1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
CHIRURGIJOS KLINIKA
KRISTINA VILBIKAITĖ
Karščio indukuojamų baltymų moduliacijos įtakos vertinimas skrandžio vėžio
ląstelėms hiperterminės chemoterapijos sąlygomis
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Vaidotas Čėsna
Kaunas
2020
2
TURINYS
SANTRAUKA 3 SUMMARY 4 INTERESŲ KONFLIKTAS 5 SANTRUMPOS 6 1. ĮVADAS 72.DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI 8
3.LITERATŪROS APŽVALGA 9
3.1 Skrandžio vėžys, epidemiologija, rizikos veiksniai, prevencija 9
3.2 Skrandžio vėžio gydymas 9
3.3 Hiperterminė intraperitoninė chemoterapija (HIPEC) 10
3.4 Karščio indukuojami baltymai, HO-1 11
4. METODIKA 12
4.1 Skrandžio vėžio ląstelių linijos 12
4.2 Tyrimo modelis 12
4.3 MTT 13
4.4 Tėkmės citometrija 13
4.5 Western Blot 13
4.6 Realaus laiko ląstelių analizė 14
4.7 Statistinė analizė 14
5.REZULTATAI 15
5.1 HO-1 RNR sintezė AGS ląstelėse HIPEC sąlygomis 15
5.2 HO-1 baltymo ekspresija HIPEC sąlygomis 16
5.3 HO-1 ekspresijos moduliavimo įtaka gyvybingumui 17 5.4 HO-1 ekspresijos moduliavimo įtaka apoptozei 18
6.REZULTATŲ APTARIMAS 18
7. IŠVADOS 19
3
SANTRAUKA
Kristinos Vilbikaitės magistro baigiamasis darbas „ Karščio indukuojamų baltymų moduliacijos įtakos vertinimas skrandžio vėžio ląstelėms hiperterminės chemoterapijos sąlygomis“/ mokslinio darbo vadovas Vaidotas Čėsna; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos fakultetas, Chirurgijos klinika.- Kaunas.
Tyrimo tikslas: Ištirti ir pagerinti intraperitoniškai plintančių vėžinių ląstelių atsaką į HIPEC, moduliuojant šių ląstelių citoprotekcinius karščio indukuojamus baltymus.
Uždaviniai: Ištirti HO-1 geno ir baltymo kiekį vėžinėse ląstelėse; Ištirti ląstelių gyvybingumo kitimus, veikiant HIPEC ir moduliuojant HO-1; Ištirti ląstelių apoptozės pokyčius, veikiant HIPEC ir
moduliuojant HO-1.
Metodai: Skrandžio adenokarcinomos ląstelių linijos (AGS) suskirstytos į 2 grupes. Vienose HO-1 veikta slopinančia RNR, kitose – ne. Abi grupės veiktos 37 °C ar 43 °C temperatūra su/be IC50 doze cisplatinos. Tirtas ląstelių gyvybingumas ir apoptozė. Statistinė analizė atlikta SPSS programa. Rezultatai vertinti kaip statistiškai reikšmingi, kuomet p<0,05.
Rezultatai: Hipertermijos sąlygomis (43 °C) AGS ląstelės HO-1 baltymo gamino 2,75 kartus daugiau. AGS ląstelių apoptozė suintensyvėjo moduliavus HO-1 ekspresiją bei veikiant HIPEC. Normotermijos sąlygomis apoptozė intensyvėjo 2,63, hipertermijos - 6,84 kartus. Intensyvesnė apoptozė statistiškai reikšmingos įtakos ląstelių gyvybingumui neturėjo.
Išvados: Paveikus skrandžio adenokarcinomos ląsteles cisplatina HO-1 baltymo gamyba nekito, tuo tarpu hipertermijos sąlygomis (43 °C) AGS ląstelės HO-1 gamino daugiau. Moduliuojant HO-1 bei veikiant HIPEC apoptozė intensyvejo, tačiau ląstelių gyvybingumui tai įtakos nedarė.
4
SUMMARY
Master thesis prepared by Kristina Vilbikaitė „ Evaluation of Heat Induced Protein Modulation in Gastric Cancer Cells under Hyperthermic Chemotherapy Conditions“ / Advisor Vaidotas Čėsna; Lithuanian University of Health Sciences; Faculty of Medicine; Surgery department.- Kaunas. Aim of the thesis: To investigate and improve intraperitoneally spreading cancer cells responce to HIPEC by modulating heat induced protein production.
Tasks: Evaluate the amount of HO-1 gene and protein in cancer cells; Investigate changes in cell viability under HIPEC conditions after modulating HO-1 expression; Investigate changes in apoptosis under HIPEC conditions after modulating HO-1 expression.
Methods : Gastric adenocarcinoma cell lines were divided into two groups. One was affected with inhibitory RNA, another was not. Both groups were exposed to 37°C or 43°C temperature
with/without IC50 dose of cisplatin. Cell viability and apoptosis was evaluated. SPSS was used for statistical analysis. Results were statistically significant, when p<0,05
Results: Under hyperthermia (43°C) AGS cells produced 2,75 times more HO-1 protein. Cell
apoptosis was intensified by modulating HO-1 expression and HIPEC conditions. Under normothermia apoptosis increased 2,63 times, while under hyperthermia 6,84 times. Increased apoptosis had no statistically significant effect on cell viability.
Conclusions: AGS cell exposure to cisplatin did not alter HO-1 protein production, however under hyperthermia (43 °C) HO-1 was production increased. Apoptosis was more intense under HIPEC conditions after HO-1 modulation, but it had no effect on cell viability.
5
INTERESŲ KONFLIKTAS
6
SANTRUMPOS
HIPEC – hiperterminė intraperitoninė chemoterapija/ hiperterminė intraperitoninė chemoperfuzija;
HO-1 – hemo oksigenazė 1;
AGS – skrandžio adenokarcinomos ląstelės;
RNR – ribonukleorūgštis;
siRNR – tildančioji RNR;
7
1. ĮVADAS
Naujai diagnozuotų vėžinių susirgimų kiekis Europoje kasmet vis auga [1,2]. 2012 metais nustatyti 3,45 milijonai [1]. Tuo tarpu 2018 metais, net 3,91 milijonai [2]. Vėžys yra viena pagrindinių mirties priežasčių [3]. 2012 metais Europoje nuo vėžinių susirgimų mirė 1,75 milijonai [1]. 2018 metais – 1,93 milijonai žmonių.
Skrandžio vėžys – penktas pagal dažnį vėžinis susirgimas Europoje [2]. Ankstyvos skrandžio vėžio stadijos besimptomės. Ligai pažengus pasireiškia pilvo skausmas, dispepsija, svorio kritimas, apetito stoka. Nespecifinė klinika ligai pažengus lemia tai, kad liga nustatoma vėlai [4]. To pasekoje 5 metų išgyvenamumas sergant skrandžio vėžiu siekia vos 20 % [5]. Pagrindinis gydymo metodas, išplitus skrandžio navikui - sisteminė chemoterapija [6]. Sisteminės chemoterapijos efektyvumas ribotas ir nustačius ascitą bei pilvaplėvės karcinomatozę išgyvenamumo mediana vos 3 - 6 mėnesiai [7].
Hiperterminė intraperitoninė chemoterapija (HIPEC) yra vienas iš metodų naudojamų intraperitoniškai išplitusio skrandžio vėžio gydyme [6]. Jo metu vėžiniai susirgimai gydomi pasitelkus citoredukcinę, t.y. vėžio tūrį mažinančią operaciją bei 42-43 °C intraperitoninę chemoterapiją [8]. Vieni tyrimai teigia, kad HIPEC išgyvenamumą ilgina [9]. Kiti, kad išgyvenamumas statistiškai reikšmingai nesiskiria [10]. Gaunant skirtingus rezultatus, ieškomi nauji būdai gerinantys HIPEC efektyvumą [11].
Karščio indukuojami baltymai, tai medžiagos, kurių gamybą skatina stresinės organizmo būklės. Jie atlieka citoprotekcinę funkciją, apsaugo ląsteles nuo pažaidos, pakitus homeostazei [12]. Hemo oksigenazė HO-1, tai skrandžio vėžio ląstelėse intensyviau gaminamas citoprotekcinis baltymas [13]. Didesni HO-1 kiekiai lemia terapinį atsparumą, t.y. slopinama apoptozė sukeliama chemoparatais [14].
Duomenų apie HIPEC poveikį skrandžio vėžio ląstelėms po HO-1 baltymo moduliacijos nėra. Atlikdami šį tyrimą siekiame išsiaiskiti ar HO-1 baltymo moduliacija turi įtakos skrandžio vėžio ląstelių gyvybingumui ir apoptozei HIPEC sąlygomis.
8
2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti ir pagerinti intraperitoniškai plintančių vėžinių ląstelių atsaką į HIPEC, moduliuojant šių ląstelių citoprotekcinius karščio indukuojamus baltymus.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti HO-1 geno ir baltymo kiekį vėžinėse ląstelėse.
2. Ištirti ląstelių gyvybingumo kitimus, veikiant HIPEC ir moduliuojant HO-1. 3. Ištirti ląstelių apoptozės pokyčius, veikiant HIPEC ir moduliuojant HO-1.
9
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1 Skrandžio vėžys, epidemiologija, rizikos veiksniai, prevencija
Nepaisant mažėjančio sergamumo, skrandžio vėžys užima penktą vietą tarp vėžinių susirgimų Europoje [1,2]. Skrandžio adenokarcinoma yra blogą ilgalaikę prognozę turintis susirgimas. Patobulėjus ligos diagnostikai ir gydymui penkerių metų išgyvenamumas išlieka 20 % [5]. Besimptomė ankstyva ligos eiga bei nespecifinė klinika ligai progresuojant lemia vėlyvą diagnozės nustatymą bei ligos išplitimą. Nustačius tolimąsias metastazes, išgyvenamumo mediana vos metai [15]. Atvejų, kai nustatoma pilvaplėvės karcinomatozė bei ascitas išgyvenamumo mediana ligos negydant siekia tik 3 - 6 mėnesius [7].
Skrandžio vėžys yra polietiologinė liga. Dažniausiai diagnozuojamas vyresniame 60 - 80 metų amžiuje. Beveik visose šalyse vyrai serga 2-4 kartus dažniau [5]. Histologiškai išskiriami du skrandžio vėžio tipai, kurie skiriasi ne tik klinika, bet ir etiologija. Pirmasis, gerai diferencijuotas žarninis tipas. Dažniau nustatomas vyresniame amžiuje, vyrams, juodaodžiams. Antrasis, blogai diferencijuotas difuzinis tipas. Dažnesnis jaunesniems pacientams bei moterims. Siejamas su genetine predispozicija [5]. Pagrindinis rizikos veiksnys skrandžio vėžio išsivystymui – Helicobacter pylori ( H. pylori) infekcija. Riziką didina didelis druskos ir nitratų vartojimas, rūkymas ir alkoholis. Taip pat dažniau pasireiškia nutukusiems, žemesnės socialinės klasės žmonėms [16].
Skrandžio vėžio prevencija paprasta – sveikas gyvenimo būdas bei rizikos veiksnių šalinimas. Svarbu eradikuoti H. pylori bakteriją. Taip pat nepamiršti svorio normalizavimo, fizinio aktyvumo bei mitybos korekcijos, mažinant druskos bei apdorotų maisto produktų vartojimą. Esant šeiminei skrandžio vėžio anamnezei, rekomenduojami genetiniai tyrimai [16].
3.2 Skrandžio vėžio gydymas
Gydymo strategija ir efektyvumas priklauso nuo nustatytos ligos stadijos. Stadijuojant skrandžio vėžį remiamasi sienelės peraugimu. Skrandžio vėžys skirstomas į ankstyvą ir vėlyvą. Ankstyvam priskiriama T1a ir T1b stadija, kuomet pirminis navikas perauga gleivinę ir pogleivį. Navikui pasiekus raumeninį skrandžio gleivinės sluoksnį, jis laikomas T2 stadijos. Vėlyva T3 - T4
10
stadija nustatoma navikui pasiekus serozinį skrandžio sienelės sluoksnį, peraugus gretimus organus [17].
Egzistuoja keli ankstyvosios stadijos gydymo modeliai. Gerai diferencijuotą skrandžio adenokarcinomą T1a, kuomet navikas mažesnis nei 2 cm bei lokalizuotas skrandžio gleivinėje, galima gydyti endoskopinės rezekcijos būdu, pašalinant naviką kartu su pogleiviu. Šiuo atveju tolimesnis gydymas nereikalingas, nes vėžio išplitimo į limfmazgius rizika labai maža. Rekomenduojama stebėsena. T1 skrandžio adenokarcinomai neatitinkančiai aukščiau išvardintų kriterijų taikomas operacinis gydymas [6]. Po radikalaus chirurginio gydymo ankstyvas skrandžio vėžys yra linkęs recidyvuoti, todėl rekomenduojama adjuvantinė chemoterapija. 5 metų išgyvenamumas po radikalaus chirurginio gydymo bei adjuvantinės chemoterapijos siekia 90 % [17].
Besimptomė ankstyva stadija bei nespecifinė klinika, ligai progresuojant, lemia tai, kad 70 % atveju skrandžio vėžys nustatomas santykinai vėlai [17]. Pogleivį peraugususi skrandžio adenocarcinoma iki pat tolimųjų metastazių atsiradimo yra gydoma taip pat. Skiriama neoadjuvantinė chemoterapija, chirurginis gydymas bei adjuvantinės chemoterapijos kursai [6]. Remiantis 2006 metų Jungtinės Karalystės tyrimu, pacientų, kuriems buvo taikyta perioperacinė chemoterapija penkerių metų išgyvenamumas tesiekė 36 %, tuo tarpu pacientų kuriems taikytas tik chirurginis gydymas – 23 % [18]. Taip pat radikalus chirurginis gydymas pasiektas 84 % atvejų taikant chemoterapiją, lyginant su 73 % – tik operacinį gydymą [19].
Skrandžio vėžys linkęs metastazuoti tiek peraugdamas gretimus organus, tiek hematogeniniu keliu. Dažniausiai metastazės aptinkamos kepenyse, pilvapleveje ar plaučiuose [20]. Pirmo pasirinkimo gydymas esant metastazavusiam skrandžio vėžiui yra sisteminė chemoterapija. Rekomenduojama sekti atsaką į gydymą, nes gali atsinaujinti operacinio gydymo galimybė. Nustačius išplitusį skrandžio vėžį, rekomenduojama pacientą ištirti dėl žmogaus epidermio augimo faktoriaus receptoriaus HER2. 10-15 % skrandžio vėžio yra HER2 teigiami, tad nustačius teigiamą HER2 prie sisteminės platinos ir fluoropirimidino chemoterapijos rekomenduojama pridėti trastuzumabą [6]. Taip pagerinama išgyvenamumo mediana nuo 11,1 iki 13,8 mėnesių [21]. Pastaraisiais metais populiarėja radioterapija išplitusio vėžio gydyme, tačiau ji taikoma kaip paliatyvi priemonė vėžio sukeltiems simptomams mažinti [17]. Hiperterminė intraperitoninė chemoterapija yra vienas iš metodų naudojamų intraperitoniškai išplitusio skrandžio vėžio gydyme. Jis taikomas pasitelkiant citoredukcinę operaciją ir cisplatiną, ar kitą chemopreparatą [6].
11
3.3 Hiperterminė intraperitoninė chemoterapija (HIPEC)
Hiperterminė intraperitoninė chemoterapija (HIPEC) yra operacinėje taikomas kompleksinis mezoteliomos, pilvaplėvės pseudomiksomos ar išplitusio, su pilvaplėvės karcinomatoze, vėžio gydymo būdas. Jis atliekamas pasitelkus citoredukcinę, t.y. vėžio tūrį mažinančią operaciją bei 42-43 °C intraperitoninę chemoterapiją [8].
Pagindinis intraperitoninės chemoterapijos tikslas yra padidinti chemopreparato poveikį pilvaplėvės mikrometastazėm, tuo pačiu mažinant jo sukeliamą sisteminį toksiškumą. Chemopreparatas į metastazes skverbiasi pasyvios difuzijos būdu, o skvarbos gylis siekia vos 2 - 3 mm. Remiantis tuo, norint pasiekti geriausią rezultatą, ypač svarbu pasirinkti tinkamą chemopreparatą bei pašalinti visas makrometastazes. HIPEC naudojamiems preparatams yra keliami tam tikri reikalavimai. Visų pirma, 42-43 °C temperatūra turi padidinti chemopreparato skverbimąsi į navikines ląsteles. Taip taip hipertermija turi didinti preparato poveikį, tam, kad citotoksiškumas būtų pasiektas per 60 - 90 minučių [22].
Vienas iš naudojamų chemopreparatų intraperitoniniame skrandžio vėžio gydyme yra cisplatina. Jis atitinka aukščiau išvardintus kriterijus: hipertermija didina cisplatinos citotoksiškumą 3 kartus ir tuo pačiu cisplatina gali penetruoti mikrometastazes iki 3 mm [22].
HIPEC gali būti atliekama tiek atviro, tiek uždaro pilvo technika. Išgyvenamumui pasirinkta procedūros technika reikšmingos įtakos neturi, tačiau atlikus tyrimą uždaros HIPEC metu stebėtas mažesnis stresas organizmui bei stabilesnės paciento gyvybinės funkcijos [23]. Renkantis techniką atsižvelgiama ir į tai, kad uždaros technikos metu yra lengviau išlaikyti chemopreparatą reikiamos temperatūros, taip pat mažesnė operacinės personalo ekspozicija chemopreparatu [23].
Pooperaciniu laikotarpiu HIPEC pacientų gyvenimo kokybė būna šiek tiek prastesnė nei gaunančių sisteminę chemoterapiją. Dažniau ir intenvyviau pasireiškia bendras nuovargis, viduriavimai bei miego sutrikimai. Gyvenimo kokybė į priešoperacinį lygį atsistato per 6-12 mėnesius. Šiuo atveju nauda pranoksta žalą, todėl trumpalaikis gyvenimo kokybės pablogėjimas neturėtų būti priežastimi HIPEC atsisakymui [24].
Kalbant apie efektyvumą, aiškiai teigti negalima, kad citoredukcinė operacija ir HIPEC prailgina išplitusiu skrandžio vėžiu sergančiųjų išgyvenamumo medianą [9,10].
12
3.4. Karščio indukuojami baltymai, HO-1
Karščio indukuojami baltymai yra medžiagos, kurių gamybą skatina stresinės organizmo būklės, tokios kaip aukšta temperatūra, cheminės medžiagos, sunkieji metalai, vaistai ar hipoksija. Intensyvesnė šių baltymų gamyba apsaugo ląsteles nuo pažaidos, t.y. padeda ląstelėms išlaikyti normalią struktūrą bei funkciją pakitus homeostazei [12]. Vėžinės ląstelės karščio indukuojamų baltymų gamina daugiau [25]. Tai lemia silpnesnę apoptozę bei atsparumą gydymui chemopreparatais [12].
Vienas iš karščio indukuojamų baltymų yra hemo oksigenazė HO-1. Šį baltymą, turintį 288 aminorūgštis, koduoja HMOX1 genas esantis 22 chromosomos q12.3 vietoje [26]. Nustatyta, kad skrandžio vėžio ląstelės HO-1 baltymo gamina daugiau. Hipertermija taip pat inicijuoja intensyvesnę šio citoprotekcinio baltymo gamybą, tai ypač svarbu pasitelkiant HIPEC [13]. Didesnis HO-1 baltymo kiekis vėžinėse ląstelėse lemia jų proliferaciją. Taip pat sukelia terapinį atsparumą, t.y. apsaugo vėžinės ląsteles nuo apoptozės, kurią sukelia chemopreparatai [14].
Šiuo metu atliekami tyrimai, kuriuose, siekiant gauti geresnį gydymo efektą, slopinama HO-1 ekspresija vėžinėse ląstelėse. Nustatyta teigiama koreliacija tarp HO-1 slopinimo ir kasos vėžio ląstelių atsako į chemoterapiją [27]. Duomenų apie HIPEC poveikį skrandžio vėžio ląstelėms po HO-1 baltymo moduliacijos nėra.
4. METODIKA
4.1 Skrandžio vėžio ląstelių linijos
Skrandžio adenokarcinomos ląstelių linijos (AGS) įsigytos iš „American Type Cell Culture“ (Manassas, VA, JAV). Augintos Ham‘s F-12K terpėje su 10 % fetaliniu jaučio serumu ir 1 % penicilino/streptomicino tirpalu. AGS ląstelių linijos laikytos pastovioje 37 °C temperatūroje su 5 % CO2 koncentracija.
13
4.2 Tyrimo modelis
Tyrimas buvo atliekamas dviem etapais. Pirmuoju, skrandžio adenokarcinomos ląstelės buvo tiriamos nemoduliavus HO-1 baltymo ekspresijos, antruoju moduliavus.
Skrandžio adenokarcinomos ląstelės, kuriose nebuvo moduliuota HO-1 baltymo ekspresija, 24 valandas kultivuotos anksčiau minėtomis sąlygomis. Po paros ląstelių linijos buvo veikiamos normotermija (37 °C), ar 43 °C temperatūra su/be IC50 doze cisplatinos (111 µM). Šiomis sąlygomis AGS buvo veikiamos 1 valandą, po kurios terpė buvo pakeista ir ląstelės buvo auginamos pradinėmis sąlygomis dar 48 valandas. Po 48 valandų tirtas ląstelių gyvybingumas, apoptozė, HO-1 ekspresijos pokyčiai.
Antrame etape, 72 valandos prieš veikiant ląsteles, į jas buvo įterpta HO-1 baltymo ekspresiją slopinanti HO-1 RNR (siRNR). AGS ląstelės buvo veikiamos normotermija (37 °C), ar 43 °C temperatūra su/be IC50 doze cisplatinos (111 µM). Šiomis sąlygomis AGS buvo veikiamos 1 valandą, po kurios terpė buvo pakeista ir ląstelės buvo auginamos pradinėmis sąlygomis dar 48 valandas. Po 48 valandų tirtas ląstelių gyvybingumas, apoptozė, taip pat HO-1 ekspresija.
4.3 MTT
Ląstelių gyvybingumas vertintas remiantis MTT ( Invitrogen; Karlsbadas; CA; JAV) tyrimu. Prieš tai veiktos ląstelės buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 4 valandas su 5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromido) reagentu. Tuomet terpė pašalinta ir įpilta dimetilsulfido (Karl Roth Gmbh; Karlsrūhė; Vokietija). Sunrise spektrofotometru (Tecan Austria Gmbh; Grodigas; Austrija) buvo matuojama spalvos sugertis 570 nm ir 650 nm bangos ilgyje.
4.4 Tėkmės citometrija
Tėkmės citometrijos metodu vertinta ląstelių apoptozė. Naudotas Guava Nexin Annexin V testas (Merck KGaA, Darmstadtas, Vokietija) su 7 – aminoactinomycinu D ir Annexinu V-PE.
14
Analizuota Guava Personal Cell Analysis (Guava; EMD Millipore, Billerica, MA, JAV) tėkmės citometru bei CytoSoft programine įranga.
4.5 Western Blot
Naudojantis radioimunoprecipitacijos buferiu (Abcam; Kembridžas; JK) paruošti ląstelių lizatai su proteazių inhibitoriais (Roche Diagnostics; Baselis; Briuselis). Baltymų koncentracija nustatyta pasitelkiant BSA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) rinkinį. Baltymų mėginiai (50 μg) 5 minutes buvo veikiami 97 °C temperatūra. Po 5 min patalpinti į 4 -12 % SDS-PAGE terpę ir perkelti ant polivinilideno fluorido membranos, kur 50 minučių buvo veikiami 30V. Tuomet membranos valandą kambario temperatūroje veiktos blokavimo buferiu (WesternBreeze Blocker/Diluent; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Per naktį inkubuotos 4 °C temperatūroje su pirminiais triušio HO -1 (kat.nr. EP1391Y; 1:2000; Abcam; Kembridžas; JK ) antikūnais ir pelės GAPDH antikūnais (kat.nr. AM4300; Ambion; Austinas; TX; JAV). Kitą dieną, 1 valandą kambario temperatūroje membranos veiktos antriniais antikūnais prieš triušio (kat.nr. WP20007; Invitrogen; Karlsbadas; CA; JAV) ar pelės kat.nr. WP20007; Invitrogen; Karlsbadas; CA; JAV) imunoglobulinus G. ChemiDoc sistema (Bio-Rad Laboratories, Inc.; Herculesas; CA; JAV) su chemiliuminescuojančiu substratu (CDP-Star; Invitrogen; Karlsbadas; CA; JAV) naudota rezultatams atvaizduoti.
4.7 Statistinė analizė
Duomenų analizei buvo naudotos SPSS ir GraphPad programos. Statistinis patikimumas vertintas Mann-Whitney ir One - Way ANOVA testais. Pateikiami duomenų vidurkiai ± standartinė paklaida iš 3 nepriklausomų tyrimų. Duomenys statistiškai reikšmingai skyrėsi, kuomet p < 0,05
15
5.REZULTATAI
5.1 HO-1 RNR sintezė AGS ląstelėse HIPEC sąlygomis
37
43
0
2
4
6
AGS
Temperatūra,
C
H
O
-1
R
N
R
e
k
s
p
re
s
ij
a
Be cisplatinos
Su cisplatina
1 pav. HO-1 RNR ekspresija AGS ląstelėse hipertermijos ir cisplatinos sąlygomis, p >0,05
Lyginant su kontroline grupe (neveikta cisplatina, normotermija), HO-1 RNR ekspresija AGS ląstelėse statiškai reikšmingai nesiskyrė veikiant hipertemija ir cisplatina. (1 pav.)
16
5.2 HO-1 baltymo ekspresija HIPEC sąlygomis
37
43
0
2000
4000
6000
8000
AGS
Temperatūra,
C
H
O
-1
e
k
s
p
re
s
ij
o
s
v
e
rt
in
im
a
s
p
ik
s
e
li
a
is
Be cisplatinos
Su cisplatina
2 pav. HO-1 baltymo ekspresijos vertinimas pikseliais. *p <0,05HO-1
GAPDH (kontrolinis baltymas) 3 pav. Western Blot rezultatų atvaizdavimas
HO-1
GAPDH
4 pav. Tildant HO-1 siRNR, baltymo gamyba sumažėjo.
HO-1 baltymo sintezėje cisplatina žymios įtakos neturėjo. 37 °C temperatūroje cisplatina padidino HO-1 baltymo ekspresiją 1,2 karto, tačiau šis pokytis, statistiškai nereikšmingas. Tuo tarpu HO-1 baltymo sintezė 43 °C temperatūroje be cisplatinos, padidėjo 2,75 kartus (p<0,05). Kuomet prie
*
Kontr oli nė HO -1 si R NR17
43 °C buvo pridėta cisplatinos, HO-1 ekspresija sumažėjo. Lyginant su kontroline grupe, ji buvo 2,14 kartų didesnė. (2 pav.) Western Blot metodu buvo vertintas HO-1 RNR tildymo efektas baltymo gamybai. (3 pav.)
5.3 HO-1 ekspresijos moduliavimo įtaka gyvybingumui
37 43 0 20 40 60
AGS
Temperatūra,
C
G
y
v
y
b
in
g
u
m
a
s
(
%
k
o
n
tr
o
li
n
ės
g
ru
p
ės
)
Cisplatina
Cisplatina + HO-1 siRNR
5 pav. HO-1 moduliacijos įtaka ląstelių gyvybingumui, *p<0,05
HO-1 moduliacija nedarė įtakos AGS ląstelių gyvybingumui. HO-1 slopinimas sustiprino cisplatinos poveikį ir sumažino AGS ląstelių gyvybingumą 16 % 37 °C temperatūroje (p<0,05). Hipertermija sustiprino cisplatinos citotoksiškumą. Gyvybingumas nukrito 24 % lyginant su 37 °C temperatūra. Nepaisant to, HO-1 moduliacija reikšmingos įtakos ląstelių gyvybingumui neturėjo, nes ląstelių gyvybingumas liko panašus moduliavus HO-1 ekspresiją ar ne. (4 pav.)
18
5.4 HO-1 ekspresijos moduliavimo įtaka apoptozei
37
43
0
2
4
6
8
10
AGS
Temperatūra,
C
A
p
o
p
to
ti
n
ės
l
ąs
te
lė
s
,
ly
g
in
a
n
t
s
u
k
o
n
tr
o
le
Cisplatina
Cisplatina + HO-1 siRNR
5 pav. HO-1 moduliacijos įtaka apoptozei, *p<0,05
AGS ląstelių apoptozė suintensyvėjo moduliavus HO-1 ekspresiją bei veikiant hipertermija ir cisplatina. HO-1 moduliavimas padidino cisplatinos poveikį normotermijos sąlygomis, todėl apoptozė suintensyvėjo 2,63 kartus. Hipertermijos sąlygomis veikiant HO-1 moduliuotas ir cisplatina veiktas ląsteles, apoptozė 6,84 kartus intensyvesnė (p<0,05). (5 pav.)
6.REZULTATŲ APTARIMAS
Kiek žinoma, straipsnių apie skrandžio vėžio gydymą, HIPEC metodu moduliuojant HO-1 baltymo ekspresija nėra. Tad šiuo tyrimu buvo siekiama įvertinti HO-1 baltymo moduliacijos įtaką skrandžio adenokarcinomos ląstelių gyvybingumui ir apoptozei, veikiant jas 37 °C ar 43 °C temperatūra bei cisplatina. Nustatyta, kad HO-1 baltymo ekspresija AGS ląstelėse padidėja hipertermijos sąlygomis, o cisplatina baltymo ekspresijai reikšmingos įtakos neturi. Remiantis tuo,
*
*
19
HO-1 baltymo moduliacija gali veikti vėžinių ląstelių atsaką į hipertermiją ir cisplatiną ir taip pagerinti gydymo rezultatus.
HIPEC yra plačiai naudojamas išplitusio skrandžio vėžio gydyme [9,10]. Pasitelkiama citoredukcinė operacija bei hiperterminė 42 - 43 °C chemoterapija [8]. Rezultatai, gydant išplitusį skrandžio vėžį HIPEC metodu, dviprasmiai [9,10]. Nustatyta, kad gastrointestinalinio trakto vėžinės ląstelės į chemoterapiją ir hipertermiją reaguoja skirtingai [28]. Manoma, kad dėl intensyvesnės karščio indukuojamų baltymų gamybos [12].
HO-1 yra karščio indukuojamas baltymas, kurio gamyba intensyvesnė skrandžio vėžio ląstelėse [13]. Hipertermija skatina HO-1 baltymo gamybą [12]. Taip pat ir vėžio gydymo metodai, tokie kaip chemoterapija ar radioterapija [29]. Didesni HO-1 baltymo kiekiai lemia vėžinių ląstelių atsparumą chemoterapijai bei lėtesnę lastelių apoptozę [14]. Taip nustatė Liu ir kiti, kai savo tyrime įrodė, kad skrandžio vėžio ląstelės, kuriose intensyvesnė HO-1 sintezė, atsparesnės apoptozei [30]. Remiantis tuo, HO-1 baltymas bei jo moduliacija svarbi tyrimo sritis vėžio gydyme.
Vienas iš naudojamų chemopreparatų intraperitoniniame skrandžio vėžio gydyme yra cisplatina, nes hipertermija didina cisplatinos citotoksiškumą 3 kartus ir tuo pačiu cisplatina efektyviai penetruoja į mikrometastazes [22]. Taip pat cisplatina skatina įvairių lokalizacijų navikų, tokių kaip galvos ir kaklo, kiaušidžių, sėklidžių, gimdos kaklelio, stemplės ir plaučių adenokarcinomos ląstelių apoptozę [31]. HO-1 slopinimas, didina navikinių ląstelių jautrumą cisplatinai, taip stiprindamas citotoksinį chemoprepatato poveikį [32]. Lv ir kiti nustatė, kad slopinant HO-1 baltymą gerklų plokščialąstelinės karcinomos ląstelėsė, didėja jų jautrumas cisplatinai [33] .Taip pat reagavo ir AGS ląstelės. Šiame tyrime nustatyta, kad HO-1 moduliacija sustiprino cisplatinos poveikį AGS ląstelėms. Tai rodo intensyvesnė apoptozė tiek normotermijos, tiek hipertermijos sąlygomis. Tačiau intensyvesnė apoptozė AGS ląstelių gyvybingumui statistiškai reikšmingos įtakos nedarė. Slopinant citoprotekcinį HO-1 baltymą ar ne, ląstelių gyvybingumas išliko panašus. Tai galėjo įvykti dėl apoptotinių veiksnių pašalinimo [34]. Geske su bendraautoriais teigia, kad ankstyva apoptozė gali būti grįštama, pašalinus apoptozę sukėlusius veiksnius [34].
7. IŠVADOS
1. HIPEC sąlygos statistiškai reikšmingos įtakos HO-1 RNR ekspresijai skrandžio adenokarcinomos ląstelėse neturi.
20
2. Hiperterminė 43° C temperatūra statistiškai reikšmingai didina HO-1 baltymo ekspresiją AGS ląstelėse.
3. AGS ląstelių gyvybingumas HIPEC sąlygomis nepriklauso nuo HO-1 ekspresijos moduliavimo.
4. AGS ląstelių apoptozė intensyvėja HIPEC sąlygomis, atlikus HO-1 ekspresijos moduliavimą.
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Ferlay J, Steliarova-foucher E, Lortet-tieulent J, Rosso S. Cancer incidence and mortality patterns in Europe : Estimates for 40 countries in 2012. Eur J Cancer [Internet].
2013;49(6):1374–403. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ejca.2012.12.027
2. Ferlay J, Colombet M, Soerjomataram I, Dyba T, Randi G. ScienceDirect Cancer incidence and mortality patterns in Europe : Estimates for 40 countries and 25 major cancers in 2018. Eur J Cancer [Internet]. 2018;103:356–87. Available from: https://doi.org/10.1016/j.ejca.2018.07.005 3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7–34. 4. Van Cutsem E, Sagaert X, Topal B, Haustermans K, Prenen H. Gastric cancer. Lancet
[Internet]. 2016;388(10060):2654–64. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(16)30354-3
5. Nagini S. Carcinoma of the stomach: A review of epidemiology, pathogenesis, molecular genetics and chemoprevention. World J Gastrointest Oncol. 2012;4(7):156.
6. Smyth EC, Verheij M, Allum W, Cunningham D, Cervantes A, Arnold D, et al. Gastric cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol.
2016;27(August):v38–49.
7. Yonemura Y, Endou Y, Sasaki T, Hirano M, Mizumoto A, Matsuda T, et al. Surgical treatment for peritoneal carcinomatosis from gastric cancer. Eur J Surg Oncol. 2010;36(12):1131–8. 8. González-Moreno S. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy: Rationale and technique.
World J Gastrointest Oncol. 2010;2(2):68.
9. Yang XJ, Huang CQ, Suo T, Mei LJ, Yang GL, Cheng FL, et al. Cytoreductive surgery and hyperthermic intraperitoneal chemotherapy improves survival of patients with peritoneal carcinomatosis from gastric cancer: Final results of a phase III randomized clinical trial. Ann Surg Oncol. 2011;18(6):1575–81.
21
of Hyperthermic Intra-peritoneal Chemotherapy (HIPEC) for Colorectal Peritoneal Carcinomatosis. PRODIGE 7. Eur J Surg Oncol. 2019;45(2):e17.
11. Roy P, Canet-Jourdan C, Annereau M, Zajac O, Gelli M, Broutin S, et al. Organoids as
preclinical models to improve intraperitoneal chemotherapy effectiveness for colorectal cancer patients with peritoneal metastases: Preclinical models to improve HIPEC. Int J Pharm
[Internet]. 2017;531(1):143–52. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ijpharm.2017.07.084
12. Wu J, Liu T, Rios Z, Mei Q, Lin X, Cao S. Heat Shock Proteins and Cancer. Vol. 38, Trends in Pharmacological Sciences. Elsevier Ltd; 2017. p. 226–56.
13. Kumar SJ, Stokes J, Singh UP, Scissum Gunn K, Acharya A, Manne U, et al. Targeting Hsp70: A possible therapy for cancer. Cancer Lett [Internet]. 2016;374(1):156–66. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.canlet.2016.01.056
14. Chau L. Heme oxygenase-1 : emerging target of cancer therapy. 2015;1–7.
15. Van Cutsem E, Sagaert X, Topal B, Haustermans K, Prenen H. Gastric cancer. The Lancet. 2016.
16. Rawla P, Barsouk A. Epidemiology of gastric cancer: Global trends, risk factors and prevention. Prz Gastroenterol. 2019;14(1):26–38.
17. Song Z, Wu Y, Yang J, Yang D, Fang X. Progress in the treatment of advanced gastric cancer. Tumor Biol. 2017;39(7).
18. Fong P, Boss D, Yap T, Tutt A, Wu P, Mergui-Roelvink M. New England Journal CREST. Science (80- ). 2010;609–19.
19. Montori G, Coccolini F, Ceresoli M, Catena F, Colaianni N, Poletti E, et al. The treatment of peritoneal carcinomatosis in advanced gastric cancer: State of the art. Int J Surg Oncol. 2014;2014.
20. Riihimäki M, Hemminki A, Sundquist K, Sundquist J, Hemminki K. Metastatic spread in patients with gastric cancer. Oncotarget. 2016;7(32):52307–16.
21. Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): A phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet [Internet]. 2010;376(9742):687–97. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(10)61121-X
22. Yan TD. A pharmacological review on intraperitoneal chemotherapy for peritoneal malignancy. World J Gastrointest Oncol. 2010;2(2):109.
22
Peritoneal carcinomatosis: Intraoperative parameters in open (Coliseum) versus closed abdomen hipec. Int J Surg Oncol. 2015;2015.
24. Zhu Y, Hanna N, Boutros C, Alexander HR. Assessment of clinical benefit and quality of life in patients undergoing cytoreduction and hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) for management of peritoneal metastases. J Gastrointest Oncol. 2013;4(1):62–71.
25. Parcellier A, Gurbuxani S, Schmitt E, Solary E, Garrido C. Heat shock proteins, cellular chaperones that modulate mitochondrial cell death pathways. Biochem Biophys Res Commun. 2003;304(3):505–12.
26. Ryter SW, Alam J, Choi AMK. Heme Oxygenase-1 / Carbon Monoxide : From Basic Science to Therapeutic Applications. 2020;583–650.
27. Abdalla MY, Ahmad IM, Rachagani S, Banerjee K, Thompson CM, Maurer HC, et al.
Enhancing responsiveness of pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment under hypoxia by heme oxygenase-1 inhibition. Transl Res [Internet]. 2019;207:56–69. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.trsl.2018.12.008
28. Cesna V, Sukovas A, Jasukaitiene A, Naginiene R, Barauskas G. n arrow line between benefit and harm : a dditivity of hyperthermia to cisplatin cytotoxicity in different gastrointestinal cancer cells. 2018;24(10):1072–83.
29. Nitti M, Piras S, Marinari UM, Moretta L, Pronzato MA, Furfaro AL. HO-1 Induction in Cancer Progression : A Matter of Cell Adaptation. 2017;1–20.
30. Liu Z, Chen GG, Ng EKW, Leung W, Sung JJY, Chung SCS. Upregulation of heme oxygenase-1 and p2oxygenase-1 confers resistance to apoptosis in human gastric cancer cells. 2004;(September 2003):503–13.
31. Barry MA, Behnke CA and Eastman A. Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin, other anticancer drugs, toxins and hyperthermia. Biochem Pharmacol 1990; 40:2353-2362.
32. Degese MS, Mendizabal JE, Gandini NA, Gutkind JS, Molinolo A, Hewitt SM, et al. Lung Cancer Expression of heme oxygenase-1 in non-small cell lung cancer ( NSCLC ) and its correlation with clinical data. Lung Cancer [Internet]. 2012;77(1):168–75. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.lungcan.2012.02.016
33. Lv X, Niu DSY. Inhibition of heme oxygenase-1 enhances the chemosensitivity of laryngeal squamous cell cancer Hep-2 cells to cisplatin. Apoptosis. 2016;21(4):489–501.
34. Geske FJ, Lieberman R, Strange R. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. 2001;182–91.
