alkoholių ir izoflurano

prisijungimo vietas, kadangi iki šiol mūsų turimomis žiniomis panašūs

tyrimai nebuvo publikuoti. Turint omenyje ypatingą alkoholių poveikį CNS,

gauti alkoholių prisijungimo vietų Cxs paieškos rezultatai leis geriau

suprasti alkoholių kompleksinio poveikio mechanizmą, įskaitant poveikį

kitiems CNS membraniniams jonų kanalams.

11

MOKSLINIO DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas

Lipofilinių medžiagų ir viduląstelinio magnio jonų poveikio koneksino 36 plyšinių jungčių elektriniam laidumui ir vartų valdymo mechanizmui bei galimų prisijungimo vietų tyrimas.

Darbo uždaviniai

1. Ištirti trumpagrandžių (pentanolio-heptanolio) ir ilgagrandžių (oktanolio- dekanolio) alkoholių poveikį Cx36 plyšinių jungčių laidumui, funkciniam efektyvumui ir valdymo įtampa mechanizmui.

2. Ištirti jaučio serumo albumino ir endogeninės arachidono rūgšties įtaką Cx36 plyšinių jungčių elektrinėms savybėms.

3. Palyginti arachidono rūgšties ir trumpagrandžių alkoholių poveikį Cx30.2, Cx36, Cx43, Cx45 ir Cx47 plyšinių jungčių elektrinėms savybėms.

4. Palyginti alkoholių ir jaučio serumo albumino poveikį HeLa ląstelių ir pelės kasos β ląstelių Cx36 plyšinių jungčių elektrinėms savybėms.

5. Įvertinti viduląstelinio pH įtaką alkoholių poveikiui Cx36 plyšinių jungčių elektriniam laidumui.

6. Ištirti viduląstelinio magnio jonų įtaką Cx36 ir Cx47 plyšinių jungčių elektrinėms savybėms.

7. Sumodeliuoti Cx36 erdvinę struktūrą ir jos pagrindu sukonstruoti Cx36- EGFP mutantus, apkeičiant 87, 92, 168 ir 264 pozicijų cisteinus kitomis aminorūgštimis, bei ištirti jų elektrines savybes ir jautrumą cheminėms medžiagoms (alkoholiams, izofluranui, flufenamino rūgščiai ir meflokinui).

12

DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS

Šiame darbe pirmą kartą parodome, kad, skirtingai nei kitų Cxs, alkoholiai reguliuoja Cx36 PJ elektrinį laidumą priklausomai nuo jų anglies atomų grandinės ilgio – trumpagrandžiai (C

–C

) stimuliuoja elektrinį ryšį, o ilgagrandžiai (C

–C

) – blokuoja. Taip pat nustatėme, kad heksanolio stimuliuojantis poveikis Cx36 PJ laidumui gali būti susijęs su blokuojančio endogeninės AR poveikio pašalinimu. Papildomai įvertinome ir kitų Cx36 PJ elektrinio ryšio aktyvatorių – JSA ir MAFF vaidmenį bei jų sąsajas su AR. Galiausiai parodėme, kad pastebėta Cx36 reguliacija HeLa kultūroje yra tokia pati pelės kasos Langerhanso salelių β ląstelėse natyviai gaminančiose Cx36. Šie naujai aprašyti Cx36 PJ reguliavimo mechanizmai yra ypač svarbūs, nes Cx36 reguliuoja insulino sekreciją kasoje [23–25], sinchronizuoja neuronus ir koordinuoja CNS aktyvumą [49].

Taip pat šio darbo metu gauti rezultatai pagilina žinias apie [Mg

]

vaidmenį, reguliuojant PJ laidumą. Iki šiol yra ganėtinai mažai darbų, aprašančių magnio jonų įtaką PJ, kuriuose nebuvo tiriamas [Mg

]

veikimo mechanizmas [50–55]. Šiame darbe parodėme, kad HeLa ląstelėse [Mg

]

koncentracijos pokyčiai yra labai svarbūs Cx36 ir Cx47 PJ elektrinio laidumo reguliacijai. Taip pat nustatėme [Mg

]

poveikį kanalo atsidarymo tikimybei ir funkcinių kanalų skaičiui. Šis naujas mechanizmas gali prisidėti prie neuroninės sinchronizacijos sąlygų, kurių metu keičiasi ATF lygis ir [Mg

]

koncentracija.

Tęsiant trumpagrandžių alkoholių prisijungimo prie PJ tyrimus

įvertinome unikalių cisteinų, esančių mCx36 baltymo sekos TM2 domene ir

iš dalies unikalaus cisteino, esančio TM4 domene, svarbą. Mūsų žiniomis,

duomenų apie galimas prisijungimo vietas PJ visiškai nėra. Taigi šiame

darbe pirma kartą parodome, kad TM2 ir TM4 domenai su juose esančiais

cisteinais yra svarbūs trumpagrandžių alkoholių ir izoflurano prisijungimui,

tuo tarpu TM2 domenas ir CL kilpa galėtų būti potencialiais struktūriniais

elementais, svarbiais formuojant ilgagrandžių alkoholių prisijungimo

kišenę(es). Taip pat TM2 ir TM4 domenų cisteinai yra svarbūs Cx36 vartų

atsidarymui-užsidarymui. Gauti duomenys pirmą kartą aprašo galimą(as)

alkoholių ir izoflurano prisijungimo kišenę(es) Cxs kanaluose, bei yra

postūmis detaliau aiškinantis tikslias alkoholių prisijungimo vietas.

13

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Plyšinių jungčių bendrosios charakteristikos

1.1.1. Plyšines jungtis formuojantys koneksinai. Koneksinų genų nomenklatūra

Plyšinės jungtys (PJ) yra sudėtingos, kanalus formuojančios, struktūros.

Jos funkcionuoja kaip kanalai, formuojantys PJ sankaupas (angl. plaques) ar membranos puskanaliai (angl. unapposed hemichannels) ir sąveikauja su kitais signaliniais baltymais. PJ formuoja dauguma gyvūnų ir žmogaus ląstelių, todėl jos yra labai svarbios daugeliui biologinių procesų [56, 57]. PJ šeimą sudaro trys stambios grupės: ineksinai (angl. innexins, Inx), paneksinai (angl. pannexins, Panx) ir koneksinai (angl. connexins, Cx).

Ineksinai yra panašios struktūros ir membranos topologijos kaip ir koneksinai, tuo tarpu paneksinai (iki šiol aprašytos trys izoformos – Panx1 (47,6 kDa), Panx2 (69,5 kDa) ir Panx3 (44,7 kDa)) pasižymi tik 20 % homologija su pirmine ineksinų seka. Paneksinai neformuoja tarpląstelinių kanalų, nes išorinės kilpos glikozilinimas neleidžia jungtis dviems puskanaliams [58].

Cxs pelės ir žmogaus genomuose yra apjungti į atitinkamai 20 ir 21 izoformų šeimą ir vadinami CxN, kur N nurodo jų molekulinę masę (išreikštą kDa) [58]. Cxs nomenklatūra skirstoma į dvi dalis: a) pagal Cxs molekulinę masę ir b) pagal Cxs sekos citoplazminio domeno panašumą ir ilgį klasifikuojant į α, β, γ, δ ir ε pogrupius (1.1.1.1 pav.) [59].

1.1.1.1 pav. Žmogaus koneksinai

Kiekvienas Cx yra koduojamas skirtingo geno. Cxs filogenetinis medis rodo, kad jie yra padalinti į penkis α, β, γ, δ ir ε pogrupius. Modifikuota pagal [13].

14

Pelės ir žmogaus organizmuose devyniolikai skirtingų Cxs priskiriami jų ortologai, tačiau žmogaus genome neaptinkami pelės Cx33, o pelės genome – žmogaus Cx25 ir Cx59 transkribuojamų genų ortologai. Daugelis žmogaus ir pelės Cxs ortologų pasižymi labai homologiška geno seka [60].

1.1.2. Plyšinių jungčių struktūra

Plyšinės jungties puskanalį (koneksoną) formuoja šeši Cx subvienetai, kiekvieną jų sudaro keturi  spiraliniai transmembraniniai domenai (TM1–

TM4), dvi išorinės kilpos (EL1 ir EL2), viduląstelinė kilpa (CL) bei viduląsteliniai NT ir CT galai (1.1.2.1 pav.) [61]. TM1–TM4 hidrofobiniai domenai paprastai yra 20–28 aminorūgščių ilgio, topologiškai išsidėstę nuo NT iki CT galo. EL1 ir EL2 išorinės kilpos (EL1 jungia TM1 ir TM2, o EL2 – TM3 ir TM4 domenus) turi po 3 cisteinus (C) ir kartu su TM domenais yra konservatyviausi regionai tarp Cxs [4]. Hidrofilinė viduląstelinė kilpa (CL), jungianti TM2 ir TM3 domenus, yra citoplazminėje ląstelės pusėje.

1.1.2.1 pav. Koneksinų ir puskanalių struktūra

Cxs topologija apima keturis TM domenus, dvi išorines kilpas (EL1–EL2), vieną citoplazminę kilpą (CL) bei viduląstelinius NT ir CT galus. Šeši Cx subvienetai formuoja puskanalį su vidine póra. Ramybės sąlygomis puskanaliai paprastai yra uždaryti, bet jų konformacija gali kisti priklausomai nuo fiziologinių ir patologinių sąlygų. Modifikuota pagal [61].

15

A B

Labiausiai variabilūs (pagal baltymo sekos ilgį bei pačią seką) Cx regionai – CT galas bei CL kilpa [2]. Antra išorinė kilpa EL2 yra atsakinga už selektyvumą jungiantis dviems puskanaliams, ypatingai sudarant heterotipines jungtis [62]. Biocheminiai tyrimai parodė, kad Cx išorinių kilpų cisteinai dalyvauja formuojantis vidumolekulinėms, bet ne tarpmolekulinėms disulfidinėms jungtims, sujungiant EL1 ir EL2 kilpas [63]. Šių cisteinų mutavimas į alaninus sutrikdo PJ formavimąsi ir jų funkciją [64].

Remiantis 2009 m. išaiškinta Cx26 kristaline struktūra ([5]; 1.1.2.2 pav.), puskanalio Cx subvienetų tarpusavio sąveika apima išorines TM2 ir TM4 domenų dalis. Dviejų puskanalių susidūrimas formuoja PJ. Puskanaliai gali būti sudaryti iš vieno tipo Cx – homomeriniai arba iš skirtingų Cxs – heteromeriniai. Atsižvelgiant į puskanalius gali susidaryti dviejų tipų PJ:

homotipinės (kai kiekvieną puskanalį sudaro ta pati Cx izoforma) ir heterotipinės (kiekvieną iš puskanalių sudaro skirtingos Cx izoformos) (1.1.2.3 pav.) [3].

1.1.2.2 pav. Koneksino 26 struktūra

(A) Kanalo struktūra iš šono su erdviniais atstumais tarp atitinkamų kanalo vietų. Abiejų puskanalių Cxs subvienetai pavaizduoti tomis pačiomis spalvomis. (B) Kanalo struktūra iš viršaus, vaizduojanti transmembraninių domenų (TM1–TM2) išsidėstymą. Kanalo póros vidinis skersmuo yra 35 Å iš citoplazmos pusės, o siauriausias skersmuo yra 14 Å.

Modifikuota pagal [5].

Cx26 kristalinėje struktūroje buvo įvertintos besiformuojančios sąveikos

tarp dviejų puskanalių, dalyvaujant Cxs EL1 ir EL2 kilpoms. Pirmo

puskanalio Cx subvieneto EL1 kilpos N54 formuoja vandenilines jungtis su

L56, esančiu antro puskanalio priešais išsidėsčiusio Cx subvieneto EL1

16

kilpoje; EL1 Q57 formuoja simetrines vandenilines jungtis su Q57, esančiu kito puskanalio įstrižai išsidėsčiusio Cx subvieneto EL1. Cxs N54, L56 ir Q57 aminorūgštys yra labai konservatyvios. Pirmo puskanalio EL2 kilpos K168, N176, T177 ir D179 formuoja vandenilinius ryšius ir druskos tiltelius su kito puskanalio priešais išsidėsčiusio Cx subvieneto EL2 kilpos aminorūgštimis [5]. Aprašytos sąveikos kartu su sąveikomis tarp puskanalio Cx subvienetų palaiko tamprią struktūra, stabilizuojančią tarpą tarp dviejų ląstelių ir saugančią kanalo vidų nuo išorinės aplinkos.

1.1.2.3 pav. Puskanalių ir plyšinių jungčių tipai

Modifikuota pagal [65].

PJ struktūrai nustatyti naudojami šie metodai: elektroninė mikroskopija, rentgeno spindulių difrakcija (angl. X-ray diffraction), branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija (BMRS) ir atominės jėgos mikroskopija (AJM) [4].

Nemažai duomenų apie PJ topografiją įvairiuose ląstelių tipuose ir audiniuose gauta taikant AJM metodą. Stebint Cx26 PJ plokšteles buvo gautos aukštos skiriamosios gebos nuotraukos, nustatant konformacinius PJ puskanalių pokyčius veikiant Ca

(1.1.2.4 pav., A ir B). Nuotraukoje pavaizduoti pavieniai atviri (nėra Ca

) ir uždaryti (0,5 mM Ca

) kanalai [66].

Fiksuoto lūžio elektronų mikroskopijos taikymas (angl. freeze-fracture

immunogold labeling) žymint Cxs aukso dalelėmis leido pagerinti

skiriamąją gebą, įvairiuose audiniuose identifikuojant PJ plokšteles. 1.1.2.4

paveikslo C dalyje pavaizduota oligodendrocitų Cx32 PJ plokštelė, kurią

sudaro ~ 1280 kanalų, pažymėtų 30-čia aukso dalelių (juodi taškai) [67].

17

1.1.2.4 pav. Plyšinių jungčių ir jų plokštelių struktūros vertinimo ir vaizdinimo analizei taikomi metodai

(A–B) Nuo kalcio priklausomų Cx26 PJ konformacinių pokyčių vaizdinimas naudojant atominės jėgos mikroskopą. Natyvaus Cx26 PJ plokštelės išorinio paviršiaus topografinės nuotraukos buvo gautos naudojant buferinį tirpalą be Ca²⁺ (A) ir esant 0,5 mM Ca²⁺ (B).

Cx26 puskanalio póros išorinės dalies skersmuo žymiai susiaurėja esant Ca²⁺ (B); A ir B skalė – 250 Å. (C) Fiksuoto lūžio elektronų mikroskopijos nuotrauka vaizduojanti oligodendrocitų Cx32 PJ plokštelę. Kiekvienas mažas taškas nuotraukoje atitinka vieną kanalą (didesni juodi taškai – aukso daleles). Skalė – 0,1 µm. Modifikuota pagal [66, 67].

1.1.3. Plyšinių jungčių gyvavimo ciklas

Cxs pasižymi labai trumpa, tik keleto valandų gyvavimo trukme, t.y., jie pastoviai gaminami ir degraduojami (nuo 1 iki 5 h in vivo [68] ir in vitro [69]).

Cxs įsiterpia į endoplazminį tinklą (ET) dalyvaujant translokonui kotransliacijos metu (išimtis Cx26, kuris gali įsiterpti į endoplazminį tinklą po užbaigtos transliacijos arba kotransliacijos metu, taip pat gali tiesiogiai įsiterpti į ląstelės plazminę membraną) [70]. Cxs oligomerizacijos stadija vyksta ET (išimtis – Cx43 ir Cx46, kurie Goldžio komplekse yra monomerinėje formoje, bet oligomerizuojasi trans-Goldžio tinkle) [71].

Prieš išeinant iš ET, taisyklingai sulankstyti puskanaliai ar Cxs pereina per ET-Goldžio tarpinį kompartmentą (angl. endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment, ERGIC) po to pasiekia cys-Goldžio tinklą. Po Goldžio komplekso puskanaliai per plazmines vezikules pasiekia plazminę membraną [72]. Tačiau yra duomenų, rodančių, kad egzistuoja nuo Goldžio komplekso nepriklausomas patekimo prie membranos kelias, dalyvaujant mikrotubulėms [73]. Puskanaliui įsiterpus į plazminę membraną, pastarasis gali laisvai difunduoti lipidų bisluoksnyje, formuoti PJ su gretimos ląstelės puskanaliais (dalyvaujant N- ir E-kadherinams) bei jungtis į PJ plokšteles (angl. plaques) (1.1.3.1 pav.).

A B C

18

1.1.3.1 pav. Plyšinių jungčių formavimasis ir degradacija

Paprastai Cxs į ET yra įterpiami kotransliacijos metu. Formuojantis puskanaliams ET vyksta Cxs oligomerizacija, tačiau kai kurių Cxs oligomerizacija atidedama, kol jie praeina ET-Goldžio tarpinį kompartmentą ir pasiekia nutolusį trans Goldžio tinklą. Pleomorfinės vezikulės ir pernašoje dalyvaujančios molekulės transportuoja puskanalį iki plazminės membranos; šiame procese gali dalyvauti mikrotubulės. Po įsiterpimo į plazminę membraną puskanaliai jungiasi su gretimos ląstelės puskanaliais, formuojantis PJ ir jų plokštelėms. Po tam tikro funkcijos atlikimo laiko PJ yra degraduojamos inicijuojant atsiskyrimą nuo membranos formuojantis žiedinėms PJ. Vėliau PJ gali būti degraduotos trimis skirtingais būdais: proteosominu, lizosominiu arba autofagosominiu. Modifikuota pagal [74].

Manoma, kad PJ degradacija prasideda joms atsiskiriant nuo plazminės membranos (angl. internalization). Prasidėjus atsiskyrimui, tolesnė Cxs degradacija siejasi su lizosominiais, proteosominiais bei naujai atrastu autofagosominiu mechanizmais [75].

1.2. Svarbiausios plyšinių jungčių funkcijos

Manoma, kad pagrindinė Cxs ir Inxs PJ funkcija – tarpląstelinio ryšio

palaikymas. Tuo pačiu sudaroma galimybė vienpusiam ir abipusiam srovę

pernešančių, citozolinių ir kitų membranai nelaidžių jonų apsikeitimui, o tai

yra labai svarbu sužadinamųjų audinių ląstelių (neuronų, širdies, lygiųjų

raumenų ląstelių ir pan.) funkcijai atlikti [1, 3].

19

Tinkamas PJ funkcijos vykdymas yra svarbus daugeliui fiziologinių procesų – embriono vystymuisi, morfogenezei, ląstelių diferenciacijai, suaugusių ląstelių proliferacijos ir migracijos kontrolei, raumenų ląstelių funkcionavimui, hormonais kontroliuojamo signalo perdavimui, sinapsinio signalo perdavimo pagreitinimui, sinchronizuoto elektrinio ir mechaninio atsako koordinavimui, atsparumui citotoksinėms medžiagoms, fermentų defektų kompensavimui, degraduotų molekulių pernašai, sekrecijai normaliomis ir patologinėmis sąlygomis. Išvardintuose procesuose iš dalies dalyvauja visi Cxs, tačiau kai kuriuose procesuose dalyvauja tik tam tikri, specifiniai Cxs [13, 25, 76–85].

PJ svarba in vivo pademonstruota sukūrus įvairių fenotipų (išveiklinus (angl. knock-out) arba įveklinus geną (angl. knock-in), įvedus Cxs taškines mutacijas ir apkeitus Cxs izoformas) transgenines peles, tokiu būdu pašalinus, padidinus arba sumažinus Cxs raišką arba įvedus naują Cx izoformą. Taip pat pademonstruota daug Cxs mutacijų sukeltų ligų [86, 87].

PJ netiesiogiai gali būti reguliuojamos: neurotransmiteriais (noradrenalinu, dopaminu, serotoninu ir glutamatu), citokinais, augimo veiksniais ir kitomis biologiškai aktyviomis molekulėmis (pavyzdžiui, LPA;

angl. lysophosphatic acid). Pastarosios biomolekulės aktyvina įvairias kinazes (PKG (nuo cGMP-priklausomą baltymų kinazę), PKA (nuo cAMP- priklausomą baltymų kinazę), PKC (baltymų kinazę C), CK1 (kazeino kinazę 1), ERK1 (išorinio signalo reguliuojamą kinazę 1), ERK2, ERK5 ir c-Src), kurios gali žymiai padidinti Cxs fosforinimo lygį, o tai lemia kanalo atsidarymą arba užsidarymą [88].

Tiesiogiai PJ yra reguliuojamos jungties įtampa (V

), dvivalenčiais katijonais (Ca

, Mg

ir pan.), pH pokyčiais ir įvairiomis cheminėmis medžiagomis [1]. Plačiau apie tiesioginę PJ reguliaciją yra kalbama poskyryje „1.3. Plyšinių jungčių reguliacija – biocheminė ir biofizikinė pusės“.

1.2.1. Koneksinų 36, 45 ir 47 paplitimas organizme, jų raiška skirtinguose audiniuose bei specializuota funkcija

Iki šiol parodyta, kad bestuburių ir stuburinių organizmų daugelio skirtingų audinių tipų ląstelės turi PJ, išskyrus raudonuosius kraujo kūnelius, spermatozoidus bei griaučių raumenis [64].

Atsižvelgiant į detalesnę Cx36, Cx45 ir Cx47 analizę, aprašytą

disertacijoje, apačioje pateikta šių Cxs funkcijų diferencijuota apžvalga

nervų, širdies ir kraujagyslių bei sekrecijos sistemose. Taip pat, dėl

audiniams specifinių Cxs tipų raiškos skirtumų, kai kuriais atvejais yra

pateikiama informacija ir apie kitus pelės ir žmogaus organų Cxs.

20

1.2.1.1. Plyšinės jungtys centrinėje nervų sistemoje

PJ, suformuotos iš Cx36, Cx45 bei Cx47 yra aptinkamos centrinės nervų sistemos (CNS) ląstelėse: astrocituose, oligodendrocituose, mikroglijoje, neuronuose bei neuroninėse kamieninėse ląstelėse [76, 89–93] (detaliau žiūrėti 1.2.1.1.1 lentelę). Palyginimui taip pat pateikiama kitų Cxs raiškos informacija nervinėse ląstelėse.

1.2.1.1.1 lentelė. Periferinės ir centrinės nervų sistemų įvairių koneksinų raiškos profilis skirtinguose ląstelių tipuose

Ląstelių tipai Cx 26

Cx 29

Cx 30

Cx 30.2

Cx 32

Cx 33

Cx 36

Cx 37

Cx 40

Cx 43

Cx 45

Cx 46

Cx 47

Astrocitai      

Oligodendrocitai    

Mikroglija   

Neuronai          

Švano ląstelės  

Neuroninės kamieninės

ląstelės        

 – raiška aptinkama, tuščias langelis – raiška neaptikta, pilka spalva – disertaciniame darbe detaliau aptariami Cxs. Modifikuota pagal [76, 89–93].

Yra duomenų, kad Cx36, Cx45 ir Cx47 gali formuoti homotipines ir heterotipines PJ tarp vieno tipo nervinių ląstelių (angl. homocellular gap junctions) bei tarp skirtingo tipo ląstelių (angl. heterocellular gap junctions) PNS (periferinėje nervų sistemoje) ir CNS sistemose (1.2.1.1.1 pav.) [94].

Žinoma, kad Cx47 sąlygoja elektrinio ryšio susidarymą tarp astrocitų ir oligodendrocitų (A-O), formuojantis heterotipinėms Cx43-Cx47 jungtims [95]. Taip pat parodyta, kad Cx47 dalyvauja tarpląstelinio ryšio susidaryme tarp oligodendrocitų (O-O) [96], tačiau nėra toks svarbus kaip Cx32; kokio tipo jungtys (Cx32-Cx32 ar Cx47-Cx47; Cx32-Cx47 neformuoja PJ) formuojasi, eksperimentiškai detalizuota nebuvo. Taip pat parodyta, kad Cx47 formuoja heterotipines jungtis su Cx30 tarp A-O žinduolių ląstelių kultūrose bei taikant dvigubą genų nutildymą pelėje [400].

Pagrindinė A-O elektrinio ryšio susidarymo funkcija – glijų ląstelių sentencijos sukūrimas, paskesniam Ca

srovės sklidimui, metabolitų pernašai bei išorinei, padidėjusiai dėl neuroninio ar sinapsinio aktyvumo, K

jonų ir neurotransmiterių pusiausvyrai palaikyti [97]. Nustatyta, kad gyvūnai stokojantys abiejų Cx32 ir Cx47, praranda A-O ir O-O tarpląstelinį ryšį, pasižymi nenormaliu judėjimu ir traukuliais, todėl jie žūsta [98, 99].

Manoma, kad Pelizaeus-Merzbacher liga yra susijusi su Cx47 funkcijos

sutrikimais oligodendrocituose, pasireiškiant trims taškinėms mutacijoms,

21

dėl kurių Cx47 pasilieka endoplazminiame tinkle ir trukdo funkcinių PJ formavimuisi [100].

1.2.1.1.1 pav. Koneksinų pasiskirstymas smegenų ląstelėse

(A–G) PJ ir puskanalių formavimasis tarp vieno tipo nervinių ląstelių ir (H–I) tarp skirtingų tipų nervinių ląstelių. A, B ir D taip pat pavaizduotas puskanalių formavimasis.

Heterotipinės PJ yra pavaizduotos B ir I. Paaiškinimai: N – neuronas, A – astrocitas, O – oligodendrocitas, M – mikroglija, EC – endotelio ląstelės, E – ependimocitai ir MC – smegenų dangalų ląstelės (angl. meningeal cells). Modifikuota pagal [94].

Cx45 buvo aptiktas smegenų žievės ir pusrutulių pamato mazgų, hipokampo (CA1–CA4 regionai) bei tinklainės (kolbelių ON tipo bipolinės, amakrininės ir ganglijinės ląstelės [101]) ląstelėse, tarpinių smegenų gumburo neuronuose, taip pat mišriose uoslės stormens glomerulų sinapsėse (angl. synapses of olfactory bulb glomeruli) [102–104]. Be to mCx36 ir mCx45 ortologai hCx36 ir hCx45 buvo rasti žmogaus tinklainės išoriniuose ir vidiniuose sluoksniuose [105]. Cx45 raiška oligodengrocituose yra prieštaringa, bet iki šiol ji siejama su smegenų kraujagyslėmis, daugiausia su lygiųjų raumenų ląstelėmis, esančiomis greta kraujagyslių [106]. Cx45 raiška yra parodyta mRNR lygmenyje in vitro mikroglijų kultūroje, tačiau

A B C

D E F

G H I

22

funkcinių kanalų aptikti nepavyko [107]. Nustatyta dviguba Cx45 ir Cx36 raiška alyvinio branduolio (angl. inferior olive), smegenėlių giluminiuose branduoliuose ir žievės neuronuose [108, 109], todėl manoma, kad gali formuotis heterotipinės Cx36-Cx45 jungtys.

PJ tarp hipokampo piramidinių neuronų yra svarbios generuojant aukšto dažnio impulsus. Šie impulsai perduoda hipokampe esančią informaciją į smegenų žievę laikinam saugojimui [104]. Cx45 koduojamojo regiono pašalinimas sukėlė skotopinės b bangos amplitudės sumažėjimą [110].

Manoma, kad Cx45 gali prisidėti prie neuroninės homeostazės ir ląstelių išgyvenimo [111]. Parodyta ypatinga Cx45 svarba smegenų kraujagyslių sistemos vystymuisi [112].

Graužikų Cx36 mRNR buvo aptikta uoslės stormenyje, kankorėžinėje liaukoje, alyviniame branduolyje, hipokampo CA3–CA4 regionuose, smegenų kamieno branduoliuose, tuo tarpu nedideli kiekiai randami kituose galvos ir stuburo smegenų regionuose. Taikant imunocitochemį metodą, stipri Cx36 raiška buvo aptikta alyvinio branduolio dendrituose, smegenėlių branduoliuose, tinklainėje (heterologinėse PJ tarp AII amarininių ir kolbelių ON tipo bipolinių ląstelių ir ganglijinėse ląstelėse;

tačiau raiška nėra aptikta lazdelėse ir horizontaliose ląstelėse) ir kituose galvos ir stuburo smegenų regionuose, tokiuose kaip uoslės stormens, hipokampo CA1 ir CA3, dantytojo vingio, dryžuotojo kūno, lęšinio branduolio blyškiojo kamuolio (lot. globus pallidus) regionuose, Purkinės ląstelių pirminiuose dendrituose bei tarpinių smegenų gumburo neuronuose [113–119].

Manoma, kad tinklainėje Cx36 formuoja elektrines sinapses, kurios yra svarbios naktiniam matymui. Taip pat žinoma, kad hipokampe Cx36 yra svarbus normaliam erdviniam kodavimui ir trumpalaikei atminčiai tarp jungiančiųjų neuronų bei neuronų remodeliacijai, keičiant neuroninių kamieninių ląstelių diferenciaciją [120, 121]. Cx36 PJ taip pat svarbios impulso sklidimui, neuronų aktyvumo (impulso dažnio) moduliacijai, greitoms osciliacijoms ir kitoms sinchronizacijos savybėms, kurios yra būdingos esant fiziologinėms sąlygoms [27, 28].

Cx36 gali pilnai funkciškai kompensuoti Cx45 praradimą pelės tinklainėje, bet ne širdyje, tai rodo Cx36 specifiškumą audinio tipui [401].

Daugelyje CNS regionų, tame tarpe smegenų žievėje ir pogumburyje, Cx36

raiška padidėja per dvi postnatalinio laikotarpio savaites ir sumažėja į

postnatalinio laikotarpio pabaigą (po 3–4 savaičių). Taip pat raiška laikinai

didėja esant neuroninėms pažaidoms – nugaros smegenų, trauminei

smegenų, tinklainės pažaidoms, išemijai, epilepsijai ir įvairiems

uždegimams. Parodyta, kad KO pelėje, kurioje buvo išveiklintas Cx36

genas (Gjd2), beveik išnyksta (95 %) neuroninis elektrinis ryšis. Tai rodo,

23

kad pirminė PJ funkcija subrendusioje CNS yra sinchronizuoto osciliacinio aktyvumo sukūrimas ir moduliacija [122].

1.2.1.1.1. Centrinės nervų sistemos patologijos ir koneksinai

PJ yra susijusios su traukulių skatinimu, palengvindamos elektrinio aktyvumo sklaidą tarp neuronų [123]. Dėl minėtos priežasties didėja susidomėjimas PJ blokavimo, silpninant traukulių aktyvumą, tyrimais. Per paskutiniuosius dešimt metų PJ vaidmuo traukulių susidarymo procese buvo intensyviai tiriamas, tačiau išlieka nesutarimų objektu. Manoma, kad atidarytos PJ, veikiančios kaip elektrinės sinapsės, turėtų padidinti sinchroniškumą tarp smegenų žievės neuronų ir paskatinti traukulių aktyvumą. Parodyta, kad PJ elektrinio ryšio sustiprinimas šarminimo būdu, naudojant trimetilaminą, sukėlė padidintą CNS traukulių aktyvumą [287–

289]. Taip pat nemažai in vivo ir in vitro tyrimų atskleidė, kad PJ blokavimas silpnina konvulsinius efektus [124–126], tačiau gali lemti ir traukulių sukėlimą [127]. Be to, transgeninėje Cx36

pelėje, kurioje nėra pagrindinio suaugusių gyvūnų neuronuose vyraujančio Cx, pasireiškia traukuliai [128]. Cx36 PJ yra aptinkamos tarp blokuojančių interneuronų ir jų slopinimas gali sutrikdyti piramidinių ląstelių aktyvumo slopinimą, tokiu būdu sąlygojant traukulius. Iš kitos pusės, piramidinių ląstelių aksoninių PJ blokavimas gali nuslopinti traukulių aktyvumą [129].

1.2.1.2. Plyšinės jungtys širdyje

Širdyje impulsas yra generuojamas sinusiniame mazge, toliau sklinda

prieširdžiu iki atrioventrikulinio mazgo, kur užlaikomas sklinda į laidžiąją

sistemą, kol pasiekia skilvelio miokardą. Normaliam impulso sklidimui ir

širdies ritmo palaikymui labai svarbus yra PJ sąlygojamas elektrinis ryšis

[10]. Kol kas žinomi šeši Cxs, kurie aptinkami normalioje suaugusioje

širdyje [130], iš kurių trys – Cx43, Cx40 ir Cx45 yra pagrindiniai, tačiau

neseniai buvo aptikti dar keli Cxs – Cx30 [131], Cx30.2 pelėje (ortologas

žmoguje Cx31.9) [132] bei Cx37 [133]. Tuo tarpu Cx36 ir Cx47 nebuvo

aptikti širdies mRNR [134, 135] ir baltymo raiškos [136] lygmenyse

(1.2.1.2.1 pav. ir lentelė).

24

1.2.1.2.1 pav. Koneksinų raiška suaugusios pelės širdyje

Modifikuota pagal [130].

1.2.1.2.1 lentelė. Pelės širdies koneksinai ir jų biofizikiniai parametrai

Cx Genas Chromosoma Cx ilgis γo (pS) γres (pS)

Cx30.2 Gjd3 11 278 9 n

Cx37 Gja4 4 333 300 63

Cx40 Gja5 3 358 162–180 36

Cx43 Gja1 10 382 60–115 23

Cx45 Gja7 11 395 32 n

Cx30 Gjb6 14 261 179 48

n

–

Pelės embriono širdies vystymosi metu pirmiausiai stebima Cx45 raiška.

Tai sutampa su širdies susitraukimo atsiradimu aštuntą embriono dieną; šis Cx yra labiausiai išreikštas pradiniu periodu formuojantis laidžiajai sistemai.

Cx45 raiškos lygis mažėja per 11–12 embriono dienas, išskyrus laidžiąją sistemą [137]. Cx43 (pirmiausia atsiranda skilveliuose, dvyliktą embriono dieną – prieširdyje) ir Cx40 (labiausiai išryškėja prieširdyje ir skilvelio trabekulų vidinėse dalyse) stebimi praėjus dienai po Cx45 atsiradimo.

Keturioliktą–penkioliktą embriono dieną Cx40 raiška mažėja skilveliuose, išskyrus besiformuojančią laidžiąją sistemą, tuo tarpu Cx43 raiška intensyviai didėja viso embrioninio ir postnatalinio periodų metu. Žinoma, kad žmogaus ir pelės Cxs raiškos profiliai širdies vystymosi metu yra panašūs [138].

Širdyje PJ daugiausia lokalizuojasi įterptiniuose diskuose, kurie sujungia

gretimus miocito galus. Taikant 3D modeliavimą ir aukštos rezoliucijos

konfokalinę fluorescencinę mikroskopiją nustatyta, kad Cx43 daugiausia

kaupiasi kardiomiocito galuose, bet taip pat gali būti randamas sarkolemoje

[139].

25

Cx43 yra plačiausiai pasiskirstęs Cx, randamas beveik visuose širdies regionuose (prieširdžiuose ir skilveliuose bei nutolusiose laidžiosios sistemos dalyse), išskyrus sinoatrialinį (SA) ir atrioventrikulinį (AV) mazgus ir Hiso pluoštą [140]. Daugiausia Cx40 gaminamas prieširdžio miocituose, AV mazge, Hiso pluošte ir skilvelio laidžiojoje sistemoje [141], tuo tarpu raiška SA mazge yra prieštaringai vertinama, nes, pavyzdžiui, Cx40 nėra aptinkamas žiurkės ir jūrų kiaulytės prieširdžiuose [142, 143].

Suaugusioje pelėje Cx45 raiška stebima SA ir AV maguose, Hiso pluošte ir jo atšakose, taip pat maži kiekiai aptinkami prieširdžių ir skilvelių miocituose, bet šis faktas yra prieštaringai vertinamas [144]. Pelėje Cx30.2, bet ne jo ortologas žmoguje Cx31.9, buvo aptiktas SA ir AV mazguose bei Hiso pluošte [145]. 2010 m. Gros ir kt. pelės SA mazge aptiko nedidelius naujo Cx30 kiekius. Šis Cx yra svarbus širdies susitraukimo dažnio reguliacijai [131] (1.2.1.2.1 pav. ir lentelė).

1.2.1.2.1. Širdies koneksinų funkcijų tyrimai in vivo

Pelės mutantas su išveiklintu Cx30.2 genu pasižymėjo sumažėjusia elektrokardiogramos PQ trukme, o tai rodo padidėjusį AV mazgo laidumą.

Pastarasis reiškinys buvo susietas su trumpesniais elektrokardiogramos AH, bet ne HV intervalais. Buvo padaryta išvada, kad laidžiosios sistemos AV mazgo impulso sklidimui užtenka vien tik Cx45, tuo tarpu Cx40 ir Cx30.2 veikia vienas kitą papildydami, tokiu būdu didindami arba mažindami laidumo greitį [148].

Naudojant peles su išveiklintais Cx40 arba Cx43 genais („knok-out“

(KO) mutantai) buvo nustatyta, kad prieširdžių laidumas nesiskiria nuo wt tipo, tačiau pelė su išveiklintu Cx40 genu pasižymėjo didesniu pažeidžiamumu supraventrikulinėms aritmijoms [149, 150]. Pakitusi Cx40 raiška ir pasiskirstymas yra siejami su prieširdžių virpėjimu [77]. Naudojant pelę su išveiklintu Cx40 genu buvo stebimas netipinis AV mazgo laidumas, t.y. pailgėjęs PQ intervalas (buvo lokalizuotas Hiso pluošto ir skilvelio HV intervale) ir ilgesnė QRS komplekso trukmė (išsiplėtimas ir pasiskirstymas (angl. QRS widening and fractionation)). QRS pailgėjusi trukmė buvo susieta su netipiniu Hiso pluošto kojyčių laidumu (sulėtėjęs dešiniosios ir kairiosios kojyčių laidumas arba stebimas dešiniosios kojytės laidumo blokavimas) [151–154].

Siekiant ištirti Cx43 vaidmenį skilveliuose, buvo generuojamos pelės,

pasižyminčios haplonepakankamumu pagal Cx43 (Cx43

) ir su sąlyginai

išveiklintu Cx genu (naudojant Cre/LoxP sistemą). Tuo tarpu pelės su

homozigotiškai išveiklintu Cx43 (Cx43

) genu žūdavo perinatalinio periodo

metu dėl širdies plautinio nutekamojo latako išsigimimo [155]. Cx43

26

pelėje Cx43 raiška sumažėdavo 50 %, o tai sąlygodavo laidumo greičio sumažėjimą ir padidintą skilvelių sužadinimo uždelsimą [156], tačiau šis pastebėjimas yra prieštaringas analizuojant kitų autorių darbus [157, 158].

Naudojant Cre/LoxP sistemą (išvengiant letalios baigties perinantalinio periodo metu) buvo sukonstruotos pelės, pasižyminčios daugiau negu 50 % Cx43 geno raiškos sumažėjimu. Ši sistema buvo pagrįsta: 1) Cre raiška buvo reguliuojama širdies αMHC ir MLC2v promotoriais (tokia pelė žūdavo praėjus dviem mėnesiams po gimimo); 2) selektyviai buvo atrenkamos vyresnės αMHC-Cre/Cx43

pelės, sukeliant laipsnišką Cx43 mažėjimą ir pailgėjusią pelės gyvenimo trukmę (iki 300 dienų); 3) Cx43

, kur viena dalis Cx43 geno buvo pakeista sulietu konstruktu, susidedančiu iš Cre rekombinazės ir domeno, surišančio žmogaus estrogeno receptorių (mutuota versija), o kita Cx43 dalis buvo apsupta LoxP sekomis ir po to iškirpta injekuojant 4-hidroksitamoksifeną; tai paskatino staigią pelės, turinčios Cx43

, žūtį po vieno mėnesio suaktyvinus iškirpimo procesą [159].

Pelės Cx45 geno haplonepakankamumas (homozigotinė Cx45 geno iškrita nebuvo stebima, kadangi tai sukelia letalią baigtį dėl sutrikusio kraujagyslių vystymosi [112]) tebesant Cx40 nesukėlė drastiškų AV mazgo laidumo pokyčių, PQ ir QRS komplekso trukmės buvo tokios pat kaip ir kontrolinėmis sąlygomis. Tačiau nebesant Cx40, haplonepakankamumas pagal Cx45 sulaikė AV laidumą ir skilvelių sužadinimą [160].

1.2.1.2.2. Koneksinai ir širdies patologijos

Esant širdies ligai keičiasi Cxs raiška ir pasiskirstymas – įterptiniuose diskuose 30–40 % keičiasi baltymo kiekis [82].

Staigios širdies išemijos metu labai greitai defosforinamas Cx43, dingsta elektrinis ryšis ir vyksta persitvarkymai baltymo lokalizacijoje [161].

Priešingą poveikį Cx43 PJ sukelia išeminio pripratimo sukelta miokardo apsauga (angl. ischaemic preconditioning) [162], tačiau tai nepasitvirtina sumažėjus Cx43 raiškai per pusę, kai pasireiškia vainikinių arterijų okliuzijos, todėl atsiranda nedideli infarktai, lyginant su įprasta Cx43 raiška [163]. Išemijos metu suaktyvėja Cx43 puskanaliai, dėl to ląstelės pradeda pūstis, išsiskiria ATF bei prarandamas membraninis potencialas [74]. Buvo pastebėta, kad prieš sukeliant išemiją, užblokavus PJ (tyrime buvo naudotas heptanolis), sumažėja infarkto pažeista zona. Tuo tarpu cheminio signalo perdavimas per PJ galėtų įtakoti išeminės pažaidos plitimą [164].

Pelėje, nutildintoje pagal Cx43, apie 90 % sumažinta šio baltymo raiška

buvo asocijuota su staigia širdies mirtimi dėl aritmijos atsiradimo; tai yra

daugiau negu žmogaus skilveliuose pastebėtas Cx43 sumažėjimas – 50 %.

27

Parodyta, kad heterogeninis PJ pasiskirstymas ir sumažėjęs Cx43 lygis papildo vienas kitą. Tyriant selektyviai atrinktas peles nustatyta, kad Cx43 59 % raiškos sumažėjimas nekeičia impulso sklidimo greičio arba polinkio į aritmijas, bet tuo atveju, kai sumažėjimas yra 82 % ir yra heterogeniškas, impulso sklidimo greitis sulėtėja 50 % bei 80 % gyvūnų žūva dėl letalios skilvelių aritmijos [165].

Išemijos metu padidėja Cx40 ir Cx45 lygis pažeistuose skilveliuose [166, 167]. Svarbu pažymėti, kad padidinus Cx45-Cx43 santykį, kai per daug gaminamas Cx45, padidėjo skilvelinės tachikardijos atsiradimo rizika ir sumažėjo tarpląstelinis ryšys [168].

1.2.1.3. Plyšinės jungtys kraujagyslių sistemoje

PJ sąlygojamas elektrinis ryšys tarp endotelio ir kraujagyslių lygiojo raumens ląstelių (EC ir VSMC) yra svarbus reguliuojant vazomotorinį tonusą bei tarpininkaujant nuo EDHF (endotelyje išskiriamas atpalaiduojantis faktorius; angl. EDHF endothelium-derived hyperpolarizing factor) priklausomame signaliniame kelyje [169]. PJ gali formuotis tarp šių ląstelių derinių: EC-EC, VSMC-VSMC, EC-VSMC [170]. EC-VSMC derinio elektrinis ryšys vadinamas mioendoteline jungtimi (angl. myoendothelial junction – MEJ). Cx45 pastebimas tik VSMC, bet ne EC [171], o Cx37, Cx40 ir Cx43 VSMC ir EC [172–174]. MEJ jungtys buvo aptiktos žiurkės smegenų arteriolėse (Cx37 ir Cx40), žiurkės žarnų pasaituose (Cx40 ir Cx37), pelės arteriolėse (Cx40 ir Cx43) ir žmogaus poodinio atsparumo arterijose (angl. subcutaneous resistance arteries;

Cx43) [175–179].

   1.2.1.3.1. Kraujagyslių sistemos koneksinų funkcijų tyrimai in vivo Mikrokraujagyslėse Cx40 yra reikalingas vazodilatacinio atsako laidumui, tuo tarpu vazokonstrikcijos atsako laidumas išilgai arteriolės sienelės lieka nepakitęs Cx40 KO pelėje [180, 181]. Cx40 KO pelės yra hipertenzinės [182]. Cx37 neturi įtakos kraujagyslių defektams, tačiau jis yra svarbus išveiklintoje pagal Cx37 ir Cx40 pelėje – jos yra gyvos, bet žūsta perinataliniu periodu atsiradus kraujagyslių anomalijoms [183]. Tai parodo, kad homotipinės Cx37 arba heterotipinės Cx37-Cx40 PJ atlieka svarbią funkciją.

Endotelinis Cx43 geno išveiklinimas taikant Cre/Lox sistemą (naudojant

endotelio promotorių TIE2) sukėlė hipotoniją ir lygiagrečiai bradikardiją

[184].

28

Neseniai parodyta, kad plokštelių ir megakariocitų Cx37 reikalingas hemostazės proceso trombo (kraujo krešulio sudaryto iš plokštelių) susitraukimo kontrolei. PJ blokavimas silpnina trombozės procesą in vitro, naudojant žmogaus kraują, ir in vivo – pelėje. Tuo tarpu išveiklintoje pagal Cx37 pelėje (Cx37

) susilpnėja plokštelių aktyvinimas, mažėjant plokštelių agregacijai, fibrinogeno prisijungimui, granulių sekrecijai ir trombo susitraukimui. Taigi buvo iškelta hipotezė, kad Cx37 yra svarbus pradinėse plokštelių aktyvinimo stadijose, formuojantis Cx37 puskanaliams, tuo tarpu trombo formavimąsi ir susitraukimą kontroliuoja Cx37 PJ sąlygojamas elektrinis ryšys [185].

1.2.1.3.2. Kraujagyslių ligos ir koneksinai

Nustatyta, kad ~ 10 % hipertenzijos atvejų sukelia inkstų liga arba aterosklerozinis inkstų arterijų susiaurėjimas, o tai veikia renino- engiotenzino sistemą ir (arba) Na

homeostazę (svarbią kraujospūdžio reguliacijai). PJ vaidmuo esant hipertenzijai siejamas su renino sekrecija [170]. Cx37, Cx40 ir Cx43 yra aptinkami inkstuose ir jungia jukstaglomerulinio aparato ląsteles. Šie Cxs randami įcentrinėse arteriolėse, tuo tarpu Cx37 ir Cx40 aptinkami reniną sekretuojančiose ląstelėse ir mezenchimos ląstelėse (angl. mesangial cells) [186]. Cx40 užtikrina elektrinį ryšį inkstuose tarp reniną gaminančių ląstelių, tarp reniną gaminančių ir endotelio ląstelių, tuo tarpu endotelio ląstelių elektrinis ryšys yra priklausomas nuo Cx43 [187].

Cx43 genetinis apkeitimas į Cx32 apsaugo Cx43KI32 pelę (angl. knok- in; KI) nuo eksperimentiškai sukeltos hipertenzijos (sumažinus renino gamybą) [188]. Tuo tarpu Cx40 geno išveiklinimas skatina pelių hipertenziją, renino gamybos ir sekrecijos padidėjimą. Tai rodo, kad Cx40 yra svarbus inkstų renino sistemos tonuso slopinimui [187]. Be to, Cx40 pašalinimas pakenkia jukstaglomerulinio aparato vystymuisi [189].

Cx37 ir Cx45 nėra būtini vystantis hipertenzijai [190], nors genetinis Cx37 polimorfizmas (C1019T) yra siejamas su kraujagyslių okliuzija ir siaurėjimu bei miego arterijos vidinių sluoksnių storėjimu, o tai gali sąlygoti ligą [191].

Priešingai, hipotonija gali atsirasti išveiklinus endotelio Cx43 (naudojant TIE-2 promotorių) geną, dėl to plazmoje sumažėja angiotenzino II lygis [184].

Modelinės pelės leido geriau išanalizuoti Cxs įtaką aterosklerozei. Buvo

sukurta pelė TIE2-Cre

Cx40

ApoE

(pelė, negaminanti Cx40 endotelyje)

ir Cx40

ApoE

kontrolinė pelė. Rezultatai parodė, kad selektyvus Cx40

pašalinimas endotelyje nepaveikė arterinio kraujospūdžio arba širdies

29

susitraukimo dažnio, bet padidino aterosklerozinės plokštelės paviršių TIE2- Cre

Cx40

ApoE

pelėje. Tai rodo, kad Cx40 pasižymi saugančiu nuo aterosklerozės poveikiu [192].

Taip pat nustatyta, kad C1019T polimorfizmas, sąlygojantis Cx37 P319S, pasižymi saugančiu nuo aterosklerozės poveikiu [193].

1.2.1.4. Plyšinės jungtys sekrecijos sistemoje – β-β ląstelių elektrinis ryšys

Cx36 bei jo sąlygojamas β-β elektrinis ryšys yra labai svarbus reguliuojant insulino sekreciją. Kasos Langerhanso salelių (skersmuo 50–

600 µm, sudaro 50–3000 ląstelių) β ląstelės (žmogaus organizme sudaro didžiąją dalį salelių – ~ 60 %) gamina hormoną insuliną ir yra svarbiausios vystantis I ir II tipo cukriniam diabetui. Langerhanso salelės papildomai turi: gliukagoną produkuojančias α, somatostatiną gaminančias δ, PP peptidą sekretuojančias, greliną gaminančias ε, endotelio, fibroblastu, limfocitų ir makrofagų ląsteles. Langerhanso salelės, išsibarsčiusios po visą kasos liauką, sudaro tik apie 1 % jos bendro tūrio [194]. β-β ląstelių elektrinį ryšį sąlygoja tik Cx36 [135] (1.2.1.4.1. pav., C ir D). Pavienės β ląstelės pasižymi padidinta bazine insulino sekrecija bei visišku sekrecijos nebuvimu stimuliuojant gliukoze, taip pat nestebimas Ca

padidėjimas.

Tačiau šie procesai atsistato vykstant ląstelių agregacijai [195].

Blokuojant Cx36 elektrinį ryšį keičiasi bazinė ir gliukoze stimuliuojama insulino sekrecija, insulino genų raiška ir Ca

panaudojimas [13, 196].

Cx36

pelėje β ląstelės, neturinčios elektrinio ryšio, negali sinchronizuoti gliukozės skatinamų kalcio padidėjimo procesų aplink kiekvieną Langerhanso salelę. Tai panaikina pulsuojantį insulino išsiskyrimą ir padidina bazinę hormono sekreciją, todėl veikimas gliukoze negali sureguliuoti insulino išsiskyrimo [23, 24]. Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant MIN6 ląsteles neturinčias Cx36 (naudojant siRNR) [197]

(1.2.1.4.1. pav., A ir B). Taip pat insulino sekrecijos kontrolės negalėjo kompensuoti kiti Cxs arba E-kadherinas [198]. Taip pat perteklinis Cx36 lygis kaip ir jo trūkumas pasižymi vienodu žalojančiu poveikiu [199].

Panašūs pokyčiai vyksta esant prediabetinei stadijai bei II tipo cukriniam

diabetui [200, 201]. Transgeninė pelė yra jautri streptozocino, aloksano ir

citokinų poveikiui [23], tai yra būdinga vystantis I tipo cukriniam diabetui

[202]. Tuo tarpu trangeninė pelė, kurios Cx36 raiška žymiai padidinta, yra

apsaugota nuo šių žalingų veiksnių bei nuo β ląstelių apoptozės [203].

30

1.2.1.4.1 pav. Koneksino 36 svarba insulino sekrecijai

(A–B) MIN6 ląstelės, neturinčios Cx36, negali sinchronizuoti Ca²⁺ padidėjimo proceso.

Ca²⁺ pokyčiai MIN6 ląstelėse buvo registruojami fluorimetrijos būdu naudojant Fluo-3 ir stebint individualias ląsteles. Ląstelės buvo stimuliuotos gliukoze (20 mM) ir tetraetilamoniu (15 mM). (A) Laukinio tipo (wt) ląstelės, gaminančios Cx36, pasižymi nuolatinėmis ir tvarkingomis Ca²⁺ lygio osciliacijomis. Lygiagrečiai buvo registruojamos skirtingos ląstelės (registracijos kreivių spalvos atitinka ląstelių apskritimų spalvas), kurios rodo tarpląstelinę sinchronizaciją per atskirus ląstelių klasterius. (B) MIN6 ląstelės, gaminančios Cx36 ir paveiktos siRNR prieš Cx36, rodo asinchroniškas Ca²⁺ osciliacijas.

(C–D) Imunofluorescenciniais metodais detektuota Cx36 raiška β ląstelėse. (C) Cx36 raiška (raudona spalva) aptinkama endokrininėse kasos Langerhanso salelėse bet ne egzokrininėse acinusų ląstelėse (už punktyrinės linijos ribų). (D) E-kadherino dažymas (žalia spalva) rodo punktyrinį Cx36 pasiskirstymą salelių membranose. Modifikuota pagal [196, 206].

Tokiu būdu Cx36 praradimas nesukelia akivaizdaus cukrinio diabeto, bet įtakoja cirkuliuojančio insulino osciliacijų sumažėjimą in vivo; tai sukelia netoleranciją popietiniam gliukozės kiekiui [24, 25]. Šis insulino osciliacijų sumažėjimas siejasi su pirmos fazės, gliukoze skatinamos, insulino sekrecijos mažesne amplitude ir jos ilgesniu gesimu, taip pat su mažesnėmis insulino osciliacijomis, vykstant antros fazės insulino sekrecijai. Tai rodo, kad Cx36 užima svarbią hierarchinę poziciją reguliuojant įvairiapusę insulino dinamiką, o tai yra svarbu gliukozės kiekio reguliacijai [25, 204, 205].

A

B

C

D

31

Terapiniam gydymui pasitelkiant nuo Cx36 priklausomą reguliaciją, jau dabar yra darbų, kuriais bandoma selektyviai parinkti farmakologines medžiagas. Pavyzdžiui, sulfonilurija (stimuliuoja insulino sekreciją sergant II tipo cukriniu diabetu) skatina Cx36 PJ susidarymą bei pagerina elektrinį ryšį. Taip pat buvo ištirtas glibenklamido ir kvinino darinių poveikis β ląstelėms [22, 207]. Analizuojant didesnę imtį farmakologinių medžiagų (1040 vnt.) bei atliekant jų atranką buvo aptiktos keturios medžiagos, kurių poveikis dar nebuvo parodytas β ląstelėms. Dvi iš jų (zaprinastas ir norkantaridinas) didino, o kitos dvi (mebeverinas ir gedulinas) mažino sinchronizavimo indeksą, kuris atspindi viduląstelinio Ca

padidėjimo sinchronizacijos laipsnio vidurkį. Nustatyta, kad šios medžiagos keičia MIN6 ląstelių elektrinį ryšį ir sinchronizavimo indeksą. Taip pat lygiagrečiai keičiasi insulino raiška, o tai patvirtina faktą, kad Gjd2 ir insulino genai yra reguliuojami giminingais promotoriais, transkripciją inicijuojant beta2/Neurod1 transkripcijos faktoriumi [22].

1.3. Plyšinių jungčių reguliacija – biocheminė ir biofizikinė pusės

1.3.1. Plyšinių jungčių farmakologija

PJ tarpląstelinis laidumas (g

) priklauso nuo kanalų skaičiaus (N

), vidutinės kanalo atsidarymo-užsidarymo trukmės (t), vienetinio kanalo laidumo (γ) bei atviros būsenos tikimybės (P

). Kanalo atsidarymo- užsidarymo procesus (angl. gap junction gating) bei P

galima reguliuoti farmakologinėmis medžiagomis, dažniausiai tai yra plačiai naudojami PJ blokatoriai. PJ farmakologinės medžiagos skirstomos į kanalus uždarančias (blokatoriai) bei kanalus atidarančias (aktyvatoriai) (1.3.1.1 lentelė) [10].

Žinoma, kad naudojant farmakologines medžiagas galima tirti PJ fiziologinę svarbą (pvz., elektrinių sinapsių funkciją in vitro) ir jų įtakojamus procesus, PJ struktūrą ir jos funkcinę reikšmę. Yra prielaidų manyti, kad Cxs yra vieni farmakologinių taikinių gydant epilepsiją, širdies aritmiją, vėžį, insultą, cukrinį diabetą bei esminį drebulį [10–14].

Priklausomai nuo ligos (pažeidimo) tipo bei būklės, PJ kanalų

blokavimas ar stimuliavimas gali lemti tolesnį rezultatą – būklės pagerėjimą

ar pablogėjimą (pvz., PJ elektrinio laidumo blokavimas [214–216] ar

stimuliavimas [217, 218] įtakoja širdies funkciją normos ir patologijos

sąlygomis; tuo tarpu epilepsijos atveju PJ blokatoriai silpnina priepuolius, o

aktyvatoriai – skatina in vitro ir in vivo sąlygomis [124–126, 219]). Deja, iki

šiol pripažįstama, kad absoliučiai specifinės farmakologinės medžiagos,

veikiančios tik PJ, nėra [210], dėl to tam tikrais atvejais, interpretuojant

tyrimų rezultatus, reikia atsižvelgti į naudotos cheminės medžiagos