LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDRA
Justinas Banelis
Mikotoksinus detoksikuojančių profilaktikos priemonių
pieniniams galvijams efektyvumo įvertinimas
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. dr. Bronius Bakutis
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas (pavadinimas)
……… 1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(data) (katedros vedėjo/jos vardas pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
(Gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų komisijos įvertinimas:
1. SANTRUMPOS
KSV/g - kolonijas sudarantys vienetai 1 g mėginio
LSMU VA – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Vterinarijos akademija ČA – Čapeko mitybinis agaras
g – gramas
Cv – įvairavimo koeficientas Xv – aritmetinis vidurkis
Sx – aritmetinio vidurkio paklaida S – vidutinis kvadratinis nuokrypis R – koreliacijos koeficientas p - patikimumo kriterijus AFL B1 – aflatoksinas B1 ZON – zearalenonas DON – deoksinivalenolis OTA – ochratoksinas A
FAO - Maisto ir Ţemės ūkio organizacija SM – sausoji medţiaga
m/o – mikroorganizmai spp. - rūšys
TURINYS
SMMARY………...…...……...5
ĮVADAS ………...…………...6
1.LITERATŪROS APŢVALGA ………...…...8
1.1 Mikromicetai ir mikotoksinai aptinkami atrajotojų pašaruose ...8
1.2 Mikotoksinų poveikis atrajotojų sveikatingumui ...9
1.2.1 Svarbiausios mikotoksinų grupės, jų įtaka karvių virškinimo trakto mikroflorai, bei ten vykstančių procesų reguliacijai...12
1.3 Mikotoksinų detoksikacija pašaruose ...13
1.3.1 Mikroskopinių grybų plitimo pašarų ţaliavoje sumaţinimas... ...14
1.3.2 Fiziniai mikotoksinų detoksikacijos metodai...14
1.3.3 Cheminiai mikotoksinų detoksikacijos metodai ...15
1.3.4 Mikrobiologiniai metodai ...15
2. DARBO METODIKA...18
2.1 Tyrimui naudoti gyvūna ir pašarai...18
2.2 Pašarų higieninis sanitarinis įvertinimas ...18
2.3 Mikotoksinų koncentracijos nustatymas pašaruose ...19
2.4 Kraujo mėginių paėmimas ir tyrimas... ...20
2.5 Pieno mėginių paėmimas ir tyrimas ...20
2.6 Statistinis duomenų įvertinimas... ...20
3. TYRIMŲ REZULTATAI ...21
3.1 Pašarų higieninis sanitarinis įvertinimas X ūkyje...21
3.2 Kontrolinės ir bandomosios galvijų grupių sveikatingumo įvertinimas bandymo metu X ūkyje ...24
3.3 Karvių kraujo tyrimas ...25
3.4 Karvių pieno tyrimas ...29
4. REZULTATŲ APTARIMAS...31
IŠVADOS...33
LITERATŪROS SĄRAŠAS...34
SUMMARY
This scientific work was done by student Justinas Banelis of Lithuanian University of Health Sciences. He was supervised by prof. dr. Bronius Bakutis and consulted by lect. dr. Violeta Baliukoniene. The topic of this scientific research is “The effects of feeding mycotoxin binding products on the performance of lactating dairy cows“. Page count 37, 10 tables,3 pictures.
The experiments was done from 01/10/2011 to 01/10/2012 in LUHS VA in the Animal Welfare Reaserch Laboratory. The aim of this study were to investigate the long-term exposure toxic effects of diet naturally contaminated with a low concentrations mycotoxins (AFL B1, ZON, DON) on biochemical, complete blood count parameters and milk composition of dairy cows and to determined the mycotoxins detoxification by with the commercial X adsorbent. 28 Lithuanian Red clinically healthy medium productive cows were selected. Cows were from 3.43±0.24 lactation and duration of lactation were 122±15.9 days. Milk-yield of cow was 15.36 kg per day, an average of milk fat was 4.14 ±0.25 %, protein content 3.06±0.04 % and urea – 23.80±1.35 mg %. In cow feeds were determined mycotoxins aflatoxin B1 (AFL B1), zearalenone
(ZON), deoxynivalenol (DON). Zearalenone was the major contaminant and was found in the hay at level of up to 1000 µg/kg of dry matter. Deoxynivalenol was the second contaminant and was found in the hay at level of up to 600 µg/kg of dry matter. The biggest Aflatoxin B1 content -
10.0 µg/kg in ground barley. The commercial detoxifying product X was gave individual to 14 cow with concentration 40 mg per day, 9 weeks.
ĮVADAS
Siekiant uţtikrinti gyvulių sveikatingumą, tinkamą produktyvumą, silosuoti, kombinuoti ir kiti pašarai turi būti aukštos mitybinės vertės ir geros higieninės sanitarinės kokybės. Silosas, gali būti uţkrėstas ne tik patogeninėmis bakterijomis, tokiomis, kaip Clostridium tyrobutyricum,
Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes ir Escherichia coli O157, bet ir filamentiniais
mikromicetais (pelėsiniais grybais) ir jų antriniais toksiniais metabolitais – mikotoksinias. Šie junginiai kelia didelį susidomėjimą, dėl neigiamo (ţalingo) poveikio gyvulio organizmui (Biro ir kt., 2009).
Ţodis “pelėsis” apima įvairias mikroorganizmų grupes plačiai paplitusias aplinkoje, kur jie egzistuoja kaip saprofitai ar augalų patogenai. Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Pencillium ir
Aspergillus sp. – filamentiniai grybai daţniausiai aptinkami pašaruose (Biro ir kt., 2009). Šie
paminėti mikroskopiniai grybai gali sukelti ne tik mikotoksikozes, bet ir įvairias alergines reakcijas gyvūnams ir ūkių (fermų) darbuotojams.
Mikroskopiniai grybai pašaruose maţina pašarų mitybinę vertę, taip pat produkuoja antrinius metabolitus – mikotoksinus. Daţniausiai aptinkami mikotoksinai pašaruose – aflatoksinai, ochratoksinas A, zearalenonas, fumonizinai. Šeriant gyvulius pašarais, uţterštais mikotoksinais ilgą laiką, sukeliamas realus pavojus gyvulio sveikatingumui, o per gyvūninę ţaliavą ir ţmogaus sveikatai (Richard ir kt., 2007).
Pašarinių ţaliavų apsaugai nuo mikroskopinių grybų ir jų antrinių metabolitų didelis dėmesys skiriamas jau laukuose. Profilaktinės priemonės - apsaugančios nuo mikroskopinių grybų augimo ir plitimo augalų (pašarų ţaliavos) augimo metu, nuimant derlių, sandėliuojant - vienos efektyviausių. Tačiau prie tam tikrų aplinkos sąlygų, pašarų uţkrėstumas įvairias mikotoksinų derivatais yra neišvengiamas. Tuomet pašarų priedai tokie, kaip antioksidantai, amino rūgštys, vitaminai, mikroelementai naudojami sumaţinti toksinį mikotoksinų poveikį gyvulio organizmui (Kolossova ir kt., 2009). Padidėjus pranešimų skaičiui apie nustatomus mikotoksinus pašaruose, atsirado paklausa mikotoksinus detoksikuojančių preparatų. Daţniausiai naudojami mikotoksinų surišėjai, kurie sumaţina kenksmingų medţiagų absorbciją iš virškinimo trakto arba suskaldo jas į maţiau kenksmingus junginius.
Darbo tikslas
Įvertinti mikotoksinus detoksikuojančio preparato efektyvumą pieninių galvijų bandos sveikatingumui.
Uždaviniai:
1. Įvertinti galvijų sveikatingumą pasirinktame X ūkyje; 2. Įvertinti X ūkio pašarų higieninę sanitarinę kokybę; 3. Nustatyti mikotoksinų koncentracijas X ūkio pašaruose;
4. 1.LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Mikromicetai ir mikotoksinai aptinkami atrajotojų pašaruose
Aukšto produktyvumo karvių raciono sausojoje medţiagoje vyrauja didelė energijos ir maisto medţiagų koncentracija. Primelţiant per parą 10 kg pieno, 1 kg raciono sausųjų medţiagų (SM) pakanka 5,0 MJ NEL (neto energija – grynoji, produktyvioji energija) ir 120 g ţalių proteinų, o kai primilţis siekia 40 kg, turėtų būti 7,2-7,6 MJ NEL ir 180-190 g ţalių proteinų (Bartkevičiūtė, 2003). Intensyvios gamybos ūkiuose, laikant gyvulius ganyklose, koncentruoti pašarai sudaro tik keletą procentų viso dienos raciono, tuo tarpu, aukšto produktyvumo pieninių karvių ūkiuose, koncentruoti pašarai gali sudaryti 70 proc. viso dienos raciono (Fink-Gremmels, 2008). Tad mikotoksinai ir/ar jų derivatai į atrajotojų organizmą gali patekti su įvairiu pašaru, priklausomai nuo gyvulių šėrimo būdų.
1 lentelė. Miktotoksinų patekimo keliai į gyvulio organizmą su įvairiais pašarais (Fink-Gremmels, 2008)
Pašaras Mikotoksinai
Koncentruotas Aflatoksinai, fumonizinai, zearalenonas,
trichotecenai (DON), skalsių alkaloidai
Ganyklų ţolės Lolitremas, paspalitremas, penitremas A,
ergovalinas, skalsių alkaloidai
Konservuotieji pašarai (silosas) Patulinas, mikofenolinė rūgštis, roquefortinas, fumitremorgenas, verruculogenas, monakolinas ir kiti
Didţiausias mikotoksinų kiekis į gyvulio organizmą patenka su koncentruotais pašarais, tokiais kaip javų ir kukurūzų grūdai, gaminiai iš sojos, išspaudos iš aliejinių augalų (ţemės riešutų, saulėgrąţų, medvilnės, palmių sėklų, kopros (išdţiovintas kokoso riešutų branduolys). Daţniausiai nustatomi toksinai šiuose pašaruose yra aflatoksinai. Kiti ţinomi mikotoksinai, kaip fumonizinai, zearalenonas daţniausiai aptinkami kukurūzuose ir jų produktuose, javų grūdai daţniausiai uţteršti trichotecenais (ypač DON), OTA ir skalsių alkaloidais.
Ganykliniu laikotarpiu, į atrajotojų organizmą, su pievų ţole gali patekti endofitinių mikromicetų - Neotyphodium produkuojami toksinai, t.y. lolitrem-paksilline grupės toksinai ir ergovalinai, taip pat kiti skalsių alkaloidai.
Trečiasis miktotoksinų šaltinis, konservuoti pašarai, t.y. silosas, šienainis, šienas, šiaudai. Ypač po ilgo sandėliavimo laikotarpio, esant silpnai rūgštinei terpei ir aerobinems sąlygoms, šie pašarai gali būti uţkrėsti įvairiasi mikotoksikogeniniais mikromicetais. Konservuotuose pašaruose daţniausiai aptinkami ir identifikuojami šie mikromicetai Penicillium roqueforti, P.
paneum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Monascus spp., Byssochlamys nivea. Šie
mikromicetai geba produkuoti patuliną, mikofenolinę rūgštį, roguefortiną, makrofortiną A. andratiną, A. gliotoksiną ir verrukulogeno/fumitremorgeno grupės toksinus.
Pašarai daţniausiai jau būna uţkrėti mikromicetais ir jų antriniais metabolitais iki/ar derliaus nuėmimo. Naudojant uţkrėstą ţaliavą pašarų gamybai, taip uţteršiami ir galutiniai produktai – pašarai. Ţaliavų uţsiteršimas mikromicetais ir mikotoksinais priklauso nuo dirvos būklės, kurioje auginamos ţaliavos pašarui. Netinkamai sandėliuojamas pašaras gali tapti mikotoksinų šaltiniu.
Pasaulyje yra ţinoma apie 400 mikromicetų metabolitų. Dalis jų ţmonėms ir gyvūnams yra toksiški ir labai pavojingi. Aplinkoje egzistuoja didţiulė mikromicetų, produkuojančių toksiškus antrinius metabolitus, rūšių įvairovė. Mikotoksinus gamina ant augalų tiek lauko, tiek saugojimo laikotarpiu bei pašarų gamybos metu paplitusių Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria,
Paecilomytes, Stachylobotrys ir daugelio kitų genčių mikromicetai. Pastaraisiais metais nustatyta,
kad ţmonių ir gyvulių sveikatai ypač pavojingi kai kurių mikromicetų rūšių produkuojami toksinai: aflatoksinai, ochratoksinai, zearalenonai, T-2 toksinas, deoksinivalenolis, patulinai, aflatremai ir kiti pasiţymintis toksiniu veikimu: daţniausiai imunotoksiniu, hematopoetiniu, hepatotoksiniu, nefratoksiniu, neurotoksiniu, kancerogeniniu, teratogeniniu, dermatotoksiniu poveikiu organizmui (CAST, 2003).
1.2 Mikotoksinų poveikis atrajotojų sveikatingumui
Padidėję mikotoksinų kiekiai koncentruotuose pašaruose yra sunkiau nukenksminami, nes padidėja jų absorbcija gyvulio organizme. Ši hipotezė paremta stebėjimais, atliktais su melţiamomis karvėmis fermose. Tyrimo metu pastebėta sumaţėjusi pieno išeiga ir padidėjęs gyvulių sergamumas infekcinėmis ligomis, apsinuodijimai silosu, kuris uţterštas pelėsiais ir dideliais kiekiais DON ir zearalenonu bei kitais mikotoksinais. Taip pat ţymūs metabolitų ir
hormonų pasikeitimai pastebimi karvėms, nes karvės pereinamuoju laikotarpiu yra jautrios pašarui, uţterštu mikotoksinais (Fink-Gremmels, 2008).
Vieni pagrindinių faktorių lemiančių gyvūnų jautrumą mikotoksinų poveikiui yra pačio organizmo gebėjimas eliminuoti ir neabsorbuoti šių junginių. Pavyzdţiui atrajotojai, dėl prieskrandţių mikrofloros veiklos, kuri skaido ir inaktyvuoja daugelį cheminių junginių tame tarpe ir mikotoksinus, maţiau jautrūs mikotoksinų ţalingam poveikiui, nei su vienkameriniu skrandţio sistema, gyvūnai. Tačiau dėl savo skirtingos cheminės struktūros mikotoksinai skaidomi ir eliminuojami skirtingai, pavyzdţiui fumonizinai yra skaidomi sunkiau, nei aflatoksinai, trichotecenai, ochratoksinai. Tačiau nuolatos, nedidelėmis dozėmis, su pašaru mikotoksinams patenkant į atrajotojų organizmą, vystosi prieskrandţių acidozė, priesvorio sumaţėjimas, stebima laminitų, mastitų klinika. Ypač į organizmą patenkant Penicillium genties (pvz. P. roqueforti) išskiriamiems mikotoksinams, kurie pasireiškia neigiamu antimokrobiniu poveikiu (Barug, 2006).
Atrajotojų klinikinės mikotoksikozės siejamos su toksinais patenkančiais su pašarų į gyvulio prieskrandţius, kuriuose šie junginiai neskaidomi, ar skyla tik dalinai. Šiems toksinams priskiriami alkaloidai, laktonai, kumarinai, taip pat eicosonic karbocikliniai esteriai (Fink-Gremmels, 2007).
2 lentelė. Mikotoksinų stabilumas galvijų didţiajame prieskrandyje ir jų poveikis prieskrandţių mikroorganizmams (Fink-Gremmels, 2007)
Mikotoksinai (cheminės grupė) Mikotoksinų stabilumas prieskrandyje
Poveikis prieskrandţių mikroorganizmams
Tremergenai (alkaloidai, indolo terpenoidai)
+ + + Nėra nustatyta
Zearalenonas, patulinas (cikliniai laktonai) + + + + Aflatoksinai, ochratoksinai (furanai, kumarinai) + Nėra nustatyta Fumonizinai (eicosanoic karbocikliniai esteriai) + + + Nėra nustatyta Trichotecenai (A ir B grupės) (+) (+)
3 lentelė. Mikotoksinų poveikis (skirtingomis dozėmis) atrajotojams (Upadhaya ir kt., 2010)
Mikotoksinas Dozė Toksikozės simptomai Literatūros šaltinis Aflatoksinai (AFL) 600 μg/kg (kastruoti
buliukai, galvijų prieauglis) Sumaţėja pašaro įsisavinimas, priesvorio sumaţėjimas Helferich et al., 1986 200-800 μg/kg Suretėjimas didţiojo prieskrandţio susitraukimų Cook et al., 1986 2500 μg/kg pašare (ėriukai) po 21 dienos
Kepenų, inkstų pakitimai, šių organų masės padidėjimas Fernandez et al., 1997 10- 108,5 μg/kg pašare (galvijai) Sumaţėja pašaro įsisavinimas priesvorio sumaţėjimas Choudary et al., 1998 2500 μg/kg pašare (5 mėn. amţ. ėriukai) Ţymus priesvorio sumaţėjimas, sumaţėjęs ląstelinis imunitetas Fernandez et al., 2000 Ochratoksinai (OT) 390-540 μg/kg mieţiuose (12
sav. amţ. veršeliai)
Klinikiniai simptomai nepasireiškė Patterson et al., 1981 2000-5000 μg/kg (avys) Klinikiniai simptomai nepasireiškė; OT neaptikta po 1val. inkubacijos Keisling et al.,1984 100-150 μg/kg oţkos rumen sultys (in vitro)
OT neaptikta po 6 val. inkubacijos Liu et al., 2010 Zearalenonas (ZEN) 385-1,925 μg/kg pašaruose (laktacijos metu) Nestebimi pakitimai pieno produkcijos kiekyje ir kokybėje Shreeve et al., 1979 12000 μg/kg pašaruose (avys) Neigiami pakitimai reprodukcinėje sistemoje Dicostanzo et al., 1996
12000 μg/kg pašaruose (galvijai)
Klinikiniai simptomai
nepasireiškė Seeling et al., 2006 Deoksinivalenolis
(DON) ir T-2 toksinas
15600 μg/kg DON (avys)
Priesvorio sumaţėjimas Harvey et al., 1986
10000-20000 μg/kg T-2 pašaruose (veršeliai)
Papilių nekrozė ir opos omasum
Cheeke et al., 1998a
3000-5000 μg/kg (pieniniai galvijai)
Sumaţėjo IgA, albuminų ir globulinų kraujo serume
Korosteleva et al., 2007
1.2.1 Svarbiausios mikotoksinų grupės, jų įtaka karvių virškinimo trakto mikroflorai, bei ten vykstančių procesų reguliacijai
Mikotoksinų įvairovė yra labai didelė, todėl, nagrinėjant jų poveikį organizmui, yra išskiriama pavojingiausių ir labiausiai paplitusių mikotoksinų grupės. Vidurio ir Šiaurės Europos kraštų pašaruose ir maisto produktuose yra labiausiai paplitę šie mikotoksinai: aflatoksinai, ochratoksinai ir Fusarium sp. produkuojami toksinai: zearalenonas, T-2 toksinas, DAS, DON, kurie gali sukelti neigiamus sveikatos pakitimus atrajotojams. Kad atrajotojai yra maţiau jautrus neigiamam mikotoksinų poveikiui, nei monogastriniai gyvūnai, lemia atrajotojų prieskrandţių mikroflora, dalyvaujanti toksinų detoksikaciniame procese. 1984 metais Kiessling ir kt. mokslininkai nustatė, kad atrajotojams mikotoksikozės išsivysto labai retai, dėl prieskrandţių mikrofloros poveikio į toksinus (Fink-Gremmels, 2008).
Aflatoksinai (AFL). Ši toksinių metabolitų grupė yra daţniausiai Aspergillus genties mikromicetų veiklos produktas (Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius) (Lugauskas ir kt., 2002).
Aflatoksinai gali sukelti kepenų paţeidimus, ypač aflatoksinas B1. Apskritai šie mikotoksinai
visų pirma pasiţymi ţymiu imunosupresyviniu, kancerogeniniu, mutageniniu poveikiu. Aflatoksinai gali būti aptinkami piene, mėsoje, kiaušiniuose (Romer TM
Labs, 2000). Aflatoksinai su pašaru patekę į didįjį prieskrandį yra veikliai metabolizuojami pvz.AFB1 į AFM1, kuris vėliau sekretuojamas į pieną. AFM1 yra priskiriamas prie kancerogeninių junginių, tačiau AFB1 yra didesnis kancerogenas, nei AFM1, dėl savo gebėjimo sudaryti reaktyvius epoksidinius junginius, sudarant kovalentines jungtis su ląstelių DNR, slopinant nukleorūgščių sintezę (D„Mello, 2000).
Trichotecenai didelė mikotoksinų grupė. Dabartiniu metu chemiškai identifikuota daugiau kaip 60 skirtingų trichotecenų. Jie dar skirstomi į keturias grupes:
grupė A (T-2 toksinas, HT-2 toksinas, diacetokscirpenolis (DAS), neosolaniolas ir t.t.); grupė B (deoksinivalenolis (DON), nivalenolas (NIV), fusarenonas-X, ir t.t.);
grupė C (krotocinas);
grupė D (roridinas A, D, E, verukarinas A, B, satratoksinas H, G).
A grupės trichotecenai ţymiai toksiškesni uţ B grupės trichotecenus (Romer TM
Labs, 2000; Bakutis, 2004).
Trichotecenų toksikozėms būdingas vėmimas, viduriavimas, priesvorio sumaţėjimas. Ūmių toksikozių metų stebimos raudonos dėmės nepigmentuotoje odoje, kraujosruvos poodyje, raumenyse, seroziniuose ir mukoziniuose paviršiuose DON jautriausios kiaulės, maţiau paukščiai, galvijai. DON, su pašaru patekęs į galvijo didįjį prieskrandį, mikrofloros yra skaldomas, ir 54-75% šio mikotoksino bei jo metabolitų yra pašalinama su išmatomis. DON gyvulio organizme sujungiamas su gliukuronine rūgštimi ir išskiriamas per inkstus. Melţiamų karvių piene buvo nustatytas 26 ng/kg de-epoksi-DON, šeriant pašarais, kuriuose buvo 66 mg/kg DON (Eriksen ir kt., 1998).
Zearalenonas (ZEN). Šis mikotoksinas gaminamas Fusarium genties mikromicetų: F.
graminearum, F. culmorum, F. avenaceum, F. lateritium, F. equiseti rūšių (Romer TM Labs, 2000).
ZEN pagrindinis biologinis poveikis, organizmo reprodukcinę veiklos sutrikdimas. ZEN sukelia estrogenams panašų sindromą, kuris pasireiškia abiejų lyčių pieno liaukų ir spenių padidėjimu bei vulvos pabrinkimu bei vulvovaginitu, progresuojančiu iki makšties iškritimo. Tiriant ZEN įtaką galvijams, nustatyta, kad sumaţėja karvių apvaisinimas dirbtinai jas sėklinant (Krogh ir kt., 1995).
1.3 Mikotoksinų detoksikacija pašaruose
Mikotoksiniais uţteršti pašarai gyvulių augintojams daro didelius ekonominius nuostolius. Svarbiausias uţdavinys ūkiuose – kaip detoksikuoti mikotoksinais uţterštus pašarus. Mikotoksinų detoksikacija vyksta keliais etapais:
• suardomi, inaktyvuojami arba pašalinami mikotoksinai;
• detoksikuoti taip, kad nenukentėtų pašaro vertė;
• kuo daugiau sunaikinti sporų ir grybų micelio ir sustabdyti galimybę atsinaujinti mikotoksinų produkavimui;
• parinkti lengvai įterpiamas, nebrangiais ir nekenksmingas aplinkai detoksikavimo priemones (Bakutis, 2004).
1.3.1 Mikroskopinių grybų plitimo pašarų ţaliavoje sumaţinimas
Aptikus mikotoksinus ţaliavose, kurios turėtų būti naudojamos gyvulių pašarų gamyboje, gali būti imamasi įvairių priemonių, uţtikrinančių vienodą ir pastovų gyvulių produktyvumą. Gali būti atliekama fizinė dekontaminacija: valant ir sijojant. Fizinės priemonės, taikomos sandėliuojant grūdus, padeda, išvengti pašarų mitybinės vertės sumaţėjimo. Taip pat turi būti taikoma grieţta kontrolė sandėlių mikroklimatui, palaikant reikiama drėgmę, deguonies kiekį, temperatūrą. Taip pat gali būti taikomas cheminis apdorojimas, tačiau daţniausiai naudojama priemonė yra mikotoksinų inaktyvatoriai. Jie sumaţina mikotoksinų absorbciją iš virškinamojo trakto arba skaldo mikotoksinus į maţiau kenksmingas medţiagas (http://www.novusitus.lt/aktualijos/0/23,2009).
1.3.2 Fiziniai mikotoksinų detoksikacijos metodai
Grūdų valymas, plovimas naudojant vandenį ar natrio karbonatą, sumaţina kukurūzų uţkrėstumą Fusarium genties toksinais. Rankiniu būdu atrenkant ir pašalinant uţkrėstus grūdus, ar naudojant fluorescentinį metodą norint aptikti kai kuriais mikotoksinais uţkrėstus grūdus. Taip pat naudojami ir kiti fiziniai metodai, padedantys apsaugoti sandėliuojamą pašarų ţaliavą nuo mikromicetų ir jų produkuojamų toksinų, tai aukšta temperatūra, UV, rentgeno spinduliai, mikrobangos. Kai kurioje literatūroje nurodoma, kad mikotoksinais uţteršti pašarai gali būti maišomi su didesniu kiekiu pašarų neuţterštų šiais toksinais. Taip pat gali būti naudojamos įvairios mikotoksinus surišančios medţiagos pvz. kaustinės sodos kalcio aliuminio silikatas (hydrated sodium calcium aluminosilicates/HSCAS) ir filosilikatas išskirtas iš ceolito absorbuoja AFB1. Tačiau daugumos tyrimų metu nustatyta, kad šie junginiai silpnai absorbuoja kitus mikotoksinus. Ceolitai – mineralai, priskiriami šarminių metalų aliumosilikatų hidratams, galintis absorbuoti AFB1 ir ZON mikotoksinus. Bentonitas - aliuminio silikato molis, sudarytas iš vulkaninių pelenų ir gali būti naudojamas AFB1, T-2 mikotoksinų absorbcijai, tačiau šis
mineralas neabsorbuoja ZON ir nivalenolio toksinų. AFB1 taip pat suriša kaolinas, sepiolitas ir montmorilinitas, tačiau netaip efektyviai kaip HSCAS ir bentonitas (Kolossova ir kt., 2009).
Aktyvuota anglis gaunama pirolizės būdu iš organinių substratų (medţiagų), kuri dėl savo heterogeninės akytos struktūros pasiţymi mikotoksinus adsorbuojančiomis savybėmis. OTA ir AFL surišančiomis savybėmis pasiţymi cholestiramino ir polyvinylpolypyrrolidoksinivalenolio dervos. Įprasti mikotoksinų surišėjai nepasiţymi selektyvinėmis savybėmis ir todėl gali surišti ne tik mikotoksinus, bet ir maistines medţiagas. Tad ir šios medţiagos turi šalutinį poveikį, nes norint pasiekti mikotoksinus absorbuojantį veikimą, reikalingas didelis kiekis, kuris taip pat suriša mineralus ir vitaminus esančius pašaruose. Molis gali būti uţterštas sunkiaisiais metalais ir dioksinu. Kai kurios mikotoksinus surišančios meţiagos nėra suskaidomos ţarnyno mikrofloros, tad gali būti naudojamos virškinamojo trakto ligoms gydyti (Kolossova ir kt., 2009).
1.3.3 Cheminiai mikotoksinų detoksikacijos metodai
Įvairios cheminės medţiagos, tokios kaip rūgštys, bazės (amoniakas, kaustinė soda), oksidantai (vandenilio peroksidas, ozonas), reduktoriai (bisulfitai), chloro junginiai, formaldehidas gali būti naudojamos, kaip mikotoksinus ardančios medţiagos pašaruose, ypač aflatoksinus. Tačiau cheminis mikotoksinus detoksikuojantis metodas nepasiţymi dideliu efektyvumu yra brangus, tad nėra labai populiaros vartotojų tarpe (Kolossova ir kt., 2009).
1.3.4 Mikrobiologiniai metodai
Tam tikros pienarūgščių bakterijų padermės, propiono rūgšties bakterijos, bifidobakterijos, dėl savo ląstelės sienelės struktūros, pasiţymi mikotoksinus surišančiomis savybėmis, taip sumaţindamos toksinų neigiamą poveikį gyvulio organizmui. Tokiu būdu mikotoksinai iš organizmo pasišalina su išmatomis, nesukeldami neigiamo gyvūnui arba pavojaus ţmonėms, dėl jų galimos kumuliacijos valgomuose gyvulinės kilmės produktuose. Šiuo metu yra vykdomi moksliniai tyrimai, su natūraliais organiniais mikotoksinų surišėjais (absorbuotojais). Viena iš tokių medţiagų yra vandenyje tirpus polisacharidas - glukomananas, išskirtas iš Saccharomyces
cerevisiae ląstelės sienelės išorinės dalies. 500 g glukomanano išskirtas iš mielių ląstelės sienelės
4 lentelė. Glukomanano, išskirto iš Saccharomyces cerevisiae mikotoksinų surišimo geba (Devegowda, 2000)
Mikotoksinai Surišimo geba (proc.) Aflatoksinas (bendras) 95.0 Fumonizinas 67.0 ZON 77.0 T-2 33.4 Citrininas 18.4 DAS 12.7 DON 12.6 OTA 12.5 NIV 8.2 Fuzariotoksinas 7.9
Atliktuose tyrimuose nustatyta, kad ši mikotoksinus surišanti medţiaga sumaţina AFM1 kiekį piene 58 proc., įdedant jos į karvių pašarą, kuomet jis uţkrėstas aflatoksinu B1 0,05 proc. SM (Devegowda, 2000).
Ir kiti mikroorganizmai gali metabolizuoti mikotoksinus (Corynebacterium rubrum) kontaminuotuose pašaruose ar biotransformuoti juos (Rhizopus, Aspergillus, Eurotium). Tačiau šie procesai (veikimo mechanizmai) yra pakankamai lėti ir maţo efektyvumo. Nustačius
Aspergillus flavus ir A.parasiticus padermes neprodukuojančias aflatoksino, buvo pasiūlyta jas
panaudoti, kaip konkuruojančias mikromicetų gentis su mikotoksinus produkuojančiomis gentimis. Nes šie kamienai uţimą tą pačią ekologinę nišą, kaip toksiną gaminančios padermės, taip sumaţinant mikotoksinus gaminančių mikromicetų skaičių, o tuo pačiu metų ir mikotoksinų kiekį pašaruose (Yiannikouris ir kt., 2002).
5 lentelė. Mikroorganizmai naudojami toksikogeninius mikromicetų ir jų produkuojamų mikotoksinų detoksikacijai (Tsitsigiannis ir kt., 2012)
Naudojama prieš mikotoksikogeninį mikromicetą
Naudojama prieš mikotoksiną Biologinis veiksnys
A. flavus, A. parasiticus Aflatoxinas Atoksikogeninė Aspergillus padermė
Aspergillus spp. Aflatoksinas Pienarūgštės bakterijos
Aspergillus spp. Aflatoksinas Mikromicetų padermės detoksikuojančios AF
A.carbonarius, A.niger Ochratoksinas A Phyllosphere mielės (pvz. Aureobasidium pullulans)
F.verticilloides Fumonizinas Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, Kluyveromyces sp.
F.graminearum, F.culmorum DON Fusarium equiseti, mielės, Bacillus spp., Pseudomonas spp. Penicillium expansum Patulinas A. pullulans, P. syringae,
2. DARBO METODIKA
2.1 Tyrimui naudoti gyvūna ir pašarai
Tyrimas atliktas tvartiniu laikotarpiu (vasario – balandţio mėn.) su 28 ţalosios karvėmis X ūkyje. Karvės buvo suskirstytos į 2 grupes (bandomoji ir kontrolinė) po 14 gyvūnų. Kontrolinės karvių grupės laktacijų skaičius buvo vidutiniškai 4,14±0,35, bandomosios – 2,71±0,56. Bandymo pradţioje kontrolinės grupės laktacijos dienų skaičius buvo vidutiniškai 139,43±23,04, bandomosios – 106,36±19,65. Bandymas truko 9 savaites (63 dienas).
Bandomoji karvių grupė šerta pašarais natūraliai uţterštais mikotoksinais: aflatoksinu B1, zearalenonu, deoksinivalenoliu ir kasdien su kombinuotu pašaru paduodant po 40 gramų mikotoksinus detoksikuojančio preparato X.
Kontrolinė karvių grupė šerta tais pačiais pašarais, kaip ir bandomoji tik neįterpiant į kombinuotąjį pašarą mikotoksinus detoksikuojančio preparato.
Bandymo metu, kas 7 dienas, abiejų karvių grupių, buvo stebima bendra sveikatingumo būklė: kūno temperatūra, pulso ir kvėpavimo daţniai, didţiojo prieskrandţio sienos judesiai, išmatų konsistencija.
Prieš pradedant bandymą, atliktas karvėms šertų pašarų mikotoksikologinis tyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ir iškart po bandymo. Nusatytos mikotoksinų koncentracijos pašaruose pateiktos lentelėje 7.
Vienos karvės pašarų paros racioną sudarė 70 kg siloso ar šienainio, 18 kg koncentruotųjų pašarų ir kas trečią dieną 5 kg šieno. Laisvas priėjimas prie švaraus geriamo vandens bet kuriuo paros metu. Paskaičiuota mikotoksinų konkcentracija su pašaru patenkanti į gyvulio oraganizmą per parą ir viso bandymo metu (7 lentelė).
2.2 Pašarų higieninis sanitarinis įvertinimas
Bendras bakterinis uţterštumas (KSV/g) pašaruose nustatytas skiedimo metodu, panaudojus mitybini agarą. Lėkštelės su uţkratu inkubuotos termostate 30o
C temperatūroje.. Augančios kolonijos skaičiuotos po 24 val. ir 48 val. Po to apskaičiuotas bendras bakterijų skaičius (KSV/g - kolonijas sudarančių vienetų 1 g mėginio) Tyrimai atlikti vadovaujantis
Lietuvos higienos normos HN 26:2006 „Maisto produktų mikrobiologiniai kriterijai“, LST EN ISO 4833:2003.
Kiekybinis pašarų uţkrėstumas mikromicetų pradais (KSV/g) nustatytas skiedimo būdu. Atsveriama 10 g mėginio sumalama, talpinama į 90 ml distiliuoto vandens kolbutę ir maišoma 20 min. Atliekami mėginio skiedimai iki – 1:10-3
. Gavus reikiamą praskiedimą, imamas 1 ml skiedinio ir sėjama į Petri lėkštelę ant Čapeko agarizuotos terpės – įtrynimo būdu. Petri lėkštelės inkubuojamos 26±2oCtemperatūroje 7-10 parų.. Augančios mikromicetų kolonijos vertinamos 7, 10 vystimosi parą. Po to apskaičiuojama mikromicetų gyvybingų sporų skaičius grame pašaro.
Grybų morfologiniai poţymiai tirti šviesiniu mikroskopu, remiantis įvairiais apibūdinimais (Samson et al., 1988, Lugauskas ir kt., 2002). Nustatyta kokios mikromicetų gentys auga ir apskaičiuota procentinė jų sudėtis.
2.3 Mikotoksinų koncentracijos nustatymas pašaruose
Mikotoksinų deoksinivalenolio (DON), zearalenono (ZEN), aflatoksino B1 (AFL B1)
koncentracijos nustatytos plonasluoksne chromatografija (PLCh), pagal Romer LAB (JAV) metodikas. Tyrimui naudoti reagentai: acetonitrilas, dest. vanduo, metanolis, toluolas, acetonas, aliuminio chloridas. Mėginio paruošimui paimtas tipingas tiriamasis mėginys sumalamas Romer Lab malūnu; sumaišoma ir atsveriama 25 g mėginio į miksterio indą. Mėginys ekstraguojamas t.y 100 ml 84/16 acetonitrilo/vandens mišinio; maišoma dideliu greičiu 3 minutes, perfiltruojama per popierinį filtrą. Gryninama per Multisep®
216 kolonėlę. Koncentracijos nustatymas: Į specialius mikrošvirkštelius pritraukti 10; 20; 40; 60; 80 µl DON, standarto ir 80 µl tiriamo mėginio. Ant chromatografinės plokštelės uţnešame: 10; 20; 40; 60; 80 µl DON standarto su specialiais mikrošvirkštais ir 80 µl tiriamo mėginio. Plokštelė įmerkiama į vonelę su ½ (10 ml/20 ml) toluolo/acetono mišiniu. Plokštelė apipurškiama 15 proc. aliuminio chloridu metanolyje. Plokštelė išdţiovinama ore ir pakaitinama 5 min ant plytelės 150 oC temperatūroje. Įvertinama
DON koncentracija UV spindulių fone (360 nm). Toksino koncentracija apskaičiuojama ppm (mg/kg). Į specialius mikrošvirkštelius pritraukti 10; 20; 40; 80 µl zearalenono standartų ir 80 µl tiriamo mėginio. Ant silikagelio chromatografinės plokštelės uţnešame: 10; 20; 40; 80 µl zearalenono bei aflatoksino B1 standartų ir 90 µl tiriamo mėginio su specialiais mikrošvirkštais.
Plokštelė įmerkiama į 9/1 (18 ml/2 ml) chloroformo/acetono mišinio vonelę. Laikoma, kol skystis pakyla iki 1 cm plokštelės viršaus. Po to plokštelė išdţiovinama ore. Įvertinama AFL B1
išdţiovinama ore. ZEN koncentracija įvertinama UV spindulių fone.Toksino koncentracija apskaičiuojama ppm (mg/kg). Aptikimo riba DON - 20 ppb; ZEN – 10 ppbAFL B1 – 2 ppb
2.4 Kraujo mėginių paėmimas ir tyrimas
Galvijų kraujas iš v. jugularis paimtas į sterilius mėgintuvėlius su konservuojančiu tirpalu (Na citratas – 3,8 %, EDTA) morfologiniams kraujo tyrimams ir į mėgintuvėlius be antikoaguliantu biocheminiams kraujo tyrimams. Kraujas imtas prieš rytinį karvių šėrimą bandymo pradţioje ir pabaigoje. Morfologiniai kraujo rodikliai tirti LSMU VA stambių gyvūlių klinikinių tyrimų laboratorijoje analizatoriumi “Abacus junior vet„. Biocheminiai rodikliai ištirti Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Radiologinių tyrimų skyriuje, naudojant automatinį biocheminį analizatorių „COBAS INTEGRA400 plus“ (Tegimenta Ltd. Roche, Šveicarija). Tirti glutamil transferazė (GGT), šarminė fosfatazė (ALP) kraujo serumo fermentai;nustatytas bendras baltymų kiekis (TB), albuminų kiekis, šlapalo kiekis. Gauti morfologinių kraujo rodiklių tyrimų rezultai lyginti su analizatoriaus “Abacus junior vet“. pateiktomis normomis kiekvieno gyvūlio rūšiai atskirai, o biocheminių ”BAYR MED LT 2000“ normomis.
2.5 Pieno mėginių paėmimas ir tyrimas
Pieno kiekis nustatytas kontrolinio melţimo metu. Mėginiai buvo tiriami VĮ „Pieno tyrimai“, juose buvo nustatyti pieno riebalai, pieno baltymai ir urėja (šlapalas) kurie tirti prietaisu „LactoScope FTIR“ (FT1.0.2001; Delta Instruments, Olandija).
2.6 Statistinis duomenų įvertinimas
Tyrimų duomenys įvertinti ,,R 2.2.0“ ir ,,Microsoft Exel“ programa. Apskaičiuoti gautų duomenų aritmetiniai vidurkiai (Xv), vidurkių paklaidos (Sx), vidutiniai kvadratiniai nuokrypiai
(S), variacijos koeficientai (Cv), koreliacijos koeficientas (r). Duomenys tarp grupių patikimi, kai
3. TYRIMŲ REZULTATAI
3.1 Pašarų higieninis sanitarinis įvertinimas X ūkyje
Gendant pašarams, kinta ir juose esančių mikroorganizmų procentinė sudėtis, todėl vertinant pašarų higieninę sanitarinę kokybę, yra svarbu atsiţvelgti į mikroskopinių grybų bei bakterijų aptikimą juose.
Prieš bandymą iš ūkio X paimti kombinuoti (grūdiniai), silosuoti pašarai, uţauginti ir paruošti tame pačiame ūkyje.
1 paveikslas. Mikromicetų aptikimo daţnis proc. pašaruose X ūkyje
Įvertinus pašarų uţkrėstumą mikroskopiniais grybais nustatyta, kad labiausiai Aspergillus spp. genties mikroskopiniais grybais uţkrėstas buvo grūdų mišinys. Daugiamečių ţolių šienas labiausiai uţkrėstas Fusarium spp. ir Penicillium spp. mikromicetais. Aviţų ir peliuškų šiaudai labiausiai uţkrėsti Penicillium spp. mikromicetų gentimi (1 pav.).
2 paveikslas. Pašaro mėginių bendras bakterinis uţterštumas (KSV/g)
Nustatyta X ūkio pašarų, šertų bandymo metu, mėginių bendras bakterinis uţterštumas (2 pav.). Bendras bakterinis uţterštumas pašaruose kito nuo 23,0x103
iki 6000,0x103, t.y maţiausias bendras bakterinis uţterštumas nustatytas liucernos-šunaţolės silose, didţiausias grūdų mišinyje.
Nepaţeistuose grūduose bendras bakterijų skaičius 1 g daţniausiai nesiekia 1 milijono (rekomenduojama norma 500000 KSV/g) (Baliukonienė ir kt., 2002). Tirtame grūdų mišinio mėginyje nustatytas bendras bakterijų skaičius 6000x103
KSV/g, ţymiai viršijo rekomenduojamą normą.
Maisto ir pašarų saugos reikalavimais mikroskopinių grybų kiekis yra ribojamas Sąlyginai saugu naudoti tokius grūdus, pašarus ar kitus augalinės kilmės produktus, kai grybų pradų kiekis viename tiriamo produkto grame neviršija 10 tūkst. KSV/g (Mankevičienė, 2007).
Ištirus X ūkio pašarus, nustatyta, kad mikroskopinių grybų pradų kiekis kito nuo 1,00x103
iki 53,33 x103 KSV/g, t.y. liucernos ir šunaţolės silose mikroskopinių grybų nustatyta maţiausiai, grūdų mišinyje - didţiausias kiekis.
6 lentelė. Mikotoksinų kiekiai pašaruose ir jų patekimas į gyvulio organizmą per parą Pašaras Mikotoksinų koncentracijos (µg/kg)
AFLB1 DON ZON
1.Aviţų, pašarinių ţirnių, liucernos silosas 6,0 350,0 550,0 2. Liucernos-šunaţolės šienainis 7,0 500,0 700,0 3.Šienas daugiamečių ţolių 4,0 600,0 1000,0 4.Grūdų mišinys 10,0 450,0 270,0 MIKOTOKSINŲ KIEKIS (mg/kg) PATEKĘS Į GYVULIO ORGANIZMĄ PER PARĄ 6,35 393,5 511,1 MIKOTOKSINŲ KIEKIS (mg/kg) PETEKĘS Į GYVŪLIO ORGANIZMĄ VISO BANDYMO METU
Vienos karvės pašarų paros racioną sudarė 70 kg siloso ar šienainio, 18 kg koncentruotų pašarų ir kas trečią dieną 5 kg šieno. Laisvas priėjimas prie švaraus geriamo vandens bet kuriuo metu. Paskaičiuotos mikotoksinų koncentracijos su pašaru patenkančios į gyvulio organizmą per parą ir viso bandymo metu (6 lentelė).
Pašarų mėginiuose, paimtuose iš X ūkio, zearalenono didţiausia koncentracija t.y. 1000 µg/kg nustatyta daugiamečių ţolių silose, maţiausias šio toksino kiekis 270 µg/kg aptiktas grūdų
mišinyje. Zearalenono koncentracija pašaruose remiantis EU Rekomendacija 2006/576/EB melţiamoms karvėms 500 µg/kg 12 proc. drėgnumo pašare.
Deoksinivalenolio didţiausia koncentracija - 600 µg/kg nustatytas daugiamečių ţolių silose.
Aviţų, pašarinių ţirnių, liucernos silose DON aptikta maţiausiai 350 µg/kg. Deoksinivalenolio koncentracija pašaruose pagal EU Rekomendacija 2006/576/EB galvijų prieaugliui iki 4 mėn. amţiaus 2000 µg /kg 12 proc. drėgnumo pašare.
Aflatokisno B1 daugiausiai aptikta grūdų mišinyje - 10,0 µg/kg, daugiamečių ţolių šiene – 4,0 µg/kg. Pagal Europos Sąjungos 2002/32/EB AFLB1 melţiamų karvių pašare, negali būti daugiau nei 20,0 µg/kg.
3.2 Kontrolinės ir bandomosios galvijų grupių sveikatingumo įvertinimas bandymo metu X ūkyje
Bandymų metu, abiejuose karvių grupėse, gyvulių gaišimų, traumų nepasitaikė, tačiau diagnozuota po vieną ūmų mastita, kurie buvo atitinkamai gydomi. Laikyta, kad mastitai neįtakojo bandymo rezultatų.
7 lentelė. Karvių sveikatingumo rodikliai
Karvių grupė Kūno temperatūra ºC Pulsio daţnis (tvinksnių skaičius/min.) Kvėpavimo daţnis (kvėpavimo judesių skaičius/min.) Didţiojo prieskrandţio sienos judesių skaičius/2 min. KONTROLINĖ 38,48± 0,005 67,04±0,32 19,05±0,19 3,99±0,04 BANDOMOJI 38,45±0,007 69,2±0,22 20,2±0,17 4,01±0,05
FIZIOLOGINĖ NORMA (Sutkevičius, 2003)
37,5 – 39,0 50 - 80 10 - 30 2-5
Kaip matoma 7 lentelėje, abiejų karvių grupių tirti karvių sveikatingumo rodikliai atitiko fiziologines normas.
3.3 Karvių kraujo tyrimas
8 lentelėje pateikta karvių kraujo serumo biocheminių rodiklių rezultatai gauti prieš ir po bandymo. Nustatant mikotoksinų absorbento poveikį gyvuliams, kontrolinės grupės karvių pašarų racioną nebuvo įterptas mikotoksinų absorbentas, o į bandomosios grupės karvių racioną buvo įdėtas.
8 lentelė. Karvių biocheminiai kraujo rodikliai prieš ir po bandymo
Karvių grupė TP (Bendri baltymai), g/l ALB (Albuminai), g/l ALP (Šarminė fosfatazė), U/L GGT (Glutamil transferazė), U/L Šlapalas, mmol/L Kontrolinė, (prieš bandymą) 70.96 ± 0.84 36.54 ± 0.47 45.0 ± 4.11 24.41 ± 1.49 5.03 ± 0.25 Kontrolinė, (63 d. po bandymo pradţios) 77.22 ± 1.12 39.12 ± 0.86 50.19 ± 8.03 29.04 ± 1.49 11.71 ± 6.23 Pašaro (raciono) poveikio) koreliacijos koeficientas *** 0.70 0.25 0.70** 0.58* -0.22
Bandomoji, . (prieš bandymą) 71.35 ± 1.21 34.54 ± 0.82 62.88 ± 11.94 28.44 ± 1.49 4.19 ± 0.32 Bandomoji (63 d. po bandymo pradţios) 76.0 ± 1.35 37.98 ± 0.72 59.56 ± 10.61 28.94 ± 2.28 6.19 ± 0.30 Pašaro (raciono) poveikio) koreliacijos koeficientas *** 0.343 0.64* 0.86** 0.6* 0.55* Rodiklių normos 70 - 94 34 - 43 _ _ 3.0 – 8.3 * p<0,05 ** p<0,01 ***r vertė
(8 lentelė). Lyginant kontrolinę grupę su bandomąja, stebimas ţymus šlapalo kiekio padidėjimas kraujyje kontrolinėje karvių grupėje, t.y. 57,05 proc. (p>0,05) 63 dienos nuo bandymo pradţios. Šis rodiklis viršijo nustatytą normą. Bandomojoje karvių grupėje, šeriant gyvulius su mikotoksinų absorbentu, šis rodiklis po 63 dienų nuo bandymo pradţios padidėjo 32 proc. (p<0,05), nei prieš bandymo pradţią, tačiau neviršijo nustatytos kraujo rodiklių normos.
Analizuojant kitus biocheminius kraujo rodiklius pastebima, kad kontrolinėje karvių grupėje (63 dienos nuo bandymo pradţios) padidėjo GGT rodiklis 15,9 proc. (p<0,05) nei prieš bandymą, bandomojoje grupėje šis rodiklis (63 dienos nuo bandymo pradţios) padidėjo 1,9 proc. (p<0,05) nei prieš bandymą. ALP, po 63 dienų nuo bandymo pradţios, padidėjo kontrolinėje karvių grupėje 11,65 proc. (p<0,01) nei prieš bandymą, bandomojoje grupėje šis rodiklis, 63 dienos nuo bandymo pradţios, padidėjo 18,15 proc. (p<0,01) nei prieš bandymą.
Bendras baltymo kiekis kontrolinėje karvių grupėje, po 63 dienų nuo bandymo pradţios, padidėjo 8,11 proc. (p>0,05), o albuminai 6,60 proc. (p>0,05) nei prieš bandymo pradţią, bandomojoje grupėje (63 dienų nuo bandymo pradţios), atitinkamai 6,12 proc. (p>0,05) ir 9,06 proc. (p<0,05) nei prieš bandymo pradţią.
9 lentelė. Karvių morfologiniai kraujo rodikliai prieš ir po bandymo Karvių grupė WBC (Leuk ocitai) ,tūkst./ µL GR, (Granuli ocitai), % LYM (Limfoc itai), % PLT (Tromboc itai), % RBC (Eritrocita i),mln./µL HCT (Hematok ritas), % HGB (Hemaglo binas), g/dL Kontrolinė,( prieš bandymą) 7.1 2±0.5 2 2.44± 0.19 4.17± 0.11 256.64 ±45.06 5.56±0. 15 26.81± 0.58 77.64± 1.95 Kontrolinė,( 63d. nuo bandymo pradţios) 8.7 6±0.7 1 3.78± 0.40 4.19± 0.33 183.00 ±26.37 5.96±0. 26 27.63± 0.75 79.79± 2.70 Pašaro (raciono) poveikio) koreliacijos koeficientas *** 0.3 8 0.18 0.56* 0.31 0.68** 0.22 0.27 Bandomoji,. (prieš bandymą) 10. 36±0. 96 4.42± 0.71 5.05± 0.42 240.07 ±35.69 6.09±0. 22 27.78± 0.66 81.14± 2.23 Bandomoji (63 d. nuo bandymo pradţios) 10. 77±0. 62 4.11± 0.38 5.74± 0.37 386.79 ±168.39 6.63±0. 25 30.30± 1.09 85.72± 2.44
Pašaro (raciono) poveikio) koreliacijos koeficientas *** -0.68 -0.19 0.43 0.22 0.5 0.27 0.51 Rodiklių normos 4.0 -12 0.6-6.7 2.5-7.5 100-800 5.0-10.0 24-46 80-150 * p<0.05 ** p<0.01 ***r vertė
Analizuojant pašaro su mikotoksinų absorbentu ir be mikotoksinų absorbento poveikį karvių morfologiniams kraujo tyrimams, nustatyta, kad kontrolinėje karvių grupėje, po 63 dienų nuo bandymo pradţios, sumaţėjo trombocitų kiekis 28,7 proc. (p>0,05) nei prieš bandymo pradţią, o bandomojoje grupėje, šis rodiklis padidėjo 37,9 proc. (p>0,05) nei prieš bandymo pradţią. Tačiau abiejų karvių grupių trombocitų keikis neviršijo normos ribų.
Hematokritas bandomųjų karvių grupėje, po 63 dienų nuo bandymo pradţios, padidėjo 8.3 proc (p>0.05) nei prieš bandymo pradţią, o kontrolinėje padidėjo 2.97 proc. (p>0.05) nei prieš
3.4 Karvių pieno tyrimas
10 lentelė. Karvių pašarų (raciono) poveikis pieno kiekiui, cheminei sudėčiai, somatinių ląstelių kiekiui Karvių grupė Pieno rodikliai Produktyvu mas (kg/karvei) Riebalai (proc.) Baltymai (proc.) Laktozė (proc.) Šlapalas (proc.) Somatin ės ląstelės ląst./ml x 1,000 Kontroli nė, (prieš bandymą) 15.01±0. 98 4.81±0. 3 3.48±0.1 1 4.61±0. 03 46.0±2. 25 47.5± 33.39 Kontrolin ė, (63 d. nuo bandymo pradţios) 15.99 ±1.71 4.17±0. 40 3.32±0.3 2 4.47±0. 44 22.0±0 .43 82,5± 66,08 Pašaro (raciono) poveikio koreliacijos koeficientas *** 0.28 0.48 -0.18 0.01 0.11 0,8 ** Bandomo 14.14 4.25±0. 2.84±0.3 3.82±0. 33.07± 247,5
ji, (prieš bandymą) ±1.77 59 3 44 4.86 0±134,5 Bandomo ji, (63 d. nuo bandymo pradţios) 16.06 ±1.04 3.53±0. 15 3.44±0.0 8 4.48±0. 03 23.36± 1.45 405,7 1±307,9 2 Pašaro (raciono) poveikio koreliacijos koeficientas *** -0.9 0.72** 0.58* 0.41 -0.14 0,1** * p<0.05 ** p<0.01 ***r vertė
Šeriant gyvulius pašarais, natūraliai kontaminuotais mikotoksinais, ir pašarais su mikotoksinų absorbentu, tyrimų metu pastebėta, kad kontrolinėje karvių grupėje, kur nenaudotas mikotoksinų absorbentas, pieno kiekis, po 63 dienų nuo bandymo pradţios, padidėjo 6,12 proc. (p>0,05) nei prieš bandymo pradţią, o bandomojoje grupėje – 11,96 proc. (p>0,05) nei prieš bandymo pradţią. Šlapalo koncentracija karvių piene, abiejuose grupėse sumaţėjo, po 63 dienų nuo bandymo pradţios,: kontrolinėje karvių grupėje 52,00 proc. (p<0,05) nei prieš bandymo pradţią., o bandomojoje 29,36 proc. (p>0,05) nei prieš bandymo pradţią.
Riebalų kiekis kontrolinėje grupėje sumaţėjo 13,31 proc. (p>0,05), o bandomojoje – 16,94 proc. (p<0,01) po 63 d. nuo bandymo pradţios. Baltymų kiekis kontrolinėje karvių grupėje sumaţėjo 4,6 proc. (p>0,05), o bandomojoje padidėjo 17,44 proc. (p<0,01) po 63 d. nuo bandymo pradţios. Laktozės kiekis kontrolinėje grupėje sumaţėjo sumaţėjo 3,03 proc. po 63 d. nuo bandymo pradţios, o bandomojoje – padidėjo 14,73 proc. (p>0,05) po 63 d. nuo bandymo pradţios.
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiame tyrime naudoti pašarai buvo natūraliai uţkrėsti mikotoksinais. Didţiausios mikotoksinų koncentracijos nustatytas daugiamečių ţolių šiene: DON - 600 µg/kg, o ZON - 1000 µg/kg, AFLB1 didţiausia koncentracija – 10 µg/kg nustatytas grūdų mišinyje. Pašarai taip pat galėjo būti uţteršti ir kitais netirtais mikotoksinais ar jų metabolitais, kurie, dėl sinergistinio poveikio tarpusavyje gali padidinti nustatytų mikotoksinų neigiamą veikimą gyvulio organizmui. Konjuguoti mikotoksinai, kurie daţniausiai būna prisijungę prie labiau polinių medţiagų, kaip pavyzdţiui gliukozės, vadinami „uţmaskuotais“ mikotoksinais. Šie mikotoksinai gali iškreipti aptikimo metodus, tačiau jie gali būti atpalaiduojami hidrolizės būdu in vivo. 2005 metais Berthiller ir kiti mokslininkai pristatė pirmą pranešimą apie natūraliai paplitusius DON glikozidus Fusarium uţkrėstuose kviečiuose (Korosteleva ir kt., 2007).
Išanalizavus bandymo rezultatus nepastebėtas ţymus poveikio skirtumas gyvulio organizmui, šeriant pašaru su mikotoksinų absorbentu ir be jo. Gyvulio kūno temperatūra, pulsas, kvėpavimo ir prieskrandţių susitraukimo daţniai nepakito dėl mikotoksinų poveikio. To prieţastimi galėtų būti santykinai ţema mikotoksinų koncentracija pašaruose, arba per trumpas bandymo laikas, geros mikroklimatinės aplinkos sąlygos. Blogos aplinkos mikroklimato sąlygos ir pašarai uţteršti mikotoksinais – tinkamas derinys neigiamai įtakojantis gyvulio organizmą (Korosteleva ir kt., 2007).
Hemaglobino kiekis, leukocitų, granuliocitų, trombocitų kiekiai nekito priklausomai nuo šėrimo būdo. Šie duomenys sutapo su 2007 metų Tripathi ir kitų moksininkų duomenimis, kuomet ėriukai šerti grūdais uţterštais aflatoksinu B1 50 µg/kg.
Mūsų atlikto bandymo, po 63 dienų, metu trombocitų kiekis sumaţėjo kontrolinės grupės, o bandomojoje grupėje šis rodiklis padidėjo. Šie duomenys nėra statistiškai patikimi (p>0.05) ir su analizuotos literatūros duomenimis nesutapo.
Literatūroje maţai aptinkama duomenų apie mikotoksinų DON ir ZON poveikį melţiamų karvių pieno primilţiui. Mūsų tyrimų duomenimis, statiškai nereikšmingai pieno primilţis neţymiai padidėjo bandomojoje karvių grupėje, šertoje su mikotoksinų absorbentais. 1996 metais mokslininko Ingalls atliktais tyrimais nustatyta, kad pieno kiekis nekito, šeriant gyvulius koncentruotais pašarais uţterštais DON toksinais 66 mg/kg 5 dienas ir 14 mg/kg 21 dieną. Mūsų bandymo metu atliktuose tyrimuose pieno cheminės sudėties pokyčiai statistiškai nereikšmingi.
dauguma α- ir β- globulinų yra sintezuojami kepenyse. Baltymų pakitimai kraujo serume gali atspindėti daugelį ligų ar sutrikimų priklausomai, kuri baltymų frakcija yra pakitusi. Mūsų atliktame tyrime bendras baltymų kiekis ir albuminų frakcijos kiekis neţymiai padidėjo (duomenys nėra statistiškai reikšmingi). 2007 metais Kanados mokslininkų atliktame tyrime, šeriant karves pašarais uţkrėstais Fusarium genties produkuojamais mikotoksinais ir įvertinus jų poveikį biocheminiams kraujo rodikliams, nustatyta, kad bendras baltymų kiekis padidėjo po 42 dienų bandymo, o albumino-globulino santykis sumaţėjo, lyginant su kontrolines karvių grupės biocheminiais rodikliais. Taip pat šio tyrimo metu padidėjo šlapalo kiekis kraujo serume. Šie duomenys sutampa su mūsų gautais duomenimis, kuomet šlapalo kiekis kraujo serume, kontrolinės karvių grupės, šertos pašarais uţterštais mikotoksinais, be mikotoksinų absorbento, padidėjo du kartus ir viršijo normą. Tačiau šlapalo kiekis mūsų tyrimų duomenimis padidėjo ir
kontrolinėje karvių grupėje, šertoje pašarais uţterštais mikotoksinais su mikotoksinų absorbentu. Literatūros duomenimis, šlapalo koncentracija karvių kraujo serume gali padidėti dėl pakitusios amoniako absorbcijos prieskrandţiuose, ar pakitusio baltymų metabolizmo audiniuose. Atrajotojų kraujo serume šlapalo koncentracija priklauso nuo prieskrandţių mikrofloros veiklos. Didţioji baltymų dalis, patenkanti į gyvulio organizmą su pašaru, yra hidrolizuojama ir deamininama prieskrandţių mikrofloros, taip susidarant laisvam amoniui, peptidams prieskrandyje (Herdt, 200).
IŠVADOS
1. Karvių sveikatingumo rodikliai X ūkyje atitiko fiziologines normas abiejų karvių grupių viso bandymo metu.
2. Įvertinus X ūkio pašarų kokybę nustatyta, kad Aspergillus spp. genties mikromicetais dominavo grūdų mišinyje. Daugiamečių ţolių šiene dominavo Fusarium spp. ir Penicillium spp. mikromicetai, o aviţų ir peliuškų šiauduose - Penicillium spp. mikromicetų gentis.
3. Bendras bakterinis uţterštumas pašaruose kito nuo 23,0x103
iki 6000,0x103 KSV/g.Maţiausias bendras bakterinis uţterštumas nustatytas liucernos-šunaţolės silose, didţiausias - grūdų mišinyje.
4. Ištirus X ūkio pašarus, nustatyta, kad mikroskopinių grybų pradų kiekis kito nuo 1x103
iki 53.33 x103 KSV/g.. Liucernos ir šunaţolės silose mikroskopinių grybų nustatyta maţiausiai, o grūdų mišinyje - didţiausias kiekis.
5. Didţiausias mikotoksinų kiekis nustatytas daugiamečių ţolių šiene, t.y. DON - 600 mg/kg, o ZON -1000 mg/kg, AFLB1 (10 µg/kg) didţiausias kiekis nustatytas grūdų mišinyje;
6. Išanalizavus biocheminius kraujo rodiklius, pastebėta, kad abiejuose karvių grupėse labiausiai pakito (90 dienų nuo bandymo pradţios) šlapalo koncentracija, t.y. padidėjo, bandomojoje karvių grupėje – 57,05 proc. (p>0,05), o kontrolinėje 32 proc. (p<0,05) nei prieš bandymo pradţią. 7. Įvertimus mikotoksinus detoksikuojančio (absorbento) peparato X efektyvumą nustatyta, kad jis neturėjo (statistiškai patikimo) poveikio morfologiniams kraujo rodikliams, pieno kiekiui ir cheminei sudėčiai;
Šeriant melţiamas karves pašarais, natūraliai uţkrėstais mikotoksinais, kai mikotoksinų koncentracija DON - 600 µg/kg, ZON 1,000 mg/kg, AFLB1 (10 µg/kg) nepastebėtas neigiamas poveikis karvių sveikatingumui, biocheminiams ir morfologiniams kraujo rodikliams, pieno sudėčiai. Tikėtinas didesnis poveikis, esant didesniam DON kiekiui pašaruose.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bakutis B. Concentraction of mycotoxins in forage under problematic cases.Veterinarija ir zootechnika. 2002. T. 19. P. 35-37.
2. Bakutis B. Mikotoksinai gyvulių pašaruose. Kaunas: Terra Publica. 2004. 82 p.
3. Baliukonienė V., Bakutis B. Kviečių ir mieţių mikotoksikologinis ir mikrobiologinis įvertinimas sandėliavimo metu. Veterinarija ir zootechnika. T. 17 (39). 2002. P 10.
4. Bartkevičiūtė Z. Pieningų karvių šėrimas. Mano ūkis. 2003. Nr.7. P. 1.
5. Bíro D., Juráček M., Kačániová M., Šimko M., Gálik B., Michálková J., Gyöngyová E. Occurrence of microscopic fungi and mycotoxins in conserved high moisture corn from Slovakia. 2009. Ann Agric Environ Med. 16. P. 227–232.
6. CAST. Mycotoxins: Risks in Plant, Animal, and Human Systems. Council for Agricultural Science and Technology, Ames, Iowa. USA. 2003. 217 p.
7. Devegowda G., Mettre les mycotoxines sur la touche : d‟où viennent glucomannanesestérifiés, Feed. Times 4 (2000) 12–14.
8. Eriksen G., Aleksander J. Fusarium toxins in cereals – a risk assessment. Tema Nord 1998:502. Nordic Council of Ministers, Copenhagen. 1998. P. 10-165.
9. Herdt, T. H. Variability characteristics and test selection inherd-level nutritional and metabolic profile testing. 2000. The Veterinary Clinics of North America. P. 387–403.
10. Yiannikouris A., Jouany J.-P. Mycotoxins in feeds and their fate in animals: a review.
Anim. Res. 2002. T. 51.P. 81–99
11. Fink-Gremmels J. Mycotoxins in cattle feeds and carry-over to dairy milk: A review. Food Additives and Contaminants February. 2008. 25(2). P. 172–180.
12. Richard E., Heutte N., Sage L., Pottier D., Bouchart V., Lebailly P., Garon D. Toxigenic fungi and mycotoxins in mature corn silage. Food and Chemical Toxicology. 2007. 45. P. 2420–2425.
13. RomerTM Labs. Mycotoxins – AN Overview. Romer Labs. Inc. 2000. P. 14-46.
14. Korosteleva S. N., Smith T. K., Boermans H. J. Effects of Feedborne Fusarium Mycotoxins on the Performance,Metabolism, and Immunity of Dairy Cows. American Dairy Science Association. 2007. P. 3867–3873.
15. Kolossova A., Stroka J., Breidbach A., Kroeger K., Ambrosio M., Bouten K., Ulbertth F. Evaluation of the Effect of Mycotoxin Binders in Animal Feed on the Analytical
Performance of Standardised Methods for the Determination of Mycotoxins in Feed. JRC Scientific and Technical Reports. 2009. P. 6–7.
16. Krogh P., Hald B., Pedersen E.J. Occurance of ochratoxin A and citrinin in cereals associated with mycotoxic porcine nephrophaty. Acta Pathol. Microbiol. Scand. B 81. 1995. P. 689-695.
17. Lugauskas A., Paškevičius A., Repečkienė I. Patogeniški ir toksiški mikroorganizmai ţmogaus aplinkoje. Vilnius. 2002. P. 7-398.
18. Mankevičienė A., Dabkevičienė Z., Supronienė S., Mačkinaitė R. Mikroskopinių grybų plitimo ir mikotoksinų kiekio ţieminių kviečių grūduose priklausomumas nuo jų nuėmimo laiko. Ţemdirbystė, t. 94, Nr. 3. 2007. P. 162–175.
19. Tsitsigiannis I. D.,Dimakopoulou M., Antoniou P.P., Tjamos C. E. Biological control strategies of mycotoxigenic fungi and associated mycotoxins in Mediterranean basin crops. Phytopathologia Mediterranea. 2012. Nr.5,1. P. 158 – 174.
20. Upadhaya S.D., Park M.A., Ha J.K. Mycotoxins and Their Biotransformation in the Rumen: A Review. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 2010. 23. 9. P. 1250–1260.
Priedai 1
Pagal EU Sąjungos direktyvas maisto ţaliavose ir maisto produktuose: LEIDŢIAMI MIKOTOKSINŲ KIEKIAI
Mikotoksinai Maisto ţaliavos ir maisto produktai
Leidţiama koncentracija
Aflatoksino M1 piene 0,05 µg kg-1
Ochratoksino A grūduose 5 µg kg-1
Patulino sultyse 50 mg l-1
Deoksinivalenolas (DON) Grūduose (išskyrus aviţas, kukurūzus)
1250 µg kg-1
aviţose 1750 µg kg-1
duonoje 500 µg kg-1
Zearalenonas (ZEN) grūduose 100 µg kg-1
grūdų miltuose 75 µg kg-1
