LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
studentės Ievos Janulaitytės
IN VIVO ALERGENU AKTYVINTŲ EOZINOFILŲ ĮTAKA BRONCHŲ LYGIŲJŲ RAUMENŲ REMODELIACIJAI SERGANT ASTMA
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Kęstutis Malakauskas
Konsultantas Dokt. Andrius Januškevičius
2 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 8 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 9
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 10
SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI IR SANTRUMPOS ... 11
ĮVADAS ... 13
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 15
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 16
1.1 Astmos apibrėžimas ir patogenezė ... 16
1.2 Ankstyvos ir vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas ... 17
1.3 Eozinofilai ... 19
1.3.1 Eozinofilų apibūdinimas ... 19
1.3.2 Eozinofilų reikšmė astmos patogenezei ... 20
1.4 Remodeliacijos samprata ... 22
1.4.1 Kvėpavimo takų remodeliacija sergant astma ... 22
1.4.2 Tarpląstelinio matrikso baltymai ... 23
1.4.3 Tarpląstelinio matrikso vaidmuo sergant astma ... 25
1.5 Wnt signalinių kelių sampranta ... 26
1.5.1 Wnt signaliniai keliai ... 26
1.5.2 Wnt signalinių kelių reikšmė sergant astma ... 28
2. METODIKA ... 30
2.1 Tyriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga ... 30
2.1.1 Tiriamųjų kontingentas ... 30
2.1.2 Tyrimo eiga ... 31
2.2 Mėginių paruošimas ... 32
2.2.1 Periferinis kraujas ... 32
2.2.2 Eozinofilų išskyrimas iš periferinio kraujo ... 32
2.2.3 Bronchų lygiųjų raumenų ląstelių kombinuota kultūra su eozinofilais ... 33
3
2.3 Tyrimo metodai ... 35
2.3.1 Plaučių funkcijos tyrimas ... 35
2.3.2 Bronchų provokacinis mėginys su metacholinu ... 36
2.3.3 Bronchų provokacinis mėginys su alergenu ... 36
2.3.4 Alerginiai odos dūrio mėginiai ... 37
2.3.5 Eozinofilų adhezijos prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių vertinimas ... 37
2.3.6 Bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijos matavimas ... 38
2.3.7 Genų raiškos vertinimas ... 38
2.3.8 Matematinė ir statistinė duomenų analizė ... 40
3. REZULTATAI ... 41
3.1 Tiriamųjų kontingentas ... 41
3.2 Eozinofilų adhezija prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių ... 41
3.2 WNT-5a geno raiška bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse ... 43
3.3 TGF-β1 geno raiška bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse ... 44
3.4 Kolageno ir fibronektino genų raiška bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse ... 45
3.5 Bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijos vertinimas ... 46
3.6 Eozinofilų integrinų blokavimo įtaka eozinofilų adhezijai prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių ... 47
3.7 Eozinofilų integrinų blokavimo įtaka genų raiškoms bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse ... 48
3.8 Eozinofilų integrinų blokavimo įtaka bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai ... 51
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 52 IŠVADOS ... 55 REKOMENDACIJOS ... 56 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 57 REZULTATŲ SKLAIDA ... 64 PRIEDAI ... 67
4
SANTRAUKA
Baigiamojo magistrinio darbo autorė: Ieva Janulaitytė
Baigiamojo magistrinio darbo pavadinimas: In vivo alergenu aktyvintų eozinofilų įtaka bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijai sergant astma
Darbo tikslas: ištirti in vivo alergenu aktyvintų eozinofilų poveikį bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijai.
Uždaviniai:
1. Įvertinti in vivo alergenu aktyvintų eozinofilų adhezijos intensyvumą prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių bei įtaką bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai.
2. Nustatyti WNT-5a, TGF-β1, kolageno ir fibronektino genų raišką bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse po sąveikos su eozinofilais.
3. Ištirti in vivo aktyvintų eozinofilų integrinų blokavimo įtaką kvėpavimo takų remodeliacijos vystymuisi.
Tiriamieji ir metodika: Į tyrimą įtraukta 19 asmenų: 9 sergantys alergine astma (AA) ir 10 sveikų asmenų (SA). Visiems tiriamiesiems atliktas bronchų provokacija alergenu. Tiriamasis objektas – kombinuotosios bronchų lygiųjų raumenų (BLR) ląstelių ir eozinofilų kultūros. Eozinofilai išgryninti naudojant centrifugavimą aukšto tankio gradiente bei magnetinę separaciją. Kiekvienam tiriamąjam paruoštos individualios eozinofilų ir BLR ląstelių kombinuotos kultūros. Eozinofilų adhezija prie BLR paviršiaus nustatyta vertinant eozinofilų peroksidazės aktyvumą kombinuotose kultūrose. Praėjus 24h po inkubacijos su eozinofilais, iš BLR ląstelių išskirta suminė ribonukleino rūgštis (RNR). Tranformuojančio augimo faktoriaus-β1 (TGF-β1), WNT-5a, kolageno ir fibronektino genų raiška vertinta atlikus tikro laiko polimerazinę grandininę reakciją. BLR ląstelių proliferacija vertinta naudojant Alamaro mėlio reagentą, išmatuojant šviesos absorbcijos pokytį, praėjus 72h po kombinuotos kultūros su eozinofilais sudarymo. Eozinofilų integrinai blokuoti juos inkubavus 1h su Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) peptidu.
Rezultatai: Eozinofilų adhezija prie BLR ląstelių buvo intesnyvesnė AA grupėje po bronchų provokacijos D.pteronyssinus alergenu vidutiniškai 31,5 proc. WNT-5a, TGF-β1 genų raiška bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse po inkubacijos su AA sergančiųjų eozinofilais prieš bronchų provokaciją alergenu buvo intesnyvesnė, atitinkamai 3,19 ir 3,30 kartus, lyginant su SA eozinofilais. Po provokacijos alergenu skirtumai tarp AA sergančiųjų eozinofilų sukeltos WNT-5a, TGF-β1 genų raiškos BLR ląstelėse lyginant su SA grupe išliko intensyvesnė, atitinkamai 3,72 ir 3,29 kartus, tačiau eozinofilų aktyvinimas alergenu reikšmingų pokyčių nesukėlė. Kolageno ir fibronektino genų raiškos BLR ląstelėse prieš bronchų provokaciją alergenu buvo didesnės AA grupėje, atitinkamai 2,44 ir 1,61
5 kartus, lyginant su SA grupe, o po provokacijos šis skirtumas dar labiau išryškėjo, atitinkamai 4,6 ir 2,69 kartus. Kolageno geno raiška po provokacijos AA grupėje padidėjo 2,69 kartus, o fibronektino – 1,98 kartus. BLR ląstelių proliferacija po inkubacijos su AA eozinofilais buvo intesnsyvesnė 13,16 proc. lyginant su SA grupe, po provokacijos skirtumas tarp grupių išliko – 5,4 proc. Tačiau provokacija neturėjo įtakos BLR ląstelių proliferacijai AA grupėje. AA sergančiųjų eozinofilų integrinų blokavimas adheziją sumažino 28,58 proc. prieš ir 64,17 proc. po bronchų provokacijos alergenu. Taip pat, integrinų blokavimas reikšmingai sumažino genų raiškas astmos grupėje prieš ir po provokacijos: atitinkamai WNT-5a 1,97 ir 1,4 kartus; TGF-β1 3,03 ir 2,61 karto; kolageno 2,35 ir 4,72 karto; fibronektino 1,73 ir 2,62 karto. AA eozinofilų integrinų blokavimas prieš ir po bronchų provokacijos alergenu BLR ląstelių proliferaciją sumažino atitinkamai 7,86 ir 7,76 proc.
Išvados: In vivo alergenu aktyvinti AA sergančiųjų eozinofilai pasižymėjo intensyvesne adhezija prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių, tačiau bronchų provokacija alergenu neturėjo įtakos intensyvesnei proliferacijai. Kolageno ir fibronektino genų raiška BLR ląstelėse padidėjo po sąveikos su aktyvintais eozinofilais, o TGF-β1 ir WNT-5a genų raiškai įtakos neturėjo. AA sergančiųjų aktyvintų eozinofilų integrinų blokavimas sumažino jų adheziją, WNT-5a, TGF-β1, kolageno ir fibronektino genų raiškas BLR ląstelėse bei BLR ląstelių proliferaciją.
6
SUMMARY
The author of Master’s thesis: Ieva Janulaitytė
The title of Master’s thesis: The role of in vivo allergen activated eosinophils in airway smooth muscle remodelling in asthma
The aim of work: To investigate the the role of in vivo allergen activated eosinophils in airway smooth muscle remodelling in asthma.
Objectives of work:
1. To evaluate in vivo allergen activated eosinophils adhesion to airway smooth muscle cells and their role in ASM proliferation.
2. To determine WNT-5a, TGF-β1, collagen and fibronectin genes expression in ASM cells after incubation with eosinophils.
3. To investigate the role of in vivo activated eosinophil integrins blocking in development of airway remodeling.
Methods and materials: A total of 19 subjects were involved in the study: 9 allergic asthma (AA) patients and 10 healthy subjects (HS). All subjects underwent bronchial allergen challenge. The main study object – combined cultures between airway smooth muscle (ASM) cells and eosinophils. Peripheral blood eosinophils were isolated by using high density centrifugation and magnetic separation methods. For each study subject the individual combined cell cultures were prepared. Adhesion of the eosinophils was evaluated by measuring eosinophil peroxidase activity in combined cultures. Samples for gene expression measurements was collected after 24h of co-culturing and total RNA were extracted by using commercial kit. TGF-β1, WNT-5a, fibronectin and collagen genes expressions were evaluated by using real time polymerase chain reaction. ASM cells proliferation was determined by using alamarBlue® Cell Viability Assay by dual wavelength spectrophotometry after 72 h. The integrins of eosinophils were blocked incubating them for 1 hour with Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) peptide.
Results: Adhesion of eosinophils to ASM cells was more intensive in AA group after allergen challenge for approximately 31.5%. Gene expression of WNT-5a, TGF-β1 in ASM cells after incubation with AA eosinophils before allergen challenge was more intensive, accordingly 3.19 ir 3.30 folds compared to HS eosinophils. AA eosinophils induce WNT-5a and TGF-β1 genes expression in ASM cells before allergen challenge, accordingly 3.72 and 3.29 folds, but eosinophils activation had no effect in AA group. Gene expression of collagen and fibronectin in ASM cells were increased in AA group, accordingly 2.44 and 1.61 folds, and after allergen challenge these differences increased even more, accordingly 4.60 and 2.69 folds, compared to HS. Collagen and fibronectin expression in
7 AA groups increased after allergen challenge, accordingly 2.69 and 1.98 folds. ASM cells proliferation was more intensive after incubation with AA eosinophils (13.16%) compared with HS group, after allergen challenge difference remained (5.4%). Allergen challenge had no effect on ASM proliferation in AA group. Blocking of AA eosinophils integrins reduced their adhesion by 28.58% before and 64.17% after allergen challenge. Also, the blocking of AA eosinophils integrins reduced their effect on gene expression before and after allergen challenge: accordingly WNT-5a 1.97 and 1.4 folds; TGF-β1 3.03 and 2.61 folds; collagen 2.35 and 4.72 folds; fibronectin 1.73 and 2.62 folds. Also, blocking of AA eosinophils integrins reduced eosinophils-induced ASM proliferation before and after allergen challenge, accordingly 7.86 and 7.76%.
Conclusion: in vivo allergen activated AA eosinophils adhesion to ASM cells and ASM cells proliferation were increased. Activated AA eosinophils increase collagen and fibronectin genes expression in ASM cells but there was no difference in WNT-5a and TGF-β1 genes expression. Supression of eosinophils integrins reduced their adhesion to ASM cells, WNT-5a, TGF-β1, collagen and fibronectin genes expression in ASM cells as well as ASM cells proliferation.
8
PADĖKA
Noriu nuoširdžiai padėkoti savo baigiamojo magistro darbo vadovui prof. dr. Kęstučiui Malakauskui už galimybę kartu dirbti, pagalbą ir patarimus ruošiant šį darbą. Taip pat, konsultantui – dokt. Andriui Januškevičiui už kantrybę ir vertingus patarimus. Dr. Deimantei Hoppenot, Laurai Tamašauskienei ir Virginijai Kalinauskaitei-Žukauskei už pacientų atranką, klinikinį jų ištyrimą; Kristinai P., Kristinai M., Editai P., Editai G., Jurgitai, Simonai ir visai šeimai už palaikymą.
9
INTERESŲ KONFLIKTAS
10
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Mokslinis tyrimas buvo atliktas 2014 – 2016 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos, Pulmonologijos ir imunologijos klinikos, Pulmonologijos laboratorijoje, gavus Kauno regioninio Biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (BE-2-13) (kopija 3 priede). Šis tyrimas yra dalis Mokslininkų grupių projekto “Eozinofilų įtaka bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijai sergant astma”, finansavimo numeris MIP-010/2014 bendradarbiaujant su Nyderlandų Groningeno Universitetu.
11
SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI IR SANTRUMPOS
BLR – bronchų lygieji raumenys
BSA – jaučio serumo albuminas (angl. bovine serum albumin)
CD – leukocitų diferenciacijos žymuo (angl. cluster of differentiation)
DMEM –Dulbeko modifikuota Eagle subalansuota ląstelių auginimo terpė (angl. Dulbecco’s modified Eagle medium)
DNR – deoksiribonukleorūgštis
ECP – eozinofilų katijoninis baltymas (angl. eosinophil cationic protein) EDN – eozinofilų neurotoksinas (angl. eosinophil-derived neurotoxin) EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis (angl. ethylenediaminetetraacetic acid) EPO – eozinofilų peroksidazė (angl. eosinophil peroxidase)
FBS – embrioninis jaučio serumas (angl. fetal bovine serum)
FcεRI – didelio afiniškumo imunoglobulinų E receptorius (angl. high-affinity IgE receptor) Fz – Frizzled receptoriai
GINA – globalinė astmos gydymo ir profilaktikos strategija (angl. Global Initiative for Asthma)
GM-CSF – granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)
GSK3 – glikogeno sintazė kinazė 3 (angl. glycogen synthase kinase 3) HLA-DR/DQ – žmogaus leukocitų antigenų receptoriai
ICAM-1 – tarpląstelinė adhezijos molekulė-1 (angl. intercellular adhesion molecule 1) IgE – imunoglobulinas E
IL- interleukinas
MBP – didysis bazinis baltymas (angl. major basic protein) MMP – matrikso metaloproteinazė
PBS – fosfatinis buferinis druskų tirpalas PGR – polimerazinė grandininė reakcija RNR – ribonukleino rūgštis
RPMI – Roswell Parko Memorialinio Instittuto subalansuota ląstelių auginimo terpė (angl. Roswell Memorial Institute medium)
SEM – standartinė vidurkio paklaida (angl. Standar error of mean)
TGF-β – transformuojantis augimo faktorius beta (angl. transforming growth factor beta) TGF-β1 – transformuojantį augimo faktorių beta1 koduojantis genas
12 Th2 – 2 tipo T limfocitų pagalbininkė ląstelė (angl. type 2 T helper cell)
TLM – tarpląstelinis matriksas
TL-PGR – tikrojo laiko polimerazinė grandininė reakcija (angl. real-time polymeraze chain reaction) VCAM-1 – kraujagyslinių ląstelių adhezijos molekulė-1
Wnt – (angl. wingless/integrase-1)
Wnt/Ca2+ – nuo kalcio priklausomas Wnt signalinis kelias (angl. calcium-dependent pathway) Wnt/PCP – ląstelių poliškumo Wnt signalinis kelias (angl. planar cell polarity pathway) WNT-5a – genas, koduojantis Wnt-5a baltymą
13
ĮVADAS
Astma – tai viena dažniausių lėtinių uždegiminių kvėpavimo takų ligų, kuriai būdinga grįžtamoji kvėpavimo takų obstrukcija. Pasaulyje yra daugiau kaip 235 milijonų segančiųjų astma ir kiekvienais metais dėl šios ligos miršta vidutiniškai apie 250 tūkstančių žmonių (1). Sergantiesiems pasireiškia švokštimas kvėpuojant, kosulys, dusimo priepuoliai bei sunkumo jausmas krūtinėje (2). Šiuos simptomus sukelia padidėjęs kvėpavimo takų reaktyvumas į alergenus ar tam tikrus nespecifinius aplinkos veiksnius.
Sergantieji astma turi genetinį polinkį antigenams specifiškų imunoglobulinų E (IgE) inicijuojamo atsako išsivystymui įvairiems alergenams (3). Astmos patogenezėje dalyvauja daug imuninių ląstelių, tačiau vienos svarbiausių – eozinofilai, T limfocitai, putliosios ląstelės, neutrofilai, epitelinės ląstelės bei jų išskiriami tarpininkai (4). Šių ląstelių išskiriami citokinai, chemokinai ir augimo faktoriai kontroliuoja lėtinį uždegimą, sukeliantį bronchų obstrukciją ir kvėpavimo takų remodeliaciją. Antrojo tipo T limfocitų pagalbininkų (Th2) valdomas bei efektorinių ląstelių, tokių kaip eozinofilai, medijuojamas lėtinis uždegimas keičia mezenchiminių ląstelių funkciją (5). Pakitusios bronchų lygiųjų raumenų (BLR) ląstelės, išskirdamos citokinus, chemokinus bei tarpląstelinio matrikso baltymus, keičia jo sudėtį ir taip prisideda prie kvėpavimo takų remodeliacijos (6). Vienas iš struktūrinių pakitimų, būdingų remodeliacijai, yra BLR masės didėjimas dėl šių ląstelių hipertrofijos bei hiperplazijos (7). Svarbų vaidmenį šiame procese taip pat atlieka eozinofilų išskiriami cisteinil leukotrienai (CysLT), skatindami bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferaciją. Eozinofilai yra pagrindinės uždegiminės ląstelės, išskiriančios transformuojantį augimo faktorių -β1 (TGF-β1), kuris, keisdamas tarpląstelinių baltymų raišką, skatina BLR ląstelių ir fibroblastų proliferaciją, poepitelinę fibrozę bei kitus kvėpavimo takų remodeliacijos procesus (8). Buvo pastebėta, kad padidėjęs TGF-β1 kiekis sergant astma skatina WNT-5a geno raiškos didėjimą BLR ląstelėse (9). Padidėjęs Wnt-5a ligando kiekis gali lemti nekanoninio Wnt signalinio kelio aktyvumo pokyčius taip keisdamas ląstelių proliferaciją, migraciją ir adheziją (10). Tai leidžia manyti, kad sutrikusi šių procesų kontrolė dėl Wnt signalinio kelio aktyvumo pokyčių yra susijusi su astmos patogeneze ir kvėpavimo takų remodeliacija. Nors mechanizmai, kuriais eozinofilai veikia BLR ląstelių išskiriamų tarpląstelinių baltymų genų raišką, nėra pilnai ištirti, yra manoma, kad eozinofilai gali veikti BLR ląsteles ne tik per išskiriamus tarpininkus, bet ir per tiesioginę sąveiką adhezijos principu dalyvaujant integrinams. Šiame tyrime buvo iškelta hipotezė, kad eozinofilai turi tiesioginę įtaką kvėpavimo takų remodeliacijai dėl viduląstelinių signalinių kelių aktyvumo pokyčių. Todėl šio tyrimo metu buvo siekiama nustatyti iš sergančiųjų astma periferinio kraujo išskirtų in vivo alergenu aktyvintų eozinofilų įtaką TGF-β1 ir WNT-5a genų raiškos pokyčiams po eozinofilų adhezijos prie BLR ląstelių. Šių genų raiška BLR ląstelėse tirta kiekybiniu tikrojo laiko polimerazinės grandininės reakcijos metodu.
14 Šio tyrimo rezultatai galėtų suteikti naujos informacijos apie astmos patogenezę bei paūmėjimo epizodus, kurie turėtų būti naudingi ligos eigos prognozavimo ir stebėjimo strategijos kūrimui.Taip pat yra tikimasi, kad šis tyrimas reikšmingai prisidės prie patogenezinio astmos gydymo metodų kūrimo bei paskatins tolimesnius tyrimus šioje srityje.
15
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Tikslas: ištirti in vivo alergenu aktyvintų eozinofilų poveikį bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijai. Uždaviniai:
1. Įvertinti in vivo alergenu aktyvintų eozinofilų adhezijos intensyvumą prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių bei įtaką bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijai.
2. Nustatyti WNT-5a, TGF-β1, kolageno ir fibronektino genų raišką bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse po sąveikos su eozinofilais.
3. Ištirti in vivo aktyvintų eozinofilų integrinus blokuojančio peptido įtaką kvėpavimo takų remodeliacijos vystymuisi.
16
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Astmos apibrėžimas ir patogenezė
Astma – tai obstrukcinė kvėpavimo takų liga, kuri charakterizuojama, kaip lėtinis kvėpavimo takų uždegimas, padidėjęs bronchų reaktyvumas, pasikartojantys sutrikusio bronchų laidumo epizodai, pasireiškiantys veržimu krūtinėje, švokštimu, dusuliu ar kosuliu bei išnyksantyts savaime ar gydant, ir kvėpavimo takų remodeliacija (11-13). Tai daugiakomponentė liga, kuri apima tiek genetinius, tiek aplinkos veiksnius bei jų tarpusavio sąveiką (14). Veiksniais, sukeliančiais astmą, gali būti gyvenimo būdas, aplinkos užterštumas, infekcijos sukėlėjai, mitybos pokyčiai, rūkymas, alergija, gastroezofaginis refliuksas, profesniai veiksniai. Astmos paūmėjimai dažniausiai kontroliuojami įkvepiamais kortikosteroidais (15). Eksperimentiniai ir klinikiniai tyrimai parodė, kad lėtinis neinfekcinis kvėpavimo takų uždegimas lemia šios ligos klinikinę eigą, sunkumą bei skiriamo gydymo efektyvumą.
Astma skiriama į dvi pagrindines kategorijas: alerginę, kurios kilmę bei eigą lemia alergenai, ir nealerginę, kai šių veiksnių neįtariama arba nustatyti nepavyksta.
Alerginė astma – viena dažniausių klinikinių astmos fenotipų. Jos skiriamasis bruožas yra alergeno ir pakitusio organizmo imuninės sistemos atsakas, sukeliantis plaučių audinio ir sisteminį uždegimą. Pagrindiniai alergenai, sukeliantys alergines kvėpavimo takų ligas, yra namų dulkių erkės (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae), grybeliai, jų sporos, naminių gyvūnų epidermis (dažniausiai kačių, šunų), medžių, žolių ir piktžolių žiedadulkės, kurie paprastai neveikia sveikųjų . Taip pat, neseniai pasirodė mokslinių publikacijų, kuriose klimato kaita nurodoma kaip viena iš galimų priežasčių dėl ko sergančiųjų alerginėmis ligomis skaičius kasmet didėja (16). Alerginis rinitas yra astmos rizikos veiksnys - 80 proc. asmenų, sergančiųjų astma, kartu diagnozuojamas ir alerginis rinitas (17).
Kvėpavimo takų uždegimas astmos metu susijęs su eozinofilais bei CD4+ limfocitais ir jų 2-o tipo T limfocitų pagalbininkų išskiriamais citokinais, interleukinais (IL)-4, IL-5 ir IL-13. Ląstelės ir įvairūs jų išskiriami mediatoriai sukelia pokyčiai kvėpavimo takuose. Šie pokyčiai vadinami kvėpavimo takų remodeliacija ir yra vienas pagrindinių astmos metu vykstančių kvėpavimo takų struktūrinių pokyčių bruožų (18). Remodeliacijos procesas apima struktūrinius plaučių ir kvėpavimo takų lygiųjų raumenų ląstelių hipertrofiją ir hiperplaziją, taurinių ląstelių metaplaziją, bronchų kraujagyslių remodeliaciją, pamatinės membranos sustorėjimą bei subepitelinę fibrozę (19). Struktūriniai kvėpavimo takų pokyčiai lemia stipresnį kvėpavimo takų reaktyvumą , plaučių funkcijos sumažėjimą ir kvėpavimo takų obstrukciją (20). Astma sergančiųjų gyvenimo kokybę mažinančiųjų priežasčių yra kvėpavimo takų obstukcija, kurios korekcijai skiriami bronchodilatatoriai ar įkvepiami
17 kortikosteroidai, tačiau nemaža dalis pacientų lieka prie simptominio gydymo, kur dažniausiai ir pasireiškia lėtinis uždegimas bei kvėpavimo takų remodeliacija (21).
1 pav. Imunohistochemiškai nudažyti histologiniai sveikų asmenų ir sergančiųjų lengva arba vidutinio sunkumo astma pacientų bronchų sienelės preparatai
1 – astmos metu sustorėjusi pamatinė membrana; 2 – padidėjusi bronchų lygiųjų raumenų masė (22).
1.2 Ankstyvos ir vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas
Alerginis uždegimas yra svarbus patofiziologinis alerginės astmos bruožas. Alerginės reakcijos skiriamos į ankstyvą ir vėlyvą reakciją. Besitęsiantis lėtinis uždegimas sukelia struktūrinius kvėpavimo takų pokyčius, o ilgainiui pažeidžia ir plaučių funkciją. Tiesa, ne visiems asmenims, sergantiems alergine astma, išsivysto vėlyvoji astminė reakcija. Šis mechanizmas dar nėra gerai ištirtas. Daugėja duomenų, rodančių, kad alergenų sukelto kvėpavimo takų uždegimo ypatumus, vėlyvąją fazę lemia ląstelės, tokios kaip eozinofilai, neutrofilai ir/ar pakitusios jų funkcijos (chemotaksis, fagocitozė, reak-tyviosios deguonies formos, apoptozė) (23, 24).
Alerginių reakcijų metu audinius infiltruoja eozinofilai. Į audinius migravę eozinofilai išskiria daug citotoksinių molekulių, TGF-β1 ir IL-5. Kartu su eozinofilais migravę 2-o tipo T limfocitai pagalbininkai išskiria gausybę mediatorių, kurie dar labiau susitiprina putliųjų ląstelių ir eozinofilų migraciją.
Ankstyva kvėpavimo takų uždegimo fazė sergant alergine astma atsiranda per pirmas minutes nuo alergeno patekimo į įsijautrinusio organizmo kvėpavimo takus. Imunoglobulino (Ig)E molekulės jungiasi prie putliųjų ląstelių didelio afiniteto receptorių antikūno Fc fragmentų (angl. high-affinity IgE receptors, FcεRI). Aktyvintos putliosios ląstelės išskiria citokinus IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8,
18 IL-16, naviko nekrozės faktorių (angl. tumor necrosis factor, TNF)α, granuliocitų-monocitų kolonijas stimuliuojantį veiksnį (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), kraujagyslių endotelio audimo veiksnį A (angl. vascular endothelial growth factor A, VEGFA), histaminą, hepariną, įvairius fermentus. Šie mediatoriai sergantiems alergine astma sukelia šiuos ūminius patofoziologinius pokyčius: kraujagyslių išsiplėtimą ir jų sienelės laidumo padidėjimą, audinių paburkimą, stimuliuoja jutiminių nervų nociceptorius, sukelia lygiųjų bronchų raumenų susitraukimą, padidina gleivių sekreciją. Dėl besikeičiančio kvėpavimo takų pralaidumo sutrikimo jaučiami būdingi astmos simptomai: dusulys, kosulys, švokštimas. Alergenas susijungęs su IgE ir FcεRI molekulių kompleksu, esančiu ant putliųjų ląstelių paviršiaus, skatina šias ląsteles dar aktyviau išskirti naujus mediatorius. Mažėja kvėpavimo takų pralaidumą, uždegiminės ląstelės iš kraujo telkiasi uždegimo židinyje - plaučiuose. Tai vyksta dėl TNF-α poveikio kraujagyslės endotelio adhezijos molekulėms, chemoatraktantų LTB4 ir PGD 2, chemokinų IL-8 ir C-C chemokino ligando 2 (CCL2). Visa tai yra vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo pradžia.
2 pav. Ankstyvos fazės alergeno sukeltas kvėpavimo takų uždegimas
FcεRI − didelio afiniteto receptorius antikūno Fc fragmentui; IgE – imunoglobulinas E; IL – interleukinas; LT – leukotrienas; PGD2 – prostaglandinas D2; TNF-α – tumoro nekrozės veiksnys alfa; VEGFA − kraujagyslių endotelio augimo veiksnys A; PAF – trombocitus aktyvinantis veiksnys; CCL2
– C-C chemokino ligandas 2. (pagal Galli S.J., 2008) (25).
Vėlyva kvėpavimo takų uždegimo fazė tai įgimto ir specifinio imuninio atsako ląstelių, esančių kvėpavimo organuose ir priplūstančių iš sisteminės kraujotakos, taip pat ir jų išskiriamų mediatorių veiklos rezultatas. Vėlyvos fazės uždegimo kvėpavimo takuose požymiai paprastai atsiranda praėjus 2–6h po alergeno patekimo ir ankstyvosios fazės uždegimo. Manoma, kad leukocitų susitelkimą
19 uždegimo židinyje skatina putliųjų ląstelių mediatoriai, o kiek vėliau – ir aktyvintų 2-o tipo T limofictų pagalbininkų išskirti citokinai (IL-5 ir GM-CSF) . Putliosios ląstelės toliau išskiria įvairius mediatorius, kurie tiesiogiai ir netiesiogiai skatina uždegiminių ląstelių migraciją į uždegimo židinį, stimuliuoja kitas ląsteles (26). Astmos simptomai atsiranda dėl struktūrinių kvėpavimo takų ląstelių ir periferinio kraujo leukocitų, priplūstančių į kvėpavimo takuose esantį alerginio uždegimo židinį, veikimo (27). Vėlyvos fazės uždegimo svarbiausios ląstelės yra eozinofilai, T limfocitai pagalbininkai, neutrofilai makrofagai, kurie ne tik susikaupia uždegimo židinyje, bet po aktyvacijos alergenu išskiria mediatorius, žalojančius kvėpavimo takų audinius bei sukeliančius lėtinį uždegimą (28). Manoma, kad vėlyvos fazės uždegimas geriausiai atspindi astmos patogenezės esmę, o jo tyrimai – svarbiausi aiškinant astmos išsivystymą.
3 pav. Vėlyvos fazės alergeno sukeltas kvėpavimo takų uždegimas
IL – interleukinas; TNF-α – tumoro nekrozės veiksnys alfa; LT – leukotreinas; GM-CSF – granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis veiksnys; Th – T limfocitas pagalbininkas; MMP
– matrikso metaloproteinazė (pagal Galli S.J., 2008) (25).
1.3 Eozinofilai
1.3.1 Eozinofilų apibūdinimas
Eozinofilai sudaro 1-3 proc. cirkuliuojančių leukocitų sveikų asmenų kraujyje (29) ir yra lengvai atskiriami pagal branduolio struktūrą bei granuliuotumą. Granulės užima penktadalį eozinofilo citoplazmos. Eozinofilų funkcijos siejamos su alerginėmis reakcijomis bei parazitinėmis infekcijomis, nes jų granulėse yra citotoksinių medžiagų (30, 31). Naujausi tyrimai atskleidžia, kad eozinofilai taip
20 pat kovoja ir su kvėpavimo takų virusinėmis infekcijomis (32). Efektorinė eozinofilų funkcija yra išskirti toksinius granules baltymus, reaktyvias deguonies formas, citokinus ir lipidinius mediatorius (24, 33, 34). Eozinofilų pagrindinis šarminis baltymas (angl. major basic protein – MBP) sudaro apie 50 procentų granulių, likusią dalį sudaro eozinofilinis katijoninis baltymas (angl. eosinophilic cationic protein – ECP), eozinofilų-išskiriamas neurotoksinas (angl. eosinophil-derived neurotoxin – EDN) ir eozinofilų išskiriama peroksidazė (angl. eosinophil peroxidase – EPO). Nustatyta, kad eozinofilai taip pat gali išskirti ir C4 leukotrieną, kuris veikia kaip bronchų lygiųjų raumenų konstriktorius ir sukelia gleivių hipersekreciją (35). Taip pat, eozinofilai yra itin svarbus citokinų ir augimo faktorių šaltinis. Iš kaulų čiulpų sutelkti eozinofilai degranuliuoja, o eozinofilų išskirtos granulės ne tik kovoja prieš uždegimo sukėlėją, tačiau ir žaloja aplinkinius audinius. Eozinofilai turi daug įvairių funckijų, todėl tiesiogiai ar netiesiogiai veikia kitas uždegimines ląsteles ir jų aplinką . Nors eozinofilai laikomi citotoksinėmis efektorinėmis ląstelėmis, tačiau naujausi tyrimai rodo, kad taip pat eozinofilai veikia ir molekulinius signalinius kelius, atsakingus už imuninį atsaką (36). Vietinis eozinofilų kaupimas yra susijęs su alerginių ligų, tokių kaip alerginė astma, patogeneze (30, 31). Schwartz ir kt. nustatė, kad eozinofilų skaičius atspindi astmos aktyvumą ir gali būti naudojamas ankstyviems paūmėjimams nustatyti. Mokslininkų komanda rado stiprų ryšį tarp periferinio kraujo eozinofilų skaičiaus ir kvėpavimo takų reaktyvumo (37). Tačiau tikslus eozinofilų vaidmuo astmos patogenezės metu lieka nežinomas.
1.3.2 Eozinofilų reikšmė astmos patogenezei
Alerginė astma pasireiškia po kontakto su alergenu. Eozinofilai yra vienos iš pagrindinių ląstelių, dalyvaujančių alerginės astmos patogenezėje ir uždegimo procesuose (29, 31).
Įkvėpto alergeno aktyvinti 2 tipo T limfocitai pagalbininkai (Th2) išskiria IL-5, kuris veikia kaulų čiulpuose esančias CD34+ progenitorines ląsteles (29). Šių progenitorinių ląstelių paviršinė membrana turi daug IL-5 receptorių, todėl interleukino signalai lemia eozinofilų vystymąsi kaulų čiulpuose . Šį procesą slopina 1-o tipo T limfocitai pagalbininkai per išskiriamus citokinus (38). Eozinofilų migraciaji į plaučius svarbūs IL-3, GM-CSF ir eotaksinas. Kuomet eozinofilai migruoja į organą, IL-4 ir IL-13 veikia jų adheziją prie kraujagyslių sienelių, o IL-5 ir GM-CSF veikia organo infiltraciją eozinofilais ir skatina pastarųjų efektorines funkcijas, tuo pačiu eozinofilai išgyvena audiniuose daug ilgiau.
Plaučiuose eozinofilai atlieka daugelį funkcijų, kurios gali būti atsakingos už ligos eigą. Eozinofilai yra atsakingi už reaktyviųjų deguonies formų (RDF) susidarymą ir išskiria toksines granules bei citokinus (IL-13, IL-5, TGF-β), chemokinus (CCL-11, CCL22, matricos
21 metaloproteinazes, granulių mediatorius ir kt.) (39), dėl ko sukeliami klinikiniai astmos simptomai – pasireiškia padidėjęs kvėpavimo takų reaktyvumas, kvėpavimo takų remodeliacija . Astmos epizodų metu, CC chemokino receptorius (CCR)3 yra tiesiogiai įtrauktas į uždegiminių ląstelių, daugiausiai eozinofilų, kaupimą plaučiuose. Eozinofilai veikdami per citokinus, chemokinus, augimo faktorius yra daugiafunkcinės ląstelės, sukeliančios uždegimą, remodeliaciją bei sujungiančios įgimtą ir įgytą imunitetą (40).
Sveiko asmens eozinofilai kraujyje išgyvena 5 h, o audiniuose – net iki 8–12 dienų, tačiau sergant astma išgyvenamumas audiniuose padidėja.
4 pav. IL-5 ir eotaksino sukelta eozinofilų migracija iš kaulų čiulpų į plaučius sergant alergine astma
Įkvėpti alergenai aktyvina 2-o tipo T limfovitų pagalbininkų (Th2 limfocitus) ir putliąsias ląsteles, kurie išskiria IL-4, IL-5, IL-13. Šie citokinai stimuliuoja plaučių epitelines ląsteles, fbroblastus ir bronchų lygiųjų raumenų ląsteles išskirti eotaksiną. IL-5 reguliuoja eoziniofilų migraciją iš kaulų čiulpų į plaučius, o eotkasinas – eozinofilų CCR3 receptorių, kuris padeda migruoti per plaučių
audinius (41).
Įvairiuose žmogaus ir eksperimentiniuose alerginės astmos modelių tyrimuose daugiausiai dėmesio skiriama eozinofilų skaičiaus sumažinimui, dėl kurio turėtų lengvėti ir astmos simptomai. Tai rodo, kad būtent eozinofilai yra pagrindinės ląstelės, dalyvaujančios astmos patogenezėje (42).
22 1.4 Remodeliacijos samprata
1.4.1 Kvėpavimo takų remodeliacija sergant astma
Kvėpavimo takų remodeliacija apibūdinama kaip struktūriniai epitelio pokyčiai, subepitelinė fibrozė, padidėjusi bronchų lygiųjų raumenų masė, sumažėjęs atstumas tarp bronchų lygiųjų raumenų ir epitelio sluoksnių, liaukinių ir taurinių ląstelių hiperplazija, kraujagyslių tinklo pakitimai, edema, tarpląstelinio matrikso baltymų kokybiniai ir kiekybiniai pokyčiai, kurie neigiamai veikia plaučių funkciją ir sukelia klinikinius astmos požymius (43).
Eozinofilai yra svarbiausios uždegiminės ląstelės astmos metu, kurios veikia ir bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijoje veikiant netiesiogiai per jų išskirtus citokinus bei tiesiogiai per integrino-ligando kontaktą. Nustatyta, kad integrinai įtakoja bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijos procesą ir kontraktilinių baltymų raišką po kontakto su alergenu gyvūnų alerginės astmos modelyje (44).
Eozinofilai savo paviršiaus membranoje ekspresuoja keletos tipų integrinus, kurie yra atsakingi už ląstelės-ląstelės ir ląstelės-tarpląstelinio matrikso sąveiką . Molekuliniai mechanizmai yra susiję su kompleksiniais signaliniais keliais alerginės astmos metu. Greta šių, jau gerai žinomų kvėpavimo takų patofiziologinių pokyčių, naujausi tyrimai nurodo tarpląstelinį matriksą kaip naują ir itin svarbų veiksnį, turintį įtakos kvėpavimo takų remodeliacijos vystymuisi sergant astma.
Uždegimas yra atsakas į audinio pažeidimą. Siekiant atitaisyti pažeistus audinius pasireiškia uždegiminis atsakas. Tam, kad būtų užtikrintas audinių ir orgnanų vientisumas ir funckija, reikalinga greita audinių reparacija, tačiau sutrikus reparacijos procesams, organas perauga jungiamuoju audiniu – fibrozė. Astmos metu labiausiai pažeidžiamas kvėpavimo takus dengiantis epitelis, taurinės ląstelės, padidėja bronchų lygiųjų raumenų ir fibroblastų proliferacija, ir pastarieji diferencijuoja į miofibroblastus (45). Du pagrindiniai BLR remodeliacijos veiksniai - padidėjusi BLR masė bei TLM pasiskirstymas - yra glaudžiai susiję su lėtiniu kvėpavimo takų uždegimu bei daugelio autorių siejamu astmos ligos sunkumu, esant padidėjusiam eozinofilų skaičiui bronchoalveoliniame skystyje bei indukuotuose skrepliuose (46). Astmai būdinga kvėpavimo takų obstrukcija dažniausiai yra grįžtamas procesas, tačiau kai kuriems pacientas būdingi negrįžtami pokyčiai dėl padidėjusios BLR ląstelių masės. BLR ląstelių masė didėja dėl hipertrofijos ir hiperplazijos. Šis raumeninio sluoksnio padidėjimas siejamas su ligos sunkumu ir trukme. Esant stabiliai astmai, padidėjusi BLR masė sumažina sienelės elsatingumą, dėl ko sunkėja oro patekimas į plaučius. Ūmios astmos metu, be bronchų obstrukcijos, kvėpavimo takai būna jautresni, kas dar pasunkina astmos simptomus.
BLR remodeliacija yra susijusi su įvairių tipų fibroze, kurią lemia sutrikusi TLM degradacija bei pasiskirstymas (47). Dėl šių pokyčių padaugėja kolageno, fibronektino ir kitų tarpląstelinio matrikso
23 baltymų. Taip pat vyksta intensyvi angiogenezė, storėja pamatinė membrana. Tyrimuose, kuriuose BLR ląstelės buvo inkubuojamos su serumu, TGF-β1, LTD4, o tai paskatino didesnę fibronektino, perlekano, elastino, laminino, trombospondino, chondroitino sulfato, I, II, III, IV ir V tipo kolageno, versikano bei dekorino raišką (48, 49). Šie tyrimai rodo, kad BLR ląstelės, veikiamos uždegiminiai mediatoriais geba produkuoti įvairius tarpląstelinio matrikso baltymus.
1.4.2 Tarpląstelinio matrikso baltymai
Tarpląstelinį matriksą sudaro koordinuotas kolagenų, elastinių skaidulų, hialurono ir proteoglikanų tinklas. Šie baltymai veikia kaip ląstelių apsauga kuomet audiniai patiria mechaninį stresą. Dažniausiai užpildą tarp ląstelių sudaro I tipo kolageno skaidulos ir fibronektinas, kurie suteikia audiniams formą. Kiti tarpląstelinį matriksą sudarantys baltymai kokybiškai ir kiekybiškai kinta priklausomai nuo audinio, organo ir jo funkcijos (50). Pavyzdžiui, dažniausiai chondroitino sulfatas, gliukozaminoglikanai randami tarpląsteliniame matrikse, kuris sudaro kremzles, raiščius ar yra didžiųjų arterijų sienelėse, suteikdami jungiamąjam audiniui struktūrinį vientisumą. Epitelinės ląstelės tvirtinasi prie pamatinės membranos, kuri reguliuoja šių funkcijas, lemia poliškumą bei diferenciaciją.
Kolagenai yra pagrindiniai tarpląstelinio matrikso baltymai, randami beveik visame organizme. Jų šeimą sudaro mažiausiai 28 skirtingi tipai ir nors ne visi įeina į tarpląstelinio matrikso sudėtį, visus vienija bendras struktūrinis motyvas – iš trijų baltymo subvienetų sudarytos spiralinės skaidulos. Motyvai susideda iš trijų α polipeptidinių spiralių, turinčių (G-X-Y)n pasikartojimus, kuriuose X - dažniausiai prolinas, o Y – hidroksiprolinas. Kiekvienas kolagenas turi bent vieną trigubosios spiralės domeną, orientuotą tarpląsteliniame matrikse, kurių pagrindu formuojami supermolekuliai agregatai. Pagrindiniai tarpląstelinio matrikso kolagenai yra skirstomi į I, II, III, IV, V ir glikozaminoglikano turintį XI tipus . Šių tipų kolagenai sudaro struktūrinį audinių pagrindą bei kitų tarpląstelinio matrikso baltymų jungimosi vietas.
Dauguma tarpląstelinį matriksą sudarančių kolagenų yra vadinami – pluoštiniais kolagenais. Nors klasikiniai pluoštus sudarantys kolagenai yra I ir III tipo, pirmojo tipo kiekybiškai išlieka pačiu svarbiausiu. Įvairūs baltymų sintezės bandymai, struktūrinės analizės tyrimai bei kiti eksperimentai yra paremti naudojant būtent šio tipo kolageną, kuris yra esminis audinių mechaninei jėgai, odos, kaulų, sausgyslių, dantų, ragenos ir odenos sudėčiai. Visuminis sausgyslių vizualinis ištyrimas parodė, kad I tipo kolagenas (sudarantis apie 90-95% sauso audinio svorio) iš esmės yra ilgas, itin orientuotas pluoštas. Dar išsamesni tyrimai su elektroniniu mikroskopu, po atitinkamo fiksavimo bei dažymo atskleidė, kad pluoštai sudaryti iš mažesnių, identiškų ir lygiagrečių mikrofilamentų.
24 Nepaisant to, kad pagrindinė kolageno funkcija yra statybinė, jis tai pat dalyvauja viduląsteliniame signalo perdavime. Buvo nustatyta, kad kolagenas gali skatinti ląstelių gyvybingumą in vitro, slopindamas apoptozės procesą priklausomai nuo β1 integrinų valdomų mechanizmų (51).
Taip pat kolagenas aktyviai dalyvauja reguliuojant ląstelių pasiskirstymo (pasklidimo) procesą . Kita svarbi ląstelių funkcija – jų proliferacija taip pat susijusi su kolagenu, kuris aktyvuodamas FAK signalinį kelią nukreipia signalą tolimesniam perdavimui per Src, MEL, PI3-kinazes ar p38 MAPK signalinius kelius (52). Galiausiai, kolagenas prisideda ir prie ląstelių migracijos valdymo, per FAK ir PI3-K aktyvaciją, lemiančią padidėjusį Rac1 aktyvumą, kaip tolimesnį veiksnį lemiantį ląstelių migraciją (53, 54).
Fibronektinas - visame organizme aptinkamas, ilgos molekulinės struktūros glikoproteinas, susidedantis iš dviejų subvienetų, sujungtų disulfidiniu tilteliu. Tai daugiadomeninis baltymas, susidedantis iš pasikartojančių struktūrinių motyvų, bendrai sudarančių funkcionuojantį makrodomeną. Specifiniai fibronektino domenai gali sąveikauti su kolagenu, fibrinu, fibulinu, heparinu, TGF-β, tiek ir su pačiu fibronektinu . Hepatocitų išskiriamas fibronektinas į kraujo plazmą pasižymi tirpia savo forma, tuo tarpu fibronektinas, kurį išskiria fibroblastai, epitelio ląstelės ir kitos ląstelės – yra netirpios formos. Plazminis fibronektinas gali patekti į audinius ir tapti fibrilinio matrikso dalimi . Fibronektino mRNR turi tris alternatyvius splaisingo vietas (EDA, EDB ir IIICS), sudarančias žmogaus organizme iki 20 skirtingų geno variacijų . Kiekis, kiek genas bus nuskaitomas nuo vienos iš splaisingo vietų bei sintezuojamo fibronektino proporcijos skiriasi priklausomai nuo organizmo vystymosi stadijos bei patologinių procesų. EDA ir EDB egzonai yra linkę nefunkcionuoti daugelyje suaugusių audinių, tačiau jie yra įtraukiami vykstant audinių persitvarkymo procesams, kaip žaizdų gyjimas .
Kartu su gerai apibrėžtu fibronektino struktūriniu vaidmeniu, jis taip pat turi ir ląstelių elgsenos valdymo funkcijas dėka jo sąveikos su ląstelių integrinais . Po fibronektino sąveikos su ląstelių paviršiumi susidaro integrinų klasteris, kuriuo yra reguliuojami esminiai aktino citoskeleto persitvarkymo etapai bei konkrečių genų raiška užtikrinant ląstelių migracijos proceso sužadinimą (55). Fibronektinas svarbus ne tik valdant ląstelių migraciją ir jų pasiskirstymą audiniuose, jis taip pat svarbus ir ląstelės išgyvenamumui ir proliferacijai (56).
Fibronektino polimerizacijos ir makrodomenų susiformąvimo slopinimas gali suteikti naujų terapinių galimybių įvairių ligų gydymui. Atliekant tyrimus su eksperimentiniais kepenų, kraujagyslių bei fibroziniais modeliais bei panaudojant fibronektino polimerizaciją slopinančius peptidus buvo nustatytas padidėjęs kolageno nusėdimas, kartu pastebint ir ankstyvąją leukocitų infiltraciją ir padidėjusią ląstelių proliferaciją. Taip pat, sužadintas fibronektino nusėdimas ir kolageno sukelta audinių remodeliacija buvo eksperimentiškai valdoma pritaikant šių slopinančių peptidų terapiją (57).
25 1.4.3 Tarpląstelinio matrikso vaidmuo sergant astma
Sergant astma, vyraujantis kvėpavimo takų eozinofilinis uždegimas sutrikdo tarpląstelinio matrikso reguliaciją, pasireiškiant kiekybiniais ir kokybiniais tarpląstelinio matrikso sudėties pokyčiais bei sutrikusia už jų apykaitą atsakingų molekulinių signalinių kelių aktyvacija (58). Tarpląstelinio matrikso kiekybiniai ir kokybiniai pokyčiai yra vienas iš kvėpavimo takų sienelės remodeliacijos bruožų, apibūdinančių astmą ir lėtinę obstrukcinę plaučių ligą (59). Tačiau molekuliniai tarpląstelinio matrikso pokyčių mechanizmai kol kas lieka neaiškūs. TGF-β1 yra svarbus kvėpavimo takų remodeliacijos mediatorius sergant astma, kuris stimuliuoja BLR ląsteles diferencijuoti į kontratiliškesnį ir hipertrofišką fenotipą (60). TGF-β1 signalinis kelias yra aktyvinamas per ligandų prisijungimą prie heteromerinių receptorių, kurie fosforilina Smad baltymus. Šie baltymai pereina per branduolio membraną ir kartu su kofaktoriais reguliuoja genų raišką (61). Kontraktilinių baltymų genų promotoriai, tokie kaip transgelinas (SM22), kalponinas ir α–lygiųjų raumenų aktinas (α-SMA) bei prokolagenas I ir prokolagenas III, turi elementus, reaguojančius į TGF-β1 ir SRF . TGF-β1 signalinio kelio blokavimas sumažina kvėpavimo takų remodeliacijos pasėkmes, sukeltas pelių provokacijos alergenu (62, 63). I ir III tipo kolagenų kiekio padidėjimas tarp lygiųjų raumenų ląstelių ir subepiteliame sluoksnyje sukelia sienelės sustorėjimą ir sumažina sienelės elastingumą, dėl ko bronchai nebegali pakankamai išsiplėsti (64).
Vienas iš būdingiausių astmos patologinių bruožų yra kvėpavimo takų sienelės storėjimas (7), kurie lemia BLR ląstelių hipertrofija ir hiperplazija bei sutrikusi tarpląstelinio matrikso apykaita. Pagrindiniai plaučių tarpląstelinio matrikso baltymų šaltiniai yra plaučių fibroblastai ir BLR ląstelės. Tarpląstelinis matriksas pasižymi tiesioginiu poveikiu pačių plaučių struktūrinių ląstelių aktyvumui (65).
Sutrikusi tarpląstelinio matrikso baltymų produkcija yra susijusi su pagrindinio profibrotinio faktoriaus - tranformuojančio augimo faktoriaus beta-1 (TGF-β1) aktyvuojamais Wnt ir Smad signaliniais keliais. Didžiausius TGF-β1 kiekius kvėpavimo takuose išskiria eozinofilai – vienos iš pagrindinių astmos patogenezėje dalyvaujančių uždegiminių ląstelių. Stabilios astmos, o ypač alergeno išprovokuoto ūmaus astmos epizodo metu, eozinofilai migruoja į kvėpavimo takus, didina vietinę TGF-β1 koncentraciją bei išskiria kitus, svarbius citokinus, chemokinus ir augimo faktorius netoli jungiamojo audinio bei bronchų lygiųjų raumenų sluoksnių.
Be baltymų tarpląsteliniame matrikse astmos metu taip pat randama daugelis augimo faktorių ir citokinų, įskaitant fibrobastų augimo faktorių (FGF)-1,-2 ir transformuojantį augimo faktorių (TGF)-β1, kurie ir sukelia tarpląstelinio matrikso baltymų kiekybinius ir kokybinius pokyčius bronchų sienelėje. Vieni iš svarbiausių augimo faktorių yra TGF-β1 ir FGF-1, kurie stimuliuoja I ir III tipo kolageno suaktyvėjusį susidarymą bronchų lygiųjų raumenų ląstelėse. Taip pat, gausesniam baltymų
26 susidarymui įtakos turi ir sumažėjęs matrikso metaloproteinazių (MMP) aktyvumas, nes bronchų lygiųjų raumenų ląstelės lėtinių kvėpavimo takų ligų metu pradeda produkuoti MMP inhibitorius .
Tikimasi, kad radus gydymą, kuris mažintų remodeliacijos sukeliamus funkcijos sutrikimus, būtų galima sumažinti kvėpavimo takų reaktyvumą ir astmos simptomus (66).
Eozinofilų išskiriamas TGF-β1 sukelia tarpląstelinio matrikso produkciją. Taip pat eozinofilai svarbūs ir bronchų lygiųjų raumenų ląstelių proliferacijoje. Halwani ir kiti 2013 metais įrodė, kad blokuojant eozinofilų prijungimą prie BRL ląstelių, naudojant specifinius antikūnus ar blokuojant cisteinil leukotrienus išskirtus eozinofilų, buvo susiję su BLR ląstelių sumažėjusia proliferacija .
Šiuo metu duomenų apie alergenu aktyvintų eozinofilų ir BLR ląstelių tarpusavio sąveiką yra itin nedaug .
1.5 Wnt signalinių kelių sampranta 1.5.1 Wnt signaliniai keliai
Wingless baltymas/integrazė-1 (WNT) signalinis kelias reguliuoja daugelį organų vystymosi procesų ir neįprasta jo aktyvacija gali sukelti ligą. Sharma ir kt. (2010) patvirtino, kad genų polimorfizmas WNT signaliniame kelyje yra susijęs su sutrikusia plaučių funkcija vaikams, sergantiems astma (67). Wingless/integrazė-1 siganilinis kelias yra atsakingas už normalų plaučių vystymąsi, kuris suaugusiame organizme įsijungia, kuomet yra plaučių audinio pažeidimas (68). WNT ligandai yra konservatyvūs tarp skirting rūšių. Naujausi tyrimai atskleidžia, kad WNT signalinis kelias dalyvauja tokiuose procesuose kaip uždegimas, audinių pažaidų taisymas bei organų sistemų, tarp jų ir plaučių, remodeliacija (69-71).
Prie kvėpavimo takų remodeliacijos galimai prisideda Wnt (wingless/integrase-1) signaliniai keliai. Wnt šeimą sudaro 19 pagal aminorūgščių seką stipriai homologiškų glikoproteinų, veikiančių per 10 skirtingų Frizzled (Fz) receptorių (69). Jungdamiesi prie Fz receptorių, šie Wnt ligandai aktyvuoja Wnt signalinį kelią, kuris sukelia ląstelinius pokyčius, reguliuojančius įvairius biologinius procesus: embriono vystymąsi, ląstelių baigtį, proliferaciją, migraciją, onkogenezę, ląstelių pyktybėjimo supresiją, audinių homeostazės ir kamieninių ląstelių pliuripotencijos palaikymą (72). Gali būti aktyvuojami du skirtingi Wnt signaliniai keliai: kanoninis (nuo β-katenino priklausantis) arba nekanoninis (nuo β-katenino nepriklausantis).
Kanoninis Wnt signalinis kelias – tai signalinis kelias, kuriame β-kateninas atlieka svarbų vaidmenį, aktyvuodamas įvairių genų transkripciją. Kai Wnt signalinis kelias nėra aktyvuotas (3A pav.), β-kateninas yra degraduojamas dėl aktyvaus β-katenino destrukcijos komplekso, kurį sudaro aksinas,
27 adenomatozinės polipozės coli baltymas (APC), glikogeno sintezės kinazė 3 (GSK3), kazeino kinazė-1α (CKkinazė-1α). GSK3 bei CKkinazė-1α fosforilintas β-kateninas yra ubikvitininamas ir tai skatina proteosominę jo degradaciją (73). Tačiau ligandui prisijungus prie Fz receptorių ir jų koreceptorių LRP 5/6, yra aktyvuojamas Wnt signalinis kelias ir per sutelktus aktyvuotus DVL (angl. Dishevelled) baltymus blokuojamas β-katenino destrukcijos kompleksas, inhibuojant β-katenino fosforilinimą (5 pav.). Dėl to β-kateninas nėra degraduojamas ir pradeda kauptis citozolyje (74). Stabilizuotas β-kateninas patekęs į branduolį atlieka transkripcijos koaktyvatoriaus funkciją ir, jungdamasis prie TCF/Lef transkripcijos faktorių, reguliuoja taikinių genų transkripciją . Įvairūs augimo faktoriai (taip pat ir TGF-β1) gali aktyvinti nuo β-katenino priklausantį signalinį kelią tiek tiesiogiai, tiek skatindami autokrininę Wnt ligandų produkciją. Stabilizuotas (nefosforilintas) β-kateninas gali aktyvinti įvairius taikinius genus: tarpląstelinio matrikso baltymų, matrikso metaloproteinazių (MMP), augimo faktorių ir uždegimą skatinančių mediatorių bei fermentų (75). Wnt signalinių kelių veikimo principai pavaizduoti 5 ir 6 pav..
5 pav. Kanoninio Wnt signalinio kelio schema
A - neaktyvuotas kanoninis Wnt signalinis kelia B -aktyvuotas kanoninis Wnt signalinis kelias; LRP 5/6 – su mažo tankio lipoproteinų receptoriais susiję baltymai 5/6; CRD – daug cisteino turintis
Frizzled receptoriaus domenas; APC – adenomatozinės polipozės coli baltymas, CK1α – kazeino kinazė-1α, GSK3 – glikogeno sintezės kinazė 3, TCF/Lef – T ląstelių faktorius/limfoidinis stiprinantis
transkripcijos faktorius, β-TrCP kompleksas – beta-transducino pasikartojimų turinčio baltymo kompleksas. (pagal Masckauchan ir Kitajewski, 2006) (76)
Nekanoninis Wnt signalinis kelias – tai signalinis kelias, kuriame nedalyvauja β-kateninas (6 pav.). Šiuo atveju signalas taip pat inicijuojamas per Fz receptorius, tačiau nėra priklausomas nuo LRP 5/6 . Geriausiai išreikšti nekanoniniai Wnt signaliniai keliai yra nuo Ca2+ priklausomas signalinis kelias (Wnt/Ca2+) bei ląstelių poliškumo signalinis kelias (Wnt/PCP).
28 Nekanoniniame Wnt/Ca2+ signaliniame kelyje yra skatinama Ca2+ tėkmė iš endoplazminio tinklo ir yra aktyvuojami jam jautrūs fermentai – baltymų kinazės C (PKC) ir nuo kalmodulino priklausančios kinazės II (CamKII). Šis signalinis kelias slopina nuo β-katenino priklausantį kelią, turi įtakos ląstelių adhezijai, atsiskyrimui ir judėjimui gastruliacijos stadijoje (77). Taip pat jis daro įtaką aktyvuotų T ląstelių branduolio transkripcijos faktoriaus (NFAT) aktyvumui, kuris yra susiję su organogenezės, imuninės sitemos, širdies kraujotakos, nervų sistemos, skeleto raumenų bei kitais sutrikimais (78). Wnt/PCP signalinio kelio metu yra aktyvuojamos c-Jun N-terminal kinazės (JNK) ir su Rho susijusios baltymų kinazės (Rhok) (79, 80). Jų aktyvavimas skatina aktino citoskeleto pokyčius ir koordinuotą ląstelių poliarizaciją bei judėjimą .
6 pav. Nekanoninis Wnt signalinis kelias
DVL – Dishevelled baltymas, Daam1 – su Disheveled susijęs morfogenezės aktyvatorius 1 (angl. Disheveled-associated activator of morphogenesis 1), Rac, Rho – guanozino trifosfato hidrolazės (GTPazės), JNK – c-Jun N-terminal kinazė, RhoK – su Rho susijusi baltymų kinazė, PKC –
baltymų kinazė C , CamKII – nuo kalmodulino priklausanti kinazė II (pagal Masckauchan ir Kitajewski, 2006) (76)
1.5.2 Wnt signalinių kelių reikšmė sergant astma
Wnt signalinis kelias yra svarbus įvairių organų formavimuisi embriono stadijoje (69). Wnt signaliniame kelyje dalyvaujančių baltymų aktyvumo sutrikimai ir Wnt ligandų kiekio pokyčiai gali sutrikdyti normalų embriono vystymąsi (81). Šis signalinis kelias dalyvauja ir kvėpavimo takų bei plaučių morfogenezėje, taigi pastaruoju metu atsiranda vis daugiau įrodymų apie galimą jo reikšmę įvairių kvėpavimo sistemos ligų, ypatingai plaučių vėžio ir plaučių fibrozės, pasireiškimui. Dėl to yra
29 manoma, kad Wnt signalinis kelias galimai prisideda ir prie astmos pasireiškimo bei kvėpavimo takų remodeliacijos.
Sergant astma yra gerokai padidėjusi 19q13.1 chromosomoje esančio TGF-β1 geno raiška (82, 83). Nustatyta, kad padidėjęs TGF-β1 kiekis kvėpavimo takuose skatina WNT-5a geno raiškos didėjimą BLR ląstelėse (9). Manoma, kad TGF-β1 gali veikti WNT-5a raišką per TGF-β-aktyvintas kinazes (TAK1). Šiuo mechanizmu yra stabilizuojamas β-kateninas, kuris, sąveikaudamas su transkripcijos faktoriumi specifiškumo baltymu 1 (Sp1), skatina jo jungimąsi prie WNT-5a geno promotoriaus ir didina jo raišką (84).
Wnt-5a ligandas yra koduojamas WNT-5a gene esančiame 3p14–p21. Tai yra vienas pagrindinių nekanoninių Wnt signalinių kelių ligandų, tačiau jis turi potencialo aktyvinti ir kanoninį signalinį kelią (85). Aktyvindamas Wnt signalinius kelius šis ligandas atlieka svarbų vaidmenį tokiuose procesuose kaip organų morfogenezė, embriogenezė, postnatalinių audinių homeostazės palaikymas ir yra siejamas su įvairių patologinių sutrikimų pasireiškimu (86). WNT-5a raiškos padidėjimas yra siejamas su įvairiais kvėpavimo takų sutrikimais. Padidėjusi jo raiška stebima sergant plaučiu fibroze bei kitomis su fibroze susijusiomis ligomis (9). Įrodyta, kad WNT-5a geno raiška astma sergančiųjų BLR ląstelėse yra apie 2 kartus didesnė nei sveikų žmonių BLR ląstelėse (80). Dėl to padidėja Wnt-5a ligando kiekis ir nekanoninio Wnt signalinio kelio aktyvumas, skatinantis remodeliaciją sukeliančių tarpląstelinio matrikso baltymų (kolageno ir fibronektino) raiškos didėjimą, reguliuojamą per aktyvuotus JNK ir NFAT (10, 80). Taigi galima teigti, kad sutrikęs Wnt signalinio kelio aktyvavimas ir jo valdomų procesų kontrolė prisideda prie astmos patogenezės. Visgi Wnt signalinių kelių įtakos astmai tyrimai yra nauja sritis ir vis dar trūksta duomenų apie tikslius mechanizmus bei jų svarbą šiai ligai.
30
2. METODIKA
2.1 Tyriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga
Mokslinis tyrimas buvo atliktas 2015-2017 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos Pulmonologijo klinikos Pulmonologijos laboratorijoje, gavus Kauno regioninio Biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (BE-2-13). Šis mokslinis tyrimas buvo Lietuvos mokslo tarybos Mokslininkų grupių finansuojamo projekto „Eozinofilų įtaka bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijai sergant astma“ (finansavimo numeris MIP010/2014), vykusio 2014 m. kovo mėn. -2016 m. gruodžio mėn., dalis.
Visi asmenys, pakviesti dalyvauti tyrime buvo supažindinti su mokslinio tyrimo protokolu (protokolo numeris PSUL-010/2014). Apsisprendę dalyvauti tyrime asmenys savo sutikimą patvirtino raštu informuoto asmens sutikimo formoje, dviem egzemplioriais. Vienas sutarties egzempliorius atiduotas tiriamąjam.
2.1.1 Tiriamųjų kontingentas
Tiriamųjų asmenų grupė sudaryta iš Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto, Pulmonologijos skyriaus pacientų Kaune. Dalyvauti moksliniame tyrime atrinkta 19 nerūkančių asmenų: 9 pacientai sirgo nuolatine lengva arba vidutinio sunkumo astma bei 10 sveikų asmenų sudarė kontrolinę grupę. Visiems tiriamiesiems buvo taikomi bendrieji atrankos kriterijai (1 priedas).
Mokslinis tyrimas buvo atliktas 2014 – 2016 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos, Pulmonologijos ir imunologijos klinikos, Pulmonologijos laboratorijoje, gavus Kauno regioninio Biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (BE-2-13). Šis mokslinis tyrimas buvo Lietuvos mokslo tarybos Mokslininkų grupių finansuojamo projekto „Eozinofilų įtaka bronchų lygiųjų raumenų remodeliacijai sergant astma“ (MIP-010/2014) dalis. Visi asmenys, pakviesti dalyvauti tyrime buvo supažindinti su mokslinio tyrimo protokolu (PSUL-010/2014). Apsisprendę dalyvauti tyrime asmenys savo sutikimą patvirtino raštu informuoto asmens sutikimo formoje, dviem egzemplioriais. Vienas sutarties egzempliorius atiduotas tiriamąjam.
31 2.1.2 Tyrimo eiga
Tiriamieji asmenys, atvykti į Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Pulmonologijos kliniką, buvo kviečiami 2 kartus. Atrankos vizito metu patikrinti įtraukimo/neįtraukimo kriterijai, atliktas fizinis tiriamųjų asmenų ištyrimas, plaučių funkcijos tyrimas, bronchų provokacinis mėginys su metacholinu ir alerginiai odos dūrio mėginiai. Jeigu asmuo atrinktas tyrimui, pirmo vizito metu atlikama spirometrija, paimtamas periferinis kraujas, atliekamas eozinofilų išskyrimas ir užšaldomi biologiniai mėginiai citokinų tyrimams (2 priedas). Iš periferinio kraujo išskyrus eozinofilus, kiekvienam individualiam tyrimui buvo paruoštos atskiros kombinuotos kultūros su bronchų lygiųjų raumenų ląstelėmis. Eozinofilų adhezija vertinama po 30, 45, 60, 120 ir 240 min nuo kombinuotosios kultūros sudarymo matuojant eozinofilų peroksidazės kiekį. Praėjus 24 h po kombinuotos kultūros su eozinofilais buvo surinkti tiriamieji mėginiai nustatyti genų ekspresiją. Bronchų lygiųjų raumenų proliferacija buvo matuojama praėjus 48 ir 72 h po kombinuotos kultūros su eozinofilais. Prieš surenkant mėginius genų ekspresijos tyrimui bei prieš atliekant bronchų lygiųjų raumenų proliferacijos matavimą po kombinuotos kultūros su eozinofilais, šulinėliai buvo inkubuojami su fosfatiniu buferiniu druskų tirpalu (PBS), kuriame yra 1mM etilendiamino tetraacto rūgšties (EDTA), kad būtų nuplauti prie bronchų lygiųjų raumenų neprisitvirtinę eozinofilai. Taip išvengiama klaidingų genų ekspresijos ir proliferacijos tyrimo rezultatų, dėl nevienalytės bronchų lygiųjų raumenų kultūros.
32 2.2 Mėginių paruošimas
2.2.1 Periferinis kraujas
Į vakuuminius mėgintuvėlius su antikoaguliantu EDTA (2×10 ml) buvo paimtas kiekvieno tiriamojo periferinis kraujas. Eozinofilų išskyrimas buvo nedelsiant eozinofilų išskyrimui.
2.2.2 Eozinofilų išskyrimas iš periferinio kraujo
Į laboratoriją pristatomi mėgintuvėliai su periferiniu krauju. Periferinis kraujas perkeliamas į naują 50 ml mėgintuvėlį ir praskiedžiamas 1×PBS (Lonza, Bio Whittaker, Verier, Belgija). PBS yra netoksiškas eozinofilams, tai izotoninis tirpalas, kuris palaiko pastovų fiziologinį pH. Eozinofilų išskyrimui naudojamas aukšto tankio gradientas (Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare, Suomija). Į 15 ml Falcon tipo mėgintuvėlius išpilstomas aukšto tankio gradientas, o ant paviršiaus užpilama praskiesto periferinio kraujo. Centrifuguojama 1000×g 30 min. 22°C temperatūroje. Po centrifugavimo susidaręs viršutinis frakcionuotas sluoksnis (8 pav.) yra pašalinamas, paliekant granuliocitų ir eritrocitų sluoksnius. Apatiniame mėgintuvėlio sluoksnyje susikaupę eritrocitai ir granuliocitai atskiriami naudojant distiliuotą vandenį, atliekama hipotoninė eritrocitų lizė. Lizuojant eritrocitus distiliuotu vandeniu, sumažėja druskų koncentracija, kuri atstatoma naudojant dviem kartais didesnės koncentracijos PBS tirpalą. Centrifuguojama 300×g 10 min. 20°C temperatūroje. Eritrocitų lizavimas ir centrifugavimas kartojamas tol, kol visiškai suardomi eritrocitai ir susidaro aiškiai matomas granuliocitų sluoksnis.
8 pav. Granuliocitų izoliavimas aukšto tankio gradientu ir centrifugavimu
A – mėgintuvėlio vaizdas prieš centrifugavimą – apačioje Ficoll, ant kurio atsargiai supilamas tiriamojo kraujas, atskiestas vienkartiniu PBS buferiu. B – mėgintuvėlio vaizdas po centrifugavimo –
išryškėja skirtingos zonos: plazma, vienbranduolės periferinio kraujo ląstelės, Ficoll reagentas, granuliocitai bei eritrocitai. Pagal Zhonghua Lin ir kt., 2014 (87)
33 Granuliocitai suspenduojami su šaltu MACS buferiniu tirpalu, kurį sudaro: PBS (pH 7,2), 0,5% jaučio serumo albuminas (BSA) ir 2 mM EDTA, gaminamu skiedžiant MACS BSA Stock Solution 1:20 su autoMACSR Rinsing Solution (40 μL - 107 visų ląstelių). Suspensija inkubuojama naudojant eozinofilų išskyrimo rinkinį (Eosinophil Isolation Kit. Human, MACS, Miltenyi Biotec, JAV). Pirma, inkubuojama įpylus Biotin-Antibody Cocktail reagento (su biotinu sujungti monokloniniai antikūnai prieš CD2, CD14, CD16, CD19, CD56, CD123 ir CD235A (glikoforiną A) (10 μL - 107 visų ląstelių) 10 min. 4°C temperatūroje. Antra, inkubuojama 15 min 4°C temperatūroje įpylus Anti-Biotin MicroBeads reagento (prieš biotiną nukreipti monokloniniai antikūnai, izotipas – pelės imunoglobulinas G1 (IgG1) (20 μL - 107 visų ląstelių). Inkubacijos metu visos ląstelės, išskyrus eozinofilus, yra pažymimos magnetinėmis dalelėmis.
Po inkubacijos eozinofilai atskiriami magnetinės separacijos metodu. Į magnetinio lauko stovą MACS Separation (MACS Multistand, Miltenyi Biotec, JAV) įstatomos LS kolonėlės (Miltenyi Biotec, JAV). Kolonėlių filtras (30 μm Miltenyi Biotec, JAV) praplaunamas MACS buferiniu tirpalu. Paruošta ląstelių suspensija užpilama ant LS kolonėlės antrankinio filtro. Magnetinėmis dalelėmis pažymėtos ląstelės lieka LS kolonėlėje, o eozinofilai išteka per kolonėlę į surinkimo mėgintuvėlį. Ant LS kolonėlės atrankinio filtro užpilami dar 3 ml MACS buferinio tirpalo ir surenkami į mėgintuvėlį su eozinofilais.
Išskirta eozinofilų suspensija centrifuguojama 400×g 10 min 25°C temperatūroje. Po centrifugacijos įpilama 1,1 ml DMEM (angl. Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (Biological Industries, Izraelis) mitybinės terpės. Eozinofilų skaičius ir gyvybingumas vertinimas naudojant automatinį ląstelių skaičiuotuvą ADAM (Witec AB, Vokietija).
2.2.3 Bronchų lygiųjų raumenų ląstelių kombinuota kultūra su eozinofilais
Tyrimui naudojama nemirtingų bronchų lygiųjų raumenų ląstelių linija, kuri pasižymi pastovia žmogaus telomerazės atvirkštinės tanskriptazės geno hTERT ekpresija (88). Bronchų lygiųjų raumenų ląstelės auginamos šešių šulinėlių plokštelėje, naudojant DMEM (GIBCO ® By Life Technologies, Peislis, Jungtinė Karalystė) auginimo terpę su 10% embrioninio jaučio serumo (FBS), 1% L-glutaminu, 2% penicilino/streptomicino mišiniu ir 1% fungizonu. Para prieš proliferacijos matavimą, mitybinė terpė pakeičiama į dalijimąsi stabdančią DMEM (ITS, GIBCO ® By Life Technologies, Peislis, Jungtinė Karalystė) terpę su 1% insulin-transferino-seleno mišiniu, 1% L-glutaminu, 2% penicilino/streptomicino mišiniu ir 1% amfotericinu B. Kombinuota kultūra sudaroma į šulinėlį su bronchų lygiųjų raumenų ląstelėmis įpilant 50 000, magnetinės separacijos būdu iš periferinio kraujo
34 išskirtų, eozinofilų. Ląstelinių vaizdinimui naudojame inversinį mikroskopą (CETI Inverso TC100, Medline Scientific, Didžioji Britanija) su 10x/22 mm plauataus lauko okuliaru ir PH 10x0,25 objektyvu bei prijungta CETI Si-5C kamera (Si-Cap software, Version 2.1, 2012).
9 pav. Kombinuotoji bronchų lygiųjų raumenų ląstelių ir eozinofilų kultūra
A – bronchų lygiųjų raumenų ląstelės pirmąją auginimo dieną. B – Kombinuotoji bronchų lygiųjų raumenų ląstelių ir eozinofilų kultūra po 30 minučių inkubacijos. C – kombinuotoji bronchų lygiųjų
raumenų ląstelių ir eozinofilų kultūra po 30 minučių inkubacijos ir 3 praplovimų šiltu fosfatiniu buferiu. Matomi eozinofilai adhezavę prie bronchų lygiųjų raumenų ląstelių, kurie nenusiplovė su fosfatiniu buferiu. D – kombinuotoji kultūra po 4 minučių inkubacijos su fosfatiniu buferiu sudėtyje
turinčiu 1 mM EDTA. Matomos bronchų lygiųjų raumenų ląstelės, prie kurių neliko adhezavusių eozinofilų. Nuplauti eozinofilai buvo naudojami TGFβ1, integrinų genų raiškoms, likusios bronchų lygiųjų raumenų ląstelės naudotos WNT-5A, TGFβ1, kolageno ir fibronektino genų raiškoms vertinti
(58).
2.2.4 RNR išskyrimas
Bronchų lygiųjų raumenų ląstelių kombinuota kultūra su eozinofilais inkubuojama 24 h. Po inkubacijos, nuo bronchų lygiųjų raumenų ląstelių nusiurbiama mitybinė terpė. Ant ląstelių užpilama 1 ml PBS (su 1 mM EDTA) tirpalo ir inkubuojama 5 min., kol atsiskiria prisitvirtinę eozinofilai. PBS tirpalas nusiurbiamas, bronchų lygiųjų raumenų ląstelės homogenizuojamos. Suminė bronchų lygiųjų
35 raumenų ląstelių RNR gryninimui naudojamas komercinis rinkinys RNeasy mini Kit (QIAGEN, Nyderlandai) pagal gamintojo protokolą.
QlAzol lizės tirpalu suardomos homogenizuotų bronchų lygiųjų raumenų ląstelių membranos. Ant paruoštos suspensijos pilama 140 μl chloroformo, inkubuojama 3 min. kambario temperatūroje ir centrifuguojama 12000 × g 15 min. 4°C temperatūroje.
Po centrifugacijos viršutinė vandeninga frakcija nusiurbiama ir perkeliama į naują mėgintuvėlį. Ant nusiurbtos viršutinės frakcijos užpilamas koncentruotas etanolis, kurio tūris 1,5 karto didesnis nei mėginio. Tiriamasis mėginys sumaišytas su etanoliu perkeliamas ant RNeasy® Mini kolonėlės, centrifuguojama 15 s ≥ 8000 × g kambario temperatūroje.
RNR išvaloma nuo DNR priemaišų naudojant RNase free DNase set (QIAGEN, Nyderlandai). Pirma, įpilama 700 μl RWT buferinio tirpalo, praskiesto koncentruotu etanoliu, kuris denatūruoja baltymus ir tirpina lipidus, centrifuguojama 15 s ≥ 8000 × g kambario temperatūroje. Suminė RNR prisitvirtina prie membranos, o priemaišos pasišalina pro membraną į surinkimo mėgintuvėlį. Tuomet įpilama 500 μl RPE buferinio tirpalo, centrifuguojama 15 s ≥ 8000 × g kambario temperatūroje, pašalinamos druskų liekanos. Po centrifugacijos įpilama dar 500 μl RPE buferinio tirpalo, centrifuguojama 2 minutes ≥ 8000 × g kambario temperatūroje. Mėginį išvalius nuo priemaišų, ant kolonėlės membranos pilama 40 μl vandens be ribonukleazių ir centrifuguojama maksimaliu greičiu 1 minutę. Dėl didelės išcentrinė jėgos, vanduo nuplauna RNR nuo kolonėlės membranos į surinkimo mėgintuvėlį. RNR mėginiai laikomi - 80°C temperatūroje tolimesniems tyrimams.
2.3 Tyrimo metodai
2.3.1 Plaučių funkcijos tyrimas
Plaučių funkcija tiriama pneumotachometriniu spirometru CustoVitM (Custo Med, Miunchenas, Vokietija), pagal 2006 m. Globalinės astmos gydymo ir profilaktikos strategijos (GINA) metodiką. Kiekvienas tiriamasis atlieka ne mažiau kaip 3 kokybiškus forsuoto iškvėpimo veiksmus ir nustatoma didžiausia forsuoto iškvėpimo tūrio per pirmąją sekundę (FEV1) bei forsuotos gyvybinės plaučių talpos (FVC) reišmė. FEV1, FVC ir FEV1/FVC santykis – rodikliai, apibūdinantys plaučių funkciją, išreiškiami absoliučiu dydžiu (litrais) ir būtino dydžio procentais. Plaučių funkcija normali, kai FEV1 ≥ 80 % būtino dydžio, FEV1/FVC ≥ 88 % būtino dydžio vyrams ir ≥ 89 % būtino dydžio moterims.
36 2.3.2 Bronchų provokacinis mėginys su metacholinu
Bronchų reaktyvumas tiriamas, pagal standartinę tarptautinę GINA metodiką, taikant rezervuarinį metodą (Provocations Test I, PARI GmbH, Vokietija). Pradedama nuo 15 µg metacholino, kas 5 min. dozė didinama 2 kartus, kol pasiekiama suminė 1929 µg į plaučius patenkanti metacholino dozė. Po kiekvienos įkvėptos metacholino dozės praėjus 30 ir 90 sekundžių, tiriamiesiems atliekama spirograma, vertinamas FEV1 pokytis. Tyrimas nutraukiamas, kai sumažėja FEV1 arba atsiranda subjektyviai netoleruojamas dusulys. Padidėjęs bronchų reaktyvumas nustatomas apskaičiavus provokacinę metacholino dozę (PD20), kuri FEV1 sumažina 20 % nuo pradinio dydžio,
bei įvertinant dozės-atsako kreivės nuolydį.
2.3.3 Bronchų provokacinis mėginys su alergenu
Bronchų provokacija su D. pteronyssinus alergenu atlikta naudojant KoKo DigiDoser purkštuvą (Sunrise Medical, Somerset, PA, JAV). Liofilizuotas D. pteronyssinus alergeno ekstraktas (Stallergenes S.A., Prancūzija) praskiestas steriliu natrio chlorido tirpalu (0,9 proc. NaCl). Naudotos skirtingos D. pteronyssinus alergeno tirpalo koncentracijos: 0,01 IR/ml, 0,1
IR/ml, 1,0 IR/ml, 10 IR/ml, 33,3 IR/ml. Alergeno koncentracijos matavimo vienetas IR (angl. Index of Reactivity, IR) reiškia, jog atliekant odos dūrio mėginį su 100 IR/ml koncentracijos alergenu trisdešimčiai šiuo alergenu įsijautrinusių asmenų sukeliama 7 mm diametro (geometrinis vidurkis) papulė, tuo pat metu nustatant ir odos reaktyvumą histamino dihidrochloridui (10 mg/ml). Tyrimas pradėtas įkvėpus 5 kontrolinio tirpalo (0,9 proc. NaCl) įkvėpimus. Po 10 min. atlikta spirometrija ir įvertintas FEV1, kurio vertė buvo laikoma pradine. Po kiekvienos įkvėptos alergeno dozės, kuri buvo didinama kas 10 min., tiriamiesiems buvo atliekama spirometrija ir vertinamas FEV1 pokytis. Ankstyva bronchų obstrukcija nustatyta, jei per pirmąją valandą po bronchų provokacijos alergenu pasiektas ≥ 20 proc. FEV1 pokytis išliko ne mažiau kaip 10 min. Tuomet tolesnis alergeno skyrimas sustabdytas, o spirometrija kartota kas 10 min., kol FEV1, atsistatys iki vertės < 10 proc. lyginant su pradine. Norint nustatyti vėlyvą bronchų obstrukciją, spirometrija atliekama kartą kas valandą sekančias šešias valandas. Vėlyva bronchų obstrukcija nustatyta, kuomet 2-7 h po bronchų provokacijos alergenu FEV1 pokytis buvo ≥ 15 proc. lyginant su pradiniu dydžiu ir išliko ≥ 15 min..
