LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO DRUSKA FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

ANTANAS ŠIAUČIŪNAS

LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO

DRUSKA FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai: prof. dr. Vitalis Briedis prof. dr. Anna Maria Fadda

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis, Data

LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO DRUSKA FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovai:

prof. dr. Vitalis Briedis prof. dr. Anna Maria Fadda Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantas Antanas Šiaučiūnas

Data Data

TURINYS

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Liposominių nanonešiklių apžvalga ... 11

1.1.1. Liposomų panaudojimas lokaliam gydymui ... 13

1.1.2. Liposomų klasifikacija ir jų pašalinimas iš organizmo ... 14

1.2. Liposomų gamyboje naudojamos medžiagos ... 15

1.2.1. Fosfolipidai ... 15

1.2.2. Cholesterolis ... 16

1.3. Liposomų charakterizavimas in vitro ... 17

1.3.1. Liposomų lamelių skaičiaus nustatymas ... 17

1.3.2. Liposomų dalelių dydžio analizė ... 18

1.3.3. Liposomų išvaizda ir drumstumas ... 18

1.3.4. Liposomų zeta potencialas ... 19

1.3.5. Liposomų inkorporavimo efektyvumas ... 19

1.3.6. Vaistinės medžiagos atpalaidavimas iš liposomų ... 20

1.4. Naujo tipo lipidiniai nanonešikliai ... 20

1.4.1. Transferosomų apžvalga ... 20 1.4.2. Etosomų apžvalga ... 22 2. TYRIMO METODAI ... 24 2.1. Tyrimo objektas ... 24 2.2. Tyrimo medžiagos ... 24 2.2.1. Reagentai: ... 24 2.2.2. Įranga: ... 24

2.3.1. Nanonešiklių homogenizavimas ... 27

2.4. Analitiniai metodai ... 27

2.4.1. Lipidinių nanonešiklių vidutinio dalelių dydžio ir PDI nustatymas ... 27

2.4.2. Lipidinių nanonešiklių zeta potencialo nustatymas ... 28

2.4.3. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimas ... 28

2.4.4. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo nustatymas ... 28

2.4.5. Statistinė analizė ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30

3.1. Lipidinių nanonešiklių homogenizavimo metodo parinkimo analizė ... 30

3.2. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo tyrimo rezultatai ... 31

3.3. Lipidinių nanodalelių dydžio nustatymo rezultatai ... 32

3.4. Lipidinių nanonešiklių stabilumo, nustatant nanodalelių zeta potencialą, tyrimo rezultatai ... 34

3.5. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai ... 35

4. IŠVADOS ... 39

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41

SANTRAUKA

LIPIDINIŲ NANONEŠIKLIŲ SU DIKLOFENAKO NATRIO DRUSKA

FORMULAVIMAS IR STABILUMO VERTINIMAS

A.Šiaučiūno magistro baigiamasis darbas, moksliniai vadovai prof. dr. V.Briedis ir prof. dr. A.M.Fadda; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra, Kaunas. Università degli studi di Cagliari, department of environmental and life science, Cagliari (Italija).

Darbo tikslas – įvertinti lipidinių nanonešiklių (liposomų, transferosomų, etosomų) su inkorporuota diklofenako natrio druska fizikines–chemines savybes, stabilumą ir inkorporavimo efektyvumą. Uždaviniai – pagaminti lipidinius nanonešiklius (liposomas, transferomoas, etosomas) naudojant plono lipidų sluoksnio hidracijos metodą; nustatyti lipidinių nanonešiklių fizikines– chemines savybes: vidutinį dalelių dydį, dispersiškumą ir zeta potencialą; įvertinti lipidinių nanonešiklių stabilumą; įvertinti lipidinių nanonešiklių gebą inkorporuoti diklofenako natrio druską.

Tyrimo metodai. Liposomų, transferosomų ir etosomomų gamybai naudotas plono lipidų sluoksnio hidracijos metodas, homogenizavimui – ultragarsinis metodas. Į visus lipidinius nešiklius inkorporuota diklofenako natrio druska. Lipidinių nanonešiklių vidutinis dalelių dydis, polidispersijos indeksas ir zeta potencialas nustatytas naudojant Zetasizer Nano (Malvern, JK) analizatorių. Dalelių stabilumas vertintas matuojant visų formuluočių vidutinį dalelių dydį ir PDI praėjus 1val., 1d., 2d., 1sav., 2sav., ir 1 mėn. po pagaminimo. Inkorporavimo efektyvumui nustatyti atskirta laisva diklofenako natrio druska nuo lipidinės nanonešiklio suspensijos. Diklofenako natrio druskos kiekis nešikliuose nustatytas spektofotometrijos metodu.

Rezultatai ir išvados. Liposomų dalelių dydis po ciklinio homogenizavimo buvo 39 proc. mažesnis lyginant su necikliškai homogenizuotomis dalelėmis. Transferosomų ir etosomų atvejais šis skirtumas buvo atitinkamai 40 proc. ir 13 proc. mažesnis. Visų lipidinių nanonešiklių zeta potencialas buvo < −44,5 mV. Nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai parodė, kad po 1 mėnesio stabiliausi buvo liposominiai nešikliai, kadangi jų dalelių dydžio pokyčiai po 1 mėn. buvo statistiškai nereikšmingi (p>0,05). Liposomų inkorporavimo efektyvumas buvo 13,1 proc. ir 33,75 proc. didesnis nei atitinkamai transferosomų ir etosomų. Tyrimų rezultatai patvirtino ultragarso tinkamumą visų trijų tipų lipidinių nanodalelių homogenizavimui. Suformuluotų liposomų stabilumas yra pakankamas. Etosomų ir transferosomų formuluotės turi būti toliau vystomos siekiant pritaikyti diklofenako natrio druskos vaisto formos gamybai. Cikliškai homogenizuotos liposomos tinkamos atlikti biofarmacinius tyrimus siekiant nustatyti diklofenako natrio druskos atpalaidavimo kinetiką.

SUMMARY

FORMULATION AND STABILITY EVALUATION OF LIPID NANOCARRIERS WITH INCORPORATED DICLOFENAC SODIUM

The aim of the study was to evaluate physico-chemical properties, stability and incorporation efficiency of vesicular carriers (liposomes, transfersomes, ethosomes), containing diclofenac sodium. Tasks – to prepare vesicular carriers (liposomes transferomoas, etosomas) using a thin lipid layer hydration method; to determine vesicular carriers physical and chemical properties: average particle size, polydispersity and zeta potential; to assess stability of vesicular carriers; to assess vesicular carriers ability to incorporate diclofenac sodium salt.

Liposomes, transfersomes and ethosomes were prepared by using a thin lipid layer hydration method and homogenised by using ultrasonic method. Diclofenac sodium salt was incorporated in all vesicular carriers. Particle size, polydispersion index and zeta potential of vesicular carriers was determined by using the Zetasizer Nano (Malvern, UK) analyzer. Stability of vesicular carriers was evaluated by measuring particles size and PDI for 28 days. To evaluate incorporation efficiency of vesicular carriers, first of all, free diclofenac sodium was separated from suspension. Amount of diclofenac sodium was evaluated by using spectrophotometric method.

Particles size of liposomes, transfersomes and ethosomes after cyclic homogenization was 39%, 40% and 13% lower compared to the non-cyclical homogenized particles. Vesicular carriers zeta potential was <-44.5 mV. Vesicular carriers stability studies showed that after 1 month the most stable was liposomes because their particle revealed lowest size changes after 1 month. Incorporation efficiency of liposomes was 13.1% and 33.75% higher than transfersomes and ethosomes. The results confirmed the suitability of ultrasonic method for all three types of vesicular carriers homogenisation. Stability of formulated liposomes was considered as sufficient. Ethosomes and transfersomes should be reformulated for futher studies. Biopharmaceutical evaluation should be considered as the next step in the development.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju magistro baigiamojo darbo vadovams: prof. dr. Vitaliui Briedžiui ir prof. dr. Anna Maria Fadda už pagalbą, paramą ir patarimus atliekant eksperimentinę dalį ir magistro baigiamojo darbo rašymo metu.

Dėkoju Kaljario universiteto darbuotojams ir doktorantams: dr. Carla Caddeo, dr. Maria Letizia Manca ir Michele Schlich už pagalbą ir patarimus atliekant magistro baigiamojo darbo eksperimentinę dalį.

Dėkoju LSMU FF klinikinės farmacijos katedros darbuotojams ir doktorantams: prof. dr. Kristinai Ramanauskienei, lekt. dr. Modestui Žiliui ir Agnei Mazurkevičiūtei už pagalbą ir patarimus rašant magistro baigiamąjį darbą.

SANTRUMPOS

nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo fosfoliponas 90G paveikslas polidispersiškumo indeksas polietileno glikolis regresijos koeficientas retikuloendotelinė sistema ultravioletiniai spinduliai

ĮVADAS

Ilgėjanti gyvenimo trukmė skatina ieškoti priemonių, kurios užtikrintų geresnę gyvenimo kokybę. Didelė dalis žmonių, ypač senyvo amžiaus, vartoja vaistus, todėl farmacijos pramonė ieško būdų kaip užtikrinti mažesnes vaistų dozes, ilgesnį ir efektyvesnį jų veikimą, sumažinti vaistų šalutinį poveikį.

Lipidiniai nanonešikliai yra sferinės formos vezikulės, sudarytos iš centre esančios vandeninės fazės, kuri padengta vieno ar kelių sluoksnių fosfolipidų [1–6]. Lipidinių nanonešiklių grupei priskiriamos liposomos, transferosomos ir etosomos. Transferosmų ir etosomų sukūrimą lėmė ribotos liposomų pritaikymo galimybės pernešant lokaliai vartojamas vaistines medžiagas [7,8]. Nors visų šių tipų nanodalelės gaminamos pritaikant panašias technologijas, tačiau jų stabilumas ir geba inkorporuoti vaistines medžiagas skiriasi.

Lipidinių nanonešiklių savybės, pernešant vaistines medžiagas, gali būti pritaikytos įvairioms patogenezėms gydyti dėl jų pakankamo stabilumo, mažo toksiškumo, efektyvumo ir universalumo parenkant priimtiniausią vartojimo būdą [2–4]. Dažniausiai lipidiniai nanonešikliai pritaikomi pernešant ribotai vandenyje tirpias vaistines medžiagas. Dabartiniu metu sparčiai tiriamos galimybės pritaikyti lipidinius nanonešiklius įvairios prigimties vaistinių medžiagų pernašai į biologinius audinius [6].

Nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (NVNU) yra viena iš dažniausiai vartojamų vaistų grupių. Jie vartojami gydant chroniškus reumatoidinio artrito simptomus, osteoartritą, dismenorėją dėl analgetinio, antipiretinio ir priešuždegiminio poveikio. Vartojant juos ant odos įprastinėmis farmacinėmis vaistų formomis (geliais, kremais, tepalais), jų biologinis prieinamumas yra ribotas. Diklofenako natrio druska yra vienas iš dažniausiai vartojamų NVNU. Jos įterpimas į lipidinius nanonešiklius galėtų pagerinti medžiagos skvarbą į gilesnius odos sluoksnius ir sisteminę kraujotaką.

Darbo tikslas – įvertinti lipidinių nanonešiklių (liposomų, transferosomų, etosomų) su inkorporuota diklofenako natrio druska fizikines–chemines savybes, stabilumą ir inkorporavimo efektyvumą.

DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: įvertinti lipidinių nanonešiklių (liposomų, transferosomų, etosomų) su inkorporuota diklofenako natrio druska fizikines–chemines savybes, stabilumą ir inkorporavimo efektyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Pagaminti lipidinius nanonešiklius (liposomas, transferosomas, etosomas) naudojant plono lipidų sluoksnio hidracijos metodą.

2. Nustatyti lipidinių nanonešiklių fizikines–chemines savybes: vidutinį dalelių dydį, dispersiškumą ir zeta potencialą.

3. Įvertinti lipidinių nanonešiklių stabilumą.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Liposominių nanonešiklių apžvalga

Pirmą kartą liposomos pagamintos 7-ame dešimtmetyje Kembridže, Anglijoje. Hematologas A. D.Bangham atlikdamas bandymus su elektoriniu mikroskopu pastebėjo, kad fosfolipidai vandeniniame tirpale linkę suformuoti uždaras pūsleles – liposomas [9,10]. Liposomų dalelių dydis gali būti nuo 0,02 µm iki 10 µm. Liposomų savybės priklauso nuo pasirinktos gamybos technologijos ir naudojamų medžiagų. Jos gaminamos iš natūralių ir/ar sintetinių fosfolipidų, tačiau kitos medžiagos, tokios kaip cholesterolis, taip pat gali būti naudojamos gaminant liposomas, siekiant pagerinti jų savybes.

Liposomų viduje esančioje vandeninėje terpėje talpinamos vandenyje tirpios medžiagos (1A pav.). Lipofilinės ir amfilfilinės medžiagos išsidėsto liposomų membranos fosfolipidų dvisluoksnyje (1B pav.) [4].

1 pav. Liposomos strukūra: A – inkorporuota hidrofilinė medžiaga, B – inkorporuota lipofilinė medžiaga [11]

Liposomos vartojamos skystomis (suspensijos), kietomis (sausi milteliai) ir pusiau kietomis (geliai, kremai) vaisto formomis, dažniausias vartojimo būdas – ant odos arba parenteraliai. Patekusios į organizmą, liposomos atpažįstamos kaip svetimos dalelės ir endocituojamos retikuloendotelinės sistemos (RES) makrofagų kepenyse ir blužnyje [12]. Todėl įprastos liposomos tinkamos pernešant vaistus į šių organų ląsteles.

Liposomos, naudojamos pernešant vaistus in vivo, privalo išlikti stabilios ilgesnį laikotarpį tam, kad pasiektų specifinius taikinius. Norint išvengti greito liposomų pašalinimo iš kraujotakos dėl RES

poveikio, prie liposomų paviršiaus prijungiamos polietileno glikolio (PEG) molekulės (2 pav.). PEG – tai hidrofilinis polimeras, turintis skirtingą molekulinę masę, priklausomai nuo monomerų pasikartojimo skaičiaus. Polimeras sudaro erdvinį barjerą, kuris apsaugo nuo sąveikos su fagocitinėmis ląstelėmis ir liposomų cirkuliacijos sisteminėje kraujotakoje laikas pailgėja. Šio tipo liposomos, dar vadinamos stealth liposomomis, taikomos gydyme, kuriame nebuvo galima panaudoti įprastinių liposomų [13]. Pagrindinis ilgo veikimo liposomų bruožas yra tai, kad jos nesiakumuliuoja RES ir gali pasiskirstyti po tas organizmo vietas, kur kraujagyslių sienelės pralaidumas yra didesnis [12]. Šiomis savybėmis pasižymi organizmo vietos, kuriose yra patologinių pakitimų (navikai, infekcijos, uždegimai). Taip apsaugomas organizmas nuo nepageidaujamų reakcijų į vaistą. Būtent dėl šios savybės liposomos pradėtos plačiai naudoti vėžio gydyme. Chemoterapijos efektyvumas yra labai ribotas dėl toksinio vaistų poveikio. Įterpus vaistinę medžiagą į liposomas, pasikeičia vaisto pasiskirstymas, sumažinamas nepageidaujamas toksinis poveikis ir padidinamas gydymo veiksmingumas. JAV maisto ir vaistų administracija patvirtino du liposominius preaparatus, kurie pradėti vartoti vėžio gydyme JAV, ES ir Japonijoje. DaunoXome® pagamintas iš mažų liposomų, kuriose įterptas daunorubicinas. Šis preaparatas yra rinkoje nuo 1990 m. Kitas preparatas – Doxil®, pagamintas iš erdviškai stabilizuotų liposomų su įterptu doksorubicinu. Su Doxil® atlikti tyrimai parodė, kad šis vaistas turi 4,5 karto mažesnį kardiotoksinį poveikį nei įprasta vaisto forma vartojamas doksorubicinas [4].

2 pav. Liposoma su prijungtu PEG [11]

Liposomos gali būti naudojamos norint apsaugoti veikliąją medžiagą nuo fermentų suskaidymo. Tokioms liposomoms ruošti naudojami lipidai yra atsparūs fermentų poveikiui, o veiklioji medžiaga, esanti liposomų viduje, apsaugoma, kol dalelės cirkuliuoja ekstraląsteliniame skystyje. Pavyzdžiui,

β-laktamazei jautrūs antibiotikai (penicilinai, cefalosporinai) yra įterpiami į liposomas ir taip apsaugomi nuo nepageidaujamo β-laktamazės poveikio [10].

Norint pagerinti amfotericino B, kuris yra pirmo pasirinkimo vaistas gydant sistemines grybelines infekcijas, tirpumą, atlikta daug tyrimų su liposomomis. Dėl blogo tirpumo vandenyje amfotericinas B dažnai vartojamas įterptas į miceles. Tačiau micelės nėra stabilios vartojant sistemiškai, o dozė privalo būti maža dėl vaisto neurotoksiškumo ir nefrotoksiškumo. Tuo tarpu liposomos yra stabilesnės koloidinės dalelės, todėl amfotericinas B efektyviau nugabenamas į makrofagus ir ženkliai sumažinamas nepageidaujamas poveikis. Tokio tipo amfotericinas prieinamas JAV ir Europoje (AmBisome®) [14].

Katijoninės liposomos kuriamos siekiant pagerinti genetinių medžiagų pernešimą į organizmą. Lipidų katijoninės dalys sąveikauja su neigiamą krūvį turinčiomis DNR ir sukondensuoja molekules į stabilesnę struktūrą. Gaunami lipidų-DNR kompleksai inkorporuojami į liposomas, tai suteikia jiems apsaugą bei skatina patekimą į ląsteles ir raišką.

1.1.1. Liposomų panaudojimas lokaliam gydymui

Liposominių preparatų naudojimas per odą pagrįstas tuo, kad lipidų vezikulių dvisluoksnio ir natūralių ląstelių membranos struktūra labai panaši. Tai suteikia liposomoms savybę keisti membranos praeinamumą ir jungtis prie jos. Dermatologijoje liposomos vartojamos dėl drėkinamojo ir atstatančio odą poveikio. Liposomos taip pat gali būti vartojamos skatinant odos regeneraciją. Lipidai yra pakankamai hidratuoti, todėl net ir neturėdami aktyvių medžiagų, drėkiną odą. Dažniausiai to pakanka pagerinti odos elastingumą ir apsauginę funkciją, kurias dažnai sutrikdo įprastas odos senėjimas [15].

Plačiai tyrinėjama liposomų savybė pernešti skirtingas medžiagas į epidermį ar dar gilesnius odos sluoksnius. Tai leidžia pradėti naudoti liposomas įvairiems odos susirgimams gydyti. Įprastos vaistų formos, tokios kaip tirpalai, kremai, tepalai, perneša vaistines medžiagas per stratum corneum, priklausomai nuo koncentracijos. Tačiau daugiasluoksnės liposomos gali pernešti vaistus į stratum

corneum, epidermį ir tikrąją odą per 30 minučių didesnėmis kocentracijomis nei kitos ant odos

vartojamos vaistų formos [4].

Į liposomas galima įterpti įvairias vaistines medžiagas, labiausiai paplitusios yra trys vaistų grupės: kortikoidai, retinoidai ir vietiniai anestetikai [16,17]. Lasch (1989) tyrinėjo liposominio preparato su hidrokortizoliu poveikį žmogaus odai [17]. Jis nustatė, kad toks preparatas perneša didesnį kortizolio kiekį, o tai labai svarbu, nes kortizolis vartojant ilgalaikiam odos gydymui nepasižymi pašaliniu poveikiu, bet dažnai nepasiekiama pakankama jo koncentracija ūmioms dermatozėms gydyti. Dėl šios priežasties didesnė hidrokortizolio kocentracija turės geresnį terapinį

efektą. Dvigubai aklame, atsitiktiniame, lyginamajame tyrime betametazono dipropionatas, įterptas į liposomas, buvo lygintas su įprastu betametazono dipropionato preparatu [16]. Pastebėta, kad pacientams, sergantiems atopine egzema ir vartojantiems liposominį betametazono dipropionatą, net ir mažesnėmis koncentracijomis, uždegimo požymiai sumažėjo labiau nei vartojant tradicinį preparatą. Kita svarbi vaistų grupė – retinoidai. Šios vaistinės medžiagos vartojamos vietiškai, sergant nesudėtinga acne vulgaris forma [18]. Tretinoino gelio vartojimas sukelia vietinį perštėjimą ir gydymo pradžioje gali sukelti ligos paūmėjimą. Šių nepageidaujamų reakcijų galima išvengti vartojant liposominį tretinoiną. Schafer-Korting (1994) atliktame dvigubai aklame tyrime buvo bandoma nustatyti liposominio tretinoino efektyvumą ir toleravimą pacientams, sergantiems nekomplikuota

acne vulgaris [19]. Rezultatai parodė, kad mažiau koncentruota liposominė tretinoino vaisto forma

turėjo vienodą efektyvumą ligos gydyme ir pasižymėjo mažesniu odos dirginimu. Šiuos privalumus lėmė didesnis liposominio tretinoino praeinamumas ir lėtesnis vaisto atpalaidavimas.

Norint sukelti ilgalaikę vietinę anesteziją reikalinga didelė anestetiko koncentracija. Gesztes ir kt. (1988) atlikti tyrimai nustatė, kad tetrakainas, įterptas į liposomas, pasižymėjo geresne anestezija (mažesnė vaisto koncentracija, ilgesnis anestezijos laikas) lyginant su įprastiniais nejautrą sukeliančiais kremais [20]. Panašūs rezultatai gauti naudojant kitą vietinį anestetiką lidokainą, kuris yra prekyboje JAV nuo 1998 m. (ELA-Max®).

1.1.2. Liposomų klasifikacija ir jų pašalinimas iš organizmo

Liposomos skirstomos pagal dydį ir fosfolipidų dvisluoksnių skaičių į 3 pagrindines grupes:

1. Daugialameliarinės (DL) – tai liposominės dalelės, turinčios daugiau nei vieną fosfolipidų dvisluoksnį. Šių pūslelių dydis nuo 100 nm iki keleto mikrometrų, priklausomai nuo jų paruošimo būdo. Dėl didelio fosfolipidų dvisluoksnių skaičiaus jos taikomos pernešant lipofilinius vaistus.

2. Mažos monolameliarinės (MML) – tai liposominės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų dvisluoksnį. Dalelių dydis nuo 20 iki 100 nm. Jos tinkamesnės parenteraliniam vartojimui lyginant su DL, nes yra homogeniškos dydžiu. Tačiau dėl mažo dydžio jos pasižymi prastesne inkorporavimo geba.

3. Didelės monolameliarinės (DML) – tai liposominės dalelės, turinčios vieną fosfolipidų dvisluoksnį. Dalelių dydis nuo 100 nm iki keleto mikrometrų. Labiausiai tinkamos inkorporuoti vandenyje tirpias medžiagas, nes turi didesnę hidrofilinę ertmę lyginant su MML [21].

Pašalinimas iš organizmo. Liposomų opsonizaciją ir pašalinimą iš organizmo atlieka

retikuloentonelinė sistema (RES). Greitis, per kurį iš sisteminės kraujatokos bus pašalintos liposomos, priklauso nuo liposomų sudėties ir dalelių dydžio. RES – tai dalis žmogaus imuninės sistemos, kurios pagrindinis tikslas pašalinti svetimkūnius iš organizmo. RES susideda iš makrofagų, kurių daugiausiai yra kepenų Kupferio ląstelėse, plaučiuose ir blužnyje. Po injekcijos liposomos padengiamos serumo baltymais – opsoninais. Po to jos fagocituojamos RES ląstelių ir didžioji dalis liposomų patenka į kepenis ir blužnį.

Didelės liposomos (>200 nm) yra greitai opsonizuojamos ir RES pagalba pašalinamos iš sisteminės kraujotakos, po to akumuliuojasi blužnyje. Opsonizacijos greitis lėtėja mažinant liposomų dydį. Mažos liposomos turi sąlyginai didesnį paviršiaus plotą, todėl prie jų membranos prisijungia mažiau opsoninų ir makrofagai lėčiau jas pašalina. Liposomos, kurių dalelių dydis nuo 70 nm iki 200 nm ilgiau išlieka sisteminėje kraujotakoje ir turi didesnę tikimybę pasiekti taikinį.

Lipidų išsidėstymas liposomų membranose turi didelę įtaką fizikinėms membranos savybėms: pralaidumui, elastiškumui ir paviršiaus krūviui. Ši savybė, kaip ir prieš tai minėtas dalelių dydis, svarbi liposomų pašalinimui iš organizmo. Neutralaus krūvio liposomos, dėl tankiai membranoje išsidėsčiusių fosfolipidų, ilgiau išlieka sisteminėje kraujotakoje ir lėčiau atpalaiduojama veiklioji medžiaga, lyginant su krūvį turinčiomis liposomomis. Baltymų opsonizacija prie liposomų paviršiaus sumažėja dėl tankaus lipidų išsidėstymo membranose. Cholesterolis, naudojamas liposomų gamyboje, stabilizuoja membraną ir padeda išvengti vaistinės medžiagos netekimo, be to jis sumažina opsoninų prisijungimą ir prailginą liposomų buvimą in vivo. Tam tikri plazmos baltymai turi afinitetą liposomoms, kuris stiprėja, jei liposomos turi krūvį. Katijoninės dalelės greičiau pašalinamos iš sisteminės kraujotakos, todėl jų gyvavimo pusperiodis in vivo trumpesnis. Anijoninės liposomos, turinčios fosfatidilserino, fosfatidilglicerolio, greitai aptinkamos makrofagų ir pašalinamos iš kraujotakos [12,22].

1.2. Liposomų gamyboje naudojamos medžiagos

1.2.1. Fosfolipidai

Liposomų gamyboje naudojami įvairūs fosfolipidai ir jų mišiniai. Fosfolipidai yra sudėtiniai lipidai sudaryti iš glicerolio, fosfato ir riebalų rūgščių. Fosfolipidų molekulės pasižymi amfipatinėmis savybėmis – į hidrofilinę dalį (galvutę) įeina 2-etilamonio fosfato fragmentas, o į hidrofobinę dalį (uodegėlę) – ilgos angliavandenilių grandinės, priklausančios riebalų rūgščių esteriams. Angliavandenilių grandinės gali turėti nuo 14 iki 24 anglies atomų. Kiekviena jų turi bent vieną

dvigubąjį (nesotųjį) ryšį. Šis ryšys suteikia molekulei galimybę deformuotis ir mažina standumą. Skirtingi uodegėlių ilgiai ir dvigubųjų ryšių skaičius lemia fosfolipidų dvisluoksnio takumą [23].

Fosfolipidams, kaip ir visoms kitoms amfipatinėms medžiagoms, būdinga tai, kad patekusios į vandenį jos savaime sudaro tam tikras struktūras. Jos būna dviejų tipų: sferinės (viduje paslėptos uodegėlės, o paviršius padengtas polinėmis galvutėmis) arba plokščios (hidrofobinės uodegėlės išsidėsto tarp dviejų hidrofilinių galvučių sluoksnių – dvisluoksnio). Tokį fosfolipidų išsidėstymą vandeniniame tirpale nulemia hidrofobinės reakcijos tarp nepolinių grandinių. Taigi jiems būdingas savaiminis užsidarymas, suformuojant uždaras erdves [23].

3 pav. Fosfolipidų cheminė sudėtis [24]

Fosfatidiletanolaminai yra etanolamino ir fosfatido rūgšties esteriai. Jie išskiriami iš galvos smegenų audinių. Fosfatidilserinai išskiriami iš širdies raumenų, smegenų ir kepenų. Juose yra amino rūgšties serino. Fosfatidilcholinai yra esteriai sudaryti iš aminoalkoholio cholino ir fosfatido rūgšties. Jie randami žmogaus nervų sistemoje. Fosfatidilcholinas dar žinomas kaip lecitinas, gaunamas natūraliu ir sintetiniu būdu. Jis lengvai išskiriamas iš kiaušinio trynio ir sojos pupelių. Galima išskirti ir iš galvijų stuburo smegenų ir širdies, bet šis procesas sunkesnis lyginant su prieš tai paminėtu. Lecitinai, gaunami iš natūralių šaltinių, būna mišiniuose su įvairiais fosfatidilcholinais, kurie turi skirtingo ilgio angliavandenilių grandines. Lecitinas, išskiriamas iš augalinių žaliavų, turi daugiau neprisotintų grandinių, o lecitinai, gaunami iš žinduolių, turi daugiau prisotingų grandinių. Fosfatidilcholinai – pagrindiniai fosfolipidai, naudojami gaminant liposomas, dėl santykinai mažos gamybos kainos, lyginant su kitais fosfolipidais, neutralaus krūvio ir cheminio inertiškumo [23].

1.2.2. Cholesterolis

Cholesterolis (chol) – tai viena iš dažniausiai naudojamų papildomų medžiagų gaminant liposomas. Jis įterpiamas į fosfolipidų dvisluoksnį ir turi įtakos liposomų savybėms. Chol stabilizuoja ir sutvirtina liposomų membraną. Chol molekulė (4 pav.) turi 4 angliavandenilių žiedus, kurie nulemia

stiprias hidrofobines savybes. Hidroksilinė OH grupė, prijungta prie cholesterolio molekulės galo, suteikia silpnas hidrofilines savybes. Chol gali būti įterptas į liposomų membranos dvisluoksnį ne didesniu nei 1:1 santykiu. Tačiau jis gali būti naudojamas tik kaip papildoma medžiaga, gerinanti liposomų savybes [25].

4 pav. Cholesterolio molekulė [24]

1.3. Liposomų charakterizavimas in vitro

Lipidinių nanonešiklių kokybė nustatoma stebint keletą parametrų. Dažniausiai charakterizuojamos lipidinių nanonešiklių savybės yra vidutinis dalelių dydis (VDD), polidispersijos indeksas (PDI), zeta potencialas (ZP), inkorporavimo efektyvumas (IE), fosfolipidų dvisluoksnio sudėtis ir dalelių sluoksniuotumas.

1.3.1. Liposomų lamelių skaičiaus nustatymas

Lipidinių nanonešiklių lamelių skaičių lemia gamyboje naudojami fosfolipidai ir paruošimo metodas. Inkorporavimo efektyvumui ir vaisto atpalaidavimo iš nešiklio greičiui didelę reikšmę turi lipidų dvisluoksnių skaičius, esantis lipidiniame nanonešiklyje. Lamelių skaičius taip pat turi įtakos in

vivo vaisto pasiskirstymui ir poveikiui. Dėl šių priežasčių svarbu nustatyti lipidinių nanonešiklių

sluoksniuotumą.

Lipidinių nanonešiklių lamelių skaičius nustatomas pagal P31 branduolių magnetinį rezonansą (BMR). Pridėjus Mn2+ jonų pasikeičia fosfolipidų, kurie sudaro pūslelių išorinį sluoksnį, P31 BMR signalas. Mn2+ reaguoja su neigiamo krūvio fosfolipidų fosfatų grupėmis, taip pakeičia gaunamą signalą. Lipidinių nanonešiklių lamelių skaičius nustatomas lyginant gautus signalus prieš pridedant Mn2+ jonus prie suspensijos su dalelėmis ir po pridėjimo [26].

1.3.2. Liposomų dalelių dydžio analizė

Vidutinis lipidinių nanonešiklių dalelių dydis ir pasiskirstymas pagal jį – vieni svarbiausių parametrų, ypač jei nešikliai vartojami inhaliuojant ar parenteraliai. Nanodalelių dydžio nustatymas vykdomas keletu metodų. Dalelių dydžio nustatymui naudojant elektroninį mikroskopą, galima tiksliai apžiūrėti individualias liposomas. Vienas iš metodo trūkumų – tiksliam tokio tyrimo atlikimui reikalingi įgūdžiai. Norint įvertini visą mėginį, reikia išmatuoti ne mažiau nei 400 dalelių, todėl reikia daug papildomo laiko [4].

Kitas lipidinių nanonešiklių dalelių dydžiui nustatyti naudojamas metodas – dinaminės šviesos sklaidos (angl. dynamic light scattering – DLS) metodas. Jis paprastesnis ir greičiau atliekamas lyginant su elektroniniu mikroskopavimu. DLS metodas remiasi Brauno dalelių judėjimu. Atliekant DLS matavimus, nustatomas pro mėginį praėjusios išskaidytos šviesios intensyvumas. Gauti signalai apdorojami ir gaunami intensyvumo funkciniai grafikai ir nustatomas vidutinis dalelių dydis mėginyje [27].

5 pav. Dinaminės sklaidos metodo schema (1 – lazeris, 2 – lęšiai, 3 – kiuvetė su mėginiu, 4 – apertūra, 5 – jutiklis, 6 – kompiuteris) [28]

1.3.3. Liposomų išvaizda ir drumstumas

Liposomų suspensijos išvaizda gali kisti nuo permatomos iki drumstos, priklausomai nuo sudėties ir dalelių dydžio. Jei drumstumas turi melsvą atspalvį, tai reiškia, kad mėginyje dalelės yra homogeniškos. Pilkšva ar pilka spalva gali reikšti neliposominę dispersiją ar mikrokristalus. Optinis mikroskopas gali aptikti liposomas ar kitas nereikalingas daleles, jei jų dydis > 0,3 um. Liposomų tirpalams būdingos savybės: panaši į vandens tirpalo paviršiaus įtemptis, putojimas ir greitai kylantys

burbulai. Dėl per didelio paviršiaus hidrofobiškumo lėtai kylantys burbulai gali būti kaip indikatorius, kad tirpale yra neliposominių lipidų [4].

1.3.4. Liposomų zeta potencialas

Didžioji dalis koloidinių dispersijų vandeninėje terpėje turi elektrinį krūvį. Tam įtaką daro paviršiaus grupių jonizacija (disocijuodamos rūgštinės grupės suteikia neigiamą paviršiaus krūvį, o bazinės – teigiamą) ir krūvį turinčių medžiagų adsorbcija (katijoniniai surfaktantai gali būti adsorbuoti dalelių ir suteikti joms teigiamą krūvį, o anijoniniai – neigiamą paviršiaus krūvį). Zeta potencialas yra bendras dalelės krūvis, kurį ji įgauna tam tikroje terpėje [29]. Tai fizikinė savybė, kuri būdinga visoms dalelėms suspensijoje. Zeta potencialo matavimas skirtas nustatyti koloidinės sistemos stabilumui. Jei suspensijoje visos dalelės turi didelį teigiamą ar neigiamą krūvį, jos bus linkusios stumti viena kitą, neformuojant agregatų. Zeta potencialas nustatomas elektroforezės šviesos sklaidos metodu. Matuojant zetą potencialą naudojamas specialus lazeris, kuris sukuria šviesos srautą, einantį per mėginio centrą. Sukuriamas elektrinis laukas, kuris visoms dalelėms, einančioms pro matavimo talpą, suteikia šviesos srauto kitimus, pamatuojamas dalelių judėjimas. Pagal judėjimo kryptį nustatomas potencialas, o pagal judėjimo greitį – potencialo dydis (zeta potencialas). Zeta potencialo matavimo rezultatai gali būti vienas iš parametrų, rodančių sistemos stabilumą [29,30].

1.3.5. Liposomų inkorporavimo efektyvumas

Liposomų preparatai sudaryti iš inkorporuotų ir neinkorporuotų vaistinės medžiagos frakcijų. Nustatant inkorporavimo efektyvumą pirmiausiai atskiriamos prieš tai minėtos frakcijos. Frakcijų atskyrimui taikomi keli skirtingi metodai. Vienas iš jų yra centrifugavimas naudojant mikrokolonėlę. Metodas pagrįstas skirtingų dalelių dydžiu tarp laisvo ir inkorporuoto vaisto. Atliekant tyrimą neskiesta liposomų suspensija lašinama į ,,Sephadex” gelinę kolonėlę, ji sukama 2000 rpm greičiu 3 minutes siekiant išstumti liposomas į centrifugavimo kamerą. Po to pridedama 250 µl vandens ir centrifugavimas kartojamas. Neinkorporuotas vaistas lieka prisijungęs prie gelio, o liposominės pūslelės atsiskiria nuo gelio ir surenkamos po centrifugavimo [4].

Kitas liposomų atskyrimo nuo laisvos vaistinės medžiagos metodas – dializė. Naudojamos tam tikro angų diametro dydžio dializės membranos. Liposomų mėginiai nepertraukiamai dializuojami buferiniame tirpale. Laisva vaistinė medžiaga difunduoja į akceptorinę terpę, o liposomos su įterptu vaistu lieka dializinėje membranoje.

Ultracentrifugavimas – vienas iš paprasčiausių ir greičiausių metodų, naudojamų norint atskirti liposomas, kuriose yra įterptas vaistas, nuo aplinkos. Paimta analitė centrifuguojama 5000 rpm greičiu 50 min, esant +4 oC temperatūrai. Taip pat galima centrifuguoti esant 3000 rpm greičiui 30 min, bet prieš centrifugavimą, į mėginį reikia įdėti atitinkamą kiekį protamino tirpalo (10 mg/ml) tam, kad susidarytų agregatai ir įvyktų sedimentacija [4].

Atskyrus liposomas, su inkorporuota medžiaga, nuo aplinkos, lipidų dvisluoksnis yra suardomas ir nustatomas išsiskyrusios medžiagos kiekis. Kiekybinės analizės metodas parenkamas pagal medžiagos savybes. Pagrindiniai analizės būdai – spektrofotometrija, fluorescencinė spektroskopija ir kiti fizikocheminiai metodai [4,26]. Dažniausiai inkoporavimo efektyvumas apskaičiuojamas procentais, lyginant medžiagos kiekį, esantį liposomose, su kiekiu, kuris naudotas gamyboje.

1.3.6. Vaistinės medžiagos atpalaidavimas iš liposomų

Lipidinių nanonešiklių vaistinės medžiagos atpalaidavimo tyrimas atliekamas naudojant dializės kameras. Liposomos patalpinamos į dializės apvalkalą, kurio membrana neadsorbuoja vaistinės medžiagos ir ji gali laisvai pereiti remiantis difuzijos principu. Keli mililitrai liposomų suspensijos įlašinami į dializės apvalkalą, kuris hermetiškai uždaromas ir patalpinamas į uždarą kamerą su tirpikliu. Viso bandymo metu sistemoje palaikoma 37 o_{C temperatūra. Atpalaiduota} vaistinės medžiagos dalis nustatoma efektyviosios skysčių chromatografijos, spektrofotometrijos ar kitu patvirtintu metodu. Paėmus mėginį iš kameros, atgal įpilamas toks pats tirpiklio kiekis. Bandymas kartojamas 3 kartus, išvedami rezultatų vidurkiai, nustatoma atpalaiduotos vaistinės medžiagos dalis atitinkamais laiko intervalais.

1.4. Naujo tipo lipidiniai nanonešikliai

1.4.1. Transferosomų apžvalga

Įprastos ant odos vartojamos liposomos nėra efektyvios pernešant vaistines medžiagas, todėl per pastaruosius du dešimtmečius skirta daug dėmesio ieškant naujų lipidinių nanonešiklių, kurie būtų tinkamesni vietiniam gydymui. Siekiant pagerinti ant odos vartojamų vaistinių medžiagų pernešimą, XX dešimtmečio pradžioje, sumodeliuotos deformuojamos liposomos – transferosomos [7]. Lyginant su įprastinėmis liposomomis, kurias gaminant naudojami fosfolipidai, trasnferosomoms papildomai naudojami surfaktantai (natrio cholatas, natrio deoksicholatas ir įvairūs polisorbatai) [7]. Surfaktantai

sumažina lipidų dvisluoksnio stabilumą ir suteikia transferosomomų nanodalelėms lankstumo [7]. Transferosominių nanonešiklių atsiradimas svarbus faktorius siekiant pagerinti lokaliai vartojamų vaistų efektyvumą. Lyginant su kitomis ant odos vartojamomis vaistų formomis, transferosomos turi šiuos privalumus: jos pagerina vaistų prasiskverbimą pro pirminius odos sluoksnius, transferosomų gamyboje naudojamos medžiagos yra visiškai saugios, todėl tinkamos farmaciniams ir kosmetiniams preparatams kurti [7,31,32].

6 pav. Transferosomos schema [32]

Transferosomų veikimo principas nėra tiksliai žinomas. Transferosomų savybė prasiskverbti per odą pernešant vaistines medžiagas aiškinama keliomis teorijomis. Vienoje iš jų teigiama, kad transferosomos pasižymi skvarbumu dėl savybės leidžiančios joms keisti dydį ir taip pereiti pro mažas poras [33]. Kiti šaltiniai teigia, kad transferosomos dehidratuoja odos paviršių, taip susidaro osmosinio slėgio skirtumas tarp vidinio ir išorinio odos paviršiaus, o tai leidžia transferosomoms pereiti į stratum

corneum ir gilesnius odos sluoksnius [34]. Transferosomos, kaip ir liposomos, pasižymi hidrofilinėmis

ir hidrofobinėmis savybėmis, todėl į jų vidų taip pat gali būti inkorporuotos įvairios medžiagos. Pagrindinis transferosomų skirtumas lyginant su liposomomis yra tai, kad transferosomos gali deformuotis ir pereiti per mažas poras (nuo 5 iki 10 kartų mažesnes, lyginant su transferosomų skersmeniu) neprarandant inkorportuotos medžiagos [35]. Ši savybė leidžia transferosomoms geriau prasiskverbti pro stratum corneum. Todėl didelės molekulinės masės medžiagos (pvz. insulinas) gali būti naudojamas vietiškai, taip išvengiant invazinių vaisto vartojimo būdų [1]. 2001 m. atliktame tyrime palygintos transferosomų ir liposomų savybės pernešant 5-floruracilą (5-FU) pro odą [36]. In

5-FU. Taip pat pastebėta, kad procentinė 5-FU dalis patekusi į odą buvo didesnė lyginant su inkorporuota į transferosomas vaisto dalimi. Autoriai teigia, kad nanonešiklių sudėtis turėjo įtakos odos savybėms ir taip pagerino 5-FU difuziją į epidermį [36].

Transferosomų efektyvumas ir indiferentiškumas kitų vaistinių medžiagų atžvilgiu leidžia jas pritaikyti įvairiems terapiniams poreikiams. Šveicarų reguliavimo tarnyba (SwissMedic) įregistravo transferosominį NVNU ketoprofeną, kuris jau prieinamas rinkoje pavadinimu Diractin. Kiti vaistai pagaminti transferosomų pagrindu, remiantis vokiečių kompanija IDEA AG, yra klinikinių tyrimų stadijoje [31].

1.4.2. Etosomų apžvalga

1997 metais Touitou pristatė naujo tipo lipidinius nanonešiklius – etosomas. Šios pūslelės skiriasi nuo kitų lipidinių nanonešiklių savo sudėtimi, struktūra ir veikimo mechanizmu. Etosomos – tai minkštos lipidinės pūslelės, susidedančios iš fosfolipidų, etanolio ir vandens. Jų pavadinimas pasirinktas dėl santykinai didelės etanolio koncentracijos (20 – 45 proc.) jų viduje. Pūslelių dydis gali kisti nuo 10 nanometrų iki kelių mikrometrų. Etosomos skirtos vartoti ant odos, nes gali pasiekti giliausios odos sluoksnius ir sisteminę kraujotaką. Etosomos naudojamos pernešant vaistines medžiagas neinvaziniais metodais. [37–41].

6 pav. Etosomos schema [41]

Geresnė etosomų skvarba pro odą lyginant su liposomomis yra pagrindinis jų privalumas. Etosomų nanodalelės turi transferosomoms būdingą savybę – deformabilumą. Lyginant su liposomomis, kurios yra standžios, etosomos gali keisti savo formą ir praeiti pro mažas odoje esančias

Fosfolipidų dvisluoksnis Etanolinis (20-45%)

poras. Etosomų veikimo mechanizmui įtakos turi gamyboje naudojamas etanolis. Vartojant etosomas ant odos, etanolis pirmiausia sąveikauja su intraląstelinių lipidų polinėmis galvutėmis, sumažindamas

stratum corneum esančių lipidų takumą. Dėl šio poveikio pasikeičia lipidų daugiasluoksnio tankis

odoje, padidėja praeinamumas pro jį, o tai leidžia joms pernešti didesnius vaisto kiekius į gilesnius odos sluoksnius [39].

2010 m. S. D. Maurya ir kt. atliktame tyrime į etosomas inkorporuotas vaistas nuo ŽIV indinaviras. Tyrime stebėtas vaistinės medžiagos pernešimo efektyvumas vartojant ant odos. Indinaviro absorbcija vartojant per os priklauso nuo pH reikšmės, o didelė dalis vaisto pašalinama pirminio metabolizmo metu. Vaisto vartojimas vietiškai – tinkama alternatyva prailginant vaisto gyvavimo pusperiodį. Tyrimo rezultatai parodė, kad vartojant preparatą su etosomomis, jo prasiskverbimas atitinkamai 2,06, 4,32 ir 8,5 karto geresnis lyginant su etanoliniu vaisto tirpalu, liposomomis ir vandenyje ištirpinto vaisto tirpalu [42].

Dvigubai aklas, dvigubai užkoduotas, randomizuotas, palyginamasis tyrimas atliktas su antivirusiniu vaistu acikloviru. 5 proc. etosominis acikloviras palygintas su 5 proc. acikloviro kremu (Zovirax) odos herpes infekcijai gydyti. Tyrimo autoriai remdamiesi gautais rezultatais teigia, kad etosominis acikloviras buvo efektyvesnis lyginant su acikloviro kremu [43].

Mokslinių tyrimų duomenys patvirtina etosomų ir transferosomų aktualumą ir svarbą lokaliam vartojimui. Tiriamajame darbe atliktas šių dalelių stebėjimas ir palyginimas su liposomomis.

2. TYRIMO METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – lipidiniai nanonešikliai su diklofenako natrio druska: • Liposomos

• Transferosomos • Etosomos

2.2. Tyrimo medžiagos

2.2.1. Reagentai:

Etanolis 96,6 proc. (v/v), Sigma Aldrich®, Milanas, Italija Diklofenako natrio druska, Galeno®, Potenca, Italija Cholesterolis, Sigma Aldrich®, Milanas, Italija Metanolis, Sigma Aldrich®, Milanas, Italija Polisorbatas 80, Galeno®, Potenca, Italija Chloroformas, Sigma Aldrich®, Milanas, Italija

Puslaidė membrana SpectraPor, 12-14 kDa pore size, Spectrum Laboratories®, JAV P90G, Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Vokietija

2.2.2. Įranga:

Spektrofotometras: Lambda 25, Perkin Elmer, JAV Svarstyklės: KERN Balingen, Vokietija

Rotacinis garintuvas: Buchi, Vokietija

Magnetinė maišyklė: IKA® C – MAG H57, IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija Ultragarsinis homogenizatorius su įleidžiamu zondu: Soniprep 150, MSE Crowley, JK Dydžio ir zeta potencialo analizatorius: Zetasizer nano, Malvern Instruments, JK Vakuuminė pompa: Edwards® 2 Two-Stage High Vacuum Pump E2M2, JK Ultragarsinė vonelė: Bransonic®, Danbury, JAV

Ekstruderis: LiposoFast, Avestin®, Vokietija Sūkurinė maišyklė: Velp Scientifica®, Italija

2.3. Lipidinių nanonešiklių gamyba

Liposomas, transferosomas ir etosomas galima paruošti naudojant keletą skirtingų metodų [3,4,7,37]. Šiame tyrime nanonešiklių paruošimui naudotas plono lipidų sluoksnio hidracijos metodas. Šis metodas dažnai naudojamas ir lengvai taikomas laboratorinėmis sąlygomis, tačiau suformuotos dalelės būna daugiasluoksnės (MLV), skirtingo dydžio ir formos [4].

7 pav. Lipidinių nanonešiklių paruošimo schema: 1,2 – lipidų sluoksnio paruošimas; 3 – lipidų sluoksnio hidracija; 4 – nanonešiklių dalelių dydžio sumažinimas; [44]

Lipidinių nanonešiklių gamybos schema pateikta 7 paveiksle.

Lipidų sluoksnio paruošimas (1 stadija, 7 pav.). Lipidų sluoksnis ruošiamas apvaliadugnėje

25 ml talpos kolboje. Fosfolipidų dvisluoksniui sudaryti naudojamas fosfatidilcholinas (P90G). Kiti gamyboje naudoti reagentai pateikti 1 lentelėje. Gaminant liposomas ir transferosomas P90G tirpintas etanolyje, o ruošiant etosomos P90G tirpinimui naudotas chloroformas, nes cholesterolis netirpus etanolyje. Naudojant automatines pipetes į apvaliadugnę kolbą dozuojamos reikiamos medžiagos (1 lentelė), po to tiksliai atsveriama, suberiama ir ištirpinama diklofenako natrio druska (DND).

Tirpiklio pašalinimas ir sluoksnio sudarymas (2 stadija, 7 pav.). Po lipidų sluoksnio paruošimo

kolba prijungiama prie rotacinio garintuvo (BUCHI, Switzerland) ir įmerkiama į vandens vonią (50°C temperatūra). Mažinant slėgį garinamas tirpiklis iki lipidų sluoksnio susiformavimo indo apačioje.

1

4

3 2

Tuomet kolba atjungiama nuo rotacinio garintuvo. Siekiant pašalinti visus tirpiklio pėdsakus, kolba prijungiama prie vakuuminės pompos ir paliekama 5 valandoms.

1 lentelė. Lipidinių nanonešiklių komponentų kiekiai pagal nanonešiklio tipą

Nanonešiklio

tipas Kodas

Medžiagos

P90G Diklofenakas Tween 80 Cholesterolis

Liposomos L1 425 mg 100 mg - - L2 50 mg - - Transferosomos T1 100 mg 78 mg - T2 50 mg 78 mg - Etosomos E1 100 mg - 30mg E2 50 mg - 30 mg

Lipidų sluoksnio hidracija (3 stadija 7 pav.). Lipidų sluoksniui hidratuoti naudoti tirpalai

priklausomai nuo nanonešiklio tipo (2 lentelė). Supylus atitinkamus tirpalus hidracijai, kolba įstatoma į rotacinį garintuvą ir įmerkiama į 50 °C temperatūros vandens vonią 30 min. Gauta suspensija paliekama 1 valandai stabilizuotis.

2 lentelė. Lipidinių nanonešiklių lipidų sluoksniui hidratuoti naudoti tirpalai

Nanonešiklis Medžiagos

Liposomos 10 ml H2O

Transferosomos 10 ml C2H5OH (7%) Etosomos 10 ml C2H5OH (30%)

Nanonešiklių dalelių dydžio sumažinimas (4 stadija 7 pav.). Po lipidų sluoksnio hidracijos,

pagamintos lipidinių nanonešiklių dalelės yra didelės (500nm<), heterogeniškos (PDI<400) ir daugiasluoksnės (MLV). Norint suvienodinti ir sumažinti dalelių dydį suspensijoje naudojamas vienas

iš homogenizacijos metodų. Bandymai atlikti su liposominiais nanonešikliais naudojant ultragarsinę vonelę, ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu ir ekstruderį. Pagal gautus rezultatus, tolimesnėje darbo eigoje naudotas tik tinkamiausias metodas. Po hidracijos praėjus 1 valandai, 10 ml suspensijos su nanonešikliais homogenizuota trimis skirtingais metodais. Bandymai kartoti 3 kartus, rezultatuose pateikiamas jų vidurkis.

2.3.1. Nanonešiklių homogenizavimas

a) Homogenizavimas ultragarsinėje vonelėje. Sūkurine maišykle suplaktos liposomos

supilamos į stiklinius buteliukus po 5 ml. Veikiamos ultragarsu 3 kartus po 20 min naudojant ultragarsinę vonelę (Bransonic®, JAV). Tarp intervalų veikimo ultragarsu daromos 10 minučių pertraukos.

b) Homogenizavimas ekstruderiu. Pagal įrenginio gamintojų pateiktą schemą paruošiamas

ekstruderis (LiposoFast, Avestin® - http://www.avestin.com/English/lf.html), naudojama 200 nm porų membrana. Vienas iš švirkštų pripildomas liposomų suspensija. Po to atliekama 11 paspaudimų į abi puses. Po paskutinio paspaudimo liposomų suspensija perpilama į stiklinį buteliuką.

c) Homogenizavimas ultragarsu su įleidžiamu zondu. Sūkuriniu maišytuvu suplaktos

liposominių nanonešiklių suspensijos padalinamos į dvi vienodas dalis ir supilamos į stiklinius buteliukus. Stiklinis buteliukas laikomas ledo vonelėje, į jį įleidžiamas zondas. Pirmoji dalis veikiama ultragarsu 5 ciklais 3 s įjungiant ir 2 s išjungiant. Ciklai kartojami 8 kartus, tarp intervalų 1 minutės pertrauka (ciklinis metodas). Kita suspensijos dalis paruošiama taip pat kaip ir pirmoji, tačiau homogenizuojama tik 1 kartą 20 s (neciklinis metodas). Skirtingų homogenizacijos metodų palyginimui naudoti tik necikliniu režimu gauti nanonešikliai.

2.4. Analitiniai metodai

2.4.1. Lipidinių nanonešiklių vidutinio dalelių dydžio ir PDI nustatymas

Pagamintų nanodarinių hidrodinaminis radiusas ir polidispersiškumas nustatytas dinaminės šviesos sklaidos metodu. Tyrimui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, UK) analizatorius. Praskiestų distiliuotu vandeniu lipidinių nanonešiklių suspensijų VDD ir polidispersiškumas matuojamas 173° kampu, 25 °C temperatūroje.

2.4.2. Lipidinių nanonešiklių zeta potencialo nustatymas

Lipidinių nanonešiklių zeta potencialas nustatytas lazerinės Doplerio elektroforezės metodu. Tyrimui naudotas Zetasizer nano ZS (Malvern Instruments, UK) analizatorius. Praskiestų distiliuotu vandeniu lipidinių nanonešiklių suspensijų zeta potencialas matuojamas 12° kampu, 25 °C temperatūroje. Naudojamos vienkartinės kapiliarinės kiuvetės (9 pav.).

8 pav. Kiuvetė naudojama nustatant zeta potencialą (http://departments.agri.huji.ac.il/zabam/zetasizer.html)

2.4.3. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimas

Skirtingų lipidinių nanonešiklių formuluočių stabilumas nustatytas stebint polidispersiškumo indekso (PDI) ir vidutinio dalelių dydžių pasikeitimus. Mėginiai analizuoti praėjus skirtingiems laiko intervalams nuo pagaminimo: 1 valandai, 1 dienai, 2 dienoms, 1 savaitei, 2 savaitėms ir 4 savaitėms. Viso tyrimo metu nanonešikliai laikyti uždaruose stikliniuose buteliukuose, kambario temperatūroje. PDI ir vidutinio dalelių dydžio nustatymo metodika aprašyta skirsnyje 2.3.1.

2.4.4. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo nustatymas

Lipidiniai nanonešikliai atskirti nuo laisvos diklofenako natrio druskos dializės metodu. Iš kiekvienos skirtingos suspensijos paimami 2 ml mėginio ir įterpiami į membranos vidų. Akceptorinė terpė – 1 l vandens, kuris pakeistas nuo dializės pradžios praėjus 1 valandai. Membranos su mėginiais patalpinamos vandens vonelėse ir uždedamos ant magnetinės maišyklės. Tyrimas atliekamas kambario

temperatūroje. Praėjus 2 valandoms nuo tyrimo pradžios, mėginiai iš membranų perkeliami į tuščius buteliukus su kamščiais.

Diklofenako kiekis suspensijose nustatytas prieš ir po dializės. Į kiuvetę pilama 10 µl mėginio ir 3990µl metanolio. Metanolis pasirinktas kaip tirpiklis tam, kad visas diklofenako kiekis išsiskirtų iš lipidinių nanonešiklių. Spektrofotometru matuojama absorbcija 280 nm bangos ilgyje. Lyginamasis tirpalas – metanolis. Gauti rezultatai lyginami pagal diklofenako natrio druskos kalibracinę kreivę (10 pav.). Kalibracinis diklofenako natrio druskos grafikas sudaryas iš 6 skirtingų tirpalo koncentracijų.

Gauti duomenys įvertinti pagal diklofenako natrio druskos kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y =38,911x + 0,0078; R2 = 0,99887.

9 pav. Diklofenako natrio druskos kalibracinis grafikas

Procentinis inkorporavimo efektyvumas (IE proc.) apskaičiuotas pagal lygtį:

Inkorporavimo efektyvumas = konc. A x 100 / konc. B

- 10 µl mėginio iki dializės + 3990 µl MeOH (B) - 10 µl mėginio po dializės + 3990 µl MeOH (A)

2.4.5. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) ir ,,SPPS 20.00“ (IBM, JAV) programas. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis ir santykinis standartinis nuokrypis. Duomenų statistinis patikimumas įvertintas Vilkoksono priklausomų imčių testu.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Lipidinių nanonešiklių homogenizavimo metodo parinkimo analizė

Nanodalelių homogenizacija buvo taikoma mažesnėms nei 200 nm vezikulėms gauti, kurių PDI <0,3. Atlikti 3 skirtingi homogenizacijos metodai, rezultatai pateikiami 10 pav.

10 pav. Lipidinių nanonešiklių homogenizavimo parinkimo rezultatai (VDD – vidutinis dalelių dydis, PDI – Polidispersiškumo indeksas)

Rezultatai parodė, kad ultragarsinės vonelės naudojimas nėra tinkamas homogenizavimui, nes gautų nanodalelių dydis buvo didesnis nei 200 nm. Ekstruderio metodo rezultatai atitiko keliamus reikalavimus, tačiau metodas atmestas, nes reikalauja daugiau laiko, lyginant su kitais metodais. Šis metodas nepakankamai sandarus, todėl prarandama dalis tiriamųjų nanonešiklių dispersijų. Iš 10 pav. diagramos matyti, kad naudojant ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu gaunami rezultatai atitinka keliamus tikslus, todėl likusiame tyrime taikytas tik šis metodas.

Tikslesniam homogenizacijos, naudojant ultragarsinį homogenizatorių su įleidžiamu zondu, įtakos nanonešiklių parametrams įvertinimui, metodas taikytas 2 skirtingais režimais (S1 – ciklinis režimas, S2 – neciklinis režimas). Formuluočių kodai pateikiami 3 lentelėje.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Ult. vonelė Ult. Zondas Ekstruderis

P ol id is p er si šk u mo i n d ek sas D al el ių d yd is , n m Homogenizavimo metodas VDD PDI

3 lentelė. Formuluočių kodų paaiškinimai

Nanonešiklio tipas Kodas Natrio diklofenako

druskos koncentracija Homogenizavimo režimas Liposomos L1S1 1% Neciklinis L1S2 Ciklinis L2S1 0,5% Neciklinis L2S2 Ciklinis Transferosomos T1S1 1% Neciklinis T1S2 Ciklinis T2S1 0,5% Neciklinis T2S2 Ciklinis Etosomos E1S1 1% Neciklinis E1S2 Ciklinis E2S1 0,5% Neciklinis E2S2 Ciklinis

3.2. Lipidinių nanonešiklių inkorporavimo efektyvumo tyrimo rezultatai

Atlikus spektrofotometrinę analizę, buvo nustatytas lipidiniuose nanonešikliuose inkorporuotos diklofenako natrio druskos kiekis. 11 pav. pateikiamos procentinės inkorporavimo efektyvumo (IE) reikšmės. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.

Didžiausias IE nustatytas liposomose, jų inkorporavimo geba buvo 13,1 proc. ir 33,75 proc. didesnė negu atitinkamai transferosomų ir etosomų. Palyginus skirtingų formuluočių IE, nustatyta, kad ciklais homogenizuotų dalelių inkorporavimo geba buvo didesnė nei nanodalelių, homogenizuotų necikliniu režimu, išskyrus L2S1 ir L2S2 atvejus. Vertinant transferosomų inkorporavimo rezultatus, didžiausia geba išsiskyrė T1S2 formuluotė, tarp etosominių nanonešiklių – E2S2. Gauti rezultatai parodė, kad 1 ar 0,5 proc. diklofenako natrio kiekis, inkorporuotas į nanodalelių vidų, neturėjo įtakos jų procentiniam IE.

Saeed Ghanbarzadeh ir Sanam Arami atlikti tyrimai parodė kitokius inkorporavimo rezultatus. Natrio diklofenakas buvo inkorporuotas į liposomas, transferosomas ir etosomas. Didžiausias IE nustatytas etosominiuose nanonešikliuose 51,72 proc. Tyrimo rezultatų skirtumus galėjo sąlygoti skirtinga gamybos metodika ir nanodalelių homogenizacija ekstruderiu [45].

3.3. Lipidinių nanodalelių dydžio nustatymo rezultatai

Pagaminti lipidiniai nanonešikliai buvo tiriami dinaminiu šviesos sklaidos metodu. 12 pav. ir 13 pav. pateikiami matavimų rezultatai gauti po nanonešiklių homogenizacijos praėjus 1 dienai. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.

Iš matavimo rezultatų pastebima, kad didžiausio diametro dalelės gautos liposominėse suspensijose, kurios homogenizuotos necikliniu režimu (L1S1 ir L2S1). Vertinant homogenizavimo režimo įtaką nanodalelių dydžiui, rezultatai parodė, kad cikliniu režimu paveiktos dalelės buvo mažesnės už necikliniu režimu paveiktas daleles: liposomose skirtumas buvo 38,7 proc., atitinkamai transferosomose - 40,1 proc. ir etosomose - 12,8 proc.. Mažiausi dalelių dydžiai (<50 nm) nustatyti etosominių nanonešiklių Rezultatai parodė, kad inkorporuotos diklofenako natrio druskos kiekis neturėjo įtakos dalelių dydžiui ir svarbiausias faktorius buvo homogenizavimo režimas.

Norint tiksliau įvertinti nanodalelių dydžio matavimų rezultatus, būtina atsižvelgti į jų polidispersiškumą. Polidispersiškumas – tai nevienodų matmenų dalelių buvimas sistemoje. PDI reikšmės gali būti nuo 0 iki 1. Remiantis moksline literatūra, nanodalelės, kurių PDI reikšmės yra nuo 0,1 iki 0,25, pasižymi vienodumu ir didesniu stabilumu [46]. Didesnės nei 0,25 PDI reikšmės nurodo dispersijos heterogeniškumą ir mažesnį stabilumą. 13 pav. pateikiamos PDI reikšmės, gautos atlikus matavimus dinaminės šviesos sklaidos metodu.

13 pav. Lipidinių nanonešiklų polidispersiškumo nustatymo rezultatai po homogenizavimo

13 pav. pateiktoje diagramoje matyti, kad visų lipidinių nanonešiklių formuluočių vidutinės PDI reikšmės yra iki 0,25. Tai rodo, kad gautos sistemos yra sąlyginai homogeniškos. Mažiausias polidispersiškumas nustatytas etosominiuose nešikliuose (<0,126).

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 P ol id is p er si šk u mo i n d ek sas

Skirtingos nanonešiklių formuluotės

3.4. Lipidinių nanonešiklių stabilumo, nustatant nanodalelių zeta potencialą,

tyrimo rezultatai

Praėjus 1 dienai po lipidinių nanonešiklių homogenizavimo, buvo atliktas jų zeta potencialo nustatymo tyrimas. 14 pav. pateikiami eksperimentinių lipidinių nanonešiklių zeta potencialo matavimų rezultatai. Formuluočių kodų paaiškinimai pateikiami 3 lentelėje.

Gauti rezultatai rodo, kad visų skirtingų formuluočių zeta potencialas yra mažesnis nei - 44,5 mV. Remiantis moksline literatūra, jei nanodalelių zeta potencialas yra <-30 mV arba >30mV, tokie nanonešikliai yra laikomi stabiliais [4,29,30]. Lyginant zeta potencialo matavimų rezultatus su VDD ir inkorporavimo efektyvumo rezultatais pastebėta, kad dydžiai tarpusavyje nekoreliuoja. Ultragarsinio dalelių homogenizavimo su įleidžiamu zondu režimo įtaka zeta potencialui taip pat nenustatyta.

Serbijos ir Slovėnijos mokslininkai (2013) atliko tyrimą, kuriame liposomų fosfolipidų dvisluoksniui sudaryti naudotas fosfolipidas P90G [47]. Jų gauti zeta potencialo matavimo rezultatai buvo nuo -53,1 iki -43,7 mV. Kitame tyrime, kuriame liposomų gamybai naudotas P90G, rezultatuose pateiktos zeta potencialo reikšmės buvo mažesnės nei -30 mV [48]. Šių tyrimų rezultatai patvirtina fosfolipido P90G įtaką lipidinių nanonešiklių paviršiaus krūviui ir tinkamumą, siekiant gauti stabilias nanodaleles.

3.5. Lipidinių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai

Lipidinių nanonešiklių stabilumas buvo įvertintas laiko atžvilgiu: nuo homogenizavimo iki 28 dienų laikotarpio. Stebėtas nanodalelių dydis (sudėtys pateiktos 3 lentelėje) ir polidispersiškumas. Liposomų rezultatai pateikiami 15, 16 pav., transferosomų 17,18 pav., etosomų 19,20 pav.

15 pav. Liposominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai

16 pav. Liposominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai (PDI)

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 1h 1d 2d 7d 14d 28d P ol id is p er si šk u mo i n d ek sas Laiko intervalai L1S1 L1S2 L2S1 L2S2

Liposomų dalelių dydis stabilumo tyrimo metu pasiskirstė nuo 53 iki 93 nm, PDI – 0,2-0,25 intervale. Statistinė tyrimų rezultatų analizė parodė, kad nėra statistiškai reikšmingo skirtumo (p>0,05) tarp nanonešiklių dalelių dydžio tirtame laiko intervale.

17 pav. Transferosomų stabilumo tyrimo rezultatai

18 pav. Transferosomų stabilumo tyrimo rezultatai (PDI)

Transferosomų dydis stabilumo tyrimo metu pasiskirstė nuo 43,37 iki 87,3 nm, PDI – 0,07-0,25 intervale. Statistinė tyrimų rezultatų analizė parodė, kad yra statistiškai reikšmingas skirtumas

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 1h 1d 2d 7d 14d 28d P ol id is p er si šk u mo i n d ek sas Laiko intervalai T1S1 T1S2 T2S1 T2S2

tarp nanonešiklių dalelių dydžio tirtame laiko intervale. T1S1 formuluotės dalelių dydis per 28 dienų laikotarpį padidėjo 11 proc., atitinkamai T1S2 – 45 proc., T2S1 – 10 proc. ir T2S2 – 30 proc., PDI sumažėjo T1S1 – 55 proc. , T1S2 – 59 proc., T2S1 – 9 proc., T2S2 – 3 proc. Tyrimo rezultatai rodo, kad mažiausiu stabilumu pasižymėjo T1S2 ir T2S2 formuluotės, tačiau T2S1 nanonešiklių dispersija dėl mažos PDI reikšmės tapo labiau homogeniška. Statistiškai reikšmingi nanodalelių pokyčiai, išskyrus T1S1, atsirado praėjus skirtingiems laiko intervalams: T1S1 – 14d; T1S2 – 7d.; T2S2 – 7d.

20 pav. Etosominių nanonešiklių stabilumo tyrimo rezultatai (PDI)

Etosomų dydis stabilumo tyrimo metu pasiskirstė nuo 22,58 iki 113,14 nm, PDI - 0,08 – 0,2 intervale. Statistinė tyrimo rezultatų analizė parodė, kad yra statistiškai reikšmingi skirtumai tarp nanonešiklių dalelių dydžio tirtame laiko intervale. E1S1 formuluotės dalelių dydis po 28 dienų padidėjo 71 proc., atitinkamai E1S2 – 76 proc., E2S1 – 57 proc. ir E2S2 – 75 proc., PDI sumažėjo E1S1 47 proc., E1S2 – proc., E2S1 – 42 proc., E2S2 – 44 proc. Tyrimo rezultatai rodo, kad nestabilios buvo visos etosominės formuluotės. Didžiausias etosominių nanonešiklių dalelių pokytis užfiksuotas tarp 14 ir 28 dienų intervalo. Svarbus faktas – tai, kad etosominių nanonešiklių PDI liko sąlyginai labai mažas t.y. dispersinių sistemų dalelių dydis kito panašiu greičiu.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 1h 1d 2d 7d 14d 28d P ol id is p er si šk u mo i n d ek sas Laiko intervalai

4. IŠVADOS

1. Tyrimo rezultatai patvirtina, kad pasirinktas lipidinių nanonešiklių gamybos metodas yra tinkamas liposomų, transferosomų ir etosomų gamybai su inkorporuota diklofenako natrio druska.

2. Patvirtintas ultragarso tinkamumas homogenizuoti lipidines nanodaleles. Nustatyta, kad ciklinis ultragarsinio homogenizavimo metodo režimas yra tinkamesnis, nes pagaminamos mažesnio vidutinio dydžio dalelės.

3. Pritaikyta technologija pagamintos liposomos su diklofenako natrio druska yra stabilesnės nei transferosomos ar etosomos po 1 mėn. laikymo, nes nustatyti mažiausi dalelių pokyčiai. 4. Visi suformuluoti lipidiniai nanonešikliai inkorporavo nemažiau kaip 34 proc. natrio diklofenako. Didžiausios diklofenako natrio druskos inkorporavimo efektyvumas nustatytas cikliniu režimu homogenizuotose liposomose, lyginant su transferosomomis, etosomomis.

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Rekomenduojama tęsti tyrimus su diklofenako natrio druska, atliekant vaistinės medžiagos atpalaidavimo iš nanonešiklio eksperimentus ir skvarbos pro odą tyrimus. Toliau vystant tyrimus svarbu optimizuoti transferosomų ir etosomų sudėtis, siekiant pagerinti jų inkorporavimo efektyvumą. Šiame darbe gautų transferosomų ir etosomų savybių pagerinimui, aktualu atlikti tyrimus su skirtingais gamyboje naudotų medžiagų santykiais.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Sinico C, Fadda AM. Vesicular carriers for dermal drug delivery. Expert opinion on drug delivery. 2009;6:813–25.

2. Rattanapak T, Young K, Rades T, Hook S. Comparative study of liposomes, transfersomes, ethosomes and cubosomes for transcutaneous immunisation: Characterisation and in vitro skin penetration. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2012;64:1560–9.

3. Storm G, Crommelin DJ. Liposomes: quo vadis? Pharmaceutical Science & Technology Today [Internet]. 1998;1:19–31. Available from:

http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1461534798000078

4. Laouini a., Jaafar-Maalej C, Limayem-Blouza I, Sfar S, Charcosset C, Fessi H. Preparation, Characterization and Applications of Liposomes: State of the Art. Journal of Colloid Science and Biotechnology [Internet]. 2012 [cited 2014 Apr 29];1:147–68. Available from:

http://openurl.ingenta.com/content/xref?genre=article&issn=2164-9634&volume=1&issue=2&spage=147

5. Vanniasinghe AS, Bender V, Manolios N. The potential of liposomal drug delivery for the treatment of inflammatory arthritis. Seminars in arthritis and rheumatism [Internet]. Elsevier Inc.; 2009 [cited 2014 May 4];39:182–96. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18926560

6. Attama AA, Momoh MA, Builders PF. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems  : A Revolution in Dosage Form Design and Development [Internet]. 2012 [cited 2015 Mar 12]. Available from: http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/40253.pdf

7. Benson H a E. Transfersomes for transdermal drug delivery. Expert opinion on drug delivery. 2006;3:727–37.

8. Elsayed MM a, Abdallah OY, Naggar VF, Khalafallah NM. Deformable liposomes and ethosomes as carriers for skin delivery of ketotifen. Pharmazie. 2007;62:133–7.

9. Madni A, Sarfraz M. Liposomal Drug Delivery: A Versatile Platform for Challenging Clinical Applications. Pharmacy and Pharmaceutical Sciences [Internet]. 2014 [cited 2015 Mar 12];17:401–26. Available from: http://ejournals.library.ualberta.ca/index.php/JPPS/article/view/20528

10. Dua J., Rana A., Bhandari A. Liposomes  : methods of preparation and applications. International Journal of Pharmaceutical Studies and Research. 2012;

11. Briedis V, Drakšienė G, Bernatonienė J, Savickas A, Kasparavičienė G, Klimas R. Parenteraliniai preaparatai ir jų technologija. Kaunas; 291 p.

12. Yan X, Scherphof GL, Kamps J. Liposome opsonization. Journal of liposome research. 2005;15:109–39.

13. Immordino ML, Dosio F, Cattel L. Stealth liposomes: Review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 2006;1:297–315.

14. Blau IW, Fauser AA. Review of comparative studies between conventional and liposomal amphotericin B (Ambisome) in neutropenic patients with fever of unknown origin and patients with systemic mycosis. Mycoses. 2000;43:325–32.

15. Betz G, Aeppli A, Menshutina N, Leuenberger H. In vivo comparison of various liposome formulations for cosmetic application. International journal of pharmaceutics [Internet]. 2005 [cited 2015 May 5];296:44–54. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037851730500147X

16. Korting HC, Zienicke H, Schafer-Korting M, Braun-Falco O. Liposome encapsulation improves efficacy of betamethasone dipropionate in atopic eczema but not in psoriasis vulgaris. European journal of clinical pharmacology. 1990;39:349–51.

17. Wohlrab W, Lasch J, Taube KM, Wozniak KD. Skin permeation of liposomal incorporated hydrocortisone. Die Pharmazie. 1989;44:333–5.

18. Thielitz A, Gollnick H. Topical retinoids in acne vulgaris: update on efficacy and safety. American journal of clinical dermatology. 2008;9:369–81.

19. Schafer-Korting M, Korting HC, Ponce-Poschl E. Liposomal tretinoin for uncomplicated acne vulgaris. The Clinical investigator. 1994;72:1086–91.

20. Gesztes A, Mezei M. Topical anesthesia of the skin by liposome-encapsulated tetracaine. Anesthesia and analgesia. 1988;67:1079–81.

21. Akbarzadeh A, Rezaei-Sadabady R, Davaran S, Joo SW, Zarghami N, Hanifehpour Y, et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters [Internet]. Nanoscale Research Letters; 2013;8:1. Available from: Nanoscale Research Letters

22. Moghimi SM, Hunter a. C, Andresen TL. Factors Controlling Nanoparticle Pharmacokinetics: An Integrated Analysis and Perspective. Annual Review of Pharmacology and Toxicology [Internet]. 2012;52:481–503. Available from:

http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-pharmtox-010611-134623

23. Li J, Wang X, Zhang T, Wang C, Huang Z. ScienceDirect A review on phospholipids and their main applications in drug delivery systems. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences [Internet]. Elsevier Ltd; 2015;10:81–98. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.ajps.2014.09.004