FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
GRETA ADAMONYTĖ
PROPOLIO EKSTRAKTŲ GAMYBOS OPTIMIZAVIMAS IR APSAUGINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS IN VITRO
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Vitalis Briedis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data (metai, mėnuo, diena)
PROPOLIO EKSTRAKTŲ GAMYBOS OPTIMIZAVIMAS IR APSAUGINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS IN VITRO
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Vitalis Briedis Data:
Recenzentas Darbą atliko
Vardas, Pavardė, parašas Magistrantė
Greta Adamonytė
Data: Data:
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Propolio cheminė sudėtis ... 12
1.2. Antioksidantinis poveikis ... 13
1.3. Priešuždegiminis poveikis ... 14
1.4. Priešbakterinis, priešgrybelinis, priešvirusinis veikimas ... 14
1.5. Priešvėžinis poveikis ... 15
1.6. Imunomoduliacinis poveikis ... 16
1.7. Propolio produktų technologija ... 16
1.8. Ląstelių modeliai ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 20
2.3. Įranga ir priemonės ... 20
2.4. Propolio ekstraktų paruošimas... 21
2.5. Propolio ekstraktų optimizavimas ... 22
2.6. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio ekstraktuose ... 23
2.7. Propolio ekstraktų analizė efektyviąją skysčių chromatografija ... 23
2.8. Optimalių propolio ekstraktų in vitro tyrimas ... 24
2.9. HaCaT ląstelių skaičiavimas ... 25
2.10. Duomenų analizė ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1. Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 26
3.2. ESC analizės rezultatai ... 31
3.3. Spektrofotometrinių ir chromatografinių rezultatų statistinė analizė ... 33
3.4. Optimalių ekstraktų spektrofotometrinė ir ESC analizė ... 35
3.5. Tyrimo su HaCaT ląstelių linija rezultatai ... 37
5. IŠVADOS ... 41 6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41 7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
SANTRAUKA
G. Adamonytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. Vitalis Briedis; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: propolis, optimizavimas, ekstraktas, HaCaT, apsauginės savybės, fenoliniai junginiai, spektrofotometrija, efektyvioji skysčių chromatografija.
Tyrimo tikslas: nustatyti optimalių propolio ekstraktų gamybos sąlygas, ištirti propolio apsaugines savybes in vitro tyrimo metodu su HaCaT ląstelių linija.
Tyrimo uždaviniai:
1. Atlikti propolio ekstraktų technologijos optimizavimą. 2. Pagaminti optimalius ekstraktus ir įvertinti jų kokybę.
3. Pritaikyti ląstelinį HaCaT ląstelių modelį apsauginiam propolio poveikiui įvertinti. 4. Ištirti optimizuotų propolio ekstraktų poveikį naudojant HaCaT linijos ląsteles.
Tyrimo objektas ir metodai: propolio ekstraktų gamyba ir optimizavimas, bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometrijos būdu, fenolinių rūgščių nustatymas chromatografiniu metodu, HaCaT ląstelių kultivavimas ir citotoksiškumo bei UV pažaidos tyrimai.
Tyrimo rezultatai: Atlikus spektrofotometrinę, chromatografinę analizes ir tyrimus su HaCaT ląstelių linija nustatyta, kad naudojant mažiausią kiekį medžiagos atliekama ekstrakcija yra efektyviausia ir ekstraktuose randama sąlyginai daugiausiai fenolinių junginių. Taip pat nustatyta, kad temperatūriniai pasikeitimai didžiausią įtaką daro ekstraktams, gaminamiems su vandeniu arba 5 proc. etanoliu. Atsižvelgiant į duomenis apie optimalius propolio ekstraktus ir realiai gautus rezultatus matyti, kad rezultatai po eksperimento nevisiškai atitinka prognozuotus rezultatus. Išanalizavus tyrimo su ląstelėmis duomenis galima teigti, kad propolio ekstraktai nėra citotoksiški ląstelėms ir dėl propolyje esančių fenolinių junginių geba apsaugoti ląsteles nuo UV pažaidos.
Išvados:
1. Atlikus propolio ekstraktų technologijos optimizavimą nustatyta, kad didžiausią įtaką fenolinių junginių ekstrakcijai turi medžiagos kiekio ir ekstrahento santykis (atliekant ekstrakciją su mažesniu kiekiu medžiagos, ji yra efektyvesnė ir išsiskiria sąlyginai daugiau fenolinių junginių). Temperatūra įtaką turi tik vandeninių ir 5 proc. etanolio ekstraktų gamybai.
2. Pagaminus optimalius propolio ekstraktus nustatyta, kad realūs rezultatai nevisiškai atitinka prognozuotus.
3. Pažeidus HaCaT ląstelių linijos ląsteles UV spinduliuote ir uždėjus optimalių propolio ekstraktų stebėtas apsauginis propolio poveikis, kai, lyginant su kontrole, ląstelių kiekis nesumažėjo, o padidėjo.
4. Optimizuoti propolio ekstraktai HaCaT ląstelėms nebuvo citotoksiški ir apsaugojo nuo UV spinduliuotės.
Rekomendacijos: Propolis yra daugiakomponentė, natūrali medžiaga, kuri, dėl sudėtyje esančių fenolinių junginių, turi platų veikimo spektrą ir paskutiniu metu tradicinis jo vartojimas vis dažniau pagrindžiamas moksliniais tyrimais. Todėl rekomenduojama tęsti optimalių tyrimo sąlygų paiešką, kad prognozuojami rezultatai būtų gaunami ir po realaus eksperimento. Taip pat rekomenduojama tęsti tyrimus su HaCaT ląstelių linija ar kitomis ląstelėmis, nes ši ląstelių linija nebuvo plačiai naudojama propolio tyrimuose ir taip pat naujų žinių gavimas tokiuose tyrimuose yra aktualu ikiklinikinių tyrimų atžvilgiu, kuomet tyrimų su gyvūnais vis dažniau atsisakoma.
SUMMARY
G. Adamonytė master thesis/Term paper advisor prof. dr. Vitalis Briedis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical pharmacy. – Kaunas
Keywords: propolis, optimization, extract, HaCaT, protective quality, phenolic compounds, spectrophotometry, high pressure liquid chromatography.
Aim of the study: to determine optimal propolis extracts production conditions and study propolis protective qualities in vitro using HaCaT cell line.
Research goals:
1. To execute propolis extracts production optimization.
2. To produce optimal propolis extracts and analyze their quality.
3. Adjust HaCaT cell line for the propolis protective qualities assessment. 4. Analyze optimal propolis extracts effect in vitro with HaCaT cell line.
Research methods and the exploratory: propolis extracts production and optimization, identifying total phenolic compounds, while using spectrophotometry and identifying phenolic acids with chromatography, HaCaT cell line cultivation, propolis cytotoxicity and protective qualities analysis. Results: After spectrophotometry and chromatography analysis and in vitro study with HaCaT cell line, it was determined that using the smallest amount of propolis in the extraction process gave the best extraction of phenolic compounds (biggest amounts). Also it was determined that temperature influenced only the extracts that was made with water and 5% ethanol. According to the optimal propolis extracts and results, which was obtained after experiment, it clearly showed, that it did not recur. After analyzing data from the in vitro assay it was concluded that propolis is not cytotoxic and because of phenolic compounds it can protect cells from UV.
Conclusions:
1. After analyzing the optimization process it was determined that the biggest influence for propolis extraction is the ratio between propolis quantity and solvent. Temperature influences extractions made with water and 5% ethanol.
2. When the optimal propolis extracts were made and the results compared to the ones that were proposed it was concluded that it does not recur.
3. Propolis extracts are able to protect HaCaT cell line from UV. The amount of cells in monolayer was bigger than control.
Recommendations: Propolis is a natural substance that has a lot of phenolic compounds. Its traditional use has already been examined by researchers all around the world. That is why it is recommended to continue studies for optimal propolis extracts production conditions. Also it is recommended to continue
in vitro assays with HaCaT cell line, because there is not much data concerning this case. It is very
important to continue this research, especially when the animal testing is continuously declined in preclinical trials.
SANTRUMPOS
BFJ – bendras fenolinių junginių kiekis BFR – bendras fenolinių rūgščių kiekis DMEM – Dullbecco modifikuota Eagle terpė FBS – fetalinis jaučio serumas
KRFE – kavos rūgšties fenetilo esteris
MKES – medžiagos kiekio ir ekstrahento santykis PBS – fosfatinis buferinis tirpalas
PEG400 – polietilenglikolis 400 PG - propilenglikolis
UV – ultravioletinė spinduliuotė
ĮVADAS
Žmonės jau nuo pirmykščių laikų naudojo bičių produktus, ypač propolį, kuris buvo gera pagalba susižeidus ar nusideginus. Dažnai naudojamas jis buvo tarp egiptiečių, arabų, graikų ir daugelio kitų [1]. Propolis randamas visame pasaulyje, kur yra bičių. Bitės propolį surenka nuo augalų, jų išskyrų ar pumpurų ir grįžusios į avilį juo kamšo skylutes. Propolio spalva ir sudėtis priklauso nuo klimatinių sąlygų, geografinės padėties ir augalų, nuo kurių surenkamas, todėl cheminė sudėtis ir vyraujančios medžiagos propolyje kinta atitinkamai.
Propolyje randamas nemažas kiekis fenolinių junginių, dėl to jis pasižymi antioksidantiniu [2,3], priešuždegiminiu veikimu [4], taip pat priešbakteriniu [5], priešgrybeliniu [6], priešvirusiniu [7], priešvėžiniu veikimu [8] ir imunomoduliaciniu aktyvumu [4]. Propolį verta tirti, nes tai yra daugiakomponentė, natūrali medžiaga, kuri veikia labai plačiai ir yra tradiciškai naudojama jau ilgą laiką. Paskelbti duomenys yra skirtingų propolių iš daugelio šalių, tikėtina, kad tokie patys poveikiai galimi ir su lietuvišku propoliu. Tyrimas aktualus todėl, kad atlikus literatūros analizę paaiškėjo, kad propolio ekstraktai visada gaminami įvairiomis sąlygomis (naudojant 60 proc., 70 proc. ar kitokių koncentracijų etanolį, vandenį ir kitus ekstrahentus, ekstrakcija atliekama skirtingą laiką ir skirtingu temperatūriniu rėžimu). Siekiant atrasti ekonomiškas eksperimento sąlygas, buvo naudotas optimizavimo metodas. Tyrimas buvo pritaikytas vėlesniam darbui su ląstelėmis, todėl naudoti ekstrahentai buvo nedidelės koncentracijos. Taip pat buvo atliktas optimalių propolio ekstraktų apsauginių savybių tyrimas in vitro su HaCaT ląstelių linija, nes su šiomis ląstelėmis tokie tyrimai dar nebuvo atlikti. Šio darbo tikslas yra nustatyti optimalių propolio ekstraktų gamybos sąlygas, ištirti propolio apsaugines savybes in vitro tyrimo metodu su HaCaT ląstelių linija.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: nustatyti optimalių propolio ekstraktų gamybos sąlygas, ištirti optimizuotų propolio ekstraktų apsaugines savybes in vitro tyrimo metodu su HaCaT ląstelių linija.
Uždaviniai:
1. Atlikti propolio ekstraktų technologijos optimizavimą. 2. Pagaminti optimalius ekstraktus ir įvertinti jų kokybę.
3. Pritaikyti ląstelinį HaCaT ląstelių modelį apsauginiam propolio poveikiui įvertinti. 4. Ištirti optimizuotų propolio ekstraktų poveikį naudojant HaCaT linijos ląsteles.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Propolio cheminė sudėtis
Propolis buvo vartojamas tradicinėje medicinoje jau nuo pirmykščių žmonijos laikų. Dažnai naudojamas jis buvo tarp egiptiečių, arabų, graikų ir daugelio kitų [1]. Propolis yra natūrali dervinga medžiaga, kurią bitės surenka iš įvairių augalų, jų pumpurų ar išskyrų. Gamtoje propolį bitės naudoja kaip statybinę medžiagą, kuria užkamšo avilio tarpus. Taip pat propolyje lieka įklimpę bičių avilio svetimkūniai [9,10]. Žemesnėje nei kambario temperatūroje propolis yra kietas ir trapus, tačiau aukštesnėje temperatūroje tampa minkštas, lankstus ir labai lipnus. Propolio spalva ir sudėtis (1 lentelė) priklauso nuo šaltinių (augalijos tipo), klimatinių sąlygų ir nuo pačio propolio amžiaus [6,9,11,12]. Propolyje randama daugiau kaip 300 skirtingų medžiagų [13], iš kurių daugiausia yra polifenolių, flavanoidų, fenolinės rūgšties ir jos esterių, fenolinių aldehidų, ketonų ir kt. Kitos medžiagos randamos propolyje yra aliejai ir aromatinės rūgštys (5-10 proc.), vaškai (30-40 proc.), dervos, balzamai ir žiedadulkių dalelės, kuriose gausu tokių svarbių elementų kaip magnis, nikelis, kalcis, geležis ir cinkas [9,10]. Paplitusi nuomonė ta, kad standartizuoti propolio produktai yra saugesni ir mažiau toksiški, nei sintetiniai vaistai [10]. Saugus propolis yra vartojamas nedidelėmis dozėmis, tačiau tam tikri šalutiniai poveikiai gali atsirasti propolio vartojant 15 gramų per dieną [10].
1. Lentelė. Skirtingo geografinio regiono propolio vyraujančios medžiagos [6].
Geografinis regionas
Fenolinės rūgštys ir jų esteriai Flavonoidai Kiti junginiai
Europa Hidroksibenzo rūgštys, Hidroksicinamono rūgštys, Kavos rūgšties fenetilo esteris
Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai
Vanilinas
Azija Hidroksicinamono rūgštys, Kavos rūgšties fenetilo esteris
Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Vanilinas, Klerodano diterpenoidai (Irakas) Šiaurės Amerika Hidroksicinamono rūgštys (p-kumaro rūgštis) Flavonai, Flavanonai Pietų Amerika Hidroksibenzo rūgštys, Hidroksicinamono rūgštys, Kavos rūgšties fenetilo esteris
Flavonai, Flavanonai, Flavonoliai Artepilinas C (3,5-diprenilp-kumaro rūgštis)
(Brazilija) Afrika Hidroksicinamono rūgštys Flavonai,
Flavanonai, Flavonoliai Okeanija Kavos rūgšties fenetilo esteris Flavonai,
Flavanonai
Bitės sumaišo nuo augalų surinktą sakingą medžiagą su savo seilėmis, kuriose yra 13-glikozidazės fermento, kuris sukelia gliukozilflavanoidų hidrolizę ir dėl to susidaro flavanoidų aglikonai [1]. Propolyje randama: kavos rūgštis, p-kumaro rūgštis, 3,4-dimetoksicinamono rūgštis, kvercetinas, pinobanksino 5-metil eteris, apigeninas, kempferolis, pinobanksinas, chrizinas, pinocembrinas, galanginas, pinobanksino 3-acetatas, fenetilo kofeino druskas, artepilinas C [1,14,15].
Dėl propolyje esančių fenolinių junginių, jis pasižymi antioksidantiniu [2,3], priešuždegiminiu veikimu [4], taip pat priešbakteriniu [5], priešgrybeliniu [6], priešvirusiniu [7], priešvėžiniu veikimu [8] ir imunomoduliaciniu aktyvumu [4].
1.2. Antioksidantinis poveikis
Propolyje esantys flavonoidai pasižymi antioksidantiniu poveikiu dėl savo gebėjimo inaktyvuoti laisvuosius radikalus ir sumažinti ne tik jų kiekį, bet ir efektyvumą [16]. Propolio antioksidantinis poveikis nekeičia kraujo sudėties ir neblogina astma sergančių pacientų būklės [2]. Propolis mažina kraujospūdį ir cholesterolio kiekį [10]. Oksidacinis stresas yra pasekmė balanso nebuvimo tarp reaktyvaus deguonies ar azoto (ROS ir RNS) junginių daugėjimo organizme ir antioksidantinio mechanizmo, kuris juos inaktyvina. ROS/RNS sukelia oksidaciją tokių biomolekulių kaip DNR, RNR, baltymai, lipidai. Dėl tokių pokyčių didėja galimybė išsivystyti uždegiminėms ligoms, širdies ligoms, miokardo infarktui, Alzhaimerio ligai, šizofrenijai ir kt. Kai žmogaus organizme ROS/RNS junginių skaičius viršija normą, yra natūralių antioksidantinių mechanizmų, kurie padeda kovoti su oksidaciniu stresu. Tai yra antioksidantinės medžiagos, kurias žmogus gauna normaliai maitindamasis (pvz.: vitaminas C, E, polifenoliai, flavonoidai ir karotenoidai), arba, jei maiste jų nėra pakankamas kiekis, kai kurias vartoja papildomai [3]. Oksidacinį stresą gali sukelti rūkymas, užteršta aplinka, neteisingas maitinimasis. Propolis inhibuoja superoksidinio anijono gamybą, kuris paprastai gaminasi per β-merkaptoetanolio autooksidaciją. Atlikto tyrimo metu paaiškėjo, kad KRFE (kavos rūgšties fenetilo esteris) buvo gerokai efektyvesnis negu galanginas inhibavimo procese [10]. Propolio
cheminė sudėtis skiriasi atitinkamai nuo regiono, kuriame jis buvo surinktas, metų laiko ir panašių aplinkybių, tačiau poveikis bet kokiu atveju išlieka. Skiriasi tik pats flavanoidų kiekis [14,17]. Taip pat nėra didelio skirtumo poveikio atžvilgiu (antioksidantinis poveikis išlieka) tarp šviežio, ką tik surinkto propolio ir propolio, kuriam yra 180 dienų ir daugiau, skiriasi tik bendras fenolinių junginių kiekis ir antioksidantinio poveikio stiprumas [11]. Taigi, skirtingų šalių propolis, dėl jo sudėtyje esančių fenolinių junginių, pasižymi antioksidantiniu poveikiu ir yra plačiai naudojamas kaip pagalbinė antioksidantinė priemonė.
1.3. Priešuždegiminis poveikis
Manoma, kad propolis tinkamas ūmiam, lėtiniam, dirgliam ar su imuniteto ligomis susijusiam uždegimui malšinti [18]. Efektyvūs priešuždegimiškai veikiantys propolio sudėties elementai yra KRFE (kavos rūgšties fenetilo esteris) ir galanginas [10], tačiau KRFE yra pats efektyviausias priešuždegiminis propolio elementas [19]. Uždegimas – vietinė kraujagyslių, jungiamojo, nervinio audinio, humoralinių ir ląstelinių veiksnių reakcijų visuma į pažaidą. Uždegimą sukelti gali egzogeniniai veiksniai (fizikiniai, mechaniniai ir t.t.), endogeninės priežastys (išemija, trombozė, šlapalo susikaupimas ir kt.). Dažnai uždegimą sukelti gali keli etiologiniai komponentai [20]. Uždegimo metu organizmo baltieji kraujo kūneliai ir cheminės medžiagos saugo nuo infekcijų ir svetimkūnių, tokių kaip virusai ir bakterijos. Šis procesas susijęs su uždegimą sukeliančių medžiagų (pvz.: prostaglandinų) išskyrimu per fermentines reakcijas, kuriose dalyvauja lipooksigenazės, ciklooksigenazės, fosfolipazė A2 ir hialuronidazė [13]. Vienas iš KRFE pagrindinių veikimo mechanizmų yra branduolio faktoriaus κB (BF-κB) aktyvavimo inhibavimas. BF-κB aktyvavimą sukelti gali įvairios uždegiminio proceso medžiagos, tokios kaip lipopolisacharidai, auglio nekrozės faktorius (ANF-α), vandenilio peroksidas ir kt. BF-κB inhibavimas vyksta dalinai dėl KRFE stabdomo IκB kinazės komplekso aktyvumo. Taip pat KRFE susilpnina uždegimo citokinų gamybą [21]. Apibendrinant, skirtingose šalyse surinktas propolis turi įvairius kiekius KRFE ir pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, todėl dažnai yra naudojamas tepalų, aliejų gamybai skirtai uždegiminėms odos problemoms spręsti.
1.4. Priešbakterinis, priešgrybelinis, priešvirusinis veikimas
Propolio antibakterinis poveikis pasireiškia tiesiogiai veikiant mikroorganizmus arba netiesiogiai, stimuliuojant imuninę sistemą. Šis bičių produktas taip pat gali veikti sinergistiškai su antimikrobiniais vaistais (pvz.: streptomicinu, kloksacilinu). Atlikti in vitro ir in vivo tyrimai parodė, kad propolis gali aktyvuoti makrofagus ir būtent dėl to pagerėja jo mikrobicidinis poveikis [22].
Dažniausi patogenai, kurie sukelia infekcijas, yra Staphylococcus aureus (Gram teigiamas),
Pseudomonas aeruginosa (Gram neigiamas), Escherichia coli (Gram neigiamas) ir Candida albicans
(grybelis) [10,22]. Tirpiklis, kuris naudojamas propolio ekstrakcijai, gali turėti įtakos antimikrobinio aktyvumo stiprumui. Pavyzdžiui, naudojant etanolį ar propilenglikolį pastebimas stiprus poveikis prieš grybelius [10]. Turkijoje atliktas propolio tyrimas, kurio metu buvo tirta jo antibakterinis ir antigrybelinis poveikiai. Šio tyrimo metu buvo nustatyta, kad antimikrobiniam poveikiui įtakos galėjo turėti pats propolio mėginys, dozė ir tirpikliai, naudoti ekstrahavimui. Ištyrus visus mėginius, buvo pastebėta, kad antimikrobinis aktyvumas stiprėjo atitinkamai su didėjančia propolio doze [15]. Mokslininkai teigia, kad propolis inhibuoja bakterijų augimą trukdydamas ląstelių dalijimuisi. Taipogi propolis dezorganizuoją citoplazmą, citoplazmos membraną ir ląstelės sienelę, sukelia dalinę bakteriolizę ir inhibuoja baltymų sintezę [15]. Taigi, dėl turimų fenolinių junginių, propolis inhibuoja bakterijų augimą, aktyvuoja makrofagus ir veikia taip, kad nesusiformuoja mikroorganizmų atsparumas, dėl to propolis pasižymi priešbakteriniu, priešgrybeliniu ir antivirusiniu poveikiu, o tyrimai, kurie apsaugo nuo mikroorganizmų vystymosi, išlieka aktualūs.
1.5. Priešvėžinis poveikis
Propolis sustiprina organizmo T ląstelių lizinį aktyvumą auglio ląstelėms. Taigi propolis turi poveikį prieš navikus, priešvėžinį ir antimutageninį poveikius, tačiau mechanizmai vis dar nėra aiškūs [22]. Braziliškame propolyje randamas artepilinas C (3,5-diprenil-4-hydroksicinamono rūgštis). Taikant artepiliną C žmonių ir pelių piktybinių auglių in vitro ir in vivo tyrimuose, pastebėta, kad ši medžiaga turi citotoksinį poveikį ir auglių ląstelių augimas buvo žymiai prislopintas. Taip pat buvo pastebėta, kad artepilinas C daro didelę žalą kietiems augliams ir leukeminėms ląstelėms [15].
Kito tyrimo metu nustatyta, kad priešvėžinis veikimas gali pasireikšti šiais būdais: 1. Dėl imunomoduliacinio poveikio supresuojamas vėžinių ląstelių plitimas; 2. Mažėjantis vėžinių kamieninių ląstelių kiekis;
3. Blokuojamas specifinis onkogeninis signalo perdavimas; 4. Antiangiogeninis poveikis;
5. Moduliuojama auglio terpė/aplinka;
6. Kaip papildomas priedas prie jau egzistuojančių priešvėžinių terapinių metodų [23].
Dėl savo įvairios sudėties, propolis ir jo produktai sustiprina organizmo T ląstelių aktyvumą, o artepilinas slopina auglių ląstelių augimą. Taigi, propolis turi priešvėžinį poveikį.
1.6. Imunomoduliacinis poveikis
Atlikus in vitro tyrimą su makrofagais pastebėta, kad propolis turi imunostimuliuojantį ir imunomoduliacinį poveikius [10]. Keli moksliniai straipsniai apie propolio imunomoduliacinį poveikį rašo, kad vandenyje tirpūs propolio dariniai gali būti pakankamai veiksminga priemonė [24,25]. Vandenyje tirpūs propolio dariniai (VTPD) buvo gauti atliekant ekstrakciją 96 proc. etanoliu, po to filtruojama ir džiovinama vakuume iki sausos medžiagos. Viskas maišoma su 8 proc. L-lizinu ir sausai užšaldoma [26]. Gautas VTPD susideda iš 6,7 proc. kavos rūgšties, 1,2 proc. γ,γ-dimetilalil ferulato, 7,4 proc. izopentil-2-enil kavos rūgšties esterio, 2,2 proc. pentenilio kavos rūgšties esterio, 8,5 proc. γ,γ-dimetilalil kavos rūgšties esterio, 2,3 proc. pinobanksino, 9,2 proc. pinocembrino, 13,6 proc. pinobanksin-3-acetato, 0,4 proc. benzil kavos rūgšties esterio, 7,8 proc. galangino, 1,2 proc. β-feniletil kavos rūgšties esterio, 32,9 proc. flavonoidų, 20,9 proc. fenilo rūgšties esterių. Propolyje randama apie 25 proc. kavos rūgšties ir kavos rūgšties fenetilo esterio [25,26]. VTPD ir jo sudedamosios dalys stimuliuoja makrofagus, tokiu būdu darydamos įtaką specifiniam ir nespecifiniam imuniniam atsakui. Aktyvuoti makrofagai sekretuoja tokias medžiagas, kaip TNF-α, H2O2 ir azoto oksidą [25,27], kurie ardo
jautrias auglio ląsteles ir inhibuoja ląstelių taikinių DNR [25,28]. Buvo pastebėta, kad gyvūnai, kurie buvo veikiami imunostimuliantais, skirtingu stiprumu, priešinosi tolimesnėms auglio ląstelių injekcijoms. Tai buvo galima matyti dėl sumažėjusio auglio ląstelių įsisavinimo, sulėtėjusio auglio augimo ir padidėjusio gyvūnų išgyvenamumo [28]. Nustatyta, kad propolis sustiprina imuninės sistemos aktyvumą ir galėtų būti naudojamas kaip priedas vakcinose [27]. Etanolis, propolio tirpiklis, nekeičia imunologinių tyrimų duomenų [22]. Taigi, dėl savo gebėjimo stimuliuoti makrofagus, propolis yra efektyvi imunomoduliaciniu poveikiu pasižyminti priemonė ir gali būti naudojamas net kaip pagalbinė priemonė vakcinacijų atveju.
Apibendrinant, uždegimas, virusiniai ar bakteriniai susirgimai, oksidacinis stresas yra glaudžiai tarpusavyje susiję reiškiniai, kai esant vienam požymiui, kitas gali būti lydintis (pvz. esant infekcijai, beveik visada organizme pasireikš ir uždegimas). Būtent dėl šios priežasties reikėtų svarstyti plataus veikimo preparatų kūrimą ir pritaikymą. Propolis yra daugiakomponentė, natūrali medžiaga, kuri veikia anksčiau minėtus simptomus ir galėtų būti alternatyva cheminiams preparatams.
1.7. Propolio produktų technologija
Pagal Europos Farmakopėją, ekstraktai yra kietos, skystos ar tirštos konsistencijos preparatai, gaminami iš augalinės ar gyvulinės kilmės medžiagų, kurios dažniausiai būna sausos. Tam
tikriems ekstraktams gaminti žaliava turi būti iš anksto apdorota, pvz.: inaktyvuoti fermentai, pašalintos nereikalingos priemaišos ir t.t. Ekstraktai ruošiami maceravimo, reperkoliacijos ar kitu tinkamu įteisintu metodu, naudojant etanolį ar kitą tinkamą tirpiklį. Visos ekstraktų gamybai naudojamos medžiagos turi atitikti Europos Farmakopėjos reikalavimus.
Fenolinės rūgštys, kurios yra biologiškai aktyvūs propolio junginiai, yra antriniai augalų metabolitai. Tai cheminiai junginiai, kurių sudėtyje yra viena ar daugiau hidroksilo grupių prijungtų prie aromatinio žiedo. Dažniausiai žaliavoje jie randami kaip esteriai ar glikozidai [29].
Norint iš propolio išgauti kuo daugiau biologiškai aktyvių junginių (vanilo rūgšties, kavos rūgšties, vanilino, p-kumaro rūgšties, ferulo rūgšties), reikia pasirinkti tam tinkamas, optimalias sąlygas. Pasirenkamos sąlygos dažniausiai yra medžiagos kiekis, ekstrahentas, kiek laiko vyks ekstrakcija ir kokioje temperatūroje. Viename iš tyrimų buvo pasirinktos temperatūros nuo 15°C iki 50°C, grynas vanduo ir ekstrakcija atlikta naudojant purtymo spintą. Ištirpusių medžiagų kiekis padidėjo atitinkamai su didinama temperatūra, kaip ir buvo numatyta. Atlikus daugiau tyrimų, mokslininkai nustatė, kad ištirpusių medžiagų kiekis taip pat priklauso ir nuo vandenilinio ryšio su vandeniu susiformavimo [29].
Fenolinių junginių tirpimą ekstrahentuose nusako termodinamika. Vienas iš termodinamikos faktorių yra aktyvumo koeficientas, kuris yra atvirkščiai proporcingas tirpumui, t.y. kuo mažesnis koeficientas, tuo didesnis tirpumas. Galanakis et al [30] atliktas tyrimas su septyniais ekstrahentais ir 15 natūralių fenolinių junginių trijose skirtingose temperatūrose parodo įvairias aktyvumo koeficiento variacijas, pateiktas 2-oje, 3-ioje ir 4-oje lentelėse.
2. Lentelė. Natūralių fenolinių junginių tirpumo aktyvumo koeficientai esant 25°C [30]. Natūralūs fenoliniai
junginiai
Aktyvumo koeficientai
Vanduo Etanolis Metanolis Acetonas
Kavos rūgštis 1,9*10-1 8,4*10-3 2,9*10-2 2,6*10-2
Kumaro rūgštis 1,7*101 1,4*10-1 1,5*10-1 1,3*10-1
Ferulo rūgštis 1,3*100 2,7*10-1 1,4*10-1 1,8*10-1
Vanilo rūgštis 2,8*100 2,8*10-1 1,9*10-1 3,2*10-1
Kavos rūgšties tirpumo aktyvumo koeficientas buvo mažiausias etanolyje, o kumaro, ferulo ir vanilo rūgščių – metanolyje.
3. Lentelė. Natūralių fenolinių junginių tirpumo aktyvumo koeficientai esant 40°C [30]. Natūralūs fenoliniai
junginiai
Aktyvumo koeficientai
Vanduo Etanolis Metanolis Acetonas
Kavos rūgštis 4,0*10-1 1,4*10-2 3,7*10-2 3,5*10-2
Kumaro rūgštis 2,3*101 1,7*10-1 1,9*10-1 1,3*10-1
Ferulo rūgštis 1,8*101 3,1*10-1 1,6*10-1 2,1*10-1
Vanilo rūgštis 4,2*100 3,3*10-1 2,1*10-1 3,7*10-1
Rezultatai, atliekant tyrimą esant 40°C temperatūrai, labai nesiskyrė nuo tyrimo, atlikto esant 25°C temperatūrai. Tendencija išliko ta pati – kavos rūgšties aktyvumo koeficientas buvo mažiausias etanolyje, o kumaro, ferulo ir vanilo rūgšties koeficientai buvo mažiausi metanolyje. Tai reiškia, kad atitinkamai tuose tirpikliuose rūgštys ištirpo geriausiai.
4. Lentelė. Natūralių fenolinių junginių tirpumo aktyvumo koeficientai esant 60°C [30]. Natūralūs fenoliniai
junginiai
Aktyvumo koeficientai
Vanduo Etanolis Metanolis Acetonas
Kavos rūgštis 8,7*10-1 2,3*10-2 4,8*10-2 4,8*10-2
Kumaro rūgštis 3,1*101 2,2*10-1 1,5*10-1 1,3*10-1
Ferulo rūgštis 2,6*101 3,7*10-1 1,9*10-1 2,4*10-1
Vanilo rūgštis 6,5*100 3,9*10-1 2,4*10-1 4,2*10-1
Tyrimą atliekant 60°C temperatūroje, tendencija išliko ta pati, kaip ir prieš tai buvusiose sąlygose. Taigi, atsižvelgianti į aktyvumo koeficiento variacijas tarp trijų skirtingų temperatūrų, vertės, gautos atliekant ekstrakcijas su vandeniu, etanoliu, metanoliu ir acetonu, didėjo kylant temperatūrai. Aktyvumo koeficientai, gauti naudojant UNIFAC modelį, parodo, kad natūralūs fenoliai tirpsta vidutinio poliškumo (alkoholiai, acetonas) tirpikliuose geriau, nei labiau poliniame vandenyje. Tai gali būti paaiškinta dėl fenolių stereochemijos (dėl jų molekulėse esančių polinių ir nepolinių fragmentų) ir tarpmolekulinių ryšių (pagrinde vandenilinio ryšio), kuris atsiranda tarp jų ir tirpiklio [30]. Atsižvelgiant į literatūros analizę, teorinis pasirinkimas ekstrahentų visada sutampa su eksperimentinių tyrimų rezultatais, todėl poliniai tirpikliai, tokie kaip etanolis, propilenglikolis, polietilenglikolis 400 yra dažnai pasirenkami [30].
1.8. Ląstelių modeliai
Cheminiai tyrimai patikimai leidžia nustatyti medžiagų kokybę, tapatybę, tačiau nesuteikia patikimos informacijos apie biologiniuose organizmuose vykstančius pokyčius, nes dažniausiai tiriamas yra vienas konkretus atsakas. Biologiniai modeliai, šiuo atveju tyrimai su ląstelėmis, suteikia patikimus biologinius rezultatus, nes parodo atsaką į visus mechanizmus bendrai, kurie yra biologiniame organizme. Ląstelių modeliai yra artimesni realiai gamtoje vykstantiems procesams. Atlikus cheminius tyrimus ir tyrimus su ląstelėmis, galima tirti ryšį tarp biologinių ir cheminių tyrimų rezultatų ir sąlygų. HaCaT ląstelės yra imortalizuoti (nemirtingi) žmogaus keratinocitai, kurie plačiai naudojami tiriant odos biologiją ir ląstelių diferenciaciją [31]. Ši ląstelių linija yra naudojama in vitro modeliuose, kaip greitai besidauginantis epidermis. HaCaT ląstelės turi bazinio epidermio keratinocitų savybių [32]. HaCaT ląstelių linija gali turėti daugiau nei 140 pasažų, atliekant in vitro tyrimus turi transformuotą fenotipą ir yra nesukelianti navikų augimo [33]. Net ir po daugelio pasažų, HaCaT ląstelės išlaiko normalų dalijimosi greitį ir kiekį, taip pat yra tinkamos keratinizacijos tyrimams, yra stabilios [33].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Bičių produktas – propolis ir jo produktai. Tyrimai atlikti su sausu, smulkintu, persijotu propoliu. Tyrimui naudotas sausas propolis gautas iš UAB „Bičių korys“, Lietuva.
2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai
Naudotas išgrynintas vanduo paruoštas Millipore vandens gryninimo sistema (Bedford, MA). Ekstraktų gamybai naudoti ekstrahentai: maistinis rektifikuotas etilo alkoholis (etanolis) (AB „Vilniaus degtinė“, Lietuva), 1,2-Propanediolis (propilenglikolis) (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), polietilenglikolis 400 (AppliChem GmbH, Vokietija). Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui naudotas Folin-Ciocalteau reagentas (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), natrio karbonatas (Na2CO3)
(Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija). Ląstelių nekrozei įvertinti naudotas propidžio jodidas (PI), apoptozei – BisBenzimide (Hoescht) 33342. Ląstelių kultivacijai naudotas fetalinis jaučio serumas (FBS) (Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija), penicilino ir streptomicino tirpalas PenStrep (LifeTechnologies, Jungtinės Amerikos Valstijos), DMEM (Dulbeko modifikuota Eagle Terpė) (Life Technologies, Jungtinės Amerikos Valstijos).
2.3. Įranga ir priemonės
Svarstyklės Scaltec SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija), spektrofotometras Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV),Agilent 1260 Infinity kapiliarinis skysčių chromatografas (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV) su diodų matricos detektoriumi, inkubatorius HERACELL 15 (Thermo Scientific, Jungtinės Amerikos Valstijos), centrifuga Centrifuge 5810R (Eppendorf, Vokietija), laminaras HERASAFE KS (Thermo Scientific, Jungtinės Amerikos Valstijos). UV pažaidai atlikti naudota lempa USHIO UV FLUORESCENT (Ushio America Inc., JAV), UVP MRL-58 Multiple Ray lempa (UVP, Jena, Vokietija), dozimetras UVX radiometer (UVP, Jena, Vokietija), mikroskopas OLYMPUS IX71 (OLYMPUS EUROPA GmbH, Hamburgas, Vokietija). Darbui su ląstelėmis naudotos permatomos lėkštelės su 96 – iais šulinėliais, audinių kultūrų kolbos, serologinis pipečių pritraukėjas, serologinės 25 ml ir 5 ml pipetės.
2.4. Propolio ekstraktų paruošimas
Išdžiovinta propolio žaliava susmulkinta elektriniu malūnėliu. Siekiant sumažinti tyrimų skaičių ir įvykdyti kryptingą technologinių parametrų optimizavimą, pritaikyta eksperimento planavimo programa Design-Expert 6.0, suformuota 30 skirtingų tyrimų sąlygų (atsižvelgiant į medžiagos kiekį, temperatūrą, laiką ir purtymo greitį) (5 lentelė).
5 lentelė. Tyrimų sąlygos suformuotos Design-Expert 6.0 programa.
Std Tyri- mo Nr. Factor 1: Konc. zaliavos, proc. Factor 2: Temperatūra, C Factor 3: Laikas, min Factor 4: Purtymo greitis, aps./min 1. 7 1.00 25.00 30.00 50.00 2. 26 10.00 25.00 30.00 50.00 3. 27 1.00 50.00 30.00 50.00 4. 22 10.00 50.00 30.00 50.00 5. 23 1.00 25.00 60.00 50.00 6. 5 10.00 25.00 60.00 50.00 7. 24 1.00 50.00 60.00 50.00 8. 12 10.00 50.00 60.00 50.00 9. 19 1.00 25.00 30.00 100.00 10. 13 10.00 25.00 30.00 100.00 11. 16 1.00 50.00 30.00 100.00 12. 2 10.00 50.00 30.00 100.00 13. 4 1.00 25.00 60.00 100.00 14. 10 10.00 25.00 60.00 100.00 15. 18 1.00 50.00 60.00 100.00 16. 17 10.00 50.00 60.00 100.00 17. 6 1.00 37.50 45.00 75.00 18. 1 10.00 37.50 45.00 75.00 19. 14 5.50 25.00 45.00 75.00 20. 8 5.50 50.00 45.00 75.00 21. 9 5.50 37.50 30.00 75.00 22. 3 5.50 37.50 60.00 75.00 23. 20 5.50 37.50 45.00 50.00
24. 15 5.50 37.50 45.00 100.00 25. 11 5.50 37.50 45.00 75.00 26. 25 5.50 37.50 45.00 75.00 27. 21 5.50 37.50 45.00 75.00 28. 30 5.50 37.50 45.00 75.00 29. 29 5.50 37.50 45.00 75.00 30. 28 5.50 37.50 45.00 75.00
Ekstraktai buvo ruošiami po 25ml. Atitinkamai pagal medžiagos kiekį (procentais) propolio buvo atsverta 0,25g, 1,388g, 2,5g. Žaliava dėta į 50ml stiklinėles, užpilta 25ml vienu iš keturių ekstrahentų (išgrynintas vanduo, 5proc. etanolis, 5 proc. propilenglikolio tirpalas, 5proc. polietilenglikolio 400 tirpalas) ir dėta į purtymo spintą parenkant trukmę, temperatūrą ir purtymo greitį. Gauti ekstraktai filtruoti per popierinį filtrą į vienkartines talpas.
Šio tyrimo metu ekstraktų gamybai buvo pasirinktas ne kelių skirtingų koncentracijų etanolis, kaip tai pasirenka daugelis mokslininkų, o keturi skirtingi ekstrahentai: vanduo, 5 proc. koncentracijos etanolis, 5 proc. koncentracijos propilenglikolio (PG) tirpalas ir 5 proc. koncentracijos polietilenglikolio 400 (PEG400) tirpalas, nes tai yra poliniai tirpikliai, kuriuose gerai tirpsta fenoliniai junginiai [29,30]. Tyrimo metu iš viso buvo pagaminta 120 ekstraktų.
2.5. Propolio ekstraktų optimizavimas
Atlikus literatūros analizę pastebėta, kad propolio ekstraktai visur buvo ruošiami skirtingai, nebuvo vieno bendro metodo kaip pagaminti optimalios sudėties propolio ekstraktus. Todėl siekiant tyrimus atlikti greitai ir ekonomiškai, naudoti kuo mažiau organinių tirpiklių, pritaikytas optimizavimo metodas [34]. Optimizavimo tyrimo metodo didžiausias pranašumas yra tai, kad galima įvertinti daug skirtingų faktorių, įvertinti didelį skaičių įvairių ekstrakto gamybos skirtingų sąlygų ir išrinkti vieną ar kelias optimaliausias, kurios yra tinkamiausios toliau vykdyti tyrimą [35]. Optimizavimo procesui atlikti buvo naudojama kompiuterinė programa Design-Expert 6.0 versija. Naudojantis programa ir apdorojus visus gautus duomenis, buvo išrinkti 4 optimaliausi ekstraktai iš kiekvieno skirtingo ekstrahento ekstraktų grupės (6 lentelė).
6 lentelė. Optimalių propolio ekstraktų ekstrakcijos sąlygos. Medžiagos koncentracija, proc. Temperatūra, °C Trukmė, min Purtymo greitis, aps./min Vanduo 9,2 37,5 44 77 5 proc. etanolis 10 48 53 57 5 proc. PG 10 50 55 100 5 proc. PEG400 10 50 60 100
2.6. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas propolio ekstraktuose
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas aprašytu spektrofotometriniu Folin-Ciocalteau metodu. Ši reakcija yra gan paprasta ir greita norint sužinoti apytikrį bendrą fenolinių junginių kiekį. Tačiau šis metodas nesuteikia informacijos apie kokybinę ekstraktų sudėtį. Norint tai išsiaiškinti, vėliau naudojamas ESC metodas.
Bendras fenolinių junginių kiekis propolio ekstraktuose (vandeniniuose, etanoliniuose, su propilenglikoliu ir su polietilenglikoliu 400) nustatytas atliekant reakciją su Folin-Ciocalteu reagentu ir pritaikant spektrofotometriją [12]. Naudojamas spektrofotometras yra Agilent 8453 UV-Vis (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV). 0,5 ml etanolinio, vandeninio ekstrakto ar ekstraktų su propilenglikoliu ar su polietilenglikoliu 400, matavimo kolbutėse sumaišomas su 3 ml išgryninto vandens, 1 ml Folin-Ciocalteu reagentu ir dvi minutes palaikoma, kol įvyks reakcija. Tada pridedama 20 proc. koncentracijos 1,5 ml Na2CO3 tirpalo. Gerai sumaišoma, mišinys skiedžiamas išgrynintu
vandeniu iki 10 ml. Tirpalai laikomi 30 min. kambario temperatūroje, saulės neapšviestoje vietoje. Absorbcija matuojama prie 765 nm bangos ilgio. Kalibracinė kreivė sudaryta naudojant p-kumaro rūgšties standartinius tirpalus. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas mikrogramais mililitre etanolinės, vandeninės, propilenglikolinės ar polietilenglikolinės 400 propolio ištraukos pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą [6]. Nemaža dalis mokslininkų, atlikusių panašius tyrimus, kalibracinę kreivę sudarė pagal galo rūgštį, tačiau ji daugiau randama tropinių kraštų propolio pavyzdžiuose. Viduržemio jūros regione propolio pavyzdžiuose daugiau randami kavos ir ferulo rūgščių esteriai [13], o Europoje ir kituose panašiuose kraštuose – p-kumaro ir ferulo rūgštys [36].
2.7. Propolio ekstraktų analizė efektyviąją skysčių chromatografija
Dažniausiai propolio fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei taikomi efektyviosios skysčių, dujų chromatografijos ir kapiliarinės elektroforezės metodai. Atliekant šį tyrimą
ir norint sužinoti skirtingų propolio ekstraktų kokybinę sudėtį, naudotas chromatografinis metodas, aprašytas dr. M. Žiliaus ir pritaikytas lietuviško propolio tyrimams [6].
Tyrimui naudotas kapiliarinis skysčių chromatografas Agilent 1260 Infinity su diodų matricos detektoriumi (Agilent Technologies Ing., Santa Clara, JAV). Fenolinių junginių atskyrimui naudota ACE C18 kolonėlė su prieškolone ACE C18 5 µm.
2.8. Optimalių propolio ekstraktų in vitro tyrimas
Darbui su ląstelėmis pradėti (buvo vykdomi du sėjimai) pirmiausiai buvo ruošiama terpė joms kultyvuoti. Per membraninį filtrą filtruojamas fetalinis jaučio serumas, jo dalis bendroje terpės sudedamųjų dalių kiekyje yra 10 proc., 89 proc. terpės sudaro DMEM, 1 proc. terpės sudaro penicilino/streptomicino tirpalas. Toliau atliekamas ląstelių atkėlimas – nupilama terpė, nuplaunama fosfatiniu buferiu (PBS), pilama tripsino (į didelį flakoną 3 ml), flakonai dedami į inkubatorių ir laikomi 12 min. Inkubatoriuje esančiuose flakonuose vyksta tripsinizacija, paskui išėmus flakonus iš inkubatoriaus mechaniškai atkabinamos likusios prikibusios ląstelės. Visa tai atlikus į flakonus pilama terpės tripsino neutralizavimui (terpės naudojama dvigubas kiekis prieš tai piltam tripsino kiekiui). Visas tūris perpilamas į sugraduotus užsukamus mėgintuvėlius ir centrifuguojama 5min, esant 25°C temperatūrai, 1000 aps./min. Nupilamas supernatantas, pilama 4ml terpės. Resuspenduojama visa ląstelių masė su terpe. Imama 10 µl suspensijos, pilama į ependorfo tipo mėgintuvėlį, pilama 90 µl dažo (Trypan Blue Solution), resuspenduojama. Visas mėginys pilamas ant hemacitometro ir dedama po inversiniu mikroskopu. Apskaičiuojama kiek ląstelių turi būti pasėta viename lėkštelės šulinėlyje. Sėjama po 50000 ląstelių į vieną šulinėlį (lėkštelės su 96-iais šulinėliais) ir dedama į inkubatorių 24 valandų laikotarpiui, esant 37°C temperatūrai, 5 proc. CO2 aplinkai ir prisotinta drėgmės.
Po 24 valandų ląstelės išimamos iš inkubatoriaus, mikroskopu apžiūrima ar jos neužsikrėtę, ar susidarė monosluoksnis. Tada ląstelės laminare plaunamos PBS (nuo ląstelių nupilama terpė, užpilama PBS, po minutės nupilamas PBS ir užpilama šviežia terpė). Kadangi PBS yra skirtas nuplovimui, jo nereikia laikyti ilgą laiką, užtenka apie 1-2 minutes. Viena lėkštelė su 96 – iais šulinėliais (dar be šviežios terpės, tik su PBS) švitinama UV spinduliais, 3 minutes. Paskui lėkštelė pripildoma terpės ir tada jau į abiejų lėkštelių šulinėlius dedami paruošti optimalūs propolio ekstraktai. Dedama kiekvieno ekstrakto po 2 µl ir 4 µl.
Praėjus parai laiko ruošiami dažai, skirti ląstelių apoptozei (Hoescht‘o dažai) ir nekrozei (propidžio jodidas) per mikroskopą stebėti. Dažai gaminami miltelius tirpinant vandenyje, 1mg/ml
koncentracijos. Dažai jautrūs šviesai, todėl supylus juos į ependorfinio tipo mėgintuvėlius, būtina saugoti nuo šviesos.
Į 200µl talpos šulinėlius dedama 1 µl propidžio jodido (PI) ir 3 µl Hoescht‘o dažų. Ląstelės inkubuojamos apie 10 min. Išėmus iš inkubatoriaus dedama į fluorescentinį mikroskopą ir fotografuojama fazių kontrasto ir fluorescentinės mikroskopijos metodu.
2.9. HaCaT ląstelių skaičiavimas
Atlikus eksperimentinius bandymus su ląstelėmis ir nusifotografavus visus šulinėlius, ląstelės turi būti suskaičiuotos. Skaičiavimas atliekamas naudojantis kompiuterine programa ImageJ 1.48v. Į programą įkraunama nuotrauka, uždedamas tinklelis, kurio vieno kvadrato plotas yra 2,5 cm2.
Visoms nuotraukoms dedamas toks pats tinklelis ir skaičiuojamas visada tas pats plotas (1 pav. apibrėžta raudonu kvadratu). Skaičiuojamos gyvos, apoptotinės ir nekrozavusios ląstelės. Gyvos ląstelės yra tamsiai mėlynos, apoptotinės – žydros, nekrozavusios – raudonos (žr. 1 pav.). Suskaičiavus visas ląsteles iš visų šulinėlių, suskaičiuojamas jų vidurkis ir standartinis nuokrypis.
2.10. Duomenų analizė
Eksperimentinis optimizavimas atliktas, naudojant Design-Expert 6.0 paketą. Duomenų analizė atlikta naudojant statistinius duomenų analizės paketus: Microsoft Excel 2013 (15.0.4719.1000) ir SPSS 19.0.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Pastaruoju metu susidomėjimas fenoliniais junginiais ir juos kaupiančiomis žaliavomis ne tik kad yra išlikęs, bet yra vis didėjantis. Taip yra dėl fenolinių junginių plataus biologinio aktyvumo. Todėl yra svarbu išsiaiškinti kokius kiekius galima rasti skirtingai paruoštose propolio ekstraktuose. Tai įvertinus galima nustatyti kokios sąlygos ruošti ekstraktams yra ekonomiškiausios.
7 lentelėje pateikti duomenys rodo bendro fenolinių junginių kiekio pokyčius esant skirtingoms ekstraktų paruošimo sąlygoms.
7 lentelė. Bendri fenolinių junginių kiekiai pagal ekstrahentus ir tyrimų sąlygų numerius.
Eil. Nr. Ekstrahentas Vanduo 5 proc. etanolis 5 proc. propilenglikolis 5 proc. polietilenglikolis 400 Tyrimo Nr. 1. 7 11,033 31,469 51,2 24,088 2. 26 37,077 64,423 45,277 46,632 3. 27 32,97 79,189 44,519 65,209 4. 22 55,784 119,52 71,4 100,18 5. 23 10,726 36,684 34,793 31,516 6. 5 29,504 91,912 58,298 43,2622 7. 24 55,087 85,397 68,556 70,297 8. 12 127,69 303,67 88,302 185,15 9. 19 18,724 33,47 49,935 39,55 10. 13 20,217 88,354 78,454 55,976 11. 16 36,958 91,612 60,491 89,485 12. 2 67,374 139,76 128,5 141,97 13. 4 24,438 57,919 48,46 48,883 14. 10 25,694 86,663 82,537 147,44 15. 18 52,362 91,891 80,626 108,72 16. 17 104,6 184,96 167,84 185,31
17. 6 78,555 66,954 41,817 77,879 18. 1 73,728 108,52 80,946 131,5 19. 14 42,102 67,855 66,008 82,078 20. 8 82,317 91,354 99,594 90,173 21. 9 47,587 85,381 41,48 94,37 22. 3 65,306 108,81 62,84 93,724 23. 20 49,444 64,965 61,251 108,47 24. 15 79,092 107,62 90,674 114,21 25. 11 32,812 99,102 70,592 91,457 26. 25 57,395 116,85 77,973 123,55 27. 21 49,881 83,189 87,069 88,079 28. 30 61,021 103,58 65,98 103,77 29. 29 58,296 105,76 56,584 110,59 30. 28 53,901 77,361 74,438 72,51
7 – toje lentelėje matyti, kad bendras fenolinių junginių kiekis tarp visų ekstrahentų svyravo nuo 10,726 mkg/ml iki 303,67 mkg/ml. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, kai ekstrahentas buvo vanduo, yra 127,69 mkg/ml, mažiausias – 10,726 mkg/ml. Skirtumas tarp mažiausio ir didžiausio bendro fenolinių junginių kiekio yra 11,9 karto. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis, kai ekstrahentas buvo 5 proc. etanolis, yra 36,684 mkg/ml, didžiausias – 303,67 mkg/ml. Skirtumas siekia 8,28 karto. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis, kai ekstrahentas buvo 5 proc. propilenglikolis, yra 34,793 mkg/ml, didžiausias – 167,84 mkg/ml. Skirtumas tarp šių dydžių yra 4,82 karto. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis, kai ekstrahentas buvo 5 proc. polietilenglikolis, yra 24,088 mkg/ml, didžiausias – 185,31 mkg/ml, skirtumas – 7,69 karto.
2 pav. BFJ kiekiai ekstraktuose, kai medžiagos koncentracija 1 proc.
0 20 40 60 80 100 120 7 27 23 24 19 16 4 18 6 B en dr as f en olin ių j un gin ių k iek is m kg /m l Tyrimo nr.
1 proc. medžiagos koncentracija
2 – ame paveiksle pateikti bendro fenolinių junginių kiekio duomenys atitinkamai pagal medžiagos kiekį, kuris yra ekstrakte (1 proc. medžiagos – propolio). Stebima tendencija, kad gaminant ekstraktus pagal 7, 27, 23, 24, 19, 16, 4 ir 18 tyrimo sąlygas su vandeniu, bendras fenolinių junginių kiekis yra mažiausias (pvz. tyrimo Nr. 7 – 11,033mkg/ml), nei su kitais ekstrahentais (pvz. tyrimo Nr. 7 – 5 proc. etanolio – 31,469 mkg/ml, 5 proc. PG – 51,2 mkg/ml, 5 proc. PEG400 – 24,088 mkg/ml), tačiau didžiausias gaminant ekstraktus pagal 6 – to tyrimo sąlygas (vandens – 78,555 mkg/ml, 5 proc. etanolio – 66,954 mkg/ml, 5 proc. PG – 41,817 mkg/ml, 5 proc. PEG400 – 77,879 mkg/ml). Taip pat pastebima ir tai, kad atliekant tyrimus anksčiau minėtomis sąlygomis su 5 proc. etanoliu ir 5 proc. PEG400, ekstraktai turi didžiausius kiekius bendrų fenolinių junginių, išskyrus 19 – to tyrimo sąlygomis gamintus ekstraktus, kai didžiausią kiekį BFJ turi ekstraktas gamintas su propilenglikoliu (49,935 mkg/ml).
3 pav. BFJ kiekiai ekstraktuose, kai medžiagos koncentracija ekstrakte 5,5 proc.
3 – čiame paveiksle pateikti bendrų fenolinių junginių kiekiai, kai medžiagos koncentracija gaminant ekstraktus buvo 5,5 proc. Čia taip pat matoma tendencija, kad vandeniniuose ekstraktuose BFJ kiekiai yra mažiausi, lyginant su kitais trimis ekstrahentais. Ekstraktai gaminti su 5 proc. etanoliu ir 5 proc. PG turi didžiausius kiekius BFJ, išskyrus pagal 8 – to tyrimo sąlygas gamintus ekstraktus, kai vandeninis ekstraktas turi 82,317 mkg/ml BFJ, 5 proc. etanolio ekstraktas – 91,354 mkg/ml BFJ, 5 proc. PEG 400 – 90,173 mkg/ml BFJ, o didžiausią kiekį BFJ turi 5 proc. PG ekstraktas – 99,594 mkg/ml.
0 20 40 60 80 100 120 140 14 8 9 3 20 15 11 25 21 30 29 28 B en d ras f en o lin ių ju n g in ių k iek is m k g /m l Tyrimo nr.
5,5 proc. medžiagos koncentracija
4 pav. BFJ kiekiai ekstraktuose, kai medžiagos koncentracija ekstrakte 10 proc.
4 – ame paveiksle pateikti bendrų fenolinių junginių kiekiai gaminant ekstraktus su visais keturiais ekstrahentais ir medžiagos kiekiui (propoliui) esant 10 proc. Didžiausias BFJ kiekis buvo gautas atliekant gamybą pagal 12 – to tyrimo sąlygas su 5 proc. etanoliu – 303,67 mkg/ml. Gaminant ekstraktus su vandeniu, kai medžiagos kiekis yra 10 proc., BFJ kiekiai yra vėlgi mažiausi (nuo 20,217 mkg/ml (pagal 13 – to tyrimo sąlygas) iki 127,69 mkg/ml (pagal 12 – to tyrimo sąlygas)). Didžiausius BFJ kiekius turi 5 proc. etanoliniai ekstraktai, išskyrus pagal 10 – to ir 1 – mo tyrimo sąlygas gamintus ekstraktus (atitinkamai 86,663 mkg/ml ir 108,52 mkg/ml). Gaminant ekstraktus su 5 proc. PEG400, didžiausi BFJ kiekiai gauti 10 – to ir 1 – mo tyrimo sąlygomis (atitinkamai 147,44 mkg/ml ir 131,5 mkg/ml). Gaminant ekstraktus su 5 proc. propilenglikoliu BFJ kiekiai nebuvo mažiausi, tačiau nebuvo didesni nei 5 proc. etanolio ar 5 proc. PEG 400 gamintų ekstraktų turimų BFJ kiekiai.
Ekstraktų gamybos metu esant 25°C temperatūrai (5 pav.), vandeninių ekstraktų BFJ kiekiai yra mažiausi lyginant su kitais naudotais ekstrahentais. 5 proc. etanolio ekstraktai turėjo didžiausius BFJ kiekius prie 25°C temperatūros, kai ekstraktai buvo gaminti pagal 26 – to, 23 – čio, 5 – to, 13 – to ir 4 – to tyrimo sąlygas (atitinkamai 64,423 mkg/ml, 36,684 mkg/ml, 91,912 mkg/ml, 88,354 mkg/ml ir 57,919 mkg/ml). Gaminant ekstraktus su 5 proc. propilenglikoliu, didžiausias kiekis BFJ buvo gaminant ekstraktą pagal 7 – to tyrimo sąlygas (51,2 mkg/ml), o gaminant ekstraktus su 5 proc. PEG400 – didžiausi kiekiai BFJ buvo pagal 10 – to ir 14 – to tyrimo sąlygas pagamintuose ekstraktuose (147,44 mkg/ml ir 82,078 mkg/ml atitinkamai). 0 50 100 150 200 250 300 350 26 22 5 12 13 2 10 17 1 B en dr as f en olin ių j un gin ių k iek is m kg /m l Tyrimo nr.
10 proc. medžiagos koncentracija
5 pav. BFJ kiekiai ekstraktuose, kai temperatūra gamybos metu buvo 25°C.
Gaminant ekstraktus esant 37,5°C temperatūrai (6 pav.) vandeniniai ekstraktai turėjo mažiausius kiekius BFJ, išskyrus ekstraktą, gamintą pagal 6 – to tyrimo sąlygas, kuomet vandeniniame ekstrakte nustatyta 78,555 mkg/ml BFJ, kai 5 proc. etanolio ekstrakte rasta 66,954 mkg/ml, 5 proc. PG ekstrakte – 41,817 mkg/ml BFJ, 5 proc. PEG400 ekstrakte nustatyta 77,879 mkg/ml BFJ. Ekstraktai, gaminti 37,5°C temperatūroje su 5 proc. PEG400 pagal 1 – mo, 9 – to, 20 – to, 15 – to, 25 – to, 21 – mo, 30 – to ir 29 – to tyrimų sąlygas, lyginant su kitais ekstrahentais, turėjo didžiausius kiekius BFJ (atitinkamai 131,5 mkg/ml, 94,37 mkg/ml, 108,47 mkg/ml, 114,21 mkg/ml, 123,55 mkg/ml, 88,079 mkg/ml, 103,77 mkg/ml, 110,59 mkg/ml). Ekstraktai, gaminti su 5 proc. PG šioje ekstraktų grupėje nepasižymėjo didesniais BFJ kiekiais.
6 pav. BFJ kiekiai ekstraktuose, kai temperatūra gamybos metu buvo 37,5°C.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 7 26 23 5 19 13 4 10 14 B en dr as f en olin ių j un gin ių k iek is , m k g /m l Tyrimo Nr.
Technologinis rodiklis - 25°C temperatūra
Vanduo 5% etanolis 5% propilenglikolis 5% polietilenglikolis 400
0 20 40 60 80 100 120 140 6 1 9 3 20 15 11 25 21 30 29 28 B en dr as f en olin ių j un gin ių k iek is , m kg /m l Tyrimo Nr.
Technologinis rodiklis - 37,5°C temperatūra
Nustačius BFJ kiekius ekstraktuose, gamintuose esant 50°C temperatūrai (7 pav.), pastebėta, kad vandeniniai ekstraktai jų turėjo mažiausiai, lyginant su tomis pačiomis sąlygomis gamintais ekstraktais su kitais ekstrahentais. Daugiausiai BFJ rasta ekstraktuose, gamintuose su 5 proc. etanoliu, pagal 27 – to, 22 – to, 24 – to, 12 – to, 16 – to tyrimo sąlygas (atitinkamai 79,189 mkg/ml, 119,52 mkg/ml, 85,397 mkg/ml, 303,67 mkg/ml, 91,612 mkg/ml). Taip pat nemaži kiekiai BFJ rasta ir ekstraktuose, gamintuose su 5 proc. PEG400 pagal 2 – to, 18 – to, 17 – to tyrimo sąlygas (atitinkamai 141,97 mkg/ml, 108,72 mkg/ml, 185,31 mkg/ml). Atliekant 8 – tą tyrimą, didžiausią kiekį BFJ turėjo ekstraktas gamintas su 5 proc. PG (99,594 mkg/ml).
7 pav. BFJ kiekiai ekstraktuose, kai temperatūra gamybos metu buvo 50°C.
3.2. ESC analizės rezultatai
Norint ištirti kokias ir kiek fenolinių rūgščių galima rasti propolio ekstraktuose ir kaip kinta jų kiekis priklausomai nuo gamybos sąlygų ir ekstrahentų, buvo atlikta efektyvioji skysčių chromatografija (plačiau aprašyta tyrimo metodikos skyriuje, „Propolio ekstraktų analizė efektyviąja skysčių chromatografija“ skyrelyje). Gauti rezultatai pateikti 8 lentelėje.
0 50 100 150 200 250 300 350 27 22 24 12 16 2 18 17 8 B en dr as f en olin ių j un gin ių k iek is , m kg /m l Tyrimo Nr.
Technologinis rodiklis - 50°C temperatūra
8 lentelė. Bendras fenolinių rūgščių kiekis ekstraktuose. Eil. Nr. Ekstrahentas Vanduo 5 proc. etanolis 5 proc. propilenglikolis 5 proc. polietilenglikolis 400 Tyrimo Nr. 1. 7 5,085 17,826 18,679 12,967 2. 26 72,125 48,114 33,372 31,815 3. 27 24,503 53,348 31,671 61,131 4. 22 8,452 82,655 41,605 79,585 5. 23 6,525 29,035 24,074 20,461 6. 5 114,415 67,648 47,641 30,911 7. 24 50,291 60,421 58,87 55,599 8. 12 22,258 257,935 63,125 170,13 9. 19 10,059 24,048 20,779 20,73 10. 13 78,78 67,846 54,074 42,456 11. 16 28,97 53,72 34,33 49,025 12. 2 10,352 104,965 101,325 92,95 13. 4 18,527 35,623 29,091 40,117 14. 10 19,107 68,075 69,455 135,225 15. 18 46,912 55,01 54,56 68,38 16. 17 19,825 158,71 160,85 148,865 17. 6 249,255 35,285 21,175 57,054 18. 1 54,865 66,375 48,185 84,13 19. 14 39,33 56,531 54,981 54,981 20. 8 57,075 68,66 77,97 67,005 21. 9 40,594 57,142 27,7 56,71 22. 3 54,985 76,41 45,665 63,785 23. 20 42,454 58,468 54,882 43,91 24. 15 77,138 133,834 87,012 100,816 25. 11 33,342 76,813 48,025 59,57 26. 25 42,225 79,295 46,365 63,9 27. 21 33,545 56,485 53,645 72,612 28. 30 52,96 62,005 42,96 59,395 29. 29 42,615 68,58 39,28 72,82 30. 28 47,166 52,918 56,907 60,269
Pagal gautus duomenis matoma, kad bendras fenolinių rūgščių kiekis skiriasi, priklausomai nuo to, su kokiu ekstrahentu buvo atlikta ekstrakcija ir kokiomis tyrimo sąlygomis ji buvo atlikta.
3.3. Spektrofotometrinių ir chromatografinių rezultatų statistinė analizė
Pagaminus visus 120 ekstraktų ir ištyrus spektrofotometriniu ir chromatografiniu metodu, buvo vertinta rezultatų ir technologinių faktorių koreliacijos. Didžiausią įtaką fenolinių junginių išsiskyrimui iš propolio turi medžiagos kiekio ir ekstrahento santykis. Atliekant ekstrakciją su vandeniu, gautų duomenų statistinė analizė parodė, kad statistiškai reikšminga (p < 0,01) atvirkštinė koreliacija (r = -0,786) buvo tarp medžiagos kiekio ir ekstrahento santykio (toliau MKES) ir bendro fenolinių junginių kiekio (BFJ), taip pat statistiškai reikšminga (p < 0,01) atvirkštinė koreliacija ( r = -0,636) tarp MKES ir bendro fenolinių rūgščių kiekio, tarp MKES ir vanilo rūgšties kiekio ( r = -0,624), tarp MKES ir kavos rūgšties kiekio ( r = -0,631), tarp MKES ir vanilino ( r = -0,631), tarp MKES ir p-kumaro rūgšties kiekio ( r = -0,651) ir tarp MKES ir ferulo rūgšties kiekio ( r = -0,644) esančio ekstrakte. Šiuo atveju koreliacijos koeficientas r rodo vidutinio stiprumo koreliaciją. Statistiškai reikšminga (p < 0,05) buvo tiesioginė koreliacija ( r = 0,388) tarp temperatūros ir bendro fenolinių junginių kiekio. Statistiškai reikšmingų koreliacijų tarp kitų faktorių (trukmės ar purtymo greičio) nebuvo (9 lentelė).
9 lentelė. Vandeninio propolio ekstraktų gautų rezultatų ir technologinių faktorių koreliacijos.
Atlikus tyrimą su 5 proc. etanoliu gauti duomenys parodė, kad statistiškai reikšminga ( p < 0,01) atvirkštinė koreliacija (r = 0,830) yra tarp MKES ir BFJ, taip pat atvirkštinė koreliacija ( r = -0,776) tarp MKES ir bendro fenolinių rūgščių kiekio, atvirkštinė koreliacija ( r = -0,791) tarp MKES ir vanilo rūgšties, atvirkštinė koreliacija ( r = -0,721) tarp MKES ir kavos rūgšties, atvirkštinė koreliacija ( r = -0,810) MKES ir vanilino kiekio, atvirkštinė koreliacija ( r = -0,756) tarp MKES ir p-kumaro rūgšties kiekio, atvirkštinė koreliacija ( r = -0,741) tarp MKES ir ferulo rūgšties kiekio. Koreliacijos koeficientas rodo, kad tai stipri koreliacija. Taip pat nustatyta, kad gaminant ekstraktus su 5 proc. etanoliu statistiškai reikšminga ( p < 0,05) yra tiesioginė koreliacija tarp temperatūros ir bendro fenolinių rūgščių kiekio (r=0,373), kavos rūgšties kiekio (r=0,378), p-kumaro rūgšties kiekio (r=0,383) ir ferulo rūgšties kiekio (r=0,438) (10 lentelė).
10 lentelė. Propolio ekstraktų su 5 proc. etanoliu gautų rezultatų ir technologinių faktorių koreliacijos.
Kai ekstraktų gamybai naudotas 5 proc. propilenglikolio tirpalas, pastebėtos statistiškai reikšmingos ( p < 0,01) atvirkštinės koreliacijos (r = -0,830) tarp MKES ir BFJ, BFR (r = -0,820), vanilo rūgšties kiekio (r = -0,821), kavos rūgšties kiekio (r = -0,812), vanilino kiekio (r = -0,830), p-kumaro rūgšties kiekio (r = -0,825) ir ferulo rūgšties kiekio (r = -0,788). Nustatyta, kad su šiuo ekstrahentu duomenys tarp temperatūros ir anksčiau minėtų faktorių nėra statistiškai reikšmingi (11 lentelė).
11 lentelė. Propolio ekstraktų su 5 proc. propilenglikoliu gautų rezultatų ir technologinių faktorių koreliacijos.
Naudojant 5 proc. PEG400 ekstrahentą gaminti propolio ekstraktams, nustatyta statistiškai reikšminga (p < 0,01) atvirkštinė koreliacija (r = -0,860) tarp medžiagos ir ekstrahento santykio ir BFJ, BFR (r = -0,721), vanilo rūgšties kiekio (r = -0,726), kavos rūgšties (r = -0,625), vanilino (r = -0,726), p-kumaro rūgšties (r = -0,736), ferulo rūgšties (r = -0,679). Taip pat nustatyta, kaip ir su 5 proc. propilenglikoliu, kad nėra statistiškai reikšmingos koreliacijos tarp temperatūros ir jau paminėtų junginių. (12 lentelė)
12 lentelė. Propolio ekstraktų su 5 proc. PEG400 gautų rezultatų ir technologinių faktorių koreliacijos.
Taigi, gauti duomenys parodė, kad ekstraktų gamybai naudojant mažiausią medžiagos kiekį galima išgauti santykinai daugiausiai fenolinių junginių. Tai yra, naudojant mažą kiekį medžiagos, atliekama ekstrakcija yra efektyviausia ir ekstrakte randama daugiausia fenolinių junginių. Taip pat duomenys parodė, kad fenolinių junginių išskyrimui iš propolio įtakos turi temperatūra, tačiau tik naudojant vandenį ar 5 proc. etanolį. Ekstraktams, gamintiems su kitais dviem ekstrahentais, temperatūra įtakos neturėjo, nes nebuvo statistiškai reikšminga.
3.4. Optimalių ekstraktų spektrofotometrinė ir ESC analizė
Optimaliausios sąlygos naudojant vandenį kaip ekstrahentą: medžiagos koncentracija 9,2 proc., temperatūra – 37,5°C, purtymo greitis – 77 aps./min, trukmė – 44 min. Optimaliausios sąlygos naudojant 5 proc. etanolį kaip ekstrahentą: medžiagos kiekis – 10 proc., temperatūra - 48°C, purtymo greitis – 57 aps./min, trukmė – 53 min. Optimaliausios sąlygos naudojant 5 proc. propilenglikolio tirpalą kaip ekstrahentą: medžiagos koncentracija 10 proc., temperatūra – 50°C, purtymo greitis – 100 aps./min, trukmė – 55 min. Optimaliausios sąlygos naudojant 5 proc. polietilenglikolio tirpalą kaip ekstrahentą: medžiagos koncentracija 10 proc., temperatūra – 50°C, purtymo greitis – 100 aps./min, trukmė – 60 min. Taip pat programa nurodo kokie dydžiai prognozuojami atlikus spektrofotometrinę analizę ir ESC tyrimą (13 lentelė).
13 lentelė. Medžiagų kiekiai prognozuojami rasti optimaliuose propolio ekstraktuose.
Vanduo Etanolis PG PEG400
BFJ 60,93 206,79 164,26 175,79 Vanilo r. 19,22 28,94 25,52 27,56 Kavos r. 2,25 5,52 3,13 3,75 Vanilinas 31,85 33,99 39,71 39,4 p-Kumaro r. 34,49 58,27 49,28 58,1 Ferulo r. 19,13 33,42 27,48 32,38
Pagaminus optimalius ekstraktus, jie buvo tirti spektrofotometriniu ir ESC metodu, norint išsiaiškinti, ar teoriniai dydžiai atsikartoja praktikoje ir ar tikrai galima prognozuoti ekstraktų optimalumą (14 lentelė).
14 lentelė. Pagamintų optimalių propolio ekstraktų rezultatai.
Vanduo Etanolis PG PEG400 BFJ 69,339 155,22 168,18 240,84 Vanilo r. 10,686 17,265 20,015 29,545 Kavos r. 1,58 1,435 2,405 4,305 Vanilinas 16,743 29,355 31,88 47,72 p-Kumaro r. 17,63 39,605 47,715 75,015 Ferulo r. 9,344 21,36 25,52 41,085
Atlikus palyginimą prognozuojamų rezultatų su realiais eksperimento rezultatais, 15 – oje lentelėje matyti, kad rezultatai neatsikartoja, yra skirtumų.
15 lentelė. Prognozuojamų ir realių optimalių propolio ekstraktų tyrimų duomenys.
Vanduo,
Opt.
Vanduo, realus
Skirtumas,
kartai PG, Opt. PG, realus
Skirtumas, kartai BFJ 60,93 69,339 0,8787 164,26 168,18 0,9767 Vanilo r. 19,22 10,686 1,7986 25,52 20,015 1,2750 Kavos r. 2,25 1,58 1,4241 3,13 2,405 1,3015 Vanilinas 31,85 16,743 1,9023 39,71 31,88 1,2456 p-Kumaro r. 34,49 17,63 1,9563 49,28 47,715 1,0328 Ferulo r. 19,13 9,344 2,0473 27,48 25,52 1,0768 Etanolis, Opt. Etanolis, realus Skirtumas, kartai PEG400, Opt. PEG400, realus Skirtumas, kartai BFJ 206,79 155,22 1,3322 175,79 240,84 0,7299 Vanilo r. 28,94 17,265 1,6762 27,56 29,545 0,9328 Kavos r. 5,52 1,435 3,8467 3,75 4,305 0,8711 Vanilinas 33,99 29,355 1,1579 39,4 47,72 0,8256 p-Kumaro r. 58,27 39,605 1,4713 58,1 75,015 0,7745 Ferulo r. 33,42 21,36 1,5646 32,38 41,085 0,7881
Palyginant vandeninių ekstraktų optimalius prognozuojamus rezultatus (15 lentelė) ir realiai gautus po eksperimento, pastebima, kad BFJ kiekis gautas 0,8787 karto didesnis, nei buvo prognozuota, tačiau visų fenolinių rūgščių kiekiai gauti mažesni nei prognozuota (vanilo r. – 1,7986
karto, kavos r. – 1,4241 karto, vanilinas – 1,9023 karto, p-kumaro r. – 1,9563 karto, ferulo r. – 2,0473 karto). Palyginus 5 proc. etanolio ekstraktų prognozuotus rezultatus ir gautus realiai matyti, kad visi realūs rezultatai yra mažesni, kai kurie daugiau nei 3 kartus. Peržiūrėjus 5 proc. propilenglikolio ekstraktų gautus rezultatus ir palyginus su prognozuotais matoma, kad jie skiriasi, tačiau kai kurių rūgščių skirtumai nėra dideli. BFJ kiekis realiai gautas yra 0,9767 karto didesnis nei prognozuotas, bet visų fenolinių rūgščių kiekiai realiai gauti mažesni, nei prognozuoti. Pastebima ir tai, kad p-kumaro rūgšties ir ferulo rūgšties prognozuoti kiekiai ir gauti realiai kiekiai skiriasi atitinkamai tik 1,03 ir 1,07 karto, dėl to galima teigti, kad rezultatai sąlyginai atsikartoja prognozuotiems. Išanalizavus prognozuotus ir realiai gautus PEG400 ekstraktų duomenis pastebima tai, kad visi realiai gauti duomenys yra didesni nei buvo prognozuoti. Taip pat nustatyta, kad vanilo rūgšties ir kavos rūgšties realūs kiekiai nuo prognozuotų skiriasi atitinkamai 0,9328 ir 0,8711 karto, todėl galima teigti, kad skirtumas nėra didelis ir čia rezultatai sąlyginai atkartoja prognozuotus.
3.5. Tyrimo su HaCaT ląstelių linija rezultatai
Naudojant HaCaT ląstelių liniją, buvo tirta propolio ekstraktų citotoksiškumas ir apsauga nuo UVB pažaidos. Tiriant citotoksiškumą, ant ląstelių monosluoksnio buvo uždėta propolio ekstrakto po 2 µl ir 4 µl. Pagal gautus duomenis matyti (8 pav.), kad gyvų ląstelių skaičius, lyginant su kontrole, sumažėjo tik šulinėliuose su 2 µl etanolio. Su visais kitais ekstraktais ląstelių skaičius buvo lygus kontrolei arba didesnis. Apoptotinių ląstelių skaičius (9 pav.), lyginant su kontrole, buvo mažesnis, išskyrus PG 4 µl šulinėlį ir vandeninio ekstrakto 4 µl šulinėlį. Šiais dviem atvejais apoptotinių ląstelių skaičius buvo didesnis, nei kontrolės, tačiau nežymiai. Nekrozavusių ląstelių skaičius (10 pav.), lyginant su kontrole, buvo didesnis , išskyrus PG 2 µl šulinėlį, kur tokių ląstelių skaičius buvo dvigubai mažesnis. Tad galima teigti, kad propolio ekstraktai su visais ekstrahentais, nėra citotoksiški ir yra tinkami naudoti ant odos.
8 pav. Gyvų ląstelių skaičių vidurkis šulinėliuose su skirtingais ekstraktais ir jų kiekiais.
9 pav. Apoptotinių ląstelių skaičių vidurkis šulinėliuose su skirtingais ekstraktais ir jų kiekiais.
Atlikus pažaidos tyrimą su UV gauti rezultatai pateikti 11, 12, 13 paveiksluose. 11 – to pav. rezultatuose matyti, kad, lyginant su kontrole, gyvų ląstelių skaičius su visais ekstraktais buvo didesnis. Tai reiškia, kad dėl propolio ekstraktuose esančių fenolinių junginių ląstelės buvo apsaugotos nuo laisvųjų radikalų poveikio, pasireiškė propolio antioksidantinis poveikis. Išanalizavus apoptotinių ląstelių skaičių (12 pav.) matyti, kad, lyginant su kontrole, apoptotinių ląstelių skaičius buvo mažesnis, išskyrus PG 4 µl šulinėlį, tačiau skaičius nebuvo žymiai didesnis. Peržiūrėjus nekrozavusių ląstelių skaičius matyti (13 pav.), kad tik PEG400 4 µl ir PG 4 µl ekstraktų šulinėlių ląstelių skaičiai buvo mažesni nei kontrolės. Visų kitų ekstraktų šulinėlių ląstelių skaičiai buvo didesni.
Palyginus citotoksiškumo ir antioksidantinio poveikio tyrimų duomenis matyti, kad po UV pažaidos ląstelių skaičius sumažėjo daugiau nei 3 kartus. Tačiau žiūrint ląstelių kiekių vidurkius po pažaidos ir su ekstraktais matyti, kad ląstelių kiekiai yra didesni nei kontrolinių šulinėlių, todėl galima teigti, kad propolyje esantys fenoliniai junginiai apsaugo ląsteles nuo UV pažaidos.
1027,17 970,17 1103,50 1201,00 1246,00 1204,3 1233,50 1174,50 0,00 200,00 400,00 600,00 800,00 1000,00 1200,00 1400,00 Kontrolė Etanolis 2µl Etanolis 4µl PEG400 2µl PEG400 4µl PG 2µl PG 4µl Vanduo 4µl Gy vy bin gų ląst elių s kaičia us vid ur kis š ulin ėliu os e
Šulinėliai su skirtingais ekstraktais ir jų kiekiais
13,33 12,17 11,00 9,67 12,67 8,0 17,50 14,17 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 Kontrolė Etanolis 2µl Etanolis 4µl PEG400 2µl PEG400 4µl PG 2µl PG 4µl Vanduo 4µl A po pto tin ių ląst elių s kaičia us vid ur kis š ulin ėliu os e
10 pav. Nekrozavusių ląstelių skaičių vidurkiai šulinėliuose su skirtingais ekstraktais ir jų kiekiais.
11 pav. Gyvų ląstelių skaičių vidurkiai po pažaidos šulinėliuose su skirtingais ekstraktais ir jų kiekiais.
12 pav. Apoptotinių ląstelių skaičių vidurkiai po pažaidos šulinėliuose su skirtingais ekstraktais ir jų kiekiais. 3,83 5,67 6,50 5,67 5,00 2,0 7,67 6,17 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 Kontrolė Etanolis
2µl Etanolis4µl PEG4002µl PEG4004µl PG 2µl PG 4µl Vanduo 4µl
Nek ro za vu sių ląst elių s kaičia us vid ur kis š ulin ėliu os e
Šulinėliai su skirtingai ekstraktais ir jų kiekiais
305,83 365,33 358,17 360,50 378,50 389,50 394,83 368,00 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 Kontrolė Etanolis 2µl Etanolis 4µl PEG400 2µl PEG400 4µl PG 2µl PG 4µl Vanduo 4µl Gy vų ląst elių s kaičia us vid ur kiai šu lin ėliu os e
Šulinėliai su skirtingais ekstraktais ir kiekiais
144,17 139,00 130,50 143,83 115,83 138,67 147,83 129,50 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 140,00 160,00 Kontrolė Etanolis 2µl Etanolis 4µl PEG400 2µl PEG400 4µl PG 2µl PG 4µl Vanduo4µl A po pto tin ių ląst elių s kaičių s vid ur kiai šu lin ėliu os e
