LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Milda Galdikaitė
Audinių aleutinės ligos paplitimas ir įtaka sveikatingumui ir
produkcijos kokybei
Aleutian disease prevalence and influence for health and
quality of production
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Algirdas Šalomskas
2 DARBAS ATLIKTAS LSMU VETERINARIJOS AKADEMIJOS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROS
PATOLOGIJOS CENTRE 2016-2017 METAI
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas
„Audinių aleutinės ligos paplitimas ir įtaka sveikatingumui ir produkcijos kokybei“ 1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Milda Galdikaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Milda Galdikaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO Algirdas Šalomskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS
KATEDROJE/KLINIKOJE Saulius Petkevičius
(aprobacijos data) (katedros/klinikos vedėjo/jos vardas, (parašas) pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-riaus) vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
3 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 6 ĮVADAS... 7 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9 1.1 Kanadinė audinė ... 9 1.1.1 Kailių dydžiai ... 9
1.2 Audinių imuninė sistema ... 10
1.2.1 Nespecifiniai mechanizmai ... 10
1.2.2 Specifiniai mechanizmai ... 11
1.2.3. Specifinio imuninio atsako vertinimas ... 13
1.3 Dažniausios audinių virusinės ligos ... 13
1.3.1 Mėsėdžių maras ... 13
1.3.2. Virusinis enteritas ... 14
1.4. Aleutinė liga ... 15
1.4.1 Aleutinės ligos sukėlėjas ... 15
1.4.2. Ligos vystymasis ... 15
1.4.3. Klinikiniai požymiai ... 17
1.4.4 ADV patologiniai pakitimai ... 17
1.4.5 Aleutinės ligos kontrolė ... 19
2.TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGOS ... 21
2.1 Tyrimo objektas ... 21
2.2.Imunoelektroforezė (CIEP) ... 21
2.3.Imunofermentinė analizė ... 21
2.4.Jodo reakcija ... 22
3.TYRIMO REZULTATAI ... 24
3.1. Aleutinės ligos paplitimas Lietuvoje ... 24
3.2 Aleutine liga sergančių audinių sveikatingumas ... 26
4.REZULTATŲ APTARIMAS ... 35
IŠVADOS ... 38
4 SANTRAUKA
Audinių aleutinės ligos paplitimas ir įtaka sveikatingumui ir produkcijos kokybei
Milda Galdikaitė Magistro baigiamasis darbas
Šio magistrinio darbo tikslas yra išsiaiškinti audinių Aleutinės ligos paplitimą Lietuvoje. Sužinoti kokią įtaka ši liga daro kailinių žvėrelių fermose auginamų audinių sveikatingumui ir, kaip dėl jos keičiasi jų gaunamos produkcijos kokybė lyginant skirtingų amžiaus grupių bei lyties audines, taikant skirtingus viruso išskyrimo metodus.
Tyrimai buvo atliekami 2016-2017 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Veterinarinės patobiologijos katedroje bei Olandijos laboratorijoje Pecon BV.
Mėginiai buvo imami iš vieno „Kailinių žvėrelių ūkio X“, kuris turi du padalinius. Mėginiai ūkyje buvo imami norint ištirti audinių Aleutinės viruso buvimą. Visiems atliktiems tyrimams buvo paimta išviso 3370 kraujo mėginių. Tyrimai buvo atliekami taikant statistinė analizę, imunoelektroforezę (120 mėginių), imunofermentinę analizę (1200 mėginių), jodo testą (2050 mėginių).
Atlikus tyrimus nustatytas, kad Aleutinės ligos virusas Lietuvoje yra labai paplitęs ir 37,4 proc. visų Lietuvos audines auginančių ūkių yra užsikrėtę šiuo virusu. Taip pat tyrimais nustatėme, jog 19,33 proc. Aleutine liga sergančių patelių būna bergždžios, o jų atvedamos vados būna 2,7 karto mažesnės nei sveikų patelių vedamos vados. Audinių populiacijos tyrimas parodė, kad Aleutine liga sergantys patinai prasčiau auga, suprastėja jų kailio kokybė. Ištyrus priklausomybę nuo spalvos nustatėme, jog vietinės Braun spalvos žvėreliai yra atsparesni Aleutinei ligai. Atlikus imunofermentinę analizę nustatėme, kad X ūkyje tirtos audinės daugiausia yra užsikrėtusios mažo virulentiškumo virusu.
5
SUMMARY
Aleutian disease prevalence and influence for health and quality of production Milda Galdikaitė
Master‘s thesis
The aim of this Master's thesis is to find out the prevalence of the Aleutian disease in Lithuania. To determine the effect of this disease on the health of minks in fur farms, and how it‘s change the quality of their produce by comparing different age groups and sex minks using different virus isolation methods.
Studies were conducted in 2016-2017 at the Department of Veterinary Pathobiology of the Lithuanian Veterinary Academy and Pecon BV laboratory in the Netherlands.
Blood samples were taken from one Fur farm farm X, which has two departments. A total number of samples were 3370. The studies were performed using statistical analysis, imunoelectrophoresis (120 samples), ELISA (1200 specimens) and iodine test (2050 samples).
The research showed that the Aleutian Disease virus in Lithuania is very widespread (37.4 %). We also found that 19.33 % females suffering from an Aleutine disease are infertile and their increase is 2.7 times lower than that of healthy females. The study of the mink population has shown that males with the Aleutian disease are worse off growing and their quality of the fur is worse. In the study of color dependency, we found that local Braun-colored animals are more resistant to Aleutian disease. After performing an enzyme-based analysis, we found that the X-farm minks were mostly infected with a low virulence virus.
6
SANTRUMPOS
AD – Aleutinės liga;
ADV – Aleutinės ligos virusas; CIEP – imunoelektroforezė; ELISA – imunofermentinė analizė; n – imties dydis;
p – patikimumo rodmuo; PI – pasikliautinasis intervalas; CDV – mėsėdžių maras
7
ĮVADAS
Kanadinės audinės – labiausiai pasaulyje paplitusi kailinių gyvūnėlių rūšis auginama dėl jų ypatingai gero kailio, kuris toliau naudojamas pramonėje rūbų, aksesuarų gamybai (1). Šie gyvūnai serga įvairiomis ligomis, kurios gali padaryti milžiniškus nuostolius verslui, tačiau nuo daugumos tokių virusinių ar bakterinių susirgimų yra sukurtos vakcinos.
Aleutinė liga yra pagrindinė ir šiuo metu daugiausia nuostolių daranti kailinių žvėrelių liga pasaulyje, nuo kurios nėra sukurta jokio gydymo ar vakcinos (2). Dėl šios ligos greito plitimo ir sunkaus likvidavimo ji yra ypač nuostolinga kailinių žvėrelių verslui. Tiek užkrėstuose regionuose, tiek ir šalyse, kur liga nėra paplitusi, reikia laikytis ypatingai griežtų higienos sąlygų norint išsaugoti audines sveikas. Tokiu tikslu reikia turėti daug žinių apie audinių ligas, o informacijos Lietuvoje apie tai dar trūksta.
Lietuvoje yra užauginama daug kailinių žvėrelių, į rinką yra tiekiami vieni geriausių kailių visame pasaulyje. Per metus Lietuvoje užauginama ir į rinką pateikiama iš viso apie 1700000 kailių (1 pav.)
1 pav. Užauginamų kailinių žvėrių skaičius Lietuvoje.
Daugiausiai Aleutinės ligos tyrimų ir eksperimentų buvo atlikta praėjusiame amžiuje. Dėl šios priežasties dalis mokslinės medžiagos, pateikiamos magistriniame darbe, yra senesnė nei 10 metų.
Tuo metu buvo nustatyta, kad pagrindinis žvėrių užsikrėtimas vyksta tiesioginio kontakto metu, peroraliniu bei aerogeniniu būdu (per užkrėstas seiles, šlapimą, išmatas ar kvėpuojamojo trakto išskyras). Tačiau vėliau buvo nustatyti ir kiti viruso plitimo keliai, tokie kaip intrauterinis ar per aplinkos daiktus. Dabar žinoma, jog išgyvenę žvėrys tampa viruso nešiotojais (3).
1850000 1600000
8 Pagrindiniai Aleutinės ligos požymiai yra didelis jauniklių mirtingumas, jautrumas bakterinės kilmės susirgimams, prasti apsivaisinimo rodikliai ir prasta kailio kokybė.
Lietuvoje mokslinių tyrimų apie Aleutinę ligą iki šiol nebuvo atliekama, todėl nėra spausdintinių duomenų apie šios ligos paplitimą ar įtaka žvėrelių sveikatingumui. Dauguma ūkių diagnostinius tyrimus atlieka savarankiškai arba siunčia mėginius į akredituotas užsienio laboratorijas.
Darbo tikslas: Ištirti audinių Aleutinės ligos paplitimą, ADV įtaką žvėrelių sveikatingumui ir produkcijai.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Aleutinės ligos viruso paplitimą Lietuvos audinių auginimo fermose. 2. Įvertinti Aleutinės ligos viruso infekcijos įtaką audinių reprodukcinėms savybėms. 3. Įvertinti Aleutinės ligos įtaką audinių kailio dydžiui ir kailio kokybei.
4. Palyginti Aleutinės ligos paplitimą ūkyje tarp skirtingų spalvų audinių linijų. 5. Įvertinti lyties ar amžiaus įtaką Aleutinės ligos virusų plitimui X ūkyje.
9 1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Kanadinė audinė
Kanadinė audinė yra kiauninių šeimos plėšrusis žinduolis. Ši gyvūnų rūšis yra kilusi iš Šiaurės Amerikos. Į Europą kanadinės audinės įvežtos tarp 1920-1930m. Kanadinės audinės buvo įvežtos norint jas auginti ir veisti dėl sparčiai augančios kailių paklausos. Šiuo metu kanadinė audinė aptinkama beveik visoje Europoje. Daugiausia jų laikoma bei randama natūralioje aplinkoje šiaurinėje žemyno dalyje (4).
Gamtoje šie gyvūnai randami prie vandens telkinių. Dažniausiai apsistoja prie upių ar ežerų, kurie yra apaugę aukšta, nešienaujama žole, stačiais krantais. Jų pagrindinis maisto šaltinis yra vandens paukščiai, žuvis bei smulkūs žinduoliai. Net fiziologiškai kanadinė audinės yra prisitaikiusios gyventi prie vandens, nes tarp kojų nagų yra plėvelės, kurios palengvina plaukiojimą (1).
1.1.1 Kailių dydžiai
Kailinių žvėrelių auginime labai svarbu yra kailio ilgis. Žemiau esančioje lentelėje pateikiami kanadinių audinių kailio ilgio išmatavimai su jiems priskirtais dydžiais.
1 lentelė. Audinių kailių dydžiai
Dydis Ilgis, cm (nuo nosies galiuko iki uodegos šaknies)
50 101 40 95,1-101 30 89,1-95 20 83.1-89 0 77,1-83 1 71,1-77 2 65,1-71 3 59,1-65 4 53,1-59 5 47,1-53
10 1.2 Audinių imuninė sistema
Išlaikyti gerą fizinę būklę ir sveikatą organizme padeda įvairūs mechanizmai, kurie susidūrę su nepažįstama medžiaga (pvz.: infekcinių ligų sukėlėjai) bando ją pašalinti iš organizmo. Visi šie mechanizmai bendrai vadinami imunine sistema (5).
1.2.1 Nespecifiniai mechanizmai
Nespecifiniai mechanizmai veikia prieš visas organizmui nepažįstamas medžiagas. Oda, taip pat virškinamasis traktas, kvėpavimo, šlapimo takai yra fizinis organizmo barjeras, kuris padeda išvengti infekcinių agentų patekimo į vidų. Virpinamasis epitelis kvėpavimo takuose atlieka apsauginę funkciją, kurios metu prie epitelio judančios ląstelės sulaiko į organizmą patekusius agentus. Kosėjimas, čiaudėjimas yra būdas sulaikytus agentus pašalinti iš organizmo. Skrandžio rūgštis sunaikina didžiąją dalį su maistu patekusiu patogenų. Urogenitaliniame trakte šlapimo judėjimas pašalina nepažįstamas organizmui medžiagas. Apsauginis odos barjeras sulaiko patogenus nuo tiesioginio jų patekimo į organizmą (6). Šių nespecifinių mechanizmų visuma veikia labai efektyviai. Tačiau, kai žvėrelio organizmas nualinamas sunkių gyvenimo sąlygų, prastos mitybos ar kitų veiksnių, organizmo apsauginiai barjerai nusilpsta ir kyla infekcijos rizika (7).
Kuomet yra pažeidžiami šie barjerai (pvz.: esant atvirai žaizdai), į darbą įtraukiamos kitos nespecifinės organizmo apsauginės ląstelės – fagicitai. Jie suranda ir fagocituoja svetimas organizmui medžiagas. Tokios medžiagos lizuojamos pasitelkus ląstelių citoplazmoje ir lizosomose esančius fermentus. Fagocitai būna dviejų rūšių: makrofagai ir neutrofilai. Abejos ląstelės yra gaminamos kaulų čiulpuose ir yra sudedamosios leukocitų populiacijos dalys. Neutrofilai sudaro apie 40 proc. visų leukocitų randamų audinių kraujyje. Jie yra pirmieji, kurie susiduria su nepažįstama organizmui medžiaga (6). Prasidėjus fagocitozei, jie aktyvina neutrofilų gamybą kaulų čiulpuose, dėl to, esant infekcijai, jų kiekis audiių kraujyje dar labiau padidėja. Neutrofilai geba fagocituoti infekcijų sukėlėjus dar prieš pasirodant klinikiniams ligos požymiams. Tačiau šios ląstelės turi ribotas galimybes, todėl ne visada sugeba įveikti infekcijų sukėlėjus (8).
Tuo tarpu makrofagai yra išmanesnės ląstelės, gebančios atsinaujinti savo energiją ir taip galėdamos pakartoti fagocitozę. Šios ląstelės audinių kraujyje cirkuliuoja nefagocituojančioje formoje, kurios metu jos vadinamos monocitais ir sudaro tik apie 5proc. visų leukocitų šeimos ląstelių. Kaip ir neutrofilai, į organizmą patekus infekcijos sukėlėjui, jie migruoja į pažeidimo vietą, kur virsta makrofagais. Dėl jų keitimosi proceso, jie užtrunka ilgiau nei neutrofilai kol pasiekia pažeista vietą ir pradeda fagocituoti (apie 6-8 val.). Fagocitų gebėjimas atnaujinti energiją yra naudingas organizmui tuomet kada patogenas geba greitai daugintis, o neutrofilų organizmas nespėja pasigaminti. Makrofagai taip pat geba patekti į audinius, kuriuose gali būti infekcijos šaltinis, ir
11 aptiktus patogeus sunaikinti. Audiniuose randami makrofagai vadinami – histocitais. Priklausomai nuo jų buvimo vietos keičiasi ir makrofagų pavadinimas (pvz.: kuperio ląstelės – kepenyse) (9).
Šie nespecifiniai mechanizmai užkerta kelią tik daliai infekcijos sukėlėjų patekti į organizmą. Dažniausiai šiuos barjerus praėję patogenai būna labai virulentiški ar toksiški, gebantys slopinti ar visai sustabdyti nespecifinių mechanizmų veiklą. Esant tokiai situacijai, organizme pradeda veikti specifiniai imuniniai mechanizmai (10).
1.2.2 Specifiniai mechanizmai
Antigenai yra apibudinami, kaip molekulės, ląstelės ar organizmo dalys, kurios yra atpažįstamos kaip svetimkūniai limfocitų bei yra imuninių ląstelių taikiniai. Vieni antigenai gali būti svarbesni už kitus aktyvuojant imuninį atsaką, nes jie aktyviau veikia organizmo apsauginių mechanizmų veiklą (11).
Audinių specifinis imuninis organizmo atsakas yra aktyvuojamas limfocitų. Limfocitai - tai nedidelės ovalios formos ląstelės, kurios yra gaminamos kaulų čiulpuose ir yra randamos kraujyje, limfmazgiuose, blužnyje ir užkrūčio liaukoje. Šios ląstelės visada juda. Judėjimas prasideda audiniuose, toliau keliauja į limfagysles, limfinius mazgus, kraujagysles, tada ciklas kartojasi. Judėdami jie praeina pro blužnį, kaulų čiulpus ir tada vėl grįžta į kraujo apytaka. Limfocitai sudaro 35 proc. visų kraujyje randamų leukocitų. Tačiau organizme, tai sudaro tik apie 10-20 proc. viso limfocitų skaičiaus (6). Yra randami dviejų rūšių limfocitai. B limfocitai gaminami kaulų čiulpuose, o T limfocitai subręsta užkrūčio liaukoje. Pastarieji limfocitai dar yra skiriami į Th it Tc imfocitus. Tc limfocitai turi CD8, bet neturi CD4 baltymo. Jų funkcija yra išjungia imuninį atsaką. Tc limfocitai sudaro apie 30 % visų T limfocitų. Th limfocitai turi CD4, bet neturi CD8 baltymo. Šios ląstelės sukelia imuninį atsaką. Audinių organizme Th sudaro apie 60 % visų T limfocitų (12).
Kuomet infekcija nėra sunaikinama nespecifinių organizmo mechanizmų, kai kurie organizmai per limfa, kraujo apytaką gali pasiekti limfmazgius ar blužnį. Limfiniuose meazguose, blužnyje šie organizmai yra fagocituojami makrofagų, kurie antigenus pristato keliaujantiems limfocitams. Kiekvienas limfocitas turi specialius receptorius, kuriu dėka gali atpažinti antigeną ar jų grupes (6). Audinės, kaip ir kiti gyvūnai turi milijonus cirkuliuojačių limfocitų, kurių kiekvienas turi atskirus receptorius, kurių dėka gali atpažinti skirtingus antigenus. Limfocitas, kuris atpažino makrofago pristatytą antigeną, geba aktyvinti kitų limfocitų gamybą, kurie savo ruožtu atpažins šį antigeną. Th ląstelės atsakingos už tirpių faktorių gamyba (interleukinai ir interferonai), kurie vėliau stimuliuoja T efektoriųs ar B limfocitus, kurie atpažins antigeną. Padidėjus limfocitų gamybai, jas gaminantys organai padidėja, kas rodo jau esančią infekcija organizme (13).
T efektoriai arba B limfocitai atsako į tuos antigenus, kuriems turi receptorius įgytus dauginimosi metu. Proliferacijos metu pasigamina didelis kiekis ląstelių, kurių vienos veikia kaip
12 tarpininkai, o kitos kaip aktyvus limfocitai. Aktyvūs limfocitai esant antigenui sparčiai dauginasi, dėl to jų kiekis organizme greit padidėja. Pastarieji išgyvena praėjus tam tikram laikui po antigeno sunaikinimo, to dėka pakartotinai apsikrėtus kraujyje jau yra didelis kiekis limfocitų su specifiniais receptoriais, kurie gali pulti antigeną (6). Toks padidėjęs imuninis atsakas rodo limfocitų gebėjimą įsiminti antigenus. Šis įsiminimo principas taikomas ir vakcinacijos metu, kurios metu yra suleidžiama inaktyvuotų ar susilpnintų antigenų, kurie nesukelia ligos, bet perduoda limfocitams antigeno informaciją, kurią jie įsimena. To dėka audinės ir kiti gyvūnai apsisaugomi nuo daugumos ligų (14).
Dalis limfocitų, pasigaminusių proliferacijos metu, veiks kaip tarpininkai prieš antigenų nešiotojus. T efektoriai juda iš dauginimosi vietos į kraujotaką ir audinius. Yra dviejų rūšių T efektorinės ląstelės. Tai Tc ląstelės, kurios prisitvirtina prie judančio antigeno ir jį sunaikina (6). Reaguodamos su viruso pažeista ląstele, šie limfocitai sunaikins ir ląstelę, taip apsaugodamos organizmą nuo viruso dauginimosi. Td ląstelės dalyvauja sulėtinant hiperjautrumą antigenui. Jos reaguoja su antigeno paveiktomis ląstelėmis ir išskiria limfokinus (interleukinus ir interferonus). Limfokinai išskiria medžiagas reikalingas aktyvuoti makrofagus bei sustiprina jų gebėjimą sunaikinti patogenus, neleidžiant jiems išgyventi makrofagų viduje. Kai kurie limfokinai yra chemotaksiški limfocitams, neutrofilams ir makrofagams, nes aktyvuoja jų judėjimą į infekcijos vietą. Kiti stimuliuoja antigenui jautrių limfocitų proliferaciją. T limfocitai organizme lemia ląstelinį imunitetą t. y. naikina užkrėstas ir vėžines ląsteles, taip pat yra svarbūs imuniteto reguliacijai (8).
B limfocitų, kitaip nei T limfocitų, paviršiaus antikūnai gali atpažinti laisvus antigenus, neprisijungusius prie ląstelių. Nesutikę antigeno, B limfocitai cirkuliuoja kraujyje bei limfoje kelias dienas ir po to žūva. Jei prie B ląstelės receptoriaus (antikūno) prisijungia antigenas, ląstelė aktyvuojama. Atpažintas antigenas yra endocituojamas ir suskaidomas į peptidus. B ląstelė pradeda gaminti MHC II (angl. major histocompatibility complex) molekules, prie kurių vėliau prikabinami antigeno peptidai (10).
Veikiant skirtingiems citokinams, B ląstelės diferencijuojasi į skirtingas imunoglobulinų klases (IgA, IgG, IgM) sekretuojančias plazmines ląsteles. Kraujo baltymai yra sudaryti iš dviejų tipų baltymų – albuminų ir globulinų. Globulinai savo ruožtu yra skiristomi į alfa, beta ir gama globulinus. Gama globulinai, kitaip dar yra vadinami imunoglobulinais. Jie yra antikūnių sudėtinė dalis, todėl vaidina ypatingai svarbų vaidmenį gynybinėse organizmo reakcijose taip labai svarbūs audinių infekcinių ligų, ypač Aleutinės ligos, diagnostikoje. Imunoelektroforezės tyrimo metu yra nustatomi penki imunoglobulinų tipai: IgA, IgD, IgE, IgG ir IgM (15).
Imunoglobulinai G (IgG) - audinėse sudaro didžiausiąją gama globulinų dalį (maždaug 75% iš visų gama globulinų). IgG saugo nuo virusų, bakterijų ir toksinų. Tai vieninteliai imunoglobulinai, kurie pereina per audinių placentinį barjerą. IgG yra labai svarbi antrinio imuninio
13 atsako sistemos dalis. Kai imuninė sistema pirmą kartą susiduria su antigenu, pirmiausia pradedami gaminti IgM klasės globulinai, kuriuos vėliau pakeičia IgG globulinų padidėjimas (16).
Imunoglobulinas A (IgA) sudaro nuo 10 iki 15 proc. visų audinių organizme esančių gama globulinų ir yra antra pagal savo dydį imungolobulinų grupė. IgA randami organizmo skysčiuose - priešpienyje, seilėse ir ašarose. Tai imunoglobulinai kurie yra laikomi pirmąją apsaugine gynybos linija ginančia kvėpavimo, virškinimo ir šlapimo takus (17).
Imunoglobulinai M (IgM) – didžiausias imunoglobulinas. Sudaro nuo 7 proc iki 10 proc visų gama globulinų. Tai pirmieji baltymai, kurie susiduria su svetimkūniu. Todėl esant infekcijai, IgM kiekis didėja pirmiausia. IgM dažniausiai randamas kraujo serume, išskyrus tuos atvejus, kai smarkiai pažeistos kraujagyslės pavyzdžiui esant atvirai žaizdai (18).
Imunoglobulinai E (IgE) – paprastai yra aptinkami tik labai mažais kiekiais. Jie dalyvauja organizmo alerginėse reakcijose, ypač anafilaksinėse. Jų kiekis didėja esant parazitinėms infekcijoms (19).
Imunoglobulinų D (IgD) – taip pat yra labai mažai. Kol kas tikroji jų funkcija nėra pilnai išaiškinta(20).
Atliekant imunoglobulinų elektroforezės tyrimą per kraujo serumą yra leidžiama elektrinė srovė, dėl ko skirtingo krūvio ir dydžio imunoglobulinai išsiskiria į atskiras grupes. Kiekviena imunoglobulinų klasė ant tiriamosios juostelės palieka tik jai specifinį pėdsaką. Todėl atliekant šį tyrimą galima pasakyti, kurios klasės imunoglobulinų yra padaugėję (6). Šis tyrimo būdas naudojamas ne tik Ig klasių tyrimams, bet ir infekcinių ligų diagnostikoje, ypač tinkamas audinių Aleutinei ligai diagnozuoti.
1.2.3. Specifinio imuninio atsako vertinimas
Antikūniai kraujo serume ar kituose kūno skysčiuose gali būti nustatyti daugumos laboratorinių testų. Serologiniai tyrimai apima agliutinacijos tyrimą, kurio dėka ląstelėms neleidžiama sulipti kraujo serume. Komplemento fiksacijos testas, kuris apriboja komplimento aktyvacijos laipsnį, kai antigenas ir kraujo serumas yra sumaišomi. Virusų neutralizacijos testas, kuris padeda įvertinti antikūnių gebėjimą kraujo serume stabdyti antigeno vystymasi bei kiti testai tokie kaip ELISA, imunofluorescensjos testas. Pagrindinis serologinis audinių ligų tyrimo būdas yra imunoelektroforezė (6).
1.3 Dažniausios audinių virusinės ligos
1.3.1 Mėsėdžių maras
Mėsėdžių marą sukelia Morbillivirus genties virusas (canine distemper virus, CDV), kuris priklauso Paramyxoviridae šeimai. Šis virusas žinomas daug metų ir yra viena iš pagrindinių
14 didelio audinių mirtingumo priežasčių. Šiam virusui yra jautrios visos audinės nuo 5 gyvenimo mėnesio. Visų genetinių linijų gyvūnai yra jautrus, tačiau atlikti epidemiologiniai tyrimai rodo, jog mutavusių, pastelinių spalvų audines auginančiuose ūkiuose dėl šio viruso poveikio yra didesni gaištamumo rodikliai (20).
Šį virusą platina laukiniai mėsėdžiai žinduoliai, todėl užsikrėsti ūkiuose laikomoms audinėms yra gana lengva. Užsikrėsti galima tiesiogiai ir netiesiogiai per artimą kontaktą, aerozoliniu būdu ar dėl užkrėstų gaišenų ėdimo (6).
Įkvėpus viruso jis pirmiausia lokalizuojasi tonzilėse, regioniniuose limfiniuose mazguose bei plaučių audinyje (21). Trečią dieną po užsikrėtimo virusas patenka į kraują ir nunešamas į įvairius organus. Kraujyje virusas išlieka visos ligos metu. Šis virusas pažeidžia imuninės sistemos ląsteles (limfocitus). Antriniai bakterinės kilmės susirgimai yra dažni esant CDV infekcijai (6).
Klinikiniai požymiai pasirodo praėjus 5 d. nuo užsikrėtimo. Pirmiausia gyvūnas netenka apetito, pasidaro vangus. Pėdučių, snukio srityse atsiranda odos išbėrimų. Šiose vietose dažnai sustorėja oda. Pasunkėja kvėpavimas. Prasideda konjunktyvitas, teka išskyros iš nosies. Mirtis ištinka praėjus 2-3 d. nuo klinikinių simptomų pasirodymo. Tačiau galimas ir persirgimas, kuris dažnai komplikuojasi į nervinę ligos formą (praėjus nuo 10 d. iki 5 sav. nuo pirmų klinikinių simptomų). Pasireiškus encefalito požymiams (dejavimas, rėkimas, kandžiojimasis, traukuliai) gyvūnas gaišta per 1-2 d. (6).
Ligos diagnozavimui taikomi serologiniai bei patologiniai tyrimai (20).
Svarbiausias būdas norint išvengti šios ligos yra vakcinacija. Vakcinuojamos yra patelės bei 2 mėn. amžiaus jaunikliai. Naujai įvežami gyvūnai turi būti suvakcinuoti mažiausiai tris savaites prieš patekdami į ūkį. Taip pat svarbi yra teritorijos priežiūra. Teritorija turi būti aptverta ir prižiūrima, kad į ją nepatektu laukiniai gyvūnai. Ūkyje esantis kiti mėsėdžiai turi būti taip pat suvakcinuoti nuo šio viruso (22).
1.3.2. Virusinis enteritas
Virusinį enteritą sukelia parvovirusas, priklausantis Parvoviridae šeimai. Šis virusas yra labai atsparus aplinkos veiksniams. Ant rūbų ar odos jis gali išsilaikyti nuo kelių savaičių iki kelių mėnesių esant kambario temperatūrai. Žemoje temperatūroje (arti minusinės) virusas gali išgyventi iki kelių metų. Pagrindinis virusų šaltinis yra išmatos. Užkrėstos išmatos į ūkius patenka kartu su musėmis, paukščiais, per avalynę, per užkrėstas gertuves. Virusą įmanoma sunaikinti tik stipriais dezinfekantais, tokiais kaip formalinas ar chloras (6).
15 Šiam virusui jautrios visos audinės. Imunitetą, gali turėti tik persirgusios šio viruso sukeltą ligą arba vakcinuotos audinės. Jautriausi šiam virusui yra atjunkomi jaunikliai. Jaunikliai per pieną gauna natūralių antikūnų, kurių netenka atjunkymo laikotarpiu. Viruso poveikis dažniausiai pasireiškia sezoniškai. Liga paprastai prasideda liepą, kuomet jau būna atjunkyti visi jaunikliai ir baigiasi apie rugsėjo mėnesį. Priklausomai nuo viruso virulentiškumo, mirštamumas gali siekti nuo 10 iki 80 proc. (23).
Klinikiniai simptomai pasireiškia praėjus 4-7 d. po užsikrėtimo. Gyvūnai praranda apetitą, jiems prasideda diarėja. Dėl pažeistos virškinamojo trakto gleivinės prasideda intensyvus viduriavimas, išmatose matomas kraujas. Tuo pat metu išmatose dažnai pastebimi pilkai rausvi gleivinės ar fibrino gabaliukai. Po kiek laiko gyvūnai tampa apatiški, visą laiką praleidžia gulėdami, ima dažnai vemti žalsvu tulžies spalvos skysčiu. Dėl šių simptomų gyvūnai greitai dehidratuoja. Dalis audinių nenugaišta, atgauna apetitą ir pasveiksta (6).
Laboratoriškai diagnozuojant šią ligą, virusas gali būti išskirtas iš išmatų ar užsikrėtusių gyvūnų organų. Tačiau praktikoje dažniausiai liga nustatoma po gaišimo atlikus skrodimą (24).
Pagrindinis būdas užkirsti kelią virusui yra vakcinacija. Jaunikliai vakcinuojami 4-6 sav. amžiaus. Patartina jauniklius vakcinuoti bent du kartus, kad organizmas įgautų tvirtą imunitetą. Pateles patartina vakcinuoti vasarą kartu su jaunikliais (24).
1.4. Aleutinė liga
1.4.1 Aleutinės ligos sukėlėjas
Aleutinė liga yra lėtinė, progresuojanti, nepagydoma imuninė audinių liga, kurią sukelia parvovirusas (ADV) (25). Tai yra vienintelė ir ypač svarbi kailinių žvėrelių liga, daranti įtaką pasaulinei kailių produkcijai ir prekybai. Aleutinės ligos virusai pirmą kartą buvo išskirti 1956 m. Šiam virusui yra jautrūs visi audinių genotipai. ADV ligą sukelia ne tik audinėms, bet ir šeškams. ADV gali užsikrėsti šunys, katės, peles, usūriniai šunys, tačiau šioms gyvūnų rūšims klinikinių ligos požymių nenustatoma. Atlikus detalesnius tyrimus, buvo padaryta prielaida, jog anksčiau paminėtos gyvūnų rūšys yra viruso nešiotojai ir platintojai (6).
Šis virusas žinomas kaip Carnivore amdoparvovirus 1. Tai pirmasis atrastas Amdoparvovirus genties narys, priklausantis Parvoviridae šeimai bei Parvovirinae pošeimiui (26). Ši gentis apima virusų grupę, galinčią užkrėsti įvairius sausumos mėsėdžius. Parvovirusų virionai susideda iš baltymo kapsidės, dengiančios vienos grandinės DNR genomą (27).
1.4.2. Ligos vystymasis
Ligos sunkumas bei žala priklauso nuo audinės genetikos, jos amžiaus, nuo sukėlėjų skaičiaus gyvūne, viruso virulentiškumo bei aplinkos sąlygų. Buvo išskirtos kelios biologinės ADV
16 padermės, kurios gali keisti savo virulentiškumą. Išskiriamo ADV viruso virulentiškumas apibūdinamas, kaip galimybė sukelti ligą sveikoms audinėms. Audinė, turinti polinkio Aleutinei ligai genotipą beveik visada sirgs sunkia progresuojančia ir mirtina ligos forma netgi jeigu virusas nėra virulentiškas (26). Užkrėstoms didelio virulentiškumo virusu bet nesergančioms audinėms paprastai nustatoma progresuojanti liga (didelis kiekis antikūnų, hypergamaglobulinemija). Dar aptinkama persistuojanti, bet neprogresuojanti ligos forma – žemas antikūnų lygis, normalus globulino kiekis, žvėreliai atrodo kliniškai sveiki, nematoma jokių išorinių pokyčių. Taip pat yra ir nepersistuojanti infekcija – po užsikrėtimo viruso replikacija nevyksta, taip pat nenustatoma jokių klinikinių simptomų (6).
Yra išskiriamos dvi ADV infekcijos formos: lėtinė ir ūmi Aleutinė liga. Apie ūmią formą nebuvo žinoma iki 1982 m., kol tokia ligos forma nepasireiškė dideliu jaunikliu mirtingumu keliuose Danijos ūkiuose. Atlikus gaišenų skrodimą buvo nustatytos intersticinis plaučių uždegimas, kurį sukėlė ADV. (2)
Klasikinė arba lėtinė viruso infekcijos forma vystosi ne dėl audinių pažeidimo, o greičiau dėl perdėto, bet neefektyvaus, imuninio atsako, dėl ko susidaro imuniniai kompleksai, kurie vėliau nusėsda inkstų glomeruluose, arterijų sienelėse, akyse ir kituose organuose. Tokios audinės gaišta dėl uremijos ir inkstų nepakankamumo. ADV taip pat skatina antikūnų gamybą užkrėstuose audiniuose, įvairiuose organuose susidaro imuniniai kompleksai, tačiau jie neveikia viruso. Lėtine ADV infekcija sergančios audinės taipogi turi sumažėjusį antikūnų atsaką į vakcinas. Vystantis ligai sutrinka vienbranduolių fagocitų veikla, dėl to audinės tampa jautrios įvairiems aplinkos veiksniams, ypač antrinėms bakterinėms infekcijoms (6).
Panašiai kaip ir audinių virusinio enterito ar šunų parvovirusai, ADV replikacija priklauso nuo greitai besidalijančių ląstelių. Todėl šie virusai pavojingesni jaunų gyvūnų organizmui. Kliniškai sveikų patelių jaunikliams ADV infekcija taikosi į alveolines 11 tipo plaučių ląsteles (28). Eksperimentais buvo patvirtinta, kad ADV viruso plautinė forma jaunikliams priklauso nuo jų amžiaus. Eksperimentiškai užkrėstų jauniklių didžiausias gaištamumas nustatomas juos užkrėtus 10-13 gyvenimo dieną (6).
Jaunikliams užkrėstiems vėliau negu 3-8 amžiaus savaitę, nepasireiškia pneumonija, jiems vystosi tipiški klasikinio ADV infekcijos simptomai. Vyresniems jaunikliams ADV gali būti randamas limfiniuose mazguose, blužnyje, skydliaukėje, kaulų čiulpuose, kepenyse, inkstuose, plaučiuose ir plonajame žarnyne. ADV replikacija yra susijusi su limfine sistema (28).
ADV antikūnų buvimas įtakoja lėtinio ADV vystymąsi. Eksperimentiškai vakcinuotų patelių jaunikliai bei sergančių patelių jaunikliai turėjo antikūnų, gautų iš motinos. Todėl tokie jaunikliai nesusirgdavo plautine ADV forma, tačiau vėliau jiems pasireikšdavo lėtinė ADV infekcija (29). Po užsikrėtimo audinės gali gaminti antikūnus prieš ADV. Tačiau in vivo būdu buvo nustatyta,
17 jog viruso baltymai yra apsaugoti fosfolipidų, kurie inaktyvuoja antikūnų recetorius. Todėl antikūnai prieš ADV dalyvauja pačio viruso dauginimosi procese, kuris vėliau įtakoja imuninės sistemos ligas ir nuolatines antrines infekcijas (6).
ADV virusas buvo išskirtas iš seilių, šlapimo, išmatų ir sergančių patelių pieno. Horizontalaus plitimo keliai gali būti per tiesioginį kontaktą tarp gyvūnų ar per medicininius reikmenis (adatas, pirštines), blusas, paukščius, graužikus. Yra įrodymų, jog ADV virusas gali išgyventi ir daugintis kraujasiurbiuose vabzdžiuose. Aeorogeniniu būdu virusas gali plisti audinėms kosėjant, čiaudint arba valant gardus aukšto spaudimo srove nuo užsikrėstų gardų į sveikus. Transplacentiniu keliu virusas plinta per pateles, kurios perduoda virusą jaunikliams, o tai yra vienas iš pagrindinių viruso plitimo kelių ūkiuose (29).
1.4.3. Klinikiniai požymiai
Ūmios ADV infekcijos atveju jaunikliai sunkiai kvėpuoja, yra apatiški, nustatomas aukštas jų mirtingumo procentas per pirmąsias 24val nuo užsikrėtimo. Vėlesniame amžiuje užsikrėtę jaunikliai nerodo jokių klinikinių ligos simptomų esant intensyviam viruso dauginimosi periodui. Imuninės sistemos atsakas į ADV dauginimąsi yra greitas, imuninių kompleksų atsidėjimas audiniuose vyksta praėjus 2-4 sav. po užsikrėtimo. Klinikinė liga vystosi nuo kelių mėnesių iki kelerių metų. Sergantys žvėrys išliesėja, išsenka, kailis tampa šiurkštus, gali vystytis ureminės opos, skrandžio erozija bei atsiranda kraujo išmatose. Mirtis gali ištikti dėl oro sąlygų kaitos bei antrinių infekcijų (29).
1.4.4 ADV patologiniai pakitimai
1.4.4.1 Ūmus AD
Kaip jau minėta aukščiau, ši forma pasireiškia jaunikliams intersticine pneumonija. Atlikus gaišusiems jaunikliams skrodimą, nustatomi plaučių pažeidimai. Plaučiai būna mėsiškos konsistencijos, margi, gausu rausvų taškelių, kurie yra kietesni nei likusios plaučių dalys (6).
Histologiškai matoma ryški intersticinė pneumonija. Matomos ir susitraukusios alveolių sienelės, kurios traukiasi dėl 11 tipo pneumocitų ląstelių hiperplazijos ir hipertrofijos, vystosi intersticinė edema bei nustatoma lėta mononuklearinių ląstelių infiltracija. Kartais pneumocitai gali įtraukti intranuklearinius eozinofilinius kūnus. Labai sunkiai pažeistuose plaučiuose formuojasi alveolinės stikliškos membranos. ADV sukelia citopatinį poveikį 11 tipo alveolių ląstelėms, dėl ko sumažėja aktyviųjų medžiagų gamyba bei atsirada hialino membranos sutrikimai (30).
18 1.4.4.2. Klasikinis (lėtinis) AD
Nuo užsikrėtimo iki klinikinių lėtinio AD požymių pasirodymo gali praeiti keli mėnesiai. Tai priklauso nuo audinės genotipo ir viruso virulentiškumo. Periferinio kraujo parametrų pokyčiai rodo ligos pokyčius. Kraujyje matomas limfocitų skaičiaus mažėjimas (leukopenija), kraujo krešėjime dalyvaujančių ląstelių mažėjimas (trombocitopenija) bei eritrocitų sumažėjimas (anemija). Anemija gali vystytis dėl imuninių kompleksų bei kaulų čiulpų silpnėjančio veikimo (28).
Audinėms vystosi plazmocitozė ir hipergamaglobulinemija. Plazmos ląstelės proliferuoja ir plinta į kitus organus taip sukeldamos jų padidėjimą (t.y. regioniniai limfiniai mazgai, blužnis, kepenys). Inkstai gali iš pradžių būti išbrinkę, išpurpę. Matomi ryškūs glomerulai ir bei petechinės kraujosruvos ant inkstų paviršiaus. Vėlesnėse stadijose inkstai gali būti susitraukę, nebūdingos formos su sunkiai pašalinama kapsule. Audinės gaišusios dėl AD būna išsekusios, dehidratuotos, su silpnu, šiurkščiu kailiu. Dauguma žvėrelių turi ureminius išopėjimus burnors paviršiuje, ant liežuvio, pėdučių. Opos gali būti randamos skrandžio gleivinėje, visame žarnyne (opas žarnyne parodo tamsios spalvos išmatos) (6).
Histologiniai pakitimai randami daugumoje organų, juos lengva susieti su klinikine ligos eiga. Ryškiausi pakitimai randami inkstuose. Inkstų žievėje praėjus vos dviem savaitėms jau matoma intercticinių limfocitų ir plazmocitų infiltracija. Intersticinė infiltracija ūmėja ligai progresuojant. Tyrimais buvo nustatyti 4 tipų glomerulų pažeidimai. Eksudatinis glomerulonefritas su infiltruotais neutrofilais, mesangiumo ląstelių nekroze bei leukocitų ir baltymų eksudacija buvo susietas su nekrozuotomis arterijomis. Mesangiumo proliferuojantis glomerunefritas ir mesangiumo nykstantis glomerulonefritas yra daugiau lėtiniai procesaiir ne taip dažnai susijęs su arterijų pažeidimais. Membranos glomerulonefritas formuoja membranos pagrindo susitraukimą ir dėl to formuojasi kilpos formos susisukimai glomeruluose, dėl ko netenkama daug baltymų su šlapimu (28).
Imuninių kompleksų sukeltas arteritas yra pastebimas, kaip progresuojančios ligos požymis. Kraujagyslių pažeidimai dažniausiai prasideda mažose ar vidutinio dydžio kraujagyslėse, kuriose viduriniame sluoksnyje vyksta degeneraciniai pokyčiai, kurie vystosi iki didelio spektro fibrinės nekrozės (31).
Histologiniai pakitimai taip pat buvo nustatyti ir daugumoje kitų organų. Kepenyse esant AD buvo nustatyta mononuklearinių ląstelių infiltracija vartų srityje, tulžies latakų išvešėjimas, ribota fibrozė ir atskirų hepatocitų nekrozė. Kraujagyslių žiediniai perivaskuliariniai mononuklearinių ląstelių segmentai buvo nustatyti smegenyse, viršutiniame smegenų dangale. Taip pat dažni akių pažeidimai. Jie charekterizuojami kaip limfinių ir plazmos ląstelių infiltracija į rainelę ir krumplyną, ko pasekoje gali vystytis uveitas arba tinklainės atsiskyrimas (32).
19 1.4.5 Aleutinės ligos kontrolė
Nėra jokio Aleutinės ligos gydymo. Ligos paplitimas priklauso nuo seroteigiamų žvėrelių identifikavimo bei jų šalinimo. Yra keletas serologinių testų AD nustatyti. Pats populiariausias būdas yra imunoelektroforezė (CIEP). Šis testas praktiškas ir nebrangus bei naudojamas visame pasaulyje. CIEP testas lengvai atliekamas, jautrus, tačiau kartais galima nustatyti klaidingai teigiamas reakcijas. Taip pat šis testas pasiteisino ūkiuose, kai norima ištirti labai daug žvėrių. Kai kuriose šalyse, tokiose kaip Danija, audinių kraujo tyrimai yra privalomi. Tik po tokių tyrimų ūkiams suteikiami sveikatingumo pažymėjimai, o tai padėjo sustabdyti ir valdyti AD plitimą. Tuo tarpu Šiaurės Amerikoje panašios kontrolės programos nebuvo privalomos, todėl teigiamo efekto ir nebuvo pasiekta (33).
Taip pat vienas populiariausių testų, naudojamų nustatyti sergančius žvėrelius, yra ELISA testas. Šis metodas taip pat yra pakankamai jautrus ir specifiškas.
ELISA tyrimo principas yra polistireno mikroplokštelės pagrindas, padengtas išgrynintais ADV antigenais. Jeigu mėginys yra teigiamas, praskiestame serumo mėginyje esantys specifiniai antikūnai jungiasi su antigenais, esančiais kietos fazės (polistireno mikroplokštelės) paviršiuje. Antrojo reakcijos etapo metu susirišę antikūnai nustatomi naudojant peroksidaze žymėtus antikūnus. Trečiojo etapo metu susidarę antikūnų ir antigeno kompleksai nustatomi naudojant chromogeno-substrato tirpalą, kuris gali sukelti spalvinę reakciją. Spalvos intensyvumas yra proporcingas serumo mėginyje esančių antikūnų koncentracijai (34).
Žvėrys dažiausiai yra tikrinami rudenį prieš „mušimą“. Visi teigiamai reagavę žvėreliai yra brokuojami. Veisimui palikti žvėrys yra tiriami pakartotinai prieš veisimą. Teigiamai reagavę vėl „mušami“. Tik neigiamai reagavę žvėrys gali būti toliau veisiami. Po atsivedimo, prieš nujunkimą, turėtų būti patikrintos visos patelės. Visos teigiamai reagavusios patelės kartu su jaunikliais turi būti pašalinamos iš pagrindinės bandos, ir per „mušimą“ brokuojamos. Ši kraujo tyrimo programa yra efektyvi norint sumažinti dėl AD patiriamus nuostolius ūkiuose (6).
Panašiai kaip ir kiti parvovirusai, ADV yra pakankamai atsparūs dezinfekcijai. Dezinfekuojant užkrėstus narvus, pradžiai reikėtu atsargiai pašalinti organinius nešvarumus. Užterštus narvus patartina mirkyti dezinfekciniuose skysčiuose, vėliau juos džiovinti tiesioginiuose saulės spinduliuose. Taikant šį metodą buvo pasiekta gerų rezultatų. Dezinfekcija natrio hipochloridu, natrio šarmu, formalinu ir chlorheksidinu taip pat efektyvi. Tačiau šie chemikalai yra labai pavojingi tiek žmogui tiek ir audinėms (35). Narvų valymas aukšto slėgio srove nerekomenduojamas, nes taip sukeliamas aerozolinis viruso plitimo kelias, dėl ko virusai gali išplisti visame ūkyje.
Visi ūkyje esantys kitų rūšių gyvūnai taip pat turi būti kontroliuojami, nes jie gali pernešti virusą. Visiškas ligos likvidavimas fermoje yra ilgas ir brangus procesas. Prieš įsivežant žvėris, būtina juos ištirti. Lankytojai turi laikytis higienos reikalavimų, dėvėti vienkartinę aprangą ir
20 apavą. Ūkio teritorijoje turi būti įrengti dezinfekciniai barjerai, kilimėliai, teritorija turi būti gerai izoliuota (6).
Lietuvoje audinių laikymo fermose AD taip pat kontroliuojama atliekant suaugusių žvėrelių ir jauniklių serologinius tyrimus bei taikant pasirinktinį infekuotų individų brokavimą. Tačiau taikomos kontrolės priemonės ne visais atvejais būna efektyvios, nėra publikuotų duomenų apie ADV infekcijos epidemiologinius ypatumus.
21
2.TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGOS
2.1 Tyrimo objektas
Visas tyrimo laikotarpis apima (mėginių rinkimas, tyrimų atlikimas, vertinimas, duomenų susisteminimas) laikotarpį nuo 2016 06 15 iki 2017 09 30. Mėginiai tyrimui buvo renkami kailinių žvėrelių X ūkyje. Iš viso buvo paimta ir ištirta 3370 mėginių. Mėginiai buvo imti tris kartus per nurodytą laikotarpį. Visais atvejais buvo tirti skirtingi kiekiai mėginių. Mėginį sudarė iš audinės nago paimtas periferinio kraujo pripildytas kapiliaras, kuriame buvo heparino. Iki transportavimo į laboratorijas kraujas buvo laikomas šaldytuvuose +2-8C temperatūroje. Laboratorijoje kapiliarai buvo centrifuguojami 850G išcentrine jėga ir iki tyrimo laikomi šaldikliuose -20C temperatūroje. Plazma ar serumas tyrimui buvo atskiriami perlaužus kapiliarą. Pirmasis tyrimas buvo atliktas taikant imunoelektroforezę (CIEP). Šiuo būdu buvo ištirta 120 veisimui paliktų patelių. Antrasis tyrimas buvo atliktas taikant nespecifinį jodo testą. Jo metu buvo ištirta 2050 audinių kraujo mėginių. Buvo tiriami jaunikliai, patinai ir patelės. Trečiasis tyrimas buvo atliktas taikant imunofermentinę analizę. Šio tyrimo metu buvo ištirta 1200 audinių.
2.2.Imunoelektroforezė (CIEP)
Imunoelektroforezės testas buvo atliekamas ant 75x50 mm dydžio objektinių stiklelių, padengtų 10 ml 1% agaru. Tyrimas buvo atliekamas naudojant barbitalio buferinį tirpalą ir komenrcinį Aleutinės ligos viruso antigeną. Antigenas ir tiriamieji mėginiai buvo lašinami į agare padarytas duobutes, kurios viena nuo kitos buvo 1cm atstumu. Rezultatus buvo vertinamas po 30 min nuo elektroforezės pradžios pagal balkšvų precipitacijos linijų atsiradimą gelyje.
2.3.Imunofermentinė analizė
Imunofermentinei analizei atlikti buvo naudojami kapiliarinio kraujo mėginiai, paimti iš audinės nago. Reagentai ir tyrimui naudojami indai prieš tyrimą buvo 1 val. buvo laikomi 20-25C temperatūroje. Tyrimo eiga aprašyta žemiau.
1. Naudojamos 20-200 µl talpos viekanalės arba daugiakanalės pipetės, kuriomis į mikrolėkštutes buvo įpilama po 200 µl skiediklio, kuris toliau naudojamas tyrime
2. Nulaužiamas kapiliaras, tiriamo kraujo mėginys pernešamas ant specialaus filtrinio popieriaus šablono, kuris pamerkiamas į atskiras mikrotitravimo plokštelės duobutes naudojantis pincetu.
22 4. Iš mikroplokštelės duobučių išimamas šablonas, tada kiekviena duobutė nuplaunama naudojant buferinį tirpalą.
5. Į kiekvieną mikroplokštelės duobutę įpilama po 100 µl konjugato ir inkubuojama 30 min., tada vėl kiekviena duobutė nuplaunama naudojant buferinį tirpalą.
6. Į kiekvieną duobutę daugiakanale pipete įpilama po 100 µl substrato ir inkubuojama 15 min. tamsoje, po to įpilama 100 µl stabdančio reagento.
7. Reakcijos rezultatai buvo vertinami spektrofotometru pagal 450 nm šviesos bangos ilgo adsorbciją ir vertinat optinį tankį.
2 pav. Nuotraukoje vaizduojamas prietaisas, naudojamas automatinėje AMDV-VP2 ELISA teste.
Įtaisas tuo pačiu metu gali įvesti aštuonis šablonus su kraujo mėginiais į ELISA plokštelę
2.4.Jodo reakcija
Šio tyrimo taikymo pradžia tokia pati, kaip ir prieš aprašytų metodų. Paimamas periferinis kraujas iš audinės kojos nago į kapiliarą. Tuomet jis gabenamas į laboratoriją ir centrifuguojamas. Atsiskiriama kraujo plazma ir serumas. Kapiliaras perlaužiamas ir šios frakcijos atskiriamos. Plazma tolimesniam tyrimui nebereikalinga. Atskirtas kraujo serumas iš kapiliaro lašinamas ant objektinio stiklelio, kuris padėtas ypatingai gerai apšviestoje vietoje arba tiesiogiai ant šviesos šaltinio. Toliau ant serumo lašinimas jodo tirpalo. Būtina atsižvelgti į tai, kad abiejų frakcijų kiekiai būtų identiški. Rezultatus buvo vertinti beveik iš karto. Per šviesos šaltinį yra stebima ar reakcijos mišinyje metu nesusidarė nuosėdų. Esant neigiamai reakcijai, neiškrenta ar nesusidaro jokių nuosėdų, dribsnių ar kitų darinių. Esant teigiamai reakcijai, matomos iškritusios nuosėdos. Net esant mažiausioms nuosėdoms reakcija yra vertinama kaip teigiama.
Metodo esmė yra jodo reakcija su kraujo serume esančiais imunoglobulinais G. Normaliai audinėse nustatomas IgG kiekis svyruoja apie 13 proc. Sergant Aleutine liga, šis kiekis
23 pakyla iki 22 proc. ir daugiau. Dėl šių parametrų pokyčio galima spręsti, ar audinės užsikrėtę ir ar jos serga. Serume esant nuo 13 iki 22 proc IgG, jodas su serumu nesureaguos ir reakcija bus neigiama. Esant serume 22proc ir daugiau serumas su jodu sureaguos ir iškrenta nuosėdos.
Tyrimo duomenų statistinis įvertinimas atliktas naudojant Excel (2010) programa, apskaičiuoti rezultatų vidurkiai, procentinė išraiška, patikimumai.
Tikimybės apskaičiuotos naudojant „EpiTools epidemiological calculators“ programa pagal formulę.
p
Z
PI
kur PI – pasikliautinasis intervalas; p – eigiamų mėginių dalis (proporcija); Z – pasikliautinumo koeficientas 0,95; σ - standartinė paklaida
24
3.TYRIMO REZULTATAI
3.1. Aleutinės ligos paplitimas Lietuvoje
Lietuvoje gausu audines auginančių ūkių. Jų skaičius yra nepastovus ir nuolatos kintantis. Išanalizavus 2017m. Lietuvos ūkių registrą buvo nustatyti 91 veikiantis ūkis. Ūkių pasiskirstymas pagal apskritis pateiktas 3 pav. Išanalizavus duomenis paaiškėjo, jog daugiausia ūkių yra Šiaulių apskrityje (45 ūkiai), toliau seka Kauno apskritis (23 ūkiai). Likusiose apskrityse yra tik po kelis ūkius.
3 pav. Audines laikančių ūkių pasiskirstymas pagal apskritis.
Taip pat analizuodami Lietuvos ūkių pateiktą informaciją nustatėme, kad Lietuvoje gausu aleutine liga užsikrėtusių ūkių (4 pav.). Iš pateiktų duomenų matome, jog užsikrėtusių ūkių yra 37,4proc. (PI-0,28-0,48; n-91). 2 5 2 45 8 23 2 2 1 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Klaipėdos apsk. Telšių apsk. Tauregės apsk. Šiaulių apsk. Panevėžio apsk. Kauno apsk. Vilniaus apsk. Utenos apsk. Alytaus apsk. Marijampolės apsk. Ūkių skaičius Apskr it y s
25
4 pav. Užsikrėtusių ūkių procentinė išraiška Lietuvoje.
Kadangi buvo žinomi užsikrėtę ūkiai, buvo išanalizuotas sergamumas aleutine liga pagal apskritis. Matomas ryškus sergamumas Šiaulių apskrityje, kurioje yra didžiausias ūkių skaičius (5 pav.). Pastarojoje apskrityje matoma, kad iš 45 veikiančių ūkių užsikrėtę yra 19 ūkių, tai sudaro 42,22 proc. (PI-0,29-0,56) visų apskrityje esančių ūkių. Šiuo atveju priešinga situacija yra Kauno apskrityje kurioje iš esančių 23 ūkių, užsikrėtę buvo tik 3 ūkiai, ir tai sudaro 13,04 proc. visų esančių ūkių. Kitose apskrityse netikslinga vertinti duomenis dėl mažo ūkių skaičiaus. (n-91)
5 pav. Užsikrėtę ūkiai Lietuvoje pagal apskritį. 37,4
50,5 12,1
Užsikrėtę ūkiai Neužsikrėtę ūkiai Nepateikė informacijos
1 4 0 20 3 3 0 1 1 1 1 1 2 19 5 15 2 1 0 0 0 0 0 6 0 5 0 0 0 0 0 4 8 12 16 20 K la ipė dos a psk. Tel ši ų aps k. Taur egė s a psk. Ši aul ių a psk. Pane vėž io a psk. K auno aps k. V il ni aus a psk. U te nos a psk. A lyt au s a ps k. M ar ij am pol ės a psk. Ū ki ų sk ai či us Lietuvos apskritys
26 Ūkyje kuriame buvo atliktas tyrimas aleutinė liga nustatyta jau prieš porą dešimtmečių. Kiekvienais metais ūkyje išauginami dideli kiekiai audinių (6 pav.).
6 pav. Užaugintų žvėrelių skaičius ūkyje, kuriame atliktas tyrimas
Pastarojoje diagramoje (6 pav.) matomas ryškus kitimas užaugintų kailinių žvėrelių. Užaugintas jų kiekis nuo 70000 2015m. sumažėjo iki 26000 2017m..
3.2 Aleutine liga sergančių audinių sveikatingumas
Sergančių audinių smarkiai pakinta ne tik elgesys, išvaizda bet ir reprodukciniai gebėjimai. Ūkyje X atlikau statistinius skaičiavimus kiek jauniklių atsivedė 2 patelių pastogės. Pirmojoje pastogėje buvo laikomos kliniškai sveikos patelės. Antrojoje pastogėje buvo laikomos sergančios patelės. Vienoje pastogėje yra laikoma 150 patelių. Gauti rezultatai pateikti 7 pav., kuriame galima matyti 3 kartus didesnį sergančių patelių bergždumą (19,33 proc.) (p<0,05; PI-0,17-0,26), palyginus su sveikomis patelėmis (4,67 proc.). Diagramoje taip pat matyti, kad sergančios patelės neatsivedė nė vienos didesnės vados, tuo tarpu sveikos patelės atsivedė 9,10,11 jauniklių vadas (n-300).
70000
48000 26000
27
7 pav. Patelių atsivestų jauniklių skaičius vadoje
Apskaičiavus bendrą jauniklių skaičių procentais (8 pav.) galima matyti, jog sveikos patelės atsivedė beveik 3 kartus daugiau jauniklių negu sergančios patelės (p<0,05) (n-1030).
8 pav. Sveikų bei sergančių jauniklių skaičius procentais
Panašus tyrimas buvo atliktas su patinais lyginant jų kailių dydžius (2,1,0,10,20,30,40,50,60). Buvo lyginamos dvi pastogės, kurių kiekvienoje buvo laikoma po 150 patinų. Viena pastogė buvo užpildyta kliniškai sveikais žvėrimis, kitoje buvo laikomi sergantys žvėrys. Gauti rezultatai pateikti diagramoje (9 pav.).
19,33 3,00 9,33 9,33 3,33 3,00 1,67 0,67 0,33 0,00 0,00 0,00 4,67 1,33 3,00 4,33 4,33 8,00 9,33 6,67 5,33 1,00 1,33 0,67 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 % Jauniklių skaičius Užsikrėtę žvėrys Neužsikrėtę žvėrys
27%
73%
Sergančių patelių atsivestų jauniklių skaičius procentais Sveikų patelių atsivestų jauniklių skaičius procentais
28 Diagramoje matoma, kad didžiausio dydžio kailį turėjo kliniškai sveiki patinai (0,67 proc.), sergančių patinų kailis dažniausiai buvo 0 dydžio, tai sudarė 18proc. visų tirtų kailių (p<0,05; PI – 0,14-0,23). Lentelėje taip pat galima matyti, jog sveiki patinai kelis kartus dažniau turėjo didesnių dydžių kailius, palyginus su sergančiais (20 dydžio - 13,67 proc. ir 8,33 proc.; 30 dydžio - 10proc. ir 3,67 proc.; 40 dydžio - 4,00 proc. ir 0,33 proc.). Tuo tarpu sergantys žvėrys turėjo kelis kartus mažesnius kailius negu sveiki (4,00 ir 1,00; 9,00 ir 5,00).
9 pav. Sergančių ir sveikų patinų kailio dydžio palyginimas
Vienas pagrindinių serologinių tyrimų taikomų aleutinės ligos diagnozavimui yra imunoelektroforezė. Naudojant šį metodą buvo ištirti 120 kailinių žvėrelių. Norėdama palyginti rezultatus, kaip palyginamąjį tyrimą panaudojau jodo testą. Šiuo testu buvo ištirta 2050 mėginių.
Atliekant jodo reakcija buvo tiriama ar audinių kailio spalva turi įtakos aleutinės ligos sergamumui. Kadangi ūkyje sergamumas aleutine liga yra didelis, tai didžiajai daliai žvėrių buvo nustatyta liga.
Pateiktoje lentelėje (10 pav.) matoma, jog didžioji dalis tirtų žvėrių serga aleutine liga.
0,67 4,00 10,00 13,67 9,67 6,00 5,00 1,00 0,00 0,00 0,33 3,67 8,33 18,00 6,00 9,00 4,00 0,67 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 50 40 30 20 0 1 2 3 4 % Kailio dydžiai Sveiki žvėrys Sergantys žvėrys
29
10 pav. Jodo testo rezultatai lyginant skirtingų spalvų žvėris
Lygiant skirtingos spalvos audines matoma, kad daugiau sveikų žvėrių buvo nustatyta braun spalvos (10,24 proc.), kai tuo tarpu silver blue spalvos sveikų žverelių buvo nustatytas tik 1,95 proc. (p<0,05; n-250)
Atlikus imunoelektroforezės reakcija (11 pav.) nustatyta, jog didžioji dalis žvėrių serga. Silver blue spalvos nesergančių žvėrių nebuvo nustatyta (0 proc.), kai tuo tarpu braun spalvos sveikų žvėrelių buvo nustatyta 4,17 proc. (p<0,05).
11 pav. Imunoelektroforezės tyrimo rezultatai lyginant skirtingų spalvų žvėris 46,83 10,24 40,98 1,95 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Teigiami Neigiami Teigiami Neigiami
Braun Silver Blue
% 25 4,17 70,83 0 0 10 20 30 40 50 60 70
Teigiami Neigiami Teigiami Neigiami
Braun Silver Blue
30 Bendrai palyginus abiejų tyrimų rezultatus nustatyta, kad teigiamų žvėrių skaičius buvo panašus, nors ir skyrėsi jų spalva. Ryškesnis pokytis matomas tarp nustatytų sveikų žvėrių. Sveikų braunų buvo 5 kartus daugiau negu sveikų silver blue spalvos žvėrių (12 pav.). Šiuo atveju braun spalvos sveikų žvėrelių 215) buvo nustatyta 9,9 proc., kai tuo tarpu silver blue spalvos žvėrelių (n-40) buvo nustatyta tik 1, 8 proc. (p<0.05).
12 pav. Sveikų ir sergančių žvėrių skaičiaus palyginimas pagal spalvą, susumavus CIEP ir jodo
testo rezultatus
Taip pat ūkyje X buvo atliktas ELISA testas, kurio metu buvo ištirti 1200 kailinių žvėrelių mėginių. Visi tirti mėginiai buvo teigiami. Dėl to papildomai buvo nustatytas viruso virulentiškumas.
Atlikus skaičiavimus, kurie pateikti 13 pav. buvo nustatyta, kad didžioji dalis tirtų mėginių yra mažo virulentiškumo (88,75 proc.) (PI-0,87-0,90). Didelio virulentiškumo buvo nustatyta tik 1 proc. tirtų mėginių (p<0.05).
9,9 45,6 1,8 42,6 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0
Braun Silver blue
%
31
13 pav. ELISA testo rezultatai (procentais).
Atliekant ELISA tyrimą buvo žinoma kiekvieno žvėrelio lytis ir amžius, todėl atlikti papildomi skaičiavimai, kurių metu buvo tiriami skirtingo amžiaus ir lyties žvėrys.
Pateiktoje diagramoje (14 pav.) matoma lyties įtaka viruso virulentiškumui. Procentine išraiška pateiktuose duomenyse galima matyti, jog yra žymus skirtumas tarp užsikrėtusių mažo virulentiškumo virusais patinų (31,08 proc., n-373) ir patelių (57,67 proc.) (n-692; p<0.05). Skirtumas matomas ir esant užsikrėtimui didelio virulentiškumo virusui. Sergančių patinų nustatyta 1 proc. (n-12), kai tuo tarpu užsikrėtusių patelių nenustatyta (p<0.05).
14 pav. ELISA testu nustatytas viruso virulentiškumas pas skirtingos lyties žvėris. 89% 10% 1% <0,4 0,4-0,8 >0,8 57,67 4,42 0,00 31,08 5,83 1,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 <0,4 0,4-0,8 0,8< % Patelės Patinai
32 ELISA testo rezultatus taip pat palyginau suskirsčiusi tirtus patinus pagal amžių (15 pav.). Tiriamieji patinai buvo suskirstyti į amžiaus grupes iki 1 metų ir daugiau, kaip 1 metai.
Vertinant rezultatus matomas skirtumas kiekvienoje viruso virulentiškumo kategorijoje. Mažiausio virulentiškumo viruso patinų iki metų amžiaus sudarė 38 proc. (PI-0,27-0,39; n-173), tuo tarpu virš metų tokių jau buvo 44 proc. (PI-0,39-0,49; n-200) (p>0.05)
Vidutinio virulentiškumo virusą turėjo 8,8proc., jauniklių iki 1m. (n-40), kai tuo tarpu vyresnių kaip 1m. (n-30) turinčių šio virulentiškumo virusą buvo 6,6 proc. (p>0.05)
15 pav. Patinų amžiaus įtaka aleutinės viruso virulentiškumui.
Atliktu testu, taip pat buvo palyginti skirtingo amžiaus kategorijų patelių duomenys. Rezultatai pateikti 16 pav..
Analizuojant duomenis matomas skirtumas skirtingose viruso virulentiškumo kategorijose. Esant viruso virulentiškumui iki <0,4 tokių užsikrėtusių iki 1m. žvėrių yra 51 proc. (n-380; PI-0,47-0,54), o turintiems daugiau, kaip 1m. užsikrėtusių žvėrių yra 54,1 proc. (n-403; PI-0,51-0,58) (p>0.05).
Situacija priešinga ribose tarp 0,4-0,8. Vyresnių, kaip 1m. (n-20; PI-0,02-0,04) žvėrelių yra 2,7proc. o jaunesnių, kaip 1m. (n-33; PI-0,03-0,06) patelių yra 4,4proc. (p>0.05).
38,00 44,00 8,80 6,60 2,00 0,70 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 <0,4 0,4-0,8 0,8< % <1m. 1m.<
33
16 pav. Patelių amžiaus įtaka aleutinės viruso virulentiškumui
Naudojant ELISA testo rezultatus buvo palyginti tos pačios amžiaus grupės, bet skirtingų lyčių audinės.
17 pav. matoma, jog patelių iki metų užsikrėtusių mažo virulentiškumo virusu yra 59,84 proc. 380; PI-0,47-0,55), o patinų užsikrėtusių tokio pačio virulentiškumo virusu 27,24 proc. (n-173; PI-0,24-0,31) (p<0.05).
Skirtumas tarp patinų ir patelių iki vienerių metų taip pat matomas tarp užsikrėtusių dideliu virulentiškumo virusu, nes tokių patelių nenustatyta, o patinų nustatyta 1,42 proc.(p<0.05; PI-0,01-0,03).
17 pav. Skirtingų lyčių, tos pačios amžiaus grupės <1m. ELISA rezultatų palyginimas. 51,0 4,4 0 54,1 2,7 0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 <0,4 0,4-0,8 0,8< % >1m. 1m.< 59,84 5,20 0,00 27,24 6,30 1,42 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 <0,4 0,4-0,8 0,8< % Patelės <1m. Patinai <1m.
34 Vyresnių, kaip 1m. patinų ir patelių užsikrėtimas aleutinės viruso virulentiškumu pavaizduotas 18 pav..
Šioje diagramoje matomas jog ribose iki 0,4 užsikrėtusių vyresnių, kaip 1m. patelių yra 61,43 proc. (n-403; PI-0,58-0,65) tuo tarpu tokių patinų yra tik 30,49 proc. (n-200; PI-0,27-0,34) (p<0.05)
Patvirtinta ankstesnė duomenų analizė (17 pav.), kad patelės dažniau apsikrečia mažo virulentiškumo virusais. Tuo tarpu patinai dažniau buvo užsikrėtę didelio patogeniškumo virusais.
18 pav. Skirtingų lyčių, tos pačios amžiaus grupės 1m.< ELISA rezultatų palyginimas.
61,43 3,05 0,00 30,49 4,57 0,46 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 <0,4 0,4-0,8 0,8< % Patelės 1m.< Patinai 1m.<
35
4.REZULTATŲ APTARIMAS
Lietuvoje šiuo metu yra daugiau nei 90 ūkių, kurie verčiasi kanadinių audinių veisimu, jų auginimu, bei tolimesniu kailių eksportu. Ūkių skaičius yra labai nepastovus ir nuolatos kinta. Praėjusiais metais, tokiu pačiu metu buvo fiksuota beveik dvigubai daugiau kailinių žvėrelių ūkių. Ūkių skaičius Lietuvoje dramatiškai pradėjo mažėti po 2014 m. kailių pramonę ištikusios krizės. Tuo metu kailių kainos krito per puse ar net daugiau. Dauguma Lietuvos ūkių nebepajėgė parduoti kailių didesne negu užauginti reikiamų sąnaudų kaina, dėl to ėmė užsidarinėti. Šiuo metu tiek Lietuvoje, tiek ir visame pasaulyje vis dar tęsiasi kailių prekybos krizė, todėl ūkių ir toliau mažėja (36).
Šiuo metu Lietuvoje yra 91 veikiantis audinių auginimo ūkis, jie pasiskirstę visose apskrityse, tačiau daugiausia jų randama Šiaulių rajone (45 ūkiai) bei Kauno rajone (23 ūkiai), kitose Lietuvos apskrityse ūkių yra po keletą.
Pagal mūsų gautus duomenis, Lietuvoje yra užsikrėtę 37,4 proc. visų ūkių. Vertinant 2016 m. pranešimą apie Aleutinės ligos plitimą Danijoje, galima būtų prognozuoti, kad ši liga gali toliau plisti ir Lietuvoje, taip kenkdama žvėrelių sveikatingumui ir gaunamos produkcijos kokybei (37).
Mūsų gauti duomenys rodo, kad apskrityse, kuriose yra gausu ūkių, yra ir didesnis užsikrėtimas Aleutine liga (pvz. Šiaulių raj. užsikrėtę 42,22 proc.). Tai gali vykti dėl to, jog ūkiai yra netoli vienas kito, užsikrėtusios audinės gali pabėgti iš ūkių, patekti į kitus. Taip pat galimi ir artimų ūkių glaudesni ryšiai. Pavyzdžiui, tarpusavyje bendraudami kaimyninių ūkių savininkai ar darbuotojai per rūbus, avalynę ar kitokiu būdu mechaniškai gali pernešti virusus. Būtent, tokie virusų pernešimo būdai buvo pastebėti Švedijos mokslininkų (38).
Ūkyje, kuriame buvo atliktas mūsų tyrimas, dėl ekonominių problemų mažėjo užauginamų žvėrelių skaičius. Per 2017 m. buvo užauginta 26000 žvėrelių, tai yra 2,5 karto mažiau, negu 2015m. Mano nuomone, šiuos ekonominius ūkio rodiklius lėmė ne tik palyginti žemos kailių supirkimo kainos, bet ir ūkyje esanti Aleutinė liga, dėl kurios suprastėjo žvėrelių reprodukcines savybės bei kailių kokybė.
Sergant Aleutine liga nukenčia vienas iš svarbiausių organizmo sistemų – reprodukcinė. Dauguma patelių neapsivaisina, veda mažas vadas arba sunaikina ką tik atvestas vadas, taip pat pasitaiko, jog neturi pieno. Atlikus tyrimą X ūkyje paaiškėjo, jog 19,33 proc. sergančių Aleutine liga patelių buvo būna bergždžios. Tuo tarpu neužsikrėtusių sveikų patelių populiacijoje bergždumas buvo tik 4,67 proc. patelių. Taip pat atlikus tyrimą pastebėjome, jog sergančių patelių vados buvo mažos, vidutiniškai siekia tik 3 jauniklius, kai tuo tarpu sveikų patelių vadose vidutiniškai buvo 6 jaunikliai.
36 Palyginus bendrą sveikų ir sergančių patelių skaičių paaiškėjo, jog sergančios patelės atsivedė tris kartus mažiau jauniklių (27 proc.) negu sveikos patelės (73 proc.).
Tokiu pačiu principu palyginus patinų kailio dydžius išryškėjo sveikų patinų pranašumas. Jie daug dažniau buvo didesni, negu sergantys žvėrys. Sveikų patinų vidutinis kailio dydis buvo 20 (13,67 proc.), kai tuo tarpu sergančių patinų vidutinis kailio dydis buvo 0 (18 proc.). Tokio dydžio dažniausiai būna tik geros rūšies sveikos patelės. Mūsų atliktas tyrimas taip pat rodo, jog sulėtėja užsikrėtusių patinų augimas, jie dažnai būna mažesni nei sveiki tokio pačio amžiaus patinai. Toks Aleutinės ligos virusų poveikis taip pat pastebėtas ir Danijoje auginamoms audinėms (39)
Atlikus jodo testą skirtingų spalvų žvėrims, paaiškėjo, jog ūkyje dažniau sveiki būna braun spalvos žvėrys (10,24 proc.) nei silver blue spalvos (1,95). Palyginimui atlikus imunoelektroforezės tyrimą braun spalvos sveikų žvėrių buvo nustatyta 4,17 proc., tuo tarpu silver blue sveikų žvėrelių išvis nebuvo nustatyta. Atlikus šį tyrimą galime daryti prielaidą, jog silver blue žvėrys yra jautresni Aleutinės ligos virusui nei braun spalvos. Tai galėtu būti dėl to, jog silver blue spalvos žvėrys į ūkį buvo atvežti prieš porą metų iš Danijos ūkių, kuriuose nėra nustatyta Aleutinės ligos užsikrėtimo atvejų. Tuo tarpu braun spalvos žvėrys ūkyje yra laikomi ilgiau kaip keletą dešimtmečių. Taigi, mūsų nuomone, vietiniai braun spalvos žvėrys yra prisitaikę prie ADV infekcijos, nes veisiant tokius žvėris išlieka tik stipriausi individai, kurie savo geriausias savybes, saugančias nuo viruso, matyt perdavė palikuonims. Matyt, neseniai į ūkį patekę silver blue spalvos žvėrys priešingai, neturi jokių apsauginių barjerų prieš Aleutinės virusą, ir yra jiems jautrūs.
Viruso virulentiškumas buvo nustatytas atlikus ELISA tyrimą. Mažo virulentiškumo viruso paplitimas buvo nustatyta 88,75 proc. Vidutinio ar didelio virulentiškumo virusais užsikrėtusių ir sergančių žvėrių buvo tik 11,25 proc.. Daugiausia, tai įvežtiniai iš kitų ūkių žvėrys. Tai, mūsų nuomone, yra patvirtinimas, kad tų pačių žvėrių daugiametis veisimas vienoje fermoje duoda teigiamus rezultatus didinant atsparumą virusui.
Mūsų atlikti tyrimai taip pat parodė, kad žvėrelio lytis turi įtakos ADV plitimui. Patinų, užsikrėtusių mažo virulentiškumo virusu, (31,08 proc.) buvo mažiau negu patelių (57,67 proc.). Kitokia padėtis buvo didelio virulentiškumo virusų plitime, nes šie virusai buvo aptikti tik patinų grupėje. Taigi, mes manome, kad patinai yra jautresni didelio virulentiškumo Aleutinės ligos virusams nei patelės. Taip pat, atlikę gautų tyrimų analizę, neradome ADV virusų infekcijos plitimo priklausomybės iki 1 metų amžiaus patinų ir patelių grupėse. Panaši ADV virusų infekcijos situacija buvo stebima ir kitų šalių audinių auginimo fermose (40)
Mūsų tyrimai parodė, kad Aleutinė audinių liga yra labai išplitusi Lietuvos žvėrininkystės ūkiuose. Tačiau reikėtų atkreipti dėmesį ir į tai, kad Aleutine liga sergantys žvėreliai dažnai gali atrodyti visiškai sveiki. O „sveikatingumas“, tai audinės gebėjimas augti, turėti stiprų,
37 sveiką, žvilgantį kailį, jos gebėjimas daugintis, apvaisinti pateles, vesti sveikus jauniklius. Audinės neturi elgtis stereotipiškai ar būti apatiškos. Todėl, mūsų nuomone, Aleutinės ligos kontrolė ūkiuose yra viena iš svarbiausių sveikatos ir gerovės užtikrinimo priemonių žvėrininkystės ūkiuose.
38
IŠVADOS
1. Aleutinės ligos virusas Lietuvoje labai paplitęs ir 37,4 proc. visų Lietuvos audines auginančių ūkių yra užsikrėsti šiuo virusu
2. Tyrimais nustatėme, jog 19,33 proc. Aleutine liga sergančių patelių būna bergždžios, o jai jos atveda jauniklius jų vados būna net 2,7 karto mažesnės negu sveikų patelių vados.
3. Audinių populiacijos tyrimas parodė, kad Aleutine liga sergantys patinai lėčiau auga, žymiai pablogėja jų kailio dydis bei kokybė.
4. Atlikus vietinės braun spalvos ir atvežtinės silver blue spalvos audinių serologinius tyrimus dėl užsikrėtimo Aleutinės ligos virusais, buvo nustatyta, kad vietinės braun spalvos žvėreliai buvo žymiai atsparesni užsikrėtimui šios ligos virusais.
5. Atlikę tyrimą imunofermentine analize nustatėme, kad 88,6 proc. audinių buvo užsikrėtę mažo virulentiškumo viruso padermėmis, o vidutinio ar didelio virulentiškumo virusai buvo rasti 11,25 proc. populiacijos. Taip pat nustatėme, kad patinų populiacijoje yra labiau išplitę didelio virulentiškumo virusai.
39 LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bonesia L., Palazon S. The American mink in Europe: Status, impacts, and control. Biological Conservation. 2007; 134: p. 470-483.
2. PORTER D. D., AUSTIN M. D., LARSEN E. The Pathogenesis of Aleutian disease of mink. J Exp Med. 1969.
3. Persson S., Jensen T. H., Blomström A., Appelberg M. T., Magnusson U.. http://journals.plos.org. [Online].; 2015.
4. Management TNDfN. Invasive American Mink (Neovison vison):.; 2011.
5. Yatim K. M., Lakkis F. G.. A Brief Journey through the Immune System. CJASN. 2015; 10: p. 1274-1281. 6. Hunter DB. Mink. biology, health and disease; 1996.
7. Netea M. G., Jessica Quintin Jos W.M.van der Meer. Trained Immunity: A Memory for Innate Host Defense. Cell Host & Microbe. 2011; 9(5): p. 297-300.
8. Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 2006; 6: p. 173-182.
9. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nature Reviews Immunology. 2003; 3: p. 23-25. 10. Hashimoto Y., Moki T., Takizawa T., Shiratsuchi A., Nakanishi Y.. Evidence for Phagocytosis of Influenza
Virus-Infected, Apoptotic Cells by Neutrophils and Macrophages in Mice. The Journal of Immunology. 2007; 178: p. 2448-2457.
11. Lanzavecchia A.. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 1985; 314: p. 537–539. 12. UzenbaevaO L. B.. Trapezova V.. KizhinaVv G. IlyukhaL A. Trapezovan I. Tyutyunnik N.. Russian Journal
of Genetics. 2011; 47: p. 76-82.
13. Martin P. A., Mayne G. J., Bursian S. J., Tomy G., Palace V., Pekarik C., Smits J.. Immunotoxicity of the commercial polybrominated diphenyl ether mixture DE-71 in ranch mink (Mustela vison).
Environmental Toxicology and Chemistry. 2007; 26: p. 988–997.
14. Hansen C. J., JFord J.C., Lewis M. S., Ventura A. B., Hughes C. M., Johnson L. C., Whizin N., Oswald K., Shoemaker R., Swanson T., Legasse A. W., Chiuchiolo M. J., Parks C. L., Axthelm M. K.. Profound early control of highly pathogenic SIV by an effector memory T-cell vaccine. Nature. 2011; 473: p. 523–527. 15. Leadbetter E. A., Rifkin I. R., Hohlbaum A. M., Beaudette B. C., Shlomchik M. J., Marshak-Rothstein A..
Chromatin–IgG complexes activate B cells by dual engagement of IgM and Toll-like receptors. Nature. 2002 416;: p. 603–607.
16. Schwab I., Nimmerjahn F.. Intravenous immunoglobulin therapy: how does IgG modulate the immune system? Nature Reviews Immunology. 2013; 13: p. 176–189.
17. Mestecky J., Mcghee J. R.. Immunoglobulin A (IgA): Molecular and Cellular Interactions Involved in IgA Biosynthesis and Immune Response. Advances in Immunology. 1987; 40: p. 153-245.
18. Weller S., Braun M. C., Tan B. K., Rosenwald A., Cordier C, Conley M.E., Plebani A., Kumararatne D. S., Bonnet D., Tournilhac O., Tchernia G., Steiniger B., Staudt L. M., Casanova J. L.. Human blood IgM
