LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA
ROMAN BOTOV
PRADINĖS AMŽINĖS GELTONOSIOS DĖMĖS DEGENERACIJOS SĄSAJOS SU CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 GENOTIPU
Medicinos vientisųjų studijų programos baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovė: Dr. Rasa Liutkevičienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SANTRUMPOS ... 7 SĄVOKOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje ... 11
1.2. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos formos ir tinklainės pokyčiai ... 11
1.3. Citochromo P450 genų šeima ir jos sąsajos su amžnės geltonosios dėmės degeneracijos patogeneze. ... 14
1.4. CYP2J2 genas: struktūra ir funkcijos ... 14
2. TYRIMO METODIKA ... 16
2.1. Tyrimo planavimas ... 16
2.2. Tyrimo objektas ... 16
2.3. Tiriamųjų atranka ... 16
2.4. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas ... 17
2.5. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru ... 19
2.6. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu ... 19
2.7. Statistinė analizė ... 21
3. REZULTATAI ... 22
3.1. Rs890293 genotipo dažnis pacientų, sergančių pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje ... 22
3.2. Rs890293 polimorfizmas, sergantiems pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje atsižvelgiant į tiriamųjų lytį ... 24
3.3. Rs890293 geno polimorfizmo sąsajos sergančių pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija amžiaus grupėse iki 65 metų bei 65 metų ir vyresnių ... 24
3
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 26
5. IŠVADOS ... 28
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 29
4
SANTRAUKA
Baigiamojo magistro darbo autorius: Roman Botov
Baigiamojo magistro darbo pavadinimas: Pradinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajos su CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 genotipu.
Vadovė: Dr. Rasa Liutkevičienė
Amžinė geltonosios dėmės degeneracija (AGDD) - tai geltonosios dėmės pakenkimas, dėl kurio ženkliai ir negrįžtamai prarandamas centrinis matymas. Iki šiol AGDD etiopatogeneziniai veiksniai nėra visiškai aiškūs. Manoma, kad amžinė geltonosios dėmės degeneracija yra daugiaveiksnės etiologijos liga, kurios išsivystymą lemia tiek aplinkos, tiek žmogaus organizmo ypatybinių bei genetinių veiksnių sąsaja. Yra nustatyta, jog drūzas, atsirandančias ligos metu, sudaro apie 40 proc. lipidų. Todėl buvo pasirinktas genas CYP2J2, kuris dalyvauja lipidų apykaitoje.
Šio tyrimo tikslas – nustatyti pradinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajas su CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 geno polimorfizmu.
Uždaviniai: 1) Nustatyti Rs890293 genotipo dažnį pacientams, sergantiems pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija bei sveikiems tiriamiesiems; 2) Nustatyti Rs890293 geno polimorfizmą, sergantiems pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje priklausomai nuo lyties; 3) Nustatyti Rs890293 geno polimorfizmo sąsajas sergant pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija, pacientams iki 65 metų amžiaus ir 65 metų bei vyresniems.
Tyrime dalyvavo 204 pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija sergantys asmenys ir 198 sveiki asmenys. DNR skyrimas buvo atliktas naudojant komercinius DNR skyrimo iš kraujo rinkinius. Genotipo nustatymas atliktas naudojant tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodą. Rezultatų vertinimui buvo naudota statistinė duomenų analizės programa ,,IBM SPSS Statistics 20.0“.
Rezultatai: CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis
sergantiems AGDD, lyginant su kontroline grupe: 0 proc. vs. 2,5 proc. (p=0,028). CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotipas taip pat buvo statistiškai reikšmingai retesnis vyresnių (≥65 m.) sergančių grupėje, nei sveikųjų grupėje (≥65 m.): 0 proc. vs. 5,4 proc., atitinkamai (p=0,03).
5
SUMMARY
Author of master thesis: Roman Botov
Full title of master thesis: CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 genotype association with early stage age-related macular degeneration.
Supervisor: PhD Rasa Liutkevičienė
Age-related macular degeneration (AMD) is disease of the macula, which significantly affects the eyesight and leads to irreversible central vision loss. The etiopathogenesis of AMD is not absolutely clear till now. It is thought that age-related macular degeneration has a multifactorial etiology, the development of which may be caused by interrelation of environmental, body peculiarities; also genetic factors have an impact. Macular degenerative changes occur due to formation of drusen, which contains about 40% of lipids. CYP2J2 gene is involved in metabolism of lipids, according to this CYP2J2 gene was selected for investigation in our research.
The purpose of this study is to determine the relation between the early stage and CYP2J2 (-76G>T) gene Rs890293 polymorphism. Objectives of the study: 1) To determine the frequency of genotypes Rs890293 polymorphism in patients with early age-related macular degeneration and control group; 2) To determine the Rs890293 polymorphism in patients with early stage age-related macular
degeneration and control group, depend on gender; 3) To determine the relation of Rs890293 polymorphism in different age groups (<65 and ≥65) of patients with early exudative age-related macular degeneration.
The study enrolled 204 patients with early AMD, and in a random sample of the population n=198 (control group). Samples of DNA from peripheral white blood cells were purified by commercial kits. The genotyping test was carried out using the method of real-time PCR. The results were assessed using the statistical analysis method of ‘‘IBM SPSS Statistics 20.0‘‘.
Results: CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotype in patients with early AMD was statistically significantly less frequent than in control group: 0 proc. vs. 2.5 proc. (p=0.028). Also, CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotype was statistically significantly less frequent in older patients (≥65 years) compared to a group of control persons (≥65 years): 0% vs. 5.4% (p=0.03).
6
PADĖKA
Nuoširdžiai noriu padėkoti savo darbo vadovei dr. Rasai Liutkevičienei už pagalbą ir patarimus ruošiant šį darbą. Taip pat dėkoju LSMU NI OL laborantei Alvitai Vilkevičiūtei už patarimus ruošiant darbą bei pagalbą laboratorijoje.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas (protokolas NR. P1-BE-2-13).
7
SANTRUMPOS
AGDD – amžinės geltonosios dėmės degeneracija
ApoE – apoliproteinas E
CYP – citochromas P450
DNR – deoksiribonukleininė rūgštis
EDTA – etilendiamintetraacetatas
8
SĄVOKOS
Amžinė geltonosios dėmės degeneracija - tai su amžiumi susijęs centrinės tinklainės dalies –
geltonosios dėmės – pakenkimas, kurį dažnai lydi žymus ir negrįžtamas centrinio matymo praradimas. Fovea - geltonos dėmės centre esanti įduba.
9
ĮVADAS
Amžinė geltonosios dėmės degeneracija (AGDD) – tai geltonosios dėmės pakenkimas, dėl kurio ženkliai ir negrįžtamai prarandamas centrinis matymas. AGDD yra dažniausia aklumo priežastis, išsivysčiusių pasaulio šalių gyventojams. AGDD taip pat yra viena iš pagrindinių priežasčių, sukeliančių aklumą vyresniems nei 60 metų amžiaus žmonėms [1]. Prognozuojama, kad sergančių AGDD žmonių skaičius iki 2020 metų išaugs iki 196 milijonų ir iki 2040 metų liga pakenks 288 milijonų gyventojų regos funkcijas [2]. AGDD nustatoma trečdaliui vyresnių nei 75 metų amžiaus žmonių, o iš jų AGDD progresuoja ir sukelia regėjimo netekimą apie 6 – 8 proc. ligonių [3]. Ligos pradžioje rega būna nepakitusi, o regos aštrumo pokyčiai stebimi ligai progresuojant. Dėl to manoma, jog amžine geltonosios dėmės degeneracija gali sirgti dar daugiau žmonių. Manoma, kad amžinė geltonosios dėmės degeneracija yra daugiaveiksnės etiologijos liga, kurios pasireiškimą lemia aplinkos bei genetiniai veiksniai. Tačiau tiksli ligos etiologija ir patogenetinis mechanizmas iki šiol nėra visiškai aiškūs.
Pažanga molekulinės genetikos technologijose leidžia identifikuoti genus, kurie gali turėti įtakos ligos patogenezei. Kadangi vienas iš pagrindinių AGDD požymių yra drūzų formavimasis, kurių sudėtyje yra apie 40 proc. lipidų, didelis dėmesys AGDD patogeneziniame mechanizme kreipiamas į genus, atsakingus už lipidų metabolizmą. Citochromo P450 genų šeima, kuriai priklauso mūsų pasirinktas genas, dalyvauja lipidų apykaitoje.
Taigi šio darbo tikslas nustatyti pradinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajas su CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 geno polimorfizmu. Tikimasi, jog mūsų pasirinkto geno polimorfizmo sąsajos tyrimas suteiks naujos informacijos apie amžinės geltonosios dėmės degeneracijos patogenezę.
10
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
Nustatyti pradinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos sąsajas su CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 geno polimorfizmu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti Rs890293 genotipo dažnį pacientams, sergantiems pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija bei sveikiems tiriamiesiems.
2. Nustatyti Rs890293 geno polimorfizmą, sergantiems pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje priklausomai nuo lyties.
3. Nustatyti Rs890293 geno polimorfizmo sąsajas sergant pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija, pacientams iki 65 metų amžiaus ir 65 metų bei vyresniems.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje
Amžinė geltonosios dėmės degeneracija (AGDD) yra liga susijusi su amžiniais senėjimo pokyčiais be jokios kitos akivaizdžios priežasties, kuri atsiranda centrinėje tinklainės srityje, tai yra geltonojoje dėmėje, vyresniems nei 55 metų žmonėms [4]. Regėjimo pakenkimas ir aklumas yra tarp trijų labiausiai gąsdinančių ligų, po vėžinių susirgimų, širdies ir kraujagyslių ligų [5]. Išsivysčiusiose pasaulio šalyse, AGDD yra viena iš dažniausių regėjimo praradimo priežasčių vyresniems nei 60 metų amžiaus asmenims [1]. Daugiau 30 procentų vyresnių nei 75 metų suaugusiųjų serga šia liga ir apie 6-8 procentams liga progresuoja, sukeldama sunkiausią regėjimo aštrumo pažeidimo laipsnį [3]. Ankstyvosios AGDD paplitimas padidėja nuo 1,3 proc. ± 0,3 proc. žmonėms nuo 30 iki 40 metų amžiaus, iki 3,6 proc. ± 0,5 proc. nuo 41 ir 50 amžiaus grupėje, iki 7,9 proc. ± 0,9 proc. nuo 51 iki 60 metų amžiaus, iki 10,0 proc. ± 1,1 proc. nuo 61 iki 70 metų, iki 8,3 proc. ± 0,2 proc. nuo 71 iki 80 amžiaus asmenų ir iki 8,0 proc. ± 5,5 proc. ≥81 amžiaus asmenų grupėje [6]. Taigi, tarp pagrindinių aklumo priežasčių AGDD sudaro 8,7 proc. ir užima trečią vietą po kataraktos ir glaukomos [7]. Wong ir kiti, 2014 metais ištyrė, kad AGDD paplitimas europiečių populiacijoje buvo didesnis, nei azijiečių ir afrikiečių (12,3 proc. vs. 7,4 proc. ir 7,5 proc., atitinkamai). Taip pat, manoma, kad sergančiųjų AGDD skaičius visame pasaulyje išaugs iki 196 milijonų iki 2020 metų ir pasieks 288 milijonus 2040 metais [2].
2002 metų Neverauskienės ir bendraautorių duomenimis, Lietuvoje AGDD yra antroje vietoje tarp pirminių regos sutrikimo priežasčių po kataraktos ir sudaro 13,8 proc. [8]. Sergančių AGDD žmonių skaičius išsivysčiusiose šalyse dramatiškai didėja. Sergančiųjų tinklainės ligomis asociacija paskelbė, jog Lietuvoje sergančiųjų vėlyva amžinės geltonosios dėmės degeneracijos forma yra virš 30 tūkstančių ir kiekvienais metais jų didėja nuo 2 iki 3 tūkstančių [10]. Atsitiktinėje Kauno m. 45 – 64 metų amžiaus gyventojų imtyje, amžinės geltonosios dėmės degeneracijos paplitimas yra 7,3 proc. [11].
1.2. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos formos ir tinklainės pokyčiai
AGDD yra susijusi su patologiniais pokyčiais geltonojoje dėmėje, tai yra centrinės tinklainės srityje. Geltonosios dėmės centras yra vadinamas fovea ir ją sudaro didelė fotoreceptorių koncentracija – kūgelių, atsakingų už regėjimo aštrumą ir spalvų suvokimą (iki 200 000 ląstelių/mm2) [12, 13]. Parafovealinis plotas yra sritis, kur dominuoja stiebeliai, jie apsupa foveą ir yra atsakingi už naktinį matymą. Ankstyvosiose AGDD stadijose dažniausiai pažeidžiami fotoreceptoriai, esantys parafoveolinėje srityje [14].
12 Geltonosios dėmės degeneraciniai pokyčiai atsiranda dėl tinklainės pigmentinio epitelio (TPE) pakenkimo ir drūzų formavimosi Brucho membranoje, kuri susideda iš TPE ir gyslainės choriokapiliarinio sluoksnio (1 paveikslas). Drūzos – ekstraląsteliniai mazgelio formos depozitai, susidedantys iš fosfolipidų, kolageno ir neutraliųjų riebalų [15]. Be to, drūzas sudaro cinkas, angliavandeniai, ir bent 129 skirtingų baltymų, įskaitant apolipoproteinus (pvz., ApoE, ApoB) ir užląstelinės matriksos baltymus. Apie 30 proc. drūzų, kurių skersmuo yra 15 mikronų, susideda iš neesterifikuoto cholesteriolio, neskaidulinio amiloido ir agliutininą jungiančių angliavandenių [15]. Drūzų formavimasis tinklainėjė keičia deguonies ir maistinių medžiagų transportavimą, sukeliant tinklainės pigmentinio epitelio pažeidimus ir laipsnišką fotoreceptorių degeneraciją, kuri sąlygoja regėjimo aštrumo sumažėjimą, kuris yra susijęs su pažeistų fotoreceptorių kiekiu [12].
1 pav. Drūzų formavimasis tinklainėje [16].
Histologiškai drūzos yra skirstomos į du tipus: kietas, kurios pavaizduotos antrame paveikslėlyje, ir minkštas - 3 paveikslas. Minkštos drūzos būna didelės su neryškiai apibrėžtomis ribomis [15]. Minkštos drūzos gali sukelti eksudacinę amžinės geltonosios dėmės degeneraciją. Procesui progresuojant įauga naujos kraujagyslės, kurios nulemia proceso perėjimą į eksudacinę hemoraginę stadiją.
13 2 pav. Dešinės akies centrinėje tinklainės dalyje stebimos kietos drūzos [9].
3 pav. Kairės akies centrinėje tinklainės dalyje stebimos minkštos drūzos [9].
Kietos drūzos yra mažos, atskiros, pusrutulio arba apvalios formos, su gerai apibrėžtais kraštais [15]. Jos turi mažesnį tinklainės pigmentinio epitelio apimtį ir susideda iš netipiško amiloido A ir vitronektino virš mažų drūzų. Paprastai, kietos drūzos yra iš cholesterolio, neskaidulinio amiloido ir kalcinatų. Drūzos taip pat gali būti sudarytos iš neesterifikuoto cholesterolio turtingų branduolių, arba iš apvalkalų, kurių sudėtyje yra ApoE, ApoC-I ir esterifikuoto cholesterolio [15]. Kietos drūzos gali sukelti tinklainės pigmentinio epitelio ir choriokapiliarinio sluoksnio atrofiją [12, 13].
AGDD skirstoma į pradinę ir pažengusią formas. Esant pradinei AGDD, atsiranda didelis skaičius drūzų (≤10), kurios atsideda už tinklainės pigmentinio epitelio ir sukelia pigmentinės srities hiperpigmentaciją arba hipopigmentaciją. Pigmentacijos sritys paprastai yra išsklaidytos. Pažengusi AGDD yra skirstoma į sausąją (su tinklainės pigmentinio epitelio atrofija ir be neovaskulizacijos) ir šlapiąją (arba eksudacinę; su naujadarėmis kraujagyslėmis gyslainėje – gyslainės neovaskulizacija, kuomet formuojasi randiniai pakitimai). Šlapia forma yra sunkesnė ligos forma nei kitos. Ji sukelia didelį tinklainės pažeidimą ir dažniau sukelia regėjimo praradimą [12, 15]. AGDD ne visada progresuoja į vėlesnę ligos stadiją. Jeigu pacientui diagnozuota pradinė forma vienoje akyje, ir nėra pažeidimų kitoje
14 akyje, tai pastebėta, jog maždaug per 10 metų liga paūmėja 5 proc. Jei esant pradinei formai pažeidimai nustatomi abiejose akyse, tikimybė, kad liga komplikuosis per 15 metų yra 15 proc. [14].
1.3. Citochromo P450 genų šeima ir jos sąsajos su amžnės geltonosios dėmės degeneracijos patogeneze.
Šiuo metu yra 270 skirtingų CYP žinomų genų šeimų, 18 iš jų yra žmonių. Jos koduoja 57 žmogaus genomo genus ir genų 33 pseudogenus, genai sugrupuoti į 18 šeimų ir 42 pošeimes. CYP2, CYP3 ir CYP4 šeimoms priklauso daugiau genų, nei likusioms 15. Citochromo P450 genai koduoja baltymus, kurie yra monooksigenazės, jos katalizuoja reakcijas, galimai susijusias su vaistų, arachidono rūgšties, eikozanoidų, cholesterolio apykaita, taip pat tulžies rūgšties sinteze, steroidų sinteze, vitamino D3 sinteze ir metabolizmu, retino rūgšties hidroksilinimu. Šių genų funkcijos vis dar lieka neišaiškintos iki galo [17].
Intraląsteliniai medžiagų apykaitos procesai, sudaro normalias sąlygas molekulių transportui ir sintezei, kaip ir reguliavimo procesams ląstelėje. AGDD gali būti susijusi su lipidų metabolizmo sutrikimais. Nustatyta, kad cholesterolis yra vienas iš pagrindinių tinklainės pigmentinio epitelio ir nervinio epitelio komponentų. Apie 10 procentų tinklainėje esančių lipidų sudaro cholesterolis [18]. Ryšys tarp AGDD patogenezės ir cholesterolio buvo nustatytas maždaug prieš dešimtmetį, kai buvo ištirta, kad su amžiumi cholesterolis kaupiasi Brucho membranoje [19]. Drūzų kaupimasis ir lipidų atsidėjimas bazinėje membranoje yra normalūs senėjimo procesai, tačiau sergant AGDD šie procesai ženkliai suintensyvėja [20]. Lipidų dalelės pažeidžia sieną tarp Bruch’o membranos ir TPE membranos, taip sutrikdomas normalus metabolizmas, ko pasekoje sutrikdoma tinklainės funkcija [21]. Tarp išorinių tinklainės ląstelių ir choriokapiliarų susiformavęs hidrofobinis lipidų barjeras, lemia drūzų susidarymą [22]. Cholesterolis buvo rastas ir pačiose drūzose, jo kietose drūzose yra apie 40 proc. [19].
Kadangi CYP genų šeima dalyvauja cholesterolio metabolizme, ieškoma geno CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 sąsajų su pradinės AGDD pasireiškimu.
1.4. CYP2J2 genas: struktūra ir funkcijos
CYP2J2 genas lokalizuotas 1 žmogaus chromosomoje trumpajame petyje (1p31.3–31.2) [24]. Šis genas susideda iš 9 egzonų, atskirtų 8 intronais (4 paveikslas) [25]. Rs890293, CYP2J2 geno dažniausias polimorfizmas, lokalizuojasi −50 bp proksimaliniame CYP2J2 geno promotoriaus regione [26]. Buvo įrodyta, kad Rs890293 yra susijęs su įvairiomis ligomis, tokiomis kaip širdies vainikinių arterijų liga, aterosklerozė, miokardo infarktas ir arterinė hipertenzija [27-31].
15
pav. 4 CYP2J2 geno struktūra. Stulpeliai žymi egzono vietą [25].
Duomenų apie analogiškus tyrimus, mums prieinamose informacinėse bazėse (Medline (Pubmed), EBSCO Publishing, Lippincott Williams & Wilkins, Oxford University Press: Oxford journals, ScienceDirect, Springer Link Information Service, Wiley InterScience) nepavyko atrasti. Tačiau pastebėjome, kad yra kreipiama daug dėmesio į genus, atsakingus už cholesterolio apykaitą. Todėl mes tiriame CYP2J2 geno Rs890293 polimorfizmą, kaip galimai naują amžinės geltonosios dėmės degeneracijos patogenezės mechanizmo veiksnį.
16
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo planavimas
Baigiamojo magistro darbo tyrimai buvo atliekami Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Oftalmologijos laboratorijoje, o pacientai buvo tiriami LSMUL KK Akių ligų klinikoje. Planuojant baigiamojo magistro darbo tyrimus, visų pirma buvo išsiaiškinome temos aktualumą, ieškodami informacijos duomenų bazėse, apie pradinės amžinės geltonosios degeneracijos sąsajas su citochromo P450 šeimos genų polimorfizmais. Išanalizavome ankščiau atliktus mokslinius tyrimus, kuriuose teigiama, jog senstant didėja lipidų kaupimasis tarp Bruch‘o membranos ir tinklainės pigmentinio epitelio, sutrikdydamas normalią tinklainės funkciją, ir kad lipidai sudaro 40 proc. drūzų sudėties, kurios yra vienas iš pirminių pradinės amžinės geltonosios dėmės degeneracijos pasireiškimo požymių. Manoma, kad lipidų apykaitoje dalyvaujantys genai koduoja baltymus, dalyvaujančius cholesterolio ir kitų lipidų apykaitoje [23]. Šių genų sąsajos su AGDD vis dar nėra aiškios. Todėl nustatysime CYP2J2 Rs890293 (-76G>T) polimorfizmo sąsajas su AGDD pasireiškimu. Antrame tyrimo planavimo etape buvo užsakyti reikalingi reagentai, kuriuos gavus, buvo pradėtas baigiamojo magistro darbo tyrimas.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo metu buvo ištirtas Rs890293 (-76G>T) vieno nukleotido polimorfizmas pacientams, sergantiems pradine AGDD bei sveikiems tiriamiesiems.
2.3. Tiriamųjų atranka
Gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (protokolas Nr. P1-BE-2-13) buvo pradėtas tyrimas. Atrinkti tiriamieji, susipažinę su vykdomu tyrimu, pasirašė asmens sutikimo formą. Tyrimo metu tiriamieji buvo suskirstyti į dvi grupes:
I grupė: pacientai, sergantys pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija (n=204). Pacientų amžius pasiskirstė tarp 50 ir 93 metų (vidurkis – 69,5). Grupę sudarė 150 moterys (73,5 proc.) ir 54 vyrai (26,5 proc.).
II grupė: šią grupę sudarė 198 oftalmologinių sutrikimų neturintys sveiki asmenys. Jų amžius buvo nuo 50 iki 89 metų (vidurkis – 67,8). Šioje grupėje buvo 154 (77,8 proc.) moterų ir 44 vyrai (22,2 proc.).
17 1. Abiejų lyčių pacientai, ≥50 metų, kuriems diagnozuota pradinė lengva arba pradinė vidutinė
AGDD.
2. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos diagnozė buvo patvirtinta gydytojo oftalmologo, naudojant spalvotą akių dugno fotografiją.
3. Visi asmenys pasirašė informuotą asmens sutikimo formą.
AGDD grupės neįtraukimo į tyrimą kriterijai:
1. Kitos akių ligos (regos nervo ligos, keratitai, ragenos drumstys, lęšiuko drumstys, didelio laipsnio refrakcijos ydos, glaukoma).
2. Sisteminės ligos (būklės po audinių ar organų transplantacijos, sisteminės jungiamojo audinio ligos, cukrinis diabetas, lėtinės infekcinės ligos, onkologinės ligos).
3. Pažengusi AGDD diagnoztuota, kai nustačius gyslainės neovaskuliarizaciją arba TPE geografinę atrofiją.
4. Negraduojamos akių dugno nuotraukos dėl neskaidrumo akies optinėje sistemoje arba negraduojamos dėl prastos akių dugno nuotraukos kokybės.
Kontrolinės grupės įtraukimo į tyrimą kriterijai: 1. Oftalmologinių sutrikimų neturintys tiriamieji.
2. Tiriamieji, nesergantys lėtinėmis ir ūmiomis infekcinėmis ar neinfekcinėmis ligomis.
3. Visi asmenys pasirašė informuotą asmens sutikimo formą.
2.4. Deoksiribonukleininės rūgšties išskyrimas
DNR skyrimui kraujas buvo surinktas į vakuuminius mėgintuvėlius su EDTA (etilendiamintetraacetatu), kad nesusidarytų mikrokrešuliai. Tyrime naudojama DNR buvo išskirta iš periferinio kraujo leukocitų, naudojant ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit’’.
2.4.1. DNR išskyrimas naudojant silikagelio kolonėles
Naudojant rinkinį ,,Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit’’ DNR buvo išskirta naudojant silikagelio kolonėles. Šiuo rinkiniu greitai ir efektyviai išskirta aukštos kokybės DNR yra tinkama tolimesniems TL – PGR tyrimams.
18 Rinkinio sudedamosios dalys:
Skaidymo tirpalas (Digestion solution) Lizavimo tirpalas (Lysis solution) Plovimo buferis I (Wash buffer I) Plovimo buferis II (Wash buffer II) Eliucijos buferis (Elution buffer) Proteinazės K tirpalas
Rnazės A tirpalas Silikagelio kolonėlės
DNR išskyrimo etapai: Ląstelių lizavimas
Į sterilų, 2 ml tūrio mėgintuvėlį įpilama 200 µl preiferinio veninio kraujo su 400 µl lizavimo tirpalo bei 20 µl proteinazės K tirpalo. Mėginys sumaišomas ir inkubuojamas 56 ºC temperatūroje 10 min. Lizavimo tirpale esančios medžiagos suardo išorinę ląstelių membraną, o proteinazė K - ląstelės baltymus, taip pat branduolio membraną bei inaktyvuoja nukleazes, kurios ardo DNR.
DNR nusodinimas silikagelio kolonėlėje
Vėliau į ląstelių lizatą buvo įpilta 200 µl 96 proc. etanolio ir mėginys sumaišytas. Sąveikaujant su etanoliu, DNR precipituoja ir nepereina per kolonėlės membraną, todėl lieka nusėdusi ant jos. Kolonėlė įstatoma į surenkamąjį mėgintuvėlį ir centrifuguojama 1 min. 6000 aps./min. greičiu. Centrifuguojant, prie kolonėlės membranos prisitvirtina DNR.
DNR išvalymas nuo baltyminių liekanų, druskų ir reagentų, naudojamų ląstelių lizavimui DNR valymui naudojami du buferiai: įpylus 500 µl plovimo buferio I, mėginys centrifuguojamas 1 min. 8000 aps./min. greičiu, tuomet įpilama 500 µl buferio II ir vėl centrifuguojama 3 min. 12000 aps./min. greičiu. Po kiekvieno centrifugavimo centrifugatas nupilamas.
DNR išplovimas iš kolonėlės
Nukleorūgšties išskyrimas kolonėlėje pagrįstas adsorbcija ant kieto paviršiaus. Lizuojamos biologinio objekto ląstelės prisitvirtina ant filtrų dėl aukštos joninės jėgos tirpalų, o nuo filtro nuplaunamos specialiu eliucijos buferiu (EB). Sąveika tarp DNR ir EB priklauso nuo pH ir druskų, esančių eliucijos
19 buferyje. DNR išplovimui naudojome 75 µl EB, po to inkibavome 2 min. kambario temperatūroje ir centrifugavome 1 min. 8000 aps./min. greičiu.
2.5. DNR koncentracijos matavimas spektrofotometru
Norint tiksliai atlikti TL-PGR tyrimą, reikia išmatuoti ir parengti vienodos koncentracijos DNR tirpalus. DNR koncentracijos matavimui buvo naudojamas spektrofotometras ,,Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis‘‘. DNR koncentracija nustatoma, matuojant tirpalo absorbciją (optinį tankį) ultravioletinių bangų ilgyje. Nukleino rūgščių nustatymas vykdomas naudojant 260 nm bangos ilgio spindulius. DNR tirpale esančios baltyminės priemaišos įvertinamos apskaičiuojant optinių tankių santykis 260 nm/280 nm, kuris rodo DNR tirpalų švarumą. Jis turi būti lygus arba didesnis už 1,8.
2.6. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos metodu
Geno polimorfizmo tyrimas Rs890293 (-76G>T) buvo atliktas tikro laiko PGR metodu.
2.6.1. PGR etapai
TL – PGR sudaro trys cikliškai pasikartojantys etapai:
1. I etapas – DNR denatūracija. Šis etapas vyksta 94 – 95ºC temperatūroje. Jo metu, nutrūksta vandenilinės jungtys tarp azotinių bazių ir DNR grandinės atsiskiria viena nuo kitos.
2. II etapas – pradmenų hibridizacija, vykdoma 40 - 60ºC temperatūroje. Pradmenys šio etapo metu vandenilinėmis jungtimis jungiasi prie jiems komplementarių dauginamos DNR sričių.
3. III etapas – elongacija, vyksta 72ºC temperatūroje, reakciją katalizuoja fermentas Taq polimerazė. Šio etapo metu polimerazė sintetina komplementarią matricinei DNR grandinę.
Grandinė sintetinama iš mononukleotidų, kurie yra mišinio sudėtyje. DNR kiekis didėja eksponentiškai, kartojant denatūraciją, hibridizaciją ir elongaciją didėja eksponentiškai.
2.6.2. PGR principas
402 mėginių genotipų nustatymą atlikome tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q‘‘. Genotipavimui skirti pradmenys ir molekuliniai žibukai buvo sukurti kompanijos ,,Applied Biosystems‘‘. Kiekvienai reakcijai naudojome po 1 µl matricinės DNR (~10 ng) ir 9 µl PGR reakcijos mišinio, kurio
20 sudedamosios dalys pateiktos 1 lentelėje. TL-PGR reakcija buvo vykdyta pagal 2 lentelėje nurodytas sąlygas.
1 lentelė. Realaus laiko PGR mišinio paruošimas
Reagentai 1 pvz., µl 72 pvz., µl
TaqMan Universal Master Mix II (,,Applied Biosystems‘‘, Lietuva)
5 µl 360 µl
Sterilus ddH2O
(,,Thermo Fisher Scientific’’, Lietuva)
3,5 µl 252 µl
,,Applied Biosystems‘‘ genotipavimo rinkinys (C___9581699_80, CYP2J2, Rs890293
0,5 µl 36 µl
Viso (PGR mišinio) 9 µl 648 µl
DNR 1 µl
Viso 10 µl
2 lentelė. Optimalios genotipavimo reakcijos sąlygos nustatant Rs890293 (-76G>T) genotipą tikro laiko PGR gausintuvu ,,Rotor – Gene Q‘‘
Genotipavimo rinkinys PGR sąlygų protokolai
Produkto dydis Rs 890293 (-76G>T) “Applied Biosystem” patentas. 95ºC 10 min 50 ciklų: 92ºC 15s 60ºC 90s Nenurodyta Metodas:
1. Polimerazės grandinės reakcijos mišinys paruošiamas 72 mėginiams. 2. Mišinys išpilstomas po 9 µl į 0,1 ml tūrio 72 mėgintuvėlius.
3. Į 71 mėgintuvėlį įpilama po 1 µl DNR, o į 72-ąjį mėgintuvėlį įpilamas sterilaus vandens, kuris naudojamas kaip neigiama kontrolė.
4. Į 72 mėgintuvėliams skirtą diską ir sudedami mėgintuvėliai su genotipavimo mišiniu bei tirimųjų DNR ir ant šio disko uždedamas apsauginis žiedas.
5. Genotipavimui nustatoma programa vieno iš polimorfizmų nustatymui, naudojant ,,Alelių nustatymo" programą (angl. „Allelic Discrimination“).
21 6. Po 2 val. 30 min. genotipavimas baigiamas. Genotipavimo rezultatų pavyzdys pateikiamas 5 paveiksle. Programa nustato individų genotipus pagal skirtingų detektorių fluorescensijos intensyvumo santykį,. X ašyje VIC fluorescensiniais dažais žymėtas molekulinis žibukas, o Y ašyje FAM fluorescensiniais dažais žymėtas molekulinis žibukas. Gauti rezultatai naudojami tolimesniems statistiniams skaičiavimams.
5 pav. ,,Alelių nustatymo’’ programos rezultatų diagrama.
2.7. Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė atlikome naudodami statistinės analizės programą „IBM SPSS Statistics 20.0“. Duomenys pateikiami kaip realieji skaičiai (procentai), vidutiniai dydžiai ir standartiniai nuokrypiai (SN). Tarp dviejų nepriklausomų grupių skirtumams nustatyti buvo naudotas Mann-Whitney U kriterijus, tarp kelių skirtingų grupių – Kruskal-Wallis H kriterijus. CYP promotoriaus srities genų polimorfizmo pasiskirstymas sergantiems AGDD ir referentinėje grupėje vertintas pagal Hardy – Weinberg dėsnį (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml). Sergančiųjų AGDD ir kontrolinės grupės CYP promotoriaus srities genų polimorfizmo pasiskirstymo homogeniškumui palyginti buvo taikomas χ² ir Fisher dvipusio kriterijų skaičiavimas (http://www.graphpad.com/quickcalcs/contingency1.cfm). Skirtumai buvo laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
22
3. REZULTATAI
Tyrimo metu tiriamieji buvo suskirstyti į dvi grupes. Pirmą grupę sudarė 204 pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija sergantys asmenys: iš jų 54 vyrai (26,5 proc.) ir 150 moterys (73,5 proc.), tiriamųjų amžiaus vidurkis buvo 69,5 metai. Kontrolinę grupę sudarė 198 asmenys, 44 vyrai (22,2 proc.) ir 154 (77,8 proc.) moterys, amžiaus vidurkis buvo 67,8 metai. Tiriamųjų charakteristikos pateiktos 3 lentelėje.
3 lentelė. Tiriamųjų charakteristika
Charakteristika Tiriamieji sergantys AGDD (I grupė) n = 204 Kontrolinė grupė (II grupė) n = 198 Vyrai, n (proc.) 54 (26,5) 44 (22,2) Moterys, n (proc.) 150 (73,5) 154 (77,8) Amžiaus vidurkis 68,83 68,22
3.1. Rs890293 genotipo dažnis pacientų, sergančių pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje
Buvo įvertintas CYP2J2 geno (-76G>T) Rs890293 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje (4 lentelė). Rs890293 kontrolinė tiriamųjų grupės neatitiko Hardžio-Veinbergo dėsnio (p<0,001), tačiau pradinės AGDD grupė atitiko Hardžio-Veinbergo dėsnį (p>0,05). Buvo nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant genotipų pasiskirstymus sergantiems AGDD bei kontrolinėje grupėje. TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis sergantiems AGDD, lyginant su kontroline grupe: 0 proc. vs. 2,5 proc. (p=0,028)
23
4 lentelė. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 polimorfizmų dažnis pacientų, sergančių pradine
amžine geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinėje grupėje
Genotipas/ alelis Dažnis (proc.) Kontrolinė grupė n(proc.) (n=198) p vertė
HWE AGDD grupė n(proc.) (n=204) p vertė HWE p vertė GG 180 (90,9) <0,001 184 (90,2) 0,462 0,8655 GT 13 (6,6) 20 (9,8) 0,2774 TT 5 (2,5) 0 (0) 0,0282 Alelis G 373 (94,19) 388 (95,1) T 26 (5,81) 20 (4,9)
AGDD – amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p vertė – reikšmingumo lygmuo, p vertė HWE – reikšmingumo lygmuo pagal Hardžio-Veinbergo dėsnį, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
*p=0,0282
Taip pat atlikome dvinarę logistinę regresinę analizę, tiriamųjų sergančių AGDD ir kontrolinės grupės (5 lentelė). Rs890293 polimorfizmo analizėje, statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo.
5 lentelė. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 genotipo dvinarė logistinė regresijos analizė
Modelis Genotipas GS (95proc. PI) p reikšmė AIC
Kodominantinis GT TT 1,505 (0,727;3,116) 0 0,271 0,999 554,819 Dominantinis G/T+G/G 1,087 (0,557;2,122) 0,807 561,141 Recesyvinis T/T 0 (-) 0,999 554,054 Overdominantinis GT 1,547 (0,747;3,202) 0,240 559,791 Adityvinis --- 0,860 (0,489;1,514) 0,601 560,926
GS–galimybių santykis, AIC-akaike, p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
24 3.2. Rs890293 polimorfizmas, sergantiems pradine amžine geltonosios dėmės
degeneracija ir kontrolinėje grupėje atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Antrasis tyrimo uždavinys buvo įvertinti Rs890293 polimorfizmus, sergantiems pradine AGDD ir sveikiems tiriamiesiems, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį.
Statistiškai reikšmingų skirtumų Rs890293 tiriamiesiems nebuvo nustatyta. Rodmenys pateikti 6 lentelėje.
6 lentelė. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 polimorfizmo dažnis pacientų, sergančių pradine
AGDD ir kontrolinėje grupėje, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 genotipų dažnis pacientų sergančių pradine amžine
geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį
Genotipas Vyrai P Reikšmė Moterys P Reikšmė AGDD grupė n (proc.) (n=54) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=44) AGDD grupė n (proc.) (n=150) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=154) GG (proc.) 48 (88,9) 41 (93,2) 0,509 136 (90,7) 139 (90,3) 1 GT (proc.) 6 (11,1) 3 (6,8) 0,509 14 (9,3) 10 (6,5) 1 TT (proc.) 0 (0) 0 (0) 1 0 (0) 5 (3,2) 0,061 Alelis G T 102 (94,44) 6(5,56) 85 (96,59) 3 (3,41) 286 (95,33) 14 (4,67) 288 (93,51) 20 (6,49)
AGDD – amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
3.3. Rs890293 geno polimorfizmo sąsajos sergančių pradine amžine geltonosios dėmės degeneracija amžiaus grupėse iki 65 metų bei 65 metų ir vyresnių
Trečiasis darbo uždavinys buvo įvertinti polimorfizmų sąsajas tiriamiesiems atsižvelgiant į amžiaus grupes. Genotipų dažnių palyginimai pavaizduoti 7 lentelėje. Statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti lyginant sergančius AGDD su kontroline grupe. TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis vyresnių sergančių grupėje (≥65 metai), lyginant su kontroline grupe (≥65 metai): 0 proc. vs. 5,4 proc. (p=0,0305).
25
7 lentelė. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 genotipo dažnis, tiriamųjų sergančių pradine amžine
geltonosios dėmės degeneracija ir kontrolinės grupės, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių
Genotipas <65 metai p reikšmė ≥65 metai p reikšmė AGDD grupė n (proc.) (n=83) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=142) AGDD grupė n (proc.) (n=121) Kontrolinė grupė n (proc.) (n=56) GG 75 (90,4) 132 (93,0) 0,6114 109 (90,1) 48 (85,7) 0,4463 GT 8 (9,6) 8 (5,6) 0,2889 12 (9,9) 5 (8,9) 1 TT 0 (0) 2 (1,4) 0,5323 0 (0) 3 (5,4) 0,0305 Alelis G 158(95,18) 272 (95,77) 230 (95,04) 101 (90,18) A 8 (4,82) 12 (4,23) 12 (4,96) 16 (9,82)
AGDD-amžinė geltonosios dėmės degeneracija, p-reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
Atlikta dvinarė logistinė regresijos analizė statistiškai reikšmingų skirtumų neparodė (8 lentelė).
8 lentelė. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 genotipo, pagal amžiaus grupes, dvinarė logistinė
regresijos analizė
Modelis Genotipas GS (95 proc. PI) p reikšmė AIC <65 Kodominantinis GT 1,760 (0,635;4,882) 0,277 299,243 TT 0,00 (-) 0,999 Dominantinis G/T+T/T 1,408 (0,533;3,721) 0,490 299,793 Recesyvinis T/T 0,00 (-) 0,999 298,411 Overdominantinis GT 1,787 (0,644;4,954) 0,265 299,032 Additive --- 1,126 (0,482;2,630) 0,785 300,189 ≥65 Kodominantinis GT 0,511 (0,353;3,166) 1,057 219,909 TT 0 (-) 0,999 Dominantinis G/T+T/T 0,661 (0,254;1,720) 0,396 224,233 Recesyvinis T/T 0 (-) 0,999 217,919 Overdominantinis GT 1,123 (0,376;3,357) 0,836 224,893 Additive --- 0,543 (0,248;1,189) 0,127 222,622
GS–galimybių santykis, AIC-akaike , p–reikšmingumo lygmuo, skirtumai laikomi statistiškai reikšmingi, kai p<0,05.
26
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Mūsų atliktame tyrime nustatėme, kad CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis sergantiems AGDD, lyginant su kontroline grupe: 0 proc. vs. 2,5 proc. (p=0,028). Taip pat CYP2J2 (-76G>T) TT Rs890293 polimorfizmas buvo statistiškai reikšmingai retesnis vyresnių sergančių grupėje ( ≥65 metų), lyginant su sveiku tiriamųjų grupe (0 proc. vs. 5,4 proc., p=0,03). Galimai CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT polimorfizmas galėtų būti, kaip apsauginis genotipas. Kaip žinoma, T alelis gali lemti transkripcijos faktoriaus Sp1 prisijungimo vietos praradimą bei sumažėjusią CYP2J2 geno raišką, todėl nustatomi mažesni metabolitų kiekiai in vivo [27, 49].
Iki šiol panašių tyrimų, tiriančių šių genų polimorfizmus, sergant AGDD mūsų duomenimis nėra. Tačiau pastaruoju metu mokslininkai ieško šio polimorfizmo sąsajų ir su kitomis ligomis. Yan ir kiti, nustatė, kad CYP2J2 Rs890293 GT + TT genotipas yra susijęs su didesne vėlai pasireiškiančios Alzheimerio ligos rizika [47]. Taip pat buvo nustatytos CYP2J2 geno Rs890293 polimorfizmo sąsajos su ateroskleroze, išemine širdies liga, miokardo infarktu [27 - 29]. Kaip ir šių ligų atveju, taip pat manoma, kad lipidai ir už jų apykaitą atsakingi genai gali turėti sąsajų su AGDD patogeneze [32, 33]. Butt AL ir bendraautoriai išanalizavo atliktus tyrimus ir paskelbė, kad gauti rezultatai yra prieštaringi [34]. Kai kurių atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad didelio tankio lipoproteinų (DTL) padidėjęs kiekis didina AGDD atsiradimo riziką [34, 35]. Kituose atliktuose tyrimuose teigiama, jog DTL mažina AGDD atsiradimą [36, 37]. Taip pat buvo paskelbti tyrimų rezultatai, kurie nenustatė jokių sąsajų su DTL kiekiu kraujyje ir AGDD pasireiškimu [38, 39].
Kai kurie mokslininkai patvirtino sąsają su padidėjusiu bendru cholesteroliu kiekiu kraujyje ir eksudacine AGDD [40, 41, 42, 43, 44], tačiau buvo taip pat paskelbti tyrimai, nerodantys šio ryšio [37, 38, 45, 46].
Cougnard-Grégoire ir bendraautoriai patvirtino genų polimorfizmus susijusius su AGDD: ApoE2, ApoE4, CFH Y420H, ARMS2 A69S, LIPC, LIPC, LPL, ABCA1, CETP [21].
Mokslinių tyrimų su mūsų pasirinktu geno CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 polimorfizmu ir AGDD, mūsų duomenimis, neradome. Todėl palyginome sveikų žmonių polimorfizmo dažnius su kitų autorių atliktais tyrimais. Mūsų tyrimo ir kitų atliktų tyrimų rezultatų palyginimas pateiktas 10 lentelėje. Iš kitų tyrimų matyti, kad rezultatai gan panašūs su mūsų atliktu tyrimu, palyginus kontrolines grupes.
10 lentelė. CYP2J2 Rs890293 genotipo kontrolinių grupių palyginimas kitų autrių atliktuose
tyrimuose
Tyrimas Šalis GG (proc.) GT (proc.) TT (proc.) Viso (n)
27 2. Yan ir kiti, 2015,
[47] Kinija 95,7 4,3 351
3. Zhu ir kiti, 2013,
[25] Kinija 90,33 9,67 0,00 455
4. Ali ir kiti, 2013, [48] Egiptas 87,6 10,7 1,6 429
Huacheng Yan ir bendraautorių atliktame tyrime, CYP2J2 Rs890293 polimorfizmas buvo tirtas ieškant sąsajų su Alzheimerio liga. Gauti kontrolinės grupės genotipų dažniai pasiskirstė taip: GG 95,7 proc., GT+TT 4,3 proc. Kontrolinė grupė šiame tyrime buvo atrinkta iš atsitiktinių asmenų kinų populiacijos [47]. Šio polimorfizmo genotipų dažnis atliktame tyrime, kontrolinėje grupėje, buvo panašus į mūsų atlikto tyrimo nustatytą dažnį.
Taip pat kontrolinės grupės dažnių rezultatus palyginome ir su Qing Zhu su bendraautorių atlikto Kinijos populiacijos tyrimo rezultatais [25]. Mūsų kontrolinės grupės genotipų dažniai, sąlyginai atitiko jų tyrėjų genotipų dažnius.
CYP2J2 Rs890293 polimorfizmas buvo tirtas Ahmed Ali ir bendraautorių, ieškant sąsajos su arterine hipertenzija. Mes palyginome jų kontrolinės grupės genotipo dažnius su mūsų tyrimų: GG 87,6 proc., GT 10,7 proc. TT 1,6 proc. [48].
Vienas iš pagrindinių mūsų tyrimų trūkumų yra santykinai mažas imties dydis. Į tyrimą buvo įtraukti 402 tiriamieji: 204 AGDD sergantys pacientai ir 198 sveiki. Kaip matyti ne tik iš mūsų tyrimo [26, 47, 48], TT genotipas yra labai retas, todėl norint išsiaiškinti Rs890293 polimorfizmo vaidmenį AGDD patogenezėje, turi būti pakartotas didesnės imties grupėje.
Mūsų atliktame tyrime nustatėme, kad CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis sergantiems AGDD, lyginant su kontroline grupe: 0 proc. vs. 2,5 proc. (p=0,028) ir TT genotipas taip pat buvo statistiškai reikšmingai retesnis vyresnių (≥65 m.) sergančių grupėje, lyginant su sveikais tiriamaisiais (≥65 m.): 0 proc. vs. 5,4 proc. (p=0,03). Tyrimas turėtų būti pakartotas ištiriant didesnę tiriamųjų imtį bei pacientus, sergančius eksudacine AGDD.
28
5. IŠVADOS
1. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis AGDD sergantiems, lyginant su kontroline grupe: 0 proc. vs. 2,5 proc. (p=0,028).
2. Tiriant CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 polimorfizmą pradinės amžinės geltonosios degeneracijos ir kontrolinės grupės tiriamiesiems suskirstytiems, atsižvelgiant į tiriamųjų lytį, statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatėme.
3. CYP2J2 (-76G>T) Rs890293 TT genotipas buvo statistiškai reikšmingai retesnis vyresnių sergančių grupėje (≥65m.), lyginant su kontroline vyresnių grupe (≥65m.): 0 proc. vs. 5,4 proc. (p=0,03).
29
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Fritsche LG, Fariss RN, Stambolian S. Age-related macular degeneration: genetics and biology coming together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2014; 15: 151–171.
2. Wong WL, Su X, Li X, Cheung CM, Klein R, Cheng CY et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2014; 2(2):e106-16.
3. Friedman DS, O’Colmain BJ, Munoz B, Tomany SC, McCarty C, de Jong PT et al. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 2004; 122: 564– 572.
4. Klein R, Peto T, Bird A, Vannewkirk MR. The epidemiology of age-related macular degeneration. Am J Ophthalmol. 2004; 137: 486–495.
5. Ferris FL, Wilkinson CP, Bird A, Chakravarthy U, Chew E, Csaky K et al. Clinical
classification of age-related macular degeneration. Ophthalmology. 2013; 120(4): 844–851.
6. Nangia V, Jonas JB, Kulkarni M, Matin A. Prevalence of age-related macular degeneration in rural central India: the Central India Eye and Medical Study. Retina. 2011; 31: 1179–1185.
7. Resnikoff S, Pascolini D, Etya’ale D, Kocur I, Pararajasegaram R, Pokharel GP et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bull World Health Organ. 2004; 82: 844–851.
8. Neverauskiene J, Chaleckiene G, Baniuliene D, Kalasauskiene A. Blindness incidence in Lithuania. Int J of Ophthalmol. 2003; 3: 225-228.
9. Liutkevičienė R. Amžinės geltonosios dėmės degeneracijos ir išeminės širdies ligos sąsajos su matrikso metaloproteinazių genų polimorfizmu. Daktaro disertacija, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, 2011.
10. Stanislovaitienė D. Klinikinių veiksnių, oksidacinio streso žymens N – karboksi(metil)lizino ir SCARB1 geno polimorfizmo ssajos su amžine geltonosios dėmės degeneracija ir išemine širdies liga. Daktaro disertacija, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, 2013.
11. Cimbalas A, Paunksnis A, Černiauskienė LR, Domarkienė S. Vidutinio amžiaus žmonių sergamumas makulopatija, susijusia su amžiumi, ir jos rizikos veiksniai. Medicina (Kaunas). 2003; 39(12): 1237-1243.
12. Joseph C, Bok BD. The retina and its disorders. Elsevier/Academic Press, San Diego, CA. 2011; pp. 830–836.
30 13. Zarbin MA. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch
Ophthalmol. 2004; 122: 598–614.
14. Young RW. Pathophysiology of age-related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 1987; 31: 291–306.
15. Rudolf M, Clark ME, Chimento MF, Li CM, Medeiros NE, Curcio CA. Prevalence and morphology of druse types in the macula and periphery of eyes with age-related maculopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008; 49: 1200–1209.
16. Nowak JZ. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy. Pharmacological Reports. 2006; 58(3): 353-363.
17. Nebert DW, Wikvall K, Miller WL. Human cytochromes P450 in health and disease. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368(1612): 20120431.
18. Fourgeux C, Dugas B, Richard F, Bjorkhem I, Acar N, Bron AM, et al. Single Nucleotide Polymorphism in the Cholesterol-24S-Hydroxylase (CYP46A1) Gene and Its Association with CFH and LOC387715 Gene Polymorphisms in Age-Related Macular Degeneration.
Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2012; 53: 7026-7033.
19. Pikuleva AI, Curcio CA. Cholesterol in the retina: the best is yet to come. Prog Retin Eye Res. 2014 ; 10: 64-89.
20. Omarova S, Charvet DS, Reem ER, Mast N, Zheng W, Huang S et al. Abnormal
vascularization in mouse retina with dysregulated retinal cholesterol homeostasis. J Clin Invest. 2012; 122(8): 3012-3023.
21. Cougnard–Grégoire A, Delyfer MN, Korobelnik JF, Rougier MB, Goff M, Dartigues JF et al. Elevated high–density lipoprotein cholesterol and age–related macular degeneration: the alienor study. PLoS One. 2014; 9(3):e90973.
22. Curcio CA. Christine Mice With Cholesterol in Bruch‘s Membrane: Have We Arrived? Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Nov; 55(11):7296.
23. Curcio CA, Johnson M, Rudolf M, Huang JD. The oil spill in ageing Bruch membrane. Br J Ophthalmol. 2011 Dec; 95(12): 1638–1645.
24. Ma J, Ramachandran S, Fiedorek FT, Zeldin JrDC. Mapping of the CYP2J cytochrome P450 genes to human chromosome 1 and mouse chromosome 4. Genomics. 1998; 49: 152–155.
25. Zhu Q1, Fu Z, Ma Y, Yang H, Huang D, Xie X et al. A novel polymorphism of the CYP2J2 gene is associated with coronary artery disease in Uygur population in China. Clin Biochem. 2013; 46(12):1047-1054.
31 26. Xu M, Ju W, Hao H,. Wang G, Li P. Cytochrome P450 2J2: distribution, function, regulation,
genetic polymorphisms and clinical significance. Drug Metabol. Rev. 2013; 45: 311–352.
27. Spiecker M, Darius H, Hankeln T, Soufi M, Sattler AM, Schaefer JR et al. Risk of coronary artery disease associated with polymorphism of the cytochrome P450 epoxygenase CYP2J2. Circulation. 2004; 110; 2132–2136.
28. Lee CR, North KE, Bray MS, Couper DJ, Heiss G,. Zeldin DC. CYP2J2 and CYP2C8 polymorphisms and coronary heart disease risk: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) study. Pharmacogenet. Genomics. 2007; 17: 349–358.
29. Liu PY, Li YH, Chao TH, Wu HL, Lin LJ, Tsai LM et al. Synergistic effect of cytochrome P450 epoxygenase CYP2J2*7 polymorphism with smoking on the onset of premature myocardial infarction. Atherosclerosis. 2007; 195: 199–206.
30. Alghasham A, Ali A, Ismail H, Dowaidar M, Settin AA. CYP2J2-50 G/T and ADRB2 G46A gene polymorphisms in Saudi subjects with hypertension. Genet Test Mol Biomarkers. 2012; 16; 1027–1031.
31. Polonikov AV, Ivanov VP, Solodilova MA, Khoroshaya IV, Kozhuhov MA, Ivakin VE et al. A common polymorphism G-50T in cytochrome P450 2J2 gene is associated with increased risk of essential hypertension in a Russian population. Dis. Markers. 2008; 24: 119–126.
32. Curcio CA, Johnson M, Huang JD, Rudolf M. Apolipoprotein B-containing lipoproteins in retinal aging and age-related macular degeneration. J Lipid Res. 2010 Mar; 51(3): 451–467. 33. Ebrahimi KB, Handa JT. Lipids, lipoproteins, and age-related macular degeneration. J Lipids
2011; 2011: 802059.
34. Butt AL, Lee ET, Klein R, Russell D, Ogola G, Warn A et al. Prevalence and risks factors of age-related macular degeneration in Oklahoma Indians: the Vision Keepers Study.
Ophthalmology. 2011 Jul; 118(7): 1380–1385.
35. van Leeuwen R, Klaver CC, Vingerling JR, Hofman A, van Duijn CM, Stricker BH, De Jong PT. Cholesterol and age-related macular degeneration: is there a link? Am J Ophthalmol. 2004 Apr; 137(4): 750–752.
36. Klein R, Cruickshanks KJ, Nash SD, Krantz EM, Nieto FJ, Huang GH, Pankow JS, Klein BE. The prevalence of age-related macular degeneration and associated risk factors. Arch
Ophthalmol. 2010 Jun; 128: 750–758.
37. Tan JS, Mitchell P, Smith W, Wang JJ. Cardiovascular risk factors and the long-term incidence of age-related macular degeneration: the Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 2007; 114: 1143–1150.
32 38. Cackett P, Wong TY, Aung T, Saw SM, Tay WT, Rochtchina E et al. Smoking, cardiovascular
risk factors, and age-related macular degeneration in Asians: the Singapore Malay Eye Study. Am J Ophthalmol. 2008 Dec; 146(6): 960–967 e961.
39. Tomany SC, Wang JJ, Van Leeuwen R, Klein R, Mitchell P, Vingerling JR et al. Risk factors for incident age-related macular degeneration: pooled findings from 3 continents.
Ophthalmology. 2004 Jul; 111: 1280–1287.
40. Reynolds R, Rosner B, Seddon JM. Serum lipid biomarkers and hepatic lipase gene
associations with age-related macular degeneration. Ophthalmology. 2010 Oct; 117(10): 1989– 1995.
41. Nowak M, Swietochowska E, Marek B, Szapska B, Wielkoszynski T, Kos-Kudla B et al. Changes in lipid metabolism in women with age-related macular degeneration. Clin Exp Med. 2005 Mar; 4(4): 183–187.
42. Hogg RE, Woodside JV, Gilchrist SE, Graydon R, Fletcher AE, Chan W et al. Cardiovascular disease and hypertension are strong risk factors for choroidal neovascularization.
Ophthalmology. 2008 Jun; 115(6): 1046–1052 e1042.
43. Mitchell P, Wang JJ, Foran S, Smith W. Five-year incidence of age-related maculopathy lesions: the Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 2002 Jun; 109(6): 1092–1097. 44. Ulas F, Balbaba M, Ozmen S, Celebi S, Dogan U. Association of dehydroepiandrosterone
sulfate, serum lipids, C-reactive protein and body mass index with age-related macular degeneration. Int Ophthalmol. 2013 Oct; 33(5):485-491.
45. Klein R, Cruickshanks KJ, Nash SD, Krantz EM, Nieto FJ, Huang GH et al. The prevalence of age-related macular degeneration and associated risk factors. Arch Ophthalmol. 2010 Jun; 128: 750–758.
46. Chakravarthy U, Wong TY, Fletcher A, Piault E, Evans C, Zlateva G et al. Clinical risk factors for age-related macular degeneration: a systematic review and meta-analysis. BMC
Ophthalmol. 2010 Dec 13; 10: 31.
47. Yan H, Kong Y, He B, Huang M, Li J, Zheng J et al. CYP2J2 Rs890293 polymorphism is associated with susceptibility to Alzheimer’s disease in the Chinese Han population. Neuroscience Letters. 2015; 593: 56-60.
48. Ali A, Wassim N, Dowaidar M, Yaseen A. Association of eNOS (E298D) and CYP2J2
(−50G/T) gene polymorphisms with hypertension among Egyptian cases. The Journal of Basic & Applied Zoology. 2013; 66(4): 234-241.
49. King LM, Ma J, Srettabunjong S, Graves J, Bradbury JA, Li L et al. Cloning of CYP2J2 gene and identification of functional polymorphisms. Mol. Pharmacol. 2002; 61: 840–852.
33
PRIEDAI
34
36
3 priedas. Publikacijų sąrašas
1. Sergejeva O, Botov R, Liutkevičienė R, Kriaučiūnienė L. Genetic factors associated with the development of age-related macular degeneration. Medicina. 2016;52(2):79-88.
2. Olga Sergejeva, Roman Botov, Rasa Čiumbaraitė, Jelena Sidorova, Ieva Gustaitė, Rasa Liutkevičienė. NR-1000F auto refractometer application in children refractive errors evaluation. Biomedical engineering 2014, At Kaunas, Volume: Vol 18, No 1. 2014;129-134
3. Olga Sergejeva, Roman Botov, Rasa Liutkevičienė. Ragenos distrofijos: literatūros apžvalga. Lietuvos bendrosios praktikos gydytojas. Kaunas. Vitae Litera. ISSN 1392-3218. 2014, t. 18, Nr. 3, p. 176-183.
