LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Evelina Stončiūtė
Įvairių kačių populiacijų tyrimų koronavirusų atžvilgiu analizė
Feline coronavirus tests analysis in various cats populations
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijųMAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Raimundas Lelešius
DARBAS ATLIKTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Įvairių kačių populiacijų tyrimų koronavirusų atžvilgiu analizė“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. (data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS LSMU VA MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE
(aprobacijos data) (instituto vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai) Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 9 ĮVADAS ... 10 1 LITERATŪROS APŽVALGA ... 11 1.1 FCoV tipai ... 111.2 FCoV dauginimosi organizme ir išskyrimo į aplinką duomenys ... 13
1.3 Rizikos veiksniai FCoV infekcijos pasireiškimui ... 14
1.4 FIPV ir FECV biotipų sukeliamos infekcijos ir jų skirtumai ... 15
1.5 FIP diagnostika ... 17
1.5.1 Serologiniai tyrimai ... 17
1.5.2 Rivalta testas ... 17
1.5.3 PGR metodas ... 18
1.5.4 Histopatologinė diagnostika ... 18
1.6 FCoV reikšmė veterinarijoje ... 19
2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 21
2.1 Serologinis tyrimas ... 21
2.1.1 Serologinio tyrimo organizavimas... 22
2.1.2 Antikūnų prieš FCoV titro nustatymas IFA metodu ... 22
2.2 Molekulinės biologijos metodo taikymas FCoV aptikimui ... 24
2.2.1 PGR tyrimo organizavimas ... 25
2.2.2 RNR išskyrimas ... 25
2.2.3 Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija ... 25
3 TYRIMŲ REZULTATAI... 28
3.1 Serologinio tyrimo rezultatai ... 28
3.2 PGR tyrimo rezultatai ... 34
3.3 Serologinio tyrimo ir PGR tyrimo rezultatų palyginimas ... 37
3.4 Sergančių gyvūnų klinikinių požymių analizė ... 38
4 REZULTATŲ APTARIMAS ... 39
5 IŠVADOS ... 42
6 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43
SANTRAUKA
Įvairių kačių populiacijų tyrimų koronavirusų atžvilgiu analizė Evelina Stončiūtė
Magistro baigiamasis darbas
Kačių koronavirusai yra plačiai paplitę įvairiose kačių grupėse. Šiam virusui mutavus į patogeninę formą, užsikrėtusiems gyvūnams išsivysto infekcinis peritonitas ir jie neišvengiamai nugaišta arba yra eutanazuojami, nes efektyvios gydymo schemos bei vakcinacijos nuo šio susirgimo nėra. Kačių infekcinio peritonito patogenezė ir epidemiologija nėra iki galo išsiaiškinta ir visos katės, užsikrėtusios koronavirusu turi tikimybę susirgti šia nepagydoma ligos forma.
Šio darbo tikslas buvo nustatyti kačių koronaviruso pasireiškimą skirtingose gyvūnų populiacijose ir apibrėžti šio viruso įtaką tiriamų kačių grupių sveikatingumui. Darbas sudarytas iš 49 puslapių, 2 lentelių, 26 paveikslų, jame panaudoti 77 literatūros šaltiniai.
Tiriamasis darbas buvo vykdomas 2017-2018 metais, jo metu išanalizuoti Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute imunofermentinės analizės metodu atlikti 100 kačių kraujo serumo mėginių tyrimai bei LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute atlikti 48 kačių fekalijų mėginių tyrimai lizdinės polimerazės grandininės reakcijos metodu. Tyrime dalyvaujantys gyvūnai buvo suskirstyti pagal tai ar gyvūnas sveikas ar sergantis, amžiaus kategoriją, lytį, veislę, vakcinacijos statusą bei pagal kačių populiacijos tankumą (prieglaudos/veislynų katės bei naminės).
Gauti tyrimų rezultatai parodė, jog 64,0 proc. tirtų kačių kraujo serumo mėginių buvo serologiškai teigiami FCoV atžvilgiu. Specifinių antikūnų prieš kačių koronavirusą titro vidurkis (4,36 log3) buvo statistiškai reikšmingai didesnis veislinių kačių grupėje, lyginant su neveislinėmis katėmis (3,63 log3). Statistiškai reikšmingai didesnis kačių titro vidurkis buvo nustatytas tankiose populiacijose- prieglaudose/ veislynuose gyvenančioms katėms (4,1 log3) lyginant su naminių kačių populiacija (3,65 log3). Reikšmingas skirtumas gautas lyginant vakcinuotas kates (3,62 log3) su nevakcinuotų kačių grupe (4,07 log3). Lytis, amžius bei gyvūno sergamumas titro dydžiui reikšmingos įtakos neturėjo.
PGR metodu nustatyta 35,4 proc. gyvūnų užsikrėtusių kačių koronavirusu. Statistiškai reikšmingai didesnė dalis teigiamų mėginių buvo rasta jauniklių kačių grupėje iki 1m. amžiaus (60,0 proc.), lyginant su vyresnėmis katėmis (24,2 proc.). Populiacijos tankis, gyvūnų lytis bei gyvūnų sveikatingumas PGR metodu tirtose grupėse reikšmingos įtakos neturėjo. Dažniausiai serologiškai ir PGR metodu nustatyti
teigiami gyvūnai pasižymėjo viduriavimu (29,2 proc.), vėmimu (27,4 proc.). Taip pat, 14,6 proc. teigiamų gyvūnų turėjo susikaupusių skysčių pilvo ertmėje bei nepraeinančią aukštą kūno temperatūrą. Raktažodžiai: kačių koronavirusas; kačių infekcinis peritonitas; imunofermentinės analizės reakcija; polimerazės grandininė reakcija.
SUMMARY
Feline conoravirus tests analysis in various cats populations Evelina Stončiūtė
Master‘s Thesis
Feline coronavirus is highly prevalent in various cats populations. When this virus mutates to its pathogenic form an infected animal develops infectious peritonitis. After that cat inevitably dies or is euthanised because there is no current effective treatment scheme or vaccination for this disease. Feline infectious peritonitis pathogenesis and epidemiology is not fully understood, therefore, all cats that are infected by feline coronavirus have a possibility to get this fatal form of disease.
The aim of this study was to estimate feline coronavirus prevalence in various cats populations and to analyse the importance of this virus to the wellness of examined cats groups. The paper consists of 49 pages, 2 tables, 26 images and 77 references.
The research was carried out during the period of 2017-2018. During this research 100 cats blood samples were analysed that were tested using ELISA method in National Food and Veterinary Risk Assessment Institute and 48 cats fecal swab samples were tested using nested RT-PCR method in Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Institute of Microbiology and Virology. Animals included in this research were categorised according to their health status, age, sex, breed, vaccination status and density of the population (to the groups of cats that are from shelters and catteries and to the ones that live in single households).
The research showed that 64.0% of tested blood samples were serologically positive for FCoV antibodies. FCoV antibodies average titre in purebred cats group (4.3 log3) was higher than in crossbreed cats group (3.63 log3) and it was a statistically significant difference. In dense cats populations FCoV antibodies average titre was bigger (4.1 log3) compared to household cats population titre (3.65 log3) and this difference was statistically significant. A statistically significant difference was compared between vaccinated cats group (3.62 log3) with an unvaccinated one (4.07 log3). Sex, age and heath status had no significant value.
PCR method tests showed that 35.4% of tested cats were infected with feline coronavirus. In younger cats group (up to 1 year) there was a bigger part of positive cats (60.0%) than in the older cats group (24.2%) and this difference was statistically significant. Population density, sex and health status had no significant value to the cat groups that were tested by using PCR method. Most animals that were
serologically and PCR positive mostly had diahrroea (29.6%) or were vommiting (27.4%). Also, 14.6% of positive animals had effusions in their peritoneal cavity and a high persistant fever.
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
AT-PGR- atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija; bp-bazių poros;
CNS- centrinė nervų sistema; DNR-deoksiribonukleorūgšis; FCoV- kačių koronavirusas;
FCoV ak-antikūnai prieš kačių koronavirusą; FECV-kačių enterinis koronavirusas;
FIP-kačių infekcinis peritonitas;
FIPV-kačių infekcinio peritonito virusas; IFA-imunofermentinė analizė;
PBS- fosfatinis buferinis tirpalas; PGR-polimerazės grandininė reakcija; RNR- ribonukleorūgštis;
ĮVADAS
Kačių koronavirusai (angl. FCoV) yra labai virulentiški mikroorganizmai, plačiai paplitę aplinkose, kuriose yra didesnis kačių tankis (1). Ir nors FCoV dažniausiai sukelia asimptomatinę infekciją, sporadiškai ir neprognozuojamai ji išsivysto į kačių infekcinio peritonito (angl. FIP) formą- mirtiną sisteminę imuninę ligą (2,3). Nepaisant to, jog koronavirusais užsikrėtusioms katėms infekcinio peritonito forma pasireiškia retai, ši forma yra viena iš dažniausių kačių gaišimo priežasčių, o šios ligos patvirtinimas klinikinėje praktikoje yra sudėtingas (1). Kadangi, po užsikrėtimo kačių koronavirusu gali praeiti savaitės ir net mėnesiai iki infekcinio peritonito išsivystymo, liga dažnai pastebima tik po to kai gyvūnas buvo pasiimtas iš prieglaudos ar nusipirktas iš veislyno. Tai dažnai sukelia daugybę problemų tiek naujiems gyvūno šeimininkams, tiek prieglaudoms ir veisėjams.
Iki šios dienos jau buvo atlikta išsamių tyrimų apie koronavirusinę infekciją, tačiau kačių infekcinio peritonito epidemiologija ir patogenezė nėra iki galo išsiaiškinta (4). Kadangi, FIP prevencijai nėra sukurta nei efektyvios vakcinos, nei nustatyta veiksminga šios ligos gydymo schema- išsamesnės viruso kontrolės gairės padėtų sumažinti šios nuostolingos ligos atvejų skaičių (5). Vienintelis FCoV paplitimo serologinis tyrimas Lietuvoje atliktas 2011 m. Jis buvo nedidelės apimties ir orientuotas tik į specifinių veislinių kačių populiacijas (6). Išsamesnis serologinis tyrimas ne tik fiksuojant antikūnų buvimo faktą, bet ir nustatant šių antikūnų titrą įvairesnėse kačių grupėse, taip pat FCoV aptikimas molekulinės diagnostikos metodu PGR ir šių skirtingų grupių palyginimas padėtų tiksliau identifikuoti galimus rizikos faktorius užsikrėsti šiuo virusu, geriau suprasti jo epidemiologiją ir suformuluoti galimas teorines kontrolės priemones viruso plitimui sustabdyti.
Todėl remiantis literatūros duomenimis ir iki šiol atliktų tyrimų rezultatais išsikėlėme darbo tikslą: Nustatyti kačių koronaviruso pasireiškimą skirtingose gyvūnų populiacijose ir apibrėžti šio viruso įtaką tiriamų kačių grupių sveikatingumui.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti serologiškai teigiamų kačių kiekį IFA metodu FCoV atžvilgiu bei apibrėžti svarbiausius veiksnius, turėjusius įtakos kačių grupių titrų vidurkių dydžiui;
2. Pritaikius PGR metodą palyginti užsikrėtimo koronavirusais gyvūnų skaičių skirtingo tankio, amžiaus, lyties bei sergamumo kačių populiacijose;
3. Palyginti gautus serologinio bei PGR tyrimo rezultatus;
4. Įvertinti kokie dažniausi klinikiniai požymiai pasireiškė serologiškai ir PGR metodu nustatytoms teigiamoms katėms;
1 LITERATŪROS APŽVALGA
1.1
FCoV tipai
FCoV yra voko pavidalo, vienagrandžiai RNR virusai, priklausantys Coronaviride šeimai Alphacoronavirus genčiai. Antigeniškai, koronavirusai yra skirstomi į 5 grupes (7,8). Alphacoronavirus genčiai taip pat priskiriami: perduodamas gastroenterito virusas (angl.TGEV), šunų koronavirusas (angl. CCoV) (9,10). Katės yra imlios visiems 1 grupės koronavirusams (8). Koronavirusams priklauso didžiausias genomas iš visų šiuo metu žinomų RNR virusų. Ši savybė suteikia šiai virusų šeimai lankstumo galimybę pertvarkyti bei modifikuoti savo genus mutacijų metu (11).
1 pav. Alphacoronavirus genties filogenetinis skirstymas (10)
FCoV skirstomi į du serotipus: I ir II. Pirmasis serotipas yra kačių kilmės ir sunkiai kultivuojamas ląstelių kultūroje. FCoV I serotipui būdinga panaši genetinė medžiaga į kiaulių transmisinio gastroenterito virusą. FCoV II serotipas, manoma, jog yra kilęs iš pirmojo kačių koronaviruso serotipo rekombinacijos su šunų koronavirusu metu (1,12). Šio serotipo virusai sparčiai auga ląstelių kultūrose sukeldami lizinį citopatinį efektą (7). Tačiau II serotipo virusai, pasak tyrimų, sukelia tik 20- 30 proc. visų infekcijų (13), o Austrijoje atlikto tyrimo metu, buvo identifikuota 60 proc. FCoV I serotipo infekcijų (14). Pirmasis bei antrasis kačių koronaviruso tipai pasižymi skirtingu tropizmu specifinėms ląstelėms, kurį nulemia skirtingi paviršiniai spyglio pavidalo proteinai, dalyvaujantys viruso prisitvirtinime prie atitinkamų ląstelių. Abu serotipai gali sukelti mirtiną ligą- kačių infekcinį peritonitą (15).
Du biologiniai FCoV tipai pagal sukeliamus ligos požymius yra identifikuoti kaip: kačių infekcinio peritonito virusas (angl. FIPV) bei kačių enterinis koronavirusas (angl.FECV) (2). Iš pradžių, buvo manoma, jog mirtiną kačių infekcinio peritonito formą sukelia itin virulentiškas kačių infekcinio
peritonito virusas. Vėliau, buvo identifikuoti du kačių koronaviruso tipai- pirmasis, kuris yra dauginasi tik virškinamajame trakte ir neplinta toliau regioninių limfinių mazgų. Šis tipas vadintas kačių enteriniu koronavirusu. Antrasis, imunologiškai artimai susijęs su FECV yra pajėgus plisti sistemiškai, infekuodamas monocitus bei makrofagus ir sukelti kačių infekcinį peritonitą (FIPV) (8,16). Remiantis ankstesniais tyrimais buvo kelta hipotezė, jog kačių infekcinis peritonitas pasireiškia kaip imuniteto sukeltas sutrikimas (17). Seroepidemiologiniai infekcinio peritonito tyrimai pirmiausia buvo atlikti naudojant kačių infekciniu peritonitu užkrėstų gyvūnų audinius kaip antigeno substratus netiesioginei imunofluorescensinei antikūnų analizei. Beveik visos sveikos naminės katės, kurių aplikoje buvo gaišusių gyvūnų dėl FIP, buvo serologiškai teigiamos. Tai leido daryti prielaidą, jog nepaisant individų dažnos infekcijos virusu- kačių infekcinis peritonitas išsivysto retai. Tačiau, išskyrus infekcinį peritonitą sukėlusį virusą iš natūraliai užsikrėtusių gyvūnų ir eksperimentiškai užkrėtus laboratorines kates- jos susirgo šia mirtina liga, o ne persirgo beveik nepastebima jos forma (18). Dar sudėtingiau buvo tai, jog kačių prieglaudose, kuriose buvo pasireiškęs kačių infekcinis peritonitas, buvo išskirtas ir genetiškai nuo jo nesiskiriantis kačių enterinis koronavirusas. Antikūnai, susiformavę prieš FECV turėjo stiprią kryžminę reakciją prieš išskirtą ląstelių kultūroje FIPV, bet užkrėstiems gyvūnams sukėlė tik nežymiai pastebimą ar trumpalaikį enteritą. Tai leido daryti prielaidą, jog kačių FIPV galėtų būti stipriai patogeniškas labiau paplitusio kačių enterinio koronaviruso mutantas (19). Šiandien yra bendrai priimta teorija, kad kačių enterinis koronavirusas ir kačių infekcinį peritonitą sukeliantis virusas yra ne dviejų skirtingų rūšių sukelėjai, o priklausanto tam pačiam FCoV. (18). Kačių koronavirusai ir kačių infekcinio peritonito virusai vis dar yra serologiškai ir genetiškai neatskiriami (8). Kačių koronavirusas (FCoV) apima visas viruso atmainas, serotipus (I-ąjį ir II-ąjį) bei biotipus (enterinį ir infekcinio peritonito virusus) (19).
Mokslininkai, remdamiesi atliktais tyrimais, iškėlė hipotezę, jog kačių infekcinis peritonitas atsirado dėl spontaniškos FCoV mutacijos įvykusios infekcijos metu bei šio mutanto gebėjimo daugintis kraujyje ir plisti sistemiškai (20,21). Konkreti viruso virulentiškumo pasikeitimo priežastis mutacijos metu buvo identifikuota kaip specifinio paviršinio baltymo pasikeitimas. Mutavusiame viruse nustatyta 3c ir 7b genų genetinės medžiagos trūkumai lemiantys šio viruso savybių pokytį (22,23). Šie nukleotidiniai trūkumai lemia kai kurių genų ar jų dalių inaktyvavimą, tokiu būdu sutrikdydami normalaus 3c baltymo gamybą. Ši mutacija yra specifinė kiekvienai individualiai užsikrėtusiai FIP katei, net jei jos yra iš tos pačios vados, todėl tai paaiškina, kodėl ši ligos forma neturi savybės persiduoti kitoms katėms. Jei viruso perdavimas „nuo katės, katei“ egzistuotų, tiriami FIPV išskirti iš kačių, susirgusių to paties protrūkio metu, turėtų tokias pačias 3c geno delecijas. Geno trūkumas neužkerta kelio mutanto dauginimuisi, bet yra manoma, jog ženkliai pakeičia viruso tropizmą ląstelėms ir gebėjimą
replikuotis makrofaguose (24). Labiau tikėtina, jog FECV mutuos į FIPV pirminės, o ne pakartotinos infekcijos metu bei jauniklėms katėms, nes šios dvi sąlygos lemia intensyvesnę FECV viruso replikaciją organizme. Kuo dažnesnė replikacija- tuo didesnė tikimybė, jog įvyks mutacija. Labai jaunoms katėms taip pat būdingas mažesnis atsparumas mutacijoms, kas suteikia puikias sąlygas viruso genetiniams pokyčiams (19). Taip pat manoma, jog koronaviruso mutacija į letalią viruso formą yra dažniau tikėtina katėms su sutrikusia imunine sistema (25). Yra atlikta mutacijos teoriją pagrindžiančių tyrimų, kurių metu teigta, jog būtent viruso specifinio S baltymo mutacija lemia viruso tropizmo ląstelėms pokytį bei įgalina virusą plisti iš virškinamojo trakto į kūno audinius, kur sukeliama mirtina FIP forma (26).
2 pav. FCoV genomo išsidėstymas (27);
Alternatyvi hipotezė yra „virulentiško / nevirulentiško cirkuliuojančio viruso“ teorija, kuri teigia, jog tiek virulentiški, tiek nevirulentiški viruso tipai cirkuliuoja kačių populiacijose, o imliems individams susidūrus su virulentiškuoju variantu išsivysto mirtina liga. Nauji atvirkštinės PGR transkripcijos metodai padėjo nustatyti, jog koronavirusai gali būti aptinkami ir sveikų kačių kraujyje. Šie pastebėjimai, leido daryti prielaidą, kad viremija nėra skiriamasis kačių infekcinio peritonito bruožas ir kad sveikos nešiotojos statusas būdingas net ir toms katėms, kurios buvo sistemiškai infekuotos (28).
1.2 FCoV dauginimosi organizme ir išskyrimo į aplinką duomenys
Gyvūnai, užkrėsti kačių koronavirusu, išskyrinėti virusą pradeda per pirmąją savaitę nuo infekcijos pradžios. Nustatyta, jog viruso platinimas vyksta iš klubinės, gaubtinės bei tiesiosios žarnos (29). Virusas yra perduodamas fekaliniu- oraliniu būdu ir gali išlikti iki dviejų savaičių kačių kraiko dėžutėse. Ankstyvose infekcijos stadijose virusas gali būti randamas seilėse, kuomet virusas replikuojasi tonzilėse bei, tikėtina, jog jo galima aptikti ir kvėpavimo takų išskyrose bei šlapime (30). Šis virusas gali būti lengvai pernešamas iš vienos patalpos į kitą ant kūno, per drabužius (31). FCoV platinimas dideliais kiekiais dažniausiai trunka nuo 2 iki 10 mėnesių. Kai kurių kačių viruso platinimo periodas gali trukti ir nuo 9 iki 24 mėnesių (32–34). Taip pat, yra užfiksuota atvejų, kuomet užsikrėtusių kačių viruso platinimo periodai keitėsi su etapais, kuomet virusas nebuvo išskiriamas, t.y. jos platino virusą su įvairaus ilgio
pertraukomis (34,35). Užfiksuota, jog katės su didesniu FCoV ak titru dažniau platino virusą su išmatomis, nei katės su mažesniu titru kraujo serume (19,36). Natūralaus susirgimo FIP atvejais, viruso platinimas gali tęstis iki mirties (37). Tačiau, lyginant su viduriuojančiais bei kliniškai sveikais viruso platintojais, kačių susirgusių FIP išskiriamas besidauginančio viruso kiekis yra labai nedidelis ir viruso replikacija virškinamajame trakte yra ženkliai mažesnė nei vidaus organuose (38,39).
Vieno tyrimo metu buvo nustatyta, jog be išimties visų, atsitiktinai atrinktų, veislynuose gyvenanančių kačių kraujyje buvo užfiksuota FCoV ak. Tai parodė, kad virusas plačiai plinta aplinkoje bei daugelis užskrėtusių kačių neturi jokių klinikinių požymių, indikuojančių užsikrėtimą šiuo virusu (40). Apie 13 procentų kačių, turėjusių kontaktą su šiuo virusu, tampa nuolatinėmis sveikomis nešiotojomis, išskiriančiomis virusą kartu su fekalijomis. Didžioji dalis kačių užsikrečia trumpam laikui ir po kelių mėnesių, visiškai nustojusios išskyrinėti virusą ir eliminavusios jį iš organizmo, vėl ilgainiui tampa seroneigiamomis. Tokios seroneigiamos katės vėl gali būti infekuotos tuo pačiu virusu. Tyrimai įrodė, kad katės pakartotinai gali užsikrėsti ne tik kitu viruso potipiu, tačiau ir tuo pačiu, kuris jau buvo sukėlęs infekciją. Tik labai nedidelė dalis kačių yra atsparios infekcijai (41).Yra teigiama, kad virusas nuolat išlieka populiacijoje, nes yra nuolatinių platintojų bei kačių su trumpalaike koronavirusine infekcija, palaikančių viruso išskyrimą į aplinką (34).
1.3 Rizikos veiksniai FCoV infekcijos pasireiškimui
Remiantis išsamaus serologinio tyrimo duomenimis nustatyta, jog amžius turi ženklią reikšmę kačių koronavirusinės infekcijos pasireiškimui. Jaunikliai (jaunesni nei 3 mėnesių amžiaus) pasižymi reikšmingai didesne mirtingumo rizika nei beveik suaugusios ir suaugusios katės (42). Tyrimai Europoje bei Amerikoje patvirtino susirgimo infekciniu peritonitu riziką jaunoms, grynaveislėms katėms, sveikiems, nekastruotiems patinams. Sumažejusi rizika susirgti buvo apibrėžta kastruotų patelių grupėje (43). Didesnė rizika susirgti taip pat nustatyta Abisinijos, Bengalų, Birmos, Himalajų, Ragdolų ir Reksų kačių veislėms, o mažesnė rizika priskirta Burmos, Egzotų trumpaplaukių, Manksų, Persų, Rusų mėlynųjų ir Siamo veislių katėms. Vis tik šis tyrimas daugiau teigė, jog su koronavirusu susijusios mirtys tikriausiai labiau lemiamos specifinės kraujo linijos individualiose veislėse, nei pačios veislės kaip lemiamo predisponuojančio faktoriaus (44,45).
Nustatyta, jog mirtys dėl FIP formos pasireiškimo kačių veislynuose buvo dažnesnės rudenį ir žiemą. Vienas iš svarbesnių faktorių- nustatytas individualus genetinis gyvūno imlumas virusui, kuris lėmė apie 50 proc. visų atvejų pasireiškimo (25).Daugybę metų, kačių infekcinis peritonitas buvo laikyta išskirtinai grynaveislių kačių, gyvenančių didesnio tankio populiacijose, problema. Didesnio kiekio kačių laikymas tankesnėmis sąlygomis lemia padažnėjusį šių gyvūnų kontaktą su kitų individų išmatomis
ir tokiu būdu palengvina viruso fekalinį-oralinį perdavimo būdą (20). Tačiau, remiantis A. Muirdeno atliktu tyrimu- laukinės ir pusiau laukinės katės, nepaisant to, jog gyvena netankiose populiacijose turi du kartus didesnę tikimybę būti serologiškai teigiamos FCoV ak atžvilgiu, nei naminės katės (46).
1.4 FIPV ir FECV biotipų sukeliamos infekcijos ir jų skirtumai
Yra išskirtos trys koronavirusinės infekcijos formos:
1) efuzinė arba šlapia kačių infekcinio peritonito forma, kuri yra charakterizuojama fibrininio peritonito ar pleurito atsiradimu. Ši forma visada pasibaigia gyvūno mirtimi;
2) neefuzinė arba sausa infekcinio peritonito forma, kuriai nebūdingas skysčio kaupimasis, tačiau pasireiškia fibrino atsidėjimu peritoneume. Ši forma yra mirtina;
3) subklinikinis enteritas, kurio pasireiškiantys požymiai yra labai nežymūs ir sunkiai atpažįstami
(19).
Dažniausiai koronavirusų dauginimasis kačių organizme net ir aptikus didelius jų kiekius- užkrėstam gyvūnui nesukelia jokių klinikinių požymių arba tik labai nežymią kliniką. Tik sporadiškai mutantai yra patogeniški ir sukelia kačių infekcinį peritonitą (17). FIPV yra mutantinė FECV forma (biotipas), todėl norint suprasti kačių infekcinio peritonito pasireiškimą, būtina suprasti kaip vyksta FECV infekcija. FECV yra visur esantis, plačiai pasaulyje paplitęs virusas, kurį su savo išmatomis gali išskirti apie 40-80 proc. kačių bet kuriuo metu. FECV infekcija dažnai yra asimptominė, sukelianti neilgai trunkantį vėmimą, trumpalaikę anoreksiją ir lengvą viduriavimą (47). Ši enterinė infekcija viena pati retai yra mirtina gyvūnams, jei jos metu gyvūnai neužsikrečia papildomais infekcijų sukelėjais (19). Infekcija FECV (kačių enteriniu koronavirusu) įprastai turi subklinikinę ligos eigą, išskyrus jaunus kačiukus, kuriems dažniausiai sukelia vidutinį arba stiprų viduriavimą (48). Vis tik, yra užfiksuota mirtinų ir enterinės koronavirusinės infekcijos atvejų jaunoms ir suaugusioms katėms. Paveiktos katės pasižymėjo katariniu ar hemoraginiu enteritu bei imunohistologiškai buvo patvirtinta, jog virusas infekavo gaurelių epitelines ląsteles (49).
FIPV lemia mirtinus pokyčius organizme kaip vaskulitas ar piogranuliomatoziniai pažeidimai skirtinguose organuose (48). Ankstyviausi susirgimo FIP ženklai be sutrikusio augimo jaunoms katėms yra: kasdien blogėjanti bendra savijauta, svyruojantis karščiavimas, apetito stoka ir svorio kritimas (44). Šio susirgimo patogenezė iki dabar nėra visiškai išsiaiškinta. FIP dažniausiai susijęs su įprastai pasitaikančia efuzine (šlapia) ligos forma, nors pastebima, jog pastaraisiais dešimtmečiais sausosios FIP formos atvejai pasireiškia vis dažniau (44,50). Šlapiosios FIP formos dažniausiai pastebimas požymis
yra pilvo išsipūtimas. Pilvas, be to kad yra nenatūraliai išsipūtęs dažniausiai yra minkštos, tešlos konsistensijos, neskausmingas palpacijai ir su perkusijos metu gerai girdima skysčio sankaupa. Atvėrus pilvo ertmę gali būti randamas iki 1 litro gelsvas, šiek tiek drumstas, mucino turintis skystis. Dispnėja gali pasireikšti katėms, kurioms į infekcinį procesą yra įtraukta pleura bei kaupiasi skysčiai krūtinėje (44). Retesnis, bet irgi mokslininkų užfiksuotas eksudacine FIP forma paveiktoms katėms būdingas sutrikimas yra hepatinės lipidozės bei odos trapumo sindromas (51). Daugumai kačių sergančių FIP dėl imununinių kompleksų susidarymo bei infekuotų makrofagų/monocitų judėjimo į sinovinę sąnarių membraną būdingas generalizuotas sąnarių paviršiaus uždegimas (sinovijitas). Dėl to, katinai užsikrėtę mutavusia viruso forma gali pasižymėti karščiavimu bei šlubavimu. Tai dažnai gali būti supainiojama su kito tipo infekcija arba imuninės kilmės poliartritu (44).
Šios ligos sausoji forma charakterizuojama granuliomatoziniu parenchiminių organų kaip inkstų, kepenų, mezenterinių limfinių mazgų, pilvo sienos, centrinės nervų sistemos bei akių įtraukimu į infekcinį procesą (50). Centrinės nervų sistemos sutrikimai dažnai būdingi gyvūnams užsikrėtusiems sausąja FIP forma. Dauguma kačių, kurioms pasireiškia centrinės nervų sistemos uždegiminiai procesai dėl FIP yra jaunesnės nei 2 metų amžiaus ir yra iš aplinkos, kurioje auginama daugiau nei viena katė (52). Sausosios FIP formos pasekoje paveiktos CNS dažniausiai pasireiškia užpakalinės kūno dalies pareze, nekoordinacija, hiperestezija, traukuliais, brachialinio, trišakio, snukio ar sėdimojo nervo paralyžiumi (53). Katėms, sirgusioms FIP, buvo užfiksuota ir smegenų vandenė. Tai lėmė demencijos pasireiškimą, elgsenos pokyčius (staiga atsiradusią agresiją, baimę, bandymą atsiriboti nuo šeimininkų, įsiučio priepuolius) bei konvulsinius traukulius. Taip pat hidrocefalijai būdingi požymiai pasireiškė vestibuliniai sutrikimai kaip akių nistagmas, galvos pakreipimas ar sukimas (54). Akių pažeidimai, kaip ir CNS pažeidimai, dažniausiai yra būdingi sausąja FIP forma užsikrėtusiems gyvūnams. Dažniausiai pasitaikantys akių pažeidimai šio susirgimo metu yra uveitas ir chorioretinitas. Akių pažeidimai dėl FIP gali pasireikšti vieni arba kartu su kitais būdingais pakitimais kaip CNS sutrikimai ar pažeidimai pilvo ertmėje. Rainelės spalvos pokyčiai yra dažnas ankstyvos FIP infekcijos požymis. Keratininiai precipitatai užpakalinėje ragenos dalyje susiformuoja dėl fibrino, makrofagų bei kitų uždegiminių ląstelių akumuliacijos (44). Atlikti moksliniai tyrimai, kurių metu stengtasi suskirstyti FIP sukeltus pažeidimus. Pagal rastų pažeidimų pasiskirstymą, ląstelių išsidėstymą FCoV antigeno ekspresiją buvo nustatyti keturi pažeidimų tipai: difuziški serozinių paviršių pakitimai, granuliomos su arba be nekrozės sričių, fokaliniai bei perivaskuliariniai B-ląstelių ir plazmos ląstelių infiltratai bei granuliomatozinis arba nekrozuojantis flebitas. Šie tipai gali pasireikšti atskirai ir kartu (55,56).
1.5 FIP diagnostika
Klinikiniai koronavirusinės infekcijos katėms požymiai yra nespecifiški ir nepadeda tiksliam ligos diferencijavimui. Hematologiniai bei biocheminiai parametrai infekcinio peritonito atveju irgi yra nepakankamai specifiški. Neinvazyvus priešmirtinis FIP diagnozės patvirtinimas vis dar yra iššūkis gydytojams, ypatingai kuomet gyvūnui pasireiškia sausoji ligos forma. Tikslingas ligos diagnozavimas turėtų susidėti iš klinikinių požymių ir specifinių tyrimų rezultatų komplekso (38).
1.5.1 Serologiniai tyrimai
Šiuo metu naudojami serologiniai testai yra nepakankamai jautrūs ir specifiški siekiant nustatyti aktyvią infekciją bei nėra tinkami diagnozuoti konkrečiam FCoV tipui, nes FECV ir FIPV sukelia identišką įmuninę organizmo reakciją (5,57). Nors serologiniai kačių koronaviruso tyrimai negali numatyti ar užsikrėtusiam gyvūnui išsivystys kačių infekcinis peritonitas, yra bendrai priimta, jog FCoV ak titro dydis atspindi neseniai vykusios infekcijos metu organizme buvusį viruso kiekį. Dėl to serologiškai teigiamos katės priskiriamos rizikos grupei susirgti letalia ligos forma- FIP (58). Dideli FCoV ak titrai taip pat gali būti būdingi kliniškai sveikoms katėms iš aplinkos, kurioje pasireiškė FIP ligos forma. FCoV ak nustatymas kraujo serume daugelio veterinarijos gydytojų laikomas pagrindiniu laboratoriniu metodu patvirtinant klinikinę FIP diagnozę. Tačiau reikia turėti omenyje, jog šie antikūnų testai negali būti vertinami vieni, o tik su anamnezės, klinikinių-patologinių pokyčių visuma (59). 1.5.2 Rivalta testas
Rivalta testas plačiai taikomas Europos gydytojų siekiant diagnozuoti su FIP susijusius eksudacinius skysčius ir diferencijuoti juos nuo transudato (3).
3 pav. Teigiamas Rivalta testas FIP atžvilgiu (60);
Testo veikimo principas yra: keli lašai ascitinio ar krūtinės ląstos skysčio įpilami į mėgintuvėlį su silpna acto rūgštimi ir stebima reakcija- pasirodžius drumstiems tiriamosios medžiagos sūkuriams testas
laikomas teigiamu FIP atžvilgiu. Mokslinio tyrimo metu buvo nustatyta, jog patvirtintų mėginių FIP atžvilgiu šis metodas pasižymėjo 91% jautrumu ir 66% specifiškumu (60). Tačiau, testo interpretavimas yra subjektyvus ir jo rezultatai iš dalies priklauso nuo vertintojo (57).
1.5.3 PGR metodas
Atvirkštinės transkriptazės polimerazinė grandininė reakcija yra greitas ir jautrus metodas, siekiant aptikti FCoV, tačiau rezultatai turėtų būti interpretuojami klinikinių požymių kontekste (5). Mutavusios FCoV formos FIPV nustatymui yra išrasta daugybė testų galinčių identifikuoti viruso RNR, tačiau visi jie pasižymi tokiais pačiais trūkumais, kurie yra būdingi ir serologiniams testams. Vieni iš populiariausių PGR testų yra paremti 7b baltymo geno trūkumo aptikimu FECV viruso prototipe bei šio geno buvimu FIPV viruso prototipe. Yra duomenų, kurie paremia teoriją, jog šio baltymo trūkumas daugiau yra artefaktas, todėl PGR testai paremti šio genetinio skirtumo užfiksavimu yra netikslingi (61). Tiesa, AT-PGR tyrimuose naudotas metodas sugebėjo tiksliai diferencijuoti FIP formos eigoje atsiradusius pilvo ertmės efuzinius skyčius, nuo skysčių, atsiradusių dėl kitų priežasčių (3). Laboratorijos kontaminacijai PGR produktais išvengti taikoma realaus laiko PGR. Atliktas PGR tyrimas siekiant aptikti FCoV paviršinio baltymo S geno 2 alternatyvius kodonus, kurie koreliuoja su kačių infekcinio peritonito formos fenotipu daugiau nei 95% atvejų. Šis AT-PGR metodas skirtas nustatyti FIP sukėlėją buvo 100% specifiškas ir patvirtino viruso mutacijos teoriją (26). Remiantis šia teorija, buvo pradėtas kurti komercinis PGR metodas, galintis aptikti mutavusią viruso formą- FIP sukėlėją. Trigubas realaus laiko PGR buvo skirtas 3 viruso galimoms mutacijoms aptikti: minėtiems S geno kodonams bei 7b geno pakitimui. Metodo patikimumas buvo tikrinamas atliekant aklą tyrimą su FIP imunohistocheminiu būdu patvirtintais mėginiais bei kontroliniais sveikų gyvūnų mėginiais. Tyrimo specifiškumas buvo apie 95%, taip pat turėjo tam tikrų neatitikimų, kurie reikalauja tolimesnių tyrimų ir metodo bandymų. PGR metodai, gebantys diferencijuoti patogeniškus FCoV tipus nuo nepatogeniškų, yra reikalingi ir jų dėka klinikinėje praktikoje galima išvengti skubotų gyvūnų eutanazavimo atvejų dėl netinkamo FIP diagnozavimo (62).
1.5.4 Histopatologinė diagnostika
Histopatologinis koronavirusinės infekcijos mirtinos formos diagnozavimas yra laikomas „aukso standartu“ atliekant testų vertinimą tarpusavyje. FIP diagnozė patvirtinama katėms su skysčių efuzijomis pilvo ertmėje, geltonais ar baltais židiniais, piogranuliomatoziniais mazgeliais vidaus organuose, gyvūnams su tipiniais histologiniais pažeidimais: perivaskulitu, plazminių ląstelių susikaupimu su nekroziniu centru (63).
Imunohistocheminiai metodai skirti aptikti FCoV antigenus CD18 ir CD3, skirti pamatyti kuriuose gyvūno organuose ar audiniuose vyko viruso replikacija (64). Histologiniai metodai yra invazyvūs ir tinkami tik pomirtinės diagnozės patvirtinimui (57).
4 pav. CD3 antigeno nudažymas imunoperoksidaze (58);
5 pav. Patologiniai FIP formos sukelti pokyčiai (57);
Vis tik, patys svarbiausi šios mirtinos FCoV formos diagnozavimo metodai yra ne laboratoriniai, o istoriniai. Dauguma kačių, sergančių FIP yra nuo 6 mėnesių iki 3 metų amžiaus, atvyksta iš prieglaudų ar veislynų, pasižymi ciklišku, antibiotikams atspariu karščiavimu bei fiziniais pokyčiais, kurie priklauso nuo specifinės mirtinos formos atmainos (sausosios/šlapiosios). Tinkamas anamnezės vertinimas turėtų būti pirmasis diagnozės diferencijavimo etapas. Antrasis, turėtų būti specifinių pilvo ertmės, pleuros skysčių vertinimas, kraujo parametrų vertinimas. Trečiasis etapas turėtų susidėti iš specifinių laboratorinių tyrimų taikymo ir jų vertinimo su pirmųjų etapų rezultatų visuma (serologinių testų ar AT-PGR) (41).
1.6 FCoV reikšmė veterinarijoje
Nuo pirmojo šios ligos pasireiškimo, FIP atvejai ženkliai dažnėjo ir šiuo metu yra pagrindinė kačių infekcinės kilmės mirties priežastis tarp jaunų kačių, ypatingai gyvenančių prieglaudose ir veislynuose (50). Didžiausią įtaką šios ligos atvejų pagausėjimui įvairių kačių populiacijose padarė po Antrojo pasaulinio karo pasikeitęs žmonių požiūris į kates kaip augintinius, į jų laikymo sąlygas bei veisimą. Naminių kačių augintinių kiekis ženkliai išaugo ir daugybė kačių (ypatingai jauniklių) atsidūrė prieglaudose. Manoma, jog didelis kačių tankis laikomas uždarose patalpose buvo palankus veiksnys plisti FECV. O ten, kur plinta FECV yra didžiulė tikimybė pasireikšti ir FIP (19). FECV endemiškai pasireiškia daug kačių turinčiose populiacijose- kačių prieglaudose, veislynuose, namuose, kuriuose laikoma daugiau nei viena katė. Situaciją dar pablogina, jei turimą kačių populiaciją nuolatos papildo nauji gyvūnai, ypatingai jaunesnės katės ir kačiukai. FECV taip pat dažnai paplitę tarp benamių miesto
kačių (20,65). Remiantis tyrimais, FCoV ak yra aptinkami 80-90 procentų kačių, esančių kačių prieglaudose ir nuo 10 iki 50 procentų katėms, kurios gyvena vienos, namuose (3). Tiesa, tik 5-10 % užkrėstų FCoV prieglaudos ar veislyno kačių išsivysto mirtina FIP forma. Naminėms katėms, gyvenančioms namuose po vieną, ši mirtina FIP forma pasireiškia dar rečiau (65). Kuomet klinikinė infekcinio peritonito forma išsivysto- mirtis gyvūną ištinka per kelias dienas ar savaites, nepriklausomai nuo gydymo (61). Kačių, susirgusių FIP, mirtingumas yra didesnis nei 95 % (43). Mirtys, įvykusios dėl pasireiškusio kačių infekcinio peritonito, yra sporadiškos, nenuspėjamos ir nedažnos, joms būdinga enzootinė forma. Kačių veislynai, kuriuose pasireiškia enzootinis FIP gali nesusidurti su gyvūnų mirtimis ištisus metus, o vėliau juose gali sekti ištisa eilė staigių susirgimo atvejų. Tuomet liga gali pranykti ir vėl pasireikšti po kelių mėnesių ar metų dideliais protrūkiais (57).
FIP yra mirtina diagnozė gyvūnui, nepaisant to ar bus atliekama klinikinė intervencija ar ne. Kadangi FIP yra imuninės kilmės sutrikimas, gydymu dažniausiai siekiama kontroliuoti imuninį organizmo atsaką prieš kačių koronavirusą (3). Ligos kontrolei buvo taikyta daugybė strategijų: viena populiaresnių gydyti interferonu ω nepasiteisino, nes preparatas sustabdė FIPV replikaciją in vitro, tačiau buvo neveiksmingas in vivo. Mokslininkai nustatė, jog ciklosporino veikimas prieš FIPV in vitro sąlygomis buvo veiksmingas, tačiau vis dar trūksta išsamesnių tyrimų, kurios patvirtintų preparato veikimą sergančiam gyvūnui (66). Gydymui įprastai taikomi imuniniai supresiniai vaistai, kaip prednizolonas ar ciklofosfamidas, dažniausiai padeda sulėtinti ligos eigą, tačiau kačių neišgydo (3). Felocell FIP (Zoetis US) yra vienintelė komercinė vakcina nuo FIP. Jos sudėtyje yra atenuota temperatūrai jautri FCoV padermė (DF2) ir ji yra leidžiama naudoti katėms nuo 16 savaičių amžiaus. Deja, šios vakcinos veiksmingumas yra nedidelis, ypatingai katėms, kurios jau turėjo kontaktą ir buvo užsikrėtusios FCoV (kas yra ypač dažna endeminėse FCoV atžvilgiu aplinkose). Šiuo metu Amerikos kačių gydytojų asociacija (AAFP) nerekomenduoja naudoti šios vakcinos. Naujos išbandomos vakcinos prieš FIP kol kas taip pat neduoda pageidaujamo imuninio eksperimentinių gyvūnų atsako prieš sukėlėją (67).
T-Teigiama kontr.; N-Neigiama kontr.,
1-Mėginys Nr.1 ir t.t.
Mėginys 145 µl buferio 100 µl buferio 100 µl buferio (1:30) (1:90) (1:270)
2 TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1 Serologinis tyrimas
6 pav. Serologinio tyrimo schema;
1 etapas. Mėginiai.
100 kačių kraujo serumo mėginiai pristatyti į NMVRVI 2017-2018m.
2 etapas. Kontrolės ir mėginiai išpilstomi mikroplokštelėje pagal nurodytą schemą;
A N N N N B T T T T C 1 1 1 1 D 2 2 2 2 E ...
3 etapas. Mėginiai skiedžiami mikroplokštelėje pagal instrukciją
5 µl 50 µl 50 µl
5 etapas. Mikroplokštelės duobučių optinio tankio nustatymas
4 etapas. Mikroplokštelės inkubavimas;
2.1.1 Serologinio tyrimo organizavimas
Atlikta 100 kačių kraujo serumo mėginių, tirtų Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute 2017-2018 metais, tyrimų analizė. Remiantis mėginių lydraščiuose nurodytais duomenimis tirti gyvūnai suskirstyti į skirtingas grupes: 1) pagal lytį; 2) amžių (atskirtos dvi grupės: kačių iki vienerių metų amžiaus ir vyresnes nei vieneri metai); 3) į veislinių ir mišrūnių kačių grupes; 4) į vakcinuotų nuo pagrindinių ligų bei nevakcinuotų kačių grupes; 5) pagal populiacijos dydį (atskirtos dvi grupės- naminių kačių bei kačių, gyvenančių tankiose grupėse, t.y. prieglaudose ar veislynuose) bei 6) pagal klinikinius požymius- į kliniškai sveikų ir sergančių gyvūnų grupes.
2.1.2 Antikūnų prieš FCoV titro nustatymas IFA metodu
Tyrimas atliktas pagal IFA rinkinyje nurodytą metodiką. Metodo principas: FCoV IFA rinkinys naudojamas aptikti antikūnus, susidariusius prieš FCoV baltymus (glikoproteinus). Testuojami mėginiai yra atskiedžiami ir inkubuojami duobutėse. Specifiniai FCoV ak esantys kraujo serumo ar ascitinio skysčio mėginyje sudaro FCoV ak imuno-kompleksą ir pasilieka surišti duobutėse. Katės, kurių mėginiuose aptikti specifiniai antikūnai (ir ypač dideli jų kiekiai), remiantis gamintojo nurodyta instrukcija yra laikomos galimomis viruso pernešėjomis bei platintojomis.
Naudojama:
1) Mikrotitravimo juostelės; 2) Juostelių laikiklis;
3) IFA buferis;
4) HRPO konjuguoti anti-rūšiniai antikūnai ; 5) Teigiama kontrolė;
6) Neigiama kontrolė;
7) Plovimo tirpalas (prieš naudojimą praskiedžiamas 200 kartų dejonizuotu vandeniu); 8) Substratas A;
9) Substratas B;
10) Reakcijos sustabdymo tirpalas. Procedūra:
1. Į visas duobutes pripilta po 250µl praskiesto plovimo tirpalo, tada iškratyta ir kartota dar 5 kartus.
2. Po paskutinio plovimo plokštelę nusausinta absorbuojančiu popieriumi, taip pašalinant plovimo tirpalo likučius.
3. Atskiroje plokštelėje atlikti kontrolių (neigiamos, teigiamos) ir tiriamųjų mėginių 3x skiedimai, pradedant santykiu 1:30 (tuomet 1:90, 1:270).
4. Į paruoštą išplautą rinkinio plokštelę perkelta po 100 µl atskiestų kontrolių (neigiamos ir teigiamos) ir tiriamųjų mėginių pagal schemą:
5. Plokštelė uždengta (dangteliu, aliuminio folija ar lipnia juosta) ir inkubuota valandą 37 °C temperatūroje.
6. Plokštelės turinys iškratytas ir plokštelė išplauta kaip aprašyta 1 ir 2 punktuose. 7. Į kiekvieną plokštelės duobutę išpilstyta po 100 µl HRPO anti-rūšinių antikūnų. 8. Plokštelė uždengta ir palikta ikubuotis 1 valandą 37 °Ctemperatūroje.
9. Lygiomis dalimis sumaišyti rinkinyje pateikti subrato „A“ tirpalas su substrato „B“ tirpalu, švelniai papurtyti ir išpilstyti po 100 µl į kiekvieną plokštelės duobutę.
10. Plokštelė inkubuota 10-25 minutes kambario temperatūroje (21 °C). 11. Išpilstyta po 50 µl „STOP“ tirpalo į kiekvieną plokštelės duobutę.
12. Spalvos intensyvumas vertintas automatiniu mikroplokštelių analizatoriumi 450 nm ilgio šviesos banga.
13. Rezultato nuskaitymas atliktas per 10min. po reakcijos sustabdymo. Rezultatų vertinimas:
1. Vertintas kiekvieno mėginio titras pagal optinio tankio reikšmes. 2. Rezultatai interpretuoti pagal nurodytą rinkinio metodiką:
1) Jeigu gautas tiriamo mėginio titras yra <30 – rezultatas laikytas neigiamu (antikūnų nerasta).
2) Jeigu gautas tiriamo mėginio titras 30-270-rezultatas laikytas teigiamas (rasti antikūnai). Rezultatai buvo vertinti kai:
1. Neigiamos kontrolės OT dydis buvo ≤0,400 titro pabaigos taškas ≤1:30 skiedime. 2. Teigiamos kontrolės OT dydis buvo ≥0,800 titro pabaigos taškas ≥1:30 skiedime.
2.2 Molekulinės biologijos metodo taikymas FCoV aptikimui
4 Etapas. Mišinio
amplifikavimas termocikleryje
40 pasikartojančių ciklų vykdymas 94 oC, 55 oC, 72 oCtemperatūrose;
Ir 35 amplifikavimo ciklai: 94 °C , 55 °C, 72 °C temperatūrose.
2 Etapas. RNR išsskyrimas Trizoliu 1 etapas. Mėginių surinkimas
Surinkti 48 kačių išmatų mėginiai į mėgintuvėlius su PBS;
3 Etapas. Reakcijos mišinio paruošimas
Reakcijai vykti reikalingų medžiagų ir tiriamųjų mėginių paruošimas Eppendorf
mėgintuvėliuose.
6 Etapas. Produktų vertinimas UV šviesoje 5 Etapas. Elektroforezės reakcija
agarozės gelyje
2.2.1 PGR tyrimo organizavimas
Tyrimui atlikti surinkti 48 kačių išmatų mėginiai. Mėginiai paimti ausų krapštuku iš tiriamojo gyvūno analinės angos ir patalpinti į mėgintuvėlį, pripildytą fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS). Iki tyrimo laboratorijoje mėginiai užšaldyti -20 °C temperatūroje. Tirti gyvūnai suskirstyti į 4 skirtingas grupes: 1) pagal lytį, 2) pagal amžių (išskirtos dvi grupės: gyvūnai iki 1 metų amžiaus bei virš 1 m. amžiaus), 3) pagal populiacijos dydį (namines kates ir gyvenančias tankiose grupėse – prieglaudose) bei 4) pagal kliniką (kliniškai sveikas bei sergančias).
2.2.2 RNR išskyrimas
RNR išskyrimas atliktas pagal Trizolio gamintojų pateiktą aprašymą. Mėginiai homogenizuoti naudojant 1 ml Trizolio reagento 100 mg mėginio. Iš homogenato pašalintos netirpios mėginio dalys atlikus centrifugaciją 12 tūkstančių apsisukimų greičiu 10 minučių, 5 °C temperatūroje. Paviršiuje susidaręs skaidrus skystis su RNR nutrauktas ir perkeltas į švarius mėgintuvėlius. Homogenizuoti mėginiai inkubuoti 5 minutes 20 °C temperatūroje. Į mėgintuvėlius pripilta po 0,2 ml chloroformo vienam mililitrui Trizolio reagento. Sandariai uždaryti mėgintuvėliai 15 sekundžių sukratyti ranka ir inkubuoti 2-3 minutes 20 °C temperatūroje. Mėginiai buvo centrifuguoti 12 tūkst. apsisukimų greičiu 15
minučių 5 °C temperatūroje. Po centrifugacijos, mišinys išsisluoksniavo į žemesniąją raudoną fenolio-chloroformo fazę, viduriniąją fazę bei bespalvę viršutiniąją vandeningą fazę. Vandeningoji fazė buvo perkelta į švarius mėgintuvėlius. RNR buvo nusodinta iš vandeningosios fazės sumaišant 0,5 ml izopropilo alkoholio (pradiniam 1 ml trizolio kiekiui). Mėginiai inkubuoti 30 °C temperatūroje 10 minučių ir centrifuguoti 12 tūkst. Apsisukimų greičiu 15 minučių 5 °C temperatūroje. Pašalintas paviršinis sluoksnis esantis mėgintuvėliuose. Į RNR pridėta 1 ml 75% etanolio. Mišinys buvo centrifuguotas 7,5 tūkst. Apsisukimų 5 minutes 5 °C temperatūroje. RNR buvo trumpai išdžiovinta ore
10 minučių ir ištirpinta Rnazių neturinčiame vandenyje kelis kartus papipetuojant ir inkubuojant 10 minučių 60 °C temperatūroje.
2.2.3 Lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
Lizdinė PGR buvo atlikta pagal Herrewegho ir kt. nurodytą metodiką (68). PGR naudotos oligonukleotidų pradmenų sekos buvo pasirinktos iš labai konservatyvaus 3‘-netransliuojamo FCoV genomo regiono.
1 lent. AT lizdinėje PGR naudoti oligonukleotidų pradmenys
Pradmuo Seka (5‘ 3‘) Pozicija nukleotide P204 GCTCTTCCATTGTTGGCTCGTC 205-184
P205 GGCAACCCGATGTTTAAAACTG 1-23 P211 CACTAGATCCAGACGTTAGCTC 213-192 P276 CCGAGGAATTACTGGTCATCGCG 25-51
Pirmiausia, vieno mėgintuvėlio lizdinėje AT-PGR buvo paruošti reagentai antrajam PGR etapui. Sumaišytas reakcijos mišinys, kuriame buvo:
1. 5 μl 22 proc. trechalozės (Sigma);
2. 20 pmol/μl kiekvieno iš vidinių nukleotidų pradmenų P276 ir P204; 3. 1 μl dNTPs mišinio (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 10 mM tirpalo; 4. 0,25 μl Taq DNA polimerazės (1,25 U).
Šio PGR mišinio buvo išpilstyta po 8,25 μl į skirtingus 0,2 ml Eppendorf mėgintuvėlio dangtelius ir palikta 2val. kambario temperatūroje išdžiūti. Kitame etape naudojome tuos pačius 0,2 ml Eppendorf mėgintuvėlius, kurių kamšteliuose pirmojo reagentų paruošimo metu buvo trechalozėje išdžiovinti lizdinės PGR komponentai. Atvirkštinė transkripcija (AT) ir PGR-I buvo atlikta šių mėgintuvėlių dugne. Amplifikacijai buvo naudojamas 50 μl mišinys:
1. 5 μl išskirtos RNR;
2. 5 μl 10xPGR buferio (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva); 3. 5μl MgCl2 (25 mM, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva); 4. 2 μl dNTPs (10 mM, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva); 5. Po 0,25 μl (po 5 pmol) išorinių pradmenų P205 ir P211;
6. 1μl 10% tritonX-100 (Sigma);
7. 0,5 μl (2,5 U) Taq - DNR polimerazės (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva); 8. 0,25 μl (10 U) RNAnasin (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva);
9. 0,5 μl (100U) M-MLV atvirkštinės transkriptazės (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics" Lietuva);
AT-PGR mišinio, esančio mėgintuvėlio dugne, atskyrimui nuo lizdinės PGR komponentų mėgintuvėlio kamštelyje buvo sulašinta 1-2 lašai skaidraus mineralinio aliejaus (Sigma). Vieno mėgintuvėlio AT lizdinė PGR buvo atliekama amplifikatoriuje 3Prime® (Bibby Scientific Ltd). Į mėgintuvėlius sulašintas paruoštas PGR mišinys ant kurio viršaus užlašinta 1-2 lašai lengvo skaidraus mineralinio aliejaus. Mišinys patalpintas į termociklerį. Temperatūros cikliškumo eiga šiai reakcijai atlikti susidėjo iš: reakcijos mišinio pašildymo 5min. 90 °C temperatūroje ir vėliau sekančių 40 pasikartojančių ciklų (po 50 sekundžių cDNR denatūracijos 94 °C temperatūroje, 1 minutės pradmenų
kaitinimo 55 °C temperatūroje bei 1 min. pradmenų cDNR elongacijaos (prailginimo) 72 °C temperatūroje). Pasibaigus pirmajam amplifikacijos etapui mėgintuvėliai buvo pakaitinti 65 °C 1 min., apversti ir laikyti 1 min., siekiant sumaišyti ir ištirpinti lizdinės PGR komponentus mėgintuvėlio dangtelyje su PGR I produktais, esančiais dugne. Po to mėgintuvėliai buvo trumpai nucentrifuguojami ir atliekama lizdinė PGR naudojant 35 amplifikavimo ciklus: 94 °C 50 sekundžių denatūracijos, 55 °C 1 min. pradmenų hibridinimo, 72 °C 1 min. prailginimo.
Rezultatų vertinimas:
AT-PGR amplifikacijos produktai buvo analizuojami 2 % agarozės gelyje (Top VisionTM GQ Agarose, UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), dažytame etidžio bromidu (koncentracija 1 μg/ml.). Po 10 µl AT-PGR amplifikacijos produkto buvo išpilstyta į agarozės gelio duobutes ir atliekama elektroforezė 1xTBE (90mM Tris, 90mM boro rūgšties, 2 mM EDTA) tirpale, leidžiant 100 V srove 45 min. PGR rezultatai buvo vertinami apšviečiant agarozės gelį UV spinduliais. Koronaviruso atžvilgiu teigiamais laikyti mėginiai, kurių amplifikavimo metu susidaręs produktas buvo 177 bp. Susidariusio produkto kiekis buvo įvertintas esant specifiniam DNR juostelių švytėjimui molekulinio žymeklio, GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus (UAB "Thermo Fisher Scientific Baltics", Lietuva), 177 bp atitinkančioje pozicijoje.
2.3 Statistinė duomenų analizė
Šiame darbe gauti tyrimų duomenys apdoroti naudojant Microsoft Excel bei R statistikos programinį paketą. Serologinio tyrimo metu gautus grupių titro vidurkius palyginti ir patikimumui nustatyti naudotas Welch’o t-testas. PGR tyrimo metu gauti kategoriniai kintamieji skirtingose grupėse lyginti naudojant chi-kvadrato testą. Duomenys, kurių p<0,05 laikyti statistiškai patikimais, o gavus p>0,05 duomenys laikyti statistiškai nepatikimais ir nereikšmingais.
3 TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Serologinio tyrimo rezultatai
Iš viso išanalizuoti 100 kačių kraujo serumo mėginių tyrimo rezultatai. Nustatyta, jog didžioji tirtų mėginių dalis (64 %) turėjo specifinių antikūnų prieš FCoV.
8 pav. Teigiamų ir neigiamų mėginių pasiskirstymas remiantis FCoV ak IFA tyrimų rezultatais;
Iš serologiškai teigiamų FCoV atžvilgiu kačių mėginių 14 (21,8 %) sudarė kliniškai sveiki gyvūnai ir 50 (78,2%) sergantys. Dažniausiai kliniškai sveikų katinų grupėje mėginiuose nustatytas buvo didžiausias tiriamas titras (1:270), jis buvo būdingas 50,0% imties. Sergančių gyvūnų grupėje dažniausias nustatytas titras buvo mažiausias tiriamas titras (1:30), jis buvo nustatytas 54,0% gyvūnų.
Kliniškai sveikų gyvūnų grupėje buvo nustatytas 4,24±0,94 log3 antikūnų prieš FCoV titro vidurkis, o sergančiųjų grupės vidurkis buvo (3,72±0,75 log3). Šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
10 pav. Antikūnų prieš FCoV titro vidurkiai (log3) kliniškai sveikų ir sergančių kačių grupėse;
Iš 64% tirtų serologiškai teigiamų FCoV atžvilgiu kačių mėginių 17 (27%) sudarė veislinės ir 47 (73%) neveislinės katės. Veislinių kačių populiacijoje (52,9% ) mėginių nustatytas didžiausias antikūnų titras (1:270), neveislinių kačių 59,6% mėginiuose buvo mažiausias vertinamas titras (1:30).
Veislinių kačių grupės FCoV ak titro vidurkis buvo didesnis (4,39±0,72 log3) nei neveislinių kačių (3,63±0.85 log3) ir šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05).
12 pav. FCoV ak titro vidurkiai (log3) veislinėje ir neveislinėje kačių populiacijos grupėse;
Iš 64% tirtų serologiškai teigiamų FCoV atžvilgiu kačių mėginių 20 gyvūnų (31,3 %) sudarė patinai ir 44 (68,7%) patelės. Dažniausias patinų grupėje mėginiuose nustatytas buvo mažiausias tiriamas titras (1:30), jis buvo būdingas 54,7% imties. Patelių grupėje dažniausias nustatytas titras sutapo su patinų grupės rezultatais (1:30), jis buvo nustatytas 47,5% patelių.
Patinų grupės FCoV ak titro vidurkis buvo 3,77±0,81 log3, o patelių grupėje nustatytas 3,88±0,83 log3 vidurkis. Skirtumas tarp šių dviejų grupių nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
14 pav. Antikūnų prieš FCoV titro vidurkiai (log3) patinų ir patelių populiacijos grupėje;
Serologiškai teigiamoje FCoV populiacijoje mažesnioji dalis– 14 individų (21,9%) buvo imunizuotos pagrindiniais skiepais, o didesnioji dalis- 50 kačių (78,1%) nebuvo. Nevakcinuotų kačių grupėje dažniausiai nustatytas (38,7%) buvo mažiausias titras (1:30), šiek tiek mažiau (35,5%) mėginių buvo nustatytas didžiausias tiriamas titras (1:270). Vakcinuotų kačių grupėje didžiausioje mėginių dalyje (60,6%) buvo nustatytas mažiausias tiriamas titras (1:30).
15 pav. Procentinis vakcinuotų ir nevakcinuotų kačių grupių mėginių pasiskirstymas pagal FCoV ak titrus;
Nevakcinuotų kačių specifinių FCoV ak titrų vidurkis buvo 4,07±0,72 log3 ir jis buvo didesnis už vakcinuotų kačių grupės vidurkį – 3,62±0,85 log3. Skirtumas tarp šių dviejų grupių buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05).
16 pav. Antikūnų prieš FCoV titro vidurkiai (log3) vakcinuotų ir nevakcinuotų kačių grupėse;
Serologiškai FCoV teigiamų mėginių didžioji dalis priklausė veislyno ar prieglaudos kačių populiacijai (73,4%), o likusioji (26,6%) buvo naminių kačių. Naminių kačių teigiamuose mėginiuose daugiausia buvo nustatytas mažiausias titras (1:30), o prieglaudos/veislyno populiacijoje vienodas mėginių procentas (42,3%) turėjo tiek didžiausią (1:270), tiek mažiausią (1:30) titrus.
17 pav. Procentinis naminės populiacijos ir prieglaudos/veislyno populiacijos kačių grupių mėginių pasiskirstymas pagal FCoV ak titrus;
Kačių iš prieglaudos/veislyno populiacijos FCoV ak titro vidurkis (4,1±0,71 log3) buvo didesnis už naminių kačių populiacijos titro vidurkį (3,65±0,68 log3) ir šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05).
18 pav. Antikūnų prieš FCoV titro vidurkiai (log3) prieglaudos/veislyno ir naminių kačių populiacijose;
Iš serologiškai teigiamų FCoV atžvilgiu kačių mėginių 38 (59,4%) sudarė jaunikliai (iki 1 metų amžiaus) ir 26 (40,6 %) suaugusios katės (virš 1 metų amžiaus). Daugiausia jauniklių grupės mėginiuose nustatytas mažiausias tiriamas titras (1:30), jis buvo būdingas 42,9% imties. Suaugusių kačių grupėje dažniausias nustatytas titras sutapo su jauniklių grupės rezultatais (1:30), jis buvo nustatytas 53,5% tirtų mėginių.
Jauniklių kačių (iki 1metų amžiaus) grupėje buvo nustatytas 4,0±0,89 log3 antikūnų prieš FCoV titro vidurkis, o suaugusių kačių (virš 1 metų) grupėje 3,75±0,78 log3 vidurkis, tačiau šis skirtumas buvo statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
20 pav. Antikūnų prieš FCoV titro vidurkiai (log3) jauniklių ir suaugusių kačių grupėse;
3.2 PGR tyrimo rezultatai
Iš viso ištirti 48 kačių išmatų mėginiai, iš kurių 17 (35,4 %) buvo teigiami kačių koronaviruso atžvilgiu.
Kliniškai sveikų gyvūnų grupėje iš viso buvo tirti 8 mėginiai, iš kurių 2 (25,0%) buvo teigiami kačių koronaviruso atžvilgiu. Sergančių gyvūnų grupę sudarė 40 klinikiniais ligos, būdingos FCoV infekcijai, požymiais pasižymėjusių gyvūnų. Šioje grupėje rasta 15 teigiamų mėginių (38,0%). Skirtumas tarp šių grupių nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
22 pav. PGR tyrimo rezultatai kliniškai sveikų bei sergančių gyvūnų grupėse;
Iš 24 tirtų patelių išmatų mėginių- 11 (46,0 %) buvo teigiami FCoV atžvilgiu. Patinų grupėje rasta 5 teigiamais mėginiais mažiau- iš 24 tirtų šios grupės mėginių, 6 mėginiuose (25,0%) buvo aptiktas kačių koronavirusas. Šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
Iš 15 iki vienerių metų amžiaus grupėje buvusių tirtų gyvūnų - 9 (60,0%) buvo užsikrėtę koronavirusu. Vyresnių nei vienerių metų amžiaus gyvūnų grupėje iš viso buvo tirti 33 mėginiai, iš kurių didžioji dalis buvo neigiamų, o teigiamų užfiksuota 24,0 % (8 mėginiai). Skirtumas tarp šių grupių buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05).
24 pav. PGR tyrimo rezultatai skirtingose amžiaus grupėse;
Iš 30 kačių mėginių, priklaususių prieglaudoje gyvenančių kačių populiacijai- 11 (37%) buvo teigiami FCoV atžvilgiu. Iš naminių kačių grupėje tirtų 18 gyvūnų- 6 (33%) buvo užsikrėtę koronavirusu. Šis skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05).
3.3 Serologinio tyrimo ir PGR tyrimo rezultatų palyginimas
Kliniškai sveikų gyvūnų grupėje IFA metodu nustatyta ženkliai mažesnė teigiamų mėginių dalis (48,2%) nei sergančių gyvūnų grupėje (70,4%) ir šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas. PGR metodu tirtuose mėginiuose, kliniškai sveikų gyvūnų grupėje rasta užsikrėtusi virusu gyvūnų dalis buvo 25,0%, o sergančių gyvūnų grupėje rasta teigiamų mėginių dalis 37,5%, tačiau šis skirtumas buvo statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
Kačių iki 1 m. amžiaus grupėje IFA metodu nustatyta teigiamų mėginių dalis buvo 59,4%, o vyresnių kačių (virš vienerių metų) amžiaus grupėje nustatyta serologiškai teigiamų mėginių dalis - 72,2%, tačiau šis skirtumas vyresnių gyvūnų grupėje buvo statistiškai nereikšmingas (p>0,05). Tuo tarpu PGR metodu nustatyta statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnė teigiamų mėginių dalis jaunesnių gyvūnų grupėje iki 1 m. amžiaus (60%), už vyresnių nei 1 metų amžiaus grupėje nustatytą užsikrėtusią gyvūnų dalį (24,2%).
2 lent. Serologinio tyrimo ir PGR tyrimo metu gauta teigiamų rezultatų dalis skirtingose kačių grupėse;
Patelių grupėje IFA metodu nustatyta teigiamų mėginių dalis siekė 68,9%, o patinų grupėje šis procentas buvo 57,1% ir šis skirtumas buvo statistiškai nepatikimas (p>0,05). PGR tyrimo metu patelių grupėje nustatyta teigiamų mėginių dalis buvo 45,8%, o patinų grupėje nustatyta užsikrėtusių gyvūnų
Veiksnys Kačių grupė
Serologinis tyrimas PGR tyrimas
Teigiamų mėginių skaičius ir dalis procentais
n % p n % p
Klinikinė būklė Kliniškai sveiki 14 48,2 <0,05
2 25,0
>0,05
Sergantys 50 70,4 15 37,5
Amžius Iki 1m. amžiaus 38 59,4 >0,05
9 60,0 <0,05 Virš 1m. amžiaus 26 72,2 8 24,2 Lytis Patelės 40 68,9 >0,05 11 45,8 >0,05 Patinai 24 57,1 6 25,0 Populiacija Naminė 26 45,6 <0,05 6 33,3 >0,05 Prieglaudos/veislyno 38 88,4 11 36,7
dalis- 25,0% ir šis skirtumas patelių grupėje taip pat nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05). Naminės populiacijos kačių grupėje IFA metodu nustatyta serologiškai teigiamų gyvūnų dalis (45,6%) buvo ženkliai mažesnė nei tankiose gyvūnų populiacijose (prieglaudose/veislynuose) gyvenančių kačių teigiamų mėginių dalis (88,4%). Šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). PGR metodu teigiamų mėginių dalis nustatyta tankiose populiacijose gyvenančių kačių grupėje buvo 36,7%, o pavienių namie gyvenančių kačių grupėje 33,3%, tačiau šis skirtumas buvo nežymus ir statistiškai nereikšmingas (p>0,05).
3.4 Sergančių gyvūnų klinikinių požymių analizė
Išanalizuoti dažniausiai, IFA bei PGR metodu gautų teigiamų mėginių, katėms pasireiškę klinikiniai požymiai. Dažniausias klinikinis požymis tiek PGR, tiek IFA metodu tirtiems gyvūnams buvo viduriavimas. Šiuo simptomu pasižymėjo 29,2% visų teigiamų, sergančių gyvūnų. Iš visų tirtų sergančių gyvūnų 27,4% vėmė. Susikaupusių skysčių pilvo ertmėje turėjo 14,6% gyvūnų bei tokia pati dalis sergančių kačių pasižymėjo aukšta, nepraeinančia kūno temperatūra. Akių pažeidimai, čiaudėjimas ar gelta pasitaikė pavieniams gyvūnams ir reikšmingos sergančių gyvūnų dalies nesudarė.
26 pav. Dažniausiai pasireiškę klinikiniai požymiai IFA ir PGR metodu nustatytiems teigiamiems gyvūnams; 0.9% 8.8% 18.6% 6.2% 0.9% 13.3% 20.4% 5.3% 10.6% 4.4% 0.9% 0.9% 7.1% 2.7% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% Čiaudėjimas Aukšta temperatūra Viduriavimas Apatiškumas Gelta Skysčiai pilvo ertmėje Vėmimas Akių pažeidimai
4 REZULTATŲ APTARIMAS
Nepaisant to, kad gyvūnų laikytojai darosi sąmoningesni bei daugėja žinių apie galimas profilaktikos priemones- užsikrėtimas kačių koronavirusu vis dar yra viena iš dažniausių kačių virusinių susirgimo priežasčių (69). Kačių koronavirusas plačiai paplitęs įvairiose kačių populiacijose, ypatingai tankiose gyvūnų laikymo vietose (70). Mutavęs kačių koronavirusas į patogeninį biotipą FIPV, sukelia mirtiną kačių susirgimo formą- kačių infekcinį peritonitą (FIP) bei pasižymi pakitusiu imuniniu atsaku, pasireiškiančiu įvairiais sisteminiais sutrikimais organizme (71). Šiuo metu nėra patvirtintų efektyvių gydymo schemų šia forma susirgusiems gyvūnams išgelbėti ir didžioji dalis užsikrėtusių gyvūnų yra eutanazuojami arba nugaišta nepriklausomai nuo to kokį gydymą gavo (32). Taip pat nėra efektyvios, veikiančios prieš viruso mutavusią formą, vakcinos, kuri būtų rekomenduojama gydytojų asociacijų ir galėtų užkirsti kelią ligos pasireiškimui (66,67). Pasak šaltinių, FIPV kaip mutantas dauginasi 5 proc. visų koronavirusais užsikrėtusių kačių. Tyrimai atskleidė, kad kačių infekcinis peritonitas yra viena svarbiausių jaunų kačių mirčių priežasčių, lemiančių apie 10 procentų seroteigiamų kačiukų mirtį pirmaisiais jų gyvenimo metais (4). Iki šiol, tikslios mutacijos priežastys yra neišsiaiškintos, todėl kiekvienas gyvūnas užsikrėtęs kačių koronavirusu turi tikimybę susirgti šia mirtina ligos forma (72). Yra duomenų, jog susirgimas dažniau užfiksuojamas katėms iki dviejų metų amžiaus, gyvenančioms tankiose, daug kačių turinčiose populiacijose, bei veislinėms katėms (73). Kačių veislynai ir prieglaudos yra pagrindinės vietos, kur nustatomas antikūnų prieš FCoV ir paties viruso buvimas yra pats dažniausias (62).
Vienintelis Lietuvoje atliktas su kačių koronavirusu susijęs tyrimas analizavo FCoV antikūnų aptikimą kliniškai sveikų ir sergančių kačių populiacijose. Šiame tyrime užfiksuotas 100% antikūnų prieš FCoV buvimas klinikinius požymius turėjusiose gyvūnų grupėse (6). Šiame darbe atlikto tyrimo metu nustatyta, jog sergančių gyvūnų grupėje seroteigiami mėginiai sudarė 70,4%. Kliniškai sveikų gyvūnų grupėje minėtame Kumpikevičienės tyrime nustatyta serologiškai teigiamų gyvūnų dalis buvo 14,3%, o šiame darbe atlikto tyrimo metu rastas ženkliai didesnis teigiamų gyvūnų procentas- 48,2%. PGR tyrimo metu nustatyta tokia pati tendencija- kliniškai sveikų gyvūnų grupėje rasta mažesnė dalis neigiamų rezultatų (25%), lyginant su sergančių gyvūnų grupe (38%). Vis tik, analizuojant antikūnų prieš FCoV titro vidurkius kliniškai sveikų gyvūnų grupėje nustatytas statistiškai nereikšmingai didesnis vidurkis (4,24) už sergančių gyvūnų grupėje nustatytą vidurkį (3,72). Literatūroje aprašoma, jog sveikos katės, nepasižyminčios jokiais klinikiniais požymiais- dažnai yra sveikos, nuolatinės viruso nešiotojos ir yra nenutrūkstantis FCoV infekcijos šaltinis (34), todėl net ir kliniškai sveikose kačių grupėse neretai galime aptikti seroteigiamų kačių bei viruso nešiotojų.
IFA tyrimo metu nustatyta, jog veislinių kačių grupėje yra statistiškai reikšmingai didesnis (4,39 log3) antikūnų prieš FCoV titro vidurkis lyginant su neveislinių kačių grupe (3,63 log3). Serologinio tyrimo metu Didžiojoje Britanijoje nustatytas teigiamų mėginių kiekis veislinių kačių grupėje taip pat buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei mišrūnių kačių (74). Australijoje atlikto tyrimo metu pastebėta tokia pati tendencija, jog specifinės veislės pasižymėjo aukštesniais FCoV ak titrais nei neveislinės katės. Šiame tyrime padaryta prielaida, jog imlumas FCoV infekcijai galimai yra susijęs su tam tikrų veislių kačių genetiškai nulemtu netipiniu imuniniu atsaku prieš šį sukelėją (59).
Patelių grupėje nustatyta seroteigiamų mėginių dalis (68,9%) buvo nežymiai didesnė už patinų grupės teigiamų mėginių dalį (57,1%), tačiau procentinė dalis ir titro vidurkis tarp šių grupių nebuvo statistiškai reikšmingai skirtingas. Panašūs rezultatai gauti ir kitų mokslininkų serologiniuose tyrimuose, kur lytis, kaip galimas rizikos veiksnys buvo patvirtintas kaip nereikšmingas (74). PGR tyrimo metu patelių grupėje nustatyta teigiamų mėginių dalis (45,8%) taip pat buvo didesnė už patinų grupėje nustatytą užsikrėtusių gyvūnų dalį (25%) ir šis skirtumas patelių grupėje taip pat nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05). Malaizijoje mokslininkų atlikto PGR tyrimo metu gauti rezultatai tarp skirtingų lyčių taip pat nebuvo statistiškai reikšmingi (75).
Kačių iki 1m. amžiaus grupėje IFA metodu nustatyta teigiamų mėginių dalis (59,4%), buvo mažesnė už vyresnių kačių (virš vienerių metų) amžiaus grupėje nustatytą serologiškai teigiamų mėginių dalį (72,2%), tačiau šis skirtumas vyresnių gyvūnų grupėje buvo statistiškai nereikšmingas (p>0,05). PGR metodu nustatyta statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnė dalis teigiamų mėginių jaunesnių gyvūnų grupėje iki 1 m. amžiaus (60,0%), už vyresnių nei 1 metų amžiaus grupėje nustatytą užsikrėtusią gyvūnų dalį (24,2%). Didžiojoje Britanijoje atlikto serologinio tyrimo metu nebuvo nustatyto reikšmingo skirtumo tarp amžiaus grupių (74). Pederseno atlikto PGR tyrimo metu statistiškai reikšmingai didesnė dalis turėjo didesnį užsikrėtusių gyvūnų skaičių jaunų kačiukų nei vyresnių kačių grupėje (76). Naminės populiacijos kačių grupėje IFA metodu nustatyta serologiškai teigiamų gyvūnų dalis (45,6%) buvo ženkliai mažesnė nei tankiose gyvūnų populiacijose (prieglaudose/veislynuose) gyvenančių kačių teigiamų mėginių dalis (88,4%). Šis skirtumas buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). Lyginant su Hartmano tyrimu gautas toks pats rezultatas: tankiose populiacijose (pavyzdžiui, veislynuose) nustatyta, jog iki 90% kačių gali turėti antikūnus prieš FCoV, lyginant su naminėmis katėmis gyvenančiomis po vieną, kur seroteigiamų mėginių nustatoma iki 50% (32). PGR metodu taip pat didesnė teigiamų mėginių dalis buvo nustatyta tankiose populiacijose gyvenančių kačių grupėje (36,7%), nei pavienių namie gyvenančių kačių grupėje (33,3%), tačiau šis skirtumas buvo nežymus ir statistiškai nereikšmingas (p>0,05). Statistiškai reikšmingas kačių populiacijos tankumo faktorius užsikrėtimui FCoV nustatytas ir Malaizijoje atlikto tyrimo metu (75).
