FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
EGIDIJUS OKUNIS
NIKOTINO IR KOTININO NUSTATYMAS RŪKANČIŲJŲ SEILĖSE CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. Dr. D. Kazlauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU
Farmacijos fakulteto dekanas Prof. Dr. Vitalis Briedis
2016 m. birželio mėn. ___ d.
NIKOTINO IR KOTININO NUSTATYMAS RŪKANČIŲJŲ SEILĖSE CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Daiva Kazlauskienė
2016 m. birželio mėn. ___ d.
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas Egidijus Okunis 2016 m. birželio mėn. ___ d.
2016 m. birželio mėn. ___ d.
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ...101.1. Rūkymo paplitimas pasaulyje ...10
1.2. Rūkymo žala žmogaus organizmui ...10
1.3. Cheminiai procesai vykstantys degant cigaretei ...12
1.4. Nikotinas ir jo farmakokinetika ...12
1.5. Kotininas ir jo farmakokinetika ...14
1.6. Nikotino ir kotinino metabolizmą ir šalinimą veikiantys faktoriai ...15
1.7. Rūkymo biožymenų palyginimas ...16
1.8. Seilės ir jų savybės ...17
1.9. Seilių surinkimo būdai ...17
1.10. Analizės metodai, taikomi nikotino ir kotinino įvertinimui ...18
1.11. Dujų chromatografija su masių spektrometru ...18
1.12. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC) ...19
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 20
2.1. Tyrimo objektai ...20
2.2. Tyrimo medžiagos ir reagentai ...20
2.3. Naudota aparatūra ...20
2.4. Tiriamųjų mėginių paruošimas ...21
2.5. Nikotino ir kotinino kokybinis ir kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) metodu ...22
2.6. Nikotino kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodu ...23
2.7. Statistinės analizės metodai ...23
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 24
3.1. Nikotino ir kotinino identifikavimas taikant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą ... 24
3.2. Ekstrakcijos metodo parinkimas nikotino ir kotinino įvertinimui seilių mėginiuose ... 25
3.4. Nikotino ir kotinino identifikavimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu .. 33
3.5. Kiekybinė tabako analizė ... 34
IŠVADOS ... 38
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
SANTRAUKA
E. Okunio magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė Doc. dr. D. Kazlauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas, 2016.
Darbo tikslas: Atlikti kokybinę ir kiekybinę nikotino ir kotinino analizę rūkančiųjų seilėse plonasluoksnės ir dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodais.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti tinkamiausią metodą nikotino ir kotinino išskyrimui iš seilių.
2. Atlikti nikotino ir kotinino kokybinę ir kiekybinę analizę seilių mėginiuose efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos ir dujų chromatografijos metodais. 3. Parinkti tinkamiausią tirpiklių sistemą ir ryškinimo būdą efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodui.
4. Įvertinti, ar seilėse aptinkamo nikotino ir kotinino chromatografinė analizė yra patikimas būdas atskirti rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų.
Tyrimo objektas: rūkančiųjų ir nerūkančiųjų suaugusių žmonių seilės ir cigaretės.
Metodai: skystis – skystis ekstrakcija, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, dujų chromatografija – masių spektrometrija.
Rezultatai ir išvados: Atlikus ekstrakcijas seilių mėginiuose nustatyta, kad tinkamiausias ekstrahentas yra dichlormetanas bei prieš atliekant seilių ekstrakciją būtinas žmogaus seilių centrifugavimas. Vertinant nikotiną ir kotininą efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, buvo pasirinkta tinkamiausia tirpiklių sistema, susidedanti iš etilacetato, metanolio ir amoniako tirpalo (85:10:5, v/v). Dėmės ryškinamos UV šviesoje. Vykdant efektyviąją plonasluoksnę chromatografiją nikotinas ir kotininas seilėse nebuvo identifikuotas, nes metodas pasižymi mažesniu jautrumu lyginant su dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu. Tačiau metodas buvo pritaikytas kokybiškai ir kiekybiškai įvertinti nikotiną tabake. Vienoje cigaretėje buvo nustatyta vidutiniškai 13,3 ± 0,41 mg nikotino. Atlikus kiekybinę nikotino ir kotinino analizę iš seilių mėginių dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu nustatyta, kad nikotino didžiausia koncentracija nustatoma popietinėje paros dalyje (15 val.), o kotinino – vakarinėje paros dalyje (21 val.). Dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodas tinka nustatyti itin mažas nikotino ir kotinino koncentracijas žmogaus seilėse. Dėl to šiuo metodu įmanoma nustatyti, ar tiriamasis asmuo yra rūkantis. Tačiau dėl rezultatų tikslumo būtina įvertinti abu biožymenis (nikotiną ir kotininą).
SUMMARY
Okunis E. master’s thesis/ supervisor D. Kazlauskienė PhD, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas, 2016
Aim: To assess quality and quantity of nicotine and cotinine in smokers’ saliva using thin layer chromatography and gas chromatography – mass spectrometry.
Objectives:
1. To select the best method for nicotine and cotinine extraction from saliva.
2. To qualitatively and quantitatively determine nicotine and cotinine in saliva samples using high performance thin layer chromatography and gas chromatography – mass spectrometry.
3. To pick the best solvent system and visualisation method for high performance thin layer chromatography.
4. To evaluate if chromatographic analysis of nicotine and cotinine in saliva is a reliable method for seperating smokers from nonsmokers.
Object: saliva from smokers and nonsmokers, cigarettes.
Methods: liquid – liquid extraction, high performance thin layer chromatography, gas chromatography – mass spectrometry.
Results and conclusions: After extraction of saliva samples we determined that the best extracting solvent is dichlormethane. We also noticed that it is important to centrifugate saliva samples before extraction procedure. For analysis of nicotine and cotinine by high performance thin layer chromatography we chose solvent system consisting of ethyl acetate, methanol and ammonia solution (85:10:5, v/v). Spots on plates were visualised under UV light. Nicotine and cotinine hasn‘t been identified using high performance thin layer chromatography presumably because this method isn‘t sensitive enough to assess small concentrations. This method was used to determine quality and quantity of nicotine in cigarette tobacco. We found averagely 13,3 ± 0,41 mg of nicotine in one cigarette. After quantitative nicotine and cotinine analysis in saliva extracts by gas chromatography – mass spectrometry we determined that the highests concentrations of nicotine and cotinine in saliva can be found at 15 o‘clock and at 21 o‘clock, respectively. Because gas chromatography – mass spectrometry enables to assess small concentrations of nicotine and cotinine this method can be used seperating smokers from nonsmokers. For the most accurate findings it is best to assess both nicotine and cotinine.
SANTRUMPOS
EPC Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija;
DC – MS Dujų chromatografija – masių spektrometrija;
m/z Molekulinių jonų masių ir jų krūvių santykis
PSO Pasaulinė sveikatos organizacija;
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, 2012 metais, globaliai, tabako produktus rūkė 21 proc. 15-os ar vyresnio amžiaus žmonių [1]. Kasmet skaičiuojama, kad miršta apie 6 milijonai žmonių dėl pasyvaus ir aktyvaus rūkymo sukeltų ligų. Ši statistika kelia nerimą, nes tabako rūkymas yra vienintelė mirties priežastis, kuri gali būti išvengiama, tačiau nusineša daugiau gyvybių nei ŽIV/AIDS ir maliarija kartu sudėjus [3]. Rūkymas gali pažeisti beveik kiekvieną kūno organą ir jų sistemą: jis didina riziką išsivystyti piktybiniams navikams, pažeidžia imuninę, širdies ir kraujagyslių, kvėpavimo, reprodukcinę sistemas [6].
Dėl šių priežasčių sveikatos draudimo kompanijos domisi ar rūko jų klientai; darbdaviai klausia apie rūkymą, savo darbuotojų, o tėvai – vaikų. Degant tabako produktui žmonės įkvepia į plaučius nikotiną – alkaloidą, randamą tabako lapuose. Pastoviai rūkantieji turi didesnius šio junginio kiekius nei nerūkantieji. Todėl tam tikros nikotino koncentracijos buvimas žmogaus organizme gali reikšti, kad tiriamas žmogus rūko tabako gaminius. Tačiau nikotinas turi trumpą (2 val.) pusinės eliminacijos laiką ir jo egzistavimas žmoguje gali parodyti, ar jis rūkė per paskutines keliolika valandų [27, 28].
Organizme ilgiau užsilieka nikotino metabolitas – kotininas (pusinės eliminacijos laikas – 16 val.). Jo nustatymas tiriamojo žmogaus organizme įrodo ilgalaikį tabako dūmų poveikį. Taigi abiejų rūkymą įrodančių junginių, nikotino ir kotinino, analizė gali pasitarnauti atskiriant rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų [27, 28].
Nikotinas ir kotininas gali būti randamas žmogaus biologiniuose skysčiuose: kraujo plazmoje, šlapime, seilėse. Seilės išsiskiria iš išvardintų bioskysčių, nes jas lengva paimti iš žmonių, tai yra neinvazinis ir nebrangus metodas, nes tiriamieji, duodami seilių, nepatiria žalos ir šis metodas jiems nesukelia nepatogumų [31].
Seilėse esančių nikotino ir kotinino kokybinei ir kiekybinei analizei naudojama daugybė skirtingų metodų. Vienas iš paprasčiausių analitinių metodų yra plonasluoksnė chromatografija, o vienas tiksliausių – dujų chromatografija [36, 37].
Šiame darbe buvo pasirinkta atlikti seilėse esančių nikotino ir kotinino, kokybinę ir kiekybinę analizę, pasitelkus efektyviąją plonasluoksnę chromatografiją ir dujų chromatografiją – masių spektrometriją.
Darbo tikslas: Atlikti kokybinę ir kiekybinę nikotino ir kotinino analizę rūkančiųjų seilėse plonasluoksnės ir dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodais.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti tinkamiausią ekstrakcijos metodą nikotino ir kotinino išskyrimui iš seilių; 2. Atlikti nikotino ir kotinino kokybinę ir kiekybinę analizę seilių mėginiuose
efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos ir dujų chromatografijos metodais; 3. Parinkti tinkamiausią tirpiklių sistemą ir ryškinimo būdą efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos metodui;
4. Įvertinti, ar seilių nikotino ir kotinino chromatografinė analizė yra patikimas būdas atskirti rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų.
Raktiniai žodžiai: nikotinas, kotininas, ekstrakcija, seilės, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija, dujų chromatografija – masių spektrometrija.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Rūkymo paplitimas pasaulyje
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis (PSO), 2012 metais globaliai tabako produktus rūkė 21 proc. 15-os ar vyresnio amžiaus žmonių. Rūkantieji vyrai sudarė 36 proc. visų vyrų, o rūkančiųjų moterų buvo 7 proc. Daugiausia vyrų rūkė Vakarų Ramiojo vandenyno regione – 48 proc., o daugiausia moterų rūkė Europoje – 19 proc. [1]. Beveik 80 proc. pasaulio rūkančiųjų gyvena silpnos ir vidutinės ekonomikos šalyse [2]. Ši statistika kelia nerimą, nes tabako rūkymas yra vienintelė mirties priežastis, kuri gali būti išvengiama, tačiau nusineša daugiau gyvybių nei ŽIV/AIDS ir maliarija kartu sudėjus. Vien XX amžiuje dėl rūkymo mirė 100 milijonų žmonių, o XXI a., jei nebus imamasi rimtesnių rūkymo problemos sprendimų, spėjama, kad mirs apie vieną milijardą žmonių. Kasmet skaičiuojama, kad miršta apie 6 milijonus žmonių, iš kurių 600 tūkstančių – dėl pasyvaus rūkymo. Manoma, kad 2030 metais dėl rūkymo mirs daugiau nei 8 milijonai žmonių [3]. Nustatyta, kad rūkantieji miršta bent jau dešimt metų anksčiau nei nerūkantieji, o nustojus rūkyti ir esant 60, 50, 40 ar 30 metų amžiaus, gyvenimą galima prailginti atitinkamai iki 3, 6, 9 ar 10 metų [4]. Taip pat yra apskaičiuota, kad surūkyta viena cigaretė gali sutrumpinti gyvenimą apie 11 minučių [5].
1.2. Rūkymo žala žmogaus organizmui
Tabako rūkymas gali pažeisti beveik kiekvieną kūno organą ir jų sistemą: jis didina riziką išsivystyti piktybiniams navikams, pakenkia kaulams, pažeidžia imuninę, širdies ir kraujagyslių, kvėpavimo, reprodukcinę sistemas, sukelia regos ir kitas komplikacijas [6].
Rūkymas skatina piktybinių auglių atsiradimą organizme. Jungtinėse Amerikos Valstijose nustatyta, kad viena iš trijų mirčių, sukeltų vėžio, yra susijusi su kancerogeniniu rūkalų poveikiu. Taip pat nustatyta, kad iš dešimties rūkymo indukuotų vėžio atvejų devyni – plaučių navikai. Tabako gaminių rūkymas neigiamai sąveikauja su vėžio gydymu. Pastebėta, kad didesnė rizika onkologinių ligų paūmėjimui ar atsinaujinimui aptinkama pas onkologinius ligonius ar išgijusius nuo vėžio, kurie vis dar rūko tabako gaminius [7]. Rūkymas taip pat sukelia inkstų vėžį. Ištirta, kad 20 procentų visų inkstų karcinomos atvejų priežastis yra cigarečių rūkymas [8]. Tabako rūkymas ne tik kelia pavojų išsivystyti inkstų vėžiui. Nustatyta, kad daug rūkantys asmenys turi didesnę riziką susirgti lėtiniu inkstų nepakankamumu, o ypač hipertenzine ar diabetine nefropatija [19]. Rūkantiems žmonėms gali išsivystyti gerklų vėžys, kuris labiausiai paplitęs Vakarų pasaulio šalyse [9].
Taip pat rūkantieji gali susirgti galvos ir kaklo srities vėžiu. Net 85 proc. vėžio atvejų registruojama dėl rūkymo sukeltos žalos. Pastebėta, kad rizikos susirgti vėžiu turi ir nerūkantys žmonės, ilgai būnantys prirūkytose patalpose ar pasyviai rūkantys [10]. Tyrimais nustatyta, kad rūkymas sukelia ir šlapimo pūslės vėžį. Šis žalingas įprotis, rūkantiems vyrams sukelia net 66 proc. visų pūslės vėžio atvejų, o rūkančioms moterims - 30 proc. [11]. Tabako produktų rūkymas ar tabako kramtymas gali būti stemplės vėžio priežastimi. Jei asmuo surūko per dieną bent vieną pakelį cigarečių, rizika išsivystyti stemplės adenokarcinomai padidėja daugiau nei 2 kartus, palyginus su nerūkančiais žmonėmis [12]. Nustatyta, kad rūkantiesiems, net 75 proc. padidėja rizika išsivystyti kasos vėžiui, lyginant su nerūkančiais asmenimis. Ši rizika išlieka mažiausiai 10 metų po rūkymo nutraukimo [13]. Taip pat tabako rūkymas gali sukelti skrandžio vėžį. Rūkantiems šis auglys išsivysto 1,5-1,6 karto dažniau negu nerūkantiems [14]. Beje, aktyviai ar pasyviai rūkydamos moterys rizikuoja susirgti gimdos kaklelio vėžiu [15]. Yra įrodymų, kad rūkymas didina riziką išsivystyti mieloidinei leukemijai, kepenų, storosios žarnos, tulžies pūslės, antinksčių ir plonosios žarnos vėžiui [14].
Lėtinė obstrukcinė plaučių liga (LOPL) yra ketvirtoje vietoje pagal mirčių skaičių Europoje ir JAV. Nors rūkymas ne visada priskiriamas prie LOPL išsivystymo (20 proc. LOPL atvejų nesusiję su rūkymu), vis tiek manoma, kad vienas iš svarbiausių rizikos faktorių susirgti šia liga yra tabako gaminių rūkymas. Rūkantys pypkes ir cigarus, turi didesnę riziką susirgti nei cigarečių mėgėjai. Beveik pusei asmenų, rūkančių cigaretes, išsivysto kvėpavimo takų obstrukcija, 10-20 proc. – LOPL. Taip pat, nustatyta, kad ir pasyvus rūkymas didina riziką susirgti LOPL. Pastebėtas ryšys tarp rūkančių mamų ir jų naujagimių plaučių funkcijos: kūdikiai ir vaikai gali turėti suprastėjusią kvėpavimo funkciją, jei mamos rūkė per nėštumą ir po jo [16]. Rūkymas laikomas rizikos faktoriumi susirgti plaučių infekcijomis, dėl šio žalingo įpročio neigiamo poveikio kvėpavimo takų gynybinėms funkcijoms. Rūkoriai dažniau serga peršalimo ligomis, gripu, plaučių uždegimu, tuberkulioze, varicella pneumonija [17].
Rūkymas yra svarbus rizikos faktorius, turintis įtakos susirgti širdies ir kraujagyslių sistemos ligomis. Rūkant kyla rizika susirgti ateroskleroze, ko pasekoje gali išsivystyti hipertenzija, širdies funkcijos nepakankamumas, periferinė arterijų liga, aritmijos, koronarinė širdies liga, miokardo infarktas ar insultas [18].
Tabako gaminių mėgėjams yra padidėjusi rizika susirgti burnos ligomis grupėje. Nerūkomos tabako formos (kramtomas tabakas), sąlyčio vietoje su burnos gleivine, gali sukelti gleivinės pažeidimus (50-60 procentų vartotojų) ir dantenų recesiją (25-30 procentų vartotojų). Rūkamų tabako formų (cigaretės) vartotojams tris kartus dažniau išsivysto periodontitas nei nerūkantiems žmonėms, o rūkančiųjų periodonto gydymo rezultatai – 2 kartus prastesni nei nerūkančiųjų [20]. Taip pat rūkymas gali sukelti burnos kandidozę, leukoplakiją (baltos apnašos), dantų dėmes ar dantų spalvos pokyčius bei halitozę (blogą burnos kvapą) [21].
Taip pat nustatyta, kad daug rūkantiems asmenims (daugiau nei 20 cigarečių per dieną), 3 kartus daugiau šansų, kad iškris dantys nei nerūkantiesiems asmenims [22].
Rūkymas vyrams gali sukelti erekcijos disfunkciją ir impotenciją [23]. Rūkančios moterys rizikuoja savo vaisingumu. Tabakas turi žalingą poveikį kiaušidėms, dėlto gali sukelti moterims nevaisingumą [24].
1.3. Cheminiai procesai vykstantys degant cigaretei
Rūkstant cigaretei vyksta daugybė cheminių ir fizinių procesų. Degančioje cigaretėje yra sritys, kuriose vyksta degimo ir pirolizės/distiliacijos/pirosintezės reakcijos. Degimo srityje deguoniui reaguojant su tabaku susidaro anglies monoksidas, anglies dioksidas ir vandenilis. Daugiausia visų cheminių junginių susidaro vėsesnėje pirolizės/distiliacijos/pirosintezės zonoje. Judant medžiagų srovei cigarete iš minėtų sričių link filtro, junginiai susikondensuoja į aerozolio daleles. Cigarečių dūmus sudaro skystų lašelių aerozolis (dalelių fazė), kuris yra suspenduotas dujų ir pusiau lakių junginių mišinyje [25]. Dūmuose gali būti susidarę daugiau nei 7000 cheminių junginių. Nustatyta, kad 93 iš jų, sukelia anksčiau minėtas ligas, o 69 iš šių 93 junginių yra kancerogenai [26]. Kietųjų dalelių fazę sudaro tokie junginiai kaip policikliniai aromatiniai angliavandeniliai, nitrozaminai, fitosteroliai ir metalai. Pusiau lakiuosiuose junginiuose galima rasti fenolių ir krezolių, o dujinėje fazėje - anglies dioksidą, monoksidą, azoto oksidą, 1,3-butadieną, formaldehidą, acetaldehidą, akroleiną, benzeną ir vandenilio cianidą [25].
1.4. Nikotinas ir jo farmakokinetika
Nikotinas - pagrindinis tabako (lot. Nicotiana) genties augalų lapuose randamas alkaloidas. Augalams jis reikalingas, nes atlieka insekticido funkciją. Nikotinas sudaro apie 1,5 proc. visos cigarečių, pypkių ir uostomojo tabako masės ir 95 proc. visų juose randamų alkaloidų. Cigarai ir kramtomasis tabakas turi perpus mažiau nikotino nei anksčiau minėtos tabako formos. Vidutinė tabako suktinė gali turėti apie 10-14 mg nikotino, tačiau organizmas pasisavinti gali tik apie 1-1,5 mg. Tabake randamas nikotinas dažniausiai būna kairiojo sukimo (S)-izomeras, o (R)-nikotinas sudaro 0,1-0,6 proc. viso nikotino kiekio [27, 28].
Iš antraeilių alkaloidų tabake dominuoja nornikotinas, anatabinas ir anabazinas. Tabake ir jo dūmuose dar randama anabazino ir anatabino N’-metil darinių.
Taip pat nustatyta, kad mažuma alkaloidų tokių, kaip miozminas, N’-metilmiozminas, kotininas, nikotirinas, nornikotirinas, nikotino N’-oksidas, 2,3’-bipiridilas ir metanikotinas, tabake atsiranda dėl bakterijų ir oksidacijos apdorojant tabaką, o ne dėl natūralių biosintezės procesų augant augalui [27, 28].
Degant tabakui nikotinas išsidistiliuoja iš jo ir patenka ant dervų lašelių (kietųjų dalelių). Šios įkvepiamos ir nikotinas absorbuojasi per biologines membranas. Absorbcija priklauso nuo pH. Šis alkaloidas yra silpna bazė, nes turi pKa 8.0. Jonizuotoje formoje, t.y. rūgštinėje aplinkoje, nikotinas
sunkiai pereina per membranas. Nustatyta, kad cigarečių kietųjų dalelių pH varijuoja nuo 6.0 iki 7.8, dėl to nikotino absorbcija burnoje gali skirtis priklausomai nuo cigarečių rūšies. Patekęs į plaučių alveoles nikotinas greitai absorbuojasi į kapiliarus, o koncentracijos pikas kraujyje pasiekiamas pabaigus rūkyti. Gerą absorbciją plaučiuose lemia didelis paviršiaus plotas alveolėse, siauri kvėpavimo takai ir šarminis (pH 7,4) plaučių skystis, kuriame ištirpsta nikotinas prieš patenkant į kraują. Rūkant žmogaus organizmas sistemiškai absorbuoja 80 – 90 proc. įkvėpto nikotino, t.y. apie 1 mg nikotino. Ištirta, kad dėl pasyvaus rūkymo moterys absorbuoja 60 – 80 proc. inhaliuoto nikotino. Po įkvėpimo nikotinas pasiekia smegenis per 10 - 20 sekundžių, greičiau nei po intraveninės injekcijos. Dėl to rūkantysis gali kontroliuoti pasisavinamo nikotino kiekį, keisdamas dūmų įtraukimo dažnį ir intensyvumą [27, 28].
Skrandyje nikotinas prastai absorbuojasi, nes rūgštinėje aplinkoje alkaloidas jonizuojasi, tačiau geriau absorbuojasi plonojoje žarnoje, kadangi ten didesnis paviršiaus plotas ir aukštesnis pH. Pavartojus nikotino per burną, jo biopasisavinimas yra 20 – 45 proc., koncentracijos pikas kraujyje pasiekiamas per valandą. Kotininas pasižymi didesniu poliškumu, dėlto metabolizuojamas lėčiau [27, 28].
Dėl bazinių savybių nikotinas lengvai prasiskverbia per odą. Dėl šios savybės egzistuoja nikotino transderminiai pleistrai, skirti padėti mažinti ir mesti rūkyti. Paskaičiuota, kad nikotinas iš pleistro per odą į kraujotaką patenka per valandą [27, 28].
Nikotino, patekusio į kraują, kur pH siekia 7,4, jonizuoto būna 69 proc., o nejonizuoto - 31 proc. Su plazmos baltymais jungiasi mažiau nei 5 proc. alkaloido. Pasiskirstymo tūris - 2,2-3,3 l/kg. Nikotino daugiausia lokalizuojasi kepenyse, inkstuose, blužnyje, plaučiuose, o mažiausiai – riebaliniame audinyje. Kotinino didžiausia koncentracija randama kepenyse. Skeleto raumenyse nikotino ir kotinino būna beveik tiek pat, kiek ir kraujyje. Nikotinas turi didelį giminingumą smegenų audiniams, be to pas rūkančiuosius daugiau nikotino gali susijungti su receptoriais, nes būna padidėjęs nikotino acetilcholinerginių receptorių kiekis. Taip pat pastebėta, kad nikotinas kaupiasi skrandžio sultyse ir seilėse. Ištirta, kad rūkančiųjų nikotino skrandžio sulčių/plazmos ir seilių/plazmos koncentracijų santykiai yra 53 ir 87. Tai grindžiama tuo, kad skrandžio sultyse ir seilėse vyksta nikotino jonų sulaikymas [27, 28].
Nikotinas gali lengvai pereiti placentą, dėlto nikotino randama 15 proc. daugiau vaisiaus kraujotakoje ir 88 proc. daugiau amniono skystyje nei mamos plazmoje. Beje, nikotino dar randama ir mamos piene [29].
Pas rūkančiuosius nikotino koncentracija kraujyje gali varijuoti nuo 10 iki 50 ng/ml. Koncentracijos maksimumas pasiekiamas pabaigus rūkyti tabaką ir staigiai mažėja per ateinančias 20 min. Nikotino plazmos pusinės eliminacijos laikas – 2 val. Nustatyta, kad nikotinas organizme aptinkamas 6-8 val. po paskutinės surūkytos cigaretės [27, 28].
1.5. Kotininas ir jo farmakokinetika
Kotinino rūkančiųjų kraujyje būna žymiai daugiau nei nikotino - 250-300 ng/ml. Taip pat jis organizme išlieka ilgiau nei nikotinas, kadangi eliminacijos puslaikis – 16 val. Tai aiškinama tuo, kad nikotinas ilgai atsipalaiduoja iš audinių ir tik tada jis metabolizuojasi į kotininą. Dėl to kotinino koncentracijos svyravimai yra mažesni nei nikotino. Kotinino koncentracija kyla stabiliai nuo dienos pradžios, pasiekia piką dienos pabaigoje, ir ne maža koncentracija išlieka per naktį. Taigi dėl šios priežasties kotininas dažniau nei nikotinas, naudojamas kaip rūkymo nustatymo biomarkeris. Nustatyta didelė koreliacija tarp plazmos, seilių ir šlapimo kotinino koncentracijų [27, 28].
Nikotinas metabolizuojamas kepenyse. 70-80 proc. viso nikotino paverčiama į kotininą. Šis metabolitas gaunamas tarpininkaujant CYP2A6 ir citoplazmos aldehido oksidazės fermentams. 4-7 proc. nikotino metabolizuojama į nikotino N’-oksidą. Šią reakciją katalizuoja flavino turinti oksigenazė – 3. Gautas metabolitas toliau neskaidomas, o tik gali būti redukuojamas atgal į nikotiną. Šis procesas pailgina nikotino gyvavimą organizme. 3-5 proc. nikotino glukuronizuojama į nikotino glukuronidą, kuris išskiriamas su šlapimu. Žmogaus organizme nikotinas dar metabolizuojamas į nornikotiną. Tačiau 40 proc. šlapime randamo nornikotino atsirado tiesiai iš tabako lapų, o ne iš nikotino skaidymo kepenyse [27, 28].
Kaip minėta anksčiau, 70-80 proc. nikotino, metabolizuojama kotinino metabolizmo keliu, bet tik 10-15 proc. absorbuoto nikotino randama nepakitusio kotinino pavidalu šlapime. Taip yra dėl to, kad kotininas dar metabolizuojamas į kitus metabolitus: trans-3’-hidroksikotininą (33-40 proc. metabolizuojamo kotinino), kotinino glukuronidą (12-17 proc.), trans-3’-hidroksikotinino glukuronidą (7-9 proc.), 5’-hidroksikotininą, kotinino N’-oksidą, norkotininą [27, 28].
Paskaičiuota, kad žmogaus organizme nikotino klirenso greitis siekia 1200 ml/min. Ne inkstų klirensas, atitinka 70 proc. kepenų kraujotakos, atsižvelgiant į tai, kad beveik visas nikotinas metabolizuojamas kepenyse. Taip pat, 70 proc. alkaloido iš kraujo ekstrahuojama kiekvieną kartą kraujui pereinant per kepenis.
Kotinino metabolizmas daug lėtesnis, dėlto ir klirensas siekia tik 45 ml/min [27, 28].
Nikotino metabolizmo greitį nulemia kepenų kraujotakos intensyvumas. Nustatyta, kad dėl prastesnės kepenų kraujotakos, senyvo amžiaus žmonių (>65 metai) nikotino klirensas yra 23 proc. mažesnis lyginant su jaunesniais rūkančiais asmenimis. Hepatinė kraujotaka dar suprastėja miegant, dėl to nikotino klirensas irgi sulėtėja. Jei žmogus pavalgė, kepenų kraujotaka gali suaktyvėti 30 proc. ir anksčiau įsisavinto nikotino metabolizmas gali būti pagreitėjęs [27, 28].
1.6. Nikotino ir kotinino metabolizmą ir šalinimą veikiantys faktoriai
Lytis turi įtakos esminių tabake randamų alkaloidų metabolizmui. Nustatyta, kad nikotino ir kotinino klirensas atitinkamai yra 13 ir 24 proc. didesnis moterims nei vyrams. Nikotino ir kotinino klirensas nėščiosioms būna atitinkamai 60 ir 140 proc. didesnis nei pagimdžiusioms moterims. Kadangi nikotino metabolizmas labiau priklauso nuo kepenų kraujotakos, o kotinino - nuo kepenų fermentų, galima teigti, kad kotinino klirenso didesnį suintensyvėjimą lemia moteriškų lytinių hormonų (progesterono ir estrogenų) indukuotas CYP2A6 akyvumas. Estrogenų yra geriamuosiuose kontraceptikuose, todėl jų vartojimas gali paspartinti 28 proc. nikotino ir 30 proc. kotinino klirensą moterims [27, 28].
Kai kurie ksenobiotikai be minėtų kontraceptikų gali keisti kepenų fermentų aktyvumą, ko pasekoje gali kisti nikotino metabolizmas. Ištirta, kad fenobarbitalis indukuoja CYP2A6, dėl to pagreitėja nikotino metabolizmas į kotininą. Kepenų fermentus gali inhibuoti kai kurie vaistai, pavyzdžiui: metoksalenas, tranilciprominas, triptaminas ir kumarinas [28]. Fermentų inhibicija dar pasižymi mentolis, randamas maiste, dantų pastoje, burnos skalavimo skystyje ar pačiose cigaretėse. Šis inhibuoja už nikotino metabolizmą atsakingą kepenų fermentą CYP2A6. Dėl to, rūkantiems cigaretes su mentoliu, nikotino vertimas į kotininą ir nikotino glukuronizacija lyginant su rūkančiais cigaretes be mentolio, yra žymiai lėtesnis [30].
Nikotino skaidymą slopinti dar gali pats rūkymo procesas bei inkstų ligos. Inkstų funkcijos nepakankamumas gali sumažinti nikotino ir kotinino inkstų klirensą ir 50 proc. sumažinti metabolinį nikotino klirensą [27, 28].
Galiausiai, nikotino metabolizmui dar turi įtakos rasė. Pastebėta, kad pas juodaodžius yra mažesnis nikotino (18,1 prieš 20,5 ml/min) ir kotinino (0,57 prieš 0,76 ml/min/kg) klirensas nei pas baltaodžius. Vienas iš paaiškinimų dėl lėtesnio kotinino klirenso būtų, kad dauguma juodaodžių rūko cigaretes su mentoliu, kuris slopina nikotino oksidaciją ir gliukuronizaciją. Taip pat buvo lyginti Amerikos kinai ir baltaodžiai. Kinai turėjo lėtesnį nikotino ir kotinino klirensą [27, 28].
Nikotino inkstų klirensas sudaro 5 proc. viso klirenso. Neatsižvelgiant į šlapimo pH, nikotino inkstų klirensas gali būti 35-90 ml/min. Tačiau jei šlapimas rūgštinis (pH 4,4), nikotinas būna jonizuotas, ir dėl to nevyksta jo kanalėlių reabsorbcija, ko pasekoje inkstų klirensas gali siekti 600 ml/min. Jei šlapimo pH 7,0, tai nikotinas būna nejonizuotas, vyksta jo reabsorbcija, ir inkstų klirensas gali sumažėti iki 17 ml/min. [27, 28].
Kotinino ekskrecija per inkstus mažiau priklauso nuo šlapimo pH, nes šis nikotino metabolitas ne toks bazinis, ir dėlto jis daugiausia būna nejonizuotas. Kotinino kaip ir nikotino šalinimas per inkstus priklauso nuo šlapimo srauto. Kotinino klirensas per inkstus sudaro 12 proc. viso klirenso [27, 28].
1.7. Rūkymo biožymenų palyginimas
Kokybiškai ir kiekybiškai tiriant, ar žmogus vartoja tabako produktus, ir ar stipriai yra paveiktas pasyvaus rūkymo, ieškomi tabako dūmų pasisavinimą parodantys biožymenys. Idealus žymeklis turi egzistuoti biologiniuose organizmo skysčiuose pakankamomis koncentracijomis, kad būtų įmanoma kiekybiškai nustatyti, pasižymėti specifiškumu, turėti ne trumpą pusinės eliminacijos laiką. Pagrindiniai biožymenys yra nikotinas, anglies monoksidas, karboksihemoglobinas, tiocianato jonai, kotininas. Nikotiną, kotininą, tiocianatą galima rasti plazmoje, seilėse, šlapime, anglies monoksidą - iškvėptame ore, karboksihemoglobiną - kraujyje. Nikotinas, karboksihemoglobinas ir anglies monoksidas dėl trumpo pusinės eliminacijos laiko negali parodyti ilgalaikio rūkymo poveikio. Anglies monoksidas turi dar vieną trūkumą - mėginiai gali būti užteršiami aplinkoje esančiu anglies monoksidu. Tiocianato egzistavimas kraujyje leidžia atskirti rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų. Tačiau šios medžiagos koncentraciją žmogaus organizme gali paveikti maistas. Tiocianato turi baklažanas, bulvės, pomidorai, dėl to šių daržovių valgymas gali atvaizduoti tokias tiocianato koncentracijas, kokios būna pas rūkančiuosius. Kotininas - pagrindinis nikotino metabolitas. Manoma, kad kotininas yra geresnis biožymuo nei tiocianatas vertinant surūkytų cigarečių kiekį [33]. Dėl ilgesnio nei nikotino pusinės eliminacijos laiko (2 val.) kotininas (16 val.) dažniau pasirenkamas kaip biožymuo. Pastebėta, kad vyrauja koreliacija tarp kotinino koncentracijų plazmoje, seilėse ir šlapime. Tačiau nustatyta, kad skirtingi, bet tiek pat rūkantys žmonės turi skirtingas kotinino koncentracijas, nes visų organizmai skirtingu greičiu metabolizuoja nikotiną į kotininą, tačiau ne vienodą procentą nikotino verčia į kotininą [27, 28].
1.8. Seilės ir jų savybės
Tiriant kokybiškai ir kiekybiškai nikotiną ir kotininą žmogaus organizme, tiriamaisiais objektais dažnai tampa biologiniai skysčiai. Daug nikotino ir kotinino galima rasti šlapime, tačiau jų koncentracijos stipriai varijuoja tarp skirtingų žmonių dėl skirtingo metabolizmo greičio. Kraujyje randama nikotino ir kotinino koncentracija tiksliai gali nusakyti tabako gaminių vartojimo dažnį ar rūkalų dūmų poveikį. Tačiau kraujo ėmimas yra invazinis būdas, ne toks paprastas kaip šlapimo ar seilių surinkimas. Seilių paėmimas yra paprastesnis metodas nei kraujo ar šlapimo paėmimas [31]. Šis metodas neskausmingas, neinvazinis, nereikia adatų, patogus, nebrangus, tiriamajam nežalingas, kartotinas. Be to surinktas seiles lengva transportuoti. Mokslininkams yra saugiau dirbti su seilėmis nei su kraujo mėginiais, nes mažiau šansų užsikrėsti ŽIV ar hepatitu [32].
Seilės - tai dantenų vagelės skysčio ir seilių liaukų išskirto skystimo mišinys. Seilės - tai kraujo plazmos ultrafiltratas. 99,5 proc. seilių sudaro vanduo, 0,5 proc. seilių sudaro kietosios medžiagos: mucinas, fermentai (amilazė, lizocimas), albuminas, globulinas bei kitos medžiagos (šlapalas, šlapimo rūgštis, cholesterolis, vitaminai, fosfolipidai). Mucinas - tai glikoproteinas, dėl kurio seilės būna klampios. Įprastai seilių pH svyruoja nuo 6,0 iki 7,9. Dėl didesnio seilių rūgštingumo dažnai kaltas būna ėduonis ir dantų erozija. Per parą pas žmogų seilių pagaminama nuo 1000 iki 1500 ml. Ramybės būsenoje, kai nėra seilių gamybą skatinančių veiksnių, seilės išsiskiria 0,1-0,25 ml/min greičiu. Jei seilių sekrecija skatinama, jų išsiskiria nuo 1 iki 2 ml/min. Seilių išsiskyrimą gali laikinai slopinti infekcijos ir kai kurie vaistai, o ilgam laikui slopina galvos ir kaklo srities švitinimas bei Šiogreno sindromas [32].
1.9. Seilių surinkimo būdai
Surinkti seiles iš tiriamųjų žmonių galima dviem būdais: pasyvaus kaupimo metodu arba pasitelkiant į pagalbą absorbuojančias medžiagas [34]. Seilėms absorbuoti naudojami į burną dedami sintetiniai, medvilniniai tamponai ir hidroceliuliozės mikrokempinėlės [35]. Absorbuojamų medžiagų naudojimas turi nemažai privalumų, ypač jei naudojama kartu su seilėtekį stimuliuojančiomis priemonėmis, pavyzdžiui citrinų rūgštimi, kuria suvilgomas absorbentas. Šis metodas ypač tinka vaikams ir žmonėms, kurie turi problemų sukaupiant pakankamą tūrį seilių. Tačiau trūkumai gali nusverti privalumus. Absorbentas sugeria tik lokalizuotas, o ne visas burnos seiles [34]. Medvilniniai absorbentai sunkiai atpalaiduoja sukauptas seiles net ir centrifūguojant [35]. Paskutiniu metu seilėtekį stimuliuojančios medžiagos yra nerekomenduojamos, nes stimuliantai susimaišo su seilėmis ir po to gali pasunkinti tiriamų junginių analizę.
Pasyvus kaupimas - pats paprasčiausias būdas sukaupti seiles tyrimams [34]. Tiriamajam asmeniui liepiama 5 minutes kaupti burnoje seiles, o po to jas iš lėto išleisti į tūbelę. Šiuo metodu garantuojama, kad surinktos seilės bus kuo mažiau suputoję [33].
1.10. Analizės metodai, taikomi nikotino ir kotinino įvertinimui
Nikotinas ir kotininas kokybiškai ir kiekybiškai tiriamas biologinėse matricose naudojant šiuos metodus: kolorimetriją, radioimuninį (RIA) ir imunofermentinį (ELISA) tyrimus ir chromatografiją. Kolorimetrija yra paprastas ir nebrangus metodas. Tačiau šiam metodui trūksta specifiškumo ir tikslumo. Seilių ir serumo kotinino koncentracijai nustatyti galima naudoti RIA ir ELISA. Pagrindiniai metodų privalumai - užtenka mažų kiekių, 100 proc. efektyvūs atskiriant rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų. Chromatografiniai metodai pasižymėję tuo, kad su jais biožymeklius galima rasti daugelyje biologinių skysčių; metodas yra labai jautrus ir specifiškas, vienu metu galima tirti ir nikotiną ir kotininą. Taip pat lyginant su imuniniu tyrimu chromatografiniai metodai atsparesni trukdžiams, nes prieš analizę reikia ekstrahuoti ir koncentruoti mėginius. Literatūroje galima rasti tokius vykdytus chromatografinius metodus: dujų chromatografiją su azoto-fosforo liepsnos jonizacijos detektoriumi, dujų skysčių chromatografiją su masių spektrometru, efektyviąją plonasluoksnę chromatografiją, dujų chromatografiją su masių spektrometrija, efektyviąją skysčių chromatografiją suporuotą su jonų chromatografu ir UV detektoriumi. Iš chromatografinių metodų dujų chromatografo ir masių spektrometro (DC-MS) duetas laikomas vienu iš patikimiausių tyrimo būdų [33].
1.11. Dujų chromatografija su masių spektrometru
Dujų chromatografija su masių spektrometru yra instrumentinės analizės metodas, kuriame dujų chromatografas yra suporuotas su detektoriumi - masių spektrometru. Šiuo metodu, pavyksta sudėtinguose mišiniuose esančius komponentus atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti bei tinka tirti medžiagas, kurios yra lakios ir stabilios aukštoje temperatūroje. Prieš tiriant mėginius dažniausiai reikia juos ekstrahuoti. Paruoštas mėginio tirpalas įleidžiamas į dujų chromatografo įleidimo angą, kur tiriamas mėginys pakaitinamas iki tiek, kad virsta dujomis. Šias dujas nuneša į kolonėlę (stacionarią fazę) kitos dujos - nešiklės (mobili fazė), pavyzdžiui helis. Dujinio mėginio mišinio komponentai, judėdami per kolonėlę, adsorbuojasi prie sluoksnio, kuris dengia kolonėlę iš vidaus.
Mišinio komponentai atsiskiria nuo vidinės kolonėlės sienelės skirtingu laiku, dėlto medžiagos, sudarančios mišinį, atsiskiria viena nuo kitos. Tolimesnė kolonėlės dalis eina per pakaitintą perdavimo liniją, o po to - prie jonų šaltinio. Junginiai, išeidami iš kolonėlės, paverčiami jonais. Egzistuoja du būdai jonams paversti. Dažniausias - elektronų jonizacija, rečiau naudojamas - cheminė jonizacija. Elektronų jonizacijos metu elektronų spindulys jonizuoja mėginio molekules, dėlto šios praranda vieną elektroną. Molekulė be elektrono - molekulinis jonas M+. Toks jonas sukuria piką masių spektre, kuris
nurodo molekulinę junginio masę. Gavęs didelį kiekį energijos, molekulinis jonas gali suirti į mažesnius jonus, kurie suteikia “piršto antspaudą”, būdingą tai molekulinei struktūrai. Ši informacija gali būti panaudota nustatyti dominančius junginius ir išsiaiškinti nežinomų mišinio junginių struktūrą. Toliau būna masių analizatorius, pavyzdžiui kvadrapolinis, jonų gaudyklė,, kuris pagal masių savybes atskiria teigiamai įkrautus jonus. Jonams atsiskyrus, jie patenka į detektorių, kur jų signalas sustiprinamas. Detektorius siunčia informaciją į kompiuterį, kur parodomi duomenys [36].
1.12. Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC)
Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija - tai junginius atskiriantis chromatografijos metodas, paremtas tirpiklio judėjimu stacionarios fazės kapiliarais. Plonas sluoksnis adsorbcinės medžiagos (stacionari fazė) būna padengtas ant aliuminio folijos, stiklo ar plastiko. Plokštelė dažnai būna vertikalioje pozicijoje, kai vykdoma chromatografija. Mišinys, kurį norima išskirstyti į komponentus, automatiniu dozatoriumi tiksliomis dozėmis užpurškiamas ant stacionarios fazės starto linijos. Plokštelės apatinė dalis įmerkiama į chromatografavimo kamerą, kur būna nedidelis kiekis tirpiklių sistemos. Tirpikliai kyla plokštele aukštyn, nes juos traukia kapiliariniai mechanizmai. Tiriamo mišinio komponentus, tirpikliai kelia aukštyn skirtingu greičiu, dėlto jie atsiskiria vienas nuo kito. Tirpikliams pakilus iki finišo linijos, vyksta plokštelės dėmių ryškinimas [37].
2. TYRIMO METODAI IR METODIKA
2.1. Tyrimo organizavimas ir kontingentas
Tyrimui atlikti gautas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto bioetikos centro leidimas, išduotas 2016 m. gegužės 17 d. (protokolo Nr. BEC-FF-35), kuris patvirtina, jog tyrime neturėtų būti pažeisto tiriamojo teisės (1 priedas).
Tyrime buvo tirtos seilės, paimtos iš rūkančių ir nerūkančių suaugusių žmonių. Papildomai buvo tirtas tabako gaminys - cigaretės.
2.2. Tyrimo medžiagos ir reagentai
Visi tyrime naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo. 25 proc. amoniako tirpalas gautas iš MERCK KGaA (Darmštatas, Vokietija). Acto rūgštis (≥ 99,7 proc.), metanolis (> 99,9 proc.), heksanas, dietileteris, kalio karbonatas (≥ 99,0 proc.), natrio hidroksidas (≥ 97 proc.), natrio sulfatas (≥ 99.0 proc.), natrio chloridas (≥ 99,0 proc.) gauti iš Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Vokietija). Dichlormetanas (> 99,9 proc.) gautas iš Carl Roth GmbH+Co (Karlsrūjė, Vokietija), etilacetatas (> 99,5 proc.) gautas iš Chempur (Pekarai, Lenkija). “Millipore” (JAV) vandens valymo sistema ruoštas dejonizuotas išgrynintas vanduo (18,2 mΩ/cm). (S)-)-nikotino (99 proc.) ir (-)-kotinino (98 proc.) standartai gauti iš Alfa Aesar (Karlsrūjė, Vokietija). Lietuvoje įsigytos “Marlboro Gold” cigaretės.
2.3. Naudota aparatūra
Cigaretės tabakas džiovintas vakuuminėje džiovyklėje BINDER (Tutlingenas, Vokietija). Tabakui sumalti naudotas elektrinis malūnas IKA A11 basic (Vokietija). Mėginiai ir reagentai sverti analitinėmis svarstyklėmis Shimadzu Auw 120 D (Duisburgas, Vokietija). Tabako ekstrakcija vykdyta ultragarsinėje vonelėje Ultrasonic Cleaner Set WUC-A06H (Witeg, Vertheimas, Vokietija). Atliekant tyrimą efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, buvo naudotos 10 cm pločio ir 10 cm aukščio HPTLC (silikagelis 60F254 ; Merck, Vokietija) stiklo plokštelės. Ant šių plokštelių tiriamieji
mėginiai užnešti pusiau automatiniu mėginių ėmikliu CAMAG Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija).
Plokštelės laikytos vertikalioje chromatografavimo kameroje CAMAG Twin Trough Chamber (Camag, Muttenz, Šveicarija). Plokštelių fotovizualizacija vykdyta, pasitelkus CAMAG TLC Visualizer prietaisą (Camag, Muttenz, Šveicarija). Seilių ekstraktai buvo plakami horizontalia plakykle ELPAN laboratory shaker type 358S (Lenkija) ir centrifuguojami Centurion Scientific C2006 (Centurion Scientific Ltd, Jungtinė Karalystė). Kai kurie seilių ekstraktai buvo džiovinami šildant krosnelėje Barnstead Lab-Line Multi-Blok Heater 2050 (Barnstead International, JAV). Dujų chromatografijos tyrimas atliktas, naudojant Shimadzu GCMS-QP2010nc Ultra system (Shimadzu, Duisburgas, Vokietija) dujų chromatografą su masių spektrometrijos detektoriumi.
2.4. Tiriamųjų mėginių paruošimas
Seilių analizei dujų ir plonasluoksnės chromatografijos metodais iš kiekvieno tiriamo žmogaus paimta seilių trimis skirtingais laikais: 9 val., 15 val. ir 21 val. Iš viso buvo tirtos 9 skirtingų žmonių seilės: 6 rūkančiųjų ir 3 nerūkančiųjų. Rūkantys tiriamieji atsikėlę turėjo nerūkyti iki 9 val. rytinio seilių ėmimo, nes buvo norima pasižiūrėti, kokios koncentracijos analizuojamų junginių būna po ilgo nerūkymo laiko. Prieš kitus seilių ėmimo laikus turėjo nerūkyti ir nevalyti dantų bent valandą prieš. Taip pat neturėjo valgyti bent pusvalandį prieš seilių davimą. Tiriamieji neturėjo jokių burnos ertmių ir dantų ligų ar pažeidimų. Tiriamiesiems asmenims liepta 5 minutes kaupti burnoje seiles, o po to jas iš lėto išleisti į užsukamą mėgintuvėlį. Surinktos seilės vežtos kuo skubiau į laboratoriją, kurioje centrifuguotos bent 5 minutes esant 5050 apsisukimų per minutę greičiu. Galiausiai mėginiai tirti arba įdėti vėlesniems tyrimams į šaldymo kamerą esant -20°C temperatūrai. Tyrimų dieną išimtos iš šaldiklio seilės atšildytos iki kambario temperatūros ir tada ekstrahuojamos.
Seilės ekstrahuotos naudojant Torano JS ir kt. sukurtą ekstrakcijos metodiką [38]. Į mėgintuvėlį perkelta 0,8 ml seilių ir pridėta 50 µl 4 M natrio hidroksido tirpalo, gauto, ištirpinus 160 g natrio hidroksido viename litre dejonizuoto išgryninto vandens. Vėliau įdėta 200 µl dichlormetano ir 100 µl prisotinto natrio chlorido tirpalo. Po to mėgintuvėlis buvo plaktas horizontaliojoje plakyklėje 30 minučių 270/min dažniu ir centrifuguotas 10 minučių 5050 apsisukimų per minutę greičiu. Organinis (apatinis) sluoksnis perkeltas į chromatografinį buteliuką ir 1 µl injekuotas į DC.
Po seilių analizės efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu, buvo papildomai tirtas tabako gaminys (cigaretė), norint nustatyti nikotiną šiuo chromatografiniu metodu. Prieš kokybinį ir kiekybinį cigarečių tabako nikotino tyrimą EPC metodu, reikėjo išekstrahuoti nikotiną iš tabako. Ekstrakcija atlikta remiantis Sheng ir kt. moksliniame straipsnyje pateikta metodika [39]. Iš cigarečių išbertas tabakas, po to jis džiovinamas vakuuminėje džiovyklėje, keturias valandas, 40°C temperatūroje.
Išdžiovintas tabakas sumaltas elektriniu malūnu. 500 mg susmulkinto tabako atsverta ir perkelta į kūginę kolbą. Į ją dar supilta 1 ml 6 proc. amoniako tirpalo, pagaminto iš koncentruoto amonio hidroksido tirpalo ir dejonizuoto išgryninto vandens santykiu 1:4 (v/v), ir 20 ml ekstrahuojančio tirpiklio, pagaminto iš metanolio ir dichlormetano santykiu 1:3 (v/v). Kolba įdėta į ultragarso vonelę 15-ai minučių. Po to ekstraktas nufiltruotas per popierinį filtrą į atskirą tamsaus stiklo užsukamą buteliuką.
2.5. Nikotino ir kotinino kokybinis ir kiekybinis nustatymas dujų chromatografijos
– masių spektrometrijos (DC-MS) metodu
Nikotino ir kotinino paruoštuose seilių ekstraktuose tapatybė ir kiekybė tirta DC-MS metodu. Nikotino ir kotinino išskirstymui naudota kapiliarinė kolonėlė (30 m ilgio, 0,25 mm išorinio diametro ir 0,25 µm vidinio diametro) su skysta nejudančia faze (5 proc. difenilo ir 95 proc. polisiloksano). Dujos nešiklės - helis, į dujų chromatografą buvo injekuojama po 1 µl ekstrakto. Naudotas visą dujų tūrį įleidžiantis į kolonėlę (angl. splitless) būdas. Injektoriaus temperatūra - 280,0°C. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas pateiktas (1 lent.).
1 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas Temperatūros kėlimo
greitis (°C) Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)
- 50,0 2,00
20,00 280,0 2,00
30,00 310,0 4,00
Nustačius pasirinktus dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodikos parametrus, injekuotas nikotino ir kotinino mišinio etaloninis tirpalas. Taip pat buvo sudaryta seilių ekstrakto DC – MS chromatograma, kurioje esančių smailių sulaikymo trukmės ir masės – krūvio santykiai sutapo su etaloninių nikotino ir kotinino trukmėmis ir santykiais. Nikotino ir kotinino koncentracija seilėse tirta pasidarius kalibracines kreives iš žinomų koncentracijų etaloninių tirpalų.
2.6. Nikotino kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios plonasluoksnės
chromatografijos (EPC) metodu
Pirmiausia buvo pasigaminti nikotino ir kotinino etalonų tirpalai. Nikotinas ir kotininas ištirpinti 96 proc. etanolyje, gauti 0,0016 g/ml nikotino ir 0,0016 g/ml kotinino etaloniniai tirpalai. Etalonų tirpalai ir mėginiai užnešti ant silikageliu dengtų chromatografinių plokštelių pusiau automatinio mėginių užnešėjo su 100 µl tūrio mikrošvirkštu pagalba. Šie išpurkšdavo labai tikslias brūkšnio formos dėmes. EPC judančioji fazė buvo tokia pat, kokią rekomenduoja naudoti nikotinui tirti Anthony C Moffat ir kt.: etilacetatas, metanolis ir koncentruotas amoniako tirpalas santykiu 85:10:5 (v/v) [40]. Tyrimui naudota 10 x 10 cm chromatografavimo kameroje, kurioje buvo įpilta 50 ml pagamintos tirpiklių sistemos. Kamerai prisotinti judančiosios fazės garais ir užtikrinti garų koncentracijos vienodumą pasitelktas filtrinis popierius. Judančiajai fazei pasiekus finišą, kuris yra 10 cm nuo starto linijos, plokštelės ištrauktos iš kameros, paliktos džiūti ir dėmės ryškintos 254 nm bangos ilgio ultravioletinių spindulių (UV) lempa. Metodo atrankumas patvirtintas, lyginant analičių vidutines Rf (sulaikymo faktoriaus) reikšmes su etaloninių medžiagų vidutinėmis Rf reikšmėmis. Rf sužinomas
padalinus tiriamo junginio nukeliautą atstumą iš atstumo tarp starto ir finišo linijų (10 cm).
Kadangi silikagelio plokštelėje atsiskyrusių ir identifikuotų analičių smailių plotai priklauso nuo jų koncentracijos tirpale, kiekybiškai junginius tirti galima sudarius tiesinės regresijos kalibracines kreives pagal smailių plotą. Nikotino ir kotinino etalonai sumaišyti, ir gautas etaloninių tirpalų mišinys. Šio etaloninio tirpalo buvo užpurkšti 6 skirtingi tūriai ant chromatografinės plokštelės: 0,5, 0,8, 1,0, 1,5, 2,0 ir 2,5 µl. Plokštelė įdėta į chormatografavimo kamerą. Kai tirpikliai pakilo iki finišo linijos, plokštelė išimta, džiovinta ir įdėta į vizualizatorių, kur apšviesta 254 nm bangų ilgio UV šviesa. Kalibracinės kreivės yra paremtos šviesos absorbcijos smailės ploto priklausomybe nuo analitės koncentracijos (mg/ml) dėmėje. Chromatogramų plotai įvertinti pasitelkus VideoScan programą.
2.7. Statistinės analizės metodai
Cigarečių kiekybinės analizės eksperimentai kartoti tris kartus, duomenys išreikšti vidurkiais ± standartiniais nuokrypiais (SN). Duomenų analizė atlikta su Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, JAV).
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Nikotino ir kotinino identifikavimas taikant dujų chromatografijos - masių
spektrometrijos metodą
Atlikus literatūros šaltinių analizę, susijusią su nikotino ir kotinino įvertinimu dujų chromatografijos metodu, buvo modifikuota metodika atsižvelgiant į J. S. Torano ir kt. moksliniame straipsnyje pateiktą DC - MS metodiką. Tyrimo eigoje buvo pakeistas temperatūrinis kolonėlės gradientinis režimas bei temperatūros kitimo laipsnių intervalas per minutę. Pritaikant DC - MS metodiką nikotino ir kotinino atskyrimui bei identifikavimui, pirmiausia tyrimai buvo atliekami su etaloninių tirpalų mišiniu (1 pav.).
1 pav. Nikotino ir kotinino etaloninių tirpalų chromatograma
Iš pateiktos chromatogramos matome, kad junginiai vienas nuo kito atsiskiria (nikotino sulaikymo trukmė - 8,62 min, kotinino sulaikymo trukmė - 10,91 min). Taip pat tyrimo eigoje buvo įvertinti tiriamųjų junginių masių spektrai (2 pav.). Buvo nustatyti nikotino ir kotinino molekulinių jonų masių ir krūvių santykiai (m/z): nikotinas - 84, kotininas - 98. Masės ir krūvio santykiai padeda dar tiksliau identifikuoti nikotiną ir kotininą.
2 pav. Nikotino ir kotinino etaloninių tirpalų masių spektrai
Apibendrinant, galima teigti, kad ši metodika yra tinkama nikotino ir kotinino identifikavimui.
3.2. Ekstrakcijos metodikų parinkimas nikotino ir kotinino įvertinimui seilių
mėginiuose
Pritaikius DC - MS metodiką nikotino ir kotinino atskyrimui, tyrimai buvo tęsiami su žmogaus seilių ekstraktais. Pirmiausia buvo siekiama parinkti tinkamiausią ekstrakcijos metodiką nikotino ir kotinino išskyrimui iš seilių mėginių. Pradžioje, tiriant, kuri seilių ekstrakcijos metodika yra tinkamiausia, seilės buvo imamos tik iš to paties rūkančiojo žmogaus. Iš kiekvieno jo seilių mėginio, pagaminta po tris seilių ekstraktus, naudojant tris skirtingus ekstrahavimo būdus. Iš trijų seilių mėginių, pagaminti 9 tiriamieji ekstraktai. Kiekvienas jų buvo analizuotas dujų chromatografu su masių spektrometrijos detektoriumi. Atlikus chromatografinius tyrimus, iš gautų chromatogramų buvo siekiama nustatyti nikotino ir kotinino buvimą tiriamuosiuose mėginiuose. Nikotino ir kotinino ekstrakcija iš žmonių seilių atlikta trimis skirtingomis ekstrahavimo metodikomis.
Pirmasis ekstrakcijos būdas vykdytas, remiantis H.-S. Shin ir kt. moksliniame straipsnyje pateikta metodika [41]. 0,5 ml seilių perkelta į mėgintuvėlį. Tada į mėgintuvėlį su seilėmis dėta 100 mg kalio karbonato, 0,5 ml dejonizuoto išgryninto vandens. Vėliau mėginys du kartus ekstrahuotas, naudojant po 3 ml dietileterio mechaniškai plakant po 10 min. Organinės fazės perkeltos į atskirą mėgintuvėlį, kuriame jau buvo įpilta 20 µl acto rūgšties. Po to mėgintuvėlio turinys džiovintas azoto srovėje iki 100 µl tūrio, vėliau džiovinama, pridedant 100 mg natrio sulfato. Ekstraktas perkeltas į chromatografinį buteliuką ir 1 µl injekuotas į dujų chromatografą.
Antrasis bandytas ekstrakcijos būdas paremtas Massadeh AM ir kt. moksliniame straipsnyje pateikta ekstrahavimo metodika kraujo plazmai [42]. Į mėgintuvėlį įdėta 0,5 ml seilių, 100 µl 2,5 M natrio hidroksido tirpalo, pagaminto ištirpinus 100 g natrio hidroksido viename litre vandens. Mišinys centrifuguotas 30 sekundžių 2800 apsisukimų per minutę greičiu. Baigus centrifuguoti, į mišinį dar įpilta 2,5 ml dichlormetano-heksano (1:1 v/v) tirpalo. Mėgintuvėlis su turiniu dar kartą centrifuguotas 2 minutes tokiu pat greičiu. Organinis sluoksnis perkeltas į atskirą mėgintuvėlį, kuriame buvo įpilta 10 µl acto rūgšties. Mišinys centrifuguotas 3 minutes 3500 apsisukimų per minutę greičiu. Organinis sluoksnis išgarintas azoto srovėje prie 35°C temperatūros, o sausi likučiai ištirpinti, pripylus 100 µl heksano. Ekstraktas perkeltas į chromatografinį buteliuką ir 1 µl injekuotas į dujų chromatografą.
Atlikus šias dvi skirtingas ekstrakcijos metodikas, tiramosiose chromatogramose nikotinas ir kotininas identifikuoti nebuvo (3 pav.).
3 pav. H.-S. Shin ir kt. metodu ekstrahuotų seilių chromatogramos pavyzdys
Chromatogramoje matyti daug išsiekstrahavusių pašalinių medžiagų smailių, kurios galėjo persikloti su tiriamaisiais junginiais. Atlikus pasirinktas dvi ekstrakcijos metodikas, mūsų tyrimo eigoje nepavyko identifikuoti nikotino ir kotinino tirtų seilių mėginiuose. Todėl šios ekstrakcijos metodikos mūsų atveju nėra tinkamos nikotino ir kotinino ekstrakcijai iš seilių mėginių.
Taikant Toraño JS ir kt. ekstrakcijos metodiką nikotino ir kotinino išskyrimui iš seilių mėginių, pavyko identifikuoti abu minėtus junginius [38]. Nikotinas ir kotininas identifikuotas, palyginus smailių sulaikymo trukmes ir masių spektrus su etaloninių junginių duomenimis (4 pav.).
4 pav. Torano JS metodu paruoštų žmogaus seilių ekstrakto chromatograma.
Tyrimų eigoje pastebėta, kad šiuo metodu ekstrahuoti seilių mėginius yra lengviausia, nes nereikia atlikti ekstraktų koncentravimo, kuris būtinas kitose dvejose bandytose ekstrakcijos metodikose. Be to, ekstrahavimo metode pagal H.-S. Shin ir kiti. atliekami ne vienas, o du koncentravimo žingsniai (azoto srovėje ir su natrio sulfatu) [41]. Torano JS ir kiti. metodas pasižymi paprastumu, nes nereikia džiovinti ekstraktų, užtenka supilti reikiamus reagentus ir tirpiklius į seilių mėginius, purtyti ir centrifuguoti [38]. Dėl metodo paprastumo sumažėja tikimybė pasitaikyti didesniam žmogiškų klaidų kiekiui. Ši metodika buvo taikyta tolimesniuose tyrimuose. Vėliau buvo gaminami ekstraktai pagal pavykusią Torano JS ekstrakcijos metodiką ir vėl chromatografuojama. Bandymų metu nustatyta, kad aukštesnės tiriamųjų junginių smailės ir mažiau pašalinių medžiagų smailių buvo chromatogramose tų seilių ekstraktų, prieš kurių ruošimą paimtos seilės buvo centrifuguotos. Tyrimo pradžioje iš žmogaus gautos seilės nebuvo centrifuguojamos, o buvo iškart vykdomas ekstrahavimas. Tačiau po kelių kokybinių analizių dujų chromatografijos metodu buvo pastebėta, kad rezultatai gali būti tikslesni, jei bus taikomas seilių ėminių centrifugavimas. Pagrindinė problema yra ta, kad seilės būna pasidalinusios į skystesnę, lengvai automatine pipete įtraukiamą dalį, ir tirštesnę, sunkiau paimamą dalį. Seilių mėginiai centrifuguoti nustačius 5050 apsisukimų per minutę greitį, centrifugavimą vykdant 5 min. Tokių centrifugavimo parametrų užtenka įvairioms priemaišoms, kietoms pašalinėms dalelėms ir tirštajai seilių daliai nusodinti.
3.3. Nikotino ir kotinino kiekybinis nustatymas žmogaus seilių mėginiuose
Atlikus kokybinę seilių mėginių analizę, kitas tyrimų žingsnis yra kiekybinis junginių nustatymas. Kiekybinei nikotino ir kotinino analizei buvo sudarytos kalibracinės kreivės iš šešių etaloninių tirpalų. Sudarius kalibracines kreives buvo nustatyta, kad mažai rūkančiųjų ir nerūkančiųjų seilių mėginiuose, nikotino ir kotinino koncentracijos per mažos tiksliam įvertinimui su gautais kalibraciniais grafikais. Dėl šios priežasties buvo sudarytos papildomos nikotino ir kotinino kalibracinės kreivės, kurios geba įvertinti itin mažas koncentracijas. Kalibracinės kreivės, skirtos nustatyti didesnes junginių koncentracijas, pateikiamos 5 pav.
5 pav. Kairėje - kalibracinė kreivė didesnėms nikotino koncentracijos nustatyti, dešinėje - didesnėms kotinino koncentracijoms nustatyti
Abiejų kreivių determinacijos koeficiento (r2) reikšmė yra arti vieneto, todėl galima teigti, kad
šios kreivės sudarytos tinkamai ir tiriamųjų medžiagų koncentracijas galima tiksliai nustatyti.
Mažesnėms nikotino ir kotinino koncentracijoms įvertinti naudotos 6 pav. nurodytos kalibracinės kreivės.
6 pav. Kairėje - kalibracinė kreivė mažesnėms nikotino koncentracijoms nustatyti, dešinėje - mažesnėms kotinino koncentracijoms nustatyti
Kalibracinių grafikų abscisių ašyje yra medžiagos koncentracija, o ordinačių – instrumento atsako intensyvumas. Abiejų kreivių determinacijos koeficiento (r2) reikšmė yra arti vieneto, todėl
galima teigti, kad šios kreivės sudarytos tinkamai ir tiriamųjų medžiagų koncentracijas galima tiksliai nustatyti.
Sudarytų kalibracinių kreivių parametrai pateikiami 2 lentelėje, nurodant koncentracijos ribas, koncentracijų skaičiavimo lygtis ir m/z duomenis.
2 lentelė. Kalibracinės kreivės parametrai
Junginys Koncentracijų ribos Lygtis m/z
Didesnėms nikotino koncentracijoms 0,637 - 40,750 µg/ml y=140240.070726*x+34313.959770 84 Mažesnėms nikotino koncentracijoms 0,001 - 1,213 µg/ml y=58908.147903*x-108.374177 84 Didesnėms kotinino koncentracijoms 0,146 - 37,250 µg/ml y=84134.279709*x+1353.027235 98 Mažesnėms kotinino koncentracijoms 0,001 - 1,104 µg/ml y=61037.215830*x-110.019225 98
Sudarytų kalibracinių kreivių, skirtų didesnėms nikotino ir kotinino koncentracijoms tirti, aukščiausios koncentracijos ribos yra panašios, tačiau apatinės – pastebimai skiriasi. Mažesnėms nikotino ir kotinino koncentracijoms nustatyti skirtos kreivės koncentracijos ribos yra panašios. Abiejų mažiausia nustatoma tiriamos medžiagos koncentracija – 0,001 µg/ml. Taip pat nurodytos kalibracinės lygtys, pagal kurias galima apskaičiuoti medžiagos koncentraciją.
Sudarius kalibracines kreives etaloniniams tirpalams, toliau atliekami kiekybinio įvertinimo tyrimai su rūkančiųjų ir nerūkančiųjų žmonių seilių ėminiais.
Ekstrahavus seilių ėminius pagal Torano JS ir kt. ekstrakcijos metodiką ir išanalizavus DC-MS metodu ir pritaikius kalibracines kreives, nustatytos nikotino ir kotinino koncentracijos seilėse. Mokslinėje literatūroje nurodytos mažiausios koncentracijos, kurios reiškia, kad tiriamasis žmogus rūko: 0,0218 µg/ml nikotino, 0,012 µg/ml kotinino [43, 44]. 7 paveiksle pavaizduotos šešių skirtingų rūkančių žmonių nikotino koncentracijos seilėse. Abcisių ašyje nurodyti rūkantieji žmonės, kurie užkoduoti šiais trumpiniais: 1R, 2R, 3R, 4R, 5R, 6R. Skirtingos diagramos stulpelių spalvos rodo nikotino koncentracijas skirtingu paros metu imtose seilėse.
7 pav. Nikotino koncentracijos rūkančiųjų seilėse skirtingu paros metu.
Diagramoje galime matyti, kad kiekvieno, išskyrus 1R, tiriamojo žmogaus rytinių (9 val.) seilių mėginiuose nikotino koncentracijos buvo mažiausios, lyginant su kitu metu paimtų seilių nikotino koncentracijomis (7 pav.). Tai aiškiname tuo, kad tiramieji paskutinį kartą rūkė prieš einant miegoti ir per naktį nikotino koncentracijos dėl trumpo (2 val.) pusinės eliminacijos laiko spėjo sumažėti. 0.511 0.128 0.217 0.018 0.275 0.107 1.118 0.39 0.81 0.105 0.513 0.248 0.458 0.348 0.317 0.084 0.446 0.752 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1R 2R 3R 4R 5R 6R µ g/ m l
1R seilių rytinis ėminys išsiskiria iš kitų mėginių, galimai dėl skirtingo žmonių nikotino metabolizmo greičio bei dėl to, kad tiriamasis galėjo turėti ilgą nerūkymo pertrauką tarp 15 val. ir 21 val. seilių ėmimo. Parūkius 1R po vakarinio seilių ėmimo, jo nikotino koncentracija galėjo pakilti ir lėtai mažėti miegant. Nikotino koncentracijos po pietų (15 val.) imtose seilėse buvo pastebimai didesnės nei ryte imtose seilėse, taip pat 15 val. seilėse nikotino koncentracija buvo didžiausia, palyginus su kitu paros metu imtomis seilėmis. Seilių mėginyje 6R, nikotino buvo pastebimai daugiau nei 15 val. imtose seilėse, nes tiriamasis žmogus didžiąją dalį cigarečių galėjo rūkyti po pietų (po 15 val.). Penkiuose vakare (21 val.) imtuose seilių mėginiuose 1R – 5R nikotino koncentracija buvo mažesnė nei po pietų imtose seilėse, galbūt dėl to, kad tiriamieji vakare, būdami namie, mažiau rūko nei per pietus. Rytiniame seilių mėginyje 4R nustatyta nikotino koncentracija yra žemiau ribos, parodančios, kad žmogus rūko. Nikotino koncentracija skirtingu paros metu paimtose seilėse labai svyravo, nes nikotino pusinės eliminacijos laikas yra tik 2 val.
Pastebėta, kad nikotino metabolito kotinino pusinės eliminacijos laikas yra pastebimai ilgesnis - 16 val. Todėl koncentracija ne taip stipriai kinta dienos eigoje (8 pav.).
8 pav. Kotinino koncentracijos rūkančiųjų seilėse skirtingu paros metu.
Visuose skirtingų žmonių rytiniuose seilių ėminiuose kotinino koncentracijos buvo mažiausios lyginant su kitu paros metu imtomis seilėmis. Po pietų imtose seilėse kotinino koncentracija buvo didesnė nei rytiniuose seilių mėginiuose. Vakare kotinino koncentracija buvo didžiausia palyginus su kitu paros metu imtomis seilėmis.
0.43 0.571 0.269 0.019 0.41 0.17 0.458 0.607 0.311 0.011 0.489 0.176 0.556 0.732 0.345 0.025 0.524 0.253 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1R 2R 3R 4R 5R 6R µ g/ m l
Iš kitų mėginių išsiskyrė 4R numeriu pažymėtas 15 val. imtas seilių mėginys, nes jame įvertinta mažiau kotinino negu turėtų būti pas rūkantįjį, o rytiniame seilių mėginyje nustatyta mažesnė nikotino koncentracija rūkymui įrodyti. Tačiau jei vieno junginio, pavyzdžiui nikotino, koncentracija buvo mažesnė nei apatinė koncentracijos riba rūkymui įrodyti, tame pačiame seilių ėminyje buvo didesnė koncentracija kito junginio, pavyzdžiui kotinino. Kartais gali būti atvejų, kad dėl tam tikro rūkymo dažnumo ir dėl individualių organizmo metabolizmo bei šalinimo greičių, vieno rūkymo biožymens gali būti per maža koncentracija rūkymui įrodyti. Tokioje situacijoje svarbu nustatyti kito biožymens koncentraciją, teisingai išvadai priimti. Taigi, nustatant, ar tiriamasis rūko, svarbu analizuoti abudu biožymenis.
Taip pat buvo tirti trys nerūkantys žmonės, užkoduoti 1N, 2N ir 3N, norint įsitikinti, kad metodas gali nustatyti itin mažas nikotino ir kotinino koncentracijas (9 pav.).
9 pav. Nerūkančių žmonių seilių nikotino (kairioji diagrama) ir kotinino (dešinioji diagrama) koncentracijos (µg/ml)
Nustatytos nikotino ir kotinino koncentracijos byloja, kad žmonės nerūko, nes nė viena nustatyta koncentracija neviršijo ribos, skiriančios rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų (nikotino - 0,0218 µg/ml, kotinino – 0,012 µg/ml). Nikotino ir kotinino gali būti pas nerūkančiuosius (1N ir 2N), nes daugelis nerūkančiųjų gali būti veikiami pasyvaus rūkymo.
DC-MS metodas parodė, kad juo galima nustatyti tokias mažas koncentracijas, kad negalima atskirti rūkančiuosius nuo nerūkančiųjų. Ištyrus žmogaus seilių mėginius galima teigti, kad didžiausia nikotino koncentracija seilėse randama po pietų (15 val.), o kotinino – vakare (21 val.).
0.008 0.003 0 0.01 0.003 0 0.012 0.002 0.001 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 1N 2N 3N µ g/ m
Kotinino koncentracija seilių
ekstraktuose
9 val. 15 val. 21 val.
0.005 0.002 0 0.009 0.004 0.002 0.008 0.003 0.001 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01 1N 2N 3N µ g/ m l
Nikotino koncentracija seilių
ekstraktuose
Didžiausios nikotino ir kotinino koncentracijos seilėse gali būti aktualios mokslininkams, atliekantiems seilių tyrimus su mažiau jautriais analitiniais instrumentais.
3.4.
Nikotino
ir
kotinino
identifikavimas
efektyviosios
plonasluoksnės
chromatografijos metodu
Norint identifikuoti seilių ekstrakte esantį nikotiną su kotininu EPC metodu, svarbu nustatyti šių junginių sulaikymo faktorius (Rf), įsitikinti, kad su pasirinkta tirpiklių sistema tiriamos medžiagos gali atsiskirti viena nuo kitos chromatogramoje bei išsiaiškinti, koks ryškinimo būdas yra geriausias. Iš pradžių tiriami etaloninių medžiagų tirpalai taikant Anthony C Moffat ir kit. metodą nikotino nustatymui [40]. Atlikus etalonų efektyviąją plonasluoksnę chromatografiją, plokštelės perkeltos į vizualizatorių, kuriame dėmės ryškinamos prie 254 nm bangų ilgio UV šviesos. Anthony C Moffat ir kt. pataria dėmes ryškinti plokštelę apipurškus Dragendorfo reagentu, tačiau mes nustatėme, kad dėmės yra matomos apšvitinus plokštelę UV šviesa. Taigi, atlikus nikotino ir kotinino etalonų ir jų etalonų mišinio EPC, buvo nustatyta, kad analitės iš mišinio atsiskiria viena nuo kitos (10 pav.).
10 pav. EPC Chromatograma: 1 - Nikotino etaloninis tirpalas; 2 - Kotinino etaloninis tirpalas; 3 - Nikotino ir kotinino etaloninių tirpalų mišinys; 4 - Cigaretės ekstraktas; 5 - Rūkančiojo žmogaus
Nustatytos Rf reikšmės: ● Nikotino - 0,65; ● Kotinino - 0,26.
Pastebėta, kad nikotino Rf reikšmė (0,65) yra labai panaši į moksliniame šaltinyje pateiktą nikotino Rf - 0,61 reikšmę [40]. Bet šiame literatūros šaltinyje nepateikti duomenys, ar įmanoma su ta pačia tirpiklių sistema identifikuoti kotininą. Mūsų tyrimai įrodė, kad ši metodika yra tinkama kotinino ir nikotino įvertinimui mišinyje, nes jie yra pilnai atskiriami atliekant EPC.
Nustačius sulaikymo faktorius buvo atlikti tyrimai su seilių ekstraktais. Seilės ekstrahuotos Torano JS ir kt ekstrakcijos metodika. Vykdant seilių ekstraktų EPC ant plokštelių buvo užnešama 10, 20 ir 50 µl ekstrakto, šalia buvo užnešami nikotino ir kotinino etalonai. Po chromatografavimo plokštelės ištrauktos iš kameros, analizuotos vizualizatoriuje. Bandymus pakartojus tris kartus, nikotino ir kotinino etaloninių tirpalų dėmės išryškėjo, tačiau seilių ekstraktuose nikotinas ir kotininas nebuvo nustatytas (10 pav).
Seilėse nebuvo identifikuoti nikotinas ir kotininas, nes manoma, kad metodas nėra pakankamai jautrus. Seilėse yra per mažos tiriamų junginių koncentracijos. Norint įrodyti metodo efektyvumą ir patikrinti, ar įmanoma juo identifikuoti ieškomus junginius, nuspręsta atlikti nikotino ir kotinino kokybinę ir kiekybinę analizę cigaretėje. Kiekvienai analizei buvo pasigamintas naujas cigaretės ekstraktas. Iš viso tirtos trys cigaretės – trys ekstraktai. Vienam ekstraktui prireikdavo 21 ml reagentų ir tirpiklių. Atlikus tabako ekstrakciją ir EPC, plokštelėje išryškėjo dėmė, kurios Rf reikšmė sutampa su
nikotino etalono Rf reikšme. Kotininas buvo neidentifikuotas, nes jo kiekiai tabake yra labai maži.
3.5. Kiekybinė tabako analizė
Identifikavus nikotiną tabako ekstrakte toliau buvo vykdoma kiekybinė analizė. Buvo padarytos nikotinui ir kotininui tiesinės regresijos kalibracinės kreivės pagal smailės plotą (11 pav. ir 12 pav). Kalibracinės kreivės yra paremtos šviesos absorbcijos smailės ploto priklausomybe nuo analizuojamo junginio koncentracijos (mg/ml) dėmėje. Kiekviena kalibracinė kreivė sudaryta iš 6 kalibracinių taškų – 6 skirtingų koncentracijų etalonų, koncentracijos ribos ir koncentracijos skaičiavimo lygtys pateikiamos 3 lentelėje.
11 pav. Nikotino koncentracijos nustatymo kalibracinė kreivė
12 pav. Kotinino koncentracijos nustatymo kalibracinė kreivė
Kalibracinės kreivės yra paremtos šviesos absorbcijos smailės ploto priklausomybe nuo analizuojamo junginio koncentracijos (mg/ml) dėmėje. Kiekviena kalibracinė kreivė sudaryta iš 6 kalibracinių taškų – 6 skirtingų koncentracijų etalonų.
Naudojantis VideoScan kompiuterine programa buvo išvestos regresinės lygtys, kuriomis galima apskaičiuoti nikotino ar kotinino koncentraciją mėginyje (3 lent.).
Plotas
Plotas
mg/ml
