LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Ieva Bajoriūnienė
17-O TIPO T LIMFOCITŲ
PAGALBININKŲ VAIDMUO
SERGANT ALERGINE ASTMA
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
medicina (06B)
Kaunas, 2014
Disertacija rengta 2009–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Kęstutis Malakauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 7
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS... 8
3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
3.1. Astmos apibrėžimas ir paplitimas ... 10
3.2. Astmos rizikos veiksniai ... 11
3.2.1. Dermatophagoides pteronyssinus alergeno vaidmuo astmos išsivystymui ... 12
3.2.2. Alerginis rinitas ... 13
3.3. Astmos fenotipai ... 14
3.4. Astmos imunologija ... 17
3.4.1. Nespecifinio imuniteto komponentai ... 17
3.4.2. Specifinio imuniteto patofiziologiniai mechanizmai ... 18
3.4.2.1. Ankstyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas ... 18
3.4.2.2. Vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas ... 21
3.4.3. T limfocitai – pagrindinės astmos patogenezėje dalyvaujančios ląstelės ... 23
3.4.3.1. 17-o tipo T limfocitai pagalbininkai ... 24
3.4.3.2. Interleukinas-17 ... 25
4. TYRIMO METODIKA ... 30
4.1. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga ... 30
4.1.1. Atrankos kriterijai ... 30
4.1.2. Tyrimo eiga ... 31
4.2. Tyrimų metodai ... 32
4.2.1. Alerginiai odos dūrio mėginiai ... 32
4.2.2. Plaučių funkcijos tyrimas ... 33
4.2.3. Bronchų provokacijos mėginys su metacholinu ... 33
4.2.4. Bronchų provokacijos mėginys su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu ... 34
4.2.5. Skreplių indukcija ir citologinis tyrimas ... 34
4.2.6. Periferinio kraujo citologinis tyrimas ... 35
4.2.7. Periferinio kraujo T limfocitų subpopuliacijų tyrimas ... 36
4.2.8. Citokinų koncentracijos serume ir indukuotų skreplių supernatante nustatymas ... 39
4.3. Matematinė statistinė duomenų analizė ... 40 3
5. REZULTATAI ... 41
5.1. Tiriamųjų demografiniai ir klinikiniai duomenys ... 41
5.2. Periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijos ... 45
5.3. Citokinų ir uždegimo ląstelių kiekis periferiniame kraujyje bei jų tarpusavio sąsajos ... 46
5.4. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti periferinio kraujo T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų kiekybiniai pokyčiai ... 48
5.5. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti citokinų ir uždegimo ląstelių kiekio periferiniame kraujyje pokyčiai bei jų tarpusavio sąsajos ... 52
5.6. Indukuotų skreplių ląstelių sudėtis bei citokinų koncentracijos prieš ir po bronchų provokacijos su D. pteronyssinus alergenu ... 55
5.7. Sergančiųjų alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija periferinio kraujo citokinų ir uždegimo ląstelių kiekis bei jų tarpusavio sąsajos ... 65
6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 77
6.1. 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų bei interleukino-17 reikšmė sergant alergine astma ... 77
6.2. Bronchų provokacijos su Dermatophagoides pteronyssinus alergenu sukelti vietinio ir sisteminio uždegimo pokyčiai sergant alergine astma ... 82
6.3. Alerginės astmos, pasireiškiančios ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija po kontakto su alergenu, imuninio atsako ypatumai ... 85
IŠVADOS ... 89
DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 91
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 92
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 105
PADĖKA ... 107
SANTRUMPOS
APC (angl. antigen-presenting cells) − antigeną pateikiančios ląstelės
ARIA (angl. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma) − Alerginis rinitas ir jo įtaka astmai BAL − bronchoalveolinis lavažas
BHR (angl. bronchial hyperresponsiveness) – bronchų hiperrektyvumas CCL2 (angl. C-C chemokine ligand 2) − CC chemokino ligandas 2 CCR (angl. C-C chemokine receptor) − CC chemokino receptorius CD (angl. cluster of differentiation) − diferenciacijos grupė
CGRP (angl. calcitonin-gene-related peptide) − su kalcitonino genu susijęs peptidas DTT (angl. dithiothreitol) – ditiotreitolas
ECP (angl. eosinophil cationic protein) − eozinofilų katijoninis baltymas ELISA (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) − imunofermentinis tyrimas ERS (angl. European Respiratory Society) − Europos respiratologų draugija
FcεRI (angl. high-affinity IgE receptors) − didelio afiniteto receptorius antikūno Fc fragmentui
FEV1 (angl. forced expiratory volume in 1 sec.) − forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę
FITC (angl. fluorescein isothiocyanate) – fluoresceino izotiocianatas Foxp3 (angl. forkhead box P3) – transkripcijos veiksnys Foxp3
g (angl. relative centrifuge force expressed in units of gravity) − išcentrinė jėga
GINA (angl. Global Initiative for Asthma) − Visuotinė astmos iniciatyva
GM-CSF (angl. granulocyte macrophage- colony stimulating factor) − granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis veiksnys
ICAM (angl. intercellular adhesion molecule) – tarpląstelinės adhezijos molekulė IFN − interferonas
Ig − imunoglobulinas IL – interleukinas
IQR (angl. interquartile range) − tarpkvartilinis plotis iRNR − informacinė ribonukleino rūgštis
IS (angl. induced sputum) − indukuoti skrepliai
K3EDTA (angl. ethylene diamine tetra acetic acid tribasic potassium salt) − tribazis kalio etilendiamintetraacetatas
l – litrai
LSMU − Lietuvos sveikatos mokslų universitetas LT – leukotrienas
mAk (angl. monoclonal antibody) − monokloninis antikūnas
MHC (angl. major histocompatibility complex) – pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas
min. − minutė
MMP (angl. matrix metalloproteinase) – matrikso metaloproteinazė NaCl − natrio chloridas
NF-κB (angl. nuclear factor-κB) – branduolio veiksnys κB NK (angl. natural killer) − ląstelė natūralioji žudikė
PAF (angl. platelet activating factor)- trombocitus aktyvinantis veiksnys PBS (angl. phosphate-buffered saline) − fosfatinio buferio tirpalas
PD20− provokacinė metacholino dozė, sumažinanti FEV1 20 proc. lyginant su pradiniu dydžiu
PerCP (angl. peridinin chlorophyll a protein) − peridino chlorofilo baltymas PG − prostaglandinas
proc. procentas
PSO – Pasaulio sveikatos organizacija PŠS − priekinė šviesos sklaida
RORγt (angl. retinoic acid receptor–related orphan receptor-γt) − tanskripcijos veiksnys ROR γt
ROS (angl. reactive oxygen species) − reaktyvios deguonies formos sav. – savaitė
SEM (angl. standart error mean) − standartinė vidurkio paklaida
STAT (angl. signal transducer and activator of transcription) − signalo perdavėjas ir transkripcijos aktyvatorius
ŠŠS − šoninės šviesos sklaida
T-bet (angl. T-box transcription factor) − transkripcijos veiksnys T-bet TCR (angl. T-cell receptor) − T limfocitų receptorius
TGF-β (angl. transforming growth factor-β) − transformuojantis augimo veiksnys-β Th (angl. T helper cells) − T limfocitai pagalbininkai
TLR (angl. Toll-like receptor) − transmembraninis atpažinimo receptorius TNF (angl. tumor necrosis factor) − naviko nekrozės veiksnys
Treg (angl. regulatory T cells) − Treguliaciniai limfocitai
TSLP (angl. thymic stromal lymphopoietin) − užkrūčio stromos limfopoetinas TX – tromboksanas
val.− valanda
VCAM (angl. vascular cell adhesion molecule) − kraujagyslių ląstelių adhezijos molekulė VEGF (angl. vascular endothelial growth factor) − kraujagyslių endotelio augimo veiksnys
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Įvertinti 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų vaidmenį sergant alergine astma.
Darbo uždaviniai
1. Ištirti sergančiųjų alergine astma T limfocitų pagalbininkų (17-o tipo, 1-o tipo ir 2-o tipo T limfocitų pagalbininkų) kiekį periferi-niame kraujyje ir palyginti su sergančiųjų alerginiu rinitu ir sveikų asmenų duomenimis;
2. Nustatyti sergančiųjų alergine astma interleukino-17 koncentraciją indukuotų skreplių supernatante ir periferinio kraujo serume, įvertinti sąsajas su 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų kiekiu perife-riniame kraujyje bei palyginti su sergančiųjų alerginiu rinitu ir svei-kų asmenų duomenimis;
3. Nustatyti 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų kiekio periferiniame kraujyje pokyčius bronchų provokacijos su Dermatophagoides
pteronyssinus alergenu sukeltos vėlyvos fazės kvėpavimo takų
uždegimo metu;
4. Nustatyti Dermatophagoides pteronyssinus alergeno sukeltus interleukino-17 koncentracijos pokyčius indukuotų skreplių supernatante ir periferinio kraujo serume bei įvertinti sąsajas su kitų citokinų (interleukino-8, interleukino-5) ir uždegimo ląstelių (limfocitų, neutrofilų, eozinofilų) kiekiu sergant alergine astma; 5. Įvertinti 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų ir interleukino-17 kiekį
sergantiesiems alergine astma, kuriems Dermatophagoides
ptero-nyssinus alergenas sukelia ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstrukciją,
bei palyginti su sergančiaisiais alergine astma, kuriems alergenas sukelia tik ankstyvą bronchų obstrukciją.
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS
Astma yra lėtinė kvėpavimo takų uždegimo liga, kurios paplitimo ir sergamumo rodikliai pastaraisiais metais pastebimai didėja daugelyje išsivysčiusių šalių, tarp jų ir Lietuvoje. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, net 300 milijonų žmonių visame pasaulyje serga šia liga. Todėl įvairių šalių mokslininkai skiria ypatingą dėmesį klinikiniams stebėjimams ir moksliniams tyrimams, siekdami išsiaiškinti astmos atsira-dimo priežastis, provokuojančius veiksnius, uždegimo kvėpavimo takuose ypatumus, ilgainiui sąlygojančius ligos progresavimą ir plaučių funkcijos sutrikimą. Mokslininkai neabejoja, jog antro tipo T limfocitai pagalbininkai (Th2) bei eozinofilinis kvėpavimo takų uždegimas yra astmos patogenezės pagrindas. Tačiau šis mechanizmas ne visuomet gali paaiškinti astmos metu esančio kvėpavimo takų uždegimo bei klinikinių simptomų įvairumą, eigos ypatumus ir net skirtingą atsaką į gydymą. Todėl įvairių šalių mokslininkai nenuilsdami ieško naujų astmos patogenezės veiksnių.
Šiame moksliniame tyrime pirmą kartą Lietuvoje tirta sergančių alergine astma 17-o tipo T limfocitų pagalbininkų (Th17) subpopuliacija. Pastarųjų metų tyrimai įrodė, jog Th17 limfocitai ir jų citokinai, interleu-kinai (IL-17A ir IL-17F), reikšmingi autoimuninių ir uždegiminių ligų formavimuisi. Eksperimentiniai tyrimai su gyvūnais parodė Th17 limfocitų svarbą alerginės astmos vystymuisi. Šios T limfocitų pagalbininkų subpopu-liacijos imuninis atsakas charakterizuojamas specifiniu IL-17 poveikiu struktūrinėms kvėpavimo takų ir uždegimo ląstelėms, kurios sukelia padi-dintą uždegimą skatinančių mediatorių raišką, lemia neutrofilų bei makro-fagų susikaupimą uždegimo židinyje, jų aktyvumą ir besitęsiantį uždegimą.
Nauja ir reikšminga atlikto tyrimo dalis yra ta, kad pirmą kartą LSMU įdiegta ir optimizuota Th17 limfocitų nustatymo periferiniame kraujyje tėk-mės citometru metodika.
Pasaulinėje mokslinėje literatūroje publikuoti tyrimų rezultatai, kuriuo-se pagrindžiama Th17 limfocitų svarba sunkios, dažnai paūmėjančios, nea-lerginės ar neutrofilinės astmos patogenezėje. Tačiau Th17 reikšmė speci-finio alergeno sukelto imuninio atsako vystymuisi dar nėra ištirta.
Šiame moksliniame tyrime nauja yra tai, kad Th17 limfocitų imuninio atsako tyrimui sergant alergine astma pasirinktas ir sėkmingai įdiegtas bronchų provokacijos namų dulkių erkės, Dermatophagoides pteronyssinus
(D. pteronyssinus) alergenu, modelis. Jis leidžia įvertinti dinamiškus Th17
limfocitų subpopuliacijos pokyčius − praėjus 7 ir 24 val. po alergeno įkvė-pimo, o vėlyva kvėpavimo takų uždegimo fazė, kuri atsiranda praėjus valandoms po alergeno įkvėpimo, pripažįstama kaip labiausiai atspindinti astmos patogenezę, o jos tyrimai laikomi reikšmingiausiais tiriant sergan-čiuosius astma.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1. Astmos apibrėžimas ir paplitimas
Astma yra lėtinė kvėpavimo takų uždegimo liga, kuriai būdingas padidėjęs bronchų reaktyvumas, pasikartojantys sutrikusio bronchų laidumo epizodai, pasireškiantys veržimu krūtinėje, švokštimu, dusuliu ar kosuliu, išnykstantys savaime ar gydant [16].
Lėtinio neinfekcinio kvėpavimo takų uždegimo kaip pagrindinio astmos patogenezės mechanizmo samprata įsigalėjo XX a. Pradėti intensyviai vyk-dyti moksliniai tyrimai atskleidė, kad ligos simptomus provokuoja aplinkoje esantys alergenai, o bronchų gleivinės infiltracija uždegimą sukeliančiomis ląstelėmis [29] sukelia padidėjusį kvėpavimo takų jautrumą [39]. Astmai būdingi ilgai išliekančio uždegimo požymiai kvėpavimo takuose: gleivinės infiltracija leukocitais [81], epitelio pažeidimas [154] ir bazinės membranos sustorėjimas [94], gleives išskiriančių liaukų [139] ir lygiųjų raumenų išvešėjimas [52].
PSO duomenimis, astma serga daugiau nei 300 milijonų žmonių visame pasaulyje, o net 250 000 kas metai miršta nuo jos [16]. Tai viena dažniausių ir vaikų, ir suaugusių lėtinių ligų. Manoma, jog 2025 m. sergančių astma bus 100 milijonų daugiau nei šiandien. Daugelis epidemiologinių tyrimų skelbia gana skirtingus astmos paplitimo, sergamumo ir mirtingumo rodiklius. Juos sunku palyginti dėl tam tikrų nuolat besikeičiančių astmos diagnostikos kriterijų, tiriamųjų populiacijų amžiaus, etninių, socialinių bei ekonominių skirtumų. Minima, kad įvairiose šalyse astma serga nuo 1 iki 18 proc. populiacijos. Europoje astma nustatoma nuo 5 iki 15 proc. populia-cijos, o Europos šiaurinėje dalyje šie skaičiai dar didesni. Europos Sąjun-goje tiesioginės išlaidos kvėpavimo sistemos ligoms yra didelės ir sudaro apie 6 proc. viso sveikatos apsaugai skiriamo biudžeto, o su astma susijusios išlaidos siekia apie 17,7 milijardų eurų per metus.
Visai neseniai manyta, kad astma − tai ekonomiškai išsivysčiusių šalių problema. Paskutinių tyrimų duomenys parodė, kad ir besivystančiose šalyse sergamumas astma sparčiai auga. Manoma, kad tokį spartų serga-mumo augimą lemia urbanizacijos procesai besivystančiose šalyse, didėjanti oro tarša, cheminių priedų naudojimas maisto pramonėje, ankstyvas vaikų kontaktas su alergenais, rūkymas. Lietuvos statistikos departamento duome-nimis 2012 m. sergančių astma suaugusių asmenų buvo 13,5 atvejų 1000 gyventojų, o vaikų iki 17 metų amžiaus − 38,7/1000. Išlaidos, susijusios su kvėpavimo organų ligų gydymu, blogėjant epidemiologinei situacijai taip pat didėja. Šių laikų mokslininkai ir sveikatos specialistai viena iš
biausių krypčių laiko astmos vystymosi mechanizmų tyrimus, naujų diag-nostikos galimybių ir gydymo būdų paiešką.
3.2. Astmos rizikos veiksniai
Kalbant apie astmos atsiradimo priežastis, dažniausiai minimas gene-tinis paveldimumas, žalingų aplinkos veiksnių įtaka, nuolatinė infekcija kvėpavimo takuose. Tikroji priežastis, sukelianti lėtinį kvėpavimo takų uždegimą, vis dar lieka neaiški. Pastarųjų metų mokslinėje literatūroje svar-biausiais vadinami genetiniai ir aplinkos veiksniai, jų tarpusavio sąveika. Identifikuota daugiau nei 100 genų, galinčių nulemti astmos atsiradimą. Nepaisant didelių skirtumų tarp populiacijų, pastarųjų metų klinikiniais bei eksperimentiniais tyrimais nustatyti genai, galintys nulemti: padidintą specifinių imunoglobulino (Ig) E klasės antikūnų gamybą, kvėpavimo takų reaktyvumą, uždegimo mediatorių gamybą, pirmo tipo T limfocitų pagalbi-ninkų (Th1) ir Th2 limfocitų imuninio atsako pusiausvyrą [137]. Net gydy-mo efektyvumas, atsakas į skiriamus bronchus plečiančiuosius vaistus ar gliukokortikoidus, kaip rodo farmakogenetiniai tyrimai, gali būti susijęs su tam tikru genotipu [83]. Genetinių skirtumų ir klinikinio astmos varianto įvertinimas leidžia kiekvienai astma sergančių pacientų grupei parinkti efektyviausią gydymą, užtikrinti tinkamą vaistų vartojimą, sumažinti paša-linį jų poveikį.
Aplinkos veiksniai – svarbi astmos rizikos veiksnių grupė. Kai kurie iš jų ne tik provokuoja ligos atsiradimą, bet kartu gali būti simptomų pasi-kartojimo ir ligos paūmėjimų veiksnys, blogos astmos kontrolės priežastis. Svarbiausiais astmą sukeliančiais aplinkos veiksniais laikomi oro alergenai: tai medžių, žolių, piktžolių žiedadulkės, esančios ore augalų žydėjimo metu, bei nuolatinai patalpų alergenai: šunų ir kačių epidermis, namų dulkių erkės, grybeliai. Nustatyta, kad vaikams, kurių namų aplinkoje pirmaisiais gyve-nimo metais yra didelis įvairių alergenų kiekis, nustatomas įsijautrinimas šiems alergenams, o ateityje – didesnė rizika susirgti astma [106]. Be to, tiriant epidemiologiškai stebimas aiškus sergančių astma skaičiaus didėji-mas miestuose bei padidintos oro taršos regionuose [128]. Įrodyta, kad rū-kančių tėvų vaikai turi du kartus didesnę tikimybę sirgti astma nei jų bendraamžiai, augantys nerūkančioje šeimoje.
Astma nevienodai dažna ankstyvame amžiuje ir subrendus, vyriškos ir moteriškos lyties atstovams. Pastebima, kad vaikų iki 14 metų populiacijoje astma serga dvigubai daugiau berniukų nei mergaičių [11], o vyresni vaikai ir suaugusieji serga vienodai dažnai. Nors tikroji priežastis nėra aiški, manoma, jog pokyčiai brendimo metu ir hormonų pusiausvyra nulemia
lyties specifinius požymius, o kartu ir skirtingą atsaką į aplinkos veiksnius. Paauglystėje ir suaugus, greta jau anksčiau išvardintų aplinkos veiksnių, veikiančių astmos atsiradimą, vis dažniau minimi mitybos ypatumai ir nutukimas [143]. Didesnis kūno masės indeksas susijęs su didesne astmos rizika, o sergantiems ja gali apsunkinti ligos gydymą. Ne mažiau domės mokslininkams kelia ir astmos vystymąsi aiškinanti higienos teorija. Paste-bėta, jog mažėjant infekcinių ligų dažniui ankstyvame amžiuje, imuninės sistemos vystymasis nukreipiamas kita, alerginių ligų vystymosi linkme [30,45], o vaikai, augantys kaimuose ar lankantys vaikų kolektyvus, rečiau serga alerginėmis ligomis [54]. Vėliau šiuos pastebėjimus mokslininkai pagrindė T limfocitų pagalbininkų tyrimais, išaiškino endotoksino, gram-neigiamų bakterijų membranos dalies lipopolisacharido, imuninį atsaką modifikuojančiu poveikiu. Kita vertus, daugelis tyrimų patvirtino, kad ankstyvame amžiuje respiracinio sincitinio ar rinoviruso sukelta infekcija yra astmos rizikos veiksnys, ypatingai asmenims, turintiems genetinį polinkį sirgti atopinėmis ligomis [99,101,168].
Plačiai tyrinėjamas ryšys tarp aplinkos alergeno, jo koncentracijos, ekspozicijos laiko bei įsijautrinimo ir ligos atsiradimo. Įrodyta, kad įsi-jautrinimas namų aplinkos alergenais, tokiais kaip naminių gyvūnų – šunų, kačių epidermis, Alternaria grybelio alergenai, priklauso astmos rizikos veiksniams [150,181]. Yra ir kitą nuomonę atstovaujantys tyrimai: vaikai, nuo pat gimimo turėję kontaktą su naminių gyvūnų alergenais, yra apsaugoti nuo astmos išsivystymo bei įsijautrinimo kitais oro alergenais [10,193]. Namų dulkių erkės yra vienas svarbiausių namų aplinkos alergenų ir nepri-klausomai nuo kontakto intensyvumo ir trukmės sukelia astmą, teigia mokslininkai [189]. O, būdamos nuolatiniai aplinkos alergenai, lemia sun-kesnę ligos eigą, prastesnę sergančių alergine astma plaučių funkciją. Namų dulkių erkių paplitimas bei įsijautrinimas jų alergenais yra vienas didžiausių iš gana plataus spektro namų aplinkos alergenų, tiesa, įvairiuose pasaulio regionuose, priklausomai nuo klimato sąlygų, jis gerokai svyruoja. Jung-tinėse Amerikos Valstijoje įsijautrinimas namų dulkių erkėmis nustatomas 20,3 proc. populiacijos [157].
3.2.1. Dermatophagoides pteronyssinus alergeno vaidmuo astmos išsivystymui
Įsijautrinimas viena iš namų dulkių erkių, priklausiančia Pyroglyphidae nariuotakojų voragyvių šeimai ir Dermatophagoides pteronyssinus genčiai, visoje Europoje yra vidutiniškai 31,3 proc., o skirtingose šalyse svyruoja: kaimyninėje Lenkijoje – 22,2 proc. Danijoje – 51,5 proc., o Portugalijoje net 68,8 proc. [75]. Svarbu pabrėžti, kad įsijautrinimas D. pteronyssinus
genu dažniausiai susijęs su klinikiniais alerginių ligų simptomais: ≥ 70 proc. teigia Austrijos tyrėjai, ≥ 50 proc. Italijos, Vokietijos, Suomijos, Olandijos [34].
D. pteronyssinus sudarytas iš daugelio įvairios struktūros ir skirtingų
savybių alergenų. Der p 1 (25 kDa) ir Der p 2 (14 kDa) yra imunodominuo-jantys alergenai, sukeliantys specifinių IgE klasės antikūnų gamybą ir Th2 limfocitų atsaką daugiau nei 80 proc. D. pteronyssinus įsijautrinusių asmenų [69]. Kiti D. pteronyssinus alergenai (jų yra išskiriama 20), tokie kaip 3, 5, 6 ir 8 grupių, pasižymi menkesnėmis antigeninėmis savybėmis ir tik 50 proc. asmenų sukelia specifinių IgE klasės antikūnų gamybą ir nedidelę jų kon-centraciją serume [176]. Didesnės molekulinės masės D. pteronyssinus alergenai, priklausantys 11, 15 ir 18 grupėms, pasižymi didesniu gebėjimu jungtis su specifiniais IgE antikūnais [169], o taip pat poveikiu kitoms plaučių ar imuninės sistemos ląstelėms. D. pteronyssinus alergenų sudėtyje yra medžiagos, nepriklausomai nuo IgE stimuliuojančios uždegimą ir susi-jusios su vėlyvos fazės uždegimo vystymusi [74]. Šios uždegimo fazės ge-nezę gyvūnų modeliuose tyrinėję mokslininkai nustatė, kad D.
pterony-ssinus alergenų sudėtyje esančios serino ir cysteino proteazės tiesiogiai
pažeidžia barjerinę kvėpavimo takų funkciją bei veikia bronchų epitelio ląstelių funkcijas [187]. Iš aplinkos patekusios proteazės skatina chemokinų išsiskyrimą, bazofilų aktyvaciją, užkrūčio stromos limfopoetino sekreciją, transmembraninių atpažinimo receptorių, TLR4 (angl. Toll-like receptor) aktyvaciją struktūrinėse plaučių ląstelėse ir Th2 limfocitų imuninį atsaką [70,190]. Chitinas, kita D. pteronyssinus sudėtyje esanti medžiaga, aktyvuo-ja makrofagus, sukelia leukotrienų (LTB4) išsiskyrimą, sutelkia neutrofilus uždegimo židinyje bei padidina jų aktyvumą. Todėl vien tik Der p1 ar Der p2 alergenai, lyginant su visu pilnu D. pteronyssinus alergenu, sukelia ne tokį intensyvų lėtosios uždegimo fazės atsaką sergantiesiems alergine astma asmenims [183].
3.2.2. Alerginis rinitas
Alerginis rinitas – dažniausia alerginė kvėpavimo liga. Jos raidą lemia genetiniai, imunologiniai bei aplinkos veiksniai. Svarbiausiu laikomas aler-geno sukeltas Th2 limfocitų tarpininkaujamas uždegimas [155]. PSO inicia-tyva suformuoto dokumento „Alerginis rinitas ir jo įtaka astmai“ (angl.
Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma, ARIA) duomenimis, apie
50 proc. suaugusių planetos gyventojų serga alerginiu rinitu, o tai yra 500 milijonų asmenų [26]. Stebimas spartus sergamumo alerginiu rinitu didė-jimas. Įrodyta, kad alerginis rinitas yra astmos rizikos veiksnys [68]. Jis
diagnozuojamas daugiau nei 80 proc. astma sergančių asmenų [109, 163, 178] ir dažnai yra susijęs su sunkesne alerginės ligos eiga [114].
Ne vienerius metus mokslininkai bando surasti alerginį rinitą ir astmą vienijančius ir skiriančius požymius. Teiginys „vieni kvėpavimo takai – viena liga“ sulaukia daugiau pritarimo nei abejonių [96]. Alerginis uždegi-mas gali būti nustatouždegi-mas ir viršutiniuose, ir apatiniuose kvėpavimo takuose net ir nesant atitinkamų ligų klinikinių simptomų. Segmentinė bronchų provokacija alergenu išprovokuoja viršutinių ir apatinių kvėpavimo ligų simptomus, nosies ir bronchų infiltraciją uždegimo ląstelėmis praėjus 24–48 val. po provokacijos [31]. Sergantiems alergine astma asmenims nosies gleivinės biopsijos metu nustatomas eozinofilinis uždegimas net ir nesant alerginio rinito simptomų. Sergantiems alergine astma asmenims nosies gleivinės biopsijoje nustatomas eozinofilinis uždegimas be alerginio rinito simptomų [59]. Ir atvirkščiai, alerginiu rinitu sergantiems asmenims nosies provokacija padidina bronchų reaktyvumą metacholinui [23], viršutinių ir apatinių kvėpavimo takų eozinofiliją [32] bei uždegimo ląstelių ir citokinų koncentracijų pokyčius serume [199]. Įdomu ir tai, kad nosies provokacija namų dulkių erkės Blomia tropicalis alergenu sukėlė nosies simptomus bei išprovokavo vėlyvą bronchų obstrukciją sergantiems astma. Yra keletas šį ryšį aiškinančių teorijų. Įtikimiausia teigia, kad vietinis kvėpavimo takų uždegimas yra lydimas sisteminio atsako, kuris aktyvuoja kaulų čiulpuose kamienines ląsteles, jų aktyvumą, brendimą, migraciją į uždegimo židinį [46].
3.3. Astmos fenotipai
Astma – sudėtinga ir įvairialypė liga. Literatūroje galima aptikti ją vadinant net ne viena liga, bet ligų grupe su įvairiais atskirais sindromais.
Kalbant apie astmą, dažniausia minima alergeno sukelta, būdingais dusulio, sunkumo krūtinėje, švokštimo ar kosulio epizodais pasireiškianti liga. Esminis jos požymis – kvėpavimo takų uždegimas ir padidintas kvėpavimo takų jautrumas, ilgainiui pažeidžiantys plaučių funkciją. Ilgą laiką vyravo teorija, kad astma yra atopinė liga, kurios metu alergenui pa-tekus į kvėpavimo takus aktyvuojami Th2 limfocitai, skatinamas citokinų išskyrimas (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) ir eozinofilinis kvėpavimo takų užde-gimas, stimuliuojami B limfocitai, gaminami IgE klasės antikūnai, kurie, prisijungę prie putliųjų ląstelių, stimuliuoja mediatorių išskyrimą ar gamybą ir sukelia nuolatinį kvėpavimo takų uždegimą [13,41,91]. Ir iš tiesų, alerginė astma yra vienas dažniausių astmos variantų [116]. Pradėjus plačiai vartoti įkvėpiamus vaistus, gliukokortikoidus ir bronchus plečiančius, kurie veikia
visus išvardintus astmos vystymosi mechanizmus, buvo galima tikėtis visiš-kai kontroliuoti astmą. Tačiau klinikinė praktika rodo, kad vieniems pacien-tams liga valdoma vartojant nedideles vaistų dozes, kitiems, nepaisant inten-syvaus gydymo ir didelių vaistų dozių, astmos kontrolės pasiekti nepa-vyksta. Be to, ir gydytojams, ir pacientams nerimą kelia sunki, dažnai paūmėjanti ar nuolatine bronchų obstrukcija pasižyminti astma. Šie ligos variantai ne tik pablogina sergančių gyvenimo kokybę, bet ir gali tapti sveikatos praradimo ar net mirties priežastimi. Pasigirsta vis nauji argu-mentai, dėl ko reikalinga suskirstyti ir apibūdinti įvairius astmos variantus, kitaip dar vadinamus fenotipais. Astmos fenotipų išskyrimas leistų geriau suprasti ligos vystymosi mechanizmus, atskleistų galimybę susieti genotipą ir patofiziologinius ligos ypatumus. O tai svarbu parenkant individualų sergančių astma gydymą, tinkamą, efektyvų ir saugų [195]. Astmos fenotipo sąvoka iki šiol neapibrėžta. Visuotinės astmos iniciatyvos (angl. Global
Initiative for Asthma, GINA) rekomendacijose astma apibūdinama kaip
turinti klinikinių skirtumų, bet patomorfologiškai panaši liga, todėl astmos fenotipų išskyrimas klasifikuojant ligą netikslingas, o gydymas vaistais parenkamas pagal paciento jaučiamus simptomus ar plaučių funkcijos rodiklius [58]. Nuolat vykdomi eksperimentiniai tyrimai atskleidžia vis naujus faktus apie astmos formų skirtumus, nulemiančius ligos kliniką ir atsaką į skiriamą gydymą. Mokslinėje literatūroje dažnai išskiriami astmos fenotipai, norint pabrėžti ir išryškinti tam tikrus svarbius ligos vystymosi mechanizmus. Kita vertus, pastaruoju metu daugėja duomenų, įrodančių, kad skirtingos, o kai kada ir tos pačios klinikinės eigos astma gali būti pro-vokuojama skirtingų veiksnių ir nulemta skirtingų patofiziologinių pokyčių. Išskiriami klinikiniai astmos fenotipai, kuriems priklauso įvairios eigos ir sunkumo liga, dažnai paūmėjanti, su nuolatine bronchų obstrukcija, pri-klausoma nuo atsako į gydymą, vaikų ir suaugusiųjų amžiuje atsiradusi astma. Pagal provokuojantį veiksnį išskiriama fizinio krūvio sukelta ir aspi-rininė astma. Labiausiai paplitęs skirstymas į uždegiminius astmos feno-tipus, kuomet kvėpavimo takuose randamas eozinofilinis ar neutrofilinis uždegimas. Reikia pasakyti, kad šis fenotipų skirstymas dažnai esti nepa-kankamas, nes yra stebimi tarpusavyje persipynę alerginės ir nealerginės astmos klinikiniai, eozinofilinės ir neutrofilinės astmos uždegiminiai fenotipai. Segančiųjų alergine astma bronchų gleivinėje aptinkamas padi-dėjęs eozinofilų bei Th2 limfocitų pagalbininkų kiekis, o neutrofilai ir limfocitai vyrauja sergant nealergine astma [13,100].
Iki šiol manoma, kad eozinofilinis kvėpavimo takų uždegimas yra esminis astmos vystymosi procese, sąlygojantis struktūrinius ir funkcinius astmai būdingus kvėpavimo takų pokyčius [91]. Eozinofilija ir padidėjęs
eozinofilų degranuliacijos produktų kiekis indukuotuose skrepliuose, bron-chų išplovose, kvėpavimo takų biopsijos mėginiuose nustatomas daugumai astma sergančių asmenų [24,47]. Eozinofilinis uždegimas nustatomas ser-gant įvairaus sunkumo astma ir esant astmos paūmėjimui, pagerėja gydant ją įkvėpiamais gliukokortikoidais [90,149]. Kita vertus, eozinofilinio kvėpa-vimo takų uždegimo sumažinimas ne visuomet susijęs su bronchų reakty-vumo ar klinikinių požymių sumažėjimu [93]. Tyrimai rodo, kad tik daliai sergančių astma asmenų nustatomas eozinofilinis kvėpavimo takų užde-gimas [49,165].
Įrodyta, kad egzistuoja ir neeozinofilinis astmos uždegiminis fenotipas. Jis dažniausiai susijęs su padidėjusiu neutrofilų skaičiumi kvėpavimo ta-kuose ir pasižymi skirtingu nei eozinofilinės astmos atvejo kvėpavimo takų histopatologiniu vaizdu ir struktūriniais pokyčiais, kvėpavimo takų disfunk-cijos mechanizmais, ligą sukeliančiais ir provokuojančiais veiksniais, atsaku į gydymą ir, galimai, prognoze. Neutrofilinis uždegimas kvėpavimo takuose sergant astma susijęs su įgimto imuniteto atsako vyravimu [65,165]. Provo-kuojantys bakteriniai ir virusiniai agentai, kaip ir aplinkos tarša ir rūkymas, yra svarbiausi šios rūšies uždegimo iniciatoriai. Pastarųjų metų eksperimen-tiniai alerginės astmos tyrimai parodė, kad neutrofilų veikla gali būti susijusi ir su specifiniu imuniniu atsaku [76].
Kai kurie tyrėjai, norėdami ištirti ir geriau suprasti alergeno sukelto imuninio atsako ypatumus, išskiria nuo reakcijos į alergeną priklausomą alerginės astmos fenotipus: Sergantys astma, kuriems bronchų provokacija alergenu sukelia ankstyvą, bei Sergantys astma, kuriems bronchų provokacija alergenu sukelia ankstyvą ir vėlyvą bronchų obstrukciją. Toks ligos suskirstymas padėjo atskleisti, kad Sergantys alergine astma su ankstyva ir vėlyva bronchų obstrukcija, išsivysčiusia po alergeno stimulia-cijos, pasižymi didesniu Th1 ir Th2 limfocitų chemokinų kiekiu, kuris sąly-goja intensyvesnį ir ilgalaikį kvėpavimo takų uždegimą bei bronchų obst-rukciją [112,130].
Visi šie duomenys patvirtina hipotezę, kad astma yra heterogeninė liga, turinti skirtingus patofiziologinius ir patomorfologinius fenotipus, lemian-čius ligos klinikinius skirtumus, o jų savalaikis identifikavimas svarbus parenkant gydymą, planuojant profilaktiką ar numatant prognozę.
3.4. Astmos imunologija 3.4.1. Nespecifinio imuniteto komponentai
Kvėpavimo takus dengia daugiasluoksnis stulpinis epitelis, darniai reguliuojamas organizmo apsaugos barjeras, nepralaidus daugeliui iš aplin-kos patenkančių agentų. Glaudžiosios tarpląstelinės jungtys, transmembra-niniai adhezijos baltymai tampriai sujungia greta esančias epitelio ląsteles ir palaiko struktūrinį kvėpavimo takų gleivinės vientisumą. Sergantiems astma apsauginė kvėpavimo takų epitelio funkcija sutrinka, o pralaidumas antige-nams – padidėja. Tokį epitelio struktūros pakitimą sergant astma gali nulem-ti ir genenulem-tiniai, ir aplinkos veiksniai. Pavyzdžiui, odos ir gleivinių struktū-rinio baltymo filagrino geno mutacijos ir šio baltymo pakitimai sumažina odos barjerinę funkciją ir sukelia odos ichtiozę bei padidina atopinio dermatito išsivystymo riziką [194]. Apie 50 proc. atopiniu dermatitu sergan-čių asmenų gali turėti filagrino geno mutacijas, tokie asmenys dažnai serga ir astma [88]. Su genetiniais pokyčiais siejama ir sutrikusi citokinų – inter-ferono (IFN-β, IFN-λ) gamyba, sumažėjęs fermentų – superoksido dismuta-zės ir glutationo peroksidadismuta-zės kiekis epitelyje [42]. Kvėpavimo takų epitelio ląstelės skatina dendritinių ląstelių susikaupimą kvėpavimo takuose, sergant astma nustatomas didesnis jų kiekis [148]. Nespecifinio imuniteto grandies pažeidimas sudaro palankias sąlygas įkvėptiems alergenams, virusams ar cheminėms medžiagoms lengvai prasiskverbti į gilesnius kvėpavimo organų audinius ir sukelti imuninį atsaką.
Užkrūčio stromos limfopoetinas (angl. thymic stromal lymphopoietin, TSLP) yra citokinas, kurį išskiria žmogaus kvėpavimo takų epitelio ląstelės, sąveikaudamos su kai kuriais mikrobų produktais (peptidoglikanais, lipotei-choinės rūgšties dariniais ir dvigrande viruso ribonukleino rūgštimi (RNR)), fiziniais stimulais, uždegimo citokinais (IL-1β, tumoro nekrozės veiksniu (TNF)). Padidintas TSLP kiekis nustatomas ir sergančių astma kvėpavimo takuose, o TSLP informacinės ribonukleino rūgšties (iRNR) raiška koreliuo-ja su ligos sunkumu [89]. Be to, TSLP sukelia padidintą bronchų reaktyvu-mą, stimuliuodamas nespecifinį įgimto imuniteto atsaką, sužadindamas putliąsias ląsteles [9]. TSLP svarbus ir specifinio imuninio atsako iniciacijai [63,167]. Jis yra vienas iš pagrindinių dendritinių ląstelių, kurios kvėpavimo takuose atlieka antigeną pateikiančios ląstelės (angl. antigen-presenting
cells, APC) funkciją, aktyvintojų. TSLP didina TLR raišką. TSLP
sti-muliuoja kvėpavimo takų dendritines ląsteles pateikti perdirbtus alergenus, kartu su II klasės pagrindiniu audinių suderinamumo kompleksu (angl.
major histocompatibility complex, MHC), T limfocitams. Apskritai nėra
aišku, kokiu būdu TSLP ir dendritinės ląstelės gali nukreipti T limfocitų
diferenciaciją – patologiniu ar reguliaciniu keliu. Tačiau jau dabar galima sakyti, kad jis veikia daugelį astmos patogenezės grandžių ir nėra susijęs tik su alerginiu, veikiau – su nealerginiu (nesusijusiu su Th2 limfocitų imuniniu atsaku) uždegimu [173].
TSLP paskatina dendritines ląsteles pradėti T limfocitų (Th1, Th2, Th17 ar T reguliacinių limfocitų (Treg)) imuninį atsaką bei lėtinio uždegimo kaskadą. Savo ruožtu, dendritinės ląstelės, reaguodamos į aplinkos poky-čius, gali tiesiogiai reguliuoti skirtingą T limfocitų diferenciaciją: išskirda-mos IL-6 kartu su transformuojančiu augimo veiksniu beta (angl.
trans-forming growth factor-β, TGF-β) ar IL-23 veikia Th2 ; išskirdamos TGF-β
ar IL-10 reguliuoja Treg; išskirdamos IL-12 reguliuoja Th1; IL-1, IL-6 ar IL-23 reguliuoja Th17 limfocitus.
3.4.2. Specifinio imuniteto patofiziologiniai mechanizmai
Specifinio imuninio atsako sergant alergine astma pagrindas – padidinto jautrumo imuninė reakcija. Šių imuninių reakcijų klasifikacija pagrįsta imuninio atsako tipu, taip pat efektorinių mechanizmų, atsakingų už ląstelių ir audinių pažeidimus, ypatumais. 1963 m. britų mokslininkai P. G. H. Gell ir R. R. A. Coombs, atsižvelgdami į efektorinę imuninio atsako fazę, išskyrė I–IV tokių reakcijų variantus [2]. Ši klasifikacija su nedidelėmis pataisomis, naudojama ir šiomis dienomis įvairių imuninių ligų, taip pat ir alerginių, mechanizmų paaiškinimui. Imuninės sistemos reakcija kiekviename organizme plėtojasi skirtingai, dažnai jos intensyvumo ir trukmės ne-įmanoma nuspėti, o nerimstanti ir besitęsianti ji įtraukia vis naujas imuninės sistemos dalis, ląsteles, audinius ir organus, todėl dažnai būna lėtinė.
3.4.2.1. Ankstyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas
Ankstyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas sergant alergine astma paprastai atsiranda per keletą minučių alergenui patekus į įsijautrinusio or-ganizmo kvėpavimo takus ir atspindi putliųjų ląstelių ir bazofilų mediatorių sukeltus patofiziologinius pokyčius (3.4.2.1.1 pav.) [121]. Pastarąją dažnai lydi vėlyva uždegimo fazė, kylanti dėl gausybės uždegimo ląstelių (eozi-nofilų, neutrofilų, T limfocitų, makrofagų, plaučių struktūrinių ląstelių) ir jų produktų poveikio [22]. Besitęsiantis lėtinis uždegimas ilgainiui sąlygoja struktūrinius kvėpavimo organų pokyčius: kvėpavimo takų epitelio ir liau-kinio audinio bei lygiųjų raumenų ląstelių išvešėjimą, bazinės membranos sustorėjimą, pogleivio fibrozę. Šis procesas vadinamas remodeliacija [53].
Įsijautrinusių asmenų putliosios ląstelės ir bazofilai savo paviršiuje paprastai jau turi alergenui specifinių IgE klasės antikūnų ir didelio afiniteto receptorių antikūno Fc fragmentui (angl. high-affinity IgE receptors, FcεRI)
kompleksą. Pakartotinai patekęs alergenas sujungia ne mažiau kaip dvi tokias IgE molekules. Šis junginys yra ląstelės aktyvinimo signalas – suke-liama putliųjų ląstelių degranuliacija [180]. Dendritinės ląstelės, monocitai, o taip pat ir neutrofilai pasižymi skirtinga FcεRI raiška [66]. Yra duomenų, kad astma sergančių asmenų neutrofilai taip pat gali būti aktyvinami IgE priklausomu keliu, o aktyvinti – sukelti IL-8 gamybą [125], ciklooksige-nazės-2 ekspresiją, prostaglandino E2 (PGE2), tromboksano A2 (TXA2), eozinofilų katijoninio baltymo (angl. eosinophil cationic protein, ECP) [126], išskyrimą. Šie patys mokslininkai nurodo, kad sveikų asmenų neutrofilams tokia FcεRI raiška nebūdinga arba jie nėra jautrūs IgE priklausomam aktyvavimui.
Iš aktyvintų putliųjų ląstelių granulių išsiskiria citokinai (IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-16, naviko nekrozės veiksnys alfa (angl. tumor
necrosis factor-α, TNF-α), granuliocitų-monocitų kolonijas stimuliuojantis
veiksnys (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), augimo veiksniai (kraujagyslių endotelio augimo veiksnys A (angl.
vascular endothelial growth factor A,VEGFA), biogeniniai aminai
(hista-minas ir serotoninas), proteoglikanai (heparinas, chondroitinsulfatas), pro-teazės (chimazė, triprazė, karbokslipeptidazė), įvairūs fermentai. Taip pat sintetinami nauji lipidiniai mediatoriai – arachidono rugšties metabolitai (prostaglandinas D2 (PGD2), LTC4, LTD4, LTE4, LTB4 ir iš membranos
fofolipidų sintetinamas trombocitus aktyvinantis veiksnys (angl. platelet
activating factor, PAF) [28, 72, 185]. Tam tikros anatominės srities
putlio-sios ląstelės yra šiek tiek skirtingos, o ir reakcija į stimulus ir mediatorių išskyrimas varijuoja. Aktyvuoti bazofilai taip pat išskiria histaminą, leuko-trienus (LTC4, LTD4, LTE4), citokinus (IL-4, IL-13). Išsiskyrę mediatoriai
sergantiems alergine astma sukelia šiuos ūminius patofoziologinius poky-čius: kraujagyslių išsiplėtimą ir jų sienelės laidumo padidėjimą, audinių paburkimą, stimuliuoja jutiminių nervų nociceptorius, sukelia lygiųjų bron-chų raumenų susitraukimą, padidina gleivių sekreciją. Dėl besikeičiančio kvėpavimo takų pralaidumo sutrikimo jaučiami būdingi astmos simptomai: dusulys, kosulys, švokštimas.
3.4.2.1.1 pav. Ankstyvosios fazės alergeno sukeltas kvėpavimo takų
uždegimas (pagal Galli S. J, 2008) [61].
FcεRI − didelio afiniteto receptorius antikūno Fc fragmentui; IgE – imunoglobulinas E; IL – interleukinas; LT – leukotrienas; PGD2 – prostaglandinas D2; TNF-α – tumoro nekro-zės veiksnys alfa; VEGFA − kraujagyslių endotelio augimo veiksnys A; PAF – trombocitus aktyvinantis veiksnys; CCL2 – C-C chemokino ligandas 2.
Alergenas ant putliųjų ląstelių, susijungęs su IgE ir FcεRI molekulių kompleksu, aktyvina šias ląsteles, stimuliuoja mediatorių išskyrimą bei naujų mediatorių gamybą. Greitai išskirti putliosiose ląstelėse susikaupę mediatoriai sukelia bronchų pralaidumo sumažėjimą dėl lygiųjų bronchų raumenų susitraukimo ir padidėjusios gleivių sekrecijos bei gleivinės pabur-kimo. Putliųjų ląstelių išskirti mediatoriai ne tik padidina kraujagyslių sie-nelės pralaidumą, bet ir skatina uždegimo ląstelių priplūdimą į uždegimo ži-dinį – kvėpavimo takus. Tai vyksta dėl TNF-α poveikio kraujagyslės endotelio adhezijos molekulėms, chemoatraktantų LTB4 ir PGD2,
chemo-kinų IL-8 ir C-C chemokino ligando 2 (CCL2). Visa tai yra vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimo pradžia.
3.4.2.2. Vėlyvos fazės kvėpavimo takų uždegimas
Vėlyvos fazės uždegimo kvėpavimo takuose požymiai paprastai atsi-randa praėjus 2–6 val. po alergeno patekimo ir ankstyvosios fazės uždegimo (3.4.2.2.1 pav.) [62]. Nėra aišku, kodėl ji išsivysto ne visiems asmenims, sergantiems astma, o ir aiškios ribos tarp ankstyvos fazės uždegimo pabaigos ir vėlyvos pradžios nėra. Manoma, kad leukocitų susitelkimą uždegimo židinyje skatina putliųjų ląstelių mediatoriai, o kiek vėliau – ir aktyvuotų Th2 limfocitų citokinai (IL-5 ir GM-CSF) [19]. Putliųjų ląstelių mediatoriai, naujai gaminami ląstelėse, išsiskiria įvairiu metu, o jų poveikis skirtingas: TNF-α, LTB4, IL-8, CCL2 gali tiesiogiai ir netiesiogiai skatinti uždegimo ląstelių migraciją į uždegimo židinį; TNF-α ir IL-5 aktyvuoja nespecifinio imuninio atsako ląsteles; IL-10, TNF-α, TGF-β, histaminas stimuliuoja dendritines ląsteles, T ir B limfocitus [60,67]. Kai kurie iš putliųjų ląstelių mediatorių reguliuoja ir kvėpavimo organų struktūrinių ląstelių-epitelinių, endotelio, fibroblastų, lygiųjų raumenų ir nervinių ląste-lių veiklą. Astmos patofiziologiniai simptomai – vėlyva bronchų obstruk-cija – atsiranda dėl struktūrinių kvėpavimo organų ląstelių ir periferinio kraujo leukocitų, priplūstančių į kvėpavimo takuose esantį alerginio uždegi-mo židinį, veikiuždegi-mo [79]. Epitelio ląstelių ir T limfocitų gaminamas ir išski-riamas su kalcitonino genu susijęs peptidas (angl. calcitonin-gene-related
peptide, CGRP) yra svarbus kraujagyslių išsiplėtimą vėlyvos fazės
užde-gimo metu skatinantis veiksnys [92].
Vėlyvos fazės uždegimo svarbiausi veikėjai – eozinofilai, T limfocitai pagalbininkai, neutrofilai, makrofagai – ne tik susikaupia uždegimo židi-nyje, bet aktyvuoti išskiria žalojančius kvėpavimo takų audinius mediato-rius, sukelia lėtinį uždegimą [145]. Mokslininkai sutaria, kad vėlyvos fazės uždegimas geriausiai atspindi astmos patogenezės esmę, o jo tyrimai – svarbiausi aiškinant astmos išsivystymą.
3.4.2.2.1 pav. Vėlyvos fazės alergeno sukeltas kvėpavimo takų uždegimas
(pagal Galli S. J, 2008) [61].
IL – interleukinas; TNF-α – tumoro nekrozės veiksnys alfa; LT-leukotreinas; GM-CSF – granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantis veiksny; Th – T limfocitas pagalbininkas; MMP – matrikso metaloproteinazė.
Vėlyva fazė atsiranda praėjus 2–6 valandoms po alergeno stimuliacijos ir ankstyvos fazės uždegimo. Tai įgimto ir specifinio imuninio atsako ląste-lių, esančių kvėpavimo organuose ar priplūstančių iš sisteminės kraujotakos, taip pat ir jų išskiriamų mediatorių veiklos rezultatas. Čia veikia įgimto imuniteto veiksniai – neutrofilai, eozinofilai, bazofilai. O alergeno, IgE anti-kūnų ir FcRI susijungimas putliųjų ląstelių paviršiuje ir jų aktyvavimas, taip pat T limfocitų sugebėjimas atpažinti alergeną yra svarbiausia specifinio imuninio atsako grandis astmos patogenezėje. Aktyvuoti T limfocitai pagal-bininkai diferencijuojasi į įvairias subpopuliacijas, besiskiriančias savo funkcijomis, įtaka uždegimui ir astmos raidai. Th17 limfocitai susiję su neu-trofilų, o Th2 limfocitai – su eozinofilų veiklos skatinimu. Vėlyvos fazės uždegimo metu neutrofilų elastazė aktyvuoja matrikso metaloproteinazę (MMP) ir III tipo kolageno degradaciją ir sukelia kvėpavimo takų
dimą; eozinofilų pagrindinis baltymas ir kai kurie kiti mediatoriai pažeidžia epitelio ląsteles, sukelia bronchų susiaurėjimą.
3.4.3. T limfocitai – pagrindinės astmos patogenezėje dalyvaujančios ląstelės
T limfocitai – pagrindinės specifinio imuninio atsako ląstelės. T limfo-citų pavadinimas kilęs iš lotyniško užkrūčio liaukos pavadinimo thymus, kurioje ir vyksta šių ląstelių brendimas. Ląstelės laisvai cirkuliuoja kraujyje, telkiasi limfiniuose organuose, visuose audiniuose ir organuose. T limfocitai gali specifiškai atpažinti į organizmą iš aplinkos patekusį antigeną. Jie nu-lemia imuninio atsako įvairovę, specifiškumą, imuninę atmintį. T limfocitų paviršiuje esantys receptoriai (angl. T cell receptors, TCR) išskiria šias ląs-teles iš kitų limfocitų. Jie reikalingi T limfocitui atpažįstant antigenus, aso-cijuotus su pagrindiniu audinių suderinamumo komplekso (angl. major
histocompatibility complex, MHC) I ir II klasės molekulėmis. Be to, T
limfocitų paviršiuje yra baltymai, vadinami CD molekulėmis arba diferen-ciacijos grupių molekulės (angl. cluster of differentiation, CD), kurios rodo ląstelių diferenciacijos laipsnį, aktyvumą, funkcinę paskirtį. Jie yra ir atskirų ląstelių grupių – populiacijų žymenys (T limfocitų, B limfocitų, NK ląste-lių). Priklausomai nuo to, kokias molekules CD4+ ar CD8+ paviršiuje turi T limfocitai, jie skirstomi į dvi stambias populiacijas: T limfocitai pagalbi-ninkai ir T limfocitai žudikai. CD4+ yra T limfocitų pagalbininkų skiriamoji molekulė. Ne tik T limfocitai, bet ir kitos ląstelės (monocitai, makrofagai) pasižymi šios molekulės raiška savo paviršiuje. CD8+ molekulė yra T lim-focitų žudikų skiriamasis požymis. Svarbiausios šių molekulių funkcijos – signalo perdavimas ir ląstelių sąveika.
T limfocitų veikla reguliuojama daugeliu būdų: signalas perduodamas dalyvaujant visai eilei molekulių, antigeną sujungiančių receptorių, citokinų, kinazių, transkripcijos veiksnių. Antigenui patekus į organizmą, jį atpažįsta įgimto imuniteto ląstelės (dendritinės ląstelės kvėpavimo takuose) ir, pagal antigeno tipą, MHC I ar II klasės molekulių pagalba pateikiami naiviesiems CD4+ T limfocitams. Taip sukeliamas specifinis imuninis atsakas. Paska-tinti naivieji CD4+T limfocitai diferencijuojasi į skirtingas efektorinių T limfocitų subpopuliacijas: CD4+INF-γ (pirmo tipo T limfocitus pagalbinin-kus, Th1), CD4+IL-4+ (antro tipo T limfocitus pagalbininpagalbinin-kus, Th2), CD4+IL-9+ (devinto tipo T limfocitus pagalbininkus, Th9), CD4+IL-17+ (septyniolikto tipo T limfocitus pagalbininkus, Th9), CD4+CD25+ (T regu-liacinius limfocitus, Treg) [166,201,202].
CD4+ T limfocitai (T limfocitai pagalbininkai) – pagrindinės imuninės sistemos ląstelės. Jie skatina B limfocitus gaminti antikūnus, reguliuoja
CD8+ T limfocitų (T limfocitų žudikų) bei makrofagų funkcijas, suderina imuninės sistemos įvairių komponentų veiksmus, nukreiptus į svetimų or-ganizmui agentų sunaikinimą, reguliuoja/slopina imuninį atsaką, kontro-liuoja autoimunitetą, regukontro-liuoja imuninio atsako stiprumą. Pagrindinė CD8+ T limfocitų funkcija yra sunaikinti virusų infekuotas piktybines bei pažeistas ląsteles. Paskatinti CD8+ T limfocitai gali diferencijuotis į skirtingas subpo-puliacijas, kaip antai CD8+IFN-γ, CD8+IL-4. Dar viena svarbi T limfocitų subpopuliacija yra CD4+CD25+T limfocitai arba reguliaciniai T limfocitai. Ši specializuota T limfocitų subpopuliacija slopina imunines reakcijas, pa-laiko imuninės sistemos homeostazę ir toleranciją saviems antigenams. Šių ląstelių išskiriami citokinai (IL-10 ir TGF-β) pasižymi uždegimą slopinan-čiu poveikiu [110]. Pastebėta, kad Treg limfocitai, slopindami signalo perdavėją ir transkripcijos veiksnį 3 (angl. signal transducer and activator
of transcription 3, STAT3), kuris reikalingas Th17 limfocitų aktyvavimui,
sukelia nekontroliuojamą, nuo šių ląstelių veikimo priklausomą lėtinį uždegimą [36].
3.4.3.1. 17-o tipo T limfocitai pagalbininkai
Atsakydama į įvairius dirgiklius, imuninė sistema gamina mediatorius, stimuliuojančius naiviuosius T limfocitus ir, TCR bei kostimuliuojančių mo-lekulių pagalba, sukelia skirtingų T limfocitų pagalbininkų subpopuliacijų susidarymą. IFN-γ ir IL-2 sukelia Th1 limfocitų subpopuliacijos gausėjimą bei aktyvuoja juos kovojant su viduląsteliniais mikroorganizmais. IL-2 skatina ir Th2 limfocitų subpopuliacijos susidarymą. Pastaroji susijusi su B limfocitų aktyvinimu ir antikūnų gamyba. Šios subpopuliacijos ląstelės svarbios gynybai nuo įvairių mikroorganizmų, parazitų, alergenų. Be to, efektoriniai citokinai, kuriuos išskiria aktyvuoti T limfocitai, grįžtamuoju ryšiu gali stiprinti jų pačių diferenciaciją. Pastebėtas tam tikras antagoniz-mas tarp šių dviejų skirtingų T limfocitų subpopuliacijų. Beveik ketvirtį amžiaus gyvavo darnaus Th1 ir Th2 limfocitų santykio teorija, pagal kurią autoimuninės ar alerginės ligos priklauso tik nuo šių subpopuliacijų santykio [129]. Viskas pasikeitė nustačius naują T limfocitų populiaciją – CD4+ T limfocitus, išskiriančius IL-17.
Th17 yra skirtinga efektorinių T limfocitų subpopuliacija. Pirmoji ir reikšmingiausia jų funkcija – kova su ekstraląsteliniais patogenais, nuo kurių neapsaugo Th1 ir Th2 limfocitų imuninis atsakas. Pastebėta jų reikšmė lėtinio uždegimo raidai. O nauji moksliniai tyrimai su gyvūnais atranda vis naujus Th17 limfocitų ir jų išskiriamų citokinų poveikius, svarbius alerginės astmos vystymuisi. Tai suburia mokslininkus detalesniems Th17 limfocitų subpopuliacijos tyrinėjimams.
Pirmieji moksliniai tyrimai, nustatę IL-17 gaminančias ląsteles gyvūnų ir žmogaus organizmuose, buvo atlikti paskutiniuoju praeito šimtmečio dešimtmečiu. 2000 m. mokslininkai aprašė skirtingą nei Th1 ir Th2 lim-focitų subpopuliaciją, kuri, paskatinta mikrobinės kilmės veiksniais, gamina ir išskiria IL-17 [82]. Literatūroje aprašomos tyrimuose su gyvūnais nusta-tytos IL-17 gaminančios ląstelės, reikšmingesnės nei Th1 limfocitai artrito bei encefalomielito vystymuisi [104,131]. Šie atradimai buvo ženklas apie IL-17 bei jį gaminančių ląstelių reikšmę lėtinio uždegimo raidai, paskatinęs naujus mokslinius tyrinėjimus. Th17 limfocitų vystymasis skiriasi nuo kitų T limfocitų subpopuliacijų. Nustatytas aktyvuotų dendritinių ląstelių gami-namas IL-23 [138], skatinantis vystytis Th17 limfocitų subpopuliaciją ir išskirti IL-17 [5]. Skirtingai nei Th1 ir Th2 limfocitų vystymuisi, jiems ne-reikalingi transkripcijos veiksniai, tokie kaip signalo perdavėjai ir transk-ripcijos aktyvatoriai STAT1, STAT4 ir STAT6 bei transktransk-ripcijos veiksnys T-bet (angl. T-box transcription factor) [71]. Svarbiausiais Th17 limfocitų transkripcijos veiksnys yra RORγt (angl. retinoic acid receptor-related
orphan receptor-γt) [84]. Vėliau atliktais tyrimais nustatyta, kad ne vien tik
IL-23, o veikiau kiti citokinai reikalingi IL-17 gaminančių ląstelių diferenciacijai. Pelių eksperimentinės astmos modeliuose tai IL-6 kartu su transformuojančiu augimo veiksniu TGF-β (angl. transforming growth
factor-β, TGF-β) [21]. Paskatinus T limfocitus 6 kartu su TGF-β bei
IL-23, sulaukiama intensyvaus IL-17 gaminančių ląstelių atsako, o kitas interleukinas (IL-10), kuris pasižymi priešuždegiminiu veikimu, iš viso negaminamas [117]. Be to, nesant IL-6, autokrininis Th17 limfocitų IL-21 gali skatinti šių ląstelių vystymąsi [135]. Kitų autorių darbai rodo, kad yra mediatorių, tokių kaip IL-27, kurie, veikdami naiviuosius T limfocitus, skatina Th1 T limfocitų atsako formavimąsi bei slopina Th17 limfocitų vystymąsi [17]. IL-35, kurį išskiria CD4+CD25+Foxp3+T limfocitai, slopi-na Th17 T limfocitų imuninį atsaką pelių eksperimentinio kolagenu indu-kuoto artrito modelyje [134]. Reikia priminti, kad žmogaus organizme IL-1β su IL-23 ar IL-1β su IL-6, bet ne kiekvienas atskirai ir ne TGF-β, sukelia Th17 limfocitų subpopuliacijos gausėjimą ir brendimą.
3.4.3.2. Interleukinas-17
Interleukinas-17 yra 20–30 kDa baltymas, gaminamas CD4+T limfo-citų. Nustatyta, kad IL-17 gali gaminti ir išskirti kitos, taip pat ir bronchų epitelio ląstelės ir fibroblastai. Šį citokiną mokslininkai nustatė dar 1995 m. Jie pastebėjo, kad IL-17A baltymo amino rūgščių seka 57 proc. sutampa su T ląstelių tropizmu pasižyminčio viruso, Herpes Saimiri, geno 13 (HVS13) kodu, nors šio panašumo biologinė reikšmė ir nėra aiški [86]. Išskiriama
letas šių citokinų: IL-17 (dar vadinamas IL-17A), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (taip pat žinomas kaip IL-25) ir IL-17F. IL-17, kaip ir jo receptoriai (IL-17RA, RB, RC, RD, RE), yra vieninteliai tokios rūšies, nepanašūs į kitus. Šis interleukinas veikia daugelyje organizmo vietų, o jo biologinis veikimas – įvairialypis. IL-17 yra potencialus audinių destrukcijos ir lėtinio uždegimo sukėlėjas [141]. Literatūros duomenys rodo, kad IL-17, veik-damas tiesiogiai ir netiesiogiai, stimuliuoja neutrofilų brendimą, migraciją ir funkciją [33,76,162]. Jis aktyvuoja kvėpavimo takų struktūrines ląsteles – epitelines, lygiųjų raumenų, fibroblastus. Iš bronchų epitelio ląstelių daugiau išsiskiria β-defensino, tarpląstelinių adhezijos molekulių (angl. intracellular
adhesion molecule, ICAM) ICAM-1, IL-8, chemokino ligando, CXCL1,
CCL20, G-CSF, daugiau epitelio mucinų (MUC5AC ir MUC5B). IL-17 taip pat skatina IL-6 ir IL-8 išskyrimą iš bronchų lygiųjų raumenų ląstelių [77,85]. Be to, IL-17 stimuliuoja makrofagus išskirti uždegimo mediatorius, IL-1β ir TNF-α, o veikdamas kartu su TNF-α sukelia fibroblastuose IL-6 ir GM-CSF gamybą [57]. Visa tai stimuliuoja granulopoezę kaulų čiulpuose, neutrofilų priplūdimą į uždegimo židinį ir sukelia ženklią kvėpavimo takų neutrofiliją. Be to, tyrėjai nustatė, kad IL-17 veikia ir neutrofilų funkciją juos aktyvindamas [102]. Įvertinus šiuos duomenis, aiškėja teigiamas užde-gimą skatinantis IL-17 poveikis ir jo reikšmė kovojant su infekcija.
Kleb-siella pneumoniae sukelto plaučių uždegimo modelyje, pelėms,
neturin-čioms IL-17R, nustatyta sutrikusi kvėpavimo takų apsauga nuo infekcijos ir šimtaprocentinis mirštamumas lyginant su kontrole [87]. Tačiau yra ir antroji, kitaip tariant, neigiama šio citokino biologinio veikimo pusė. Įvairių stimulų paskatintos įgimto ir įgyto imuninio atsako ląstelės išskiria IL-17, pastarasis skatina lėtinį neinfekcinį uždegimą ir aktyviai dalyvauja autoimu-ninių, alerginių ligų patogenezėje. Sergant reumatinėmis ligomis IL-17 su-kelia kremzlės destrukciją dėl MMP aktyvumo stimuliacijos ir proteoglika-nų sintezės slopinimo, osteoklastų aktyvinimą ir dėl to atsirandantį kaulinio audinio nykimą. Tai patvirtina eksperimentiniai kolagenu indukuoto artrito tyrimai bei klinikiniai tyrimai sergantiesiems reumatoidiniu artritu [4,184,203]. Uždegiminių žarnyno ligų metu IL-17 stimuliuoja MMP, IL-6, IL-8 gamybą žarnyno pogleivio miofibroblastuose. Sergantiesiems Krono liga ar opiniu kolitu IL-17 stimuliuoja neutrofilų judėjimą ir žarnos sienelės uždegimą [97]. Keletas tyrimų, atliktų sergantiesiems psoriaze, atopiniu dermatitu, pemfigoidu atskleidė, kad IL-17 reguliuoja GM-CSF, IL-6, redu-kuoto grafeno oksidas gamybą keratinocituose, tokiu būdu sukeldamas specifinius lėtinių odos uždegiminių ligų klinikinius požymius [98,177]. Centrinėje nervų sistemoje IL-17 sutrikdo hematoencefalinį barjerą, gerin-damas sąlygas CD4+T limfocitų migracijai bei jų patologiniam veikimui
sergant išsėtine skleroze. Visi šie radiniai leidžia pamatyti daugialypį IL-17 veikimą autoimuninių ir uždegiminių ligų patogenezėje. Pastarųjų metų mokslinėje literatūroje išskirtinis dėmesys skiriamas IL-17 bei jo įtakai neutrofiliniam kvėpavimo takų uždegimui sergant astma [123].
Įsivyravo nuomonė, kad astma yra Th2 limfocitų imuninio atsako su-kelta ir eozinofiliniu uždegimu kvėpavimo takuose pasireiškianti liga. Ser-gantiesiems astma padidėja Th2 limfocitų kiekis bei jų aktyvumas. Šia liga sergančių pacientų bronchoalveolinio lavažo (BAL) skystyje, indukuotuose skrepliuose (IS) ar plaučių audinio biopsijoje nustatomi padidėję šių ląstelių išskiriamų citokinų IL-4, IL-5, IL-13 ir jų iRNR kiekis. Transkripcijos veiksnio GATA-3 raiška Th2 limfocituose sergant astma – didelė. Visa tai patvirtina šios efektorinės T limfocitų subpopuliacijos reikšmę astmos pato-genezėje. Mokslininkai patvirtino, kad T limfocitai pagalbininkai reguliuoja granuliocitų migraciją į kvėpavimo takus sergant obstrukcinėmis plaučių ligomis. Th2 limfocitai ir jų išskiriamas IL-5 yra svarbus eozinofilų migracijos į kvėpavimo takus sergant astma mediatorius [132]. Tyrimuose su gyvūnais įrodyta, kad specifiniai antikūnai prieš T limfocitus pagalbinin-kus, anti-IL-2, sutrikdo alergenų sukeltą eozinofilų ir neutrofilų priplūdimą į kvėpavimo takus alerginės astmos modelyje [152]. T limfocitų pagalbininkų išskirti veiksniai, skatinantys neutrofilų migraciją sergant alergine astma, nėra iki galo ištirti. Toks veiksnys galėtų būti IL-17.
Literatūroje aprašomi moksliniai tyrimai, kurių metu nustatytas padi-dėjęs IL-17 kiekis sergančių astma BAL, IS, serume. Pastebėta, kad padidė-jusi IL-17 koncentracija skrepliuose dažnai yra susipadidė-jusi su padidintu bron-chų reaktyvumu [15] ar astmos sunkumu [35]. Šie faktai teigia, kad IL-17 ir jį gaminančios ląstelės gali būti vieni iš svarbesniųjų astmos patogenezės dalyvių. Pastebime, kad IL-17 skatinanti uždegimą veikla iš pirmo žvilgsnio visiškai nesusijusi su Th2 limfocitų imuniniu atsaku: IL-8 yra žinomas neutrofilų chemoatraktantas, IL-6 ir GM-CSF svarbūs granuliocitų, ypatin-gai neutrofilų, gamybai. Tyrimuose su gyvūnais nustatyta įkvėpus IL-17 atsirandanti kvėpavimo takų neutrofilija [80], o stimuliavus sergančių astma bronchų epitelio ląsteles, sukeliamas IL-8 ir neutrofilų kiekio kvėpavimo takuose padidėjimas [102]. Remiantis šiais pastebėjimais, astmos patogene-zės aiškinimas įgavo naujų argumentų, o neutrofilinis astmos fenotipas vėl atsirado dėmesio centre.
Eksperimentiniuose tyrimuose su alerginės astmos gyvūnų modeliais aktyviai tiriama IL-17 išskiriančių CD4+ T limfocitų veikla ir reikšmė ligos patogenezei. Viename iš jų aptariami rezultatai, kuomet ovalbumino inhalia-cija juo įsijautrinusioms pelėms, esant eozinofiliniam lėtiniam kvėpavimo takų uždegimui, sukelia žymų IL-17 iRNR pagausėjimą plaučių audinyje,
lydimą neutrofilų kiekio padidėjimo [76]. Tame pačiame tyrime pastebėta, kad anti-IL-17 monokloniniai antikūnai (mAk), suleisti pelėms prieš provokaciją ovalbuminu, žymiai sumažina neutrofilų priplūdimą į kvėpavi-mo takus, padidindami IL-5 kiekį kvėpavikvėpavi-mo takuose bei eozinofilinį uždegimą. Šis gydymas sumažino kvėpavimo takų neutrofiliją lygiagrečiai su neutrofilų kiekio periferiniame kraujyje ir jų sintezės kaulų čiulpuose sumažėjimu. Kitame tyrime nustatyta, kad IL-17R neturinčioms pelėms ne tik nesukeliamas neutrofilinis kvėpavimo takų uždegimas, bet sumažėja ir eozinofilinis, susijęs su Th2 limfocitų veikimu [159]. Panašius duomenis skelbia kiti tyrėjai, kurie nustatė, kad, nesant IL-17, pelėms po provokacijos alergenu sutrinka Th2 limfocitų atsakas. Taigi IL-17 ir IL-17R nebuvimas sumažina ne tik neutrofilinį, bet ir su Th2 limfocitais susijusį eozinofilinį kvėpavimo takų uždegimą pelių alerginės astmos modeliuose. Yra tyrėjų, kurie nurodo dvigubą ar net priešingą IL-17 veikimą eozinofilinio uždegimo atžvilgiu. Jie nustatė, kad alergeno patekimas įsijautrinusioms pelėms plaučiuose sukelia padidintą IL-23 iRNR raišką, o IL-23 sukelia ir eozino-filų, ir neutrofilų susitelkimą kvėpavimo takuose, skatina Th2 limfocitų citokinų išskyrimą, liaukinio audinio vešėjimą, kvėpavimo takų jautrumo padidėjimą [76,186]. Abiejų, Th2 ir T17 limfocitų, veiklos sąlygotas užde-gimas padidina bronchų jautrumą, tačiau pastebima, kad CD4+IL-17 T limfocitai sąlygoja gydymui įkvepiamaisiais gliukokortikosteroidais atsparų uždegimą. Šis atradimas yra svarbus siekiant išaiškinti gydymui įkvepiamais gliukokortikoidais atsparios astmos fenotipą [118]. Nepaisant neginčytinų ir svarių argumentų, patvirtinančių Th17 limfocitų svarbą astmos vystymuisi, vis dėlto nėra žinoma, kaip ir kodėl Th17 limfocitai dalyvauja alergeno sukeltame su Th2 limfocitais susijusiame imuniniame atsake.
Neutrofiliniai granuliocitai – imuninės sistemos ląstelės, kurių svar-biausia funkcija yra apsaugoti nuo bakterinės ar grybelinės infekcijos. Dau-gelis tyrimų nurodo neutrofilus esant astmos pažeistuose kvėpavimo ta-kuose. Jų randama tiriant astma sergančių pacientų plaučių audinio biopsinę medžiagą, BAL ar IS [124]. Kvėpavimo takų neutrofilija nustatoma sergant sunkios eigos astma, yra susijusi su nuolatiniu kvėpavimo takų siaurėjimu [164]. Kai kurie tyrimai patvirtina, kad neutrofilai yra dominuojančios kvė-pavimo takų uždegimo ląstelės esant sunkios astmos paūmėjimui [140], nu-statomi mirusiųjų nuo astmos asmenų kvėpavimo takuose [171]. Moksli-ninkai atskleidė, kad sergantiesiems alergine astma, kurių kvėpavimo takuose vyrauja neutrofilai, mažiau efektyvus gydymas įkvepiamaisiais gliukokortikoidais [20]. Kita vertus, gyvuoja ir kita nuomonė – sergantie-siems sunkios eigos astma ir gydomiems didelėmis įkvepiamųjų gliukokor-tikoidų dozėmis padidėja neutrofilų kiekis kvėpavimo takuose dėl šių
ląstelių natūralios žūties (apoptozės) slopinimo. Tai prailgina neutrofilų gyvavimą ir veiklą sergančių astma kvėpavimo takuose. Aktyvuoti neutro-filai gamina LTA2, LTB2, TXA2, citokinus (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α),
augi-mo veiksnį TGF-β, proteazes (elastazę, MMP2 ir MMP9), mieloperoksidazę (MPO), prilipimo molekules, reaktyvias deguonies formas (angl. reactive
oxygen species, ROS) ir eozinofilų katijoninį baltymą [126]. Išsiskyrusios į aplinką šios biologiškai aktyvios medžiagos skatina nuolatinį kvėpavimo takų uždegimą, ilgainiui sergantiesiems astma sukeliantį struktūrinius kvė-pavimo takų ir kvėkvė-pavimo organų funkcijos pokyčius.
Pastaraisiais metais mokslininkai nustatė, kad ne tik putliosios ląstelės, bazofilai, eozinofilai, trombocitai, monocitai, dendritinės ir Langerhanso ląstelės turi savo paviršiuje FcεRI. Nustatyta, kad atopine astma sergančių asmenų periferinio kraujo neutrofilams būdinga FcεRI raiška ir sugebėjimas sujungti IgE [127]. Priešingai, sveikų žmonių neutrofilai neturi FcεRI arba negali būti aktyvinami su IgE susijusiu mechanizmu. IgE prailgina neutro-filų išlikimą kvėpavimo takuose slopindamas šių ląstelių apoptozę [156], tuo pačių skatindamas IL-8 išsiskyrimą bei neutrofilų pritraukimą į už-degimo židinį. Kai kurie tyrėjai pastebėjo, kad po bronchų provokacijos alergenu, neutrofilai kvėpavimo takuose pastebimi ankščiau nei eozinofilai [113], pastebimas jų veiklos suaktyvėjimas [107]. Šis mechanizmas vis dar nėra ištirtas. Gali būti, kad vienas iš neutrofilų migraciją ir jų aktyvumo padidėjimą sergantiems astma sukeliančių veiksnių yra alergeno įkvėpimo sužadintas IL-17 koncentracijos padidėjimas kvėpavimo takuose.
Apibendrinant šiuos literatūros duomenis galima iškelti hipotezę, kad Th17 limfocitai bei jų išskiriamas neutrofilus veikiantis IL-17 galėtų būti svarbi alerginės astmos patogenezės grandis.
4. TYRIMO METODIKA
Perspektyvusis mokslinis tyrimas atliktas 2010–2012 m. Lietuvos svei-katos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos Pulmonologijos ir imunologijos klinikoje, gavus Kauno regioninio Biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (2010 12 06, Nr. P1-48/2004, versija 4, 2010), Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos leidimą atlikti asmens duomenų tvarkymo veiksmus (2014 05 16, Nr. 2R-2556 (2.6-1)). Šis mokslinis tyrimas buvo Lietuvos mokslų tarybos Nacionalinės mokslo programos „Lėtinės neinfekcinės ligos“ finansuojamo projekto „Uždegiminių ląstelių fenotipo ir funkcijų ypatumai alerginių kvėpavimo ligų eigos progno-zavimui“ (LIG-18/2010) dalis. Visi pakviesti į tyrimą asmenys buvo supa-žindinti su mokslinio tyrimo protokolu, o tyrime apsisprendę dalyvauti asmenys savo sutikimą patvirtino raštu informuoto asmens sutikimo for-moje. Vienas sutarties variantas atiduotas tiriamajam.
4.1. Tiriamųjų kontingentas ir tyrimo eiga 4.1.1. Atrankos kriterijai
Dalyvauti moksliniame tyrime atrinkti 102 nerūkantys asmenys, kurios tyrė ir gydė gydytojas alergologas ir klinikinis imunologas 2010–2012 metais LSMUL KK Pulmonologijos ir imunologijos klinikos ambulato-riniame kabinete. Į tyrimą įtraukta 80 asmenų (47 vyrai ir 33 moterys, amžiaus vidurkis 34 ± 3 metai), kurie atitiko visus atrankos kriterijus. Iš jų: 30 sergančių alergine astma; 30 sergančių alerginiu rinitu (palyginamoji grupė); 20 sveikų asmenų (kontrolinė grupė).
Visiems tiriamiesiems taikyti šie bendrieji atrankos kriterijai:
Bendrieji įtraukimo kriterijai:
1. Amžius nuo 18 iki 50 metų; 2. Vyrai ir moterys;
3. Informuoti apie mokslinio tyrimo tikslą ir eigą, o sutikimą daly-vauti jame patvirtinę raštu.
Bendrieji neįtraukimo kriterijai:
1. Kitos kvėpavimo ligos (tokios kaip lėtinė obstrukcinė plaučių liga, plaučių vėžys, sarkoidozė, tuberkuliozė ir kt.);
2. Kvėpavimo organų infekcija per paskutinį mėnesį iki tyrimo pradžios;
3. Kitos ženklios vidaus organų ligos ir būklės (įskaitant psichikos sutrikimus) su organų funkcijos nepakankamumu;
4. Kontraindikacijos alerginių odos ir (ar) bronchų provokacijos mė-ginių atlikimui;
5. Kontraindikacijos adrenalino naudojimui;
6. Forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę (FEV1) < 70 proc.
normos; 7. Rūkymas;
8. Nėštumas ir žindymas.
Sergančių alergine astma įtraukimo kriterijai:
1. Intermituojanti ar persistuojanti lengva/vidutio sunkumo astma, nustatyta vadovaujantis GINA 2002 m. kriterijais [133];
2. Astmos simptomų trukmė ≥ 1 metai;
3. Forsuoto iškvėpimo tūris per pirmąją sekundę (FEV1) ≥ 70 proc.
normos;
4. Teigiamas bronchų provokacijos mėginys su metacholinu;
5. Teigiamas odos dūrio mėginys su namų dulkių erkės D.
pterony-ssinus alergenu.
Sergančių alerginiu rinitu įtraukimo kriterijai:
1. Alerginio rinito diagnozė nustatyta vadovaujantis ARIA 2001 m. kriterijais [26];
2. Alerginio rinito simptomų trukmė ≥1 metai;
3. Teigiami odos dūrio mėginiai su namų dulkių erkės D.
pterony-ssinus alergenu.
Sergančių alergine astma ir alerginiu rinitu bendri neįtraukimo kri-terijai:
1. Klinikiniai sezoninės alergijos simptomai;
2. Kliniškai reikšmingos nuolatinės alergijos simptomai (pvz., sukeltos katės, šuns epidermio alergenų);
3. Astmos paūmėjimas per paskutinį mėnesį iki tyrimo pradžios; 4. Gydymas vaistais: vietinio poveikio (tame tarpe ir įkvepiamais) bei
sisteminio poveikio gliukokortikoidais paskutinį mėnesį iki tyrimo pradžios; H1 receptorių blokatoriais, tricikliais antidepresantais, leukotrienų receptorių blokatoriais – paskutinę savaitę iki tyrimo pradžios; ilgai veikiančiais bronchus plečiančiais vaistais – 48 val., o trumpai veikiančiais – 12 valandų iki tyrimo pradžios.
4.1.2. Tyrimo eiga
Atvykti į Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Pulmonologijos ir imunologijos kliniką tiriamieji asmenys buvo kviečiami 3 kartus. Atrankos vizito metu (pirmas vizitas) patikrinti įtraukimo/neįtraukimo kriterijai, atlik-tas fizinis tiriamųjų asmenų ištyrimas, plaučių funkcijos tyrimas, bronchų
