LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
ANATOMIJOS INSTITUTAS
ELEKTRONINĖS MIKROSKOPIJOS LABORATORIJA
EGIDIJUS MORKŪNAS
AMŽIAUS ĮTAKA ŠIRDIES VIDUSIENINIŲ NERVŲ ULTRASTRUKTŪRAI
Baigiamasis magistro darbas
Medicina
Darbo vadovė:
Prof. dr. Neringa Paužienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 3 SUMMARY ... 4 PADĖKA ... 5 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 5ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 7
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9
1.1. Jūrų kiaulytės ir žiurkės širdžių modeliai. ... 9
1.2. Nervų sistemos sandara ... 9
1.3. Širdies nervinė sistema ... 11
1.4. Periferinės nervų sistemos pokyčiai senstant ... 12
1.5. Širdies vidusieninių nervų pokyčiai senstant ... 13
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODIKA ... 14
2.1. Tyrimo medžiaga ... 14
2.2. Medžiagos paėmimas ir įliejimas ... 14
2.3. Pusiau ploni pjūviai ir jų analizavimas šviesiniu mikroskopu ... 16
2.4. Ploni pjūviai ir jų analizavimas transmisiniu elektroniniu mikroskopu ... 17
2.5. Morfometriniai matavimai ir statistinė duomenų analizė ... 17
3. REZULTATAI ... 18
3.1. Senų žiurkių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumai ... 18
3.2. Žiurkių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai ... 20
3.3. Senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumai ... 22
3.4. Jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai ... 23
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27
5. IŠVADOS ... 29
3
SANTRAUKA
Egidijus Morkūnas. Baigiamasis magistro darbas „Amžiaus įtaka širdies vidusieninių nervų ultrastruktūrai“. Darbo vadovė: prof. dr. Neringa Paužienė; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, Medicinos fakultetas, Anatomijos institutas.
Nėra daug žinoma apie žmogaus ar laboratorinių gyvūnų širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros pokyčius senstant, todėl šio darbo tikslas yra ištirti žiurkės ir jūrų kiaulytės širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžinius pokyčius.
Darbo uždaviniai: įvertinti senų žiurkių ir jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumus transmisiniu elektroniniu mikroskopu bei nustatyti šių nervų ultrastruktūros amžinius pokyčius, palyginant gautus duomenis su ankstesnių tyrimų duomenimis.
Medžiaga ir metodai: tyrimui panaudoti 60 trijų jūrų kiaulyčių širdžių ir 56 trijų žiurkių širdžių epikardo mėginiai iš prieširdžių ir skilvelių. Transmisiniu elektroniniu mikroskopu ištirti epikardo nervai, atlikta jų ultrastruktūros morfometrinė analizė, rezultatai palyginti su ankstesnių tyrimų duomenimis.
Rezultatai: Nustatyta, kad žiurkėms senstant padidėjo aksonų skerspjūvio plotas, bet padaugėjo labai plonų aksonų, sumažėjo aksonų skaičius nemielininėje nervinėje skaiduloje, padidėjo atvirų aksonų dalis, o uždarų aksonų mezaksonai tapo santykinai trumpesni. Jūrų kiaulytėms senstant taip pat padidėjo aksonų skerspjūvio plotas, padaugėjo labai plonų aksonų, sumažėjo aksonų skaičius nemielininėje nervinėje skaiduloje, sumažėjo uždarų aksonų dalis, o atviros dalies ilgis padidėjo.
Išvados: žiurkėms ir jūrų kiaulytėms senstant vyksta degeneraciniai ultrastruktūriniai nemielininių nervinių skaidulų pokyčiai.
4
SUMMARY
Egidijus Morkunas. Master‘s Thesis „Age-related ultrastructural changes of the intracardiac nerves“. Supervisor: prof. dr. Neringa Pauziene; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Medicine, Department of Anatomy.
Age-related changes of ultrastructure of the intracardiac nerves in human or laboratory animals are still almost unknown. The aim of this study is to analyse age-related ultrastructural changes of the intracardiac nerves in the rat and the guinea-pig.
The objectives of the study are to evaluate the ultrastructural characteristics of the intracardiac nerves in the rat and the guinea-pig by using the transmission electron microscope and to determine the age-related ultrastructural changes of these nerves by comparing the results with the results from the previous studies.
Material and methods: 60 epicardium samples of three guinea-pigs‘ hearts and 56 epicardium samples of three rats‘ hearts (from both atria and ventricles) were used in this study. Nerves of epicardium were analysed by using the transmission electron microscope, morphometric analysis of these nerves was performed and the results were compared with the results of the previous studies.
Results: This study showed these ultrastructural changes in aging rats: the mean area of the axon increased, but more very thin axons were found, the number of axons in the unmyelinated nerve fiber decreased, the percentage of axons that were not fully covered by Schwann cell, increased, and mezaxons became relatively shorter. In aging guinea-pigs the mean area of the axon also increased as well as the number of very thin axons, the number of axons in the unmyelinated nerve fiber decreased, less axons were fully covered by Schwann cells and the open part of the axon increased in length.
Conclusions: aging process in both rats and guinea-pigs was associated with degenerative ultrastructural changes of unmyelinated nerve fibers.
5
PADĖKA
Dėkoju šio darbo vadovei prof. dr. Neringai Paužienei už visapusišką pagalbą atliekant mokslinį darbą. Taip pat dėkoju LSMU MA MF Anatomijos instituto darbuotojams asist. Hermanui Inokaičiui už pagalbą dirbant su laboratoriniais gyvūnais bei Elektroninės mikroskopijos laboratorijos darbuotojai Rimutei Masienei už pagalbą ruošiant preparatus mikroskopavimui. Dėkoju prof. dr. Dainiui Haroldui Paužai už galimybę dirbti AI Elektroninės mikroskopijos laboratorijoje.
INTERESŲ KONFLIKTAS
Interesų konflikto nebuvo.
ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas atlikti eksperimentus su gyvūnais Nr. 0206, išduotas 2010-08-11.
6
SANTRUMPOS
AI – Anatomijos institutas
ANS – autonominė nervų sistema; CNS – centrinė nervų sistema; INS – intrakardinė nervų sistema;
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetatas; PNS – periferinė nervų sistema;
7
ĮVADAS
Širdis – pirmasis embriogenezės metu funkcionuoti pradedantis organas [1]. Tai – vienas svarbiausių organų, be kurių neįsivaizduojama gyvybė. Nors širdis yra vienas labiausiai mokslininkų tyrinėjamų organų, širdies ir kraujagyslių ligos išlieka viena iš pagrindinių žmonių mirties priežasčių. Normaliai širdies veiklai palaikyti labai svarbi nesutrikusi širdį inervuojančios autonominės nervų sistemos (ANS) funkcija. Yra nustatyta, kad sutrikusi ANS funkcija gali sukelti pavojingas ar net mirtinas širdies ligas: aritmijas, išeminę širdies ligą, širdies nepakankamumą ar net staigią kardialinę mirtį [2,3]. Viena iš galimų pagrindinių ANS disfunkcijos priežasčių – organizmo senėjimas.
Širdies veiklą reguliuojančią nervinę sistemą sudaro širdies nervinis rezginys, sudarytas iš simpatinių, parasimpatinių ir juntamųjų nervų ir nervinių mazgų. Nors yra išskiriami trys – epikardinis, miokardinis ir endokardinis – nerviniai širdies rezginiai, epikardinis rezginys yra pats gausiausias ir dėl to funkciškai svarbiausias [4]. Jūrų kiaulytės ir žiurkės širdies modeliai yra vieni populiariausių modelių, naudojamų širdies nervinio rezginio ypatumams tirti [5,6].
Tyrimų, nagrinėjančių periferinės nervų sistemos (PNS) morfologines ir funkcines ypatybes, yra atlikta nemažai. Tačiau amžinius nervų, ypač jų ultrastruktūros, pokyčius vertinančių darbų nėra daug ir dauguma jų analizuoja galūnių ar kitus didžiuosius nervus [7,8]. Intrakardinės nervų sistemos (IKS) morfofunkciniai tyrimai jau gana detaliai padėjo suprasti širdies nervinio rezginio topografines, morfologines ir funcines, imunohistochemines ypatybes [9–11]. Pakankamai detaliai ištirti ir amžiniai širdies nervinio rezginio pokyčiai [5,6], tačiau ultrastruktūriniu lygmeniu širdies vidusieninių nervų sandaros ypatumai organizmui senstant nėra pakankamai išanalizuoti.
Tiksliai nustatyti ir įvertinti amžiniai širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros pokyčiai galėtų padėti labiau suprasti senėjimo, kaip neišvengiamo proceso, įtaką nervams ir tuo pačiu prisidėti prie detalesnio širdies ligų patogenezės mechanizmų išaiškinimo. Todėl šio darbo tikslas yra ištirti žiurkės ir jūrų kiaulytės širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžinius pokyčius.
8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti žiurkės ir jūrų kiaulytės širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžinius
pokyčius.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti senų žiurkių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumus transmisiniu elektroniniu mikroskopu;
2. Nustatyti žiurkių širdies vidusieninių nervų amžinius pokyčius, palyginant gautus duomenis su ankstesnių Anatomijos instituto tyrimų duomenimis.
3. Įvertinti senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumus transmisiniu elektroniniu mikroskopu;
4. Nustatyti jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų amžinius pokyčius, palyginant gautus duomenis su ankstesnių Anatomijos instituto tyrimų duomenimis.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Jūrų kiaulytės ir žiurkės širdžių modeliai.
Žiurkės ir jūrų kiaulytės yra vieni dažniausiai naudojami laboratoriniai gyvūnai moksliniuose medicininiuose tyrimuose [12].
Dažniausiai tiek žiurkės, tiek jūrų kiaulytės širdies modeliai yra naudojami modeliuojant žmogaus širdies patologines būkles, tokias kaip širdies nepakankamumą, ritmo sutrikimus, staigią kardialinę mirtį, ir analizuojant struktūrinius, elektrofiziologinius širdies audinių pokyčius, esant šioms būklėms, tiriant priežastis bei kuriant galimus prevencijos ar gydymo būdus [13–18]. Abiejų gyvūnų širdies modeliai taip pat naudojami tirti kitų ligų, pavyzdžiui cukrinio diabeto, įtaką širdies audiniui ir inervacijai [19], elektrofiziologiniams širdies nervinių mazgų tyrimams [20].
Lietuvoje žiurkės ir jūrų kiaulytės širdies modeliai dažnai taikomi tirti širdies inervacijos savybes. Žiurkės širdies modelis buvo taikomas intrakardinės nervų sistemos elektrofiziologiniams ir morfologiniams tyrimams [20], tiriant širdies nervinių mazgų ypatybes, sergant cukriniu diabetu [19], elektrinės stimuliacijos poveikį angiogenezei išeminės širdies ligos atvejais [21], taip pat fiziologinių procesų tyrimuose [22]. Jūrų kiaulytės širdies modelis Lietuvoje taikytas tiriant vaistų poveikį širdies inotropinei funkcijai [23,24]. Abiejų šių gyvūnų širdies modeliai buvo taikomi tiriant ir lyginant širdies nervinių rezginių anatomines, topografines ir morfologines savybes (nepublikuoti N.Paužienės duomenys) [26] bei vertinant intrakardinės nervų sistemos amžinių pokyčių ypatumus [5,6].
1.2. Nervų sistemos sandara
Žmogaus nervų sistema yra viena sudėtingiausių organizmo organų sistemų tiek histologiškai, tiek fiziologiškai ir yra sudaryta iš milijardų nervinių ląstelių, apsuptų dar daugiau glijos ląstelių, tinklo. Skiriamos centrinė nervų sistema (CNS), apimanti galvos ir nugaros smegenis, ir periferinė nervų sistema (PNS), sudaryta iš galvinių ir nugarinių nervų, jų šakų bei nervinių mazgų. Nervais nerviniai impulsai sklinda į CNS (aferentiniai, juntamieji neuronai) ir iš CNS (eferentiniai, motoriniai neuronai). Funkciškai eferentinė PNS dalis skirstoma į somatinę, valdančią valingai kontroliuojamus skersaruožius griaučių raumenis, ir autonominę nervų sistemą (ANS), atsakingą už lygiųjų bei širdies skersaruožių raumenų ir liaukų funkcijų valdymą. ANS funkciškai ir morfologiškai skirstoma į simpatinę ir parasimpatinę nervų sistemas [27].
Dar 1891 metais vokiečių anatomas Heinrichas Waldeyeris apibrėžė svarbiausią struktūrinį ir funkcinį nervinio audinio komponentą – nervinę ląstelę arba neuroną, sudarytą iš ląstelės kūno ir
10 ataugų: vieno ar daugelio dendritų ir vieno aksono [28]. Neurono kūnas yra ląstelės metabolinis centras. Čia esančios organelės gamina membraninius ir sekrecinius baltymus ir vykdo jų pernašą ataugomis. Dendritai – įvairaus ilgio šakotos neurono ataugos, kuriomis nerviniai impulsai sklinda į neurono kūną. Aksonas – tik viena, dažniausiai ilgiausia iš neurono ataugų, kuria nervinis impulsas plinta iš ląstelės kūno. Signalai iš vienų neuronų kitiems perduodami sinapsėmis [4]. Neurono atauga, padengta neuroglijos apvalkalu ir bendra pamatine membrana, yra vadinama nervine skaidula [29]. Neuroglija svarbi, nes suteikia nervinių ląstelių ataugoms tvirtą struktūrinę atramą ir izoliuoja ją nuo aplinkos [9]. Nervinių ląstelių ataugos, dažniausiai aksonai, gali būti mielinizuotos arba nemielinizuotos. Mielininį dangalą taip pat formuoja neuroglijos ląstelės - gliocitai (CNS – oligodendrocitai, PNS – Švano ląstelės), daug kartų apsisukdami ir sluoksniuodamiesi aplink aksoną. Šis dangalas nutrūksta tik ties Ranvje sąsmaukomis, vieta tarp dviejų kaimyninių, mielino dangalą formuojančių gliocitų. Mielino apvalkalas ženkliai padidina nervinio signalo sklidimo aksonu greitį [30].
Nemielinines skaidulas, daugiausia išplitusias PNS, sudaro Švano ląstelė, apgaubianti vieną ar daugiau aksonų ir neformuojanti mielininio dangalo. Nemielininėje nervinėje skaiduloje Švano ląstelei visiškai apgaubus aksoną susidaro mezaksonas – to paties gliocito dviejų membranų formuojamas 10 nm skersmens kanaliukas, jungiantis ekstraląstelinę terpę su periaksonine ertme. Pastebėta, kad aksono gaubimas Švano ląstele nemielininėje nervinėje skaiduloje gali būti trejopas. Aksonai nemielininėje skaiduloje gali būti uždari (visiškai apgaubti Švano ląstelės ir su išorine aplinka tiesiogiai nekontaktuoja), atviri (dalis aksono lieka nepridengta Švano ląstelės ir su ekstraląsteline erdve kontaktuoja tiesiogiai) bei pliki (visiškai nedengiami gliocito, kuriuos nuo ekstraląstelinės terpės skiria tik gaubianti nervinės skaidulos pamatinė membrana) [31,32]. Pastebėta, kad aksonų dengtumas Švano ląstele skiriasi tarp skirtingų gyvūnų rūšių, pavyzdžiui, triušio širdies skilveliniuose nervuose dominuoja atviri aksonai, o žiurkės širdies nervuose dauguma aksonų uždari ir su ilgais mezaksonais (nepublikuoti N. Paužienės duomenys) [10]. Žmogaus širdies nervuose taip pat dominuoja uždari aksonai [33]. Aksonų dengtumas Švano ląstele skiriasi ir priklausomai nuo nervo topografinės lokalizacijos, pavyzdžiui, avies širdies skilveliniuose nervuose uždari aksonai gausesni užpakaliniame širdies paviršiuje lyginant su priekiniu ir kairiajame skilvelyje lyginant su dešiniuoju [29].
Klasikiniu atveju PNS nervinėje skaiduloje Švano ląstelė apgaubia kiekvieną aksoną atskirai, t. y., skaiduloje aksonai nekontaktuoja tarpusavyje. Tačiau kartais vienoje Švano ląstelės suformuotoje kišenėje ar griovelyje išsidėsto 2 ar net daugiau aksonų, kurie jau tiesiogiai liečiasi vieni su kitais. Pastebėta, kad aksonų skaičius viename Švano ląstelės griovelyje taip pat priklauso nuo gyvūno rūšies. Triušio širdies nervuose du ir daugiau aksonų viename Švano ląstelės griovelyje aptinkami dažniau nei žiurkės ar šuns širdies nervuose (nepublikuoti N. Paužienės duomenys).
11 Nervus sudaro mielininių ir nemielininių nervinių skaidulų pluoštai, apdengti jungiamojo audinio dangalais: endoneuriumu (vidiniu, kiekvieną nervinę skaidulą dengiančiu sluoksniu), perineuriumu (viduriniu, skaidulų pluoštus gaubiančiu sluoksniu) ir epineuriumu (išoriniu, storu sluoksniu, dengiančiu visą nervą) [27,29]. Nervinės skaidulos nerve pagal savo morfofunkcines savybes gali būti A, B arba C tipo. A ir B tipų nervinės skaidlos yra mielininės, kuriomis nerviniai impulsai plinta greitai (iki 120 m/s). C tipo nervinės skaidulos yra nemielininės, kurios būdingos užmazginiams ANS ir visceraliniams aferentiniams nervams [32].
1.3. Širdies nervinė sistema
Už širdies inervaciją ir nervinę reguliaciją yra atsakinga ANS, kontroliuojanti ir kitų vidaus organų veiklą [34]. Per ANS vyksta širdies raumens susitraukimo jėgos (inotropinis poveikis), širdies ritmo ir susitraukimo dažnio (chronotropinis poveikis) ir elektrinio laidumo (dromotropinis poveikis) reguliacija [35]. Širdies veiklai reguliuoti svarbios tiek simpatinė, tiek parasimpatinė, tiek atskirai išskiriama intrakardinė (INS) nervų sistemos [36,37]. Simpatinės nervinės skaidulos į širdį atkeliauja širdies nervais iš simpatinio kamieno kaklinių mazgų ir širdinėmis šakomis iš viršutinių krūtininių mazgų. Kartu šiais nervais driekiasi ir širdies juntamosios skaidulos, kurių neuronų kūnai išsidėstę aštuntajame kakliniame ir pirmuosiuose šešiuose krūtininiuose nugariniuose mazguose. Dauguma simpatinių ikimazginių nervinių skaidulų simpatinio kamieno mazguose „persijungia“ ir širdį pasiekia jau kaip užmazginės, nemielinizuotos skaidulos, kurių pagrindinis neuromediatorius - noradrenalinas [4,38]. Parasimpatinės skaidulos, dažniausiai ikimazginės, prasidėjusios nugariniame, nucleus dorsalis
nervi vagi, ir dvilypiame, nucleus ambiguus, branduoliuose, pailgosiose smegenyse, į širdį ateina
klajoklio nervo, nervus vagus, širdinėmis šakomis. Šiomis šakomis kartu eina ir juntamosios skaidulos, prasidedančios viršutiniame ir apatiniame klajoklio nervo mazguose, ganglion superius et ganglion
inferius. Dauguma širdies parasimpatinių užmazginių neuronų, kurių pagrindinis neuromediatorius –
acetilcholinas, išsidėsto širdies paviršiuje [4,39].
Simpatinės, parasimpatinės ir juntamosios nervinės skaidulos susiliedamos formuoja širdies nervinį rezginį, kuris anatomiškai skirstomas į epikardinį, miokardinį ir endokardinį sluoksnius. Nervai kartu su širdies nerviniais mazgais ir suformuoja intrakardinę nervų sistemą (INS) [4,39]. Širdies nerviniame rezginyje yra ir vidinės kilmės nervinių skaidulų, kurios prasideda širdies nerviniuose mazguose. Vidiniai širdies nerviniai mazgai ne tik integruoja ir reguliuoja simpatinį ir parasimpatinį poveikį, bet ir atlieka vidinių širdies refleksų centrų funkciją [4,37].
12
1.4. Periferinės nervų sistemos pokyčiai senstant
Visos žmogaus ar kitų gyvūnų organų sistemos augant, bręstant ir senstant keičiasi tiek funkciškai, tiek morfologiškai. Nervų sistema ne išimtis. Nepaisant to, kad neuronai yra vienos iš nedaugelio organizmo ląstelių, kurios negali dalintis, nervų sistema yra gana plastiška. Šis plastiškumas pats didžiausias embrioniniu laikotarpiu, kai susiformuoja tiek neuronų, kad dalis jų, nesudarę sinapsinių ryšių su kitais neuronais, sunyksta apoptozės būdu. Organizmui augant neuroplastiškumo pajėgumai mažėja, tačiau nervo regeneracijos galimybė, susižeidus ir augant neuronų ataugoms bei formuojant naujas sinapses, išlieka [27]. Nervų sistemos vystymosi pradžioje, visos nervinės skaidulos neturi mielininio apvalkalo ir jų mielinizacija, prasidėjusi embrioniniu laikotarpiu, pasibaigia tik pirmaisiais gyvenimo metais [4]. Senstant pamažu vyksta priešingas procesas – mielininių skaidulų demielinizacija, dėl kurios atsiranda mielininio dangalo vientisumo pažeidimai, platėja Ranvje sąsmaukos ir sumažėja nervinio impulso plitimo greitis [40–43]. Pastebėta, kad organizmui senstant ne tik plonėja mielino dangalo sluoksnis, bet ir mažėja aksonų bei nervinių skaidulų skaičius ir tankis nerve, t. y., vyksta aksonų atrofija galimai dėl sumažėjusios citoskeletinių baltymų sintezės ir transportavimo neurono atauga [43]. Tiriant skirtingo amžiaus žiurkių ir triušių nervus, nustatyta, kad nervinių skaidulų skaičius nerve dar šiek tiek didėja organizmui bręstant, o suaugus jis pradeda mažėti ir iki senatvės nuolat mažėja [44–46]. Keli tyrimai su žiurkėmis parodė, kad šis nervinių skaidulų skaičiaus ir tankio mažėjimas senstant labiausiai paliečia nemielinines, mažesnio skersmens (mažiau nei 0,7 µm) skaidulas. Tuo tarpu stambesnių nemielininių ir visų mielininių skaidulų laidumo bei tankio nerve gyvūno senėjimo procesas taip ženkliai nepaveikia [47,48]. Senėjimas paveikia ir periferinių nervų regeneracijos pajėgumus, kurie ženkliai sumažėja lyginant su jaunais organizmais. Nervo vientisumas, o kartu ir sensorinė, motorinė ar autonominė nervo funkcijos senatvėje atkuriamos sunkiau [43,49]. Organizmui senstant keičiasi ir aksono artimiausios aplinkinės ląstelės bei struktūros. Nervo dangaluose senstant proliferuoja jungiamasis audinys, daugėja kolageninių skaidulų, nervo dangalai kietėja, standėja, jungiamojo audinio ląstelėse kaupiasi lipidiniai lašeliai, ženkliai padaugėja makrofagų ir putliųjų ląstelių, nervinėse skaidulose atsiranda daugiau kolageninių kišenių [48,50]. Švano ląsteles, gaubiančias aksonus periferiniuose nervuose, senėjimo procesas taip pat paveikia: mielininėse skaidulose sumažėja jų skaičius, dėl to didėja Ranvje sąsmaukų ilgis, blogėja nervo laidumas. Dar vėliau kuriam laikui Švano ląstelių skaičius mielininėse skaidulose gali ir padidėti dėl prasidėjusio kompensacinio remielinizacijos proceso [48].
Daugelio gyvūnų nervų pokyčiai senstant panašūs, tačiau šių su senėjimu susijusių procesų intensyvumas ir mastas skiriasi priklausomai nuo gyvūnų rūšies ar porūšių [8]. Morfologiniai ir galimai senėjimo proceso nulemtų procesų skirtumai gali būti priklausomi ir nuo lyties. Nustatyta, kad
13 vyresnių moterų nervinių skaidulų tankis pusiausvyros nerve yra mažesnis nei to paties amžiaus vyrų [51].
Ultrastruktūriniai senėjimo nulemti pokyčiai paveikia daugelį PNS vykdomų funkcijų. Senstant vystosi sarkopenija (griaučių skersaruožių raumenų masės sumažėjimas), kurios viena pagrindinių priežasčių – motorinių neuronų degeneracija [52]. Taip pat senstant paveikiama ir sensorinė nervų sistema - silpsta jutimai, silpnėja refleksai, sutrinka propriorecepcija, regėjimas, dėl to dažniau griūnama, dažnesni neuropatiniai skausmai [53]. Pažeidžiama ir ANS: mažėja funkcionuojančių liaukų [7], sutrinka rainelės lygiųjų raumenų [54], žarnyno [55] ir širdies nervinė reguliacija [11].
1.5. Širdies vidusieninių nervų pokyčiai senstant
Yra atlikta nemažai mokslinių darbų, kurių metu tirti širdies nervinio rezginio ir širdies vidusieninių nervų morfologiniai, imunohistocheminiai ar elektrofiziologiniai ypatumai. Tačiau tyrimų, kuriais būtų analizuojami šių ypatumų pokyčiai senstant, atlikta labai nedaug. Širdies vidusieniniai nervai kaip PNS dalis senstant organizmui turėtų keistis panašiai kaip ir kiti nervai. 1999 metais Velso mokslininkų atliktas tyrimas su žiurkėmis parodė, kad mielininių nervinių skaidulų savybės (skaidulos skersmuo, aksono skersmuo, mielininio dangalo storis) senesnių gyvūnų širdyse reikšmingai nepakito lyginant su jaunų gyvūnų širdžių mielininėmis skaidulomis [11]. Tačiau buvo stebimi kitokie struktūriniai aksonų ir Švano ląstelių pokyčiai, kurie gali būti susiję su organizmo senėjimu. Senstant širdies vidusieninių nervų mielininėse skaidulose padaugėjo mielininio dangalo netolygumų, išgaubų, susiaurėjimų. Tiek mielininėse, tiek nemielininėse senesnių gyvūnų širdies nervų skaidulose aksono citoplazmoje stebėti panašaus į mieliną tankio intarpai, kurių jaunesnių gyvūnų nervuose nebuvo arba buvo ženkliai mažiau [11].
Analizuojant širdies nervinį rezginį, pastebėta, kad senstant nervinių mazgų skaičius ir tankis intrakardinėje nervų sistemoje mažėja, o jų vietą užima proliferuojantis fibrozinis kolageninis jungiamasis audinys [56]. Nors nervinių mazgų skaičius širdies rezginyje senstant mažėja, tačiau jų užimamas plotas didėja, taip pat didėjant neuronų ir jų branduolių plotui. Mažėja ir satelitinių ląstelių, gaubiančių neuronų kūnus nerviniuose mazguose, skaičius [57].
Vertinant širdies inervaciją, tyrimų su žiurkėmis metu nustatyta, kad senstant slopsta katecholaminerginė bei cholinerginė širdies raumens, vožtuvų ir vainikinių kraujagyslių inervacija [58,59], mažėja receptorių, pavyzdžiui, dopamino, skaičius širdyje ir vainikinėse kraujagyslėse [60]. Šių su amžiumi susijusių pokyčių reikšmė įvairioms širdies funkcijoms ir savybėms bei tokių ligų, kaip išeminės širdies ligos, miokardo infarkto ar aritmijos, patogenezei nėra iki galo ištirta.
14 Galima teigti, kad tyrimų, rodančių senėjimo įtaką širdies inervacijai ir širdies vidusieninių nervų pokyčiams morfologiniu, imunohistocheminiu ar elektrofiziologiniu aspektu, yra atlikta nepakankamai, kad galutinai suprastume, kaip ir kodėl senstant keičiasi širdies nervinė sistema ir kokią reikšmę tai turi organizmo gyvybinėms ir adaptacinėms funkcijoms išsaugoti bei palaikyti.
2. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODIKA
2.1. Tyrimo medžiaga
Tyrimui atlikti panaudoti penki seni gyvūnėliai: trys 2-3 metų amžiaus vyriškos lyties jūrų kiaulytės ir dvi vienerių metų amžiaus vyriškos lyties žiurkės. Šie gyvūnėliai gauti iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos vivariumo. Gyvūnai buvo panaudoti moksliniam tyrimui, atsižvelgiant į laboratorinės praktikos taisykles, pagal Lietuvos Respublikos Maisto ir veterinarinės tarnybos išduotą leidimą Nr. 0206.
Taip pat tyrime panaudoti vienos senos žiurkės (amžius - 21 mėn.) širdies audinių gabalėliai, įlieti į epoksidinę dervą 1989 metais ir saugoti LSMU Anatomijos instituto Neuroanatomijos laboratorijoje.
Tyrimui paimta ir ištirta 60 jūrų kiaulytės ir 56 žiurkės širdies epikardo mėginiai iš visų širdies dalių (prieširdžių, skilvelių), nuo priekinio ir užpakalinio širdies paviršių.
2.2. Medžiagos paėmimas ir įliejimas
LSMU Anatomijos institute jūrų kiaulytėms ir žiurkėms, atgabentoms iš LSMU Veterinarijos akademijos vivariumo, buvo taikoma anestezija eteriu, po kurios atlikta stuburo kaklinės dalies dislokacija. Kiekvieno gyvūno krūtinė buvo atveriama išilgai krūtinkaulio, širdis 5-10 minučių buvo perfuzuojama į kairįjį skilvelį įvestu kateteriu 0,01 M fosfatiniu buferiu (pH 7,4), atšaldytu iki 4°C, kol buvo išplaunamos širdies kameros ir kraujagyslės, nesukeliant jokių struktūrinių ląstelių pokyčių. Praplovus širdį buvo vykdoma cheminė prefiksacija – širdis buvo perfuzuojama 2,5 % gliutaraldehido tirpalu 0,1 M fosfatiniame buferyje, pH 7,4. Po to širdis buvo papildomai 10-20 min. fiksuojama ją panardinant į tą patį fiksuojantį tirpalą. Fiksuota širdis buvo karpoma gilesnėje to paties gliuraldehido fiksuojančio tirpalo pripildytoje Petri lėkštelėje. Buvo iškerpami maždaug 1x1x3 mm dydžio širdies audinio gabalėliai iš įvairių širdies vietų, vadovaujantis anksčiau Anatomijos instituto tyrėjų sudarytomis jūrų kiaulytės ir žiurkės širdžių nervinio rezginio topografijos schemomis [5,6] (1,2 pav.).
15 Gabaliukai buvo fiksuojami gliutaraldehido tirpale 4°C temperatūroje per naktį, vėliau du kartus po 10 minučių praplaunami fosfatiniu buferiu. Po to dvi valandas kambario temperatūroje buvo vykdoma antrinė fiksacija 1 % osmio tetroksido tirpalu. Šis tirpalas svarbus ne tik kaip širdies audinio fiksatorius, bet ir kaip elektroninės mikroskopijos vaizduose fosfolipidines membranas ir lipidinius intarpus išryškinanti kontrastinė medžiaga [61]. Po fiksacijos osmio tetroksido tirpalu, mėginiai buvo dar kartą 15 minučių plaunami fosfatiniu buferiniu tirpalu ir dehidratuojami didėjančios koncentracijos etanolio tirpalais: po 10 min. 30 proc., 50 proc., 70 proc. ir 96 proc. etanolio tirpalais, po to tris kartus po 10 min. 100 proc. etanoliu bei 3 kartus po 10 min. 100 proc. acetonu. Vėliau mėginiai buvo palaipsniui infiltruojami acetono ir epoksidinių dervų („Epon 812“ ir „Araldit 502“, gamintojas „Serva“) mišiniu kambario temperatūroje: mišinyje, kuriame acetono ir dervos santykis 2:1 mėginiai buvo laikomi 12 val., mišinyje, kuriame acetono ir dervos santykis 1:2 – taip pat 12 valandų, tik dervoje – 24 val. Sunumeruoti mėginiai buvo suorientuojami specialiose formelėse išilgai epikardo, siekiant tirti nervų skerspjūvius, ir jose įlieti į tų pačių epoksidinių dervų mišinį. Derva su joje įlietais širdies audinio gabaliukais buvo polimerizuojama 48 valandas 60°C temperatūroje.
1 pav. Žiurkės širdies nervinio rezginio schema.
Schematiškai pavaizduotas priekinis (a) ir užpakalinis (b) žiurkės širdies paviršiai. Baltomis rodyklėmis pažymėtos ekstrakardinių nervų įėjimo į prieširdžius vietos. Juodos rodyklės rodo nervinio rezginio išsidėstymą širdies paviršiuje, jo plitimo eigą ir kryptis. Pilki ploteliai žymi širdies nervinių mazgų vietas. Žiurkės širdies audinio gabaliukai buvo kerpami vadovaujantis šia schema ir stengiantis, kad nervai kuo tiksliau pakliūtų į iškirptą medžiagą. Raudoni stačiakampiai žymi apytikslias mėginių iškirpimo vietas. DKV – dešinioji kranialinė (galvinė) vena; KKV – kairioji kranialinė (galvinė) vena; Ao – aorta; PT – plautinis kamienas; CV – kaudalinė (uodeginė) vena; LPS – kairysis plautinis antis; MPS – vidurinysis plautinis antis; RPS – dešinysis plautinis antis. Iliustracija parenkta pagal Batulevičius ir kt., 2003 (5).
16
2 pav. Jūrų kiaulytės širdies nervinio rezginio schema.
Schematiškai pavaizduotas priekinis (a) ir užpakalinis (b) jūrų kiaulytės širdies paviršiai. Baltomis rodyklėmis pažymėtos ekstrakardinių nervų įėjimo į prieširdžius vietos. Juodos rodyklės rodo nervinio rezginio išsidėstymą širdies paviršiuje, jo plitimo eigą ir kryptis. Pilki ploteliai žymi širdies nervinių mazgų vietas. Jūrų kiaulytės širdies audinio gabaliukai buvo kerpami vadovaujantis šia schema ir stengiantis, kad nervai kuo tiksliau pakliūtų į iškirptą medžiagą. Raudoni stačiakampiai žymi apytikslias mėginių iškirpimo vietas. DKV – dešinioji kranialinė (galvinė) vena; PT – plautinis kamienas; CV – kaudalinė (uodeginė) vena; LPS – kairysis plautinis antis; MPS – vidurinysis plautinis antis; RPS – dešinysis plautinis antis. Iliustracija parenkta pagal Batulevičius ir kt., 2005 (6).
2.3. Pusiau ploni pjūviai ir jų analizavimas šviesiniu mikroskopu
Polimerizavus epoksidinę dervą, naudojantis metaliniais skutimosi peiliukais, iš dervos blokelių buvo paruošiamos pirminės piramidės, nupjaunant perteklinę dervą. Pusiau ploni pjūviai (1 µm storio) buvo pjaunami ultramikrotomu „Tesla BS 490A“ (Brno, Čekija), naudojant stiklinius peilius. Pjūviai buvo dedami ant objektinių stiklelių ir dažomi metileno mėliu (1,3 % metileno mėlis 2 % kalio permanganato vandeniniame tirpale). Pusiau ploni pjūviai buvo analizuojami šviesiniu mikroskopu „AxioImager M1“ bei fotografuojami skaitmenine kamera „AxioCamMRm“ (abu – „CarlZeiss“, Gotingenas, Vokietija). Šviesiniu mikroskopu matomi širdies audinio mikroskopiniai vaizdai buvo detaliai aprašomi, naudojantis „Microsoft Word 2007“ programa. Mikroskopuojant ir aprašant vaizdus buvo atsižvelgiama, ar yra nervinio audinio struktūrų pjūvyje, koks jų dydis, kokia jų lokalizacija širdies audinyje, kokios skaidulos (mielininės ar nemielininės) dominuoja. Jei mikroskopuojant nervinių struktūrų nebuvo rasta, šių mėginių pusiau ploni pjūviai buvo kartojami, tikintis jas rasti gilesniuose mėginio sluoksniuose. Tyrimui elektroniniu mikroskopu atrenkami mėginiai, kuriuose buvo matomi skersiniai nervų pjūviai. Mėginiai, kuriuose ir pakartojus pusiau
17 plonus pjūvius, nervinių struktūrų rasta nebuvo, bei mėginiai, kuriuose nervai ar nervinės skaidulos išsidėsčiusios įstrižinėje projekcijoje, buvo atmetami ir toliau tyrime nebenaudojami.
2.4. Ploni pjūviai ir jų analizavimas transmisiniu elektroniniu mikroskopu
Atrinkus ploniems pjūviams tinkamus mėginius, iš jų metaliniu skutimosi peiliuku buvo paruošiamos antrinės, apie 0,1 mm2
paviršiaus ploto piramidės, bloko viršūnėje paliekant tik širdies audinio gabaliuko skerspjūvio fragmentą, kuriame yra nervinė struktūra. Ploni (70 nm storio) pjūviai buvo daromi ultramikrotomu „Leica EM UC7“ („Leica Mikrosysteme Handelsges m.b.H.“, Viena, Austrija), naudojant deimantinį peilį „DiATOME 45° Ultra“ (Bielis, Šveicarija). Pjūviai iš peilio vandens vonelės buvo surenkami ant 3 mm skersmens metalinių tinkliukų, skirtų elektroninei mikroskopijai, ir kontrastuojami uranilo acetatu ir švino citratu automatiniu dažymo įrenginiu „TEM Stainer QG-3000SC“ (RMC, Tucson, Arizona, JAV).
Ploni pjūviai buvo analizuojami transmisiniu elektroniniu mikroskopu „Tecnai BioTwin Spirit G2“ (FEI, Eindhovenas, Olandija), naudojant 120 kV elektros įtampą. Pirmiausia pjūviai surandami ir mikroskopuojami padidinus vaizdą 690-1200 kartų, naudojant kamerą „Olympus® MegaViewG2“ (Munsteris, Vokietija). Buvo išrenkami geriausi pjūviai, kuriuose nervinė struktūra kokybiškiausia, neuždengta arba minimaliai uždengta tinkliuko sijų. Toliau nervas ar nervinės struktūros buvo apžiūrimos ir fotografuojamos vaizdą didinant 4800 ir/arba 6800 kartų didesnės skiriamosios gebos kamera „16 Mega Pixel TEM CCD Eagle 4K“ naudojant programinę įrangą „TIA“ („FEI“, Eindhovenas, Olandija).
Iš viso transmisiniu elektroniniu mikroskopu ištirti 42 jūrų kiaulytės ir 36 žiurkės širdies audinio mėginiai. Nufotografuota 504 elektronogramos (jūrų kiaulytės - 281 žiurkės - 223), kurias naudojant atlikta nervų ir nervinių skaidulų ultrastruktūrinė morfometrinė analizė.
2.5. Morfometriniai matavimai ir statistinė duomenų analizė
Elektronogramose buvo atliekami morfometriniai matavimai naudojant kompiuterinę programą „AxioVision Rel. 4.8.2“ (Carl Zeiss, Jena, Vokietija). Kiekvieno nervinės skaidulos aksono skerspjūvis buvo atskirai apibrėžiamas, taip apskaičiuojant jo plotą, perimetrą ir vidutinį skersmenį. Iš viso išmatuota 2056 aksonai žiurkės nervuose ir 2664 aksonai jūrų kiaulytės nervuose. Jei aksonas atviras, buvo matuojamos jo atviros dalies ilgis, jei uždaras ir turi mezaksoną – mezaksono ilgis. Tuomet buvo apvedama visa nervinė skaidula ir taip išmatuojamas jos plotas. Buvo vertinamos ir šios
18 nervinių skaidulų ir aksonų ypatybės: aksonų skaičius skaiduloje, aksonų skaičius Švano ląstelės griovelyje, aksono dengtumas Švano ląstelės atžvilgiu (pilnai apgaubtas, dalinai gaubiamas ar visai nedengiamas). Visi parametrai buvo suvedami ir sukoduojami į lenteles naudojant „Microsoft Excel 2007“ programą.
Gauti tyrimo su suaugusiomis žiurkėmis ir jūrų kiaulytėmis rezultatai buvo palyginami su panašaus tyrimo, LSMU MA Anatomijos instituto mokslininkų atlikto su jaunomis žiurkėmis, jūrų kiaulytėmis ir kitais gyvūnais (nepublikuoti N. Paužienės duomenys). Šio tyrimo rezultatai dar nėra viešai publikuoti.
Statistinė duomenų analizė buvo atliekama naudojant programinę įrangą „IBM SPSS Statistics 23“ (SPSS Inc., Čikaga, Ilinojus, JAV). Lyginant gautų tyrimo rezultatų vidurkių reikšmes su ankstesnių AI atliktų tyrimų rezultatų vidurkių reikšmėmis buvo taikytas parametrinis Stjudento t kriterijus nepriklausomoms imtims. Skirtumai buvo laikomi statistiškai patikimi, jei p <0,05.
3. REZULTATAI
3.1. Senų žiurkių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumai
Žiurkių širdies vidusienininiuose nervų nemielininėse skaidulose buvo nedaug aksonų. Dominavo uždari ir ilgą mezaksoną turintys aksonai. Buvo aptikta daug labai plonų aksonų (3 pav.).
Nemielininių nervinių skaidulų senų žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose vidutinis plotas buvo 7,63 µm2 (1 lentelė). Šiuose nervuose buvo aptinkamos ir labai mažos (nuo 0,11 µm2), ir labai didelės (67,23 µm2
) nervinės skaidulos.
Vidutinis aksono skersmuo senos žiurkės širdies nervų nemielininėse nervinėse skaidulose buvo 1,08 µm. Mažiausias aksono skersmuo tesiekė 0,08 µm, o didžiausias – net 3,75 µm. Aksonų užimamų plotų vidurkis – 1,18 µm2. Aksonų plotų reikšmės svyravo nuo 0,005 iki 7,878 µm2
. Analizuojant aksonus buvo išskiriami labai ploni aksonai, kurių skersmuo buvo mažiau nei 0,2 µm ir plotas mažesnis nei 0,031 µm2
(3 pav.). Tokio dydžio aksonai kai kurių autorių duomenimis yra mažesni už mažiausią nurodomą aksono skersmens ar skerspjūvio ploto reikšmę [32]. Šioje grupėje labai ploni aksonai sudarė 4,9%. Labai didelių aksonų, kurių plotas viršijo 4 µm2
, dalis sudarė 3,1 proc. Buvo įvertintas ir vidutinis aksono perimetras, kuris senų žiurkių širdžių vidusieniniuose nervuose vidutiniškai siekė 3,53 µm.
Be morfometrinių aksono charakteristikų, buvo vertinamos ir kitos nemielininių nervinių skaidulų savybės. Viena iš jų – aksonų skaičius vienoje nervinėje skaiduloje. Vidutiniškai viena Švano ląstelė gaubė 2,93 aksono. Daugumos nervinių skaidulų sudėtyje buvo po 1 aksoną (44,0%), o net 74,9% visų tirtų senų žiurkių širdžių nervinių skaidulų turėjo ne daugiau nei 3 aksonus. Daugiausiai
19 vienoje nervinėje skaiduloje aptikta 28 aksonai. Dauguma aksonų buvo išsidėstę po vieną atskiruose Švano ląstelės grioveliuose (98,7%). Du ir daugiau aksonų viename gliocito griovelyje pasitaikė retai ir tesudarė 1,3% visų tirtų aksonų.
Kita svarbi aksono charakteristika – dengtumas Švano ląstele. Kiek daugiau nei trys ketvirtadaliai (75,7%) aksonų senų žiurkių širdies nervuose buvo uždari, t.y., tiesiogiai nekontaktavo su ekstraląsteline terpe ir turėjo mezaksoną (3 pav.). Vidutinis mezaksono ilgis – 0,89 µm, vidutiniškai mezaksonas sudarė 27,7% aksono perimetro. Ilgiausias išmatuotas mezaksonas siekė 12,25 µm ilgio. Ilgą mezaksoną, t.y., jau aiškiai suformuotą 10 nm skersmens kanaliuką, turėjo 74,3% visų uždarų aksonų. Likusį visų tirtų senų žiurkių širdžių aksonų ketvirtadalį (24,3%) sudarė atviri ir tiesiogiai su ekstraląsteliniu tarpu kontaktuojantys aksonai (3 pav.). Vidutinis atviros aksono skerspjūvio perimetro dalies ilgis siekė 0,405 µm, maksimalus išmatuotas atviros dalies ilgis – 2,13 µm. Vidutiniškai atviroji aksono dalis užėmė 20,2% viso aksono skerspjūvio perimetro. „Plikų“ aksonų, kurių Švano ląstelė visai nedengė, nebuvo rasta.
3 pav. Žiurkės epikardinės nervinės skaidulos.
Žiurkių epikardinėse nervinėse skaidulose dominavo uždari ir ilgus mezaksonus turintys aksonai (pažymėta mėlynomis rodyklėmis). Atvirų ir su ekstraląsteline terpe tiesiogiai kontaktuojančių aksonų (pažymėta raudonomis rodyklėmis) buvo aptinkama mažiau. Rasta nemažai labai plonų aksonų, kurių skersmuo mažesnis nei 0,2 µm (pažymėta žaliomis rodyklėmis).
20
3.2. Žiurkių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai
Rezultatai, gauti ištyrus senų žiurkių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūrinius ypatumus buvo lyginami su AI mokslininkų anksčiau atlikto tyrimo su jaunomis suaugusiomis žiurkėmis, rezultatais. Rezultatų vidurkiams palyginti buvo naudojamas Stjudento t kriterijus.
Nervinių skaidulų skerspjūvių plotų amžiniai pokyčiai nebuvo vertinti, nes anksčiau AI atlikto tyrimo metu skaidulų plotai tirti nebuvo.
Palyginus suaugusių ir senų žiurkių širdies vidusieninių nervų aksonų skersmenų vidurkius, pastebėta, kad aksonai žiurkėms senstant statistiškai reikšmingai padidėjo (p<0,001) nuo vidutiniškai 0,73 µm skersmens suaugusių žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose iki 1,08 µm skersmens atitinkamuose senų žiurkių nervuose (4 pav.). Aksonų skersmens reikšmės senstant labiau varijavo: jaunesniame amžiuje nuo 0,14 iki 1,59 µm, o vyresniame amžiuje nuo 0,08 iki 3,75 µm. Labai ploni aksonai, kurių skersmuo mažesnis nei 0,2 µm, statistiškai reikšmingai (p<0,001) didesnę dalį sudarė senų žiurkių grupėje: 0,9% suaugusių ir 4,9% senų žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose (4 pav.). Aksonų skerspjūvio plotas bei perimetras, taip pat kaip skersmuo, žiurkėms senstant statistiškai reikšmingai (p<0,001) padidėjo. Vidutinis aksono skerspjūvio plotas didėjo daugiau nei 2,5 karto, nuo 0,44 iki 1,18 µm2
, o perimetras – 1,7 karto, nuo 2,05 iki 3,53 µm (4 pav.).
4 pav. Aksonų morfometrinės analizės rezultatai ir jų amžiniai pokyčiai.
Grafiškai vaizduojami vidutinio aksono skersmens (viršuje kairėje), skerspjūvio ploto (viršuje dešinėje), perimetro (apačioje kairėje) bei labai plonų (<0,2 µm skersmens) aksonų dalies tarp visų tirtų aksonų (apačioje dešinėje) pokyčiai žiurkėms ir jūrų kiaulytėms senstant.
0,73 0,63 1,08 0,9986 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Žiurkė Jūrų kiaulytė Ak so no s ker sm uo ( µm ) suaugusi sena 0,44 0,38 1,18 0,95 0 0,5 1 1,5 Žiurkė Jūrų kiaulytė Ak so no s ker spjūv io plo ta s (µm 2) suaugusi sena 2,05 1,98 3,53 3,25 0 1 2 3 4 Žiurkė Jūrų kiaulytė Ak so no perim et ra s (µm ) suaugusi sena 0,9 1,5 4,9 2,4 0 1 2 3 4 5 6 Žiurkė Jūrų kiaulytė L aba i plo nų a ks onų da lis (%) suaugusi sena
21 Vidutinis aksonų skaičius vienoje skaiduloje senstant statistiškai reikšmingai (p<0,001) sumažėjo. Švano ląstelė, jaunesniame amžiuje vidutiniškai gaubusi 3,74 aksono, vyresniame amžiuje dengė 2,93 aksono (7 pav.). Nors aksonų skaičius žiurkei senstant mažėjo, reikšmingo amžinio didžiausio skaičiaus vienoje nervinėje skaiduloje pokyčio nepastebėta (maksimaliai 26 jaunesniame ir 28 vyresniame amžiuje). Palyginus, kokią dalį sudaro du ir daugiau aksonų viename Švano ląstelės griovelyje, nustatyta, kad senstant tokių susigrupavusių aksonų žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose dalis statistiškai reikšmingai padidėjo nuo 0,39% iki 1,3%.
Vertinant aksono dengtumą Švano ląstele, nustatyta, kad žiurkei senstant atvirų ir tiesiogiai su ekstraląsteline terpe kontaktuojančių aksonų dalis reikšmingai padidėjo. Jaunesniame amžiuje atviri aksonai pasitaikė tik maždaug kas dvidešimtą aksoną (5,27%), o žiurkei pasenus tokių aksonų jau buvo beveik kas ketvirtas (24,3%) (8 pav.). Nors uždarų aksonų, turinčių mezaksonus, senstant sumažėjo, tačiau vidutinis mezaksono ilgis suaugusių žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose (0,87 µm) ir senų žiurkių atitinkamuose nervuose (0,89 µm) statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p=0,586>0,05). Ilgais mezaksonais su ekstraląsteline aplinka besijungiančių aksonų dalis tarp visų uždarų aksonų žiurkei senstant reikšmingai padidėjo nuo 50,41% iki 74,34%. Vyresniame amžiuje gerokai padidėjo ir ilgiausio išmatuoto mezaksono reikšmė (nuo 5,24 iki 12,25 µm). Nors vidutinis mezaksono ilgis nepasikeitė, mezaksono ir aksono skerspjūvio perimetro santykis senstant statistiškai reikšmingai sumažėjo (p<0,001). Mezaksonas, jaunesniame amžiuje vidutiniškai sudaręs 43 proc. aksono skerspjūvio perimetro ilgio, žiurkei pasenus tesudarė 27,7%. Taigi senstant didėjant aksono skersmeniui, uždarų aksonų mezaksonai neilgėjo ir tapo santykinai trumpesni. Senstant padaugėjus atvirų aksonų, statistiškai reikšmingai padidėjo (p<0,001) ir vidutinis atviros aksono perimetro dalies ilgis (suaugusios žiurkės – 0,22 µm, senos – 0,405 µm) (5 pav.) bei didžiausia išmatuotos atviros dalies ilgio reikšmė (nuo 0,67 iki 2,13 µm). Taip pat senstant statistiškai reikšmingai (p<0,001) padidėjo ir atviros aksono perimetro dalies ilgio ir aksono perimetro santykis (nuo 0,16 iki 0,202) (5 pav.).
5 pav. Atviros aksono perimetro dalies ilgio pokyčiai senstant.
Žiurkėms ir jūrų kiaulytėms senstant keitėsi vidutinis atviros aksono perimetro dalies ilgis (kairėje) ir jo santykis su aksono perimetru (santykinis ilgis) (dešinėje).
0,22 0,38 0,4 0,66 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Žiurkė Jūrų kiaulytė At v iro s a k so no da lies ilg is (µm ) suaugusi sena 0,16 0,21 0,2 0,23 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Žiurkė Jūrų kiaulytė At v iro s a k so no da lies ir perim et ro s a nty k is suaugusi sena
22
3.3. Senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumai
Analizuojant senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūrą, pastebėta, kad, nervinėse skaidulose yra daugiau aksonų nei atitinkamuose žiurkių nervuose. Taip pat aptikta ženkliai daugiau atvirų ir nepilnai Švano ląstele dengiamų aksonų (6 pav.).
6 pav. Jūrų kiaulytės epikardinės nervinės skaidulos.
Jūrų kiaulyčių epikardiniuose nervuose buvo aptinkama daugiau atvirų ir su ekstraląsteline terpe tiesiogiai kontaktuojančių aksonų (pažymėta raudonomis rodyklėmis). Uždari aksonai sudarė mažesnę dalį (pažymėta mėlyna rodykle). Buvo aptinkta ir labai plonų aksonų, kurių skersmuo mažesnis nei 0,2 µm (pažymėta žaliomis rodyklėmis).
Vidutinis nemielininės nervinės skaidulos senos jūrų kiaulytės širdyje plotas buvo 6,29 µm2 (1 lentelė). Mažiausias išmatuotas nemielininės nervinės skaidulos plotas tesiekė 0,018 µm2, o didžiausias – net 45,38 µm2
.
Apskaičiuoti ir kiekvieno aksono nemielininėse nervinėse skaidulose morfometriniai parametrai: skersmuo, plotas, perimetras. Vidutinis aksono skersmuo senų jūrų kiaulyčių širdies nervuose buvo 0,9986 µm su plačiomis variacijomis nuo 0,086 iki 3,799 µm. Labai plonų aksonų, kurių skersmuo mažesnis nei 0,2 µm buvo 2,4%. Aksonų skerspjūvių plotai taip pat atitinkamai gana ženkliai varijavo: nuo mažiausio išmatuoto 0,006 µm2
skerspjūvio ploto iki ypatingai didelio – 11,332 µm2
23 plotas viršijo 4 µm2
dalis šioje grupėje sudarė tik 0,6%. Vidutinis senų jūrų kiaulyčių širdžių vidusieninių nervų aksono perimetras siekė 3,25 µm.
Tyrinėjant nemorfometrines charakteristikas, skaičiuotas ir vertintas aksonų skaičius nervinėje skaiduloje. Senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų nervinėse skaidulose vidutiniškai buvo 3,396 aksono. Turtingiausia aksonų nervinė skaidula turėjo 26 aksonus. Net trečdalyje (34,0%) nervinių skaidulų gliocitas gaubė tik vieną aksoną. Ne daugiau 4 aksonų turėjo net 76,2 proc. visų tirtų nervinių skaidulų. Didžioji dalis (98,5%) aksonų nesigrupavo po kelis ir Švano ląstelės linkyje ar griovelyje dėstėsi po vieną. Tik 1,5% aksonų tiesiogiai kontaktavo vieni su kitais ir gliocito griovelyje grupavosi po du ir daugiau aksonų.
Tiriant aksonų dengtumą Švano ląstele, nustatyta, kad 48,4% aksonų buvo uždari, tiesiogiai nekontaktavo su ekstraląsteline erdve ir turėjo mezaksoną. Tirtų senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieniniuose nervuose Švano ląstelei apgaubiant aksoną susiformavo vidutiniškai 0,43 µm ilgio mezaksonas. Ilgi mezaksonai susidarė 22,09% atvejų, kai aksonas buvo uždaras. Ilgas mezaksonas sudarė maždaug penktadalį (20,04%) aksono skerspjūvio perimetro. Daugiau nei pusė (51,3%) tirtų aksonų buvo atviri, nepilnai apgaubti Švano ląstelės. Vidutinis atviros aksono skerspjūvio perimetro dalies ilgis buvo 0,657 µm. Didžiausias išmatuotas atviros dalies ilgis – 4,57 µm. Buvo aptikta ir „plikų“ aksonų, kurie visiškai nebuvo susiję su Švano ląstele ir buvo dengiami tik pamatinės membranos. Šie „pliki“ aksonai sudarė vos 0,3% visų tirtų senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų aksonų.
3.4. Jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai
Jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai buvo vertinami tokiu pačiu principu kaip analogiškų žiurkių nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai. Nervinių skaidulų ploto pokyčiai jūrų kiaulytėms senstant nevertinti, nes anksčiau vykdyto tyrimo su jūrų kiaulytėmis metu šis parametras vertintas nebuvo.
Palyginus suaugusių ir senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų sudėtyje esančių nemielininių nervinių skaidulų aksonų morfometrinius parametrus, pastebėta, kad tiek vidutinis aksono skersmuo, tiek vidutinis aksono skerspjūvio plotas, tiek vidutinis aksono perimetras statistiškai reikšmingai (visų p<0,001) padidėjo gyvūnui senstant (4 pav.). Vidutinis aksono skersmuo senstant padidėjo nuo 0,63 iki 0,9986 µm. Kaip ir žiurkės tyrimo atveju, jūrų kiaulytei senstant atsirado daugiau plonesnių aksonų (mažiausia aksono skersmens reikšmė sumažėjo nuo 0,15 iki 0,086 µm), tačiau taip pat vyresnių gyvūnėlių nervuose buvo aptinkama ir gerokai didesnių aksonų (didžiausia išmatuota aksono skersmens reikšmė padidėjo nuo 1,67 iki 3,8 µm). Labai plonų aksonų, kurių skersmuo
24 neviršija 0,2 µm, dalis reikšmingai padidėjo jūrų kiaulytei senstant nuo 1,5% iki 2,4% (4 pav.). Vidutinis aksono skerspjūvio plotas vyresnio amžiaus gyvūnų intrakardiniuose nervuose (0,95 µm2
) lyginant su aksono skerspjūvio plotu jaunesnių gyvūnų atitinkamuose nervuose (0,38 µm2) padidėjo net 2,5 karto. Aksono perimetro vidurkis senstant taip pat ženkliai pakilo nuo 1,98 iki 3,25 µm.
Vidutiniškai vienos Švano ląstelės gaubiamų aksonų skaičius, didėjant jūrų kiaulytės amžiui, statistiškai reikšmingai (p<0,001) sumažėjo. Tirtuose jaunesnio gyvūno nervuose nervinė skaidula vidutiniškai turėjusi 7,47 aksono, pasenus teturėjo 3,396 aksono (7 pav.). Didžiausias užfiksuotas aksonų skaičius vienoje skaiduloje senstant taip pat reikšmingai sumažėjo nuo 41 iki 26. Sumažėjus aksonų skaičiui jūrų kiaulytės nervinėje skaiduloje, reikšmingai sumažėjo ir viename gliocito griovelyje susigrupavusių dviejų ir daugiau aksonų dalis. Tokių aksonų jaunesniame amžiuje buvo 2,12% visų tirtų aksonų, vyresniame amžiuje ši dalis sumažėjo iki 1,5%.
7 pav. Vidutinio aksonų skaičiaus nervinėje skaiduloje pokyčiai senstant.
Jūrų kiaulytei senstant reikšmingai pasikeitė ir aksono dengtumo Švano ląstele ypatumai. Atvirų, nevisiškai gliocito dengiamų aksonų dalis nuo trečdalio (33,63%) jaunesniame amžiuje padidėjo iki daugiau nei pusės (51,5%) vyresniame amžiuje (8 pav.). Tiek vidutinis atviros aksono perimetro dalies ilgis, tiek didžiausias išmatuotas atviros dalies ilgis statistiškai reikšmingai padidėjo (p<0,001) jūrų kiaulytei senstant. Vidutinis atviros aksono perimetro dalies ilgis padidėjo nuo 0,38 iki 0,66 µm (5 pav.). Didžiausia šio rodiklio reikšmė nuo 1,64 µm padidėjo iki 4,57 µm vykstant natūraliam senėjimo procesui. Atviros aksono perimetro dalies ilgio santykis su aksono perimetru nors ir ne daug, bet statistiškai reikšmingai (p<0,001) padidėjo nuo 0,21 iki 0,23 (5 pav.). Nors jūrų kiaulytei senstant sumažėjo uždarų, turinčių mezaksoną aksonų dalis, vidutinis mezaksono ilgis statistiškai patikimai (p<0,001) didėjo nuo 0,31 iki 0,43 µm. Visiškai suformuotą mezaksono kanalą, aksoną jungiantį su ekstraląsteline aplinka, didėjant amžiui, turėjo didesnė dalis uždarų aksonų (atitinkamai 5,12% suaugusio gyvūno amžiuje ir 22,09% senyvame amžiuje). Senesnių jūrų kiaulyčių
3,74 7,47 2,93 3,4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Žiurkė Jūrų kiaulytė Ak so nų s ka ičius nerv inėj e sk a id u lo je suaugusi sena
25 širdies vidusieniniuose nervuose buvo išmatuota didesnė ilgiausio mezaksono reikšmė (4,24 µm lyginant su 1,29 µm jaunesniame amžiuje). Statistiškai reikšmingo amžinių procesų nulemto mezaksono ilgio ir aksono perimetro santykio skirtumo nerasta (p=0,097>0,05).
8 pav. Aksonų dengimo Švano ląstele ypatumų amžiniai pokyčiai.
Senų jūrų kiaulyčių likusią dalį tirtų aksonų (0,3%) sudarė „pliki“ aksonai, gaubiami tik pamatinės membranos. 94,7 75,7 66,7 48,4 5,3 24,3 33,6 51,3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
suaugusi sena suaugusi sena
Žiurkė Jūrų kiaulytė Ak so nų deng tum as ( % ) uždaras atviras
26
Žiurkė Jūrų kiaulytė
Suaugusi Sena Suaugusi Sena
Nervinės skaidulos skerspjūvio plotas (µm2
) -* 7,637 ± 0,45 -* 6,291 ± 0,24
Aksono skersmuo (µm) 0,73 ± 0,009 1,08 ± 0,019 0,63 ± 0,009 0,999 ± 0,008 Mažiausias aksono skersmuo (µm) 0,14 0,081 0,15 0,086 Didžiausias aksono skersmuo (µm) 1,59 3,75 1,67 3,799 Labai plonų aksonų, kurių skersmuo
<0,2 µm, dalis (%) 0,9 4,9 1,5 2,4
Aksono skerspjūvio plotas (µm) 0,44 ± 0,01 1,18 ± 0,04 0,38 ± 0,01 0,95 ± 0,016 Aksono perimetras (µm) 2,05** 3,53 ± 0,06 1,98 3,25 ± 0,03 Aksonų skaičius nervinėje skaiduloje 3,74 ± 0,34 2,93 ± 0,18 7,47 ± 0,70 3,396 ± 0,12 Didžiausias aksonų skaičius nervinėje
skaiduloje 26 28 41 26
Du ir daugiau aksonų viename
griovelyje (%) 0,4 1,3 2,1 1,5
Uždarų aksonų dalis (%) 94,7 75,7 66,7 48,4
Atvirų aksonų dalis (%) 5,3 24,3 33,6 51,3
„Plikų“ aksonų dalis (%) -* 0 -* 0,3
Ilgi mezaksonai (%) 50,41 74,34 5,12 22,09
Mezaksono ilgis (µm) 0,87 0,89 ± 0,046 0,31 0,44 ± 0,02 Didžiausias mezaksono ilgis (µm) 5,24 12,25 1,29 4,24 Mezaksono ilgio ir aksono perimetro
santykis 0,43 0,28 ± 0,01 0,17 0,20 ± 0,02
Atviros aksono perimetro dalies ilgis
(µm) 0,22 0,40 ± 0,02 0,38 0,66 ± 0,01
Didžiausias atviros aksono dalies ilgis
(µm) 0,67 2,13 1,64 4,57
Atviros dalies ilgio ir aksono
perimetro santykis 0,16 0,20 ± 0,01 0,21 0,23 ± 0,0046
1 lentelė. Bendra tyrimo metu analizuotų charakteristikų suvestinė.
Suaugusių žiurkių ir jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros tyrimo duomenys surinkti iš nepublikuoto N. Paužienės straipsnio, o senų gyvūnų atitinkami duomenys gauti šio tyrimo metu. Lentelėje pateikiamos charakteristikų vidurkių reikšmės kartu su standartinėmis paklaidomis.
* - šie duomenys nebuvo vertinami anksčiau atlikto, bet nepublikuoto tyrimo metu;
** - anksčiau atlikto tyrimo rezultatuose buvo pateikiamos ne visų charakteristikų standartinės paklaidos.
27
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Ištyrus skirtingo amžiaus žiurkių ir jūrų kiaulyčių širdies vidusieninių nervų ultrastruktūros ypatumus, nustatyti gana akivaizdūs pokyčiai gyvūnui senstant. Kadangi panašių tyrimų būtent su širdies vidusieninių nervų ultrastruktūriniais pokyčiais senstant nėra atlikta daug, šio tyrimo rezultatus galima lyginti ir su tyrimų, kuriuose nagrinėti kitų lokalizacijų nervų ultrastruktūros amžiniai pokyčiai, rezultatais. PNS yra vienalytė sistema ir amžiniai nervų ultrastruktūros pokyčių procesai panašūs visame organizme.
Vienas iš svarbiausių pastebėtų pokyčių širdies vidusieniniuose nervuose gyvūnams senstant yra reikšmingas vidutinio aksonų skaičiaus nervinėje skaiduloje mažėjimas. Šis rezultatas pritaria ir kitų mokslininkų atliktų tyrimų išvadoms, kad tiek jūrų kiaulytės, tiek žiurkės širdies nerviniame rezginyje, didėjant gyvūno amžiui, ženkliai mažėja neuronų skaičius [5,6]. Lietuvos mokslininkams tiriant širdies nervinį rezginį buvo nustatyta, kad senstant mažėja nervinių mazgų skaičius ir tankis intrakardinėje nervų sistemoje [56,57]. Mažėjant nervinių mazgų skaičiui, mažėja neuronų ir tuo pačiu aksonų skaičius tiek nervinėse skaidulose, tiek apskritai visoje INS, ką patvirtino ir šio tyrimo rezultatai.
Nors vidutinis nervinių skaidulų skaičius ir vidutinis aksonų skaičius nervinėje skaiduloje senstant mažėja, vidutinis aksono užimamas skerspjūvio plotas ir skersmuo reikšmingai didėja tiek žiurkių, tiek jūsų kiaulyčių širdies vidusieniniuose nervuose. Nors tokių amžinių pokyčių jūrų kiaulyčių ar žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose mokslininkai netyrė, LSMU AI tyrėjai nustatė, kad žmogaus intrakardinėje sistemoje senstant taip pat didėja vidutinis aksono skerspjūvio plotas ir diametras [57]. Kiti mokslininkai nustatė, kad senėjimo procesas labiausiai paliečia mažo skersmens nervines skaidulas ir aksonus [47,48]. Tai taip pat galėtų būti viena iš priežasčių, kodėl vidutinis aksono plotas senstant didėja.
Nors abiejų tirtų gyvūnų širdies vidusieniniuose nervuose vidutinis aksono užimamas plotas senstant didėjo, labai plonų aksonų, kurių skersmuo buvo mažesnis nei 0,2 µm, dalis padidėjo tiriant tiek žiurkės, tiek jūrų kiaulytės medžiagą. Tokie dažniau aptinkami labai ploni aksonai, galėtų rodyti senatvinį aksonų nykimą, nervinių skaidulų atrofiją ir jų skaičiaus bei tankio mažėjimo procesą. Vyresniame amžiuje aptiktas vidutiniškai didesnis aksono plotas taip pat galėtų būti susijęs su likusių aksonų adaptacijos ir kompensacijos mechanizmais, daliai aksonų sunykus.
Abiejų tirtų gyvūnų širdies vidusieniniuose nervuose buvo stebimi panašūs amžiniai pokyčiai, susiję su aksonų dengtumu Švano ląstele. Tiek žiurkės, tiek jūrų kiaulytės atvejais senstant reikšmingai padidėjo atvirų ir su ekstraląsteline erdve tiesiogiai kontaktuojančių aksonų dalis. Be to, abiejų gyvūnų širdies vidusieniniuose nervuose senstant reikšmingai padidėjo ir kiti su aksono atvirumu susiję parametrai: vidutinis atviros aksono perimetro dalies ilgis, didžiausias išmatuotas atviros dalies ilgis ir
28 atviros aksono dalies ilgio santykis su aksono perimetru. Šie senatviniai pokyčiai galėtų būti susiję ne tik su jau nustatytu vidutinio aksonų užimamo ploto didėjimu, bet ir su atraminės Švano ląstelės senatviniu mažėjimu. Švano ląstelės vidutinio ploto mažėjimą bei jų skaičiaus mažėjimą senstant nustatė ir kiti tyrėjai [48,57].
Uždarų ir su ekstraląsteline aplinka tik per mezaksoną kontaktuojančių aksonų dalis senstant sumažėjo tiek žiurkės, tiek jūrų kiaulytės širdies vidusieniniuose nervuose. Lyginant žiurkių ir jūrų kiaulyčių atvejus, išryškėja akivaizdūs tarprūšiniai skirtumai, susiję su aksono dengtumu. Tiek jaunesniame, tiek vyresniame amžiuje žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose uždari aksonai užėmė nuo 3 iki 10 kartų didesnę dalį nei atitinkamuose jūrų kiaulyčių nervuose. Tačiau su mezaksono savybėmis susijusių ypatumų amžiniai pokyčiai, nors ir skirtingi, buvo stebimi abiejų gyvūnų atvejais. Žiurkių atveju senstant ir didėjant vidutiniam aksono skersmeniui bei plotui, uždarų aksonų mezaksonai neilgėjo (jų vidutinis ilgis senstant statistiškai reikšmingai nepakito) ir tapo santykinai trumpesni, atsižvelgiant į aksono perimetrą. Šis pokytis galėtų būti susijęs su jau nustatytu aksono ploto didėjimu senstant. Jūrų kiaulyčių atveju panašių rezultatų gauti nepavyko. Nors ženkliai sumažėjo uždarų aksonų dalis, vidutinis mezaksono ilgis ne daug, bet reikšmingai padidėjo.
Šis tyrimas papildo negausius anksčiau atliktus tyrimus, nagrinėjančius amžinius ultrastruktūrinius būtent širdies vidusieninių nervų pokyčius. Tokio pobūdžio tyrimai galėtų ženkliai prisidėti prie nuodugnesnio amžinių INS pokyčių supratimo bei padėti paaiškinti struktūrinius širdies inervacijos ir su tuo susijusius širdies audinio pokyčius bei jų mechanizmus senatvėje dažnai pasitaikančių ligų, tokių kaip arterinė hipertenzija ar aritmijos, metu.
29
5. IŠVADOS
1. Senų žiurkių širdies vidusieniniuose nervuose Švano ląstelė vidutiniškai gaubė mažiau nei tris aksonus, dominavo uždari aksonai, turintys ilgą mezaksoną, dažni buvo labai ploni aksonai. 2. Žiurkėms senstant statistiškai reikšmingai (p<0,05) padidėjo aksonų skerspjūvio plotas, tačiau
padaugėjo labai plonų aksonų. Aksonų skaičius nemielininėje nervinėje skaiduloje sumažėjo, tačiau pablogėjo aksonų uždengtumas: atvirų aksonų padaugėjo, o uždarų aksonų mezaksonai tapo santykinai trumpesni.
3. Senų jūrų kiaulyčių širdies vidusieniniuose nervuose nervinės skaidulos buvo nedaug didesnės už žiurkės ir turėjo daugiau nei tris aksonus. Švano ląstelė menkai dengė aksonus - net pusė visų aksonų buvo atviri.
4. Jūrų kiaulytėms senstant taip pat statistiškai reikšmingai (p<0,05) padidėjo aksonų skerspjūvio plotas, padaugėjo labai plonų aksonų. Aksonų skaičius nemielininėje nervinėje skaiduloje sumažėjo, o atvirų aksonų skaičius, kaip ir aksono perimetro atviros dalies ilgis, padidėjo.
30
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Männer J, Wessel A, Yelbuz TM. How does the tubular embryonic heart work? Looking for the physical mechanism generating unidirectional blood flow in the valveless embryonic heart tube. Dev Dyn [Internet]. 2010 Apr;239(4):1035–46. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20235196
2. Parati G, Esler M. The human sympathetic nervous system: its relevance in hypertension and heart failure. Eur Heart J [Internet]. 2012 May;33(9):1058–66. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22507981
3. Verrier RL, Tan A. Heart rate, autonomic markers, and cardiac mortality. Heart Rhythm [Internet]. 2009 Nov;6(11 Suppl):S68–75. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19880076
4. Stropus, R., Vaičekauskas, V., Tutkuvienė, J., Paužienė, N., Pauža DH, Dabužinskienė, A., Gedrimas, V., Aželis, V., Schumacher GH. Žmogaus anatomija 2. Kaunas: KMU leidykla; 2007.
5. Batulevicus D, Pauziene N, Pauza DH. Topographic morphology and age-related analysis of the neuronal number of the rat intracardiac nerve plexus. Ann Anat. 2003;185(5):449–59.
6. Batulevicius D, Pauziene N, Pauza DH. Architecture and age-related analysis of the neuronal number of the guinea pig intrinsic cardiac nerve plexus. Ann Anat. 2005;187(3):225–43. 7. Navarro X, Kennedy WR. Changes in sudomotor nerve territories with aging in the mouse. J
Auton Nerv Syst [Internet]. 1990 Nov;31(2):101–7. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2290000
8. Tabata H, Ikegami H, Kariya K. A parallel comparison of age-related peripheral nerve changes in three different strains of mice. Exp Anim [Internet]. 2000 Oct;49(4):295–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11109556
9. Marron K, Wharton J, Sheppard MN, Fagan D, Royston D, Kuhn DM, et al. Distribution, morphology, and neurochemistry of endocardial and epicardial nerve terminal arborizations in the human heart. Circulation [Internet]. 1995 Oct 15;92(8):2343–51. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7554220
10. Pauziene N, Alaburda P, Rysevaite-Kyguoliene K, Pauza AG, Inokaitis H, Masaityte A, et al. Innervation of the rabbit cardiac ventricles. J Anat [Internet]. 2016 Jan;228(1):26–46. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26510903
11. Atkinson, Santer. Quantitative studies on myelinated and unmyelinated nerve fibres in the interatrial septal region of aged rat hearts. J Auton Nerv Syst [Internet]. 1999 Sep 24;77(2-3):172–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11130961
31 12. Annual Report Animal Usage by Fiscal Year. 2015;
13. Liu T, Demazumder D, O’Rourke B. A Guinea Pig Model for Heart Failure-Associated Sudden Cardiac Death. Biophys J [Internet]. Elsevier; 2015 Jan;108(2):273a. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006349514027088
14. Liu T, Takimoto E, Dimaano VL, DeMazumder D, Kettlewell S, Smith G, et al. Inhibiting mitochondrial Na+/Ca2+ exchange prevents sudden death in a Guinea pig model of heart failure. Circ Res [Internet]. 2014 Jun 20;115(1):44–54. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24780171
15. Wang Y, Yuan J, Qian Z, Zhang X, Chen Y, Hou X, et al. β2 adrenergic receptor activation governs cardiac repolarization and arrhythmogenesis in a guinea pig model of heart failure. Sci Rep [Internet]. 2015;5:7681. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25567365 16. Soltysinska E, Olesen SP, Osadchii OE. Myocardial structural, contractile and
electrophysiological changes in the guinea-pig heart failure model induced by chronic sympathetic activation. Exp Physiol [Internet]. 2011 Jul;96(7):647–63. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21571815
17. Fardin NM, Antonio EL, Montemor JAS, da Veiga GL, Tucci PJF, Campos RR. Digitoxin improves cardiovascular autonomic control in rats with heart failure. Can J Physiol Pharmacol [Internet]. 2016 Jan 17;1–8. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27082032 18. Tewari SG, Bugenhagen SM, Vinnakota KC, Rice JJ, Janssen PML, Beard DA. Influence of
metabolic dysfunction on cardiac mechanics in decompensated hypertrophy and heart failure. J Mol Cell Cardiol [Internet]. 2016 Apr 13;94:162–75. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27085901
19. Batulevicius D, Frese T, Peschke E, Pauza DH, Batuleviciene V. Remodelling of the
intracardiac ganglia in diabetic Goto-Kakizaki rats: an anatomical study. Cardiovasc Diabetol [Internet]. 2013;12:85. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23758627 20. Batulevicius D, Pauziene N, Pauza DH. Key anatomic data for the use of rat heart in
electrophysiological studies of the intracardiac nervous system. Medicina (Kaunas) [Internet]. 2004;40(3):253–9. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15064547
21. Rackauskas G, Saygili E, Rana OR, Saygili E, Gemein C, Laucevicius A, et al. Subthreshold High-Frequency Electrical Field Stimulation Induces VEGF Expression in Cardiomyocytes. Cell Transplant [Internet]. 2015;24(8):1653–9. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25008404
22. Treinys R, Bogdelis A, Rimkutė L, Jurevičius J, Skeberdis VA. Differences in the control of basal L-type Ca(2+) current by the cyclic AMP signaling cascade in frog, rat, and human cardiac myocytes. J Physiol Sci [Internet]. 2015 Dec 16; Available from:
