LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Agnė Budvytytė
Galvijų virusinių ligų tyrimų analizė pietvakarių Lietuvos
pienininkystės ūkyje
Analysis of investigations of bovine viral diseases in
southwestern Lithuanian diary farm
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
2 DARBAS ATLIKTAS VIRUSOLOGIJOS IR MIKROBIOLOGIJOS INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Galvijų virusinių ligų tyrimų analizė pietvakarių Lietuvos pienininkystės ūkyje
“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 SANTRUPŲ SĄRAŠAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 111.1. Virusinių ligų paplitimas Lietuvoje ... 11
1.2. Rizikos veiksniai įtakojantys virusinių ligų plitimą ... 12
1.3. Galvijų virusinės diarėjos epidemiologinių duomenų apžvalga ... 13
1.4. Galvijų infekcinio rinotracheito epidemiologinių duomenų apžvalga ... 16
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 18
2.1. Epidemiologiniai tyrimai ... 19
2.2. Klinikiniai tyrimai ... 19
2.3. Serologiniai metodai ... 19
2.3.1. Imunofermetinės reakcijos analizės metodai ... 19
2.4 Molekulinės biologijos metodai ... 20
2.4.1. Lizdinė polimerazės grandininė reakcija ... 20
2.5. Duomenų vertinimas... 22
2.6. Statistiniai metodai ... 22
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 22
3.1. Epidemiologiniai tyrimų rezultatai ... 23
3.2. Klinikinių tyrimų rezultatai ... 24
3.3. Galvijų serologinių ir molekulinės biologijos tyrimų rezultatai ... 25
3.3.1. GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų skirtingų amžiaus grupių analizė...25
3.3.2. GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų rezultatų analizė skirtingose amžiaus grupėse...29
3.3.3. Mišrių GVD ir GIR virusų infekcijų analizė ... 32
3.3.4. 2006 m. ir 2014 m. mišrių GVD ir GIR virusų infekcijų analizė ... 34
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 36
IŠVADOS ... 39
PADĖKA ... 40
4
SANTRAUKA
Galvijų virusinių ligų tyrimų analizė pietvakarių Lietuvos pienininkystės ūkyje X. Agnė Budvytytė
Magistro baigiamasis darbas
Darbo tikslas atlikti svarbiausių virusinių ligų, GVD ir GIR analizę pietvakarių Lietuvos pienininkystės ūkyje, kuriame šių ligų epidemijos nediagnozuotos. Darbo apimtis 45 lapai, juose 6 lentelės, 13 paveikslų, panaudota 61 literatūros šaltinių.
Literatūros apžvalgoje aprašoma tiriamajame ūkyje aptiktų virusinių ligų t.y. galvijų infekcinio rinotracheito ir galvijų virusinės diarėjos paplitimas Lietuvoje, rizikos veiksniai, kurie gali lemti šių ligų plitimą, bei GIR ir GVD epidemiologinių duomenų analizė.
Tiriamasis darbas buvo vykdomas 2014-2016 metais, jo metu LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos instituto labaratorijoje atlikti galvijų kraujo serumo mėginių tyrimai panaudojant IFA ir PGR metodus GIR ir GVD atžvilgiu. Taip pat buvo analizuojami gauti klinikinių ir epidemiologinių tyrimų duomenys siekiant įvertinti GVD ir GIR svarbą galvijų sveikatingumui.
Tyrimui buvo surinkti 36 skirtingo amžiaus galvijų kraujo mėginiai. Visi atrinkti galvijai buvo kliniškai sveiki. Galvijai suskirstyti į 4 amžiaus grupes: 6-12 mėnesių amžiaus, 12-24 mėnesių amžiaus, pirmaveršes ir karves. Atlikus IFA nustatyta, kad serologiškai teigiami galvijai GVD ar GIR virusų atžvilgiu sudarė 44,4 proc. (16/36), serologiškai teigiami ir GVD, ir GIR virusų atžvilgiu – 50,0 proc. (18/36), o 5,6 proc. (2/36) buvo serologiškai neigiami.
Tyrimai parodė, kad tiriamajame ūkyje galvijų virusinė diarėja (94,4proc.) (34/36) yra labiau paplitusi (P<0,05) nei galvijų infekcinis rinotracheitas (44,4 proc.) (16/36). GVD seroteigiamų galvijų atskirose grupėse buvo 90,0 proc. (9/10) ir 88,9 proc. (8/9) (6-12 ir 12-24 mėnesių amžiaus grupėse) bei karvių ir pirmaveršių grupėse (100 proc.) (9/9;8/8). Serologiškai teigiamų galvijų procentas statistiškai nesiskyrė (P>0,05).
GIR tyrimų rezultatai parodė, kad virusų antikūnų turi karvės (100 proc.) (8/8) ir pirmaveršės (89,9 proc.) (8/9), o jaunesni galvijai buvo serologiškai neigiami. GVD užsikrėtimas vyksta 6-12 mėnesių ir 12-24 mėnesių amžiaus grupėse ar anksčiau, o GIR – pirmaveršių ir karvių amžiaus grupėse. Serologiškai teigiamų galvijų procentas statistiškai skyrėsi (P<0,05) lyginant pirmaveršių ir vyresnių karvių grupes su 6-12 ir 12-24 mėnesių amžiaus grupėmis.
GVD imlūs galvijai sudarė 5,6 proc. (2/36) visų tiriamųjų skaičiaus. Tirtieji serologiškai neigiami galvijai nebuvo viruso nešiotojai. Jie aptikti 6-24 mėnėsių amžiaus grupėse. GIR infekcijai imlūs galvijai aptikti 6-24 mėnesių ir pirmaveršių amžiaus grupėje (18/36). GIR imlių galvijų
5 mėginių skaičius (55,6 proc) statistiškai buvo didesnis (P<0,05) nei GVD atvžvilgiu, visose amžiaus grupėse (5,6 proc.)
Raktažodžiai: galvijų virusinė diarėja, galvijų infekcinis rinotracheitas, epidemiologija imunofermentinės analizės reakcija, polimerazės grandinės reakcija, paplitimas.
6
SUMMARY
Analysis of investigations of bovine viral diseases in southwestern Lithuanian diary farm Agnė Budvytytė
Master‘s Thesis
The aim of this thesis is to perform the analysis of the most important viral diseases in the dairy farm, located in the southwestern Lithuania, where bovine viral diarrhea (BVD) and infectious bovine rhinotracheitis (IBR) occur as the endemic diseases without applying specific preventive measures. The paper consists of 45 pages, including 6 tables, 13 images, and 61 references.
The literature review describes the prevalence of viral diseases, detected in the farm, i.e. infectious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea, in Lithuania, the risk factors that could determine the prevalence of these diseases, and presents analysis of epidemiological data of BVD and IBR.
The research was carried out during the period of 2014-2016. During the research, bovine blood serum samples were tested, using ELISA and PCR, with respect to BVD and IBR in Institute of Microbiology and Virology, Faculty of Veterinary Medicine, Lithuanian University of Health Sciences. In order to evaluate the importance of BVD and IBR to bovine wellness, the clinical and epidemiological findings were also analysed.
36 blood samples of different ages of bovines were collected for this research. All selected bovines were clinically healthy. Bovines were divided into 4 age groups: 6-12 months old, 12-24 months old, primiparous, and cows. ELISA revealed that bovines, seropositive for BVD or IBR, made 44.4% (16/36), and seropositive for both BVD and IBR – 50.0% (18/36). 5.6% (2/36) were seronegative.
The research revealed that bovine viral diarrhea (94.4%) (34/36) is more widespread (P<0.05) than infectious bovine rhinotracheitis (44.4%) (16/36) in the farm under review. The level of spread of BVD seropositive animals in different groups was 90.0% (9/10) and 88.9% (8/9) (age groups of 6-12 and 12-24 months), and age groups of cows and primiparous (100%) (9/9; 8/8). The percentage of seropositive animals was not statistically different (P>0.05).
IBR test results showed that cows (100%) (8/8) and primiparous (89.9%) (8/9) have antibodies, and younger animals were seronegative. BVD infection process takes place in the age groups of 6-12 months, and 12-24 months, or earlier, while IBR– in age groups of primiparous and cows. The percentage of seropositive animals was not statistically different (P >0.05).
7 BVD susceptible bovine made 5.6% (2/36) of the total number of the tested animals. The tested serologically negative bovines were not carriers of the virus. The virus was detected in the age group of 6-24 months.
IBR susceptible bovines were detected in age groups of 6-24 months and primiparous (18/36). The actual number of IBR susceptible bovines (55,6%) was statistically higher (P<0.05) than BVD in all age groups (5.6%).
KEY: Bovine viral diarrhea, infectious bovine rhinotracheitis, epidemiology, polymerase chain
8
SANTRUPŲ SĄRAŠAS
AT-PGR - atvirkštinės transkriptazės polimerazės grandininė reakcija GHV-1 - 1 tipo galvijų herpes virusas
cDNR – komplementari deoksiribonukleorūgštis GIR – galvijų infekcinis rinotracheitas
GIRV – galvijų infekcinio rinotracheito virusas
GIRV ak – antikūnai prieš galvijų infekcinio rinotracheito virusus
GIRV ak- – serologiškai neigiami galvijų infekcinio rinotracheito atžvilgiu GIRV ak+ – serologiškai teigiami galvijų infekcinio rinotracheito atžvilgiu GVD – galvijų virusinė diarėja
GVDV – galvijų virusinės diarėjos virusas
GVDV ak antikūnai prieš galvijų virusinės diarėjos virusus
GVDV ak- – serologiškai neigiami galvijų virusinės diarėjos atžvilgiu GVDV ak+ – serologiškai teigiami galvijų virusinės diarėjos atžvilgiu IFA – imunofermentinė analizė
PGR – polimerazės grandininė reakcija RNR – ribonukleorūgštis
9
ĮVADAS
Galvijų ligos yra plačiai nagrinėjama tema galvijų augintojams bei veterinarijos gydytojams. Susirgus gyvuliams mažėja produkcijos kiekis, didelės išlaidos išleidžiamos jų gydymui bei profilaktinėms priemonėms. Vienos iš sunkiausiai gydomų ligų – virusinės, todėl būtina diagnozuoti galvijų virusines ligas bei užkirsti kelią jų plitimui Lietuvoje (8).
Dažnai virusinės ligos būna be simptomų arba pasireiškia nebūdingais požymiais. Tam turi įtakos galvijų organizmo rezistentiškumas, laikymo sąlygos, viruso patogeniškumas, virulentiškumas, transportavimas ir kt. (8). Norint išsiaiškinti kokios virusų padermės cirkuliuoja, kaip jos kinta, ir kokią reikšmę turi profilaktai reikia atlikti įvairius labaratorinius tyrimus. Lietuvos pramoniniuose pienininkystės ūkiuose virusinių ligų endemiškas pasireiškimas praktiškai netirtas. Anksčiau atlikti tyrimai buvo nedidelės apimties. 2006-2007 m. atliktų tyrimų rezultatais nustatyta, kad galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio rinotracheito virusų paplitimas Lietuvoje yra didžiausias. Šie virusai labiausiai paplitę karvių ir telyčių amžiaus grupėse (8, 54).
Pasaulio mokslininkai atlieka daug tyrimų su GVD ir GIR virusą nešiojančiais galvijais ir juos supančia aplinka. Nagrinėjami šie biotiniai veiksniai, kurie yra susiję su lytimi, banda, veisle, rušimi, mažesnis tyrimų kiekis atliktas lyginant tiriamųjų amžiaus grupių atžvilgiu. Taip pat tiriami abiotiniai veiksniai: regionai, gyvūnų aplinka, laikymo sąlygos. Ligų pasireiškimui diagnozuoti taikomi įvairūs klinikiniai, serologiniai ir molekulinės biologijos labaratoriniai tyrimai.
Diagnozei patvirtinti klinikinių ir epidemiologinių tyrimų duomenų nepakanka. Papildomai reikia atlikti laboratorinius tyrimus pritaikant molekulinės biologijos bei serologinius tyrimų metodus. Tokio tipo tyrimai Lietuvoje dažniausiai yra komerciniai. Nustatyta, kad remiantis klinikiniais, epidemiologininiais požymiais bei labaratoriniais tyrimais, galvijams gali būti diagnozuojamos galvijų virusinė diarėja ir galvijų infekcinis rinotracheitas kaip mono- ar mišrios infekcijos esant skirtingam sergamumui.
Pastaruoju metu daugumoje pasaulio šalių diegiamos kontrolės programos bei sukurtos specifinės vakcinos nuo GIR ir GVD, kurios gali apsaugoti nuo infekcinės ligos ar sumažinti galvijų sergamumą ir gaištamumą (23,26). Dėl ekonominių sumetimų Lietuvoje laboratoriniai tyrimai bei profilaktinės priemonės nėra plačiai naudojamos, todėl didžioji dalis ūkių, pasireiškusių ligų nediferencijuoja ir galvijų kvėpavimo bei virškinimo ligas gydo simptomiškai. Dažniausiai pasirenkami antibiotikai, kurie virusinėms ligoms yra neefektyvus. Todėl labai svarbu tiksliai diagnozuoti galvijų kvėpavimo ir virškinimo trakto susirgimų sukėlėjus, įvertinti patogenų paplitimą įvairiose amžiaus grupėse.
Galvijininkystės ūkiai paprastai profilaktinius tyrimus ir rezultatų analizę virusinių ligų atžvilgiu atlieka tirdami tik suaugusių melžiamų karvių mėginius arba kai infekcinės ligos
10 pasireiškia epidemijomis įvairiose amžiaus grupėse. Tokie tyrimų rezultatai gali neatspindėti galvijų imuninės struktūros įvairių infekcinių ligų atžvilgiu, nes netiriami visų amžiaus grupių galvijai. Todėl remiantis literatūros šaltiniais ir tendencijomis suformulavome ir iškėlėme šio darbo tikslą: atlikti svarbiausių virusinių ligų, GVD ir GIR, analizę pietvakarių Lietuvos pienininkystės ūkyje, kuriame šių ligų epidemijos klinikos nepasireiškė.
Darbo uždaviniai:
1. Atlikti laboratorinių tyrimų retrospektyvinę analizę
2. Atlikti pienininkystės ūkio galvijų laboratorinius tyrimus galvijų virusinės diarėjos ir galvijų infekcinio rinotracheito atžvilgiu.
3. Įvertinti pienininkystės ūkio skirtingo amžiaus galvijų imuninę struktūrą GVD ir GIR atžvilgiu.
4. Remiantis laboratoriniais tyrimų duomenimis nustatyti imlias GVD ir GIR atžvilgiu galvijų amžiaus grupes.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Virusinių ligų paplitimas Lietuvoje
Galvijininkystės ūkiuose nuolat pasitaiko veršelių, telyčių ir karvių įvairios kilmės kvėpavimo takų, virškinamojo trakto ir reprodukcijos susirgimų, kurie pasireiškia skirtingais klinikiniais požymiais ir sukelia didelius ekonominius nuostolius (3,1). 1990-2002 m. laikotarpio, tyrimo metu nustatyta, kad šalyje vidutiniškai 48 proc. ir 30 proc. visų esančių galvijų ligų susiję su virškinimo ir kvėpavimo organų sutrikimais (3). Šių susirgimų viena iš priežasčių – virusinės ligos. Vienais atvejais galvijų susirgimus gali sukelti mono-, kitais atvejais - mišrios infekcijos. Todėl monoinfekcijų atveju tiramių susirgimų priežastis vieno patogeno atžvilgiu, ligos sukėlėjas gali būti nenustatytas, o tirdami mišrių infekcijų atvejus – vieno sukėlėjo vaidmuo stipriai pervertintas.
Esant mono- ar mišrioms virusinių ligų infekcijoms galvijai yra labiau pažeidžiami. Nustatyta, kad dėl virškinamojo trakto ir kvėpavimo ligų galvijai gaišo žymiai dažniau nei nuo reprodukcijos, medžiagų apykaitos ar mastitų (3). Didesnį susirgimų skaičių ir gaišimą dėl enterito bei respiratorinių ligų sukeltų komplikacijų galima paaiškinti dideliu virusinių ligų išplitimu: galvijų virusinės diarėjos, infekcinio rinotracheito ir koronavirusinių ligų ir kt.(2).
Mokslininkų tyrimai rodo, kad labiausiai paplitusios virusinės ligos sukeliančios didžiausius susirgimus ir ekonominius nuostolius yra galvijų infekcinis rinotracheitas ir galvijų virusinė diarėja. Galvijų virusinė diarėja yra vienas iš veiksnių sąlygojančių galvijų bandos sveikatingumą, reprodukciją bei pieno primilžį. Vienas iš pagrindinių galvijų virusinės diarėjos virusų šaltinių yra persistentiškai infekuoti gyvuliai. Jie išlieka virusų nešiotojais visą gyvenimą ir juos platina (7). GVDV yra plačiai išplitęs Lietuvos galvijų populiacijoje. Šios ligos kraujo serumo tyrimai pradėti nuo 1992 m. ir tęsiami iki šiol (4).
2001-2003 m. iš viso galvijų virusinės diarėjos antikūnų atžvilgiu buvo ištirta 6843 galvijų kraujo serumo mėginių, iš kurių 2751 buvo teigiami. Buvo pradėtas sistemingas galvijų virusinės diarėjos viruso likvidavimas veislininkystės įmonėse, bei sustabdytas infekuotų galvijų importas į Lietuvą. 2001-2003 metais galvijų virusinės diarėjos ligos aptikimo tyrimų atlikta 77 proc. daugiau nei ankstesniais metais. 2001-2003 metų tyrimo metu ištirtų mėginių rezultate, 37 proc. buvo teigiami. Daugiausia GVD tyrimų atlika Kauno, Marijampolės, Panevėžio bei Šiaulių apskrityse, kuriose mėginiai sudarė 85 procentus visų tiriamųjų mėginių. Didžiausias paplitimas aptiktas Klaipėdos (55,9 proc.) ir Marijampolės (53,6 proc.) apskrityse. Apskrityse, kuriose galvijininkystė bei pienininkystė nėra labai išvystyta, tyrimai atlikti mažesniu mastu, susirgimų buvo aptikta ženkliai mažiau. (5)
12 Lietuvoje galvijų infekcinis rinotracheitas pradėtas tyrinėti nuo 1993 metų. Tuo metu didžiausias dėmesys buvo skirtas ligos likvidavimui bulių – spermos donorų bandose. Iki 1997 metų veislininkystės įmonėse buvo likviduoti visi serologiškai teigiami buliai ir jų užkrėstų spermų mėginiai (6). Vėlesni tyrimai parodė, kad įgyvendinus šias priemones veislininkystės įmonių buliai daugiau nebeužsikrėtė galvijų infekciniu rinotracheitu, nors laboratorinių tyrimų metu, dar buvo aptikti keli serologiškai teigiami bulių spermų mėginiai (3). Tuo tarpu galvijų infekcinis rinotracheitas pramoniniuose pienininkystės ūkiuose beveik netirtas. Remiantis atliktais tyrimais, labai produktyvių galvijų ūkiuose 26,7% – 77,8% galvijų yra užsikrėtę galvijų infkecinio rinotracheito virusu, o viruso paplitimas Lietuvos galvijų populiacijoje sudarė 11,9%, nuo 2008 metų nustatyta didėjanti BoHV-1 plitimo tendencija. Tyrimai, kurie buvo atlikti, buvo labai mažos apimties, ligos paplitimas visos šalies mastu analizuotas nebuvo. GIR paplitimas Lietuvos pienininkystės ūkiuose, šios ligos enzootiškumas bei atlikti tyrimai rodo, kad mažai skiriama dėmesio epidemiologinės situacijos nagrinėjimui. Skiriant diagnostines, profilaktikos bei kontrolės priemones būtų galima sumažinti GIR paplitimą ir patiriamus ekonominius nuostolius galvijų augintojams.
1.2 . Rizikos veiksniai įtakojantys virusinių ligų plitimą
Epidemiologija - tai procesas nuo ligos atsiradimo iki prevencinių priemonių plano vykdymo. Nuolat analizuojami ligų protrūkiai padeda atskleisti rizikos veiksnius, kurie turėjo epidemijų atsiradimui, plitimui ir stabdymui. Rizikos veiksniai įvairiuose ūkiuose yra skirtingi, nepriklausomai nuo tos pačios gyvūno rūšies, skiriasi gyvūno laikymo sąlygos, veislinės savybių įvairovės, atsparumas ligoms, regionas, gydymo priemonės, specifinės profilaktikos priemonės ir kt. Vienas iš didžiausių veiksnių, kuris gali įtakoti virusinų ligų išplitimą yra naujų gyvulių įvežimas į bandą. Įvairiose Europos šalyse virusinių ligų situacija yra skirtinga, tad perkant galvijus, skirtinga ir rizika užkratui pateikti į mūsų šalį. Europos Sąjungos komisija 2004 m. priėmė sprendimą suskirstyti šalis nares į grupes pagal ligos išplitimą ir tam tikrai šaliai taikyti kontrolės priemones (8). 2006 metais į Lietuvą buvo importuoti 959 veisliniai galvijai, dauguma jų buvo atvešti iš šalių, kuriose galvijų infekcinis rinotracheitas yra išplitęs ir užsikrėtimo galimybė yra didelė (8). Tais pačiais metais įvežta 1795 veislinių pieninių galvijų iš šalių, kuriose galvijų infekcinis rinotracheitas yra likviduotas arba išplitimas labai mažas, tačiau galvijų virusinės diarėjos paplitimas didelis (9). Tai parodo, kad GIR ir GVD užsikrėtimo tikimybės ūkyje, į kurį bus vežami galvijai išauga. Todėl eksportuotus gyvūnus būtina karantinuoti, stebėti, jei yra galimybė ir vakcinuoti.
Virusinių ligų plitimui įtakos turi galvijų bandų dydis. Remiantis 2005 – 2010 metais Lietuvoje atliktais tyrimais GIR viruso paplitimas yra proporcingas bandos dydžiui. Bandose nuo 1
13 – 200 galvijų užsikrėtimas vyravo 5,6 proc., o bandose, kuriose laikoma daugiau nei 200 galvijų 14,8 proc (4). Kuo didesnė galvijų koncentracija bandoje, tuo serologiškai teigiamų galvijų aptikta daugiau. Didėjant galvijų skaičiui bandoje, didėja užsikrėtimo rizika, t.y. užsikrėtusių bandoje skaičius auga nuolat. Virusinių ligų paplitimo priklausomybė nuo bandos dydžio pastebėta ir kitose šalyse (58). Bandos dydžio kontroliavimas, kontrolės priemonės ir profilaktika turėtų būti griežčiau atliekama bei stebima dideliuose ūkiuose, atskirose bandose, kadangi didėjant laikomų galvijų skaičiui didėja ir tikimybė užsikrėsti plintančia liga.
Temperatūros kaita, drėgmė, pasikeitusi aplinka – tai dar keletas veiksnių sudarančių sąlygas viruso plitimui. Keičiantis klimatui - orams atšilus ar vėstant, silpsta ir gyvūno imunitetas. Sveikiems gyvūnams didesnė tikimybė užsikrėsti liga, virusų nešiotojams išryškina klinikinius simptomus ir padidina patogenų išskyrimo kiekį, o sergantiems paūmina ligą, sukelia sunkesnes komplikacijas. Remiantis užsienio literatūra, galvijo optimali laikymo temperatūra yra nuo -7 iki 17°C (13). Atsižvelgiant į tai patariama sudaryti visas sąlygas siekiant apsaugoti gyvūnus nuo perkaitimo ir nuo peršalimo. Stebėti santykinį drėgmės kiekį, reguliuoti ventiliacijos pralaidumą, guliaviečių sausumą bei šiltumą. Nors Lietuvoje streso nuo temperatūros pasikeitimų pasitaiko nedažnai, pereinanamuoju laikotarpiu būtina, atkreipti dėmesį į laikymo sąlygas (12).
1.3 . Galvijų virusinės diarėjos epidemiologinių duomenų apžvalga
Galvijų virusinė diarėja (GVD) – tai užkrečiama virusinė liga, kurią sukelia Flaviviridae šeimos Pestivirusai. Jie yra labai heterogeniški (13). GVDV turi viengrandinę, apvalkalėtąją RNR, kurios genomas yra monocistroninis linijinis. Viengrandinė GVD RNR yra 2 tipų: BDVD – 1a - ir 2b. Dažniausiai pasitaikantis potypis yra 1a, remiantis tyrimų rezultatais jo paplitimas siekia 80%, o 2b tik 20%. Taip pat aptinkami 2 biotipai: citogeninis ir necitogeninis (14). Šie du biotipai skiriasi virulentiškumu, bet antigeniškai jie yra giminingi. Citogeninis biotipas sukelia apoptozę ląstelių kultūrose, (15) o necitogeninis yra ūminių infekcinių procesų priežastis, kurios gali būti plačiai perduodamos su kūno skysčiais: seilėmis, išskyromis iš nosies, šlapimu, sperma (16). GVDV – labiausiai paplitę patogenai pasaulio galvijų populiacijoje. GVDV užkrečia galvijus ir kitus smulkius atrajotojus, sukeldamas įvairių klinikinių požymių pasireiškimą (17). Šis patogenas padaro ženklius ekonominius nuostolius galvijus auginančiose šalyse (18).
Neveršinga, imuniteto neturinti karvė, ūmia GDV infekcija užsikrečia iškart, o klinikiniai požymiai atsiranda po 3 dienų pasireiškiant viremijai, kuri trunka apie 2 savaites kol susiformuoja imunitetas (19). Šia liga dažniausiai serga 2 mėn. – 2 metų galvijai, tačiau užsikrėsti gali ir itin jauni 1-4 dienų veršiukai, ir vyresnio amžiaus 3 – 7 metų suaugę galvijai. Galvijų virusinės diarėjos virusu gali užsikrėsti ne tik galvijai, bet ir laukiniai gyvūnai: stirnos, muflonai, danieliai (20). Virusą gali platinti užsikrėtę – klinikinių požymių turintys ir neturintys galvijai. Taip galime išskirti
14 3 pagrindines GVD formas: ūmiai pasireiškianti GVD, gimdoje esanti GVD infekcija ir subklinikinė GVD forma. (21).
GVDV labiausiai platina PI galvijai. Nustatyta, kad galimybė užsikrėsti lytinio kontakto ar netiesioginio kontakto būdu per užterštą veterinarinę įrangą, muses ar pakratus yra ženkliai mažesnė. (22). Tačiau dažniausiai GVD patogenas į galvijo organizmą patenka alimentiniu arba respiratoriniu būdu. 1 – 4 dienas virusas dauginasi gleivinėse, jas pažeisdamas. Po inkubacinio laikotarpio, virusas patenka į kraują, išplinta po visą oranizmą dažniausiai sukeldamas virškinimo organų, akių, burnos bei nosies gleivinių pažeidimus. Gleivinių pažeidimus dažniausiai pasireiškia opų pavidalu. Dėl atsiradusių šių pažeidimų, sutrinka normali organizmo būklė: galvijai pradeda viduriuoti, seilėtis, sutrinka vandens ir mineralinių medžiagų apykaitos balansas, vystosi dehidratacija. Apsikrėtęs galvijas taip pat pasidaro imlesnis ir kitiems, respiratoriniams ar virškinamojo trakto patogenams (24).
GVD yra vienas iš didžiausių veiksnių, kuris neigiamai įtakoja reprodukciją, primilžį bei bandos sveikatingumą. Dažniausiai galvijų virusinė diarėja pasireiškia be ryškesnių ligos simptomų, tačiau liga gali prasidėti ir nuo stipraus karščiavimo, diarėjos ir net kvėpavimo takų pažeidimų, nors anksčiau manyta, kad GVD virusai yra tik gausaus viduriavimo priežastis (25). Liga gali baigtis gyvūno pasveikimu arba mirtimi, kurios baigtis dažniausiai priklauso nuo imuninio statuso, galvijo amžiaus ir apsikrėtimo būdo (26). Pirmieji ligos požymiai pasireiškia per 2 – 14 parų. Liga gali pasireikšti ūmiai, poūmiai, lėtiniu pavidalu ar be simptomų. Klinikiniai požymiai gali pasireikšti trumpalaike leukopenija, limfopenia, trombocitopenija, apoptozėmis užkrūčio liaukoje, imunosupresija, pireksija ir diarėja, kosulį, apetito netekimą, ištakas iš nosies ir akių. Imūninės sistemos nusilpimas dėl galvijų virusinės diarėjos viruso, turi įtakos kito infekuoto patogeno patekimui į organizmą, kuris sukelia įvairius susirgimus, dėl kurių pasireiškia klinikinių požymių įvairovė. (26)
Didžiausi ekonominiai nuostoliai yra patiriami tada, kai GVD virusai užkrečia karves nėštumo metu ir palikuonys gimsta persistentiškai infekuoti. (27). Veršingoms karvėms klinikiniai požymiai pasireiškia embrionų mirtimi, išsimetimais ar persistentiškai infekuoto (PI) palikuonio atsivedimu (28). Ligos sunkumas priklauso nuo karvės imuniteto, veršingumo laiko, amžiaus. Sergančioms veršingoms karvėms ši liga dažniausiai yra lydima išsimetimų pirmąjį veršingumo trimestrą. Kai išsimetimas neįvyksta, transplacentinė infekcija įvyksta iki 125 veršingumo dienos. Gimę galvijai dažniausiai turi sulėtėjusio augimo sindromą, yra nekordinuotų judesių, imunotolerantiški infekcijos nešiotojai (29). Kai užsikrėtimas įvyksta 100-150d. veršingumo laikotarpiu – veršeliai gimsta su smegenų hiperplazija, hidrocefalija, katarakta bei kitomis patologijomis (30). Veršiukai yra silpni, gaišta. Veršinga karvė užsikrėtusi patogenine GVD
15 infekcija nuo 150d. atsiveda veršiukus, kurie yra sveiki, bei turintys stirpų imunitetą, dėl jau susiformavusios veršelių imuninės sistemos, bet virusą nešiojantys ir platinantys.
Galvijų virusinės diarėjos virusas yra siejamas su daugumos organizmo sistemų patologijomis: reprodukcijos organų, kvėpavimo, virškinimo, imunologinėmis, limfinėmis, raumenų, odos ir centrinės nervų sistemos (31). Gaišę gyvūnai yra anoreksiški, netekę daug skysčių, dehidratavę. Galvijų plaukai būna pasišiaušę. Tarpunagėse galima pastebėti atsivėrusių opų. Apžiūrėjus naturalias kūno angas, pastebimi paraudimai, nekrozės židinėliai, opos burnos ir nosies ertmėse, gausios skadrios arba pūlingos išskyros. Skeleto raumenys sausi. Paviršiniai limfiniai mazgai padidėję.
Virškinimo sistema stipriai pažeista. Stemplėje, šliuže, plonosiose žarnose erozijos ir opos. Ryškus šliužo ir plonųjų žarnų uždegimas, žarnų submukoziniame sluoksnyje nustatomi arteriolių, mažų arterijų vaskuliarinių sienelių segmentinė nekrozė bei perivaskuliarinių limfmazgių uždegimai (32).
Galvijų virusinė diarėja galvijų augintojams yra labai aktuali liga. Vienas greičiausių galvijų virusinės diarėjos diagnozavimo metodų yra nustatomas remiantis klinikiniais simptomais, nors šis ir nėra 100 procentų tikslus. Taip pat liga nustatoma serologiniais tyrimais, kurių metu yra atliekami IFA ir virusų neutralizacijos metodai. GVD galime nustatyti atlikę antigeno nustatymo reakciją, kurios metu yra tiriama stabilizuoto kraujo limfocitų frakcija. Patogeną identifikuoti įmanoma ir virusų išskyrimo būdu, naudojant pirmines ir perspėjamasias lastelių kultūras. Diagnostika atliekama ir pačių organų, išskyrų pritaikant nukleorugščių nustatymo būdą, tokiu būdu atskiriant citopatogeninius ir necitopatogeninius variantus. Tikslus galvijų virusinės diarėjos ligos diagnozavimas yra labai svarbus ne tik gyvūno gydymo srityje, bet ir ligos kontroliavimui bei viruso izoliavimui.
Tinkamiausia ir efektyviausia priemonė galvijų virusinės infekcijos pašalinimui yra persistentiškai infekuotų galvijų identifikavimas ir pašalinimas (33). Vakcinacija taip pat gali būti naudojama kaip pagalba kontrolėje ir prevencijos priemonė (34). Brazilijoje yra naudojamos 8 tipų komercinės vakcinos ir visos jos yra GVDV-1 ar GVDV-2 inaktyvuotos padermės, tačiau jos apsaugo tik mažą dalį bandos ir daugelyje atvejų tai nepasireiškia sistematiškai (35). Galvijai gali būti taip pat vakcinuojami monovalentine, multivalentine, inaktyvuota ir modifikuota gyva vakcina. Vakcinos naudojimo būdas gali būti įvairus: galima lašinti į nosies landą, švirkšti į raumenį ar po oda. Pagal naujausius duomenis, veršiukus patartina pradėti vakcinuoti nuo 8 savaičių, pakartojant po 6 mėnesių nusilpninta vakcina. Revakcinuoti būtina kiekvienais metais, taip stengiantis sumažinti galvijų virusinės diarėjos paplitimą bei mažinant ekonominius nuostolius.
Galvijai patogeninį virusą gali platinti ir lytiškai. Bulių, kurie serga GVD sperma taip pat yra užkrėsta. Apsėklinant karvę, sergančio bulio sperma, yra didelė susirgimo tikimybė. Dėl šios
16 priežasties būtina tikrinti bulių spermą, jei fermoje yra GVD susirgimų, net jei ir bulius klinikinių simptomų neturi.
1.4 . Galvijų infekcinio rinotracheito epidemiologinių duomenų apžvalga
Galvijų virusinį rinotracheitą sukelia galvijų herpes virusas, priklausantis Herpesviridae šeimai, Alphaherpesvirinae pošeimiui, galvijų I tipo herpės rušies virusams. DNR grandinę dengia ikosaedrinė kapsidė apie 100 nm ilgio, kuri sudaryta iš 162 kapsomerų. Tarp kapsidės ir apvalkalo yra nestruktūrinių baltymų sluoksnis (36). Pati svarbiausia viruso dalis - ištisinė DNR, kuri leido ligą suskirstyti į 3 potypius: GHV.1.1 sukelia kvėpavimo takų ligas, GHV.1.2. užkrečia kvėpavimo takų ir lytinių organų gleivines, o GHV.1.3. būdingi neurologinės kilmės infekcijos (37). Taip pat skiriami 2a ir 2b subtipai, kurie yra mažiau virulentiški nei 1a subtipai (38) (39). Tai yra labiausiai paplitęs virusas visoje pasaulio galvijų populiacijoje, kurio sukeliama liga teikia didelius ekonominius nuostolius dėl sumažėjusios pieno gamybos, apvaisinimo problemų, abortavimosi bei jaunų galvijų gaišimo.
Infekcinio rinotracheito inkubacinis laikotarpis trunka apie 2 – 4 paras. Po inkubacinio laikotarpio pastebimas, ryškus ligos progresavimas. Atkreipiamas dėmesys į tai, kad virusas yra labai svarbus faktorius, kuris sąlygoja sunkesnius susirgimus, sukeltų antrinių infekcijų, dėl galimybės koduoti keletą baltymų, kurie yra atsakingi už organizmo imuninės sistemos atsaką (40) (41). Remiantis ES šalių epidemiologiniais duomenimis pastebėta, kad didžiausia žalą padaro ne virusas, o įsimetusi antrinė infkecija. Pastarella multodica, Histophilus somni – dažniausias pasitaikantis antrinis patogenas, kuris sukelia pūliuojančią pneumoniją, infekcinę tromboemboliją, meningoencefalitą bei gerklų abscesus (42). Todėl viruso sukeltos infekcijos metu tenka gydyti ir atsiradusias antrines, dažniausiai bakterines infekcijas. Nors organizmo imuninė sistema ir formuoja atsaką į Herpes patogeną, virusas infekuotame organizme pasilieka, gyvūnas tampa nešiotoju (42). Bandoje esantys nešiotojai, ligą platina periodiškai, taip užkrėsdami sveikus gyvūnus tiesioginio kontakto metu per kvėpavimo takus, akių ir nosies išskyras, oro lašeliniu būdu. Infekcija taip pat gali plisti per šviežią arba užšaldyta infekuotų galvijų spermą (43). GIR plinta oro lašeliniu, tiesioginio kontakto būdu, lytinio akto metu – per spermą, organizmo skysčius, sekretus, per plancentą bei amonio audinius. Atkreipiamas dėmesys, kad GIR užsikrečia ir laukiniai atrajojantys gyvūnai. Viruso platinimas tarp laukinių atrajotojų gali turėti didelės reikšmės plitimui ir naminių gyvūnų populiacijoje Europoje, kadangi perdavimo ryšys tarp skirtingų rūšių gyvūnų dar nėra iki galo ištirtas (44,45). Gyvūnai nuo šios ligos gaišta retai, tačiau, sirgdami šia liga, suteikia didelius ekonominius nuostolius galvijų augintojams. Sumažėja duodamo pieno kiekis, jo kokybė, galvijams krinta svoris, keičiasi mėsos sudėtis, kokybė. Sergant sunkia forma, kai organizmas paveikiamas antrinės infekcijos, skiriama antimikrobinė terapija, dėl kurios būtina atsižvelgti į išlauką, nuostoliai
17 dėl profilaktikos, kritimų. Privaloma naikinti veislinių bulių užkrėsta spermą, užkrėstus veislinius gyvūnus.
Galvijų infkecinis rinotracheitas pasižymi didele klinikinių požymių įvairove. Karščiavimas, seilėtekis, gleivingos išskyros iš nosies ertmės, išliesėjimas, depresija, atsiranda uždegiminiai procesai tokie kaip: laringitas, faringitas, rinotracheitas, bronchomneumoniją, pleuritas, encefalitas (46). Esant 2 potypio rinotracheitui, šalia jau išvardytų požymių atsiranda lytinių organų infekcijos: pustulės, opos vulvos ir makšties srityje, padažnėjęs šlapinimąsis, abortai. Buliams puslelės ir opos susiformuoja apyvarpės ir varpos srityse. Jauniems veršeliams gali išsivystyti ir nervinis pažeidimas: raumenų drebulys, ėjimas ratu, encefalitas. Pasireiškia ir įvairios ligos formos. Formos gali būti ūmi, poūmė ir lėtinė. Liga gali pasireikšti ir subklinikine forma, kai ligai būdingi simptomai nepasireiškia. Profilaktinių priemonių taikymas yra daug efektyvesnė priemonė, nei simptominis gydymas gyvūnams susirgus.
Pagrindiniai patologiniai anatominiai pokyčiai skrodžiant nugaišusius galvijus yra nosies ertmės paraudimas, paburkimas, erozijos, opos, ryklės, gerklų, trachėjos paraudimas taškinės kraujosruvos. Lytinių organų paraudimas, paburkimas, opos, erozijos, nekrozės židinėliai, gleivinė padengta pūlingu eksudatu.
Siekdami kontroliuoti galvijų infekcinio rinotracheito paplitimą, imtasi priemonių surasti tinkamiausią būdą viruso plitimo užkirtimui. Efektyviausias būdas užkirsti viruso perdavimą yra galvijų vakcinavimas. Vakcinavimą galima pradėti nuo 3-7 mėn. veršelių. Po vakcinacijos susidaręs imuninis atsakas yra silpnas, todėl būtina pervakcinuoti po pirmosios vakcinos praėjus 10 - 14d. Vakciną galima švirkšti į raumenį, po oda arba lašinti į nosies ertmę. Lašinimas į nosies ertmę yra saugesnis, nesukelia šalutinio poveikio, saugi veršingoms karvėms, apsaugo nuo abortų. Po vakcinacijos virusas dar gali būti platinamas 10-14 dienų (47). Vakcinavimo efektyvumas taip pat priklauso nuo pasirinktos vakcinavimo programos. Kai kuriose Europos sąjungos šalyse yra naudojamos vakcinavimo programos: vakcinavimas pažymėtomis vakcinomis, vakcinavimas gyvomis vakcinomis ir inaktyvuotomis vakcinomis. Galvijų vakcinavimas sumažina galvijų infekecinio rinotracheito sergamumą bei stabdo GHV- 1 viruso plitimą (48).
18
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
Darbas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute laikotarpiu 2014 m. – 2016 m., veterinarinės medicinos magistrantūros vientisųjų studijų metais.
Virusinių ligų paplitimo pienininkystės ūkyje įvertinimui atlikta ūkio ankstesnių metų klinikinių, epidemiologinių ir laboratorinių tyrimų analizė, taip pat paimti ir ištirti skirtingo amžiaus galvijų kraujo serumo mėginiai. Mėginiai tirti naudojant serologinius (imunofermentinės analizės metodai) ir molekulinės biologijos (polimerazės grandininės reakcijos metodai) metodus.
Tiriamasis ūkis augina galvijus. Šiai žemės ūkio bendrovei priklauso 3 fermos, esančios 1-2 km atstumu viena nuo kitos. Joje laikoma 1100 pieninių karvių. Karvės yra holšteinizuotos Lietuvos juodmargių veislės.
Tyrimui atsitiktine tvarka atrinkti 36 kliniškai sveiki galvijai iš keturių amžiaus grupių: 6-12 mėnesių, 12-24 mėnesių, pirmaveršių ir suaugusių karvių. Detalūs mėginių paėmimo duomenys pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė: Galvijų kraujo serumo mėginių paėmimo schema serologiniams ir molekulinės biologijos tyrimams.
Galvijų amžius ar grupė Mėginių kiekis
6 – 12 mėnesių 10
12 – 24 mėnesių 9
Pirmaveršės 9
Karvės 8
Iš viso: 36
Visi tyrimui naudoti kraujo mėginiai buvo paimti tą pačią dieną, vienkartinėmis priemonėmis. Kraujas steriliai paimtas iš vena jugularis į vakuuminius mėgintuvelius be koagulianto. Atvežti kraujo mėginiai centrifuguojami, atsiskyręs kraujo serumas nupilamas į kitus mėgintuvėlius ir iki tyrimo laikytas -20 laipsnių temperatūroje. Kraujo mėginiai atgabenti į Mikrobiologijos ir virusologijos institutą prieš tai užpildžius lydraščius ir nurodžius tyrimo tikslą: imunofermentinės analizės metodu ištirti GVD ak atžvilgiu; GIR ak atžvilgiu. Prieš tyrimą reagentai yra laikomi kambario temperatūroje (18-20 ºC), po naudojimo grąžinami į 2-8 ºC (56).
19
2.1 . Epidemiologiniai tyrimai
Veterinarijos specialistai buvo apklausiami apie galvijų susirgimus ir epidemiologinę situaciją prieš mėginių paėmimą, mėginių paėmimo metu ir po mėginių paėmimo. Tyrimo metu ypač buvo atkreipiamas dėmesys į būdingus galvijų virusinei diarėjai ir galvijų infekciniam rinotracheitui klinikinius ir epidemiologinius požymius. Teirautasi, kokio amžiaus galvijams dažniausiai pasireiškia šių ligų klinikiniai požymiai ir kokia ligos baigtis. Domėtasi retrospektyviais ūkyje laikomų galvijų tyrimais, apie virusinių ligų dažnumą, kokios specifinės ar nespecifines profilaktinės priemonės bei gydymas buvo ar yra taikomas. Aiškintasi ar į bandą buvo įvežami nauji galvijai ir ar jie buvo karantinuojami. Kokie laboratoriniai tyrimai atlikti siekiant nustatyti užsikrėtimą infekcinėmis ligomis ir kokie gauti jų rezultatai. Domėtasi, kokiu pašaru šeriamos karvės, ar gali turėti kontaktą su kitais ūkiniais ar laukiniais gyvūnais.
2.2 . Klinikiniai tyrimai
Klinikinių tyrimų metu buvo atkreipiamas dėmesys į galvijų ligų klinikinius požymius, sergamumą ir sveikatingumą. Ūkį aptarnaujančio veterinarijos gydytojo buvo paklausta, ar laikotarpyje prieš kraujo ėmimą nebuvo pastebėti galvijų virusinei diarėjai ir galvijų infekciniam rinotracheitui būdingi požymiai, ir ar ūkyje nepasireiškė kitoms virusinėms ar bakterinėms ligoms būdingi simptomai. Aiškintasi ar atsiradę klinikiniai požymiai pasireiškia dažniausiai keletui galvijų, ar tai apima masinius susirgimus ūkyje. Taip pat domėtasi ar įvairių amžiaus grupių kontaktavimas tarpusavyje kraujo ėmimo metu, nesutrigdė galvijų sveikatos.
2.3 . Serologiniai metodai
Antikūnai prieš GVDV ir GIRV buvo nustatomi komerciniais diagnostiniais IFA rinkiniais. 2.3.1. Imunofermetinės reakcijos analizės metodai
LSIVet Ruminant BVD/BD p 80-Serum (LSIVet™) bei GIR LSIVet Bovine IBR screening-serum (LSIVet™) pagamintais bei standartizuotais Švedijoje ir Prancūzijoje.
GVD LSIVet Ruminant BVD/BD p 80-Serum metodas yra paremtas blokuojančios IFA principu. IFA tyrimo metodas paremtas principu, kai virusui specifiniai antikūnai tiriamajame mėginyje konkuruoja su peroksidaze konjuguotus monoklininius virusui p-80 specifinius antikūnus arba juos blokuoja. IFA atlikta pagal diagnostinių rinkinių metodikas. Tyrimo rezultatai įvertinti tiriamo mėginio optinį tankį (OT) pamatuojant spektrometru „Multiscanex“ (Labsystems)“, kai bangos ilgis λ= 450 nm. Remiantis IFA diagnostikumo gamintojo rekomendacijomis pagal optinį tankį apskaičiuotas kiekvieno mėginio inhibijos procentas, kuris yra tiesiogiai proporcingas
20 specifinių antikūnų kiekiui. Mėginiai, kurių inhibijos procentas yra nuo 50 iki 80 procentų žymimi „+“ ir vadinami serologiškai silpnai teigiamais, o mėginiai, kurių inhibijos procentas daugiau nei 80 procentų – žymimi „++“ ir vadinami serologiškai stipriai teigiamais.
Remiantis IFA tyrimų GVD atžvilgiu rezultatais mėginiai buvo suskirstyti į serologiškai neigiamus ir silpnai bei stipriai teigiamus.
GIR LSIVet Bovine IBR screening-serum rinkinys. Šis metodas yra paremtas netiesioginės IFA principu. Polistirolo mikroplokštelės šulinėliai padengti galvijų infekcinio rinotracheito viruso antigenu. Metodo pagrindas – antikūno ir antigeno reakcija. Tam, kad išvengti kryžminės reakcijos tiriamieji mėginiai skiedžiami skiedimo buferiu, kuriame yra GIR viruso ekstrakto ir inkubuojami. Po inkubacijos tiriamieji mėginiai perkeliami į rinkinio mikroplokštelę. Kai tiriamajame mėginyje yra antikūnų, reakcijos metu susidaro antigeno ir antikūno kompleksas, kuris yra surištas šulinėliuose. Nesurištos medžiagos yra išplaunamos. Įpilamas konjugatas, kuris sureaguoja su surištu antigenu. Po plovimo pilamas substratas, kuris sąveikoje su konjugatu pakeičia spalvą. Spalvos intensyvumas yra proporcingas antikūnų koncentracijai serumo mėginyje. Tyrimo rezultatai įvertinti tiriamo mėginio optinį tankį (OT) matuojant spektrometru „Multiscanex (Labsystems)“, kai bangos ilgis λ= 450 nm.
2.4 . Molekulinės biologijos metodai
2.4.1. Lizdinė polimerazės grandininė reakcija PGR tikslas buvo nustatyti virusų nešiotojus ar apsikrėtusių individus.
RNR išskyrimas buvo atliekamas pagal Trizolio gamintojų (Invitrogen, JAV) pateiktą aprašymą. RNR išskirti 250 µl tiriamojo mėginio ( kraujo serumo) buvo paveikiama 750 µl trizoliu, kuris sukelia visišką ląstelių lizę. Mėginys inkubuojamas apie 5 min. kambario temperatūroje ir užpilamas 200 µl chloroformo. Po to stipriai pakratoma ir 2-3 min. laikoma kambario temperatūroje. Taip paruoštas mėginys centrifuguojamas 15 min. 12 tks. g + 4 C temperatūroje.
Paviršinė frakcija perkeliama į naują mėgintuvėlį, užpilama 500 µl izopropanoliu, pakratoma ir laikoma 10 min. kambario temperatūroje. Tada mėginys centrifuguojamas 15 min. 13 tks. g + 4 °C temperatūroje. Po to nusodintos virusinės RNR molekulės, prisitvirtinusios prie mėgintuvėlio dugno pilamos 500 µl etanolio ir inkubuojamos 3-5 min. kambario temperatūroje. Taip apdorotas mėginys centrifuguojamas 3-5 min. 15 tks. g + 4 C temperatūroje. Po to etanolis ir jo likučiai išgarinami ir RNR ištirpinama 20 µl vandens, kuris neturi Rnazių ir kitų inhibitorinių medžiagų (DEPC vanduo). Bendra iškirta RNR buvo naudota kaip matrica vieno mėgintuvėlio atvirkštinės transkripcijos lizdinėje polimerazės grandininėje reakcijoje (AT-PGR).
21 Vieno mėgintuvėlio lizdinėje AT-PGR pirmiausia buvo ruošiami reagentai antram, t.y. lizdinės PGR etapui. Šiam tikslui paruošiamas reakcijos mišinys, kuriame yra 5 µl 22 proc. trechalozės (Sigma), sunaudojamos kitiems reakcijos komponentams išlaikyti, 20 pmol/µl kiekvieno iš vidinių nukleotidų pradmenų A11 ir A14,1 µl dNTPs mišinio (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 10 mM tirpalo ir 0,25 µl Taq DNA polimerazės (1,25 U). Į kiekvieno 0,2 ml Eppendorf mėgintuvėlio dangtelį tokio lizdinės PGR mišinio pilstoma po 8,25 µl ir paliekama 2 val. kambario temperatūroje išdžiūti. Tokiu būdu džiovinti lizdinės PGR reagentai yra tinkami naudoti 6 mėn. 2 lentelė. AT lizdinėje PGR panaudoti bendri visiems pestivirusams oligonukleotidų pradmenys
Pradmenų pavadinimai
Kryptis
5' 3' Oligonukleotidų pradmenų seka 5'--3'
Pozici ja nukleotide Genomo regionas V324
Išoriniai ATGCCC(T/A)TAGTAGGACTAGCA 90-110 5’UTR
V326 TCAACTCCATGTGCCATGTAC 353-373 5UTR/NPRO
A11 Vidiniai AGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGT TCG 161-186 5’UTR A14 CAACTCCATGTGCCATGTACAGCA G 348-372 5UTR/N PRO
Kitame etape buvo naudoti tie patys 0,2 ml Eppendorf mėgintuvėliai, kurių kamšteliuose buvo trechalozėje išdžiovinti lizdinės PGR komponentai. Atvirkštinė transkripcija (AT) ir PGR-I buvo atliekama paminėtų mėgintuvėlių dugne. Amplifikacijai buvo naudojamas 50 µl mišinys: 5 µl bendros RNR, 5 µl 10xPGR buferio (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), 5µl MgCl2
(25 mM, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), 2 µl dNTPs (10 mM, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), po 0,25 µl (po 5 pmol) išorinių pradmenų V324 ir V326, 1µl 10% tritonX-100 (Sigma), 0,5 µl (2,5 U) Taq - DNR polimerazės (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), 0,25 µl (10 U) RNAnasin (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva) ir 0,5 µl (100U) M-MLV atvirkštinės transkriptazės (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva) ir 30,25 µl DEPC vandens. AT-PGR mišinio, esančio mėgintuvėlio dugne, atskyrimui nuo lizdinės PGR komponentų mėgintuvėlio kamštelyje buvo naudojamas mineralinis aliejus (Sigma). Vieno mėgintuvėlio AT lizdinė PGR buvo atliekama amplifikatoriuje Mastercycler ® (Eppendorf).
Sumaišius RNR ir AT-PGRI mišinį, atvirkštinė transkripcija buvo atliekama termocikleryje esant 42°C temperatūrai 30 min. AT fermentai inaktyvuojami kaitinant 95°C 5 min. ir kartu po to pradedama 20 ciklų amplifikacijos reakcija: cDNR denatūravimas – 94°C 1 min., hibridinimas su
22 specifiniais pradmenimis - esant 52°C 1 min., cDNR elongacija (prailginimas) – esant 72°C temperatūrai 1 min. Pasibaigus pirmajam amplifikacijos etapui mėgintuvėliai buvo pakaitinami 65°C 2 min., apverčiami ir laikomi 2 min., siekiant sumaišyti ir ištirpinti lizdinės PGR komponentus mėgintuvėlio dangtelyje su PGRI produktais, esančiais dugne. Po to mėgintuvėliai buvo trumpai nucentrifuguojami ir atliekama lizdinė PGR naudojant 30 amplifikavimo ciklų: 94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 1 min. Galutiniam amplifikavimui užbaigti buvo panaudojama prailginimo procedūra 72°C 10 min. Tokiu būdu gaunamas AT-PGR produktas 212 bp.
AT-PGR amplifikacijos produktai buvo analizuojami 2% agarozės gelyje (Top VisionTM GQ Agarose, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), dažytame etidžio bromidu (koncentracija 1 µg/ml.). 10µl PGR produkto buvo atliekama elektroforezė 1xTBE (90mM Tris, 90mM boro rūgšties, 2 mM EDTA) arba 1xTAE buferyje, leidžiant 100 V srove 45 min. PGR rezultatai buvo matomi UV lempos spinduliuose, esant specifiniam DNR juostelių švytėjimui 212 bp molekulinį žymeklį GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus (UAB "Thermo Fisher Scientific
Baltics", Lietuva) atitinkančioje pozicijoje.
2.5 . Duomenų vertinimas
Gauti galvijų duomenys buvo susisteminti ir sugrupuoti pagal: 1. Epidemiologinius ir klinikinius duomenis;
2. GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų skirtingų amžiaus grupių duomenis; 3. GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų atskirose amžiaus grupėse duomenis; 4. Mišrių GVD ir GIR infekcijų tyrimų duomenis;.
5. 2006 ir 2014 vm. Atliktų tyrimų rezultatų duomenis, juos palyginant.
2.6 . Statistiniai metodai
Rezultatai apdoroti naudojant Microsoft Office programą. CHITEST - testas buvo panaudotas siekiant įvertinti rezultatų skirtumų patikimumą. Rezultatai tarpusavyje lyginami tokiu principu: jei gauti duomenys P<0,05, tai duomenys patikimi ir statistiškai yra reikšmingi, jei P>0,05 tai duomenys yra nepatikimi ir statistiškai yra nereikšmingi. Taikant šiuos statistinius metodus buvo įvertinta ar serologiškai teigiamų GIR ir GVD virusų atžvilgiu, gyvūnų skaičius statistiškai skiriasi skirtingo amžiaus galvijų grupėse.
23
3.1. Epidemiologiniai tyrimų rezultatai
Veterinarijos gydytojų teigimu, GVD ir GIR Lietuvoje yra diagnozuojama, ir ši liga stipriai paplitusi visos Lietuvos mastu. Pagrindiniai ligos simptomai yra virškinamojo trakto ir kvėpavimo takų ligos, kuriomis dažnai sergama vienu metu. Suaugusios karvės gaišta staiga, o veršeliams dažniausiai pasireiškia kvėpavimo takų ir virškinimo ligos (33).
Tyrimams kraujo serumo mėginiai buvo imti Šakių rajone esančiame X ūkyje. Čia laikoma apie 1100 pieninų karvių. Tvartuose laikomi galvijai dėl judėjimo tvarkos turi kontaktą tarpusavyje. Kontaktas su laukiniais gyvūnais tikėtinas tik vasaros metu. Fermoje karvės vasarą laikomos ganykloje, o žiemos laikotarpiu taikomas tvartinis galvijų laikymas. Galvijų mocionas - ganykloje šalia tvartų apie 2 valandas per dieną. Naujai įsigytų galvijų karantinavimas vyksta fermoje, kuri ganykliniu laikotarpiu būna tuščia, tuo metu išvaloma ir dezinfekuojama. Galvijai šeriami savos gamybos pašarais: šienainis, kukurūzų silosas, prieaugliui – šienas. Kombinuotieji pašarai gaminami fermoje, o kombinuotojų pašarų priedai perkami. Karvės ir telyčios sėklinamos UAB „Litgenas“ tiekiama sperma. Vidutinis karvių amžius yra 3-4 laktacijos.
Tiriamojo ūkio aptarnaujantis veterinarijos gydytojas, teigė, kad pagrindinės galvijų sveikatingumo problemos yra tai, kad jauni veršeliai suserga kvėpavimo takų ir virškinamojo trakto ligomis vienu metu. Pastebėta, kad šių susirgimu protrūkis prasidėjo tada, kai į banda buvo įvestos 146 telyčios, kurios buvo pirktos Vokietijoje ir Olandijoje. 2006 m. metų liepos ir rugpjūčio mėnesiais nuo šių ligų nugaišo ~50 procentų fermoje laikytų veršelių. Pagrindiniai simptomai buvo karščiavimas, seilėtekis, išskyros iš nosies ertmės, anoreksija, apatija, smarkus viduriavimas. Skrodimo metu, pastebėti žarnų ir plaučių pažeidimai, jų uždegimai.
Nuo 2006 m. tiriamajame ūkyje buvo pradėti tyrimai GIR ir GVD ligos paplitimui nustatyti. Tyrimo metu nustatyta, kad didžiausias užsikrėtimas GIR virusu buvo karvių amžiaus grupėje (80 proc.), o GVD – telyčių (30 proc.). 2006-2008 metais ūkyje buvo vykdoma vakcinacija nuo galvijų infekcinio rinotracheito. Virusai nebuvo labai išplitę, užsikrėtimas prieauglio grupėje buvo 20-27 proc. Tačiau 2012 metais atlikto tyrimo duomenimis, prasidėjus respiratorinių ligų protrūkiui, seroteigiamų padaugėjo iki 87 proc. Tų metų rudenį veršelių gaištamumas siekė 30 proc (50). Dauguma gaišo nuo lėtinės kvėpavimo takų ligos formos.
Nuo 2010 metų vakcinacija ūkyje nebevykdoma.
Kalbant apie kitas ūkyje paplitusias ligas, veterinarijos gydytojas sakė, kad 2012 metais buvo atlikti papildomi patologiniai, serologiniai, mikrobiologiniai tyrimai dėl užkrečiamųjų ligų. Tyrimų rezultatai pateikti lentelėje nr. 3:
24 3 lentelė: Serologinio ir mikrobiologinio tyrimo rezultatai.
Nustatytas sukėlėjas Metodas
Galvijų virusinės diarėjos virusas Serologinis Galvijų infekcinio rinotracheito virusas Serologinis Galvijų respiratorinis sincitinis virusas Serologinis
Šmalenbergo virusai Serologinis
Paragripo 3 virusas Serologinis
Mycoplasma bovis Mikrobiologinis
M. Dispar Mikrobiologinis
Pasteurellaceae spp. Mikrobiologinis
Mannheimia haemolytica Mikrobiologinis
Cl. Perfringens Mikrobiologinis
Staphylococcus spp. Mikrobiologinis
Patologinių tyrimų rezultatai, parodė, kad skrodimo metu, ryškesnių patognominių patologinių pakitimų organuose nebuvo aptikta.
3.2 . Klinikinių tyrimų rezultatai
Ūkį aptarnaujančio veterinarijos gydytojo teigimu, pastaruoju metu (prieš mėginių paėmimą, mėginių paėmimo metu ir po mėginių paėmimo), karvėms nepasireiškė GIR ar GVD infekcijoms būdingi klinikiniai požymiai. Gydytojas taip pat užsiminė, kad yra galimybė, jog šie simptomai galėjo būti nežymūs ir nepastebimi. Kalbant apie kitų bakterinių ar virusinių ligų klinikinius požymius, sipmtomai taip pat nebuvo pastebėti.
Šiame ūkyje ryškūs klinikiniai požymiai dažniausiai pasireiškė daugumai galvijų vienu metu vienos epidemijos metu, kai buvo įvežtas didelis skaičius galvijų iš užsienio. Aptikta ir pavienių atvejų, kai galvijui pasireiškia virškinamojo trakto ar kvėpavimo ligos, tačiau šiuos susirgimus ne visada galima sieti su virusinėmis ligomis. Taip pat pastebima, kad kai kuriems galvijams klinikiniai požymiai yra nelabai ryškūs, galvijai greitai pasveiksta.
25
3.3 . Galvijų serologinių ir molekulinės biologijos tyrimų rezultatai
3.3.1. GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų skirtingų amžiaus grupių analizė
Iš viso tyrimo metu ištirti 36 galvijų kraujo serumo mėginiai. Pirmame pav. pateiktas serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų pasiskirstymas remiantis GVD IFA tyrimų rezultatais. Tyrimų atsakymai rodo, kad tik dviejų (5,6 %; 2/36) galvijų kraujo serumuose nerasta antikūnų prieš galvijų virusinės diarėjos virusus. Likusieji 34 (94,4 proc.; 34/36) galvijai buvo serologiškai teigiami GVD atžvilgiu.
1 pav. Serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų mėginių pasiskirstymas remiantis GVD IFA tyrimų rezultatais
2 pav. pateiktas serologiškai silpnai ir stipriai teigiamų bei neigiamų galvijų pasiskirstymas remiantis GVD IFA rezultatais. Kaip matome 61,1 proc. (22/36) galvijų kraujo serumo mėginių buvo serologiškai stipriai (++) teigiami, o 33,3 proc. (12/36) - silpnai teigiami (+).
26 2 pav. Serologiškai neigiamų ir silpnai bei stipriai teigiamų galvijų pasiskirstymas remiantis GVD IFA tyrimų rezultatais.
Trečiame pav. pavaizduotas GVD serologiškai neigiamų ir teigiamų galvijų pasiskirstymas amžiaus atžvilgiu remiantis GVD IFA tyrimo rezultatais. Serologiškai teigiami galvijai aptikti visose amžiaus grupėse. Serologiškai neigiamų galvijų mėginių aptikta tik 6-12 mėnesių (2,8 proc.) (1/36) ir 12-24 mėnesių (2,8 proc.) (1/36) grupėse. Visose amžiaus grupėse serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų mėginių skaičius statistiškai nesiskyrė (P>0,05).
3 pav. Serologiškai neigiamų ir teigiamų galvijų pasiskirstymas amžiaus atžvilgiu remiantis GVD IFA tyrimo rezultatais
27 Galvijų GVDV ak mėginių pasiskirstymo rezultatai buvo paremti imunofermentinės reakcijos metu gautų rezultatų optinio tankio matavimais. Mėginio inhibicijos procentas yra tiesiogiai proporcingas specifinių antikūnų kiekiui. Atsižvelgiant į gautus mėginių optinio tankio matavimus, apskaičiavome skirtingo amžiaus serologiškai teigiamų galvijų grupių inhibicijos vidurkį bei standartinį nukrypimą. Paveikslėlyje nr. 4 pateikti atskirų grupių serologiškai teigiamų galvijų GVD inhibicijos procentų vidurkiai GVDV ak inhibicijos vidurkis buvo nuo 87,7 proc. yra 6-12 mėnesių grupėje iki 77,6 proc. – melžiamų karvių grupėje. Inhibicijos vidurkiai buvo skirtingi, tačiau skirtumai tarp vidurkių nebuvo statistiškai ženklūs (P>0,05).
4 pav. GVD inhibicijos procento vidurkiai remiantis GVD IFA tyrimų rezultatais
Penktame pav. matome serologiškai neigiamų, silpnai teigiamų bei stipriai teigiamų galvijų mėginių pasiskirstymą amžiaus atžvilgiu remiantis GVD IFA tyrimų rezultatais. Iš duomenų matome, kad serologiškai stipriai teigiamų galvijų mėginių buvo nuo 80 proc. (8/10) ir 66,7 proc. (6/9) 6-12 mėnesių ir 12-24 mėnesių grupėse iki 45proc. (4/9) ir 50 proc. (4/8) pirmaveršių ir karvių grupėse. Visose amžiaus grupėse serologiškai stipriai teigiamų galvijų mėginių skaičius statistiškai nesiskyrė (P>0,05).
Serologiškai silpnai teigiamų galvijų mėginių remiantis pagal IFA tyrimo rezultatus, vyravo vyresniųjų karvių amžiaus grupės nuo 55 proc. (5/9) ir 50 proc. (4/8) pirmaveršių ir karvių grupėse iki 22,2 proc. (2/9) ir 10 proc. (1/10) 12-24 mėnėsių ir 6-12 mėnesių amžiaus grupėse. Visose amžiaus grupėse serologiškai silpnai teigiamų galvijų mėginių skaičius statistiškai nesiskyrė (P>0,05).
GVD serologiškai neigiami galvijai rasti tik 6-12 mėnesių (10 proc.) ir 12-24 (11,1 proc.) mėnesių amžiaus grupėse.
28 5 pav. Serologiškai neigiamų ir silpnai bei stipriai teigiamų skirtingo amžiaus galvijų mėginių pasiskirstymas remiantis GVD IFA tyrimų rezultatais
Nagrinėjant procentinį galvijų infekcinio rinotracheito serologiškai neigiamų bei teigiamų galvijų paplitimą, 6 pav. matome, kad mažesnė dalis (44,4 proc.), (16/36) tirtų galvijų turi galvijų infekcinio rinotracheito antikūnus.
6 pav. Serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų pasiskirstymas remiantis GIR IFA metodo tyrimų rezultatais.
Tyrimo metu nustatyta, kad iš 36 galvijų kraujo mėginių 16 atvejų buvo teigiami GIR atžvilgiu. Detalesnė tyrimų analizė pavaizduota 7 pav. Jame matomas tirtų galvijų GIR IFA
29 rezultatų pasisikirstymas serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų amžiaus grupių atžvilgiu. Iš gautų rezultatų matome, GIRV antikūnai kraujo serume nustatyti tik vyresniųjų galvijų mėginiuose, t.y. pirmaveršių 22,2 proc. (8/36) ir karvių 22,2 proc., (8/36) grupėse. Jaunesnėse amžiaus grupėse nerasta nei vieno GIR serologiškai teigiamo galvijo. GIR serologiškai neigiamų galvijų mėginių 12-24 mėnesių atžvilgiu skaičius (25 proc.) statistiškai buvo didesnis (P<0,05) nei serologiškai
teigiamų pirmaveršių amžiaus atvžvilgiu (22,2 proc.) (7 pav.).
7 pav. Serologiškai neigiamų ir teigiamų galvijų mėginių pasiskirstymas amžiaus grupėse, remiantis GIR IFA tyrimų rezultatais.
3.3.2. GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų rezultatų analizė skirtingose amžiaus grupėse
Aštuntame pav. pateikti GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų mėginių tyrimų rezultatai, 6-12 mėnesių amžiaus grupės atžvilgiu. Pirmoje amžiaus grupėje labiausiai paplitę serologiškai teigiami GVD atžvilgiu 90proc. (9/10). GIR serologiškai teigiamų galvijų nerasta. GVDV ak serologiškai teigiami atvejai tiriant galvijų kraujo mėginius 6-12 mėnesių amžiaus grupėje statistiškai dažniau (P<0,05) buvo nustatomi nei tiriant mėginius GIR ak serologiškai teigiamų atžvilgiu.
30 8 pav. Serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų mėginių pasiskirstymas 6-12 mėnesių amžiaus grupėje remiantis GVD ir GIR IFA tyrimų rezultatais
Devintame pav. matome GVD ir GIR serologiškai teigiamų galvijų pasiskirstymą 12-24 mėnesių amžiaus atžvilgiu. GVDV ak labiausiai paplitę tarp šios amžiaus grupės galvijų 88,9 proc. (8/9), o GIR nerasta šios amžiaus grupės galvijų kraujo serume. GVDV ak serologiškai teigiami atvejai tiriant galvijų kraujo mėginius 12-24 mėnesių amžiaus grupėje statistiškai dažniau (P<0,05) buvo nustatomi nei tiriant mėginius GIR ak serologiškai teigiamų atžvilgiu.
9 pav. GVD ir GIR seroteigiamų galvijų mėginių pasiskirstymas 12-24 mėnesių amžiaus grupėje remiantis IFA tyrimų rezultatais
31 Pirmaveršių amžiaus grupės pasiskirstymas pagal GIR ir GVD teigiamus virusų antikūnus kraujo serume, pateiktas pav. nr. 10. Iš šios diagramos matome, kad šioje amžiaus grupėje, GVDV ak yra paplitę visuose mėginiuose (100proc.) (10/10), o GIRV ak aptikti didesnėje dalyje mėginių (88,9 proc.) (8/9). GVD ir GIR atžvilgiu serologiškai teigiamų galvijų procentas statistiškai nesiskyrė (P>0,05) pirmaveršių amžiaus grupėje.
10 pav. Pirmaveršių amžiaus grupės pasiskirstymas remiantis GVD ir GIR IFA tyrimu rezultatais
Karvių amžiaus grupėje taip pat pastebimi panašūs rezultatai kaip ir pirmaveršių. Visi galvijai karvių amžiaus grupėje buvo serologiškai teigiami GIRV ak (100 proc.) (8/8) ir GVDV (100 proc.) (8/8) ak atžvilgiu. GVD ir GIR atžvilgiu serologiškai teigiamų galvijų procentas statistiškai nesiskyrė (P>0,05).
32 11 Pav. Karvių amžiaus grupės pasiskirstymas remiantis GVD IR GIR IFA tyrimų rezultatais.
3.3.3. Mišrių GVD ir GIR virusų infekcijų analizė
Iš viso tirti 36 galvijų kraujo serumo mėginiai. 2 galvijų mėginių atsakymai parodė, kad jų kraujo serumuose nerasta nei galvijų virusinės diarėjos nei galvijų infekcinio rinotracheito viruso antikūnų. 18 tirtų galvijų kraujo serumuose, buvo aptikti serologiškai teigiami vieno iš virusų atžvilgiu (50 proc.). O likusioje tiriamų galvijų dalyje - kraujo serume rasta abiejų GVD ir GIR viruso antikūnų, tai sudarė 44,4 proc. (16/36) tirtų mėginių.
4 lentelė: Karvių kraujo serumo mėginių tyrimų IFA metodu GVD ir GIR rezultatai.
Tyrimo rezultatai Galvijų kiekis, n
n %
Serologiškai neigiami 2 5,6
Serologiškai teigiami vieno iš virusų atžvilgiu
18 50,0 Serologiškai teigiami GVD ir GIR virusų atžvilgiu 16 44,4 Iš viso: 36 100
5 lentelėje iš pateiktų duomenų matome GVD ir GIR serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų pasiskirstymą atskirose amžiaus grupėse. 6-12 mėnesių amžiaus grupėje, kraujo serume nerasta abiejų rūšių virusų antikūnų, tačiau serologiškai teigiamų tik GVDV ak ar GIRV ak rasta net
33 9 veršelių kraujo mėginiuose. Šioje amžiaus grupėje matoma, kad 1 individo kraujo serume tiriamų virusų antikūnų išvis nerasta. Vyresnėje 12-24 mėnesių amžiaus grupėje, serologiškai neigiamas vienas galvijas, o net 7 veršeliai yra serologiškai teigiami tik GVD ar GIR viruso atžvilgiu. Atkreipus dėmesį į pirmaveršes ir karves matome, vyravimą abiejų rūšių virusų antikūnų kraujo serumuose, t.y. abi grupės yra serologiškai teigiamos ir GVD ir GIR virusų atžvilgiu išskyrus vieną galviją pirmaveršių amžiaus grupėje, kuris serologiškai teigiamas tik GVD ar GIR viruso atžvilgiu.
5 lentelė: Serologiškai teigiamų ir neigiamų galvijų mėginių pasiskirstymas atskirose amžiaus grupėse GVD ir GIR atžvilgiu
Amžiaus grupė Galvijai
Serologiškai neigiami Serologiškai teigiami GVDV ar GIRV atžvilgiu
Serologiškai teigiami ir GVD, ir GIR virusų atžvilgiu
n % n % n % 6-12 mėnesių 1 10,0 9 90,0 0 0 12-24 mėnesių 1 11,1 8 88,9 0 0 Pirmaveršės 0 0 1 11,1 8 88,9 Karvės 0 0 0 0 8 100,0 Iš viso: 2 5,6 18 50,0 16 44,4
Iš viso ištirti 36 galvijų kraujo serumo mėginiai PGR tyrimo metodu GVD atžvilgiu. Tyrimo rezultatai pateikti 6 lentelėje. Iš pateiktų duomenų matome, kad nei vienas iš tirtųjų mėginių nebuvo teigiamas. Tai parodo, kad nei vienas tiriamas galvijas nebuvo užsikrėtęs galvijų virusine diarėja.
6 lentelė: Galvijų kraujo serumo mėginių tyrimų PGR metodu galvijų virusinės diarėjos atžvilgiu rezultatai
Amžius Tirta mėginių, n PGR teigiami
n % 6-12 mėnesių 10 0 0 12-24 mėnesių 9 0 0 Pirmaveršės 9 0 0 Karvės 8 0 0 Iš viso: 36 0 0
34 3.3.4. 2006 m. ir 2014 m. mišrių GVD ir GIR virusų infekcijų analizė
2006 metais mūsų tiriamajame ūkyje buvo atliktas tyrimas galvijams, GVD ir GIR antikūnams kraujo serume nustatyti. Tyrimo metu buvo ištirti 30 galvijų. 12 paveikslėlyje pateikti duomenys rodo 2006 ir 2014 metų GIR rezultatų pasiskirstymą atsižvelgiant į galvijų amžių. GIR antikūnų turinčių galvijų didžiausias kiekis buvo aptiktas karvių amžiaus grupėje 2014 metais atliktuose tyrimo rezultatuose (80 proc.). Telyčių amžiaus grupėje serologiškai teigiami galvijai rasti tik 2006 metų tyrimo rezultatuose (20 proc.). GIR atžvilgiu serologiškai teigiamų galvijų mėginių procentas statistiškai nesiskyrė (P>0,05) 2006 ir 2014 metais.
12 pav. Galvijų pasiskirstymas amžiaus grupėse remiantis 2006 ir 2014 metais GIR IFA tyrimo rezultatais
13 paveikslėlyje matome galvijų pasiskirstymą pagal amžiaus grupes ūkyje atliktų skirtingų tyrimų metais. Matome, kad pagal GVD IFA tyrimų rezultatus, galvijų turinčių GVD antikūnus kraujo serume ženkliai daugiau 2014 metais visose tirtose galvijų amžiaus grupėse nei 2006 metais. GVDV ak serologiškai teigiami atvejai tiriant galvijų kraujo mėginius 2014 m. statistiškai dažniau (P<0,05) buvo nustatomi nei tiriant GIR ak mėginius 2006 m.
35 13 pav. Galvijų pasiskirstymas amžiaus grupėse 2006 ir 2014 metais remiantis GVD IFA tyrimo rezultatais
36
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Galvijų virusinės diarėjos ir infekcinio rinotracheito susirgimai yra vieni iš aktualiausių galvijininkystės ūkiams. Šie susirgimai gali pasireikšti įvairios lyties, amžiaus, veislės galvijams, buliams reproduktoriams, veršingoms karvėms ir sukelti didelius ekonominius nuostolius (55). Šių susirgimų eiga priklauso nuo daugybės veiksnių: virusų patogeniškumo ir virulentiškumo, bandos imunologinės struktūros, genetikos, taikomų specifinės profilaktikos priemonių, transportavimo, gyvulio priėmimo ir laikymo vietos, amžiaus, lyties, veislės, aplinkos veiksnių - aplinkos temperatūros, drėgmės, ventiliacijos, kenksmingų dujų koncentracijos ir dulkių dalelių. Rizika taip pat dažnai padidėja esant stresinėms situacijoms - nujunkymo laikotarpio, netinkamo transporto, mitybos kaitos, didelio gyvulių tankumo ir chirurginių procedūrų (ragų šalinimas) (8,11,17).
Patekus GVDV ir GIRV sukėlėjams į neapkrėstą ūkį liga pasireiškia sunkiausiai. Ligų eiga dažniausiai pasireiškia ūmiomis formomis. Šios ligos tęsiasi ilgai, galvijai gaišta (22). GIR klinikiniai požymiai prasideda seilėtekiu, pakilusia temperatūra, gleivingomis išskyromis iš nosies ertmės, depresija anoreksija, esant sunkesniai GIR formai, atsiranda pažeidimai ir lytiniuose organuose. Kalbant apie GVD, klinikiniai požymiai pasireiškia pireksija, diarėja, ištakomis iš nosies ertmės, reprodukcijos sumažėjimu (25,26). Veršingoms karvėms būdingi išsimetimai, abortai (26). GVD endemijos metu gaiša iki proc. 11 proc., o bandoje gali būti iki 44 proc. serologiškai teigiamų (61). GIR epizootijos metu gaiša iki 9 proc., o bandoje gali būti iki 77 proc. serologiškai teigiamų (62).
Ūkiuose, kuriuose šie sukėlėjai seniai paplitę liga dažniausiai pasireiškia endemiškai, rečiau epidemijomis. Tai paaiškinama tuo, kad didelė dalis suaugusių galvijų būna įgiję specifinį aktyvų poinfekcinį imunitetą, o veršelių – pasyvų kolostrinį imunitetą. Atliekant serologinius tyrimus tokių galvijų kraujo serumo mėginiuose nustatomi specifiniai antikūnai.
Ligos šiuose ūkiuose dažniausiai praeina lengvesne forma ar pasireiškia poūmia eiga. Kai kuriems galvijams klinikiniai požymiai gali būti nepastebėti ar visai nepasireikšti. Veršingoms karvėms, besilaukiančioms palikuonių, transplacentinė infekcija gali sukelti abortus, vaisius gali gimti negyvas, išsigimimęs, o palikuonims gali sukelti persistentišką infekciją. Persistentiškai užsikrėtę galvijai virusą platina visą gyvenimą (26,57). Persistentiškai infekuotiems gyvuliams dažniausiai klinikiniai požymiai nepasireiškia, tačiau dalis veršelių yra apatiški, mažesnio svorio, nekoordinuotų judesių. Tokie veršeliai ilgai neišgyvena (57).
Ūkyje atlikti klinikiniai ir epidemiologiniai tyrimai. Aptarnaujančio veterinarijos gydytojo buvo paklausta apie buvusią ir esamą epidemiologinę situaciją virusinių ir bakterinių ligų atžvilgiu. Veterinarijos gydytojas teigė, kad tyrimai šiame ūkyje buvo atliekami, todėl virusinių ir bakterinių ligų rasta pakankamai ankstesniais metais, kalbant apie šiuos metus ryškių, kurios nors ligos
