Lietuvoje galvijų gydymui naudojamų vaistų likučių patekimo į maistą rizika Magistro darbas

1

Lietuvos veterinarijos akademija

Veterinarijos fakultetas

Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedra

Jonas M÷ginis

Lietuvoje galvijų gydymui naudojamų vaistų likučių patekimo į

maistą rizika

Magistro darbas

Darbo vadovas:

Dr. Jonas Milius

2

Lietuvos veterinarijos akademija

Veterinarijos fakultetas

Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedra

Magistrinis darbas atliktas 2008 - 2010 m. Lietuvos veterinarijos akademijos Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedroje.

Magistro darbą paruoš÷ : Jonas M÷ginis

(parašas)

Magistro darbo vadovas: Dr. Jonas Milius

(parašas)

Recenzentas (-ai):

3

Turinys

SUTRUMPINIMAI 4

ĮVADAS 5

1. LITERATŪROS APŽVALGA 6

1. 1 Antibiotikai ir jų patekimas į maisto produktus 6

1.1.1 Amfenikoliai 7

1.1.2 Sulfonamidai 9

1.1.3 Tetraciklinai 11

1.1.4 Chinolonai ir fluorochinolonai 13

1.1.5 Penicilinai 14

1.2 Veterinarinių vaistų likučiai maiste, jų kontrol÷ 14

1.3 Vaistų likučių keliamas pavojus ir prevencija 15

1.4 Likučių kontrol÷, normavimas 16

1.5 Steb÷sena Lietuvoje 17

2. DARBO ATLIKIMO VIETA IR METODIKA 19

2.1 M÷ginių ÷mimas 19

2.2Sulfonamidų analiz÷ piene ESCh metodu 20

2.2.1 Aparatūra 20

2.2.2 Procedūra 22

2.3 Eksperimento rezultatų analiz÷ 23

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZö 24

3.1 Žaliavinio pieno tyrimai 24

3.2 Galvijų raumens tyrimai 27

3.3 Galvijų kepenų tyrimai 29

3.4 Galvijų inkstų tyrimai 31

4. IŠVADOS 33 5. PASIŪLYMAI 34 6. PADöKOS 35 7. SUMMARY 36 8. LITERATŪROS SĄRAŠAS 37 9. PRIEDAI 40

4 SUTRUMPINIMAI

CAP - chloramfenikolis

DLK - didžiausia leistina koncentracija ESCh - efektyvioji skysčių chromatografija ES – Europos Sąjunga

KFE - kietafaz÷ ekstrakcija MeOH - metanolis

MS - masių spektrometrija

NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas SA - sulfonamidai SAC - sulfacetamidas SBZ - sulfabenzamidas SDZ - sulfadiazinas SMD - sulfadimetoksinas SMZ - sulfametazinas SMR - sulfamerazinas SMT - sulfametizolas SMX - sulfametoksazolas SPY - sulfapiridinas STZ - sulfatiazolas

5 ĮVADAS

Maisto produktuose, gaminamuose iš veterinarinais vaistais gydytų gyvūnų gali likti tų vaistų likučių, kurie vartojami su maistu gali kenkti žmonių sveikatai. Siekiant apsaugoti visuomen÷s sveikatą, visuotinai pripažintais saugos įvertinimo principais, atsižvelgiant į mokslo pasiekimus nustatomi didžiausi likučių kiekiai įvairiuose gyvūnin÷s kilm÷s produktuose, įskaitant m÷są, žuvį, pieną, kiaušinius ir medų. ES šalys įpareigotos kontroliuoti veterinarinių vaistų likučių kiekius gyvūnin÷s kilm÷s produktuose, vertinti jų patekimo į maistą riziką. Tai atliekama vykdant nacionalines gyvūnin÷s kilm÷s produktų steb÷senos programas. Veterinarinių vaistų likučių nustatymas vienas iš sud÷tingiausių analiz÷s objektų. Veterinarinius vaistus, taip pat kitus teršalus reikalaujama aptikti mikrogramų, ar net jų dalių kilograme eil÷s koncentracijose. Analiz÷s metodai šiose srityse reikalauja vis pažangesn÷s aparatūros, o taip pat griežtesnių metodų įvertinimo procedūrų, savu ruožtu užtikrinančių atliekamų tyrimų kokybę. Ne pakankamai tiksliai identifikavus teršalą, ar jo kiekį gali nukent÷ti tiek gamintojas, tiek vartotojas, ant kurio stalo atsidurs užterštas maisto produktas. Lietuvoje taip pat pastoviai vykdoma gyvūnin÷s kilm÷s produktų taršos steb÷sena, kur pagrindinis d÷mesys skiriamas vaistų likučių kontrolei.

Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje galvijų gydymui naudojamų vaistų likučių patekimo į gyvūnin÷s kilm÷s produkciją galimybę ir riziką.

Uždaviniai:

1. Apžvelgti literatūros šaltiniuose esančius duomenis apie galvijų gydymui naudojamus vaistus, jų pasišalinimo iš organizmo terminus bei patekimo į gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktus priežastis.

2. Praktiškai susipažinti su Lietuvoje galvijų gydymui naudojamų vaistų likučių nustatymu gyvūnin÷s kilm÷s produkcijoje.

3. Praktiškai susipažinti su m÷ginių atrinkimo reikalavimais, išmokti paimti m÷ginius.

4. Atlikti 2004 -2009 metais pagal kasmetines steb÷senos programas vykdytų tyrimų rezultatų analizę.

6 1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Antibiotikai ir jų patekimas į maisto produktus

Antibiotikai - mikroorganizmų, augalų ir gyvūnų audinių gyvybin÷s veiklos produktai, slopinantys kitų aplinkinių mikrobų augimą ir dauginimąsi arba juos naikinantys. Antibiotikai gaminami iš mikroorganizmų (grybų, aktinomicetų, bakterijų) medžiagų apykaitos produktų arba gaunami sintez÷s būdu.

Antibiotikų atradimas – didžiausias žmonijos XX a. pasiekimas. Pirmuoju antibiotiku laikoma iš Penicillium šeimos grybų išskirta veiklioji medžiaga penicilinas. Šiomis dienomis antibiotikų rūšių yra daug: penicilinai, tetraciklinai, sulfonamidai ir kt. (http://www.mothernature.com/Library/Ency/Index.cfm/Id/1455007. Prieiga per internetą 2008 m. lapkričio 18 d.).

Antibiotikai mikroorganizmus gali veikti dvejopai - naikindami juos arba prislopindami jų augimą bei dauginimąsi. Antruoju atveju yra paliekama galimyb÷ pačiam organizmui įveikti susilpnintus svetimkūnius.

Antibakterin÷s medžiagos veterinarin÷je medicinoje ir žem÷s ūkyje vartojamos sergantiems gyvuliams gydyti, siekiant užtikrinti gerą gyvulių savijautą bei neleisti plisti pavojingoms infekcijoms (David Waltner-Toews and Scott A. McEwen, 2002). Tačiau yra nustatytas ir neigiamas antibiotikų naudojimo poveikis. Naudojant antibiotikus jautrios bakterijos žūva, o atsparios bakterijos išlieka. Patogeninių bakterijų atsparumo did÷jimas antibiotikams kelia gr÷smę antibakterinio gydymo s÷kmei.

Patogeninių mikroorganizmų atsparumo did÷jimas antibiotikams turi įtakos gyvūnų ir žmonių sveikatai, kai gyvūnų m÷sa ir kiti gyvūniniai produktai naudojami maistui. Per daug ir dažnai nekontroliuojamai vartojant antibiotikus gyvūnams, jų liekanos su gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktais gali patekti vartotojams. Maistas užterštas antibiotikais ar jų liekanomis yra pagrindin÷ did÷jančio ir plintančio mikroorganizmų atsparumo antibiotikams priežastis. (Food and Chemical Toxicology, 2000). Nedidel÷s antibiotikų liekanos gyvūniniuose produktuose gali sukelti alergines reakcijas, sunaikina naudingą organizmui mikroflorą, didina patogeninių mikroorganizmų atsparumą (Food and Chemical Toxicology, 2002, WHO, 2006).

Gyvuliai yra tikrinami - ištiriama, ar antibiotikų kiekis atitinka keliamus reikalavimus. Jeigu aptinkama neatitikimų - gyvulių m÷są ar produktus maisto pramon÷je naudoti draudžiama. Tokioje patikroje dalyvauja ne tik valstybin÷s institucijos, bet ir privatūs subjektai, kurie būna suinteresuoti gera savo gaminių kokybe. Tod÷l, duodant gyvuliams antibakterinių preparatų, būtina laikytis vaisto vartojimo instrukcijos, kurioje turi būti

7 nurodytas karencijos laikas (laikas, per kurį vaistai pasišalina iš gyvulio organizmo arba jų sumaž÷ja tiek, kad nebeįmanoma aptikti, ir jie nedaro įtakos gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktų technologin÷ms savyb÷ms, bei vartotojų sveikatai). Tik pasibaigus karencijos periodui, gyvuliai ir jų produktai gali būti parduodami (Report and Qualitative Risk Assessment by the Committee for Veterinary Medicinal Products, 1999). Tačiau daugelis vaistų gyvulio organizme laikosi ilgiau negu nurodyta vartojimo instrukcijoje, ir tuo laiku tiriami bandiniai inhibitorinių medžiagų atžvilgiu būna teigiami. Pavyzdžiui penicilinas piene - rekomenduojamas karencijos laikas yra 72 valandos, tačiau šio vaisto likučių piene galima aptikti net iki 18 dienų (Matusevičius, Špakauskas, 2005).

2008 m. lapkričio 18 dieną Europoje prad÷ta min÷ti diena, skirta padidinti visuomen÷s supratimą apie atsakingą, pagrįstą ir tikslingą antibiotikų naudojimą, kad būtų išsaugotas jų efektyvumas ateičiai.

Lietuvos Valstybin÷ maisto ir veterinarijos tarnyba 2010 metus paskelb÷ maisto kokyb÷s metais, taip pat 2010 metais prad÷jo vykdyti „Tetraciklino grup÷s antibiotikų prevencijos programą“, taip pat sugriežtintos Pieno supirkimo taisykl÷s. Jomis padidinta atsakomyb÷ už nekokybišką pieną. Visomis šiomis priemon÷mis bus griežtai kontroliuojami pieno ūkiai ir pieno perdirbimo įmon÷s d÷l žalio pieno, kuriame nustatytos inhibitorin÷s medžiagos, panaudojimo. Prevencijos programos suteikia garantijų, kad užteršta žaliava nepateks perdirbimui. Kita vertus, visiškai nuo antibiotikų apsaugoti žaliavos neįmanoma - aflotoksinų (penicilino) gali būti tiesiog pašaruose.

1.1.1 A m f e n i k o l i a i

Klinikin÷je praktikoje naudojami : chloramfenikolis (toliau CAP), tiamfenikolis ir florfenikolis. Jie veikia Gr- ir Gr+ mikrobus. CAP, dar žinomas kaip levomicetinas arba chloromicetimas. Sisteminis pavadinimas-2,2-dichlor-N-[(1R,2R)-1-hidroksi-2-hidroksimetil-1-(nitrofenetil)]acetamidas). Tai balta kristalin÷ medžiaga, gerai tirpsta alkoholiuose (metanolis, etanolis), etilacetate, acetone, netirpi benzene ir petrolio eteryje. Vaistas yra labai stiprus antibiotikas ir būna taikomas gydant sunkius bakterinius susirgimus. Jį vartojant liekanos randamos įvairiuose audiniuose, organuose, piene, kiaušiniuose. CAP pasižymi stipriu šalutiniu poveikiu: gali sukelti aplastinę anemiją, kaulų čiulpų disfunkciją, kepenų ir širdies darbo sutrikimus naujagimiams (Commission Decision 2002/657/EC, 2003). Europos Sąjunga, pagal toksikologinių CAP tyrimų duomenis (WHO Food Additives series, 1988), nuo 1994 m. uždraud÷ naudoti šį vaistą veterinarijoje maistui auginamų gyvūnų gydymui.

8 O2N C-C-CH2OH H NH-C-CHCl2 O H OH

1 pav. Chloramfenikolio struktūrin÷ formul÷ (Matusevičius, Špakauskas, 2005)

Kadangi CAP molekul÷je esanti nitro grup÷ sukelia aplastinę žmonių anemiją, buvo bandoma pakeisti chloramfenikolio molekul÷s struktūrą, bet išsaugoti jo gerą antimikrobinį aktyvumą ir poveikį. Buvo susintetinta keletas naujų junginių, tokių kaip tiamfenikolis. Jame (NO2) grup÷ pakeista metilsulfonilu (HC3-SO2). O florfenikolio struktūroje ir šonin÷je

grandin÷je OH grup÷ pakeista fluoro atomu (F).

C-C-CH2OH H NH-C-CHCl2 O H OH H3C-SO2

2 pav. Tiamfenikolio struktūra (Matusevičius, Špakauskas, 2005)

H NH-C-CHCl2 O

H OH

H3C-SO2 C-C-CH2F

3 pav. Florfenikolio struktūra (Matusevičius, Špakauskas, 2005)

Šie pakeitimai jų struktūroje panaikino toksinį poveikį į kaulų čiulpus, o antimikrobinis aktyvumas išliko toks pat. Šiuos du amfenikolius leidžiama naudoti produkcijos gyvūnams (Matusevičius, Špakauskas, 2005). Jų DLK yra nurodyti Komisijos reglamente (EU) No 37/2010.

9 1.1.2 S u l f o n a m i d a i

Sulfonamidai (toliau SA) – sintetiniai antibiotikai, žinomi nuo 1932 m. Jiems priskiriama virš 20 junginių. Jų chemin÷s struktūros pagrindas yra paraaminobenzoin÷ rūgštis. Jie yra hidrofolio rūgšties biosintez÷s inhibitoriai. Taip pat pasižymi kai kuriomis bendromis chemin÷mis savyb÷mis: tirpūs praskiestose neorganin÷se rūgštyse (pvz., HCl), mažai tirpūs nepoliniuose organiniuose tirpikliuose, tirpūs alkoholiuose.

Veterinarijoje SA naudojami kaip antimikrobiniai preparatai bei augimo skatintojai. Tai vieni plačiausiai naudojamų vaistinių preparatų (W.M.A. Niessen J., 1998).

SA likučiai gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktuose susidaro d÷l netikslaus dozavimo, vartojimo būdo ir išlaukos trukm÷s. Gyvūnams, kurie gavo sulfonamidus su pašaru, išlauka rekomenduojama iki 15 dienų. SA likučiai gali žmon÷ms sukelti toksines ir alergines reakcijas (J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010). Likučiai maisto produktuose įtakoja atsparių mikrobų vystymąsi, ypač Enterobacteriacae spp. (Matusevičius, Špakauskas, 2005).

D÷l jų kancerogeninių savybių bei d÷l to, kad žmogaus organizmas gali nesunkiai adaptuotis jų poveikiui, šie preparatai yra išvardinti Komisijos reglamento 37/2010 I priede. DLK išreiškiama kaip visų m÷ginyje rastų sulfonamidų suma ir jos reikšm÷ yra 100 µg/kg.

10 4 pav.Bendra sulfonamidų substruktūra ir atskirų junginių

pavyzdžiai: 1 – sulfacetamidas (SAC), 2 – sulfadiazinas (SDZ), 3 – sulfapiridinas (SPY), 4 – sulfatiazolas (STZ), 5 – sulfamerazinas (SMR), 6 – sulfametazinas (SMT), 7 – sulfametizolas (SMZ), 8 – sulfametoksazolas (SMX), 9 – sulfadimetoksinas (SDM), 10 –

11 1.1.3 T e t r a c i k l i n a i

Jie buvo atrasti atradus penicilinus ir sulfonamidus. Pirmasis tetraciklinų junginys buvo chlortetraciklinas, išskirtas iš aktinomicetų Streptomyces aureofaciens kultūros 1940 m. Jį išskyr÷ Loidas Konoveris.

Tetraciklinai sudaryti iš keturių žiedų ir skirtingose vietose prijungus įvairius radikalus gaunami nauji junginiai. Jie visi turi vienodas savybes ir panašų antimikrobinį veikimą. Tetraciklinai yra plataus veikimo spektro, gerai veikia tiek Gr+, tiek ir Gr- bakterijas. Tetraciklinai – geltoni amorfiniai milteliai. Blogai tirpasta vandenyje. Milteliai esti patvarūs, o jų vandeniniai tirpalai - ne. Su dvivalenčių ir trivalenčių metalų ( geležies, aliuminio, vario), taip pat magnio ir kalcio katijonais jie sudaro beveik netirpius ir antimikrobiškai neaktyvius chelatų kompleksus. Klinikin÷je praktikoje naudojama: tetraciklinas, chlortetraciklinas, oksitetraciklinas, doksiciklinas ir kt.

Chlortetraciklinas veikia bakteriostatiškai, slopindamas bakterijų citoplazmos baltymų sintezę. D÷l jo žalingo poveikio gali sutrikti virškinamojo trakto veikla, išsivystyti disbakterioz÷ (J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010). Kartais gali pasireikšti alergin÷s reakcijos, fotosensibilizacija. (WHO, 2002). Gali geltonai arba rudai nudažyti dantų užuomazgas, sukelti emalio hipoplaziją (Matusevičius, Špakauskas, 2005, Kaltenis 1993).

5 pav. Chlortetraciklino struktūra

Demeklociklinas - veikia bakteriostatiškai, slopindamas bakterijų baltymų sintezę. Jis gerai rezorbuojasi iš virškinamojo trakto. Demeklociklinas koncentruojasi kepenyse ir tulžyje (J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010).

12 6 pav. Demeklociklino struktūra

Doksiciklinas – plataus spektro sintetinis antibiotikas susintetintas iš oksitetraciklino (Matusevičius, Špakauskas, 2005).

7 pav. Doksiciklino struktūra

Oksitetracikliną 1953 m. atrado Robert B. Woodward. Tai natūralus plataus veikimo spektro tetraciklinų grup÷s antibiotikas. Koncentruojasi kepenyse ir tulžyje (J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010).

13 Tetraciklinas – natūralus plataus veikimo spektro antibiotikas. Veikia bakteriostatiškai, slopindamas bakterijų baltymų sintezę (Matusevičius, Špakauskas, 2005; J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010).

9 pav. Tetraciklino struktūra

Anksčiau tetraciklinai buvo naudojami kaip augimo stimuliatoriai, tačiau d÷l jų likučių gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktuose ir neigiamo poveikio žmogaus sveikatai, dabar naudojami tik gydymui. Nors jie yra toksiški, bet jie laikomi vienais iš saugiausių antibiotikų sergantiems gydyti (Matusevičius, Špakauskas, 2005; Kaltenis 1993; J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010).

1.1.4 C h i n o l o n a i i r f l u o r o c h i n o l o n a i

Chinolonai - sintetiniai plataus veikimo spektro antimikrobiniai vaistai. Pirmoji šios grup÷s vaistin÷ medžiaga buvo nalidikso rūgštis. Iššifravus jos cheminę sud÷tį buvo susintetinta visa eil÷ jos darinių ir jie prad÷ti vadinti fluorochinolonais. Fluorochinolonais pavadinti tod÷l, kad jų žiedo šeštoje pad÷tyje yra prijungtas fluoro atomas.

Fluorochinolonai - sintetiniai antimikrobiniai dariniai. Dažniausiai naudojami: enrofloksacinas, ciprofloksacinas, marbofloksacinas, danofloksacinas, ciprofloksacinas, norfloksacinas ir kt.

Veterinarijoje naudojami seniai, jiems vystosi atsparūs mikrobai. Jų likučiai gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktuose gali įtakoti atsparių mikrobų perdavimą žmon÷ms (Matusevičius, Špakauskas, 2005, J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010).

14 1.1.5 Penicilinai

10 pav. Penicilinų struktūra (Baranauskas L. 2005)

1928 metais mokslininkas Aleksandras Flemingas, dirbdamas savo laboratorijoje pasteb÷jo, kad Penicillium šeimos grybai (kasdieniniame žmogaus gyvenime sutinkami pel÷siai) pasižymi antimikrobin÷mis savyb÷mis. 1941 metais pirmą kartą buvo patikrintas penicilino poveikis žmogui. Pasitvirtinus rezultatams, kad penicilinu galima gydyti stafilokokines infekcijas, prasid÷jo antibiotikų era.

Penicilinai pasižymi specifiniu poveikiu į mikrobo apvalkal÷lį ir beveik neturi poveikio į gyvūno ląstel÷s apvalkal÷lį. Gerai veikia Gr+ bakterijas, taip pat naudojami esant ypač intensyviam bakterijų vystymuisi.

Ilgai naudojant penicilinus terapin÷mis doz÷mis ar žmogui gaunant juos mažais kiekiais su gyvulin÷s kilm÷s maistu, galima žmogų sensibilizuoti ir jis jiems tampa jautrus. Sensibilizacijos laipsnis priklauso nuo doz÷s dydžio, naudojimo ar patekimo trukm÷s (J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer, 2010).

1.2 Veterinarinių vaistų likučiai maiste, jų kontrol÷

Veterinarinis vaistas – vaistin÷ medžiaga ar jų mišinys paruoštas atitinkamame pavidale ar vaisto formoje ir skirtas gyvūnams gydyti ar ligų profilaktikai. Vaistin÷s medžiagos ar jų mišiniai, kurie gali būti naudojami gyvūnams, siekiant nustatyti diagnozę ar atstatyti, koreguoti ar modifikuoti gyvūnų fiziologines funkcijas, taip pat laikomi veterinariniais vaistais (Codex Alimentarius Commission, 2009). Jie gali būti skiriami tik nustačius ligos diagnozę bei įvertinus ligos suk÷l÷jų jautrumą. Be to atskiri veterinariniai vaistai naudojami kaip pašarų priedai.

Naudojami veterinariniai vaistai kurį laiką išlieka gyvūno organizme, kaupiasi jame ir gali patekti į žmogaus maistą – m÷są bei pieną. Tod÷l vaistų likučių problema aktuali visame

15 pasaulyje. Codex Alimentarius Komisija paruoš÷ ir kiekvienais metais atnaujina duomenų bazę, nustatančią veterinarinių vaistų likučių DLK gyvūnin÷s kilm÷s produktuose

(www.codexalimentarius.net/vetdrugs/data/index.html. Prieiga per internetą 2010 m. kovo 4 d.).

Siekiant užtikrinti saugaus maisto mainus (prekybą), pasaulin÷ prekybos organizacija inicijavo tarptautinį sanitarinių ir fitosanitarinių priemonių susitarimą, kuris leidžia kiekvienos šalies vyriausybei nusistatyti moksliškai pagrįstus reikalavimus maisto saugai savo šalyje, atsižvelgiant į kitų tarptautinių organizacijų siūlymus/rekomendacijas. Susitarimas įgalioja kiekvieną jį pasirašiusią šalį, užtikrinti, kad maistas jos rinkoje yra saugus, nepriklausomai nuo to, ar jis pagamintas šalies viduje, ar importuotas iš trečiųjų šalių (World Trade Organisation, 1995). Lietuvoje galioja tie patys reikalavimai ir DLK kaip ir ES, kurioje dauguma DLK yra griežtesn÷s, negu rekomenduoja Codex Alimentarius. Europos Komisija yra pri÷musi reglamentą Nr. 37/2010 d÷l farmakologiškai aktyvių medžiagų, jų klasifikacijos ir didžiausios leidžiamosios koncentracijos gyvūniniuose maisto produktuose ir eilę kitų svarbių dokumentų, reglamentuojančių veterinarinių vaistų likučių kiekį. Veterinarinių vaistų likučių leistini kiekiai nurodyti 1 priede.

Kylant potencialiai gr÷smei vartotojų sveikatai, buvo prad÷ta kurti aplinkos ir maisto produktų monitoringo sistema. ES šalyse tai reglamentuoja 1996 m. balandžio 29 d. Tarybos direktyva 96/23/. ir nuo 1997 metais prad÷ta veterinarinių vaistų likučių steb÷sena. Buvo parengti cheminių medžiagų radimo bei identifikavimo metodai, įsteigtas ES referentinių ir nacionalinių referentinių laboratorijų tinklas bei nustatytos jų likučių, nekenksmingų vartotojui, lygio ribos – didžiausia leistina koncentracija (DLK). Dalis veterinarinių vaistų uždrausta naudoti žmogaus maistui auginamų gyvūnų gydimui. Tai Aristolochia spp. ir jos preparatai, Chloramfenikolis, Chloroformas, Chlorpromazinas, Dapsonas, Dimetridazolas, Kolchicinas, Metronidazolas, Nitrofuranai (įskaitant furazolidoną), Ronidazolas (Commission Regulation 37/2010, 2010).

1.3 Vaistų likučių keliamas pavojus ir prevencija

Vaistų likučiai bei jų metabolitai gali sukelti įvairius neigiamus poveikius: a) alergines/toksines reakcijas į veterinarinių vaistų likučius;

b) chroniškus toksinius efektus, kai ilgą laiką gaunamos nedidel÷s antibiotikų doz÷s; c) padeda išsivystyti antibiotikams atsparioms bakterijoms;

16 d) suardo natūralią mikrobinę žarnyno ekosistemą, naikindami žmogui naudingas

bakterijas (M. Ellin Doyle, 2006).

Veterinarinių vaistų likučiai įtakoja gamybos procesus:

a) gaminant fermentuojamus m÷sos produktus žaliavoje buvę antibakterinių medžiagų likučiai iškreipia vykstančius mikrobiologinius procesus, apsunkina gamybos procesą, pakenkia galutinio produkto kokybei. Rūkytoms dešroms naudojant m÷są su antibakterinių medžiagų likučiais, sutrinka brendimo metu vykstantys mikrobiologiniai procesai ir nukenčia jų kokyb÷;

b) gaminant pieno produktus antibiotikai turi neigiamą poveikį pagamintų produktų kokybei. Jie slopina sūrių, jogurtų, sviesto ir kitų pieno produktų gamyboje naudojamos mikrofloros veiklą, mažina pieno sutraukinimą.

Apdorojant ir kaitinant m÷są kai kurie preparatai, tarp jų tetraciklinas, sulfonamidai, aktyvumo nepraranda. Po terminio apdorojimo penicilinas praranda antibakterinį aktyvumą, tod÷l jo negalima aptikti tradiciniais mikrobiologiniais tyrimų metodais, tačiau susidarę penicilino skilimo produktai turi ne tik tokį pat alergizuojantį poveikį, bet yra toksiškesni, nei pats penicilinas. Nitroimidazolai atskiruose produktuose skyla, jų koncentracija maž÷ja (Matusevičius, Špakauskas, 2005, Rose MD, 1997, 1999).

Prevencija – duodant gyvuliams antibakterinių preparatų būtina laikytis konkretaus vaisto vartojimo instrukcijos, kurioje karencijos laikas turi būti nurodytas. Gyvulių augintojas antibakteriniais vaistais gydyti gyvūnus gali tik rekomendavus veterinarijos specialistui (Jokimas, Sudikien÷, 2007).

1.4 Likučių kontrol÷, normavimas

Veterinariniais vaistais gydant gyvūnus, gyvūniniuose maisto produktuose gali būti nustatomos farmakologiškai aktyvių medžiagų liekanos. 1996 m. balandžio 29 d. Tarybos direktyva 96/23/EB d÷l kai kurių medžiagų ir jų liekanų gyvuose gyvūnuose ir gyvūniniuose produktuose steb÷senos reikalavimų ipareigoja valstybes nares parengti ir vykdyti nacionalinius liekanų steb÷senos planus (Council Directive 96/23/EC, 1996).

Pagal min÷tos direktyvos reikalavimus ES valstyb÷s liekanų steb÷seną vykdo nuo 1997 metų, o Lietuvoje liekanų steb÷sena prad÷ta vykdyti 1998 m. Teršalai kontroliuojami gyvulių (galvijų, avių, ožkų, kiaulių, arklių, paukščių, triušių) m÷soje, paukštienoje, žuvyje. Kontrol÷ apima pagrindines teršalų grupes.:

17 A-2. Antitiroidiniai agentai

A-3. Steroidai

A-4. Recorcilo rūgšties laktonai, t.t. ir zeranolis A-5. Beta-agonistai

A-6. EEB Nr. 37/2010 reglamento II priede nurodyti junginiai B-1. Antibakterin÷s medžiagos, t.t. ir sulfonamidai ir chinolonai

B-2. Kiti veterinariniai preparatai: antihelmintikai, kokcidiostatikai, t.t., nitroimidazolai, karbamatai ir piretroidai, sedatyviai veikiantys preparatai, nesteroidiniai vaistai.

B-3. Chloro ir fosforo organiniai junginiai, PCB, dioksinai, cheminiai elementai (sunkieji metalai), mikotoksinai, dažų grup÷s preparatai.

1.5 Steb÷sena Lietuvoje

Valstybin÷ maisto ir veterinarijos tarnyba kontroliuoja antibakterinių medžiagų naudojimą produkcijos gyvūnams ir jų likučius gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktuose. Lietuvoje kenksmingų medžiagų liekanų steb÷sena vykdoma vadovaujantis Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2003 m. liepos 22 d. įsakymu Nr. B1-646 „D÷l medžiagų ir medžiagų liekanų gyvūnuose ir gyvūniniuose produktuose steb÷senos taisyklių patvirtinimo“. Šis dokumentas į nacionalinę teisę perkelia ES direktyvos 96/23/EB ir Komisijos sprendimo 97/747/EB reikalavimus. Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas, kuris taip pat yra paskirtas nacionaline referentine laboratorija medžiagų liekanų gyvūnuose ir gyvūniniuose produktuose tyrimui, rengia kenksmingų medžiagų liekanų steb÷senos metinį planą, kuriame nurodomas privalomas paimti ir ištirti m÷ginių skaičius pagal gyvūnų rūšis ir gyvūninius produktus, taip pat pagal farmakologiškai aktyvių medžiagų liekanų ir teršalų pobūdį. Metinis liekanų steb÷senos planas yra ruošiamas metų pradžioje pagal pra÷jusių metų gyvūnų skerdimo ir produkcijos gavimo duomenis, taip pat atsižvelgiant į pra÷jusių metų kenksmingų medžiagų liekanų steb÷senos duomenų analiz÷s rezultatus, Europos Komisijos pastabas ir rekomendacijas, Centrinių referentinių laboratorijų pastabas ir rekomendacijas bei skubių pranešimų d÷l nesaugaus maisto ir pašarų duomenis. M÷ginių tyrimai atliekami Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto laboratorijose. Nustačius kenksmingų medžiagų liekanas, Valstybin÷ maisto ir veterinarijos tarnyba atlieka tyrimą bei taiko poveikio priemones, siekiant pašalinti trūkumus. Kenksmingų medžiagų liekanų steb÷sena taip pat apima eksportui skirtus gyvūnus bei gyvūninius

18 produktus. Tokiu būdu yra užtikrinamas eksportuojamų gyvūnų sveikatingumas ir gyvūninių maisto produktų sauga (Council Directive 96/23/EC, 1996, Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC, 1996).

19 2. DARBO ATLIKIMO VIETA IR METODIKA

Eksperimentinis darbas buvo atliktas Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto Laboratorijos departamento Cheminių tyrimų skyriuje.

Laikotarpyje nuo 2009 11 01 iki 2010 03 31 atlikau 11 žaliavinio pieno tyrimų – juose ieškojau sulfonamidų. M÷giniai buvo tiriami aukšto efektyvumo skysčių chromatografijos (ESCh- UV/VIS) metodu.

Veterinarin÷s maisto saugos magistrantūros studijų programos praktikos metu teko praktiškai susipažinti su m÷ginių ÷mimu, kurį trumpai aprašysiu ir savo magistriniame darbe.

2.1. M÷ginių ÷mimas

M÷ginių ÷mimas vienas svarbiausių steb÷senos etapų, kurį reikia atlikti tiksliai laikantis nustatytų reikalavimų. Nuo 2009 m. spalio 1 d. įsigaliojo naujos maisto ir/ar pašarų, medžiagų liekanoms bei gyvūnų užkrečiamoms ligoms tirti m÷ginių pa÷mimo aktų formos. Jos užtikrina vienodą dokumentų pildymo tvarką. M÷ginių pa÷mimo tirti akte nurodomi visi duomenys, apibūdinantys pristatytą m÷ginį.

M÷ginius laboratoriniam ištyrimui paimti gali tik teritorin÷s VMVT įgaliotas pareigūnas, kuris turi specialų pasiruošimą m÷ginių ÷mimo srityje.

M÷ginių ÷mimo metu dalyvauja ir ūkio subjekto atsakingi asmenys. arba jų atstovai, turintys rašytinius įgaliojimus.

M÷ginių pa÷mimo tirti aktas rašomas tik vienam m÷giniui. Surašomi trys to akto egzemplioriai. Pirmas akto egzempliorius pristatomas su m÷giniu į laboratoriją, antras egzempliorius – teritorinei VMVT, trečias – paliekamas gamintojui, platintojui, paslaugos teik÷jui, importuotojui ar jų įgaliotam asmeniui (VMVT direktoriaus įsakymas Nr. B-296, 2009).

Kiekviena į laboratoriją siunčiama tara su m÷giniu (-iais) turi būti užplombuota (m÷ginių pa÷mimo akte nurodomas m÷ginio plombos Nr. ir/ar m÷ginio tapatumo nustatymo Nr., esantis ant specialios m÷giniui skirtos pakuot÷s ar taros) ir su pritvirtinta etikete, atitinkančia m÷ginių pa÷mimo akte nurodytus duomenis. M÷ginių transportavimas vyksta VMVT nustatyta tvarka, perdavimas pagal laboratorijos paruoštas procedūras.

20 2.2 Sulfonamidų analiz÷ piene ESCh metodu

Sulfonamidai piene nustatomi aukšto efektyvumo skysčių chromatografija (ESCh- UV/VIS). Ši procedūra taikoma sulfonamidų grup÷s antibiotikų (sulfacetamido, sulfadiazino, sulfatiazolo, sulfamerazino, sulfametazino, sulfametizolo, sulfametoksazolo, sulfabenzamido, sulfadimetoksino) kontrolei piene ir pieno miltuose. Metodas leidžia kiekybiškai nustatyti ir patvirtinti aukščiau išvardintas medžiagas.

2.2.1 Aparatūra

Pagrindin÷ įranga:

• Aukšto efektyvumo skysčių chromatografas su UV/VIS detektoriumi ir pokolon÷liniu derivatizatoriumi - „Shimadzu“. Chromatografo darbinis sl÷gių intervalas ne mažesnis nei: 0-400 bar. Kolon÷l÷s temperatūra nekontroliuojama (kambario temperatūra).

• Chromatografin÷ kolon÷l÷ - “ACE “ 5 C18 - HL, 250x4,6 mm, dalelių dydis 5 µm.

.

21 12 pav. Aukšto efektyvumo skysčių chromatografas

Bandymo įrenginiai ir matavimo priemon÷s.

• Nugarinimo sistema „Zymark Turbo Vap LV“

• Mechanin÷s pipet÷s 20 – 200 µl, 100 -1000µl, 500-5000µl ir 1000-10000µl tūrio. • Vortex tipo maišykl÷ „IKA Labortechnic Minisheker MS2“ 0-2500 aps/min. • Orbitinis kratytuvas „Edmund Buhler KS-15“ 0 – 420 aps/min

• Centrifuga „Hettich Zentrifugen Rotina 46R 0-4000 aps/min • Laboratorin÷s svarstykl÷s „AND GX - 400”

• Analitin÷s svarstykl÷s „SCALTEC” SBC 31

• Šaldytuvas su šaldymo kamera. Tempatūros: Kamera: -30 - -18oC, šaldytuvas 2-8oC

• Vakuuminis siurblys „Edwards DLab10-8“ • Vakuumin÷ skysčių filtravimo sistema

• Įvairaus tūrio matavimo kolbos (etaloniniams tirpalams skiesti A klas÷s) • Matavimo cilindrai 100 – 1000 ml talpos.

22 • Stikliniai m÷gintuv÷liai nugarinimo sistemai „Zymark“ 10 ml talpos.

• 0,2µm 45-50 mmØ membraniai filtrai

2.2.2 Procedūra Procedūros atlikimas:

• M÷ginio paruošimas:

• Į vienkartinius polipropileninius 50 ml talpos m÷gintuv÷lius įpilama 5 ml homogenizuoto m÷ginio.

• Nestipriai maišomas „vortex“ tipo maišykle (100-1400 aps/min, apie 10s) ir palaukiama 10 min.

• Į m÷gintuv÷lį pripilama 30 ml ekstrakcijos tirpalo (0,2 M amonio acetatas, pH = 5,35) ir toliau kratomas ant orbitinio kratytuvo 30 min., esant 350 aps/min.

• Centrifuguojama 10 minučių, esant 4000 aps/min (+ 4 oC). • Ekstraktas valomas KFE (Strata X).

• KFE procedūra:

• Kolon÷l÷s paruošiamos, jas plaunant 10 ml MeOH ir paskui 10 ml vandens ir 6 ml ekstrakcijos tirpalo (0,2 M amonio acetatas, pH = 5,35), vakuumas naudojamas tik džiovinimui.

• Per kolon÷les praleidžiamas ekstrakatas (30 ml).

• Kolon÷l÷s plaunamos 10 ml ekstrakcijos tirpalu (0,2 M amonio acetatas, pH = 5,35), su kuriuo prieš tai dar praplautas polipropileninis m÷gintuv÷lis, kuriame buvo ekstraktas (jei esama nuos÷dų tai prieš tai dar centrifuguojama 10 min. 40000aps/min.greičiu)

• Kolon÷l÷s džiovinamos, naudojant maksimalų vakuumą apie 10 min.

• Analit÷ iš kolon÷lių eliuojama 7 ml acetonitrilo į nugarinimo m÷gintuv÷lius. • Eliuatas nugarinamas iki sausos liekanos azoto srov÷je, esant 40oC temperatūrai. • Sausa liekana tirpinama 0.5 ml tirpinimo tirpalo, filtruojama ir perpilama į

23 • Analizuojama ESCh-UV/VIS sistema. Injekcijos tūris 100 µl.

2.3. Eksperimento rezultatų analiz÷ 1 lentel÷. Eksperimento tyrimų rezultatai

Eil. Nr Apskritis Tiriamoji medžiaga Nustatytas kiekis Leistina koncentracija Metai

1.

Taurag÷s apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

2.

Taurag÷s apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

3.

Taurag÷s apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

4.

Klaip÷dos apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

5.

Marijampol÷s apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

6.

Kauno apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

7.

Vilniaus apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

8.

Telšių apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

9.

Šiaulių apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2009

10.

Telšių apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2010

11.

Kauno apskritis Sulfonamidai Nerasta 100 µg/kg 2010

Buvo ištirta 11 m÷ginių. Sulfonamidų piene nebuvo nustatyta. Panašių tyrimų rezultatų buvo galima tik÷tis, nes teigiami atvejai nesiekia 1 % tirtų m÷ginių. Su kitų veterinarinių vaistų analiz÷s metodais taip pat susipažinau, bet savarankiškai tyrimų neatlikau, nes pagal instituto kokyb÷s sistemos reikalavimus, kiekvieno metodo įsisavinimui reikia ne mažiau 20 darbo dienų apmokymo (NMVRVI Kokyb÷s vadovas). Nor÷damas išsamiau įvertinti maisto produktų taršą, atlikau 2004-2009 metais NMVRVI padarytų tyrimų rezultatų analizę. Jos metu peržiūr÷jau archyve saugomas ataskaitas ir pirminius tyrimų duomenis, surinkau informaciją apie tų metų laikotarpyje atliktus tyrimus, nustatant veterinarinių vaistų likučius.

24 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ ANALIZö

Vienas svarbiausių saugaus gyvūninio maisto gavimo būdų yra užtikrinti, kad jame nebūtų teršalų, veterinarinių vaistų liekanų. Tai yra kiekvieno maisto gamintojo, gyvūno augintojo ir privataus veterinarijos gydytojo, dirbančio su produkcijos gyvūnais, atsakomyb÷. Kad maisto produktuose nebūtų vaistų ar kitokių nepageidaujamų medžiagų liekanų, gyvulininkyst÷s produkcijos gamintojai informuojami apie tokių medžiagų žalą, kokiomis priemon÷mis to galima išvengti. Nors tyrimų metodai vis labiau tobul÷ja ir tampa įmanoma nustatyti vis mažesnes medžiagų koncentracijas, m÷ginių skaičius, su veterinarinių vaistų likučiais, viršijančiais DLK, sudaro tik nežymią tiriamų m÷ginių dalį. Tod÷l taršai vertinti buvo apžvelgti ir apibendrinti 2004 – 2009 metų laikotarpyje atliktų m÷ginių tyrimų rezultatai, nustatyti tiriant žaliavinį pieną, galvijų m÷są, kepenis ir inkstus.

3.1 Žaliavinio pieno tyrimai

2004 - 2009 metų laikotarpyje NMVRVI buvo atlikti 1363 m÷ginių tyrimai ieškant veterinarinių vaistų likučių žaliaviniame piene, 18 m÷ginių nustatyti veterinarinių likučių kiekiai viršijo DLK (1,3 % visų m÷ginių skaičiaus). Duomenys pateikti 1 lentel÷je, kiekvienais metais atliktų tyrimų skaičius pavaizduotas 1 grafike.

2 lentel÷. Žaliavinio pieno m÷ginių tyrimų rezultatai 2004 – 2009 m.

2004 metai 2005 metai 2006 metai 2007 metai 2008 metai 2009 metai

Medžiagos pavadinimas A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * Sulfonamidai 16 14 30 30 30 25 Penicilinai 24 1 34 38 6 45 2 35 30 3 Tetraciklinai 20 19 28 31 2 27 26 1 Chloramfenikolis 86 80 64 2 46 65 1 57 Antihelmintikai 42 49 39 43 43 41 NVNU** 52 52 51 51 Viso: 188 1 196 - 251 8 247 4 251 1 230 4

Rasta* - nustatytas veterinarinių likučių kiekis viršijo DLK NVNU** - Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo

25

NVNU* - Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo

1 grafikas. Žaliavinio pieno m÷ginių tyrimų skaičius 2004 – 2009 m.

2004 - 2009 metų laikotarpyje ieškant sulfamidų buvo ištirti 145 žaliavinio pieno m÷giniai, tačiau n÷ viename jų nebuvo rasta kiekių, viršijančių DLK. Penicilinų ieškota 206 m÷giniuose, rasta dvylikoje m÷ginių. Tetraciklinų ieškota 151 m÷ginyje, rasta trijuose Chloramfenikolio ieškota 398 m÷giniuose. Nors jis neturi būti naudojamas maistinių galvijų gydymui, tačiau jo p÷dsakų vis tik yra aptinkama žaliaviniame piene. Pagal NMVRVI 2004 2009 metų duomenis, buvo nustatyti trys teigiami atvejai.

3 lentel÷. Teigiami m÷giniai, kurie buvo nustatyti tiriant žaliavinį pieną:

Eil. Nr

Apskritis Tiriamoji

medžiaga

Nustatytas kiekis Leistina koncentracija

Metai

1. Šiaulių apskritis Penicilinai Penicilinas V

4,1± 0,8 µg/kg

4 µg/kg 2004

2. Kauno apskritis Penicilinai Ampicilinas 9,21

µg/kg

4 µg/kg 2006

26 3 lentel÷s tęsinys

3. Kauno apskritis Penicilinai Kloksacilinas

63,1 µg/kg

13 µg/kg 2006

4. Marijampol÷s apskritis Penicilinai Amoksicilinas

20,4 µg/kg

4 µg/kg 2006

5. Marijampol÷s apskritis Penicilinai Penicilinas G 6,6 µg/kg

4 µg/kg 2006

6. Šiaulių apskritis Penicilinai Penicilinas G 8,9

µg/kg

4 µg/kg 2006

7. Vilniaus apskritis Penicilinai Penicilinas G 20,7

µg/kg

4 µg/kg 2006

8. Panev÷žio apskritis Penicilinai Penicilinas G 6,8

µg/l

4 µg/kg 2007

9. Panev÷žio apskritis Penicilinai Penicilinas G 5,23

µg/l

4 µg/kg 2007

10. Šiaulių apskritis Penicilinai Penicilinas G 16,4

µg/l

4 µg/l 2009

11. Šiaulių apskritis Penicilinai Amoksicilinas 4,5

µg/l

4 µg/l 2009

12. Marijampol÷s apskritis Penicilinai Klokcsacilinas 39,7 ug/l

13 µg/l 2009

13. Marijampol÷s apskritis Tetraciklinai Oksitetraciklino ir e –

oksitetraciklino suma 51,22 µg/l

21 µg/kg 2007

14. Klaip÷dos apskritis Tetraciklinai Oksitetraciklino ir e –

oksitetraciklino suma 43,46 µg/l

21 µg/kg 2007

15. Marijampol÷s apskritis Tetraciklinai Oksitetraciklino ir e-oksitetraciklino

suma 76,8 g/l

21 µg/kg 2009

16. Panev÷žio apskritis Chloramfenikolis 0,08 µg/kg Neturi būti 2006

17. Vilniaus apskritis Chloramfenikolis 0,06 µg/kg Neturi būti 2006

18. Panev÷žio apskritis Chloramfenikolis 0,04 µg/kg Neturi būti 2008

Daugiausia šių medžiagų teigiamų naudojimo atvejų nustatoma rugpjūčio – lapkričio m÷nesiais. Tai gali būti aiškinama tuo, kad gamintojai siekia realizuoti kuo daugiau savo

27 produkcijos ir imasi d÷l to per didel÷s veterinarin÷s profilaktikos ir nesilaiko rekomenduojamų karencijos terminų. Antihelmintikų ieškota 257 m÷giniuose - visuose tirtuose m÷giniuose nenustatyta kiekių, viršijančių DLK. NVNU grup÷s medžiagų ieškota 206 m÷giniuose, tačiau tai pat n÷ viename m÷ginyje nerasta kiekių, viršijančių DLK.

Žaliavinio pieno tarša veterinarinių vaistų likučiais Lietuvoje yra panaši kaip ir ES šalyse. Teigiamų atvejų skaičius nesiekia 2 %, pvz.: Jungtin÷je Karalyst÷je 2008 metais 443 tirtuose m÷giniuose nustatytas tik vienas atvejis kai antibakterinių medžiagų kiekis viršijo DLK (Annual Report on Surveillance for Veterinary Residues in Food in the UK, 2008). Tais pačiais metais RASFF sistemoje buvo gautas tik vienas pranešimas apie piene nustatytą veterinarinių vaistų likučių kiekį, viršijantį DLK - Cephalonium - DLK 20 mikrogramų - rasta 50 mikrogramų [2,5 karto viršyta norma] (The Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) Annual Report, 2008).

3.2 Galvijų raumens tyrimai

2004 - 2009 metų laikotarpyje NMVRVI buvo atliktas 661 m÷ginio tyrimas ieškant veterinarinių vaistų likučių galvijų m÷soje (raumenyje), 6 m÷giniuose nustatyti veterinarinių likučių kiekiai viršijo DLK (0,9 % visų tyrimų skaičiaus). Per min÷tą laikotarpį buvo ieškoma sulfonamidų, penicilinų, tetraciklinų, chloramfenikolio, antihelmintikų, o nuo 2006 metų ir NVNU (nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo) grup÷s medžiagų. Duomenys pateikti 2 lentel÷je, kiekvienais metais atliktų tyrimų skaičius pavaizduotas 2 grafike.

4 lentel÷. Galvijų raumens m÷ginių tyrimų rezultatai 2004 – 2009 m.

2004 metai 2005 metai 2006 metai 2007 metai 2008 metai 2009 metai

Medžiagos pavadinimas A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * Sulfonamidai 24 20 1 5 2 8 33 23 Penicilinai 26 25 18 15 26 29 Tetraciklinai 4 23 29 1 3 6 5 1 Chloramfenikolis 29 26 25 18 24 22 Antihelmintikai 25 25 26 27 23 21 NVNU** 10 10 16 1 12 Viso: 108 - 119 1 113 3 81 - 128 1 112 1

Rasta* - nustatytas veterinarinių likučių kiekis viršijo DLK NVNU** - Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo

28

NVNU* - Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo

2 grafikas. Galvijų raumens m÷ginių tyrimų skaičius 2004 – 2009 m.

Tiriant galvijų raumenį daugiausia d÷mesio skiriama chloramfenikoliui, penicilinams, tetraciklinams, antihelmintikams.

2004 – 2009 metais iš viso buvo ištirta 113 m÷ginių, kuriuose buvo ieškota sulfonamidų, 70 m÷ginių ieškota tetraciklinų, penicilinų - 139 m÷giniuose, chloramfenikolio – 144 m÷giniuose, antihelmintikų – 147 m÷giniuose, NVNU grup÷s medžiagų – 48 m÷giniuose.

5 lentel÷. Teigiami m÷giniai, kurie buvo nustatyti tiriant galvijų raumenį:

Eil. Nr

Apskritis Tiriamoji

medžiaga

Nustatytas kiekis Leistina koncentracija

Metai

1. Vilniaus apskritis Sulfonamidai 2,3 mg/kg 100 µg/kg 2005

2. Taurag÷s apskritis Sulfonamidai 2,1 mg/kg 100 µg/kg 2006

3. Taurag÷s apskritis Sulfonamidai 5,0 mg/kg 100 µg/kg 2006

4. Marijampol÷s apskritis Tetraciklinai Oksitetraciklinas 168,8 µg/kg

100 µg/kg 2006

5. Šiaulių apskritis Tetraciklinai Chlortetraciklinas 55,75 mg/kg

100 µg/kg 2009

6. Panev÷žio apskritis NVNU* Diklofenakas

29 µg/kg

5 µg/kg 2008

29 Galvijų m÷sos tarša veterinarinių vaistų likučiais Lietuvoje yra panaši kaip ir ES šalyse. Teigiamų atvejų skaičius nesiekia 1 %, pvz.: Jungtin÷je Karalyst÷je 2008 metais nenustatyta n÷ vieno antibakterinių medžiagų kiekio viršijimo DLK atvejų (Annual Report on Surveillance for Veterinary Residues in Food in the UK, 2008).

3.3 Galvijų kepenų tyrimai

2004 - 2009 metų laikotarpyje NMVRVI buvo atlikti 667 m÷ginių tyrimai ieškant veterinarinių vaistų likučių galvijų kepenyse. Teigiamų atvejų nebuvo nustatyta. Duomenys pateikti 3 lentel÷je, kiekvienais metais atliktų tyrimų skaičius pavaizduotas 3 grafike.

6 lentel÷. Galvijų kepenų m÷ginių tyrimų rezultatai 2004 – 2009 m.

2004 metai 2005 metai 2006 metai 2007 metai 2008 metai 2009 metai

Medžiagos pavadinimas A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * Chinolonai 2 5 Ivermektinas 23 43 19 28 29 Tetraciklinai 8 14 Levamizolis 24 44 37 24 28 19 Klenbuterolis 44 54 50 67 61 β agonistai 2 42 Viso: 93 - 141 - 106 - 119 - 128 - 80 -

30 3 grafikas. Galvijų kepenų m÷ginių tyrimų skaičius 2004 – 2009 m.

2004 - 2009 metų laikotarpyje ieškant chinolonų buvo ištirti 7 galvijo kepenų m÷giniai, tačiau n÷ viename jų nebuvo rasta kiekių, viršijančių DLK. Ivermektino ieškota 142 m÷giniuose – nebuvo rasta. Tetraciklinų ieškota 22 m÷giniuose - rasta nebuvo. Levamizolio ieškota 176 – nieko nerasta. Klenbuterolio ieškota 276 m÷giniuose - visuose tirtuose m÷giniuose nenustatyta kiekių, viršijančių DLK. β-agonistų medžiagų ieškota 44 m÷giniuose - nerasta kiekių, viršijančių DLK.

Tuo tarpu Jungtin÷je Karalyst÷je 2008 metais iš 550 tirtų m÷ginių dviejuose buvo nustatyta kad oksfendazolo kiekis viršijo DLK – DLK yra 500 mikrogramų/kg, o viename rasta 2090 mikrogramų/kg [4,18 karto viršijo leistiną normą], o kitame 14300 mikrogramų/kg [28,6 karto viršijo leistiną normą], bei vienas atvejis iš 339 tirtų m÷ginių, kai ivermektino kiekis viršijo DLK – DLK yra 100 mikrogramų/kg – rasta buvo 270 mikrogramų/kg [2,7 karto viršijo leistiną normą] (Annual Report on Surveillance for Veterinary Residues in Food in the UK, 2008).

31 3.4 Galvijų inkstų tyrimai

2004 - 2009 metų laikotarpyje NMVRVI buvo atlikti 346 m÷ginių tyrimai ieškant veterinarinių vaistų likučių galvijų inkstuose. Duomenys pateikti 4 lentel÷je, kiekvienais metais atliktų tyrimų skaičius pavaizduotas 4 grafike.

7 lentel÷. Galvijų inkstų m÷ginių tyrimų rezultatai 2004 – 2009 m.

2004 metai 2005 metai 2006 metai 2007 metai 2008 metai 2009 metai

Medžiagos pavadinimas A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * A tli k ta ty ri m ų R a st a * Enrofloksacinas 21 1 2 43 59 Tetraciklinai 19 41 21 38 26 17 Chinolonai 35 2 24 Viso: 40 1 43 - 64 - 97 - 61 2 41 -

Rasta* - nustatytas veterinarinių likučių kiekis viršijo DLK

4 grafikas. Galvijų inkstų m÷ginių tyrimų skaičius 2004 – 2009 m.

Tiriant galvijų inkstus daugiausia d÷mesio yra skiriama enrofloksacinui, tetraciklinams, chinolonams.

32 2004 2009 metais iš viso buvo ištirta 125 m÷giniai, kuriuose buvo ieškota enrofloksacino, 162 m÷giniuose ieškota tetraciklinų, o chinolonų, kurie prad÷ti tirti tik 2008 metais buvo ieškota 59 m÷ginyje.

8 lentel÷. Teigiami m÷giniai, kurie buvo nustatyti tiriant galvijų inkstus: Eil. Nr Apskritis Tiriamoji medžiaga Nustatytas kiekis Leistina koncentracija Metai

1. Taurag÷s apskritis Enrofloksacinas 555 µg/kg 200 µg/kg 2004 2. Kauno apskritis Chinolonai Difloksacinas

- 3891 µg/kg

800 µg/kg 2008

3. Klaip÷dos apskritis Chinolonai Difloksacinas - 1663 µg/kg

800 µg/kg 2008

Jungtin÷je Karalyst÷je 2008 metais iš 545 tirtų m÷ginių viename buvo nustatytas atvejis kai NVNU grup÷s medžiagos ibuprofeno kiekis galvijo inkste viršijo leistiną DLK – DLK yra 8 mikrogramai/kg - rasta 30 mikrogramų/kg [3,75 karto viršijo leistiną normą]. Tuo tarpu kitų gyvūnų inkstuose tokia tarša buvo nustatyta dažniau (Annual Report on Surveillance for Veterinary Residues in Food in the UK, 2008).

33

4. IŠVADOS

1. Tiriant žaliavinį pieną dažniausiai randama penicilinų ir tetraciklinų likučių, bei uždrausto galvijų gydimui naudoti chloramfenikolio. Daugiausia šių medžiagų teigiamų naudojimo atvejų nustatoma rugpjūčio – lapkričio m÷nesiais.

2. Galvijų raumenyse dažniausiai randami sulfonamidai, tetraciklinai ir NVNU grup÷s medžiagos.

3. Galvijų kepenyse veterinarinių vaistų likučių kiekiais viršijančiais didžiausią leidžiamą koncentracija nebuvo rasta.

4. Galvijų inkstuose kiekiais, viršijančiais didžiausią leidžiamą koncentraciją, buvo nustatyti enrofloksacinas ir chinolonai.

5. Analizuojant tyrimų rezultatus nenustatyta statistiškai patikimo ryšio tarp ištirtų m÷ginių skaičiaus ir m÷ginių, kuriuose randamų veterinarinių vaistų likučių kiekiai viršija didžiausią leidžiamą koncentraciją, skaičiaus.

34 5. PASIŪLYMAI

1. Naudojami veterinariniai vaistai, bei jų metabolitai gali išlikti gyvūnų organizme, kauptis jame ir patekti į žmogaus maistą, sukeldami nepageidautinas pasekmes. Tod÷l reikia pastoviai kontroliuoti veterinarinių likučių kiekį, nustatyti ir įvertinti DLK viršijimo faktus bei didžiausią riziką keliančią taršą.

2. Norint geriau ir tiksliau įvertinti gyvūnin÷s kilm÷s produktų taršą veterinarinių vaistų likučiais būtų tikslinga neapsiriboti dviem kategorijomis: „mažiau DLK“, „daugiau DLK“, o kaupti duomenų bazę apie rastus, bet neviršijančius DLK veterinarinių vaistų likučių kiekius.

35 6.

PADöKOS

Pad÷kos žodžius nor÷čiau tarti gerbiamam vadovui, dr. Jonui Miliui, už jo vadovavimą, rūpestį ir atsakomybę.

Labai ačiū NMVRVI direktoriaus pavaduotojui dr. Julijonui Petraičiui už pastabas ir patarimus.

D÷koju NMVRVI Laboratorijos departamento Cheminių tyrimų skyriaus ved÷jai Ingai Jarmalaitei bei visam kolektyvui už pagalbą man rašant šį darbą.

36 7. SUMMARY

Jonas M÷ginis

Used for bovine treatment of drug residues access to food risk in Lithuania

Lithuanian Veterinary Academy, Department Food Safety and Animal Hygiene, in 2008 - 2010.

Research supervisor – dr. Jonas Milius

Thesis contains 43 pages of explaining part with 8 tables, 12 pictures, 4 graphics and 34 literature sources.

Aim of study – evaluate the treatment of animals used drug residues access to bovine production possibility and risk in Lithuania.

In raw milk most often found the penicillin and tetracycline residues and banned the use of treatment chloramphenicol. In muscle of bovine mostly are found sulfonamides, tetracyclines and NSAID's groups substances. In liver of bovine residues of veterinary medicines in quantities exceeding the maximum allowable concentrations not have been found. In kidney of bovine, quantities exceeding the maximum allowable concentration, were determined enrofloxacin and quinolones.

Analyse the results not relate statistically significant correlation between the number of tested samples and they found to contain residues of veterinary medicines in quantities exceeding the maximum limit of the number.

On purpose to better and more accurately assess animal products pollution veterinary medicinal residue, them is not appropriate to divide into categories: „ less maximum residue levels ", or " more maximum residue levels " but collect information about found on of the cases in which not exceeding the maximum residue levels for veterinary drug residue limits.

37 8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. http://www.mothernature.com/Library/Ency/Index.cfm/Id/1455007. Prieiga per internetą 2008 m. lapkričio 18 d.

2. Food and Chemical Toxicology Volume 38, Issues 23, February 2000, Pages 255 -312 Threshold of toxicological concern for chemical substances present in the diet: A practical tool for assessing the need for toxicity testing

3. Food and Chemical Toxicology Volume 40, Issues 2-3, February-March 2002, Pages 327-385 Assessment of intake from the diet

4. David Waltner-Toews and Scott A. McEwen. Residues of antibacterial and antiparasitic drugs in foods of animal origin: a risk assessment, Preventive Veterinary Medicine Volume 20, Issue 3, August 1994, Pages 219-234. Accepted 4 January 1994, available online 14 November 2002

5. World Health Organisation Tech Rep Ser. 2006;(939):1-80, backcover.Evaluation of certain veterinary drug residues in food. Sixty-sixth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

6. World Health Organ Tech Rep Ser. 2002;911:i-vi, 1-66, back cover. Evaluation of certain veterinary drug residues in food.Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

7. Antibiotic Resistance in the European Union Associated with Therapeutic Use of Veterinary Medicines // Report and Qualitative Risk Assessment by the Committee for Veterinary Medicinal Products. London, 1999. P. 84

8. J. M. Leitner, W. Graninger, F. Thalhammer. Hepatotoxicity of antibacterials: pathomechanisms and clinical data, 2010

9. Matusevičius Algimantas, Špakauskas Vytautas. Antimikrobin÷s ir antiparazitin÷s vaistin÷s medžiagos ir vaistai veterinarijoje; Lietruvios veterinarijos akademija, Veterinarijos institutas. Kaunas : VŠĮ „Terra Publica“, 2005. 520 p.

10. Commission Decision of 13 March 2003 amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin, Official Journal of the European Communities L71 (2003) 17-18.

11. World Health Organisation. Toxicological evaluation of certain veterinary drug residues in food. WHO Food Additives series, 23 (1988)1-71.

38 13. Petras Kaltenis “Antibakteriniai preparatai” žinynas, Vilnius, “Pradai” 1993.

14. World Trade Organisation. Agreement of application of sanitary and phytosanitary measures. Geneva: WTO, 1995

15. M.Ellin Doyle, Veterinary Drug Residues in Processed Meals – Potential Health Risk, FRI Briffings, 2006

16. Rose MD, Bygrave J, Farrington WH, Shearer G.The effect of cooking on veterinary drug residues in food. Part 8. Benzylpenicillin. Analyst. 1997 Oct;122(10):1095-9 17. Rose MD, Bygrave J, Sharman M.Effect of cooking on veterinary drug residues in

food. Part 9. Nitroimidazoles. Analyst. 1999 Mar;124(3):289-94

18. Codex Alimentarius Commission. Glossary of terms and definitions (residues of veterinary drugs in foods) (2009)

19. Commission Regulation (EU) No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin

20. Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996 on measures to monitor certain substances and residues thereof in live animals and animal products

21. Directives 85/358/EEC and 86/469/EEC and Decisions 89/187/EEC and 91/664/EEC. Official Journal of European Communities, L125 (1996) 10-32.

22. Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2003 m. liepos 22d. Įsakymas Nr. B1-646 „D÷l medžiagų ir medžiagų liekanų gyvūnuose ir gyvūniniuose produktuose steb÷senos taisyklių patvirtinimo“.

23. Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos (VMVT) direktoriaus 2009 m. liepos 3 d. įsakymas Nr. B-296 (Žin., 2009, Nr. 84-3568)

24. Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos (VMVT) direktoriaus 2007 m. vasario 6 d. įsakymas Nr. B1-221 „ Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos kontroliuojamų prekių m÷ginių pa÷mimas ir pristatymas į laboratoriją “

25. Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos (VMVT) direktoriaus 2010 m. balandžio 13 d. įsakymas Nr. B1-147 „ M÷ginių duomenų registravimas ir m÷ginių pristatymas į laboratoriją “

26. Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus 2005 m. gruodžio 9 d. įsakymas Nr. B1-686 „Valstybin÷s maisto ir veterinarijos tarnybos ir jai pavaldžių įstaigų administracinių sprendimų vykdymas“.

39 28. Jokimas, Juozas; Sudikien÷, Kristina. Veterinarinių vaistų liekanos ir vaistų naudojimas maistiniams gyvūnams. - Kaunas : LVA Spaudos ir leidybos centras, 2007. - 68 p.

29. www.codexalimentarius.net/vetdrugs/data/index.html. Veterinary Drug Residues in Food. Maximum Residue Limits. Prieiga per internetą: 2010 m. kovo 4 d.

30. Regulation (EC) No 470/2009 of the European Parlament and of the Council of 6 May 2009 laying down Community procedures for the establishment of residue limits of pharmacologically active substances in foodstuffs of animal origin, repealing Council Regulation (EEC) No 2377/90 and amending Directive 2001/82/EC of the European Parlament and of the Council and Regulation (EC) No 726/2004 of the European Parlament and of the Council (Text with EEA relevance )

31. NMVRVI Kokyb÷s vadovas, 2009

32. ISSN 1392-0227. MAISTO CHEMIJA IR TECHNOLOGIJA. 2004. T. 38, Nr. 2 Inhibitorių grupių nustatymas žaliame karvių piene mikrobiologiniais metodais

33. Annual Report on Surveillance for Veterinary Residues in Food in the UK, 2008 34. The Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) Annual Report, 2008

40

9. PRIEDAI

1 priedas Kontroliuojamos antibiotikų liekanos gyvūnin÷s kilm÷s žaliavose

Farmakologiškai aktyvi medžiaga

Gyvūnų rūšis DLK Tiksliniai audiniai

Albendazolas Visi atrajotojai 100 µg/kg 100 µg/kg 1 000 µg/kg 500 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

Amoksicilinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 4 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

Ampicilinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 4 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Benzilpenicilinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 4 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Cefaleksinas Galvijai 200 µg/kg 200 µg/kg 200 µg/kg 1 000 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Cefapirinas Galvijai 50 µg/kg 50 µg/kg 100 µg/kg 60 µg/kg Raumenys Riebalai Inkstai Pienas Chlortetraciklinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 100 µg/kg 300 µg/kg 600 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Kepenys Inkstai Pienas Difloksacinas Galvijai 400 µg/kg 100 µg/kg 1 400 µg/kg 800 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Diklofenakas Galvijai 5 µg/kg 1 µg/kg 5 µg/kg 10 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai

41

0,1 µg/kg Pienas

Dikloksacilinas Visos maistui skirtos gyvūnų rūšys 300 µg/kg 300 µg/kg 300 µg/kg 300 µg/kg 30 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Doksiciklinas Galvijai 100 µg/kg 300 µg/kg 600 µg/kg Raumenys Kepenys Inkstai Enrofloksacinas Galvijai 100 µg/kg 100 µg/kg 300 µg/kg 200 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Eprinomektinas Galvijai 50 µg/kg 250 µg/kg 1 500 µg/kg 300 µg/kg 20 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

Febantelis Visi atrajotojai 50 µg/kg

50 µg/kg 500 µg/kg 50 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Fenbendazolas Visi atrajotojai Visi atrajotojai 50 µg/kg 50 µg/kg 500 µg/kg 50 µg/kg 10 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Florfenikolis Galvijai 200 µg/kg 3000 µg/kg 300 µg/kg Raumenys Kepenys Inkstai Gentamicinas Galvijai Galvijai 50 µg/kg 50 µg/kg 200 µg/kg 750 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

Ivermektinas Visos maistui

skirtos žinduolių rūšys 100 µg/kg 100 µg/kg 30 µg/kg Riebalai Kepenys Inkstai Klenbuterolio hidrochloridas Galvijai Galvijai 0,1 µg/kg 0,5 µg/kg 0,5 µg/kg 0,05 µg/kg Raumenys Kepenys Inkstai Pienas

42

Kloksacilinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 300 µg/kg 300 µg/kg 300 µg/kg 300 µg/kg 30 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

Kolistinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 150 µg/kg 150 µg/kg 150 µg/kg 200 µg/kg 50 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Levamizolas Galvijai 10 µg/kg 10 µg/kg 100 µg/kg 10 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Marbofloksacinas Galvijai Galvijai 150 µg/kg 50 µg/kg 150 µg/kg 150 µg/kg 75 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Monenzinas Galvijai 2 µg/kg 10 µg/kg 30 µg/kg 2 µg/kg 2 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

Oksacilinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 300 µg/kg 300 µg/kg 300 µg/kg 300 µg/kg 30 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Oksitetraciklinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 100 µg/kg 300 µg/kg 600 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Kepenys Inkstai Pienas Permetrinas Galvijai 50 µg/kg 500 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas Sulfonamidai

(visos sulfonamidų grupei priklausančiosmedžiagos) Galvijai Visos maistui skirtos gyvūnų rūšys 100 µg/kg 100 µg/kg 100 µg/kg 100 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas

43

Tetraciklinas Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 100 µg/kg 300 µg/kg 600 µg/kg 100 µg/kg Raumenys Kepenys Inkstai Pienas

Tiamfenikolis Visos maistui

skirtos gyvūnų rūšys 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg 50 µg/kg Raumenys Riebalai Kepenys Inkstai Pienas