LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
Arūnas Jankauskas
SMILTYNINIŲ ŠLAMUČIŲ (Helichrysum arenarium L.)
AUGALŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Raimondas Benetis
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė
prof. dr. Ramunė Morkūnienė, parašas,
Data
SMILTYNINIŲ ŠLAMUČIŲ (Helichrysum arenarium L.)
AUGALŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
doc. Dr. Raimondas Benetis,
parašas
Data
Darbą atliko magistrantas
Arūnas Jankauskas,
parašas
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Smiltyninio šlamučio (H. arenarium L.) bendroji charakteristika ... 13
1.2. Oksidacinis stresas ir laisvieji radikalai ... 15
1.2.1. Aktyvių deguonies formų klasifikavimas ... 16
1.2.2. Biologinių medžiagų oksidacija ... 17
1.3. Antioksidantai ... 18
1.4. Fenoliniai junginiai ... 19
1.4.1. Fenolinių junginių klasifikacija ... 20
1.4.2. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės ... 21
1.4.3. Fenolinų junginių ekstrahavimas iš augalinės žaliavos ir antioksidacinio aktyvumo nustatymų metodai in vitro...21
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 25
2.1. Tyrimų objektas ... 25
2.2. Medžiagos ir reagentai ... 26
2.3. Naudota aparatūra ... 26
2.4. Tyrimų metodai ... 26
2.4.1. Smiltyninių šlamučių žaliavų ekstraktų paruošimas ... 26
2.4.2. Reagentų paruošimas ... 27
2.5. Smiltyninių šlamučių (H. arenarium) ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 28
2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 28
2.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas ... 29
2.5.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas ... 30
2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant spektrofotometrinį Fe2+ jonų sujungimo metodą ... 30
2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį DPPH radikalų surišimo metodą 31 2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant ABTS·+ surišimo metodą ... 31
2.5.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 33
4
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34
3.1. Optimalių salygų ekstrakcijai parinkimas ... 34
3.1.1. Ekstrahento poliškumo nustatymas ... 34
3.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės nustatymas ... 35
3.1.3. Temperatūros nustatymas ekstakcijoje ultragarsu ... 36
3.2. Bendrasis fenolinių junginių kiekio nustatymas H. arenarium žaliavose ... 37
3.3. Bendrasis fenolio rūgščių kiekio nustatymas H. arenarium žaliavose ... 39
3.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas H. arenarium žaliavose ... 40
3.5. H. arenarium augalinių žaliavų ekstraktų chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų sujungimo metodu ... 42
3.6. H. arenarium ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH surišimo metodu ... 44
3.7. H. arenarium augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymas taikant ABTS metodą ... 46
3.8. H. arenarium augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymas taikant FRAP metodą ... 48
3.9. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro flavonoidų, fenolio rūgščių ir fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo H. arenarium žaliavose ... 50
4. IŠVADOS ... 52
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 53
5
SANTRAUKA
Arūno Jankausko magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.
Smiltyninių šlamučių (Helichrysum arenarium L.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.
Tikslas - ištirti iš skirtingų Lietuvos regionų surinktų, natūraliai augančių smiltyninių šlamučių (Helichrysum arenarium L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai. 1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš smiltyninio šlamučio (H. arenarium) žaliavų. 2. DPPH ir ABTS metodais įvertinti smiltyninių šlamučių (H. arenarium) ekstraktų antiradikalinį aktyvumą. 3. Įvertinti smiltyninių šlamučių (H. arenarium) chelatines ir redukcines savybes, taikant dvivalentės geležies jonų sujungimo ir FRAP metodus. 4. Ištirti iš skirtingų cenopopuliacijų surinktų smiltyninių šlamučių (H. arenarium) žiedų, stiebų, lapų flavonoidų, fenolio rūgščių ir fenolinių junginių kiekį ir įvertinti jų rodmenų kitimus. 5. Įvertinti koreliaciją tarp H. arenarium augalinių žaliavų bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
Tyrimo metodika. Tyrimui atlikti buvo naudojamos natūraliai augančių smiltyninių šlamučių (Helichrysum arenarium L.) augalinės žaliavos (žiedai, lapai, stiebai), kurios buvo surinktos iš 17 skirtingų Lietuvos teritorijoje esančių augaviečių masinio žydėjimo laikotarpiu. Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu. Naudojamas 80% (V/V) etanolio ir vandens mišinys, ekstrakcijos laikas 10 min, ekstrakcijos temperatūra – 60 oC. Bendrajam fenolinių junginių kiekybiniam nustatymui naudotas
spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentais (GRE) (mg/g). Bendras flavonoidų kiekis nustatomas vykdant reakciją su AlCl3, rezultatai išreikšti rutino
ekvivalentais (RE) (mg/g). Bendram fenolinių rūgščių kiekybiniam nustatymui naudotas Arnow reagentas. Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudojami spektrofotometriniai DPPH, FIC, ABTS ir FRAP metodai.
Rezultatai ir išvados. Atlikus tyrimus, nustatyta, kad fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekiai varijavo priklausomai nuo augalo morfologinės dalies. Didžiausi kiekiai šių medžiagų aptikti H. arenarium žiedų žaliavose (vidutiniškai 27,957 ± 2,013 mg/g; 58,34 ± 2,31 mg/g; 36,662 mg/g), o mažiausi - stiebuose (12,11 mg/g; 18,506 mg/g; 7,75 mg/g). In vitro modelinėse sistemose nustatyta, kad H. arenarium ekstraktai pasižymi antiradikaliniu aktyvumu. Didžiausias
6
aktyvumas nustatytas H. arenarium žiedų žaliavose (vidutiniškai DPPH surišimas – 64,288 %; ABTS – 66,992 µmol/l; FRAP – 42,399 µmol/l). Atliekant chelatų surišimo metodą (FIC), reikšmingi rezultatai gauti H. arenarium žiedų žaliavose, žaliava vidutiniškai radikalus suriša - 69,232 %.
7
SUMMARY
Arūnas Jankauskas master`s thesis. Scientific supervisor: doc. dr. Raimondas Benetis; Lithuanian University of health sciences, faculty of pharmacy, Department of drug chemistry. – Kaunas.
The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of sand everlasting (Helichrysum arenarium L.) plants.
The aim: To examine overall quantity of phenolic compounds and ammount of flavonoids as well as antioxidant activity found in sand everlast‘s (Helichrysum arenarium L.) raw materials (leafs, stems and petals), that are found naturaly growing in different regions of Lithuania.
Tasks: 1. Prepare optimal conditions for extraction from the biomass of drwarf everlast (Helichrysum arenarium L.) 2. Evaluate antiradical activity of extracts from sand everlast (Helichrysum arenarium L.) using DPPH and ABTS methods. 3. Evaluate sand everlast‘s
(Helichrysum arenarium L.) chelating and reducing properties by applying divalent iron ion coupling.
4. Analyse the ammount and fluctuation of flavonoid, phenolic acids phenolic compounds in sand everlast‘s (Helichrysum arenarium L.) petals, stems and leafs, that are gathered from different cenopopulations. 5. Evaluate the sand everlat‘s(Helichrysum arenarium L.) antidioxin activity correlation between general ammount of phenolic compounds, acids and flavanoid compounds of the biomass and the extracts.
Metodology of investigation:. Research was done by using biomass(leaves, petals and stems) of sand everlast (Helichrysum arenarium L.) gathered from it‘s natural growing sites in 17 different regions in Lithuania, during flowering period. Method of extraction – extraction by ultrasound. Used 80% (V/V) ethanol, duration of extraction – 10 minutes, temperature of extraction - 60 oC. Spectrophotometric method of Folin-Ciocalteu was used to sum up the overall amount of phenolic coumpounds, results are expressed in galic acid equivalent‘s (GE) (mg/g). Overall ammount of flavonoids is measured by performing reaction with AlCl3, results are registered in Rutin equivalents.
Arnow reagent was used to measure overall ammount of phenolic acids. DPPH, FIC, ABTS ir FRAP spectrophotometric methods were used to evaluate the antidioxin activity.
Results and conclusions: After the research, results were established, that ammounts of phenolic compounds, phenolic acids and flavonoids fluctuated depending on morphological part of the plant. Bigest ammounts of these substances were found in H. arenarium biomass of the petals (average 27,957±2,013 mg/g; 58,34±2,31 mg/g ; 36,662 mg/g), smallest - in the stems (12,11 mg/g; 18,506
8
mg/g; 7,75 mg/g). In vitro modular systems, it‘s established, that H. arenarium extracts are characterized by antiradical activity. Highest activity is measured in biomass of H. arenarium petals averaged (DPPH connection – 64,288%; ABTS – 66,992 µmol/l; FRAP – 42,399 µmol/l). Performing chelat connection method(FIC), important results were found in biomass of H. Arenarium petals, biomass radical connection – 69,232%
9
SANTRUMPOS
FRAP – geležies jonų redukcijos antioksidacinės galios tyrimas (angl. „Ferric reducing antioxidant
power”)
RAR – Reaktyviosios azoto rūšys V/V – Tūrio procentai
FIC – Geležies (II) jonų sujungimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay) DPPH – 2,2-difenil-1-pikrikhidrazilo laisvasis radikalas
ABTS – 2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. GRE – galo rūgšties ekvivalentai
TE – trolokso ekvivalentai DNR – deoksiribonukleorūgštis
BAM – biologiškai aktyvios medžiagos RDF – Reaktyviosios deguonies formos VAŽ – Vaistinė augalinė žaliava
10
ĮVADAS
Oksidacinis stresas – tai procesas, kurio metu dėl nepalankių aplinkos sąlygų arba dėl tam tikrų ląstelių funkcijų disbalanso organizme gali susidaryti aktyvios deguonies arba azoto formos, pasižyminčios stipriu oksidaciniu poveikiu. Kai biologinėje sistemoje susidaro didelis kiekis laisvųjų radikalų, jie sąlygoja oksidacinio streso išsivystymą. Moksliškai yra įrodyta, kad tai turi reikšmingą įtaką daugelio lėtinių ir ūminių ligų išsivystymui. [1,2,3]
Laisvieji radikalai – tai aktyvios dalelės, kurios organizme veikia agresyviai prieš kitas molekules ir ląsteles, sukeldamos jų struktūrų pakitimus ar pažeidimus. Tokioms dalelėms būdingas ypatingai stiprus cheminis reaktyvumas ir nestabilumas, jos gali prisijungti arba atiduoti laisvą elektronų porą. [4] Tam, kad ląstelės būtų apsaugotos nuo oksidacinės pažaidos, yra naudojami antioksidantai. [3]
Antioksidantai – tai medžiagos, kurios mažina oksidacinį pažeidimą biologinėse sistemose. Organizme veikiant antioksidacinei sistemai, ląstelės apsaugomos nuo laisvųjų radikalų poveikio, o tai labai svarbu tam tikrų ligų prevencijai ir senėjimo procesams stabdyti. [5,6,3] Viena svarbiausių antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių grupių – polifenoliniai junginiai, kurių aptinkama apie 8000. Jie sintezuojami augalinėse ląstelėse kaip antriniai metabolitai ir naudojami įvairioms funkcijoms, pvz. apsauginei ar dauginimosi. Kadangi žmogaus organizmas tokių antioksidantų nesintezuoja, jie yra gaunami iš įvairių augalinės kilmės maisto produktų.
Smiltyninis šlamutis (Helicrysum arenarium L.) – augalas priklausantis graižažiedžių (Asteraceae) šeimai, dažnai aptinkamas Lietuvoje, taip pat auga Europoje, Centrinėje Azijoje ir Kinijoje. Šio augalo žiedų žaliava (Helichrysi arenarii flos) yra aprašyta kai kurių Europos šalių farmakopėjose (Lenkijos, Rusijos). Smiltyninių šlamučių fitopreparatai vartojami esant įvairiems hepatobiliarinės sistemos pažeidimams. Vienkomponentės H. arenarium žiedų arbatos nuo seno yra vartojamos tulžies sekrecijos skatinimui, geltai, hepatitui ir cholecistitui gydyti. Be to, šio augalo žiedų žaliava įeina į daugiakomponenčių arbatų, skirtų virškinimo gerinimui, sudėtį. [7,8] H. arenarium žaliavose kaupiami dideli fenolinių junginių tokių kaip, flavonoidų, chalkonų, fenolio rūgščių, kumarinų ir pironų kiekiai. Dauguma mokslinių straipsnių patvirtina, kad būtent flavonoidai iš esmės yra atsakingi už šio augalo preparatų antibakterinį, priešuždegiminį ir spazmolitinį poveikius. Svarbu pažymėti, kad H. arenarium kai kuriose Europos šalyse (Belgijoje, Serbijoje) jis klasifikuojamas kaip nykstantis augalas. [9]
11
Šiuo metu Lietuvos Respublikos teritorijoje nėra draudžiama rinkti smiltyninių šlamučių žaliavą. Kadangi šis augalas nėra kultivuojamas ir natūraliai auga tik gamtinėse cenopopuliacijose, todėl Lietuvos vaistažolių produktų gamintojai naudoja Helichrysi arenarii flos žaliavą surinktą iš natūralių augaviečių Lietuvoje ir(ar) Ukrainoje. Dėl šios priežasties būtų tikslinga atlikti H. arenarium fenolinių junginių kiekybinės sudėties analizę ir ištirti skirtingose cenopopuliacijose augančių augalų ekstraktų antioksidacines savybes.
12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti iš skirtingų Lietuvos regionų surinktų, natūraliai augančių smiltyninių šlamučių (Helichrysum arenarium L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš smiltyninio šlamučio (H. arenarium) žaliavų. 2. DPPH ir ABTS metodais įvertinti smiltyninių šlamučių (H. arenarium) ekstraktų antiradikalinį
aktyvumą.
3. Įvertinti smiltyninių šlamučių (H. arenarium) chelatines ir redukcines savybes, taikant dvivalentės geležies jonų sujungimo ir FRAP metodus.
4. Ištirti iš skirtingų cenopopuliacijų surinktų smiltyninių šlamučių (H. arenarium) žiedų, stiebų, lapų flavonoidų, fenolio rūgščių ir fenolinių junginių kiekį ir įvertinti jų rodmenų kitimus. 5. Įvertinti koreliaciją tarp H. arenarium augalinių žaliavų bendro fenolinių junginių, flavonoidų
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Smiltyninio šlamučio (H. arenarium L.) bendroji charakteristika
Smiltyninis šlamutis (Helichrysium arenarium L.) – daugiametis, žolinis vaistinis augalas, priklausantis graižažiedžių (Asteraceae) šeimai. Augalas paprastai užauga nuo 15 iki 30 cm (retais atvejais iki 50 cm). Stiebas tiesus arba kylantis į viršų, lapuotas. Lapai pražanginiai; apatiniai lapai lancentiški, kotuoti, kiaušiniškai buki, o viduriniai ir viršutiniai bekočiai, smailūs. Visi lapai padengti sidabriniais pūkeliais, kurie apsaugo lapą nuo sausros. Žiedai smulkūs, rutuliškais graižais susitelkę į sudėtines skydiškos šluotelės pavidalo žiedynus, geltonos arba oranžinės spalvos, viršūnėje su auksinės spalvos liaukutėmis. Graižo pakraštyje žiedai siūliški, o viduryje vamzdiški, dar nepražydę atrodo sausi dėl plėvelinių skraistlapių, kuriems būdinga geltona spalva. Šakniastiebis storas, tamsiai rudos spalvos, sumedėjęs; šaknys gausios ir plonos. Vaisius pailgas lukštavaisis su skristuku, o pats augalas dauginasi sėklomis arba vegetatyviškai (1 pav.) [7,8,11]14
Augalas auga šlaituose, sausose smėlėtose vietovėse, smiltpievėse, kai kuriais atvejais aptinkamas sausų miškų aikštelėse, pamiškėse. Plačiai paplitęs visoje Lietuvos Respublikos teritorijoje, gana dažnas, dažniau aptinkamas pietų ir rytų Lietuvoje. Žydi birželio – rugsėjo mėnesiais, vaisius sunokina rugpjūčio-rugsėjo mėnesiais [7,8].
Smiltyninio šlamučio žaliavoje aptinkami dideli kiekiai flavonoidų ir kumarinų (iki 6,5 %), izochelichrizino (0,85 %), eterinio aliejaus (0,05 %), glikozidų, diterpeninio alkoholio, dažinių ir karčiųjų medžiagų, mineralinių medžiagų (1,3 %), askorbo rūgšties (1,6 mg), vitamino K, karotino (iki 16 mg), dervų ir rauginių medžiagų. [10]
Smiltyninio šlamučio žiedai (flores Helicrysi arenarii) – augalinė vaistinė žaliava, kuri renkama masinio žydėjimo laikotarpiu, birželio – rugpjūčio mėnesiais. Žiedynai pjaunami kartu su 1-2 cm ilgio žiedynkočiais. Žaliava džiovinama nuo tiesioginės saulės spindulių apsaugotoje vietoje, šiltoje sausoje aplinkoje, paskleidus plonu sluoksniu ant popieriaus. Išdžiūvusi vaistinė žaliava yra kartaus skonio, silpno kvapo, o graižai – intensyvios geltonos spalvos, blizgantys. Tinkamai (pagal esamus reikalavimus: sausoje, tamsioje vietoje) laikoma žaliava nesugenda 3 metus. Kai kuriais atvejais renkant ir fasuojant vaistinę augalinę žaliavą, gali išberti rankas; tokiu atveju patartina dėvėti apsaugines priemones – pirštines [7,8].
Smiltyninio šlamučio preparatai naudojami kaip antibakteriniai, priešuždegiminiai ir spazmolitiniai vaistai nuo geltos, hepatito, cholecistito, tulžies akmenligės. Preparatas naudojamas padidinti tulžies sekrecijai: mažindamas tulžies skysčių klampumą ir bilirubino koncentraciją kraujyje, jis pagerina ligonio būklę, sumažina arba visai pašalina virškinimo sutrikimus ir nemaloniai raižantį skausmą. Lėtiniu cholecistitu sergantiems ligoniams, pagerinus tulžies sekreciją ir atsiradus spazmolitiniam poveikiui, pamažu iš tulžies latako šalinasi smėlis ir smulkūs akmenukai. Liaudies medicinoje šlamučio nuovirai nuo senų laikų naudojami įvairių kepenų, šlapimo pūslės ir virškinamojo trakto ligų gydymui. Dėl savo spazmolitinio ir priešuždegiminio poveikio, šlamučio arbatos buvo naudojamos geltos, gastrito, moteriškų ligų, skrandžio ir virškinamojo trakto ligoms gydyti arba jų prevencijai, o dėl savo antibakterinio poveikio buvo vartojamos sergant plaučių tuberkulioze. Farmacijos pramonė iš šlamučio veikliųjų medžiagų gamina vaistinį preparatą, pavadinimu „Flaminum“, tabletuota forma cholecistitui ir hepatocholecistitui gydyti. Lietuvos rinkoje prekiaujama smiltyninio šlamučio žiedų arbata. Be to, ši augalinė žaliava dedama į arbatų, kurios pasižymi tulžį varančiu poveikiu, sudėtį. Nors preparatai mažai toksiški, tačiau nerekomenduojama preparato vartoti ilgiau nei 10 dienų, o pabaigus vieną vartojimo kursą rekomenduojama daryti pertrauką. Augalinė žaliava gali būti kontraindikuotina žmonėms, kurių kraujospūdis yra žemas, tad hipotenzija sergantiems žmonėms prieš vartojimą būtina pasitarti su gydytoju. Ši augalinė žaliava priskiriama prie tradicinio vaistinio preparato dėl jo ilgalaikio vartojimo ir per laiką surinktų indikacijų. [7].
15
Šis augalas naudojamas ir kitoms reikmėms. Dėl žieduose esančių dažinių medžiagų jis
naudojamas kaip dažas: audinius nudažo ryškiai geltona spalva, o audiniai ilgai išlaiko spalvą. Dėl šio augalo antibakterinių savybių jo nuoviruose buvo mirkomos sėklos prieš sėją tam, kad užaugę augalai mažiau sirgtų bakteriozėmis. Dėl išskirtinio smiltyninio šlamučio skleidžiamo kvapo preparato
eteriniai aliejai naudojami vabzdžiams kenkėjams atbaidyti [7,8]
1.2. Oksidacinis stresas ir laisvieji radikalai
Oksidacinis ląstelės stresas – tai antioksidacinės sistemos sutrikimas, kai, dėl nepalankių aplinkos sąlygų, sukeliamas nevaldomas aktyvios deguonies formos didėjimas ląstelės viduje. Aktyvios deguonies formos gali būti tiek žalingos, tiek ir naudingos organizmui. [1,48]
Laisvaisiais radikalais vadinamos bet kurios molekulės, kurios savo valentiniame sluoksnyje turi po vieną ar po kelis nesuporuotus elektronus išorinėje orbitalėje. Tokioms molekulėms būdingas ypatingai stiprus cheminis aktyvumas, o pačios molekulės yra nestabilios ir yra linkę prisijungti arba atiduoti laisvą elektronų porą.[4]
1956 metais D. Harmanas iškėlė hipotezę, kad fermentacijos metu, vykstant oksidacijos-redukcijos reakcijai, ląstelėse kaip šalutiniai produktai susidaro deguonies radikalai ir kitos aktyvių junginių formos. Jos yra vadinamos reaktyviosiomis deguonies formomis (RDF – reactive oxygen
species) ir yra žymiai aktyvesnės už molekulinį deguonį. RDF susidaro veikiant organizmą tiek
vidiniams, tiek išoriniams veiksniams. Mokslinėje literatūroje yra rašoma, kad daugiausia RDF šaltinių susidaro mitochondrijose dėl vykstančių biocheminių reakcijų. Šioje organelėje didžiausias deguonies kiekis yra redukuojamas į vandens molekulę, tačiau yra keli biocheminiai procesai, dėl kurių susidaro laisvieji radikalai. Iš viso suvartoto deguonies iki 4 % deguonies gali virsti superoksidu. Mitochondijose superoksidas yra lemiamas veiksnys, dėl kurio įvyksta apoptozė. Būtent mitochondrijos yra atsakingos už oksidacinio streso atsaką organizmui [12,48].
Literatūroje minima, kad organizme aktyvios deguonies formos yra ir naudingos organizmui. Vienos RDF susidarymas vyksta fagocitozės metu, kai makrofagai, neutrofilai ir monocitai naudoja NADPH-oksigenazinę fermentinę sistemą ir sugeba pasigaminti aktyvųjį O2·- radikalą, kuris kaip
ginklas veikia prieš mikroorganizmus. Vykstant šiai reakcijai, RDF dažniausiai pažeidžia tik fagolizosomos apsuptus mikroorganizmus. Lėtinio uždegimo metu (sergant tokiomis ligomis kaip reumatoidinis artritas, vilkligė) ar gavus traumą labai intensyviai susidaro O2·- radikalai. Be to,
žinduolių ląstelių paviršiuje yra NADH/NADPH oksidazės, kurios natūraliai palaiko tam tikrą O2·-
16
Oksidaciniais pažeidimais yra vadinami RDF sukelti biomolekulių pažeidimai. RDF sukelia patogenezė daugeliui ligų – kataraktai, uždegiminsės ir degeneracinės ligos, išemija, aterosklerozė, dėl padidėjusių mutacijų sukeltas vėžys ir organizmo senėjimas. Padidėjusį oksidacinį stresą sukelia ir kenksmingi aplinkos veiksniai: ultragarsas, radiacija, sunkieji metalai, traumos, didelis karštis, fizinio krūvio perteklius, tam tikrų medžiagų (tabako dūmų, oro taršos, herbicidų, vaistų) patekimas į organizmą. [1,22]
1.2.1.
Aktyvių deguonies formų klasifikavimas
Aktyvios deguonies formos apibūdina ne tik deguonies radikalus, bet ir neradikalinius deguonies darinius bei kartu su deguonimi esančius azoto junginius, kurie vadinami reaktyviomis azoto rūgštimis (RAR – reactive nitrogen species). Jos išdėstytos 1 lentelėje:
1.Lentelė. aktyvios deguonies ir azoto aktyvios formos [3]
Laisvieji radikalai Neradikaliniai atomai Aktyvios deguonies formos Superoksidas O2•- Vandenilio peroksidas H2O2
Hidroksiradikalas OH• Singuletinis deguonis 1O2
Lipidų peroksiradikalas LOO• Ozonas O3
Hidroperoksiradikalas HO2• Hipochlorito rūgštis HClO
Aktyvios azoto formos Azoto oksidas NO• Nitrito rūgštis HNO2
Azoto dioksidas NO2• Nitroksianijonas NO-
Peroksinitritas ONOO -Nitrozilkatijonas N+O
Superoksidas (arba superoksido anijonas, superoksido anijonradikalas O2•-) susidaro
mitochondrijų kvėpavimo grandinėje nepilnutinės deguonies redukcijos proceso metu, tam tikrų fermentinių reakcijų metu. Superoksidas nėra stiprus oksidatorius ir dažniausiai susidaro fagocituojančiose ląstelėse. [3,19]
Hidroksiradikalas (OH•) – stipriausias ir aktyviausias oksidatorius – stipriai oksiduoja visas biologinių molekulių rūšis ir stipriai pažeidžia ląsteles. Dėl mažo difuzinio spindulio susidaręs jis veikia arti esančias molekules. Junginys susidaro vandens jonizacijos metu, skylant peroksinitrato rūgščiai.
17
Singuletinis molekulinis deguonis (1O2) – stiprus ir geras, bet labai nepatvarus oksidatorius –
susidaro deguonį sužadinus elektromagnetinėmis bangomis, kai keičiasi vienas iš nesuporuotų elektronų sukinių ir O2 pereina į singuletinę vienalytę būseną.[19]
Azoto oksido radikalas (NO•) susidaro sintezėje iš arginino. Šis radikalas reaguodamas su vandenilio peroksidu sudaro peroksonitratą.
Vandenilio peroksidas (H2O2) susidaro veikiant superoksido dismutazei, ksantino oksidazei,
aminorūgščių oksidazėms. Nors vandenilio peroksidas nėra radikalas, tačiau gali oksiduoti baltymų -SH grupę. Pagrindinis šio oksidatoriaus toksinis poveikis yra tas, kad jis greitai gali virsti agresyviu radikalu – hidroksiradikalu.[19,49]
Nors ozonas (O3) yra naudingas gamtoje kaip UV spindulius sulaikanti ir gyvąjį pasaulį nuo
radiacijos apsauganti medžiaga biosferoje, tačiau gamtoje dėl pramoninės taršos ar elektros išlydžio susidariusi ši medžiaga sukelia stiprų oksidacinį stresą gyvų organizmų ląstelėse. Ląstelėms sąveikaujant su O3 organizme susidaro aktyvus singulentinis deguonis 1O2. [3]
1.2.2.
Biologinių medžiagų oksidacija
Aktyvios deguonies formos pažeidžia daugumą pagrindinių ląstelių makromolekulių: lipidus, baltymus ir šiek tiek silpniau DNR.[15]
Lipidų peroksidacija. Membraniniai fosfolipidai oksiduojami dažniausiai. dažniausiai RDF atakavimo vietos yra dvigubas ryšys riebalų rūgščių grandinėse bei esterinė grandinė tarp riebalų rūgšties ir glicerolio. Peroksidacija vyksta trim etapais: 1) pradėtis, 2) sklidimas, 3) baigtis. Lipidų peroksidacija yra žalingas poveikis, kadangi susijęs su membranos pažeidimais, kurie išardydami lipidinį sluoksnį ir į ląstelės vidų praleisdami didelius kiekius RDF bei kitas medžiagas, sunaikina ląstelę.[24,27,28]
Baltymų oksidacija. Radikalai dažniausiai atakuoja cisteino, histidino, metionino, triptofano ir tirozino nukleorūgštis. RDF pažeidus baltymus, šie fragmentuojasi, sulimpa, sudaro kovalentinius aminorūgščių susiuvimus. Jei oksidacinis stresas yra stiprus, o proteolizinių sistemų pajėgumas ląstelėje per mažas sunaikinti oksiduotus baltymus, tuomet ląstelėje susidaro pažeisti baltymų agregatai.[15,20,49]
Nukleorūgščių oksidacija. DNR ir RNR ląstelės yra labai linkusios į oksidacinius pokyčius, kurie sutrikdo replikaciją, transkripciją, transliaciją, sukelia mutacijas, ląstelės senėjimą ir mirtį. Nors oksidacija vyksta su įvairiais oksidatoriais, stipriausiai DNR ląsteles veikia hidroksiradikalas ir nukleorūgštis įvairiais būdais modifikuojama. Modifikuojasi nukleotido bazės ir angliavandeniai, skyla
18
pentozės žiedas, susidaro DNR ir baltymo kovalentiniai ryšiai. Labiausiai oksidacine pažaida pasižymi guanino bazė, o bendroji nukleorūgščių pažaida turi didelę įtaką kancerogenezei.[15]
1.3. Antioksidantai
Antioksidantai yra medžiagos, kurios mažina oksidacinį pažeidimą biologinėse ląstelėse (atitinkamai: prooksidantai – oksidacinius pažeidimus sukeliančios medžiagos). Organizme veikiant antioksidacinei sistemai ląstelės yra apsaugomos nuo laisvųjų radikalų poveikio, o tai labai svarbu tam tikrų ligų prevencijai ir senėjimo procesams stabdyti. Antioksidacinė ląstelės apsauga skirstoma į tris rūšis: 1) fermentai; 2) mažos molekulinės masės gaudyklės, kurios suriša laisvuosius radikalus; 3) pereinamųjų metalų jonus jungiantys baltymai.[5,12,14] 2 lentelė parodo svarbiausias RDF, jų atsiradimo šaltinius, ką jos labiausiai pažeidžia ir kokios medžiagos apsaugo.
2. Lentelė. Aktyvios deguonies formos, jų susidarymas, pažeidimai ir antioksidantai
RDF Šaltiniai Pažeidžia Antioksidatoriai
Superoksidas O2•- Mitochondrijos, oksigenazės (NADPH, ksantino oksidazė, lipoksigenezė Baltymus, turinčius prostetines metalų grupes SOD, GSH, vitaminas C CoQH2 Singuletinis deguonis 1 O2 Savaiminė O2•- dismutacija, jonizuotos spinduliuotės sąveika su ląstelių struktūra
Lipidus Karotenoidai, vitaminai C ir E, GSH
Hidroksiradikalas OH• Citochromas P450,
Fentono reakcijos
Visas biomolekules Vitaminas E, GSH, NAD(P)H, NAC, melatoninas Vandenilio peroksidas
H2O2
Mitochondrijos, SOD Oksiduoja baltymų SH grupes, Fe2+ ir Cu+ turinčias grupes
Katalazė, GSHPX, vitaminas GSH, NAC Peroksilo radikalas
ROO• Membranos, prostaglandinų sintezė Peroksiduoja lipidus Vitaminas E, GSH, NAD(P)H Hipochlorito rūgštis
HClO
Leukocitai Oksiduoja baltymus, lipidus, su O2•- sudaro
OH•
Vitaminas C, NAC, GSH, albuminas Peroksinitritas ONOO- NO• reakcija su O2•- Lipidus, oksiduoja
nitroziliną, susiuna baltymus
Šlapimo rūgštis, NADPH, polifenoliai flavonoidai
Superoksido dismutazė (SOD) – fermentas, kuris katalizuoja dviejų superoksido anijonų susijungimą į deguonies molekulę. Mitochondrijos ir dauguma bakterijų savo aktyviajame centre turi mangano, o kai kurių aktyviajame centre aptinkami geležies arba mangano dariniai (Fe-SOD, Mn-SOD). Hema turinčiame fermente vandenilio peroksidas yra suskaidomas, katalizuojant katalizei.
19
Glutationo peroksidazė (GSH) katalizuoja vandenilio ir lipidų peroksidų redukciją. [16]
Ubichinonas KoQ – stiprus antioksidantas, palaikantis vitamino E antioksidacines savybes, gana stipriai saugo organizmą nuo laisvųjų radikalų. Dažniausiai aptinkamas ląstelės mitochondrijose. Manoma, kad nesioksiduojančioji KoQ dalis neutralizuoja laisvuosius radikalus.
Vitaminas E (tokoferoliai ir jo dariniai) stabdo grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas, neutralizuoja singuletinį deguonį, peroksiradikalus ROO•. Membranose yra tirpus.
Karotenoidai – membraniniai antioksidantai. Vienas iš jų yra vitamino A darinys – β-karotenas, kuris veikia kaip radikalų gaudyklė.[29]
Vitaminas C ( L-askorbo rūgštis). Į šios rūgšties sudėtį įeina dvi enolinės grupės, tad medžiaga gali būti ir vandenilio akceptorius, ir donoras. Jei terpėje yra geležies ir vario jonų, vitaminas C būna stiprus prooksidatorius ir veikia kaip oksidatorius. Rūgštis pašalina hidroperoksidų, hipochlorito, sinuletinio deguonies, superoksido bei hidroksiradikalo kenksmingumą ir redukuoja α tokoferolio radikalą.
Polifenoliniai antioksidantai yra viena plačiausių cheminių junginių grupių, jų aptinkama apie 4000 rūšių. Polifenoliai antioksidantai suriša laisvuosius radikalus ir mažina žalingą aktyviųjų deguonies formų poveikį. Ši grupė plačiai aptinkama vaisiuose, daržovėse, ankštiniuose augaluose, vyne, šokolade, arbatose.
Šlapimo rūgštis. Jos veikimas gali būti tiesioginis arba kartu su pereinamųjų metalų Fe ir Cu jonais ji gali sudaryti chelatinius junginius, kurie kartu stabdo Fentono, Haberio ir Veiso reakcijas.
Pereinamųjų metalų jonus surišantys baltymai – tai baltymai, turintys metalų jonus (feritinas, transferitinas, laktoferinas). Jie sukelia antioksidacinį poveikį surišdami metalų jonus, taip sustabdoma Fentono reakcija. [14,16]
1.4. Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai – viena didžiausių augaluose aptinkamų cheminių grupių, kurių cheminė sudėtis susideda iš aromatinio žiedo ir vienos ar daugiau hidroksi grupių. Augalų ląstelėse fenoliniai junginiai kaupiasi įvairiose morfologinėse dalyse: žieduose, lapuose, stiebuose, žievėje, šaknyse, vaisiuose, tačiau jų kiekiai tarp dalių gali skirtis priklausomai nuo augalo dalies ir joje esančių organelių. Augalo ląstelės išorėje dažniausiai kaupiasi netirpūs fenoliai, o ląstelės viduje – tirpūs. Fenoliniai junginiai augalui padeda apsisaugoti nuo kenkėjų, kadangi junginiai turi specifinį kvapą ir skonį; taip pat jie įeina į dauginimosi sudėtį, nes tam tikri fenoliai suteikia žiedui spalvą, o tai pritraukia vabzdžius apdulkintojus; dėl šių priežasčių junginiai yra būtini augalui. Be to, fenolinių
20
junginių grupė yra svarbi žmogaus organizmui, kadangi apsaugo ląsteles nuo antioksidacinio streso, suriša laisvuosius radikalus ir veikia kaip antioksidatorius, apsaugantis ląsteles nuo pažaidos. Kadangi žmogaus organizmas fenolinių junginių negali susintetinti pats, juos privalo gauti iš aplinkos, todėl privaloma į mitybos racioną įtraukti kuo daugiau daržovių, vaisių, augalinės kilmės produktų (šokolado, vyno) ir augalų nuovirų – arbatų.
1.4.1. Fenolinių junginių klasifikacija
Fenoliniai junginiai klasifikuojami į penkias dideles grupes: fenolio rūgštys, flavonoidai, kumarinai, stilbenoidai ir taninai. Tarpusavyje jie skiriasi konfigūracija ir anglies atomų skaičiumi.[20] Fenolio rūgštys – vienas iš dažniausiai augaluose aptinkamų fenolinių junginių, kai kuriais atvejais fenolio rūgštis gamina ir bakterinės ląstelės. Augalų ląstelių sienelių rūgštys turi unikalią C6
-C3 (fenilpropanoido tipo) cheminę struktūrą, o mikrobiologinės kilmės – C6-C1 struktūrą [17,25,47].
Flavonoidai (flavus – geltonas) – pati didžiausia junginių grupė. Iš viso suskaičiuota beveik 6000 flavonoidų, kurie klasifikuojami taip: antocianidai, flavonoliai, flavonai, flavanonai, flavanoliai (katechinai) izoflavonai ir (izoflavonoidai). Flavonoidai susideda iš 15 anglies atomų, dviejų benzeno žiedų (A ir B), sujungtų trijų anglies atomų tilteliu (C), kuris su deguonies atomu sudaro heterociklą C6-C3-C6 [2 pav.]. B grupės benzeno žiedas gali būti prisijungęs prie 2-o, 3-io, 4-to C žiedo atomų, jei
prisijungs prie 4-to anglies atomo, flavonoidai priklausys neoflavonoidų klasei, jei prie 3-io – izoflavonas, o jei prie 2-o – bus suskirstyti į pagrindines klasifikacijas [1,24,28]. Gamtoje flavonoidai aptinkami glikozilinti arba aglikonų pavidalu, dažniausiai prisijungę gliukozę ar bet kurį kitą angliavandenį, o tai suteikia flavonoidui tirpumą vandenyje. [20,41,47]
2. Pav. Bendroji flavonoidų struktūra
Kumarinai susideda iš 9 anglies atomų ir turi C6 – C3 konfigūracijas.
Stilbenoidai susideda iš 18 anglies atomų ir turi C6-C2-C6 fragmentą.[30]
Taninai – tai tirpūs vandenyje junginiai, augale gaminasi kaip antimikrobinė arba apsauginė nuo žolėdžių gyvūnų medžiaga [1,14], sudaryta iš 15 anglies atomų ir sudaro C6-C3-C6
21
1.4.2. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės
Fenoliniai junginiai apsaugo ląsteles nuo oksidacinės pažaidos. Junginiai užkerta kelią laisviesiems radikalams aktyviai dalyvauti oksidacijos-redukcijos reakcijose. Vienas iš variantų - tai tiesioginis laisvųjų radikalų surišimas su fenolių hidroksilo grupėmis, kadangi jie ląstelėje laisvai oksiduojasi su laisvaisiais radikalais ir tampa stabiliais junginiais. Radikalai tampa neaktyvūs, nes fenolinių rūgščių hidroksi grupės yra stipriai reaktyvios. Tą parodo 3 paveikslėlyje pateikta lygtis [21,22]
3. Pav. Radikalo ir oksidatoriaus reakcijos lygtis
R – laisvasis radikalas; O – laisvasis deguonies radikalas.
Mokslininkai ištyrė, jog kai kurie flavonoidai tiesiogiai veikia superoksidus, o kiti sugeba neutralizuoti ypač reaktyvų deguonies radikalą – peroksinitritą. Mokslininkai taip pat nustatė, kad tokie flavonoidai kaip rutinas pasižymi stipriu antiradikaliniu poveikiu in vitro tyrimuose. [6]
Flavonoidų antioksidaciniam aktyvumui didelę reikšmę turi B žiedo hidroksilo grupių konfigūracija, o esantis hidroksi grupių skaičius turi įtakos antioksidaciniam stiprumui, kadangi būtent šiame žiede esančios hidroksilo grupės atlieka donoro-aceptoriaus vaidmenį ir lengvai stabilizuoja antiradikalines molekules. B žiedo 3 ir 4 padėtyse esančios hidroksilo grupės (3,4-katecholis) atlieka stiprią antiradikalinę funkciją prieš tokius stiprius radikalus kaip peroksilo, superoksido ir peroksinitrito radikalai. Visas flavonoidų oksidavimasis vyksta B žiede, o tyrimais buvo įrodyta, jei flavonoide nėra kateholio arba piragololio grupės, antioksidacinio poveikio metu su radikalais susidaro gana silpnas cheminis ryšys, kuris nėra tvirtas. A žiede esantis benzenas realiai neturi jokios reikšmės antioksidaciniam poveikiui ir jo poveikis yra abejotinas; nežymų poveikį jis turi, kai A bezeno žiede prie 5 anglies atomo yra prisijungusi hidroksilo grupė. C žiedas esantis flavonoide taip pat prisideda prie antioksidacinio poveikio: yra nustatyta, kad jei prie 3 anglies padėties prisijungusi –OH grupė, o prie 2 anglies grupės prisijungęs 3,4-katecholis, tokio tipo flavonoidai yra 10 kartų stipresni nei ebselenas (sintetinis antioksidantas, naudojamas kaip vaistas) [5,18,28].
1.4.3.
Fenolinų junginių ekstrahavimas iš augalinės žaliavos ir
antioksidacinio aktyvumo nustatymų metodai in vitro
22
Fenolinių junginių išgavimui iš skirtingų augalinių žaliavų naudojami įvairūs ekstrahavimo būdai. Paprastai ekstrahavimas apima šiuos veiksmus: 1) augalo surinkimas ir džiovinimas; 2) suskirstymas į dalis ir smulkinimas; 3) ekstrakcija; 4) filtracija [5].
Augalinė žaliava renkama augalui pradėjus žydėti arba masinio žydėjimo laikotarpiu, kadangi augale tuo metu būna susikaupę didžiausi kiekiai biologiškai aktyvių medžiagų. Iš vienos augavietės patartina surinkti daugiausiai iki 70% žaliavos, augančios vienoje populiacijoje, o likusią palikti tam, kad resursai kitais metais atsinaujintų. Tinkamiausias laikas rinkti yra rytinis, kai nudžiūsta rasa, saulėtą dieną. Augalinės vaistinės žaliavos nepatartina rinkti arti autostradų, geležinkelių, pramoninių rajonų, kadangi augale susikaupia dideli kiekiai pašalinių toksinių medžiagų. Surinkta VAŽ džiovinama kambario temperatūroje sausoje vietoje, ant popieriaus, apsaugant žaliavą nuo tiesioginių saulės spindulių, nes žaliavoje esančios biologiškai aktyvios medžiagos saulėkaitoje pradeda reaguoti arba skilti, taip mažėja veikliųjų medžiagų kiekis žaliavoje. Išdžiovinta augalinė žaliava smulkinama naudojant įvairias malimo mašinas, kapokles, grūstuves. Smulkinimas svarbus ekstrakcijai, nes kuo smulkesnės dalelės, tuo lengviau iš augalinių ląstelių išsiekstrahuoja veikliosios medžiagos, o išeiga būna žymiai didesnė.
Norint iš augalinės žaliavos išgauti kuo didesnius kiekius biologiškai aktyvių medžiagų, svarbu pasirinkti ekstrahavimo metodą. Tokiems klasikiniams metodams kaip Soklseto ekstrakcija arba maceracija reikia daug laiko ir tirpiklių sąnaudų, o gauti ekstraktai pasižymi gana maža polifenolinių junginių išeiga. Todėl labiau apsimoka naudoti naujesnius ekstrakcijos metodus, tokius kaip ekstrakcija ultragarsu. Šis metodas, lyginant su senaisiais ekstrakcijos metodais, yra žymiai greitesnis, iš augalinės žaliavos juo gaunami didesni kiekiai veikliųjų medžiagų, o ultragarso bangos minimaliai veikia veiklius junginius. Norint išgauti didelius kiekius biologiškai aktyvių junginių, reikia parinkti ir optimaliausias sąlygas parenkant tirpiklį, temperatūrą, ekstrakcijos laiką, dalelių dydį ir kitus veiksnius siekiant išgauti maksimalią išeigą. Ekstrakcija taip pat labai priklauso nuo augalo savybių ir sudėties, todėl būtina atsižvelgti ir į tai. Tirpikliais dažniausiai naudojami alkoholiai, tokie kaip metanolis ir etanolis, kitais atvejais – ir acetonas, etilacetatas bei jų mišiniai su vandeniu įvairiais santykiniais tūriais, nes dėl savo polinių savybių labai gerai ekstrahuoja polifenolinius junginius iš žaliavos.[31]
Ekstraktams ištirti naudojama UV spektrofotometrinė analizė. Tai greitas, pigus ir efektyvus procesas, nereikalaujantis didelių pastangų. Iš principo, spektroskopija tiria šviesos sąveiką su medžiaga, nes visos medžiagos sugeria šviesą, o to rezultatas yra padidėjęs atomų ir molekulių energijos sugeriamumas, kuris išryškėja matomosios arba ultravioletinės šviesos absorbcija, o pastaroji cheminiui junginiui sukuria spektrą. Spektrofotometrinės analizės metodu nustatomas ir medžiagos grynumas: mėginio absorbcija yra lyginama su etalonino tirpalu, o gauti rezultatai lyginami
23
tarpusavyje [23]. Šia analize ekstraktuose nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis, fenolio rūgščių, antocianus, flavonoidų kiekis ir antioksidacinį aktyvumas.[16]
Folin-Ciocalteu (F-C) tyrimas dažniausiai naudojamas bendrajam fenolinių junginių kiekiui nustatyti įvairiose augalinėse žaliavose, maisto produktuose ir cheminiuose mišiniuose. Tai vienas populiariausių metodų, jis naudojamas visame pasaulyje, mėgstamas dėl mažų išlaidų, nes vartojami ne itin dideli kiekiai medžiagų, ir yra lengvai atkartojamas. Principas paremtas elektronų perdavimo reakcijomis esančiuose fenoliniuose junginiuose itin silpnoje šarminėje terpėje, kuri palaikoma pridedant natrio karbonato, o susidaręs mėlynos spalvos kompleksas spektrofotometriškai matuojamas, esant 720-765 nm bangos ilgiui. Kaip etanolinis tirpalas naudojama galo rūgštis.
Bendrajam fenolinių rūgščių nustatymui naudojamas arnow reagentas, kuris susideda iš natrio molibdato, natrio nitrito ir vandenilio chlorido. Šioms medžiagoms reaguojant su fenolio rūgštimis, susidaro nuo geltonos iki tamsiai raudonos spalvos tirpalas, kuris matuojamas spektrofotometru, esant 500 – 525 nm bangos ilgiui [32,33].
Flavonoidų bendrasis kiekis tiriamas panaudojant AlCl3, o pats metodas remiasi aliuminio
susijungimu su flavonoidais ir stabilių chelatų susidarymu. Visiškas chelatinis aktyvumas nusistovi praėjus 30 minučių, o spektrofotometru matuojama esant 404-430 nm. Rezultatai pateikiami mg/g rutino ekvivalentais (RE)
DPPH – vienas dažniausiai naudojamų antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodų, kai vykstant oksidacijos-redukcijos reakcijoms etanolyje violetinė spalva redukuojasi į šviesiai geltoną. Būtent geltoną spalvą sudaro redukuota antioksidanto dalis, kuri susidaro DPPH sumaišius su medžiagomis, kurios yra vandenilio atomo donorai (4 pav.). Pats DPPH junginys yra organinis radikalas, kuris yra gana pigus, greitas ir paprastas bei pasižymi tiksliais rezultatais. Mėginiai spektrofotometriškai matuojami esant 515-517 nm šviesos bangai, kai pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (5-30) minučių intervale [34,35].
4 pav. DPPH laisvo radikalo sąveika su antioksidantu
ABTS radikalų – katijonų surišimo metodas. Naudojamas aktyvuotas ABTS katijonas, kuris aktyvuojamas kalio persulfato tirpalu, pati aktyvacija trunka nuo 12 iki 16 valandų, o pagamintas
24
tirpalas aktyvus išbūna 36 valandas. Gautas tirpalas matuojamas prie 734 nm spektrofotometru, o metodas paremtas antioksidantų surišimu su aktyviu ABTS, kai tirpalo spalva gali kisti nuo mėlynos iki žalsvos arba jis gali tapti visai bespalvis. Etalonas naudojamas troloksas, o rezultatai išreiškiami trolokso ekvivalentais (TE) [36,37,38].
FIC (Ferrous Ion Chelating) – metodas, paremtas ferozino sugebėjimu sujungti pereinamųjų metalų jonus, taip sudarant kompleksinę druską. Pridėjus į tirpalą chelatuojančių medžiagų pradeda blukti raudona tirpalo spalva, pagal išblukimo kiekį galima įvertinti antioksidacinį aktyvumą. Tirpalas matuojamas po 10 minučių spektrofotometru, esant 562 nm absorbcijos bangos ilgiui, o aktyvumas išreiškiamas procentais [20,27].
FRAP metodas panašus į ABTS arba DPPH metodus, o skiriasi tuo, kad reakcija vyksta rūgštinėje terpėje. Metodas paremtas antioksidanto sugebėjimu rūgštinėje terpėje redukuoti Fe(III) TPTZ iki Fe(II) – mėlynos spalvos kompleksą. Tiriamasis spektrofotometriškai matuojamas esant 593nm bangos ilgiui, o kaip palyginamasis tirpalas naudojamas troloksas ir išreiškiamas trolokso ekvivalentais [39]
25
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimų objektas
Tyrimui buvo naudojamos natūraliai gamtoje augančių smiltyninių šlamučių (Helichrysum
arenarium L.) augalinės dalys, kurios buvo surinktos iš 17 skirtingų Lietuvos augaviečių, masinio
žydėjimo laikotarpiu, liepos – rugpjūčio mėnesiais 2017 ir 2018 metais (žr. 3 lentelė). Augalas rinktas pievose prie miškų, smėlingose vietovėse, kuo toliau nuo automagistralinių kelių, geležinkelių ir pramoninių objektų. Siekiant išskirti tiriamųjų medžiagų ekstraktus iš skirtingų augalo dalių, surinktas augalas buvo paskleistas ant sauso laikraščio ir džiovinamas sausoje šiltoje vietoje, atokiau nuo tiesioginių saulės spindulių, kurie galėtų veikti organines medžiagas augale, jas suardytų ir iškreiptų tyrimo rezultatus. Išdžiovinti žaliavos mėginiai buvo suskirstyti į dalis (žiedai, lapai, stiebai), susmulkinti ir laikomi popieriniuose maišeliuose, sausoje, tamsioje vietoje.
3. Lentelė. H. arenarium žaliavų rinkimo vieta ir data
NR. Vietovė Rinkimo data
1. Kaunas 2017-07-12 2. Alytus 2017-07-06 3. Jieznas 2017-08-17 4. Labanoras 2017-08-24 5. Jonava 2017-07-25 6. Švenčionys 2017-08-14 7. Leipailingis 2017-07-31 8. Nida 2018-09-16 9. Biržai 2018-07-15 10. Skuodas 2018-07-12 11. Kretinga 2018-07-25 12. Šiauliai 2018-07-28 13. Trakai 2018-08-07 14. Kėdainiai 2018-08-26 15. Varniai 2018-08-14 16. Ignalina 2018-08-17
26
17. Obeliai 2018-08-29
2.2. Medžiagos ir reagentai
Tyrimui naudotos šios medžiagos ir analitinio švarumo reagentai: etanolis (96 proc.) (V/V) (UAB „Vilniaus Degtinė“, Lietuva), išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2009:0008), natrio šarmas (99%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (2M)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Šveicarija), galo rūgšties monohidratas (≥ 98%) (,,Sigma–Aldrich“, Kinija), acto rūgštis (100%) (,,Carl Roth“, Vokietija), aliuminio chlorido heksahidratas (≥ 95%) (,,Carl Roth“, Vokietija), rutino hidratas (≥ 94%)(,,Sigma – Aldrich“, Vokietija), metenaminas (≥ 99,5%)(,,Sigma – Aldrich“, Rusija), ferozinas (≥ 97%)(,,Sigma – Aldrich“, JAV), bevandenis geležies (II) chloridas (99,5%) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) (95%) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono)) rūgštis (,,Sigma-Aldrich“, Kanada), kalio persulfatas (,,SIAL“, Kanada), troloksas (,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Danija), analitinio švarumo natrio nitritas Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatas (≥ 99%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis (37%) (Sigma-(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija).
2.3. Naudota aparatūra
Ekstraktų gamybai naudota ultragarso vonelė „ElmaSonic S40H“ (U=230V), kurios gamintojas
Elma Schmidbauer (Vokietija) ir automatinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic, kurios gamintojas
IKA-WERKE (Vokietija). Spektrofotometrinei analizei naudoti spektrofotometrai „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) ir „Agilent Technologies“ (Cary – 60, JAV).
2.4. Tyrimų metodai
2.4.1. Smiltyninių šlamučių žaliavų ekstraktų paruošimas
Ekstraktų gaminimui tiksliai atsveriama 0,100 g H. arenarium žaliavos (lapų, žiedų ar kotų) ir sudėjus žaliavas į tamsaus stiklo buteliukus, jos užpilamos 10 ml 80% (V/V) etanoliu. Buteliukai su ekstraktu veikiami ultragaro vonelėje 10 min, esant 60 °C temperatūrai. Gauti ekstraktai filtruojami per popierinius filtrus į matavimo cilindrą, ant popierinio filtro likusi žaliava nuplaunama 80 % (V/V)
27
etanoliu iki 10 ml cilindro žymės. Kiekvienai morfologinės žaliavos daliai (lapams, žiedams ir kotams) buvo pagaminta po 2 mėginius, iš viso buvo pagaminta 102 H. arenarium etanolinių ekstraktų (1:100).
2.4.2. Reagentų paruošimas
80 proc. (V/V) etanolio ir vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 783 ml 96 proc. (V/V) etanolio ir 217 ml išgryninto vandens.
0,2 N Ciocalteu reagentas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 10 ml 2M Folin-Ciocalteu fenolinio reagento praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
7,5 proc. (W/V) natrio karbonato (Na2CO3) tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 7,5 g
bevandenio natrio karbonato tirpinama 100 ml išgryninto vandens.
5 proc. metenamino tirpalas gaminamas 2,5 g metenamino tirpinant 50 ml išgryninto vandens. 33 proc. acto rūgšties tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 33 ml 99,8 proc. ledinės acto rūgšties skiedžiama vandeniu iki 100 ml žymos.
10 proc. aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas ruošiamas stiklinėje kolboje 5,0 g aliuminio
chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.
Rutino etanolinis tirpalas gaminamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99 proc. grynumo rutino tirpinant 25 ml 80 proc. (V/V) etanolio.
2 mM geležies (II) chlorido (FeCl2) tirpalas ruošiamas 0,0063 g (tikslus svėrinys) bevandenio
FeCl2 tirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas.
5 mM ferozino tirpalas gaminamas 0,0616 g ferozino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml išgryninto vandens.
6×10-5 M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas gaminamas ir laikomas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugančiame nuo šviesos. 0,00118 g (tikslus svėrinys) DPPH reagento ištirpinama 50 ml 96 proc. (V/V) etanolyje. Kiekvieną tyrimo dieną ruošiamas naujas DPPH tirpalas.
ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių tirpinama 50 ml išgryninto vandens, pridedama 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys 15–16 valandų laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS•+ tirpalą.
0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas gaminamas atmatuojant 42 ml 37 proc. vandenilio chlorido rūgšties ir ją maišant su išgrynintu vandeniu iki 1 litro.
Praskiestas natrio šarmo tirpalas gaminamas pasveriant tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį, kuris ištirpinamas išgrynintame vandenyje ir praskiedžiamas iki 100 ml.
28
Arnow reagentas gaminamas pasveriant tikslų 10,000 g natrio molibdato kiekį, ištirpinant jį 70-80 ml išgryninto vandens. Pasveriamas tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris ištirpinamas gautame tirpale ir praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
300 nM acetato buferis gaminamas atsveriant 3,1 g (tikslus svėrinys) natrio acetato, kuris tirpinamas 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiamas iki 1000 ml.
10 mM TPTZ tirpalas gaminamas 50 ml išgryninto vandens tirpinant 0,1562 g TPTZ (2,4,6-tri(2-piridil)-s-triazino) miltelių.
20 mM geležies (III) heksahidrato tirpalas gaminamas atsvėrus 0,2703 g (tikslus svėrinys) ir sumaišius su 50 ml išgryninto vandens.
2.5. Smiltyninių šlamučių (H. arenarium) ekstraktų spektrofotometrinė
analizė
2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas
Naudojant spektrofotometrinę analizę su Folin-Ciocalteu reagentu, nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis etanoliniuose H. arenarium ekstraktuose. Analizei imamas 1 ml etanolinis
H. arenarium ekstraktas ir sumaišomas su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu, po 4 minučių į tirpalą
įpilame 4 ml 7,5% (W/V) natrio karbonato tirpalo, gerai sumaišius paliekame stovėti 1 valandą tamsioje vietoje. Optinis tankis matuojamas 765nm šviesos bangos ilgiui naudojant spektrofotometrą, palyginamasis tirpalas – analitinio grynumo vanduo.[35,40]
Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentais (GRE), remiantis galo rūgšties kalibracine kreive (5 pav.) ir formule:
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml); v – pagaminto ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas žaliavos kiekis (g).
29
5 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=2).
2.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas
Nustatant bendrąjį flavonoidų kiekį etanoliniuose H. arenarium mėginiuose, gaminami du tirpalai: tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamasis tirpalas gaminamas 25 ml cilindrinėje matavimo kolboje, į ją pilant 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto, 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5% metenamino tirpalo, distiliuoto vandens iki 25 ml kolbos žymės. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat 25 ml cilindinėje matavimo kolboje, į ją įpilant 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto, 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo ir distiliuoto vandens iki 25 ml žymos. Abu tirpalai gerai sumaišomi ir po 30 minučių matuojama absorbcija, esant 407nm bangos ilgiui. Tiriamasis tirpalas lyginamas su palyginamuoju, absorbcija kiekvienam mėginiui matuojama po 3 kartus.
Gauti absorbciniai rezultatai vertinami lyginant tirpalo absorbciją su etanolinio rutino tirpalo absorbcija, kuris gaminamas vietoj 1 ml etanolinio H. arenarium ekstrakto įpilant 1 ml etanolinio rutino tirpalo.
Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas išreiškiant rutino ekvivalentu (RE) (mg rutino/ml ekstrakto) taikant formulę:
30
mr – rutino masė etaloniniam rutino tirpalui ruošti (g);
A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – ekstrakto tūris (ml);
m – atsvertas žaliavos kiekis (g);
Ar – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
Vr – etaloninio rutino tirpalo tūris (ml).
2.5.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas
Nustatant bendrą fenolinių rūgščių kiekį gaminami po du tirpalus kiekvienam ekstraktui: tiriamąjį ir palyginamąjį. Tiriamasis tirpalas gaminamas 10ml cilindrinėje matavimo kolboje į ją įpilant: 1ml tiriamojo etanolino H. arenarium ekstrakto, 2ml 0,5 M vandenilio chlorido tirpalo, 2ml Arnow reagento, 2ml praskiestos natrio hidroksido tirpalo ir distiliuoto vandens iki 10ml žymos. Gaminant palyginamąjį į matavimo kolbutę įpilam: 1ml tiriamojo etanolinio ekstrakto, 2ml 0,5 M vandenilio chlorido tirpalo, 2ml praskiestos natrio hidroksido tirpalo ir distiliuoto vandens iki 10ml žymos. Abu tirpalai gerai sumaišomi ir matuojama absorbcija estant 525 nm bangos ilgiui.
Bendras fenolio rūgščių kiekis paverčiamas cholergeno rūgštimi ir skaičiuojamas remiantis formule:
A – tiriamojo tirpalo absorbcija; m – atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant
spektrofotometrinį Fe2+ jonų sujungimo metodą
H. arenarium etanoliniuose ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai gali surišti pereinamųjų
metalų (vario ar geležies) jonus, kurie sudaro chelatus, leidžiančius nustatyti fenolinių junginių antioksidacines savybes. Savybės nustatomos įvertinus Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimą, esant 562 nm šviesos bangos ilgiui. Analizė atliekama į 1ml tiriamojo ekstrakto įpilant 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo ir gerai sumaišoma, o po 5 minučių reakcija inicijuojama įpilant 0,2 ml 5mM
ferozino tirpalo, kuris gerai sumaišomas, paliekamas 10 minučių ir tiriamas spektrofotometru. Kartu paruošiamas ir tuščias bandinys, kuris susideda iš 1 ml 80% (V/V) etanolio, 50 μl 2mM FeCl2 ir 0,2 ml
31
5mM ferozino tirpalo. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 80% (V/V) etanolis ir kiekvienas mišinys tiriamas po tris kartus.[13,20,45,46]
Tiriamojo ekstrakto gebėjimas susijungti su Fe2+ jonais išreiškiamas procentais ir
skaičiuojamas pagal formulę:
Aa – su tiriamuoju ekstraktu bandinio absorbcijos dydis;
Ab - tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).
2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį
DPPH radikalų surišimo metodą
Antioksidacinis aktyvumas įvertinamas atliekant DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodą, kuris paremtas elektronų perdavimo reakcijomis. Analizei imama 50 µl smiltyninių šlamučių etanolinio ekstrakto, pilama į 1 cm3 kvarcinę kiuvetę ir pilamas 2ml 6*10-5
M DPPH tirpalas. Kartu gaminamas ir tuščias bandinys, kuris ruošiamas 1 cm2
kvarcinėje kiuvetėje maišant 50 µl 80% (V/V) etanolio ir 2ml 6*10-5 M DPPH tirpalo. Tiriamųjų absorbcija matuojama spektrofotometriškai, esant 515nm šviesos bangos ilgiui, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra, kuri nusistovi po ~30 min.[42] Mėginiai tiriami mažiausiai po 3 kartus, o ekstraktų antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procento dalimis pagal formulę:
Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (t = 30 min);
Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).
2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant ABTS·+
surišimo metodą
Antiradikalų aktyvumui įvertinti naudojamas ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgšties radikalo surišimo metodas. Gaminamas 2mM motininis ABTS tirpalas: tamsaus stiklo buteliuke maišome tiksliai atsvertą 0,0548 g ABTS reagento, tirpiname 50 ml distiliuotame
32
vandenyje. Tirpalas aktyvuojamas į jį įpylus 70nM vandeninio kalio persulfato tirpalo, gerai sumaišomas ir paliekamas 16 valandų tamsioje vietoje, kad nusistovėtų pusiausvyra. Nusistovėjus pusiausvyrai, gaminamas darbinis ABTS·+ tirpalas, skiedžiant motininį tirpalą distiliuotu vandeniu, kol absorbcija, esant 734nm bangos ilgiui, pasiekia 0,800 ± 0,03; palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo.
Ekstraktų antiradikalinis aktyvumas atliekamas į 1 cm3
kvarcinę kiuvetę įpilant 30 µl
H. arenarium etaloninio ekstrakto ir 3 ml darbinio ABTS·+ tirpalo. Kiekvienam tiriamajam gaminami 2 mėginiai, kurie 60 min laikomi kambario temperatūroje tam, kad nusistovėtų pusiausvyra. Absorbcija matuojama esant 734 nm bangos ilgiui; palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.[36,37] Laisvųjų radikalų surišimas įvertinamas remiantis trolokso kalibracine kreive (6 pav.) ir išeiškiamas trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos pagal formulę:
c – trolokso koncentracija, remiantis kalibracijos kreive (μmol/l); V - pagaminto ekstrakto kiekis (ml);
m - atsvertas žaliavos kiekis (g).
33
Trolokso kalibracinei kreivei sudaryti gaminame 6 skirtingų koncentracijų (250 – 6000 µmol/l) trolokso tirpalus, kurie gaminami tiksliai atsvėrus trolokso kiekį ir jį tirpinant 80% (V/V) etanolyje. Gavus trolokso tirpalų absorbcijos reikšmes, sudaroma kalibracinė kreivė.
2.5.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
Redukciniam aktyvumui nustatyti naudojamas FRAP tirpalas, kuris parūgštintas acto rūgštimi (pH ~ 3,6). Darbinis FRAP reagentas gaminamas maišant 10 dalių 300 mM acetatinio buferio su 1 dalimi 10 mM TPTZ ir 1 dalimi 20 mM geležies (III) chlorido heksahidratu. Analizei imami 3 ml darbinio FRAP reagento ir 20 µl tiriamojo etanolinio ekstrakto, kiekvienam tiriamajam gaminami po 2 mėginius, kurie gerai sumaišomi 1 cm3
kvarcinėje kiuvetėje ir paliekami stovėti 1 valandą kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Lygiagrečiai ruošiamas ir palyginamasis mėginys, kuris susideda iš tų pačių reagentų, tik vietoje tiriamojo ekstrakto įpilama 80% (V/V) etanolio. Absorbcija matuojama spektrofotometru esant 593nm bangos ilgiui.
Redukcinis aktyvumas išreiškiamas standartiniu trolokso ekvivalentu (TE) 1 gramui žaliavos ir apskaičiuojamas:
c – trolokso koncentracija, remiantis kalibracijos kreive (μmol/l); V - pagaminto ekstrakto kiekis (ml);
m - atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.6. Duomenų analizė
Statistinei duomenų analizei atlikti ir grafikams braižyti buvo naudojamos „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS 20“ (IBM, JAV) programos. Duomenų statistiniams įvertinimams buvo apskaičiuotas vidurkis, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida ir variacijos koeficientas. Tiesinės regresijos modelio tinkamumas apskaičiuotas determinacijos koeficientu R2
. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo – 0,05, tad rezultatai yra statistiškai reikšmingi, kai p<0,05. Koreliacinių ryšių įvertinimas atliktas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą.
34
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Optimalių salygų ekstrakcijai parinkimas
Atliekant analizinius tyrimus labai svarbu pasirinkti geriausias sąlygas biologiškai aktyvių junginių išskyrimui iš augalinės žaliavos, siekiant išgauti kuo didesnę aktyvių medžiagų išeigą ir kuo mažiau jų suardyti dėl netinkamų sąlygų. Moksliniuose straipsniuose aprašoma, kad geriausias tirpiklis ekstraktams yra metanolis, tačiau dėl pastarojo toksiškumo atliekant tyrimus buvo naudotas etanolis, kuris, palyginus su kitais tirpikliais, nėra brangus, ir pasitarnavo dezinfekavimui bei plovimui. Parinkus tinkamą tirpiklio koncentraciją ir atlikus optimalizacijos tyrimus, buvo parinkta tinkama temperatūra ir laikas, kuris taikytas visiems ekstraktams.
Parenkant ekstrakcijos sąlygas, visiems tyrimams naudota natūraliai gamtoje augančių smiltyninių šlamučių žiedų žaliava, kuri buvo surinkta Lietuvoje, Kauno rajono Taurakiemo seniūnijoje, 2017 metų liepos mėnesį.
3.1.1. Ekstrahento poliškumo nustatymas
Siekiant nustatyti ekstrahento poliškumą Smiltyninio šlamučio žieduose, buvo taikomas maceracijos metodas. Buvo gaminami skirtingų koncentracijų etanoliniai augaliniai ekstraktai ir Folin-Ciocalteu metodu nustatoma, kokioje etanolinėje terpėje fenolinių junginių išeiga yra didžiausia. Nustatymui buvo pasirinkti 40 %, 50 %, 60%, 70%, 80% (V/V) koncentracijos etanolio ir išgryninto vandens mišiniai. Ekstraktų gamybai imama 0,100 g (tikslus svėrinys) susmulkintų H. arenarium žiedų ir užpilama kiekvienos parinktos koncentracijos etanoliu. Mišinys 60 minučių purtomas automatinėje kratyklėje, paliekamas 24 valandoms tamsioje vietoje ir vėl purtomas 60 minučių kratyklėje. Gauti ekstraktai filtruojami pro popierinį filtrą ir matuojama absorbcija. Rezultatai pateikiami grafiko forma (7 pav.).
35
7. pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas H. arenarium žiedų žaliavos mėginiuose paprastos maceracijos būdu. GRE – galo tūgšties ekvivalentais (n=2)
Gauti rezultatai rodo, kad didėjant etanolio koncentracijai fenolinių junginių išeiga didėja, o didžiausias fenolinių junginių kiekis ekstrahuojasi 80 % (V/V) etanolio ir grynojo vandens mišinyje (18,465 ± 0,147 mg/g). Todėl tolimesniuose tyrimuose naudotas šios koncentracijos etanolis.
3.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės nustatymas
Greitam ir pigiam fenolinių junginių išgavimui naudojama ultragarso vonelė, kuri pagreitina junginių ekstrakciją iš augalinės žaliavos, kai ultragarso bangos pažeidžia ląstelės sienelę ir iš jos lengviau išsiskiria dideli kiekiai junginių. Svarbu nustatyti, per kiek laiko fenolinių junginių išsiskiria
daugiausiai, nes ilgiau trunkantis ekstrahavimas gali pakenkti ekstrakto kokybei ir junginių išeigai. Tyrimui pasirinkta optimali 30±5 °C temperatūra ir ekstrakcija veikiama 5, 10, 15, 20 minučių. Tyrimui imama 0,100 g (tikslus svėrinys), užpilama 80 % (V/V) etanolio ir išgryninto vandens tirpalu, veikiami ultragarso vonelėje atitinkamą laiką ir matuojama absorbcija pasitelkus Folin-Ciocalt metodą.
36
Rezultatai pateikiami grafike (8.Pav.)
8. pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės vertinimas H. arenarium žiedų žaliavose. Ekstrahentas 80% (V/V) etanolis. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=2)
8 paveiksle pateiktas grafikas rodo, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis išsiekstrahuoja veikiant ekstraktą 10 minučių (23,4699 ± 0,135 mg/g). Veikiant ekstraktus ilgesnį laiką, fenolinių junginių kiekis mažėjo dėl junginių degeneracijos, todėl tolimesniuose tyrimuose ekstrakcija buvo vykdoma 10 minučių.
3.1.3. Temperatūros nustatymas ekstakcijoje ultragarsu
Atliekant optimalių sąlygų parinkimą, svarbu nustatyti kokioje temperatūroje biologiškai aktyvių medžiagų koncentracija didžiausia. Kadangi tiriami fenoliniai junginiai, kurie pasižymi termolabilumu, temperatūra dažniausiai būna žema (nuo 20 iki 60 °C), kadangi aukštesnėse temperatūrose fenoliniai junginiai degraduoja.
Nustatymas atliekamas ankščiau nustatytomis sąlygomis – ekstrahentas 80% (V/V) etanolio ir išgryninto vandens mišinys bei ekstrakcijos laikas ultragarso vonelėje 10 minučių. Bandyniai ekstrahuojami skirtingomis temperatūromis: 40 °C, 50 °C, 60 °C ±5 °C, absorbscija matuojama pagal Folin-Ciocalteu metodą. Rezultatai pateikiami grafike (9.pav.)
37
9. pav. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros vertinimas H. arenarium žiedų žaliavoje. Ekstrahentas 80% (V/V) etanolis, ekstrahavimo trukmė 10 min. GRE – galo rūgšties ekvivalentai. (n=2)
Grafikas rodo, kad kylant temperatūrai didėja fenolinių junginių kiekis ekstrakte (27,399 ± 0,113 mg/g), todėl ekstraktų gaminimui naudota 60±5 °C temperatūra.
Nustačius optimalių sąlygų parametrus, ekstraktų gamybai naudojamas 80% (V/V) etanolio ir išgryninto vandens mišinys, ultragarso vonelėje ekstrahuojama 10 minučių, 60±5 °C temperatūroje.
3.2. Bendrasis fenolinių junginių kiekio nustatymas H. arenarium
žaliavose
Augalai, turintys vieną ar kelis aromatinius žiedus, gamina didelius kiekius fenolinių junginių, kurie augale sudaro apie 40 % biosferoje esančio anglies dioksido, o junginiai pasižymi antioksidaciniu poveikiu ir deguonies surišimu ląstelėse. Bendrajam fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudotas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, kuris gana pigus, lengvai atliekamas ir yra naudojamas maisto pramonėje bei biologiniuose tyrimuose.[35,40] Tyrimo H. arenarium augalo žaliavose esančių fenolinių junginių kiekiui nustatyti rezultatai pateikiami 10 paveiksle.
