Iveta Mikailaitė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Iveta Mikailaitė

STAT5 IR AGPAT6 GENŲ POLIMORFIZMŲ RYŠYS SU OŽKŲ PIENO

PRODUKCIJOS SAVYBĖMIS

STAT5 AND AGPAT6 GENES POLYMORPHISM ASSOCIATION WITH

MILK TRAITS OF DAIRY GOAT

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovė: lektorė, jaunesnioji mokslo darbuotoja, dr. Renata Bižienė

2 DARBAS ATLIKTAS BIOLOGINIŲ SISTEMŲ IR GENETINIŲ TYRIMŲ

INSTITUTE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „STAT5 ir AGPAT6 genų polimorfizmų ryšys su ožkų pieno produkcijos savybėmis“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltiniu, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visa naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) ( katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai: 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1 Ožkininkystė Lietuvoje ir pasaulyje ... 10

1.2 Pieninių ožkų veislės ... 11

1.3 Ožkų pienas ir jo sudėtis ... 13

1.4 Genai, turintys įtakos pieno kiekiui ir sudėčiai ... 14

1.4.1 Kazeino genai ... 15 1.4.2 ß-laktoglobulino genas ... 16 1.4.3 AGPAT6 genas ... 16 1.4.4 POU1F1 genas ... 17 1.4.5 DGAT1 genas ... 17 1.4.6 STAT5 genas ... 18 1.4.7 LPL genas ... 19

2 TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGA ... 20

2.1 Tyrimų medžiaga ... 20

2.2 DNR skyrimas iš pieno ... 21

2.3 DNR skyrimas iš šerių ... 21

2.4 Polimerazės grandininė reakcija (PGR) ... 21

2.5 Elektroforezė ... 24

3 TYRIMO REZULTATAI... 26

3.1 STAT5 geno polimorfizmo tyrimai ... 26

3.2 AGPAT6 geno polimorfizmo tyrimai ... 29

4 REZULTATŲ APTARIMAS ... 32

4 REKOMENDACIJOS ... 35 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 36

5

SANTRAUKA

STAT5 ir AGPAT6 genų polimorfizmų ryšys su ožkų pieno produkcijos savybėmis

Iveta Mikailaitė Magistro baigiamasis darbas

Darbo tikslas buvo ištirti 1-acilglicerolio-3-fosfato O-aciltransferazės 6 geno (AGPAT6) ir transkripcijos signalų keitiklio ir aktyvatoriaus 5 geno (STAT5) polimorfizmo asociacijas su ožkų pieno kokybinėm ir kiekybinėm savybėm. Tyrimai atlikti su Zaaneno (n=38), Čekų baltosios (n=38), Alpių ir Zaaneno mišrūnėm (n=14), Alpių (n=12), Anglo Nubijos ir Lietuvos vietinių mišrūnėm (n=12), Lietuvos vietinių (n=10) ir Anglo Nubijų (n=4) veislės ožkomis. AGPAT6 ir

STAT5 genai genotipuoti PGR – RFIP metodu. Ožkų pieno – baltymų, riebalų ir pieno išeigos

kiekiai gauti iš VĮ „Pieno tyrimai“.

Atlikus AGPAT6 geno tyrimus su Lietuvoje veisiamomis pieninių ožkų veislėmis buvo identifikuoti trys genotipai – homozigotinis CC genotipas (42,9 proc.), heterozigotinis CG (42,9 proc.) ir homozigotinis GG (14,2 proc.). C alelis pasireiškė 0,357 dažniu ir G alelis 0,643 dažniu. Vertinant AGPAT6 geno įtaką pieno savybėms nustatyta, kad ožkos su CG genotipu išskyrė baltymingiausią pieną.

Atlikus STAT5 geno tyrimus Lietuvos pieninių ožkų nustatyta buvo trys genotipai – homozigotinis CC genotipas (63,9 proc.), heterozigotinis CT genotipas (30,5 proc.) ir homozigotinis TT genotipas (5,6 proc). C alelis pasireiškė 0,792 dažniu, o T alelis 0,208 dažniu. Vertinant STAT5 geno polimorfizmo ryšį su pieno savybėmis nustatyta, kad ožkos su TT genotipu davė baltymingiausią pieną, o su CT genotipu didžiausią pieno kiekį laktacijos metu.

AGPAT6 ir STAT5 genai gali būti naudojami kaip žymenys vykdant pieninių ožkų selekciją.

6

SUMMARY

STAT5 and AGPAT6 genes polymorphism association with milk traits of dairy goat

Iveta Mikailaitė Mastes‘s Thesis

The aim this Research was to investigate the 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 6 (AGPAT6) and Signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5) genes polymorphism associations with dairy goat qualitative and quantitative characteristic of milk. The study was performed on different goat breeds. It consisted of Saanen (n=38), Czech white (n=38), Alpine and Saanen goats mixed breed (n=14), Alpine (n=12), Anglo Nubian and Lithuanian local goats mixed breed (n=12), Lithuanian local (n=10) ir Anglo Nubian (n=4) goats. AGPAT6 and STAT5 genes genotipes were analysed with PCR-RFLP method. Goat milk traits get from State-owned Enterprise „Pieno Tyrimai“.

The genotypes of Lithuanian dairy goats were found in the AGPAT6 gene: the homozygous CC genotype (42,9 %), the heterozygous CG genotype (42,9 %) and the homozygous GG genotype (14,2 %).During the evaluation on the effect of the AGPAT6 gene to milk properties, goat that had CG genotype produced the richest milk in proteins.

The genotypes of Lithuanian dairy goats were found in the STAT5 gene: the homozygous CC genotype (63,9 %), the heterozygous CT genotype (30,5 %) and the homozygous TT genotype (5,6 %). It was found that goats with the TT genotype isolated the protein-rich milk and the highest milk yield in the lactase with the CT genotype.

AGPAT6 and STAT5 genes can be used as markers for dairy goat selection.

7

SANTRUMPOS

AI – dirbtinis apvaisinimas;

AGPAT6 - 1-acilglicerolio-3-fosfato O-aciltransferazė 6; bp – bazių pora; BLG – ß-laktoglobulinsas; Ca - kalcis; CSN1S1 – alpha-S1-kazeinas; CSN2 – beta-kazeinas; CSN1S2 – alpha-S2-kazeinas; CSN 3 – kappa-kazeinas;

CHI – kombinacijos aktualiuose taškuose; DGAT1 – diacilglicerolio O-aciltransferazė 1;

FAOSTAT – maisto ir agrikultūros organizacijos statistinių duomenų bazė; IGGC – tarptautinis ožkos genomo konsorciumas;

LPL – lipoproteino lipazė; LR – Lietuvos Respublika;

mRNR - matricinė ribonukleino rūgštis; NGS – naujos kartos tyrimai;

P - fosforas;

PGR – polimerazės grandininė reakcija;

POU1F1 – hipofizės transkripcijos teigiamas faktorius 1; QTL – kiekybinių požymių lokusas;

RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas; STAT5 – transkripcijos signalų keitiklis ir aktyvatorius 5;

VĮ ŽŪIKVC – valstybinė įmonė žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centras; VNP – vieno nukleotido polimorfizmas;

8

ĮVADAS

Ožkos yra vienas iš seniausiai prijaukintų gyvūnų, nuo seno pasaulyje jos laikomos vargingai gyvenančių žmonių „karvėmis“. Šiais laikais ožkų populiacija pasaulyje didėja, ir yra siekiama didinti gaunamą produkcijos kiekį pasitelkiant genetiką ir selekciją. Dėl pieno unikalių savybių ožkų pienas ir jo produktai vertinami vis labiau nei galvijų. Gaunamas pieno kiekis priklauso nuo šėrimo, aplinkos faktorių ir nuo genetikos. Norint gauti kiek įmanoma geresnę pieno kokybę ir didesnę išeigą reikia ne mažai dėmesio skirti genetikai, atrinkti ir išbrokuoti gyvūnus kurie turi genetinių mutacijų dėl kurių sumažėja produktyvumas.

Per pastaruosius dešimtmečius kiekybinių požymių lokuso (QTL) ir genų, turinčių įtakos pieno išsiskyrimo požymiams, nustatymas buvo atliekamas įvairiuose molekulinės genetikos tyrimuose (1). Daugelis genetinių tyrimų sutelkti į pieno sudedamųjų dalių turinį, tačiau tyrimais taip pat domėtasi geresne sūrio išeiga, skoniu, kvapu, ir ožkų pieno vartojimu, kaip karvės pieno pakaitalu (2). Pienas vertinamas pagal jo saugumą, sudėtį, technologines ir organoleptines savybes, maistingumą bei funkcines savybes. Visos šios savybės skiriasi priklausomai nuo skirtingų genetinių variantų (2).

Tai, kad genetiniai veiksniai turi įtakos pieno sudedamosioms dalims, buvo įrodyta tradiciniu kiekybiniu būdu (2). Buvo nustatyta, kad visų pagrindinių pieno baltymų genetiniai variantai daro įtaką pieno sudėčiai ir technologiniam procesui, nuo kurių priklauso pieno perdirbimas (2). Daugiausia tyrimų yra atlikta su ožkų αS1-kazeino genu, taip pat tirti kiti kazeino genai ir išrūgų baltymai, naujausiais tyrimais nustatyta, kad ne vien pieno baltymus koduojantys genai lemia pieno savybes, bet joms turi poveikį ir fermentai susiję su pieno gamyba.

Lietuvoje 2013 m. buvo ištirta αS1-kazeino, αS2-kazeino, kappa-kazeino ir ß-laktoglobulino genai ir jų poveikis pienui Zaaneno ir Čekų baltosios veislės ožkoms. Nustatyta αS2-kazeino geno įtaka gaunamam pieno kiekiui, pieno riebalų ir baltymų kiekiui, kappa-kazeino geno įtaka pieno kiekiui, ir ß-laktoglobulino geno įtaka baltymų kiekiui piene. 2016 m. ištirtas lipoproteino lipazės genas ir jo įtaka pieno riebalų kiekiui Čekų baltųjų, Zaaneno, Lietuvos vietinių ir Latvijos vietinių veislių ožkoms. Kitų šalių mokslininkų tyrimų rezultatai rodo apie AGPAT6 ir STAT5 genų poveikį ožkų pieno savybių kitimui.

Darbo tikslas:

Ištirti STAT5 ir AGPAT6 genų polimorfizmų ryšį su ožkų pieno produkcijos savybėmis. Darbo uždaviniai:

1. Ištirti STAT5 geno polimorfizmą, nustatant genotipų ir alelių dažnius; 2. Ištirti AGPAT6 geno polimorfizmą, nustatant genotipų ir alelių dažnius;

9

3. Nustatyti STAT5 geno polimorfizmo ryšį su produkcijos savybėmis. 4. Nustatyti AGPAT6 geno polimorfizmo ryšį su produkcijos savybėmis.

10

1 LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Ožkininkystė Lietuvoje ir pasaulyje

Ožkos buvo vienos iš pirmųjų prijaukintų gyvūnų prieš 10,5 tūkst. metų (3). Nuo 1990 m. ožkų skaičius kasmet didėjo, ir ožkininkystė Lietuvoje pradėjo atsigauti (4). Ožkininkų dėka buvo įvežta nemažai įvežtinių (Čekų baltųjų, Zaaneno ir kt.) veislių ožkų vietinėms gerinti (4). Ožkų skaičius 2001-2002 m. buvo išaugęs iki 23,7 tūkst., o 2003-2007 m. sumažėjo iki 7 tūkst. (4). Lietuvoje laikomos ožkos privalo būti ženklinamos ir registruojamos pagal LR žemės ūkio ministro 2003 m. birželio 16 d. įsakymą Nr. 3D-234, visa informacija pateikiama VĮ ŽŪIKVC tinklalapyje. Pagal ŽŪIKVC duomenis per 2016 m. Lietuvoje auginamų ožkų skaičiaus vidurkis yra 13770 ožkų.

Pasauliniu mastu pagal FAOSTAT 2012 m. duomenis ožkų pienas sudaro tik 2,4 proc. iš visų gyvūnų rūšių gaunamo pieno (5). Pasaulyje pagal FAOSTAT, 2013 m. duomenis ožkų skaičius siekė beveik 1 mlrd. (996 120 851) – daugiau nei pasaulio kiaulių populiacijos ir 15 procentų mažiau nei avių populiacija. Daugiau nei 90 proc. šių ožkų yra Azijoje ir Afrikoje, o Europoje jų yra tik 1,8 proc. Per pastaruosius 50 metų ožkų populiacija padaugėjo 2,4 karto, o kitų gyvulių rūšių populiacijos nekito ar sumažėjo.

Apie 95 proc. pasaulio ožkų yra Azijoje, Afrikoje ir Lotynų Amerikoje, o didžiausią dalį sudaro 60 proc. Azijoje (6). Daugiausia pieninių ožkų auginama Viduržemio jūros regionuose, Pietų Azijoje, Lotynų Amerikoje ir Afrikos dalyse (6). Pagrindiniai ožkų pieno gamintojai pasaulyje yra Indija, Bangladešas ir Pakistanas (6). Bangladeše vidutinė ožkų pieno išeiga yra apie 80 kg per metus, o Indijoje ir Pakistane daugiau kaip 140 kg per metus (6).

Europoje ožkininkystė vertinama daugiausia dėl sūrių gamybos. Vidutinis pieno gamybos lygis skirtinguose pasaulio regionuose skiriasi, dėl skirtingų ūkių valdymo sistemų, bei skirtingos ožkų genetikos (veislės, atrankos). Ožkų veisimo programos nėra tokios dažnos, kaip galvijų (7). Kai kurios šalys yra sukūrę kolektyvines struktūras, kurios kontroliuoja rezultatus ir vertina veislinę vertę (7). Pieno savybės yra gyvybiškai svarbios gyvulininkystės produkcijai. Šiandien Prancūzija yra pirmoji ožkų pieno perdirbėja Europos Sąjungoje, kuri gauna 27 proc. bendro pieno kiekio tik iš 10 proc. gyvūnų ir yra penkta didžiausia pasaulyje gamintoja (7).

Naujos kartos tyrimų (NGS) kūrimas leido iš naujo nustatyti ožkos genomą, kuris 2010 m. suteikė galimybę sukurti Tarptautinį ožkų genomo konsorciumą (IGGC, www.goatgenome.org), kurio tikslai buvo sustiprinti mokslinius tyrimus tarptautiniu lygmeniu, ožkų genomo informacija buvo paskelbta ir prieinama mokslinei bendruomenei (7). „Goat SNP50 Bead Chip“ lustas buvo išleistas 2011 m. kad užtikrintų vienodą genomo apimtį, jame pateiktos Alpių, Boerio, Kreolio,

11 Katjango, Zaaneno ir Savanna ožkų veislių genomo sekos ir sukurtas gyvūnų VNP (vieno nukleotido polimorfizmų) genetinis ir fizinis žemėlapis, kas leidžia specialistų grupėms pamatyti rūšies genetinį kintamumą (7).

Palyginus pagal gyvąjį svorį ožkos duoda daugiau pieno nei galvijai, avys ir buivolai (8). Todėl, kad ožkos pasižymi geresniu pašarų suvartojimu ir įsisavinimu, aukštesnės laktacijos užsilaikymu, bei turi didesnę kūno svorio dalį apimančių pieno liaukos audinių ir išskiria daugiau pieno (8). Dėl to reikia išnagrinėti ožkų pieno gamybos potencialą, nes jis susijęs su gaunamu pieno kiekiu. Faktoriai, kurie paveikia pieno kiekį yra klasifikuojami į dvi plačias kategorijas: genetiniai ir negenetiniai ar aplinkos faktoriai (8). Dėl genetinių faktorių atsiranda pakitimai tarp atskirų gyvūnų veislės viduje ir tarp veislių (8). Pieno gamybos lygis priklauso nuo veislės ir pieno išeiga skiriasi tarp skirtingų veislių ir veislės viduje (8). Siekis pagerinti pieno kokybę nėra lengvai pasiekiamas, nes kokybės samprata apima daugelį aspektų. Efektyvus darbas, siekiant genetinio pagerinimo ožkų pieno savybėms, reikalauja žinių apie paveldimumą ir aplinkos faktorius taip pat gerus veislinės vertės įvertinimo modelius (9).

1.2 Pieninių ožkų veislės

Užsienio literatūroje išskiriamos šešios pagrindinės pieninių ožkų veislės yra Zaaneno, Nubiano, Toggenburgo, La Manča, Oberhaslis ir Alpių (5). O Lietuvoje pagal ŽŪIKVC registruojamus duomenis išskiriamos šios pieninių veislių ožkos (10):

 Lietuvos vietinės. Manoma, kad ši veislė yra kilusi iš Sibiro kalnų ožio, vėliau iš Rusijos pieninės ožkos, paplitusios iš Sankt Peterburgo, Maskvos, Ivanovo, Jaroslavlio ir kitų sričių (11). Ožkos sveria 35-45 kg, jų kūnas padengtas ilgais šiurkščiais plaukais, dažnai turi barzdą ir „auskarus“, taip pat ragus (4,11). Laktacija trunka 7-10 mėnesių, per dieną duoda 1-3 kg pieno, atsiveda po 2-3 palikuonis (4,11).

 Zaaneno ožkos. Šios pieninės ožkos kilę iš Šveicarijos, Zaaneno slėnio, ir yra paplitusios visame pasaulyje (12). JAV ši veislė laikoma viena iš geriausių pieninių ožkų, dėl didelio pastovaus pieno kiekio, lengvo išlaikymo ir ožkų prisitaikymo prie bet kokių aplinkos pokyčių (12). Zaaneno ožkos yra baltos spalvos, kartais su juodais taškais ar dėmėmis ant tešmens, ausų ir nosies, jų ausys tiesios, dažnai turi barzdą ir „auskarus“, yra beragės (12). Turi ilgą kaklą, trumpas kojas ir didelį tešmenį, visas kūnas padengtas trumpais plaukais (12). Suaugęs ožys sveria apie 85 kg, o ožkos – 60 kg (4,12). Per 300 dienų laktaciją duoda 700-900 kg pieno, kurio riebumas yra 3,8-4,5 proc., šis pienas yra tinkamas visų pieno produktų gamybai (4,12). Ožkos atveda po 2-3 palikuonis (4,12).

12

 Vokietijos baltosios. Ožkos pasižymi greitu brendimu, geru vislumu ir geru prisitaikymu prie aplinkos sąlygų (5). Sudėjimas tvirtos konstitucijos, kūnas vidutinio dydžio, turi storą nugarą ir platų dubenį, kūnas padengtas baltu trumpaplaukiu kailiu (4,5). Ožys sveria apie 75 kg, o ožkos apie 60 kg (4,5). Per 300 dienų laktaciją duoda iki 2000 kg pieno, kurio riebumas 3,7 proc., o baltymingumas 2,8-3,2 proc. (4,5).

 Alpių ožkos. Ši veislė kilusi iš Prancūzijos Alpių ir yra vienos iš labiausiai paplitusių naminių ožkų veislių (13). Ožkos yra vidutinio dydžio, jų ausys stovi vertikalioje padėtyje, kailis yra įvairios spalvos, juodas, rudas, baltas (13). Suaugusios ožkos sveria apie 50 kg, o ožiai apie 65 kg (4,13). Per laktaciją duoda 600-1200 kg pieno, kurio riebumas 3,4-3,8 proc. (4,13).

 Toggenburgo veislė. Šios ožkos kilę iš Šveicarijos Toggenburgo slėnio, žinoma, kaip viena iš seniausių pieninių ožkų veislių (14). Ožkos yra vidutinio dydžio, tvirto sudėjimo, energingos ir budrios išvaizdos, ausys tiesios, pakeltos į priekį (14). Plaukai yra vidutinio ilgio, lygūs, spalva kinta nuo šviesios iki tamsiai rudos, gali būti baltos ausys su tamsia vieta viduryje ar dvi baltos juostos ant galvos virš kiekvienos akies, užpakalinės ar priekinės kojos baltos (14). Suaugusios ožkos sveria apie 60 kg, o ožiai – 75 kg (4,14). Puikiai išvystytas tešmuo, per laktaciją duoda iki 1200 kg pieno, kurio riebumas 3,6-4,2 proc., o baltymingumas 2,7 proc. atveda po 2-3 ožiukus (4,14).

 Megrelo veislė. Ši veislė kilusi iš Gruzijos, išauginta pietų kalnuotose vietovėse (15). Ožys sveria apie 70 kg ir užauga iki 60 cm dydžio (4,15). Per metus ožkos duoda 800-900 kg pieno (4). Mergelio veislės ožkų kūnas pailgas, krūtinė ir nugara plati, kojos tiesios, ausys įtemptos, turi barzdą, kailis trumpas, baltos arba šviesiai pilkos spalvos (15).

 Rusų baltosios ožkos. Panašios į mūsų vietines ožkas. Šios ožkos pasižymi stipria kūno konstitucija, kaklas ilgas ir tiesus, galva siaura, tešmuo didelis ir proporcingai išvystyti ketvirčiai, kojos stiprios ir skeletas stiprus (16). Plaukai baltos spalvos, turi ragus. Suaugusios ožkos sveria 40-50 kg, o ožiai – 55-70 kg (4). Per laktaciją duoda 400-1000 kg pieno, kurio riebumas 4,5-5 proc., gali atvesti 2-3 ožiukus (4,16).

 Čekų baltosios ožkos. Ožkų gimtinė Čekija. Kailis baltas trumpaus plauko, be pigmento, beragės (17). Atsparios aplinkos sąlygoms (17). Suaugusios ožkos sveria 70 kg, o ožiai – 90 kg (4,17). Per laktaciją duoda 700-900 kg pieno, kurio riebumas 3,8-4,5 proc. ir gali atvesti 2-3 palikuonis (4,17).

 Anglo Nubijų veislė. Šios veislės pagrindinis identifikavimo bruožas galva, kuri turi ryškią „romėnų“ nosį ir ilgas smunkančias žemyn ausis, turi ilgą kūną ir stačią poziciją, o kailis yra labai spalvotas (18). Per parą duoda apie 3,89 kg pieno, kurio riebumas 4,84 proc., o baltymingumas 3,51 proc. Ši veislė tinkama ir mėsos gamybai (18).

13

1.3 Ožkų pienas ir jo sudėtis

Pienas yra daugiakomponentė nepastovios sudėties sudėtinga biologinė sistema, kuri susideda iš dispersinėje terpėje (vandenyje) pasiskirsčiusių vienokios ar kitokios būsenos sudedamųjų dalių (19,20). Palyginus pasauliniu mastu karvių pieno pagaminama daugiau, bet vartojančių ožkų pieną žmonių skaičius didėja, dėl to, kad karvių pienas nebetinka dėl alergijų, laktozės netoleravimo ir kitų savybių. Ožkų pieną lyginant su karvės ar moters pienu, galime išskirti jį dėl geriau subalansuotų aminorūgščių, pieno šarmingumo, švelnumo ir terapinių savybių medicinoje (4,21). Ožkų pieną, kaip ir karvių pieną sudaro tie patys pagrindiniai komponentai. Ožkų piene vanduo sudaro 87,8 proc. ir kietosios medžiagos 12,2 proc.: riebalai 3,8 proc., baltymai 3,5 proc., laktozė 4,1 proc. ir mineralinės medžiagos 0,8 proc. (21). Palyginus su karvių pienu, ožkų piene randame daugiau riebalų, baltymų, mineralinių medžiagų ir mažiau laktozės.

Sudėtingą pieno baltymų sistemą sudaro dvi pagrindinės šių medžiagų grupės: kazeinas 75 proc. ir išrūgų baltymai 25 proc. Yra rasti penki pagrindiniai ožkų piene baltymai: αS2-kazeinas (s2-CN), ß-kazeinas (ß-CN), к- kazeinas (к-CN), ß-laktoglobulinas (ß-Lg), ir α–laktoalbuminas (α-La) (22). ß-kazeinas yra pagrindinė kazeino frakcija ožkų piene, tuo tarpu αS1-kazeinas yra pagrindinis karvės piene (21). Ožkų piene yra mažiau αs1-kazeino, apie 89 proc. palyginus su karvės pienu, ir daugiau ß-kazeino, kaip ir žmogaus piene (21). Dauguma žmonių kenčia dėl alergijos pienui būtent dėl αS1-kazeino baltymo (21). Amino rūgšties sudėties skirtumai tarp ožkų pieno kazeino frakcijų yra daug didesni negu skirtumai tarp rūšies (ožkų ir karvės) (22). α-kazeinas turi savyje daugiau aspartato, lizino ir tirozino negu ß-kazeinas, tuo tarpu pastarasis turi daugiau leucino, prolino ir valino (22). Ožkų pieno kazeino micelės yra mažiau koncentruotos, yra mažiau šilumai stabilios ir praranda ß-kazeiną greičiau nei galvijų micelės (21). Didžiausią dalį sudaro šios amino rūgštys: glutamatas (20 proc.), prolinas (10 proc.), ir leucinas (10 proc.) (21).

Riebalų kiekis ožkų piene priklauso nuo veislės ir svyruoja nuo 2,45 iki 7,76 proc. Riebalų lašeliai yra daug smulkesni nei karvės piene, ožkų vidutiniškas riebalų globulės skersmuo - 3,49 µm, o karvių – 4,55 µm (22). Mažesni riebalų lašeliai geriau virškinami ir labiau homogenizuojasi piene, aprūpindami didesnį riebalų absorbuojamąjį paviršiaus plotą ir sustiprinant virškinimą (7,22). Esant mažam riebalų dydžiui riebalai neišsiskiria ir neplūduriuoja ant paviršiaus, kaip karvių pieno, dėl to papildomai ožkų pieno nereikia homogenizuoti. Ožkų pieno riebalai turi savyje 97-99 proc. laisvų lipidų (kurių 97 proc. yra trigliceridai), ir 1-3 proc. surištų lipidų (47 proc. neutralūs ir 53 proc. poliariniai lipidai) (21). Taip pat pieno riebalai turi žymiai aukštesnio lygmens trumpų ir vidutinio ilgio riebalų rūgščių grandinių, turi daugiau kaprilo, kaprino ir kaprono rūgščių ir mažiau cholesterolio, negu karvės pienas (21). Ožkų pieno riebalų rūgščių sudėtis skiriasi, turi didesnę dalį trumpųjų ir vidutinių riebalų rūgščių grandžių, kurios taip pat yra sugrupuotos į mažesnius riebalų

14 sluoksnius (7,22). Ožkų piene yra žymiai didesnis kaprozės (C 6:0), kaprilo (C 8:0), kaprino (C 10:0) ir lauro rūgščių (C 12:0) santykis, tai yra riebios rūgštys, kurios suteikia ožkų pienui ir sūriui tipišką skonį (7,22). Dėl to šis pienas turi gydomųjų savybių sprendžiant virškinimo problemas (7,21,22).

Pagrindinis ožkų pieno angliavandenis yra laktozė, kurios yra apytiksliai 0,2-0,5 proc. mažiau negu karvės piene (22,21). Laktozė yra disacharidas, sudarytas iš gliukozės ir galaktozės molekulių, ir yra sintetintas pieno liaukoje. Ožkų piene esanti gliukozė ir laktozė yra lengvai įsisavinamos (4).

Ožkų pienas turi aukštesnius kalcio, fosforo, kalio, magnio ir chlorido, bet žemesnius natrio ir sieros kiekius, negu karvės pienas (22). Palyginti su karvių pienu, ožkų piene daugiau kalio, kalcio, fosforo, bet piene mažai natrio, dėl ko, jis tinka sergantiems inkstų ligomis (4). Ožkų pienas turi savyje apytiksliai 134 mg Ca ir 141 mg P/100 g (21).

Ožkų pienas turi didesnį vitamino A kiekį nei karvės pienas. Ožkos pienas yra baltesnis už galvijų pieną, nes ožkos piene visi ß-karotinai pereina į vitaminą A (21). Ožkų piene yra 5 kartus mažiau folio rūgšties ir vitamino B12 palyginus su karvės pienu (7,22). Ožkų ir karvių piene panašus

kiekis vitamino B6 ir vitamino C ir D.

Ožkų pieno sudėtis ir kiekis kinta priklausomai nuo rūšies, veislės, aplinkos sąlygų, maitinimo ir laikymo sąlygų, sezono, vietos, ir laktacijos stadijos (22). Taip pat išskirtas aukštas ožkų pieno sudėties kintamumas tarp skirtingų sezonų ir genotipų (22). Ožkų pieno kazeino sudėtis kinta priklausomai nuo genetinio polimorfizmo kazeino lokuse (21). Šie pieno baltymo polimorfizmai yra sukeliami kitų pakitusių amino rūgščių ar dėl delecijų kai kurių šių aminorūgščių, šie polimorfizmai gali būti nustatomi atliekant DNR analizę (2,22). Tradiciniu veisimo būdu sunku išauginti puikių ožkų veislių, todėl daugelis veisėjų daugiausia skiria dėmesio DNR žymenims, pagal kuriuos vykdoma atranka ir selekcija.

1.4 Genai, turintys įtakos pieno kiekiui ir sudėčiai

Pieno savybės priklauso nuo piene esančių komponentų: baltymų, riebalų, fermentų ir kt. Pieno baltymo genai koduoja baltymus, kuriuos gamina ir išskiria pieno liaukos epitelio ląstelės (1). Šių genų mutacijos turi įtakos genų transkripcijai ir pieno savybėms (23). Ožkų piene egzistuoja šeši pagrindiniai baltymai, apimantys 95 proc. visų baltymų ir klasifikuojami į keturis kazeinus (αS1-kazeinas, αS2-kazeinas, ß-kazeinas ir к-kazeinas) ir du išrūgų baltymus (α-laktoalbuminas ir ß-laktoglobulinas) atitinkamai užkoduotus šių genų CSN1S1; CSN1S2; CSN2; CSN3, LALBA ir

15 savybes (7). Toliau aptariami genai, aprašyti kitų šalių mokslininkų, kurie turi įtakos pieno savybėms ir kiekiui.

1.4.1 Kazeino genai

Keturi kazeinai sudaro pieno baltymų pagrindą t. y. 76–86 proc. bendro baltymų kiekio (24). Šie genai yra standžiai sujungti (CSN1S1, CSN2, CSN1S2, CSN3) 250 kb, chromosomoje 6 (1). Kazeino genai žymiai paveikia fizikinę, cheminę ir maistinę ožkų pieno kokybę (23).

Ožkų αS1-kazeino poveikis pieno savybėms yra labiausiai ištirtas (22,23,25). Šis genas yra labai polimorfiškas (1). Kazeinas svarbiausia atrajotojų pieno baltymų frakcija, yra vienas iš vertingiausių komponentų dėl jo maistinės vertės ir apdirbimo ypatybių (25). Labiausiai kintantis αS1-kazeino baltymas, užkoduotas CSN1S1 geno, turi mažiausiai 18 alelinių variantų, skirstomų į stiprų (A, B1, B2, B3, B4, B0, C, H, L, M), vidutinį (E, I) ir silpną (D, F, G) baltymų kiekio poveikį, bei nulinius alelius (01, 02, N) (1,22,23). Šis suskirstymas rodo skirtingą baltymų sintezės lygį piene, stiprių alelių 3,5 – 3,6 g/l baltymų sintezė, vidutinių alelių 1,1 – 1,6 g/l, silpnų 0,45 – 0,6 g/l, nuliniai aleliai rodo nežymų pėdsakų kiekį arba visišką šios kazeino frakcijos nebuvimą piene (24). Prancūzijos pieninių ožkų populiacijoje 2000 m. buvo rasta A, B, C, E, F alelių, ir E, F alelių daugiausia rasta Zaaneno ir Alpių ožkų veislėse (7). Jis yra 16,7 kb dydžio ir susideda iš 19 egzonų, kurių ilgis nuo 24 - 385 bp ir 18 intronų, kurių ilgis nuo 90 – 1685 bp (24). Dauguma genetinių variantų skiriasi dėl amino rūgšties pakitimo, tačiau, daug variantų kyla iš egzono praleidimo (2,7).

CSN1S1 kazeino kintamumo charakterizacija yra svarbi dėl jo ryšio su sūrio gamyba ir pieno

perdirbimo savybėmis (25). CSN1S1 baltymas yra labai fosforilintas ir kalciui jautrus baltymas, kurio svarbus vaidmuo yra pieno gebėjimas transportuoti kalcio fosfatą (1). Yra įrodymų, kad ožkos su aukštu αS1-kazeino kiekiu (A arba B aleliai) gamina pieną, kuriam būdingas didelis baltymų, riebalų ir kalcio kiekis, geresnis varškės stabilizavimo laikas, varškės tvirtumas ir sūrio produkcijos kiekis, palyginus su ožkom turinčiom homozigotinį alelį, kuris susijęs su mažu ar vidutiniu kiekiu (E arba F alelis) (25). αS1-kazeino genotipų įtaka pieno savybėms iš pradžių buvo įrodyta Alpių veislės ožkoms, kur CSN1S1 AA ožkos gamino pieną su aukštesniu kazeinu, baltymų, ir riebalų kiekiu bei mažesnes kazeino miceles nei CSN1S1 EE ir FF ožkos (25) ir CSN1S1 FF genotipas buvo susijęs su mažesniais pieno riebalų rutulėliais (26).

ß-kazeino frakcija yra užkoduota CSN2 geno, kuris apima devynis alelinius genus: A, A1, B, C, C1, D, E, 0 ir 01 (23).

αS2-kazeinas yra užkoduotas CSN1S2 geno, kuris apima aštuonis alelinius genus (25), charakterizuojančius skirtingus išraiškos lygius: stiprius (CSN1S2 sintezė 2,5 g/l A, B, C, E, F, G), vidutinius (CSN1S2 sintezė 1,25 g/l D) ir nulinius (CSN1S2 0) (23). G. M. Vacca et al., (23) tyrime buvo nustatyta, kad CSN1S2 genotipas paveikė pieno kiekį, pieno riebalus ir baltymus kasdieninėje gamyboje. Kai kurie autoriai teigia, kad ožkų pienas, stokojantis αs2-kazeino frakcijos, yra

16 panašesnis į žmogaus pieną, negu pienas be αs1-kazeino (23). S2-kazeino kiekis buvo susijęs su pieno alergiškomis savybėmis. Variantai A, B, C, E ir F sukelia didesnį alerginį poveikį (2). Ožkų trys kalciui jautrūs kazeino genai (αs1, αs2 ir ß) yra polimorfiniai, ir aleliniai genai susiję su stipriais jų lygmens skirtumais (27).

Jautrūs kalciui kazeino genai (αs1, αs2 ir ß) plėtojosi nuo primityvaus kazeino geno per geno dvigubėjimą; tačiau, atrodo, kad к-kazeinas nėra susietas struktūriškai su šiais genais, o susijęs su γ-fibrinogenu (27). к-kazeino baltymų variantai ožkų buvo nustatyti ir patvirtinti baltyme ir DNR lygmenyje (27). Buvo įrodyta pelės modeliu, kad κ-kazeinas yra būtinas laktacijai ir sėkmingam užbaigimui žinduolių reprodukcijoje (27). Ožkų pieno к-kazeino frakcija atlieka lemiamą vaidmenį formuojant, stabilizuojant ir agreguojant kazeino miceles, todėl daro įtaką technologinėms ir maistinėms pieno ypatybėms (27). Šio geno frakcija yra užkoduota CSN3 geno, kuris turi 21 žinomą alelinį geną: A, B, B’, B", C, C’, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q ir R (23,27). Ožkų κ-kazeino genas yra sudarytas iš 5 egzonų, iš kurių dalis, koduojanti brandų baltymą, yra esanti 3 egzone (9 amino rūgštys) ir 4 egzone (162 amino rūgštys) (6).

1.4.2 ß-laktoglobulino genas

ß-laktoglobulinas yra vienas iš svarbiausių išrūgų baltymų piene. BLG priklauso lipokalinų šeimai, tai grupė mažų baltymų su gebėjimu surišti hidrofobines molekules (1). Ožkų ß-laktoglobulino geno seka siejama su CHI11 (22) ir jame yra septyni egzonai kartu su šešiais intronais, koduojančiais 162 amino rūgščių baltymus (2). BLG ožkų genas yra 11q28 chromosomoje (24). Yra pranešta 15 šio geno polimorfizmų įvairių ožkų veislėse iš Ispanijos, Prancūzijos, Italijos, Senegalo ir Azijos, devyni polimorfizmai yra promotoriaus srityje, o šeši egzono (2). Visi polimorfizmai yra vieno nukleotido pakitimai, išskyrus vieną deleciją / įterpimą promotoriaus srityje (2). Nors BLG rodo baltymo struktūrą, panašią į retinolio (28), pagrįstą sieros turinčiomis amino rūgštimis, manoma, kad tai lemia maistinį vaidmenį piene (29).

1.4.3 AGPAT6 genas

1-acilglicerolio-3-fosfato-O-actiltransferazė (AGPAT) fermentas yra išreikštas pieno liaukos epitelio tešmens audinyje (30). AGPAT katalizuoja pakeitimą lizofosfatidinės rūgšties į fosfatidinę rūgštį (30). Manoma, kad jis irgi turi įtakos pieno savybėms. AGPAT fermentai svarbūs eukariotų glicerolipidų sintezei ir trigliceridų biosintezei (31). Iki šiol buvo aprašyti aštuoni AGPAT genų šeimos nariai, kurie yra AGPAT 1-8, ir kiekvienas iš jų turi lizofosfatidinės rūgšties aciltransferazės motyvą (30,31). Kaip AGPAT šeimos narys, AGPAT6 atlieka pagrindinį vaidmenį lipidų biosintezėje (30). AGPAT6 susijęs su trigliceridų sinteze pieno liaukose ir buvo pripažinta kaip mikrosominė glicerolio-3-fosfato aciltransferazė (GPAT), kuri katalizuoja glicerolipidų biosintezės kelią (30). Atsižvelgiant į AGPAT6 geno reguliavimo vaidmenis glicerolipidų biosintezės katalizėje

17 ir pieno riebalų gamyboje, AGPAT6 geną galima laikyti potencialiu pieno sudėties genu (30). Tyrimai su pelėmis parodė, kad AGPAT6 genas yra stipriai išreikštas rudame riebaliniame audinyje, pieno liaukos epitelinių ląstelių ir daug kitų audinių, ir koduoja būtiną fermentą pieno riebalų sintezei (30). O žmonių AGPAT6 geno išraiška parodė didesnį kiekį lizofosfatido rūgščių, fosfatidinės rūgšties ir GPAT ląstelių (30). Be to, substrato specifiškumo tyrimai parodė, kad

AGPAT6 veikė tiek sočiųjų tiek neprisotintų ilgalaikių grandžių riebalų acyl-CoAs (30). O pelės

modelis, stokojantis AGPAT6, parodė 25 proc. kūno svorio sumažėjimą ir atsparumą abiem atvejais, tiek dietos sukeltam, tiek genetiškai sukeltam nutukimui, kuris toliau parodė jo unikalų vaidmenį nustatyme trigliceridų turinio, kurio negalėjo kompensuoti kiti AGPAT šeimos nariai (30), tuo metu, kai galvijų, pranešama, kad AGPAT6, kartu su kitais genais, to paties rango reguliuoja nukreipimą riebalų rūgščių produktyvaus pieno riebalų sintezės kryptimi (30). Dėl to AGPAT yra svarbus komponentas pieno gamyboje. Nors tai yra tyli mutacija, buvo praneštas santykis tarp mutacijos ir geno funkcijos (30). Tai yra, baltymo produktas su ta pačia rūgščių seka, bet skirtinga geno seka turėjo skirtingas struktūrines ir funkcines ypatybes (30).

1.4.4 POU1F1 genas

Kaip POU – srities šeimos geno narys, POU1F1 (taip pat vadinamas DOUBE 1 ar GHF – 1) yra daugiausia išreikštas hipofizėje, ir jo išraiška yra būtina normaliam atsiskyrimui, išsivystymui ir trijų adenohipofizės ląstelės tipų išlikimui (tirotropino, somatotropino ir laktotropo) (32). POU1F1 genas dalyvauja įvairiuose signaliniuose keliuose, kurie yra svarbūs daugeliui vystymosi ir fiziologinių procesų, įskaitant hipofizio vystymąsi (32,33), pieno liaukų vystymąsi ir augimą (33), pieno baltymo ekspresiją (34) ir pieno gamybą bei sekreciją (32,33). Galvijų, avių ir ožkų POU1F1 genas nustatytas 1q21 – 22 chromosomoje (35). POU1F1 genas reguliuoja augimo hormoną (GH), prolaktiną (PRL) ir skydliaukę stimuliuojantį hormoną (TSHß) (36). Be to, GH, PRL ir TSH genai bei juos koduojantys baltymai yra glaudžiai susiję su žinduolių reprodukcija (36,37). Vadinasi,

POU1F1 mutacijos gali sukelti skirtingą GH, PRL, TSH ir POU1F1 genų išraišką / ekspresiją

(32,35). Atsižvelgiant į POU1F1 geno svarbą svarbių hormonų genų ekspresijai kontroliuoti yra tiesiogiai susijęs su augimo procesu ir pieno gamyba, pagrįstai manoma, kad tai yra geras kandidato genas, naudojamas markeriu selekcijai (35). Nustatyta, kad pelių POU1F1 mutacijos susiejamos su Snell dwarf (dw) ir Jackson dwarf (dw-J) (35), ir buvo aprašyta, kad žmogaus POU1F1 mutacijos yra susijusios su dwarfish (32,36,35). Galvijų ir kiaulių genetiniai POU1F1 geno pakitimai susiję su ekonominiais bruožais ir produkcijos našumu (35).

1.4.5 DGAT1 genas

Identifikuotas dar vienas genas, kuris turi poveikį pieno savybėms - DGAT1. Ožkų DGAT1 baltymo seka apima 489 amino rūgštis, kaip avių ir galvijų (7). Pauline Martin et al., (7) tiriant QTL

18 buvo rasta CHI 14, kuris susijęs su riebalų turiniu piene, DGAT1 geno srityje, kuris koduoja pagrindinius fermentus, apimančius pieno trigliceridų sintezę. Alpių ir Zaaneno ožkų veislėse nustatyta 29 polimorfizmai (27 SNPs, 1 bp ir 8 bp) ant DGAT1 geno (7). Tarp šių polimorfizmų 27 buvo intronai ir du buvo nustatyti egzonai - 8 ir 15, atsakingi už R251L ir R396W pakeitimą

DGAT1 baltymo sekoje (7). Genomo T kitimo dažnis, atsakingas už R396W polimorfizmą,

nustatytas Zaaneno ir Alpinių ožkų veislėse (7). R251L padėtyje T alelinio geno dažnis buvo 4,4 proc. ožkų ir 2,6 proc. AI Zaaneno veislės patinų, o Alpių veislės AI patinų nebuvo nustatyta T mutacijos nešėjų, o ožkų patelių rasta 0,7 proc. (7). Variacijos analizė patvirtino, kad T-alelis 251 ir 396 kodonuose labai sumažino pieno riebalų kiekį (7). Kalbant apie riebalų rūgštis, R396W mutacija sukėlė didelį kiekį prisotintų ir nesočiųjų riebalų rūgščių kiekio mažėjimą piene, tačiau atitinkamos sočiųjų ir nesočiųjų riebalų rūgščių proporcijos riebaluose nebuvo labai paveiktos, o R251L lokusas paveikė tik riebalų kiekį (7). Pauline Martin et al., (7) tyrimo metu nustatyta, kad heterozigotai nešėjai (G/T) turėjo žymiai žemesnį vidutinį riebų kiekį (1.11 g/kg,) negu homozigotai (G/G). LS priemonė homozigotų individų (T/T), nebuvo įvertinta todėl, kad per mažai ožkų turėjo šį genotipą (7). Šios dvi mutacijos sukėlė DGAT1 baltymo amino rūgščių sekos modifikacijas ir buvo susijusios su pieno sudėties pokyčiais, pvz. riebalų kiekio sumažėjimu.

1.4.6 STAT5 genas

Transkripcijos signalų keitikliai ir aktyvatoriai (STAT) yra transkripcijos faktorių šeima, kuri tarpininkauja įvairių peptidinių hormonų ir citokinų veikimui (38). STAT šeima turi septynis narius:

STAT1-4, STAT5A, STAT5B ir STAT6 (39). STAT baltymai atlieka svarbų vaidmenį fiziologinių

ląstelių procesuose, tokiuose, kaip diferenciacija, proliferacija ir apoptozė daugelyje audinių, įskaitant pieno liauką (40).

STAT5, dar vadinamas pieno liaukos faktoriumi, iš pradžių buvo atrastas kaip PRL sukeltas transkripcijos faktorius (38). Tai yra pagrindinis prolaktino signalizavimo vidinės ląstelės tarpininkas ir gali aktyvinti transkripciją pieno baltymo genų atsakant į prolaktiną (38). STAT5 egzistuoja dviem izoformomis - A ir B, jos yra labai homologiškos, kodavimo seka yra apie 90 proc. identiška, tačiau izoformos skiriasi keliomis amino rūgščių baltymų molekulėmis karboksiniame gale ir yra užkoduotos skirtingų genų (38). STAT5 A genas nustatytas ožkų 19 chromosomoje. Nepriklausomai nuo rūšies gyvūno, tas pats genas veikia vienodai. STAT5 A genas buvo tirtas galvijų, kaip galimas geno kandidatas turintis įtakos pieno gamybai ir vystymosi savybėms (38). Liu X. et al., (41) nustatė, kad STAT5 A delecija pelėms pasireiškia sutrikusiu pieno liaukų vystymusi bei pieno sekrecijos sutrikimais. Nustatyta, kad STAT5 A delecija sukelia pieno displaziją ir sumažina pieno laktaciją (41), o STAT5 B delecija neturi įtakos pieno liaukos vystymuisi (42). STAT5 gali aktyvuoti daugybę citokinų, tokių, kaip 2, interleukinas-3, interleukinas-12, eritropoetinas, granulocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius,

granulocitų-19 makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius, trombopoetinas bei augimo hormonas (43). Šis genas yra reikalingas pieno liaukos ląstelių dauginimuisi ir išlikimui nėštumo, laktacijos ir pieno liaukos degeneracijos metu (44).

1.4.7 LPL genas

Lipoproteino lipazė yra atsakinga už trigliceridų hidrolizavimą į glicerolį ir laisvas riebalų rūgštis. Jis sintezuojamas pieno liaukų epitelio ląstelėse ir veikia riebalų rūgščių išsiskyrimą pieno audinyje (2). Išskirtos ir nustatytos kelios žinduolių LPL kDNR sekos, įskaitant avių, galvijų, žmogaus ir pelės. LPL aktyvumas ir mRNR ekspresija buvo tiriami daugelyje audinių, įskaitant riebalinį audinį, širdį, kepenis, skeleto raumenis, plaučius, pieno liaukas, smegenis ir inkstus pelių, žiurkių ir galvijų (45). LPL mRNR ekspresija tarp įvairių audinių priklauso nuo gyvūno fiziologinės būklės, šėrimo / badavimo, šalto prisitaikymo, mitybos, medžiagų apykaitos ir transportavimo veiklos (45). LPL aktyvumas yra didesnis laktacijos metu pieno liaukoje. Nustatyta, kad pieno LPL aktyvumas skiriasi tarp kelių ožkų veislių, o tai rodo, kad egzistuoja genetinis polimorfizmas, turintis įtakos šio fermento funkcinėms savybėms (46). Pieno riebalų sluoksnių trigliceridų hidrolizę į laisvąsias riebalų rūgštis atlieka lipoproteinų lipazė 56 kDa fermentas, kuris taip pat atlieka pagrindinį vaidmenį reguliuojant plazmos lipoproteinų kiekius riebalų ir raumenų audiniuose, taip pat kitas kūno dalis, tokias kaip kepenys, širdis, nervų sistema ir pieno liauka (46). Ožkų pieno LPL aktyvumą veikia žindymo laikotarpis, melžimo dažnis ir lipidų papildai (46).

20

2 TYRIMO METODIKA IR MEDŽIAGA

2.1 Tyrimų medžiaga

Baigiamasis darbas atliktas 2016 - 2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Biologinių sistemų ir genetinių tyrimų institute. Molekuliniai tyrimai atlikti LSMU dr. K. Janušausko genetikos laboratorijoje. Visi tyrimai buvo atlikti laikantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo (Valstybės žinios, 1997-11-28, Nr. 108-2728) bei Europos Konvencijos dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų stuburinių gyvūnų apsaugos (Valstybės žinios, 2007-05-05, Nr. 49-1883) teisės aktų.

Tirtos visos pieninių ožkų veislės (1pav.) laikomos kontroliuojamuosiuose Lietuvos ožkų ūkiuose dėl STAT5 (6853C → T) ir AGPAT6 (9263C → G) genų polimorfizmo. Sudarytos skirtingos ožkų grupės kiekvienam genui: STAT5 – 72 ožkos, AGPAT6 – 56 ožkos.

1 pav. Tirtų ožkų pasiskirstymas pagal veislę.

30%

30%

9%

3%

8%

9%

11%

Anglo Nubijos ir Lietuvos vietinių mišrūnės (n=12) Alpių ir Zaaneno mišrūnės (n=14)

21 Genetiniai tyrimai atlikti iš pieno ir šerių su svogūnėliais mėginių. Pieno bei šerių mėginiai surinkti iš skirtingų kontroliuojamų Lietuvos pieninių ožkų ūkių. Kiekvienos tirtos ožkos gaunamo pieno kiekio ir jo sudėties duomenys gauti iš VĮ „Pieno tyrimai“.

Tyrimų duomenys sisteminti MINITAB programa, ir rezultatų statistinei analizei naudota MS Excel programa, skaičiuoti vidurkiai, chi –kvadrato testas, teorinis ir faktinis heterozigotiškumas, patikimumai.

2.2 DNR skyrimas iš pieno

Vykdant skyrimą iš pieno pavyzdžių: 750µl pieno buvo užpilta 750 µl Tris-HCH buferiu. Centrifūguojama 10 min. 2500 aps./min. greičiu, po centrifugavimo centrifūgatas nupilamas. Ant nuosėdų užpilta 600 µl Na citrato tirpalo. Turinys gerai sumaišomas ir centrifuguojama 5 min. 13500 aps./min. greičiu, centrifūgatas vėl nupilamas. Ant nuosėdų dar kartą užpilama 600 µl Na citrato tirpalo, nucentrifūguojama 5 min. 13500 aps./min. greičiu, centrifūgatas nupilamas ir ant nuosėdų užpilama 200 µl lizuojančio buferio ir 10 µl fermento Proteinazės K. Mėgintuvėlis sumaišomas ir centrifuguojama 10 sek. 13500 aps./min. greičiu. Mėginys inkubuojamas 45 min. 560

C temperatūroje. Po inkubacijos mėginys pakaitinamas 10 min. 940 _{C temperatūroje ir atšaldomas}

iki kambario temperatūros (47).

2.3 DNR skyrimas iš šerių

DNR ektrakcija Chelex dervų pagalba. Nukerpami 5-10 plaukų svogūnėliai ir patalpinami į mėgintuvėlius. Paruošiamas lizavimo mišinys (DTT – 7,5 µl, Chelex – 200 µl, Proteinazė K (20 mg/ml) – 10,7 µl). Mėgintuvėlio turinys užpilamas lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 218,2 µl paruošto mišinio). Mėgintuvėliai 30 sek. maišomi maišyklės „Vortex“ pagalba. Centrifuguojami 10 sek. 13500 aps./min. greičiu. Pavyzdžiai 45 min. inkubuojami 56° C temperatūroje (47).

2.4 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) buvo naudojama norint pagausinti AGPAT6 ir STAT5 genų tiriamus fragmentus (47).

22

 Pirminis: 5’-ATCTGGCATTTTCACACATT-3‘

 Atvirkštinis: 5‘- CTGACTCCATCTAAGAGCCT-3‘

Po DNR skyrimo, norint inaktyvuoti mišinyje likusį Proteinase K fermentą, į mėgintuvėlį įpilama 10 µl DNR (atliekama inaktyvacija 10 min. 950 _{C temperatūroje, amplifikatoriuje}

(AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700)). Į inaktyvuotą DNR įpilama 15 µl paruošto PGR mišinio, pagal 1 lentelėje pateiktus komponentus. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje (AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) 2 lentelėje pateiktu režimu.

1 lentelė. PGR komponentai AGPAT 6 geno tyrimui

PGR komponentai Vienai reakcijai atlikti (µl)

Dejonizuotas vanduo ddH2O 5,75

10x Dream Taq Buferis 2,5

dNTP mišinys (2mM) 2,5

Pirminis pradmuo AGPAT 6 F 2,0

Atvirkštinis pradmuo AGPAT 6 R 2,0

Dream Taq polimerazė (1U/µl) 0,25

2 lentelė. AGPAT 6 geno PGR reakcijos amplifikatoriuje rėžimas

Ciklų sk. Temperatūra, ⁰C Laikas

1 95⁰ C 2 min 35 94⁰ C 30 s 57⁰ C 45 s 72⁰ C 45 s 1 72⁰ C 7 min Laikymas 4⁰ C ∞

Po polimerazės grandininės reakcijos gaunamas 241 bp fragmentas. Atlikus PGR, norint nustatyti tiriamo geno fragmento polimorfizmą, PGR produktas buvo karpomas NcoI restrikcijos fermentu: į 10 µl PGR produkto buvo įpilama 20 µl restrikcinio mišinio, kuris sudarytas iš 17,0 µl ddH2O, 2,0 µl 10xMbuf., 1,0 µl NcoI. PGR produkto karpymas vykdomas amplifikatoriuje

(AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) 370 C temperatūroje 15 min. Po skaldymo restrikciniu fermentu, esant tiriamo geno sekoje, bazinių porų pasikeitimui, gaunami 130 ir 111 bp fragmentai (3 lentelė).

23

3 lentelė. AGPAT6 geno PGR produkto gairės genotipų vertinimui agarozės gelyje UV šviesoje.

Bp GC CC GG

130 --- ---

241 --- ---

111 --- ---

Tiriant STAT5 geną, buvo naudojami šie specifiniai oligonukleotidų pradmenys:

 Pirminis: 5‘-CTGCAGGGCTGTTCTGAGA-3‘

 Atvirkštinis: 5‘-TGGTACCAGGACTGTAGCACAT-3‘

Po DNR skyrimo, norint inaktyvuoti mišinyje likusį Proteinase K fermentą, į mėgintuvėlį įpilama 10 µl DNR (atliekama inaktyvacija 10 min. 950 _{C temperatūroje, amplifikatoriuje}

(AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700)). Į inaktyvuotą DNR įpilama 15 µl paruošto PGR mišinio, pagal 4 lentelėje pateiktus komponentus. PGR reakcija vykdoma amplifikatoriuje (AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) 5 lentelėje nurodytu režimu.

4 lentelė. PGR komponentai STAT5 geno tyrimui.

Eil. Nr. PGR komponentai Vienai reakcijai atlikti (µl) 1 Dejonizuotas vanduo ddH2O 5,75 2 Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5 3 dNTP miksas (2mM) 2,5

4 Pirminis pradmuo STAT5 F 2,0

5 Atvirkštinis pradmuo STAT5 R 2,0

6 Taq polymerazė (1vnt./µl)

aktyvumo

0,25

5 lentelė. STAT5 geno PGR reakcijos rėžimas.

Ciklų sk. Temperatūra, ⁰C Laikas

1 95⁰ C 5 min 35 94⁰ C 45 s 60⁰ C 45 s 72⁰ C 45 s 1 72⁰ C 7 min Laikymas 4⁰ C ∞

Po polimerazės grandininės reakcijos gaunamas 215 bp fragmentas. Atlikus PGR, norint nustatyti tiriamo geno fragmento polimorfizmą, PGR produktas buvo karpomas AvaI restrikcijos

24 fermentu: į 10 µl PGR produkto įpilama 20 µl restrikcinio mišinio, kuris sudarytas iš 17,0 µl ddH2O, 2,0 µl 10xMbuf., 0,7 µl AvaI. PGR produkto karpymas vykdomas amplifikatoriuje

(AppliedBiosystem; GeneAmp PCR System 2700) 370 C temperatūroje 15 min. Po skaldymo restrikciniu fermentu, esant tiriamo geno sekoje, bazinių porų pasikeitimui, gaunami 215, 181 ir 34 bp fragmentai (6 lentelė).

6 lentelė. STAT5 geno PGR produkto gairės genotipų vertinimui agarozės gelyje UV šviesoje.

Bp CC CT TT

215 --- ---

181 --- --- 34 --- ---

2.5 Elektroforezė

Karpytas PGR produktas, elektroforezės būdu frakcionuojamas 2 proc. agarozės gelyje, 100 V 45 min. ir analizuojamas UV šviesoje (bangos ilgis 300 nm) „MiniBisPro“ video dokumentavimo prietaisu (Herolab).

1. Paruošiamas gelis:

 Pasveriama 2 g agarozės, suberiama į kolbą ir užpilama 100 ml 1 x TAE buferio;

 Pamaišoma ir verdama mikrobangų krosnelėje 3 kartus po 1 minutę kaskart pamaišant, agarozės tirpalas turi tapti skaidrus ir pradėti virti;

 Tirpalas atvėsinamas; į jį įlašinama 1 lašas etidžio bromido ir nestipriais judesiais sumaišoma;

 Tirpalas supilamas į rėmelius, kuriuose yra įstatytos šukutės;

 Laukiama apie 15 minučių kol gelis sustings.

2. Elektroforezės aparatas užpildomas TAE buferiu. Iš sustingusio gelio išimamos šukutės. Gelis įdedamas į elektroforezės vonelę.

3. Restrikciniais fermentais skaldyti PGR produktai yra sumaišomi su 2 μl dažo ir perkeliami į gelio šulinėlius. Pirmame ir paskutiniame šulinėlyje įleidžiama 5 μl molekulinės masės žymeklio.

4. Elektroforezės sistema uždengiama ir prijungiama prie elektros srovės šaltinio. Elektroforezė vykdoma apie 45 minutes, esant 100 V įtampai.

5. Pasibaigus elektroforezei gelis pernešamas į gelio video dokumentavimo prietaisą, kuriame gelis apšviečiamas UV šviesa ir esantys fragmentai yra matomi kompiuterinėje „Gel Capture“

25 programoje. Gelis yra fotografuojamas ir nuotrauka išsaugoma, atliekama DNR fragmentų analizė.

26

3 TYRIMO REZULTATAI

3.1 STAT5 geno polimorfizmo tyrimai

STAT5 geno polimorfizmo (6853C → T) asociacijos su pieno savybėmis tirtos 72 ožkų

grupėje. 2 ir 3 pav. nurodytos tirtos ožkų veislės ir jų pasiskirstymas atitinkamai pagal nustatytus alelių ir genotipų dažnius.

7 lentelė. Nustatyti STAT5 geno genotipų dažniai tirtoje ožkų grupėje.

CC genotipo dažnis TT genotipo dažnis CT genotipo dažnis

0,639 0,056 0,305

Tirtų ožkų grupėje nustatyti trys STAT5 geno genotipai (7 lentelė). Homozigotinį CC genotipą turėjo 63,9 proc. tirtų individų, heterozigotinį CT genotipą – 30,5 proc. ir rečiausiai nustatytas homozigotinis TT genotipas – 5,6 proc.

2 pav. STAT5 geno nustatytų genotipų dažniai pagal veisles.

Tarp tirtų Čekų baltųjų ir Lietuvos vietinių ožkų buvo nustatyti visi trys galimi genotipai – CC, CT, TT, dažniausiai nustatytas buvo CC genotipas - nepakitęs. Tarp Alpių, Zaaneno, Lietuvos vietinių, Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių mišrūnių bei Alpių ir Zaaneno mišrūnių ožkų veislių buvo nustatytas tik vienas polimorfinis genotipas – CT.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,91 14 12 12 4 8 8 14 Zaaneno Čekų baltosios Alpių Anglo Nubijos Lietuvos vietinės Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių mišrūnės Alpių ir Zaaneno mišrūnės 0,9 0,5 0,4 1 0,5 0,5 0,9 0,1 0,3 0,6 0 0,25 0,5 0,1 0 0,2 0 0 0,25 0 0 CC CT TT

27 Didžiausias CT genotipo dažnis nustatytas Alpių veislės ožkoms – 0,6 dažniu, o TT genotipo dažnis – Lietuvos vietinėms – 0,25 dažniu ir Čekų baltosios veislės ožkoms - 0,20 dažniu (2 pav).

8 lentelė. Nustatytų STAT5 geno alelių dažniai tirtoje ožkų grupėje.

C alelio dažnis T alelio dažnis

0,792 0,208

Tirtų ožkų grupėje nustatyti du STAT5 geno aleliai – C ir T. Dažniau aptiktas C alelis 79,2 proc., o mutuotas T alelis rečiau – 20,8 proc. (8 lentelė).

3 pav. STAT5 geno rastų alelių dažniai pagal veisles.

Lyginant pagal tirtas veisles C alelis visų veislių atžvilgiu pasireiškė dažniau, nei T alelis (3 pav.). Dažniau T alelis nustatytas tarp Lietuvos vietinių (0,375 dažniu), Alpių (0,34 dažniu) ir Čekų baltųjų (0,34 dažniu) veislės ožkų.

9 lentelė. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas STAT5 geno lokuse.

Heterozigotiškumas X2 Faktinis heterozigotiškumas 0,056 Teorinis heterozigotiškumas 0,329 0,93 0,66 0,66 1 0,625 0,75 0,93 0,07 0,34 0,34 0 0,375 0,25 0,07 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 14 12 12 4 8 8 14

Zaaneno Čekų baltosios Alpių Anglo Nubijos Lietuvos vietinės Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių

mišrūnės

Alpių ir Zaaneno mišrūnės

28 Vertinant Hardžio – Weinbergo pusiausvyros dėsnį apskaičiuotas faktinis ir teorinis heterozigotiškumą tirtoje ožkų grupėje (9 lentelė) faktinis heterozigotiškumas buvo rastas mažesnis už teorinį, kas rodo heterozigotiškumo trūkumą.

10 Lentelė. STAT5 geno polimorfizmų genotipų vidurkiai palyginus su tirtų ožkų pieno baltymų, riebalų ir pieno kiekiu (vidurkis ± standartinė paklaida)[***-p<0,001].

STAT5 Genotipai

Rodiklis CC CT TT

Riebalai, proc. 3,99±1,26***TT 3,61±1,25 3,18±0,52***CC

Baltymai, proc. 3,21±0,49 3,02±0,40***TT 3,44±0,10***CT

Pienas, kg 1,4±0,56***TT 1,72±1,14 1,03±0,02***CC

Palyginus ožkų STAT5 geno CC, CT, TT genotipus ir pieno riebalų, baltymų bei gauto pieno kiekio vidurkius iš rezultatų 10 lentelės matome, kad individai turintys CC genotipą pasižymi didesniu riebalų kiekiu (statistiškai tarp CC ir TT genotipų nustatyta p<0,001). Pagal ožkų veislę mažiausią riebalų kiekio reikšmę turėjo Zaaneno veislė – 2,06 proc., o didžiausią reikšmę – Anglo Nubijų - 6,63 proc. Didesniu pieno baltymų kiekiu pasižymėjo individai su TT genotipu (tarp CT ir TT genotipų p<0,001). Didžiausią pieno kiekį per laktaciją (kg) davė individai turintys CT genotipą (lyginant su kitais nustatytais genotipais šis rezultatas nėra statistiškai patikimas) (10 lentelė).

11 Lentelė. Tirtų ožkų veislių riebalų, baltymų ir pieno kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida), ir tirtų ožkų palyginimai tarp veislių [* -p<0,05; **-p<0,01; ***-p<0,001].

Veislė Riebalai Baltymai Pienas, kg

Zaaneno1 2,77±0,49*3;***4,7 3,41±0,13**3;***5 1,93±0,02*4;***6;**7 Čekų baltosios2 3,87±1,21***4 3,17±0,46*5;*7 1,5±0,07**6 Alpių3 3,44±0,66***4;*7 2,9±0,38*4;*5 1,71±1,12 Anglo Nubijos4 6,07±0,80*5;**6;7 3,88±0,81*7 1,01±0,69*1 Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių mišrūnės5 3,74±1,92*4 2,84±2,84**6 1,61±0,86 Lietuvos vietinės6 _3,19±0,39*7;**4 _3,23±0,32*7 _1,14±0,16**2;;***1**2 Alpių ir Zaaneno mišrūnės7 4,51±1,15 *6;*3;***1 2,81±0,02*6 _1,33±0,48**1

29 Lyginant tarp veislių (su Anglo Nubijų veislės ožkomis, p<0,05; su Alpių ir Zaaneno mišrūnėmis, p<0,01; su Lietuvos vietinėmis ožkomis, p<0,001) galime išskirti Zaaneno veislės ožkas dėl didžiausio duodamo pieno kiekio. Didžiausiu baltymų kiekiu piene pasižymėjo Anglo Nubijos ožkos (su Alpių ir Zaaaneno mišrūnėmis, p <0,05) ir Zaaneno veislės ožkos (su Alpių veislės ožkomis, p<0,01; su Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių mišrūnėmis, p<0,001). Pieno riebalingumas didžiausias buvo pas Anglo Nubijos veislės ožkas (su Anglo Nubijos ir Lietuvos vietinių mišrūnėmis, p<0,05; su Lietuvos vietinėmis ir Alpių ir Zaaneno mišrūnėmis, p<0,01) (11 lentelė).

3.2

AGPAT6 geno polimorfizmo tyrimai

AGPAT6 geno (9263C → G) polimorfizmo asociacijos su pieno savybėmis tirtos 56 ožkų

grupėje. 4 ir 5 pav. nurodytos tirtos ožkų veislės ir jų pasiskirstymas atitinkamai pagal nustatytus alelius ir genotipus.

12 lentelė. AGPAT6 geno genotipų dažniai tirtoje ožkų grupėje.

GG genotipas CC genotipas CG genotipas

0,142 0,429 0,429

Tirtų ožkų grupėje nustatyti trys AGPAT6 geno genotipai (12 lentelė). Homozigotinį CC genotipą turėjo 42,9 proc. tirtų individų, homozigotinį GG genotipą turėjo rečiausiai – 14,2 proc. individų ir heterozigotinį CG genotipą turėjo tiek pat tirtų individų, kaip ir homozigotinį CC genotipą – 42,9 proc.

4 pav. AGPAT6 geno nustatytų genotipų dažniai priklausomai pagal tirtas veisles. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 24 26 2 4

Zaaneno Čekų baltosios Lietuvos vietinės Anglo Nubijų ir

Lietuvos vietinių mišrūnės 0,33 0,54 1 0,67 0,15 1 0,31 CC CG GG

30 Tarp Čekų baltųjų veislės ožkų buvo nustatyti visi trys GPAT6 geno polimorfizmai. CG genotipas buvo nustatytas tarp Zaaneno veislės ožkų dažniausiai, o CC genotipas tarp Čekų veislės individų. GG genotipas buvo nustatytas tik tarp Čekų baltųjų veislės ožkų (4 pav.).

13 lentelė. Nustatyti AGTP6 geno alelių dažniai tirtoje ožkų grupėje.

G alelis C alelis

0,357 0,643

Tirtoje ožkų grupėje (13 lentelė) nustatyti du AGPAT6 geno aleliai – G ir C. Alelis G aptiktas 35,7 proc. rečiau, o C alelis dažniau – 64,3 proc.

5 pav. AGPAT6 geno polimorfizmo genotipų dažniai pagal veislę.

Tarp Lietuvos vietinių mutuotas G alelis nebuvo nustatytas. Didžiausias G alelio dažnis nustatytas tarp Čekų baltosios veislės ožkų (5 pav.).

14 lentelė. Faktinis ir teorinis heterozigotiškumas AGPAT6 geno lokuse.

Heterozigotiškumas X2 Faktinis heterozigotiškumas 0,357 Teorinis heterozigotiškumas 0,459 0,67 0,62 1 0,5 0,33 0,38 0,5 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 24 26 2 4

Zaaneno Čekų baltosios Lietuvos vietinės Anglo Nubijų ir Lietuvos

vietinių mišrūnės

31 Vertinant Hardžio – Weinbergo pusiausvyros dėsnį apskaičiuotas faktinis ir teorinis heterozigotiškumą tirtoje ožkų grupėje (14 lentelė) faktinis heterozigotiškumas buvo rastas mažesnis už teorinį, kas rodo heterozigotiškumo trūkumą.

15 lentelė. AGPAT6 genotipų vidurkiai palyginus su pieno riebalų, baltymų ir pieno kiekiu ( vidurkis±standartinė paklaida)[**-p<0,01]. AGPAT6 Genotipai Rodiklis CC CG GG Riebalai, proc. 3,52±0,70 3,31±0,29 3,35±0,21 Baltymai, proc. 2,98±0,69 3,33±0,25 2,94±0,35 Pienas, kg 1,17±0,49**CG 1,88±0,06**CC,GG 0,97±0,28**CG

CC genotipą turėję individai pasižymėjo didesniu riebalų kiekiu. Palyginus pagal veislę mažiausią reikšmę riebalų kiekio turėjo Lietuvos vietinės ožkos – 2,47 proc., o didžiausią reikšmę turėjo Čekų baltosios veislės ožkos – 4,59 proc. CG genotipą turėjo ožkos duodančios didesnio baltymingumo pieną. Ir didesniu pieno kiekiu laktacijos metu pasižymėjo individai turintys CG genotipą (lyginant gautus genotipus gauti statistiškai patikimi rezultatai, p<0,01). Riebalų ir baltymų rodikliai tarp gautų genotipų buvo statistiškai nepatikimi (15 lentelė).

16 lentelė. Tirtų ožkų veislių riebalų, baltymų ir pieno kiekis (vidurkis ± standartinė paklaida), ir tirtų ožkų palyginimai tarp veislių [* -p<0,05; **-p<0,01; ***-p<0,001].

Veislė Riebalai Baltymai

Zaaneno1 3,25±0,48*2;5;***6 3,41±0,09**2;***5;***6

Čekų baltosios2

3,62±0,47***6;*1 3,03±0,55**6;**1

Anglo Nubijų ir Lietuvos

vietinių mišrūnės5 3,5±0,02

**6;*1

2,92±0,04***1

Lietuvos vietinės6

2,44±0,05**5;***1;***2 2,58±0,11**2;***1

Lyginant tarp veislių galime išskirti Čekų baltosios veislės ožkas, kaip duodančias pieną su didesniu riebalų kiekiu (su Lietuvos vietinėm, p<0,001; su Zaaneno veislės ožkom, p<0,05). O baltymingiausias pienas buvo pas Zaaneno veislės ožkas (su Čekų baltosiomis p<0,01; su Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių mišrūnėm ir Lietuvos vietinėm, p<0,001) (16 lentelė).

32

4 REZULTATŲ APTARIMAS

Ožkų pienas yra vertingas maisto produktas, iš kurio gaunama įvairių maisto produktų. Iš jo gaminamas sviestas, kefyras, varškė, jogurtas, sūris. Produkcijos gausa ir kokybė priklauso nuo pieno kokybės. Pieno kokybei įtakos turi įvairūs veiksniai: gyvūnų genetika, šėrimas, laikymo sąlygos (48).

Gyvulių produktyvumo rodikliai, tokie kaip pieno kiekis, pieno sudėtis, pieno riebalų ir baltymų kiekis, pieno cheminė sudėtis ir kiti, yra paveldimi iš kartos į kartą, o jų formavimąsi bei funkcines savybes lemia genai (49).

AGPAT6 genas svarbus glicerolipidų biosintezės ir pieno riebalų gamyboje. Anksčiau atlikti

tyrimai C. He et al. (30) parodė keturias ožkų AGPAT6 geno mutacijas (NC_007328.3:g. 152G → C, 8124G → A, 9263C → G, 16436G → A), kurios aptiktos 5‘UTR (P1-Kpnl), introne 2 (P2), egzone (P4) ir 3‘UTR (P10). Šiame tyrime buvo tirta mutacija 9263C → G. Mutacija 9263C → G pridėta NcoI endonukleasės restrikcinės vietos (CCATGG), ir paveikta su NcoI 241 bp PGR produktu parodė du fragmentus (130 ir 111 bp) G alelio ir vieną fragmentą (241 bp) C alelio (30). Tiriant Kinijos Zaaneno (n=268) ir Guanzhong (n=281) ožkų veisles nustatyta, kad individai su GG ir CG genotipais turi gerokai aukštesnį pieno riebalų, baltymų turinį ir pieno kiekį (p < 0,05 ar p < 0,01), negu genotipo CC individai (30). Ištyrus Lietuvos 56 pieninių ožkų grupę, nustatyti AGPAT6 geno mutacijos (9263C → G) genotipai – CC, CG ir GG. Individai turėję CG genotipą pasižymėjo didesniu pieno baltymų ir pieno kiekiu (statistiškai patikimas rezultatas pieno kiekio rodiklis tarp gautų genotipų, p<0,01). Todėl galime teigti, kad individai turintys mutuotą G alelį duoda didesnį pieno kiekį su didesniu baltymų kiekiu. Net jei tai yra tyli mutacija, pastaruoju metu buvo keletas pranešimų apie ryšį tarp tylios mutacijos ir geno funkcijos, tai reiškia, kad baltyminis produktas, turintis tą pačią rūgščių seką, bet skirtingą geno seką, turi skirtingas struktūrines ir funkcines savybes (30). Čekų baltosios ožkos pasižymėjo didžiausiu G alelio dažniu – 0,38, ir jų pienas turėjo didžiausią riebalų kiekį. Zaaneno veislės ožkos turėjo G alelį 0,33 dažniu ir jų pienas pasižymėjo didžiausiu baltymingumu. Lietuvos vietinių ir Anglo Nubijų ir Lietuvos vietinių mišrūnių gautus rezultatus nepatikima vertinti dėl labai mažos imties, Lietuvoje šių veislių kontroliuojamų yra mažas skaičius, reikėtų atlikti daugiau tyrimų su šiomis veislėmis.

Pagal STAT5 geno mutacijos (6853C → T) tyrimus tarp Lietuvos pieninių ožkų nustatyta trys polimorfizmai – CC, CT, ir TT. Tarp tirtų ožkų veislių C alelis pasireiškė 0,792 dažniu, o T alelis 0,208 dažniu. Ožkos turinčios CT genotipą išskyrė didesnį pieno kiekį (statistiškai nereikšmingas lyginant su kitais genotipais), o ožkos su TT genotipu išskyrė didesnį pieno baltymų kiekį (statistiškai reikšmingas lyginant su CT genotipu, p<0,001). Kinijoje X. P. An et al. (38) atliktuose

33

STAT5 geno tyrimuose tarp Zaaneno ir Guanzhong veislės ožkų nustatyta, kad CT genotipą turintys

individai turėjo didesnę pieno išeigą ir pieno riebalų kiekį, nei ožkų su CC genotipu (p<0,05). Tiek užsienio mokslininkų tyrimuose, tiek šiame tyrime gauti rezultatai, rodo reikšmingą pasikeitimą C → T alelio, dėl pagerėjusių pieno kokybinių ir kiekybinių rodiklių.

34

IŠVADOS

1. Atlikus STAT5 geno tyrimus tarp Lietuvoje auginamų ožkų veislų buvo identifikuoti trys genotipai – homozigotinis CC (63,89 proc.), heterozigoninis CT (30,55 proc.) ir homozigotinis TT (5,56 proc.). C alelis pasireiškė 0,792 dažniu ir T alelis 0,208 dažniu. 2. Atlikus AGPAT6 geno tyrimus tarp Lietuvoje auginamų ožkų veislių buvo identifikuoti

trys genotipai – homozigoninis CC (45,86 proc.), heterozigotinis CG (42,86 proc.) ir homozigotinis GG (14,28 proc.). G alelis nustatytas 0,357 dažniu, C alelis nustatytas 0,643 dažniu.

3. Ožkos, kurių STAT5 gene rastas CT genotipas, turėjo padidėjusią pieno išeigą 0,32 kg. per laktaciją, nei ožkų turinčių CC genotipą. Veislėse, kuriom buvo nustatyta didesnė pieno išeiga t.y. Zaaneno (1,93 kg.) ir Alpių (1,71 kg.) STAT5 CT genotipas lėmė didesnę pieno išeigą.

4. Ožkų, kurių AGPAT6 gene rastas CG genotipas pieno baltymingumas buvo 0,35 proc. didesnis nei ožkų su CC genotipu. Veislėse, kuriose nustatytas didžiausias pieno baltymingumas t.y. Zaaneno (3,41 proc.) ir Čekų baltųjų (3,03 proc.) AGPAT6 CG genotipas lėmė didesnį ožkų pieno baltymingumą.

35

REKOMENDACIJOS

Šie atlikti tyrimai rodo, kad ištyrus ožkų pieno kiekybinius ir kokybinius rodiklius, kuriuos nulemia genetiniai veiksniai, selekcija būtų vykdoma efektyviau, parenkant ožkas turinčias genotipą, kuris lemia didesnę pieno išeigą, ar didesnį pieno baltymingumą / riebumą.

Atsižvelgiant į tyrime gautus rezultatus pieninių ožkų augintojams Lietuvoje, siekiantiems gauti didesnį pieno kiekį, rekomenduojama rinktis Alpių veislės ožkas turinčias STAT5 CT genotipą; ar norint gauti didesnį pieno kiekį pasižymintį didesniu baltymingumu reikėtų rinktis Zaaneno veislės pienines ožkas turinčias AGPAT6 CG genotipą.

36

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Morammazi S, Masoudi AA, Vaez Torshizi R, Pakdel A. Differential Expression of the Alpha S1 Casein and Beta-Lactoglobulin Genes in Different Physiological Stages of the Adani Goats Mammary Glands. Iran J Biotechnol. 2016 Dec;14(4):278-285.

2. Moioli B, D’Andrea M, Pilla F. Candidate genes affecting sheep and goat milk quality. Small Rum Rese. 2007 March;68(1):179-192.

3. Taberlet P, Coissac E, Pansu J, Pompanon F. Conservation genetics of cattle, sheep, and goats. Comp Rend Biol. 2011 March;334(3):247-254.

4. Juškienė V. Gyvulininkystės žinynas. Baisogala (Radviliškio r.): LVA Gyvulininkystės institutas; 2007. p. 426-453.

5. Agricultural alternatives [Internet] [cited 2017 Sept 25] Available at: https://extension.psu.edu/downloadable/download/sample/sample_id/524/

6. Small ruminants [Internet] [cited 2017 Sept 21] Available at: http://www.fao.org/dairy-production-products/production/dairy-animals/small-ruminants/en/

7. Martin P, Palhiere I, Maroteau C, Bardou P, Canale-Tabet K, Sarry J, et al. A genome scan for milk production traits in dairy goats reveals two new mutations in Dgat1 reducing milk fat content. Sci Rep. 2017 May 12;7(1):1872-017-02052-0.

8. Taiwo Idowu S, Olufunke Adewumi O. Genetic and Non-Genetic Factors Affecting Yield and Milk Composition in Goats. J Adv Dairy Res. 2017 01/01;5(2):175.

9. Petrovic M.P., Mekic C., Ružic Dragana, Žujovic M. Genetic principles relating to improvement of milk yield in sheep and goats. Biotech in Anim Husb. 2005;21(5-6):73-78. 10. Ožkų veislių klasifikatorius [elektroninis išteklius] [žiūrėta 2017 m. rugsėjo 19 d.]. Prieiga

per internetą: http://www.vic.lt/?mid=279

11. Goats – Lithuanian local [Internet] [cited 2017 Sept 14] Available at: http://www.agrowebcee.net/awlt/animal-genetic-resources/goats-lithuanian-local/

12. Saanen goat [Internet] [cited 2017 Sept 14] Available at: http://www.roysfarm.com/saanen-goat/

13. Alpine goat [Internet] [cited 2017 Sept 14] Available at: http://www.roysfarm.com/alpine-goat/

14. Toggenburg goat [Internet] [cited 2017 Sept 14] Available at: http://www.roysfarm.com/toggenburg-goat/

15. Goats of dairy without odor [Internet] [cited 2017 Sept 14] Available at: http://repairrs.com/en/pages/695628