Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas
Mikroemulsijų su ciklopirokso olaminu formulavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Baigiamasis magistro projektas
Justina Juknevičiūtė Projekto autorė
Prof. Vitalis Briedis Vadovas
Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas
Mikroemulsijų su ciklopirokso olaminu formulavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Baigiamasis magistro projektas
Medicininė chemija (6281CX001)
Justina Juknevičiūtė Projekto autorė
Prof. Vitalis Briedis Vadovas
Lekt. dr. Vaida Juškaitė Recenzentė
Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas
Justina Juknevičiūtė
Mikroemulsijų su ciklopirokso olaminu formulavimas ir
biofarmacinis vertinimas
Akademinio sąžiningumo deklaracija
Patvirtinu, kad mano, Justinos Juknevičiūtės, baigiamasis projektas tema „Mikroemulsijų su ciklopirokso olaminu formulavimas ir biofarmacinis vertinimas“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.
Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.
(vardą ir pavardę įrašyti ranka) (parašas)
Juknevičiūtė Justina. Mikroemulsijų su ciklopirokso olaminu formulavimas ir biofarmacinis vertinimas. Baigiamasis magistro projektas / vadovas / prof. Vitalis Briedis. Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas.
Studijų kryptis ir sritis (studijų krypčių grupė): chemija, fiziniai mokslai.
Reikšminiai žodžiai: mikroemulsija, ciklopirokso olaminas, ultra-efektyvioji skysčių chromatografija Kaunas, 2019. 51 p.
Santrauka
Darbo tikslas – sumodeliuoti eksperimentines mikroemulsijas su ciklopirokso olaminu ir įvertinti sistemų biofarmacinius rodiklius.
Darbo uždaviniai: išvystyti analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą kiekiniam ciklopirokso olamino įvertinimui; sumodeliuoti eksperimentines mikroemulsijas su ciklopirokso olaminu ir įvertinti jų kokybės rodiklius; ištirti ciklopirokso olamino atpalaidavimą iš modelinių sistemų in vitro; įvertinti ciklopirokso olamino skvarbą į žmogaus odą ex vivo esant skirtingoms vaistinės medžiagos kiekiams modelinėse mikroemulsijose.
Metodai: Ciklopirokso olamino kiekiniam įvertinimui naudotas validuotas ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Ciklopirokso olamino sąveika su mikroemulsijos komponentais įvertinta IR spektroskopijos metodu. Ciklopirokso olamino jautrumas šviesos poveikiui įvertintas apšvitinus ciklopirokso olamino tirpalą UVB spinduliais. Ciklopirokso olamino atpalaidavimo iš mikroemulsijų tyrimai in vitro vykdyti naudojant modifikuotas Franz tipo difuzines celes. Ciklopirokso olamino skvarbos į žmogaus odą ex vivo iš eksperimentinių mikroemulsijų tyrimai atlikti naudojant modifikuotas Bronaugh tipo pratakias difuzines celes.
Rezultatai:Veikiant ciklopirokso olamino tirpalą UVB spinduliais jis sudaro skilimo produktus ir per 30 minučių ciklopirokso olamino koncentracija sumažėjo nuo 88,85 μg/ml iki 8,53 μg/ml, taip pat susidarė naujas produktas. Sumodeliuotos mikroemulsijos yra tinkamos vartoti ant odos, jų pH vertės svyravo nuo 6,25 iki 6,94. Ciklopirokso olamino atpalaidavimo iš mikroemulsijų tyrimo in vitro metu nustatyta, kad didžiausias kiekis vaistinės medžiagos atsipalaiduoja iš sistemos, kurioje buvo 2 proc. ciklopirokso olamino – 11,3 proc. Iš mikroemulsijų, kurių sudėtyje buvo inkorporuota 1 proc. ciklopirokso olamino ir kurioje S:koS santykis buvo 5:1 atpalaiduotos vaistinės medžiagos kiekis siekė 8,4 proc. Kai S:koS santykis 6:1 buvo atpalaiduota 6,8 proc. ciklopirokso olamino ir iš mikroemulsijos, kurioje S:koS santykis buvo 7:1 – 9,8 proc. Skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimo metu nustatyta ciklopirokso olamino koncentracija epidermyje kai vaistinės medžiagos kiekis sistemoje siekė 1 proc. buvo 5,83 μg/ml, kai sistemoje buvo 2 proc. vaistinės medžiagos – 20,60 μg/ml. Dermoje nustatyta ciklopirokso olamino koncentracija kai sistemoje buvo 1 proc. ciklopirokso olamino – 21,42 μg/ml, o iš mikroemulsijos, kurioje buvo 2 proc. – 42,14 μg/ml.
Išvados: Išvystytas ir validuotas ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, kuris buvo tinkamas ciklopirokso olamino kiekybinei analizei atlikti in vitro bei ex vivo tyrimuose. In vitro atpalaidavimo tyrimas atskleidė, kad vaistinė medžiaga atsipalaiduoja iš vaistinės medžiagos nešiklio ir yra tinkama skvarbos į žmogaus odą tyrimui ex vivo atlikti. Skvarbos į žmogaus odą tyrimo metu nustatyta, kad dermoje aptikta ciklopirokso olamino koncentracija iš skirtingų koncentracijų mikroemulsijų buvo panaši ir svyravo nuo 20,6 μg/ml iki 21,1 μg/ml atitinkamai. Todėl galima teigti, kad mikroemulsijos komponentai bei jos fizinės charakteristikos neturėjo lemiamos įtakos vaistinės medžiagos prasiskverbimui į dermą.
Juknevičiūtė Justina. Formulation and Biopharmaceutical Evalutation of Microemulsion with Ciclopirox Olamine. Master's Final Degree Project / supervisor / prof. Vitalis Briedis. Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.
Study field and area (study field group): Chemistry, Physical Sciences.
Keywords: microemulsion, ciclopirox olamine, ultra-high performance liquid chromatography. Kaunas, 2019. 51 pages.
Summary
The aim of the work – to develop experimental microemulsions with ciclopirox olamine and evaluate biopharmaceutical characteristics.
Tasks: to develop and validate ultra-high performance liquid chromatography method; to prepare experimental microemulsions with ciclopirox olamine and evaluate their quality; to assess ciclopirox olamine release from experimental microemulsions in vitro; to evaluate ciclopirox olamine penetration from experimental microemulsions into human skin ex vivo.
Methods: Validated ultra-high performance liquid chromatography method was used for quantification of ciclopirox olamine. Ciclopirox olamine interaction with microemulsion components was assessed by infrared spectroscopy. Ciclopirox olamine sensitivity to light influence was evaluated by illuminate ciclopirox olamine solution with UVB light. In vitro release studies were performed using modified Franz type diffusion cells. Ciclopirox olamine skin penetration experiments ex vivo were carried out using full-thickness human skin in modified Bronaugh type flow-through diffusion cells.
Results: ciclopirox olamine was degraded by affecting it with UVB light. Concentration of ciclopirox olamine was decreased from 88.85 µg/ml to 8.53 µg/ml by effect with UVB light for 30 minutes and new compound was detected. Prepared microemulsions were suitable to use on the skin, pH values ranged from 6.25 to 6.94. Ciclopirox olamine release studies in vitro has confirmed that the highest amount of ciclopirox olamine was released from microemulsion with 2 percent of ciclopirox olamine 11.3 %. Amount of ciclopirox olamine from drug carrier with 1 percent of ciclopirox olamine was released from microemulsion with S:CoS ratios 5:1 8.4 %, microemulsion with S:CoS ratios 6:1 – 6.8 %, microemulsion with S:CoS ratios 7:1 – 9.8 %. Ciclopirox olamine was detected in epidermis – 5.83 μg/ml of microemulsion with 1 percent of ciclopirox olamine and 20.60 μg/ml of microemulsion with 2 percents of ciclopirox olamine. In dermis 21.42 μg/ml ciclopirox olamine from microemulsion with 1 percent of ciclopirox olamine and 42.14 μg/ml of microemulsion with 2 percents of ciclopirox olamine was detected.
Conclusions: Developed and validated ultra-high performance liquid chromatography method that was suitable for quantitative analysis of ciclopirox olamine for in vitro and ex vivo studies. In vitro release studies confirmed that ciclopirox olamine has been released from microemulsions and drug carrier was suitable for penetration studies into human skin ex vivo. Ciclopirox olamine penetration studies results demonstrated similar concentration of ciclopirox olamine in dermis from different microemulsions from 20.6 μg/ml to 21.1 μg/ml. Results showed that microemulsion components and their physical characteristics did not have a decisive influence to drug penetration into dermis.
PADĖKA
Už suteiktas puikias darbo sąlygas, pagalbą ir patarimus rengiant mokslinį darbą nuoširdžiai dėkoju magistro projekto darbo vadovui, Klinikinės farmacijos katedros vedėjui prof. dr. Vitaliui Briedžiui.
Už pagalbą ir patarimus atliekant mokslinius tyrimus nuoširdžiai dėkoju Klinikinės farmacijos katedros dr. Modestui Žiliui ir visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
Turinys
Įvadas ... 9
Darbo tikslas ir uždaviniai ... 10
1. Literatūros apžvalga ... 11
1.1. Žmogaus oda ir jos ligos ... 11
1.2. Ciklopirokso olaminas ... 12
1.2.1. Priešgrybelinis aktyvumas ... 12
1.2.2. Fizikinės ir cheminės ciklopirokso olamino savybės ... 12
1.2.3. Ciklopirokso olamino veikimo mechanizmas ... 12
1.2.4. Ciklopirokso olamino terapinis poveikis ... 13
1.2.5. Ciklopirokso olamino priešuždegiminis aktyvumas ... 13
1.3. Vietinio veikimo preparatai ... 13
1.3.1. Vietinio vartojimo preparatų privalumai ... 14
1.3.2. Vietinio veikimo preparatų trūkumai ... 14
1.3.3. Vietinio vartojimo preparatų absorbciją lemiantys veiksniai ... 14
1.4. Mikroemulsijos ... 15
1.4.1. Mikroemulsijų susiformavimas ... 16
1.4.2. Mikroemulsijų klasifikacija ... 16
1.4.3. Mikroemulsijų kaip vaistų nešiklių sistemų teikiami privalumai... 17
1.5. Mikroemulsijų vertinimo kriterijai ... 17
1.6. Skvarbos skatintojai ... 18
1.6.1. Surfaktantai... 19
1.6.2. Kosurfaktantai ... 19
1.6.3. Lipofilinė fazė ... 20
1.7. Apibendrinimas ... 20
2. Medžiagos ir tyrimų metodai ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. Reagentai ir medžiagos ... 21
2.3. Naudoti įrenginiai ... 21
2.4. Ciklopirokso olamino kiekinio nustatymo metodas ... 22
2.5. Ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo ciklopirokso olamino nustatymui validacija ... 22
2.5.1. Tiesiškumas ... 22
2.5.2. Aptikimo (LoD) ir kiekybinio nustatymo (LoQ) ribos... 22
2.5.3. Tikslumas ir glaudumas ... 22
2.6. UV spinduliuotės poveikis ciklopirokso olaminui ... 23
2.7. Ciklopirokso olamino tirpumo vertinimas ... 23
2.8. Eksperimentinių mikroemulsijų susidarymo ribos aptikimas ... 23
2.9. Mikroemulsijų gamyba ... 24
2.10. Mikroemulsijų vertinimas IR spektroskopijos metodu ... 24
2.11. Modelinių sistemų fizikinių savybių nustatymas ... 24
2.12. Mikroemulsijų stabilumo vertinimas ... 24
2.14. Akceptorinės terpės parinkimas ... 25
2.15. Ciklopirokso olamino atpalaidavimo in vitro iš eksperimentinių mikroemulsijų tyrimai ... 25
2.16. Ciklopirokso olamino skvarbos į žmogaus odą tyrimai ex vivo ... 26
2.17. Statistinė duomenų analizė ... 26
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas ... 27
3.1. UV spinduliuotės poveikis ciklopirokso olaminui ... 27
3.2. Ciklopirokso olamino tirpumas ... 28
3.3. Eksperimentinių mikroemulsijų susidarymo ribų nustatymas ... 28
3.4. Modelinių mikroemulsijų gamyba ... 29
3.5. Eksperimentinių mikroemulsijų kokybinis vertinimas pagal polidispersiškumo indeksą ... 30
3.6. Mikroemulsijų ir jų komponentų sąveikos vertinimas IR spektroskopijos metodu ... 32
3.7. Mikroemulsijų fizikinių rodiklių įvertinimas ... 34
3.8. Mikroemulsijų stabilumas ... 36
3.9. Mikroemulsijų termodinaminis stabilumas ... 38
3.10. Ciklopirokso olamino atpalaidavimo iš mikroemulsijų tyrimas in vitro ... 41
3.11. Ciklopirokso olamino skvarbos į žmogaus odą tyrimas ex vivo ... 44
IŠVADOS ... 46
Įvadas
Odos mikozės yra vienos iš labiausiai paplitusių odos infekcinių ligų, kurios daro įtaką milijonams žmonių visame pasaulyje. Odos infekcijos neturi geografinių apribojimų, tačiau dažniau paplitusios regionuose, kuriuose vyrauja karštas ir drėgnas oro klimatas. Pagrindiniai veiksniai lemiantys mikozių atsiradimą yra virulentiškumas, klimato ir socialiniai veiksniai, higienos įpročiai bei migracija. Didesnis infekcijų skaičius siejamas su pacientams išsivystančiu atsparumu vaistams bei imunosupresinių vaistų vartojimu [1].
Viena iš dažniausiai pasitaikančių odos infekcinių ligų yra dermatofitozė, sukeliama dermatofitų. Dermatofitai sukelia raginio sluoksnio pažeidimus, pažeidža plaukų folikulus, tačiau į gilesnius odos sluoksnius dažniausiai nesiskverbia, todėl paprastai taikomas vietinis gydymas [1,2]. Sergant odos infekcinėmis ligomis dažnai išsivysto ir nagų pažeidimai. Viena iš dažniausiai pasitaikančių nagų infekcinių ligų – onichomikozė. Onichomikoze serga apie 14 proc. visų pasaulio gyventojų ir 48 proc. vyresnio amžiaus gyventojų [3]. Onichomikozės gydymo eiga yra sunki, ilgai trunkanti, gali būti taikomas kombinuotas gydymas skiriant preparatus per os ir taikant vietinį gydymą. Vietinio vartojimo preparatai yra patrauklūs, nes apeinamas metabolinis kelias, vietinių vaistinių preparatų vartojimas gali padėti kontroliuoti vaisto vartojimą, suteikia galimybę įvesti vaistus, turinčius trumpą pusinės eliminacjos laiką [4,5,6]. Tačiau šiuo metu rinkoje esantys preparatai nėra pakankamai veiksmingi, ypač gydant sunkias onichomikozės formas, todėl ieškoma būdų kaip pagerinti esamų vaistinių preparatų veiksmingumą ir naujų preparatų kūrimą.
Vietinio veikimo prepatai yra patraukli vaisto forma dėl mažesnės sisteminio šalutinio poveikio rizikos, todėl gali būti pritaikomi platesnei pacientų grupei. Mokslinių publikacijų analizė atskleidė, kad nanotechnologijomis paremtos vietinio veikimo sistemos yra pranašesnės priešuždegiminių, anestetikų, priešgrybelinių ir steroidinių vaistų tiekimo sistemos, lyginant su makroemulsijomis, todėl šiuo metu didelis dėmesys skiriamas nanostruktūrinių sistemų kūrimui: liposomoms, mikroemulsijoms, skystiesiems kristalams. Nanostruktūrinės sistemos gali pakeisti vaisto atpalaidavimo profilį, pagerinti vaisto stabilumą ir padidinti vaisto buvimo laiką veikimo vietoje [7].
Modeliuojant naujus farmacinius preparatus neretai susiduriama su problema – mažu vaistinės medžiagos tirpumu, todėl ieškoma būdų kaip pagerinti vaistinės medžiagos tirpumą. 2018 metų duomenimis, beveik 40 proc. visų naujų potencialų vaistinių medžiagų molekulių tirpumas vandenyje yra labai ribotas, todėl vaistas turi prastą biologinį prieinamumą. Vienas iš būdų kaip pagerinti vaistinės medžiagos tirpumą – formuojant mikroemulsijas, kurios pagerina tiek lipofilinių, tiek hidrofobinių vaistinių medžiagų tirpumą [8,9]. Todėl šiomis sistemomis tikimasi padidinti netirpių arba mažai tirpių vaistų molekulių pritaikymo galimybes.
Tyrimamas atlikti buvo pasirinktas mažą tirpumą vandenyje (1,41 mg/ml) turintis vaistas ciklopirokso olaminas [10]. Literatūros analizė atskleidė, kad tiek gydant dermatofitų sukeltą infekciją, tiek onichomikozę vienas iš pagrindinių preparatų skiriant gydymą yra ciklopirokso olaminas. Todėl šio darbo tikslas yra sumodeliuoti mikroemulsijas su ciklopirokso olaminu siekiant didesnio vaistinės medžiagos tirpumo ir biologinio prieinamumo.
Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas – sumodeliuoti eksperimentines mikroemulsijas su ciklopirokso olaminu ir įvertinti sistemų biofarmacinius rodiklius.
Darbo uždaviniai:
1. išvystyti analitinį ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodą kiekiniam ciklopirokso olamino įvertinimui.
2. sumodeliuoti eksperimentines mikroemulsijas su ciklopirokso olaminu ir įvertinti jų kokybės rodiklius.
3. ištirti ciklopirokso olamino atpalaidavimą iš modelinių sistemų in vitro.
4. įvertinti ciklopirokso olamino skvarbą į žmogaus odą ex vivo esant skirtingoms vaistinės medžiagos kiekiams modelinėse mikroemulsijose.
1. Literatūros apžvalga 1.1. Žmogaus oda ir jos ligos
Oda – pats didžiausias ir pažeidžiamiausias žmogaus organas, kuris sudaro apie 10 proc. žmogaus kūno ir kurio bendras plotas siekia iki 2 m2. Pagrindinės odos funkcijos yra reguliuoti kūno temperatūrą, palaikyti kūno paviršiaus vientisumą, apsaugoti nuo mikroorganizmų, UV ir laisvųjų radikalų poveikio [11]. Odą sudaro epidermis, derma ir poodis. Epidermio paviršiuje esantis raginis sluoksnis (stratum corneum), kurį sudaro 10–20 ląstelių sluoksnis, veikia kaip apsauginis barjeras, kuris riboja medžiagų patekimą į gilesnius sluoksnius. Stratum corneum pasižymi dideliu tankiu (1,4 g/cm2 sausoje būsenoje) ir maža hidratacija 15–20 proc. [3,4]. Raginį sluoksnį sudaro lipidai (fosfolipidai, cholesterolis ir kt.) bei baltymai, iš kurių pagrindis ir svarbiausias odos tvirtumui palaikyti yra keratinas [12]. Odos paviršiuje esanti lipidinė plėvelė veikia kaip apsauginis sluoksnis, kad būtų išvengta drėgmės pasišalinimo iš odos ir padeda išlaikyti raginio sluoksnio barjerinę funkciją. Stratum corneum hidratacija gali padidinti laidumą vaistinėms medžiagoms. Apsaugos funkciją dar labiau palengvina nuolatinis raginio sluoksnio atsinaujinimas, taip ribojant vietinį vaistinių medžiagų biologinį prieinamumą [5]. Dėl šių priežasčių pastaraisiais dešimtmečiais buvo atlikta daug tyrimų, norint padidinti vaistinių medžiagų svarbumą, taip padidinant vaistinių medžiagų efektyvumą.
Esant paviršinio odos sluoksnio pažeidimams, didelei drėgmei, pakankamai aukštai temperatūrai 28 – 30 ºC vystosi palankios sąlygos mikroorganizmų augimui, o tuo pačiu didėja tikimybė susirgti odos ligomis [13,14]. Dermatologijos praktikoje dažnai pasireiškianti odos liga yra dermatofitozė, kurią sukelia dermatofitai. Šie mikroskopiniai grybiai klasifikuojami į antropofilinius, zoofilinius ir geofilinius. Dermatofitozę sukelia Epidermothyton spp., Microsporum spp. ir Trichophyton spp. gentys, žmonėms dažniausiai odos ligas sukelia Trichophyton spp., ypač dažnai pasitaikantys T. tonsurans ir Trichophyton rubrum. Dermatofitai pažeidžia keratinocitus, esančius raginiame sluoksnyje, plaukų folikuluose, tačiau į gilesnius odos sluoksnius dažniausiai nesiskverbia, todėl įprastai taikomas vietinis gydymas [1,2,15].
Nusilpus organizmo imuninei sistemai, sergant odos infekcinėmis ligomis didėja tikimybė susirgti ir nagų grybelinėmis infekcijomis.Viena iš jų – onichomikozė – lėtinė, dermatofitų, mieliagrybių ar pelėsių užkrečiama odos ir nagų liga, kuri sukelia 50 proc. visų nagų ligų. Dėl skirtingo inkubacinio periodo kurį laiką ligos požymių gali nepasireikšti, todėl ankstyvieji ligos požymiai yra sunkiai pastebimi [16, 18]. Nepaisant naujų gydymo metodų, ši grybelinė infekcija yra plačiai paplitusi ir sergamumas didėja proporcingai didėjant pacientų amžiui: 0–10 metų amžiaus sergančiųjų yra 2,3 proc., 20–30 metų amžiaus 6,9 proc., 40–50 m. – 24,1 proc., 60–70 m. – 40 proc. pacientų ir 80 ir daugiau m. – 61,5 proc. sergančiųjų [17].
Mieliagrybiai ir pelėsiai dažniausiai sukelia rankų nagų onichomikozę, o dermatofitai dažniausiai siejami su pėdų nagų grybelinėmis infekcijomis. Pėdų onichomikozė pasreiškia keturis kartus dažniau nei rankų onichomikozė, taip pat pėdų onichomikozė yra sunkiau išgydoma dėl mažesnės kraujotakos cirkuliacijos, lėto nagų plokštelės augimo, kuris siekia 2–3 mm per mėnesį [19,20]. Priklausomai nuo ligos sudėtingumo atitinkamai skiriamas gydymo būdas. Ligai itin pažengus gali būti pašalinami pažeisti nagai, esant lengvesniai ligos formai skiriami preparatai per os arba gali būti naudojami vietinio veikimo preparatai – mikroemulsijos. Šiuo metu medicinos praktikoje vartojamas daug žadantis mikroemulsijos pagrindu sukurtas nagų lakas su ciklopiroksu efektyviai gydo lengvas onichimikozės formas [17].
1.2. Ciklopirokso olaminas
Ciklopirokso olaminas (CPO), kurio cheminė formulė 6-cikloheksil-1-hidroksi-4-metilpiridin-2 (1H) –onas (1pav.) yra sintetinis hidroksipiridono darinys atrastas 1973 metais kompanijos Hoechst A. G. [10]. Šis vaistinis preparatas plačiau žinomas kaip „Hoe-296“ ir parduodamas komerciniu pavadinimu „Batrafen5“ [21].
1.2.1. Priešgrybelinis aktyvumas
CPO – tai plataus veikimo spektro antimikrobinis agentas, kuris slopina daugelį gram-teigiamų (Trichophyton spp., Microsporum spp., Epidermophyton floccosum) ir gram-neigiamų (Esherichia spp., Proteus spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Shigella spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp.) bakterijų augimą. Jis taip pat efektyvus prieš dermatofitus (Trichophyton spp., Microsporum spp., Epidermophyton floccosum), pelėsius (Aspergillus spp., Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium solani), mieles (Candida spp., Malassezia furfur, Cryptococcus neoformans, Sacchromyces cerevisiae), įskaitant azolams atsparias Candida rūšis, tokias kaip Candida glabrata, Candida krusei, ir Candida guilliermondii [16,21,22]. Ciklopirokso olamino priešgrybelinį ir antibakterinį aktyvumą lemia hidroksipiridono grupė ir hidroksi pakaitų pašalinimas lemtų visišką vaistinės medžiagos veikimo praradimą.
1.2.2. Fizikinės ir cheminės ciklopirokso olamino savybės
Ciklopirokso olaminas – piridino darinių klasei priklausantis junginys. Tai balti ar švelniai gelsvi kristaliniai milteliai, kurių lydymosi temperatūra siekia 143 °C laipsnius. CPO pH siekia 8–9, logP – 2,3. Rūgšties disociacijos konstanta sieka 6,84, bazės pKa – 6,2. CPO prastai tirpsta vandenyje (1,41 mg/ml), praktiškai netirpsta cikloheksane, tačiau yra tirpus metanolyje, etanolyje, acetonitrile, metileno chloride [10,23,24].
1.2.3. Ciklopirokso olamino veikimo mechanizmas
Nors CPO gydant odos ir nagų grybelines infekcijas vartojamas keletą dešimtmečių, jo veikimo mechanizmas nėra galutinai išaiškintas. Skirtingai nuo kitų priešgrybelinių vaistinių medžiagų, tokių kaip terbinafinas, amorolfinas, kurie turi įtakos sterolių sintezei, ciklopirokso olaminas veikia sudarydamas chelatus su metalų katijonais [24]. Manoma, jog ši vaistinė medžiaga sudaro chelatus su Fe3+ ir Al3+ ir inhibuoja enzimus, tokius kaip peroksidazę ir katalazę patogenų ląstelėje, taip pat slopina aminorūgščių, kalio ir fosfatų transmembraninį transportavimą [25,26]. Be to, mielėse Saccharomyces cerevisiae ciklopirokso olaminas gali sutrikdyti DNR atkūrimą, jis gali įsiterpti į mitozines verpstes, gali inhibuoti kai kuriuos ląstelių transportavimo elementus [23]. Paminėtina, kad
CPO antibakterinė veikla stebima ir augalinėse ląstelėse – ji pastebėta Zataria multiflora, kuri paprastai auga pietvakarių Azijoje – Irane, Afganistane ir Pakistane [27].
1.2.4. Ciklopirokso olamino terapinis poveikis
Ciklopirokso olaminas yra ciklopirokso etanolamino druska, todėl terapinis 1 proc. ciklopirokso olamino poveikis yra ekvivalentus 0,77 proc. ciklopirokso. Ciklopiroksas išlieka aktyviuoju junginiu, nes junginio etanolamino dalis nepadidina priešgrybelinio aktyvumo [24,27]. Gydant odos infekcijas ciklopirokso olaminas yra naudojamas įvairiose farmacinėse formose: kremas, suspensija, šampūnas, losjonas, gelis, milteliai, nagų lakas, tirpalas [26,27,41]. Ciklopirokso olamino terapinės dozės dermatofitų, mielių grybelinėms infekcijoms gydyti svyruoja nuo 0,98 µg/ml iki 3,9 µg/ ml. Mokslininkai Markas Nievertas, Donika Kunzė, Michailas Seiboldas su kolegomis tyrinėdami ciklopirokso olamino poveikį C. albicans ląstelėms nustatė, kad 0,6 µg/ml ciklopirokso olamino koncentracija slopino, tačiau nesustabdė patogeninių mikroorganizmų augimo, o padidinus ciklopirokso olamino koncentraciją iki 0,7 µg/ml patogeninių mikroorganizmų augimas buvo beveik inhibuotas [28].
Sidhartas Sontialia su mokslininkų grupe atliko eksperimentą, kuriame dalyvavo sveiki savanoriai, jiems ant dilbio buvo užteptas 1 proc. ciklopirokso kremas. Tyrimo rezultatai atskeidė, kad praėjus dvejoms valandoms po kontakto buvo nustatyta didelė vaisto koncentracija paviršiniame odos sloksnyje ir tik nedidelė gilesniuose odos sluoksniuose. Tyrimas su radioaktyviai pažymėtu 1 proc. CPO tirpalu, ištirpintu PEG 400 parodė, kad užtepus šio tirpalo ant 750 cm2 nugaros odos vaistinės medžiagos okliuzija buvo pasiekta po 6 valandų, pusinės eliminacijos laikas – 1,7 val. Ciklopirokso olaminas prasiskverbia per epidermį į plaukus ir plaukų folikulus, riebalines liaukas bei dermą ir tik nedidelė vaistinės medžiagos dalis lieka epidermyje [25,26].
Ciklopirokso olamino efektyvumą stipriai įtakoja terpės sudėtis ir pH. Remiantis mokslininkų Gupta ir Koli duomenimis, ciklopiroksas pasižymėjo didžiausiu efektyvumu prieš dermatofitus (ištyrus 110 padermių), mieles (14 Candida štamų) lyginant su ketonazolu, itrakonazolu ir terbinafinu. Nustatytas in vitro fungicidinis aktyvumas prieš T. mentagrophytes: CPO kremas 1 proc. > naftifino kremas 1 proc. > oksikonazolo kremas 1proc. > bifonazolo kremas 1 proc. Nustatytas in vitro aktyvumas prieš C. albicans: CPO kremas 1 proc. > tiokonazolo kremas 1 proc. > oksikonazolo kremas 1 proc. > mikonazolo kremas 2 proc. > ekonazolo kremas 1 proc. > klotrimazolo kremas 1 proc. [26].
1.2.5. Ciklopirokso olamino priešuždegiminis aktyvumas
Ši vaistinė medžiaga rodo priešuždegiminį poveikį inhibuodama arachidono rūgšties kaskadą taip inhibuodama prostaglandinų ir leukotrienų sintezę granulocituose. Mokslinių tyrimų rezultatų duomenys atskleidė, kad ciklopiroksas turi stipriau išreikštą priešuždegiminį poveikį nei naftifinas ir klotrimazolas. Amorolfinas, kuris taip pat vartojamas onichomikozės gydymui, nepasižymi priešuždegiminiu poveikiu [3,28].
Nors ciklopirokso olaminas klinikinėje praktikoje vartojamas daugiau nei du dešimtmečius kol kas nėra nustatyta rezistentiškumo atvejų prieš šią vaistinę medžiagą. Ciklopirokso olaminui nebūdinga inhibuoti ergosterolio biosintezę, kaip daugeliui priešgrybelinių vaistinių preparatų.
1.3. Vietinio veikimo preparatai
Vietinis vaisto įvedimo būdas gali būti apibrėžiamas kaip vaistinės medžiagos turinčios kompozicijos panaudojimas ant odos, siekiant tiesiogiai gydyti odos ligas [29]. Vietinio vartojimo preparatai yra gera alternatyva lyginant su vaistų vartojimu parenteriniu būdu ar per os [30]. Vietinio
veikimo vaistinių preparatų vartojimas gali padėti kontroliuoti poveikio vietą, leidžia įvesti vaistines medžiagas, turinčius trumpą pusinės eliminacijos laiką, nepatenkant jiems į kraujotakos sistemą. Transderminiai preparatai turi keletą svarbių privalumų: apeinamas metabolizmas kepenyse, palaikoma pastovi vaisto koncentracija plazmoje [4,5,31]. Vietinio veikimo preparatai į gilesnius odos sluoksnius gali prasiskverbti per prakaito liaukas, per plaukų folikulus ir riebalines liaukas arba tiesiogiai per stratum corneum sluoksnį. Kadangi vietinio veikimo preparatų vartojimo būdas yra neinvazinis jų vartojimas yra priimtinesnis pacientams, sumažinama pacientų interferencija, vidinis kintamumas ir padidinamas terapinis indeksas bei sumažinamas šalutinių poveikių skaičius [30]. 1.3.1. Vietinio vartojimo preparatų privalumai
Vietinio vartojimo preparatai yra patraukli vaisto forma, nes pasižymi šiais privalumais [4,5,29,30,31]:
Vietinio poveikio vaistas suteikia pastovią vaisto infuziją per ilgesnį laiką, todėl tokiu būdu galima išvengti nepageidaujamų šalutinių reiškinių ir gydymo nepakankamumo, dažnai susijusio su periodišku dozavimu.
Alternatyvus vartojimo būdas pacientams, kurie netoleruoja geriamųjų vaisto formų.
Padidina daugelio vaistinių preparatų terapinę vertę, išvengiant specifinių problemų, tokių kaip virškinamojo trakto dirginimas, maža vaistinės medžiagos absorbcija, sąveika su kitais vartojamais vaistais, maistu ar gėrimais.
Vietinio vartojimo preparatai yra lengvai ir greitai nustatomi ekstremalių situacijų metu (pavyzdžiui, nereaguojantys, sąmoningi ar komos būsenos pacientai) dėl jų fizinio buvimo, savybių ir žymėjimo.
1.3.2. Vietinio veikimo preparatų trūkumai
Nors transderminių vaistų tiekimo sistemos turi daug privalumų ir yra plačiai vartojami, jie taip pat turi tam tikrų trūkumų [4,5,29,30,31]:
Sunku skirti didelę dozę, tai yra daugiau kaip 10 mg per parą. Joniniai surfaktantai gali būti toksiški.
Vaistinės medžiagos, kurių molekulinė masė didesnė nei 500 daltonų, gali riboti skvarbumą į odą.
Didelės vaistinės medžiagos koncentracijos preparatuose gali sudirginti odą, todėl į mikroemulsijų sudėtį nerekomenduojama įterpti daugiau nei 60 proc. paviršiaus aktyvių medžiagų.
Sunku pasiekti didelę vaisto koncentraciją plazmoje. Ilgalaikis gydymas sukelia diskomfortą pacientams.
Vaistai, turintys labai mažą arba didelį pasiskirstymo koeficientą, nesugeba pasiekti sisteminės cirkuliacijos.
1.3.3. Vietinio vartojimo preparatų absorbciją lemiantys veiksniai
Oda susideda iš dviejų sluoksnių: epidermio (~100 μm storio) ir dermos (~500 – 3000 μm storio). Epidermio paviršiuje esantis raginis sluoksnis (~10 – 40 μm storio) yra pagrindė kliūtis vaistinėms medžiagoms difunduoti į gilesnius sluoksnius. Todėl norint įvesti vaistinę medžiagą į vietinio veikimo preparatus, vaistas turi pasižymėti šiomis savybėmis: maža molekuline mase, žema lydymosi temperatūra, turi neturėti dirginančio poveikio, turi būti tinkamas vartojimui vietiškai ilgą laiką [4].
Vietinio veikimo preparato absorbcijai turi įtakos fiziologiniai veiksniai: odos storis ir pH, lipidų kiekis, kraujotakos cirkuliacija, odos hidratacija, plaukų folikulų tankis, prakaito liaukų tankis bei ligos sudėtingumas [29].
1.4. Mikroemulsijos
Pirmieji terminą ,,mikroemulsija‘‘ panaudojo mokslininkai T. P. Hoaras ir J. H. Šulmanas 1943 metais, kurie pagamino skaidrą vienfazę A/V sistemą, lašinant aliejų į vandeninę fazę, šios fazės buvo stabilizuotos surfaktanto – heksanolio ir kosurfaktanto – etanolio mišiniu [30,32,33]. Vėliau mikroemulsijų panaudojimas buvo išplėtotas ir šiuo metu jos naudojamos ne tik farmacijoje, bet ir kosmetikos, maisto pramonėse, agronomijoje [33].
Mikroemulsijos – spontaniškai susiformuojančios, termodinamiškai stabilios, optiškai izotropinės, metastabilios, skaidrios sistemos, sudarytos iš dviejų tarpusavyje nesimaišančių skysčių, stabilizuotų surfaktantu ar jo mišinio su kosurfaktantu [34,35,36]. Mikroemulsijos susiformuoja, kai surfaktantas ar surfaktanto ir kosurfaktanto mišinys, pridėtas į vandeninę ir aliejinę fazes turinčią sistemą, elgiasi kaip paviršiaus įtempimą tarp aliejaus ir vandens lašelių mažinančios medžiagos. Kad dispersija susiformuotų spontaniškai, laisvoji sitemos energija turi būti mažesnė nei atskirų sistemos komponentų energija [29]. Susiformuojant dispersinės fazės lašeliams reikšmingai padidėja mikroemuslijų paviršiaus plotas. Veikiant kartu surfaktantui ir kosurfaktantui sumažėja paviršiaus įtempimas, sistemos lašeliai padengiami monomolekuliniu sluoksniu [33]. Priklausomai nuo vandens, aliejinės fazės, surfaktanto ir kosurfaktanto santykio gali būti suformuojamos įvairių struktūrų sistemos (2 pav.) [36].
A/V tipo mikroemulsijos gali sudaryti kubų, sferinių ar cilindrinių micelių struktūras, o V/A mikroemulsijos gali sudaryti invertuotų micelių struktūrą arba išsidėstyti monosluoksniu.
Svarbu paminėti, jog mikroemulsijos nėra ta pati sistema kaip emulsijos. Mikroemulsijos yra pripažintos pranašnesnėmis sistemomis ir pirmoje lentelėje pateikti pagrindiniai mikroemulsijų ir emulsijų skirtumai [37].
1 lentelė. Mikroemulsijų ir emulsijų skirtumai [37]
Nr. Emulsijos (makroemulsijos) Mikroemulsijos 1. Susideda iš sferinių vienos fazės lašelių,
pasiskirsčiusių kitoje fazeje.
Vienfazė sistema, kurią palaiko surfaktantas ar jo mišinys su kosurfaktantu.
2 Dalelių dydis 1 -20 mm. Dalelių dydis 10 -200 nm. 3. Dauguma emulsijų yra nepermatomos (baltos
spalvos), nes didžioji dalis jų lašelių yra didesni už šviesos bangos ilgį.
Mikroemulsijos yra skaidrios arba permatomos, nes jų lašelių skersmuo yra mažesnis nei ¼ šviesos bangos ilgio, jie išsklaido mažai šviesos.
4. Emulsiją sudarantys lašeliai egzistuoja kaip atskiri objektai.
Mikroemulsijos lašelis gali išnykti per sekundę, o kita lašelis spontaniškai susidaro kitur.
5. Termodinamiškai nestabilios. Termodinamiškai stabilios.
6. Emulsijos yra lipofilinės. Mikroemulsijos yra koloidinės sistemos. 7. Reikia didelės energijos suformavimui. Susiformuoja spontaniškai.
Iš pateiktos pirmosios lentelės galima teigti, jog mikroemulsijos yra pranašesnės sistemos nei emulsijos, nes pasižymi šiomis savybėmis: termodinaminiu stabilumu, skaidrumu, mažesne klampa ir mažesnėmis energijos sąnaudomis, mažesniu dalelių dydžu, kuris siekia iki nuo 10 iki 200 nm, emuslijų – nuo 1 iki 20 mm [32]. Dalelių dydžiui įtakos turi paviršiaus aktyvių medžiagų bei aliejinės fazės anglies grandinės ilgis bei temperatūra. Trumpesnės surfaktanto ir kosurfaktanto anglies grandinės sąlygoja didesnius dispersinės fazės lašelius ir padidina lašelių sąveiką, o tokia sąveika gali turėti įtakos mikroemulsijos stabilumui. Didesnis mikroemulsijų tankis sąlygoja mažesnį dalelių dydį [29].
1.4.1. Mikroemulsijų susiformavimas
Mikroemulsijų susiformavimui, priešingai negu emulsijų, makroemulsijų ar nanoemulsijų, nereikalinga papildoma energija. Mikroemulsijose nevyksta komponentų cheminiai pokyčiai laikant jas metus ar ilgiau 45 °C temperatūroje, o tuo tarpu emulsijos pasižymi tik kinetiniu stabilumu, agregatiškai jos nėra patvarios ir esant laisvosios energijos pertekliui vyksta fazių atsiskyrimas, koalescencija [29,31]. Mikroemulsijoms, lyginant su makroemulsijomis ar nanoemulsijomis paprastai reikalingas didesnis paviršiaus aktyvių medžiagų kiekis norint suformuoti stabilias sistemas. Mokslinių publikacijų analizė atskleidė, kad kosurfaktanto anglies grandinės ilgis formuojant mikroemulsijas pageidaujamas mažesnis, nei nanoemulsijose [29].
1.4.2. Mikroemulsijų klasifikacija
Remiantis Vinsoro (1948) klasifikacija mikroemulsijos gali būti skirstomos į 3 kategorijas: vanduo aliejuje (V/A), kai paviršiaus aktyvios medžiagos (PAM) yra pasiskirsčiusios vandeninėje fazėje, aliejus vandenyje (A/V), kai PAM yra pasiskirsčiusios aliejinėje fazėje ir biištisinės mikroemulsijos, kai surfaktantas ar surfaktanto ir kosurfaktanto yra tolygiai pasiskirstęs vienodame aliejinės ir vandeninės fazių kiekyje. Visos trys mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios ir teoriškai turėtų neišsiskirsti į ME sudedamąsias dalis [33,36]. Temperatūros pokyčiai, nejoninių surfaktantų ir
vandens santykio pokyčiai gali sukelti mikroemulsijų transformaciją: A/V ME į biištisinę ME, o ji įV/A ME [29].
1.4.3. Mikroemulsijų kaip vaistų nešiklių sistemų teikiami privalumai
Mikroemulsijos gali būti naudojamos kaip naujos vaistinės medžiagos tiekimo priemonės, skirtos didinti vaistinės medžiagos tirpumą, absorbciją ir biologinį prieinamumą. Pastaraisiais dešimtmečiais buvo tiriamas transderminis vaistinių medžiagų tiekimas, siekiant įveikti sisteminį vaistinės medžiagos toksiškumą [4].
Mikroemulsijomis galima kontroliuoti vaistinės medžiagos atpalaidavimo greitį, palaikyti terapinio aktyvumo trukmę ir reguliuoti vaistinės medžiagos tiekimą į audinį. Pagrindinė vietinio vartojimo sistemų paskirtis yra užtikrinti ilgalaikį vaistinės medžiagos vartojimą, todėl ir nuolatinę vaisto koncentraciją plazmoje per ilgesnį laiką. Teigiama, kad ilgalaikis terapinis aktyvumas gali būti pasiektas su vietinio veikimo preparatais. Tačiau, tam kad pasiekti norimą terapinį poveikį, vietinio vartojimo preparatai turėtų gebėti atpalaiduoti vaistinę medžiagą pakankamu greičiu ir kiekiu, o visų vietinio vartojimo preparatų gebėjimas pernešti vaistinę medžiagą per odą pakankamu greičiu ir kiekiu priklauso nuo pagalbinių medžiagų [4,5,6].
1.5. Mikroemulsijų vertinimo kriterijai
Mikroemulsijų kokybė įvertinama atliekant pH, klampumo, laidumo matavimus, taip pat įvertinamas vidutinis dalelių dydis bei polidispersiškumo indeksas [39]. Klampos matavimu galima greitai įvertinti susidariusios sistemos skystumą bei susidariusios mikroemulsijos struktūrą [38]. Laidumo matavimu galima greitai nustatyti susidariusios mikroemulsijos tipą. Laidumo matavimai taip pat aptinka įvairius reiškinius, susijusius su perkolacija ir fazių inversijos reiškiniais [7,30].
Dinaminiai ir statiniai šviesos sklaidos metodai, mažo kampo neutronų sklaidos bei mikroskopiniai metodai yra itin reikšmingi mikroemulsijos struktūros išaiškinimui [4,37]. Vienas svarbiausių ME kokybės rodiklių yra dalelių dydis, kadangi mažesnis dalelių dydis sąlygoja geresnę sistemos skvarbą į odą [26]. Kadangi mikroemulsijos pasižymi ilgalaikiu termodinaminiu stabilumu, sumažėjęs paviršiaus įtempimas sumažina dalelių dydį ir taip padidina absorbciją bei pagerina skvarbumą. Be to, kombinuojant surfaktantą kartu su kosurfaktantu sumažinamas stratum corneum difuzinis barjeras, o sumažintas lašelių dydis ir didesnis vidinės fazės kiekis sistemose suteikia didesnį paviršiaus plotą ir didesnį tankį [32]. Dėl šių priežasčių nustatomas didesnis koncentracijos gradientas, todėl padidėja vaisto pralaidumas, nes maži lašeliai glaudžiai susliečia su oda dėl mažesnės įtampos paviršiuje. Be to, disperguota fazė atlieka vaistinės medžiagos rezervuaro vaidmenį, palaikanti koncentracijos gradientą odos paviršiuje ilgą laiką. Mikroemulsijos gali prarasti stabilumą esant ekstremalioms temperatūroms, tačiau mikroemulsijų stabilumas gali būti atkurtas, kai mikroemulsijų temperatūra grįžta prie sistemoms būdingos temperatūros. Mikroemulsijų komponentai veikia kaip tirpikliai, galintys ištirpinti tiek hidrofilines tiek lipofilines vaistines medžiagas, kurių tirpumas vandenyje ar organiniuose tirpikliuose yra labai ribotas [39].
Modeliuojant vietinio veikimo preparatus svarbus rodiklis yra sumodeliuotos sistemos pH, kadangi labai didelės arba labai mažos pH vertės gali būti žalingos odai. Esant vidutinėms pH vertėms jonizuojamų vaistinių medžiagų srautą gali įtakoti pH pokyčiai, kurie keičia įkrautų ir neįkrautų dalelių santykį ir jų transderminį pralaidumą [7,30]. Mikroemulsijų pH rodikliui įtakos turi ir vaistinės medžiagos koncentracija. Padidėjusi vaistinės medžiagos koncentracija sukelia proporcingą pH padidėjimą. Esant didesnei koncetracijai vaistinės medžiagos perteklius veikia kaip vaistinės
medžiagos rezervuaras ir odos paviršiuje išlieka ilgiau. Vaistinės medžiagos tirpumas sistemoje lemia jo išsiskyrimo greitį. Taip pat vaistinės medžiagos išsiskyrimo mechanizmui įtakos turi kaip vaistinė medžiaga buvo įvesta į sistemą: ištirpinta ar suspenduoda į tiekimo sistemą [4,39].
1.6. Skvarbos skatintojai
Kadangi didžioji dalis vaistinių medžiagų negeba prasiskverbti per odą reikiamu greičiu, į mikroemulsijų sistemą įterpiamos paviršiaus aktyvios medžiagos, kurios padidina vaistinių medžiagų pralaidumą ir padeda užtikrinti aukštą terapinį veiksmingumą [42]. Literatūros analizė atskleidė, kad cheminės skverbties stiprikliai didina vaisto tirpumą bei difuziją į gilesnius odos sluoksnius, taip padidindamos terapinį veiksmingumą. Skvarbos stipriklio įtaka vaisto pasiskirstymo greičiui gilesniuose odos sluoksniuose priklauso nuo skverbties stipriklio cheminės prigimties bei naudojamų medžiagų suderinamumo [12,37,42,43]. Pradedant mikroemulsijų formulavimą ypatingai svarbu tinkamai pasirinkti paviršiaus aktyvias medžiagas, jos turėtų būti lipofilinės prigimties, turi pasižymėti gebėjimu sumažinti paviršiaus įtempimą tarp aliejinės ir vandeninės fazių iki labai mažų verčių, bei gebėti formuoti lanksčią plėvelę aplink susidarančius lašelius [44]. Skvarbos skatintojai turi atitikti šiuos reikalavimus: turi būti netoksiški, nesukelti dirginančio poveikio, turi būti suderinami su kitomis sistemos sudedamosiomis dalimis, turi turėti greitą poveikį, turi būti nebrangus ir lengvai prieinamas, turi būti lengvai suįrantis, pakeistos odos barjerinės savybės turi būti grįžtamos [12]. Skvarbos stiprikliai skirstomi į sekančias klases: riebalų rūgštys, alkoholiai, terpenai, sulfoksidai, anijoninės paviršinio aktyvumo medžiagos, katijoninės paviršinio aktyvumo medžiagos, nejoninės paviršinio aktyvumo medžiagos, cviterjoninės paviršinio aktyvumo medžiagos [44-48].
Riebalų rūgščių, kaip skvarbos skatintojų veiksmingumas tiesiogiai priklauso nuo jos struktūros. Nustatyta, kad riebalų rūgštys, turinčios trumpą anglies grandinę yra veiksmingesnės modifikuojant stratum corneum odos sluoksnio barjerines savybes lyginant su ilgą anglies grandinę turinčiomis riebalų rūgštimis. Riebalų rūgštys naudojamos ME formavimui: oleino rūgštis, linoleno rūgštis, palmitolio rūgštis ir kt [44-48].
Alkoholių, kaip skvarbos stipriklių veikimo mechanizmas pagrįstas lipidų ekstrahavimu iš paviršinio odos raginio sluoksnio ląstelių. Lipidų ekstrahavimas lemia porų susidarymą, taip padidindamas odos hidrataciją ir medžiagų skvarbumo galimybes. Alkoholiai, naudojami ME formulavimui: etanolis, propilenglikolis, dietilenglikolis, manitolis ir kt [44-48].
Terpenų, kaip skvarbos skatintojų veikimo mechanizmas nėra visiškai aiškus, tačiau eksperimentiškai įrodyta, kad jie veikia keliais būdais: I) terpenai gali išekstrahuoti lipidus iš stratum corneum odos sluoksnio ir nutraukti vandenilines jungtis, II) terpenai gali veikti skysdindami raginiame odos sluoksnyje esančius lipidus ir taip padidinti vaistinių medžiagų skvarbą į gilesnius odos sluoksnius. Natūralių terpenų, pasižyminčių skarbumo skatinimu, pavyzdžiai: anitolis, kamparas, borneolis, eugenilis. Tačiau ME formulavimui kamparas nerekomenduojamas, nes gali pažeisti raginio sluoksnio vientisumą [44-48].
Vienas pirmųjų plačiai tiriamų skvarbos skatintojų buvo dimetilsulfoksidas (DMSO). Tai bespalvis, bekvapis, higroskopinis tirpiklis, kuris jungiasi su vandenilio molekulėmis. DMSO yra stiprus tirpiklis, todėl dideliais kiekiais modeliuojant vaistų nešiklių sistemas nerekomenduojamas, nes dideli DMSO kiekiai gali sukelti negrįžtamus odos sluoksnio pažeidimus. DMSO sąveikauja su α-keratino baltymais ir paverčia juos β-tipo konformacija, taip pat keičia lipidų sudėtį, taip padidindami vaistų molekulių skvarbą į gilesnius odos sluoksnius. Dar vienas sulfoksidų klasei priklausantis tirpiklis – dimetilformamidas (DMF).
Kaip ir DMSO pasižymi stipriomis tirpinančiomis savybėmis ir dideliais kiekiais gali sukelti negrįžtamus membranų pažeidimus. Todėl geru skvarbos skatinimu pasižymintys DMSO ir DMF nerekomenduojami didesnėmis nei 60 proc. koncentracijomis [44-48].
Mikroemulsijų sistemose naudojamos PAM gali būti joninės (anijoninės, katijoninės, cviterjoninės) ir nejoninės prigimties. Literatūros analizė atskleidė, kad joninių ir nejoninių paviršinio aktyvumo medžiagų mišinys pasižymi dideliu efektyvumu ir padidina mikroemulsijos susidarymo sritį [43]. Pasirenkant paviršiaus aktyvias medžiagas mikroemulsijoms formuoti svarbu atsižvelgti į PAM hidrofilinį – lipofilinį balansą. Surfaktantai, pasižymintys mažesnėmis HLB vertėmis 3 – 6 priimtinesni formuojant V/A tipo mikroemulsijas, o surfaktantai pasižymintys aukštu HLB 8 – 18 tinkamesni A/V tipo mikroemulsijoms. Tačiau, esant aukštesnėms HLB surfaktanto vertėms (~20) yra būtina į sistemą įvesti kosurfaktantą, norint išlaikyti sistemą stabilią [4,5,12,42].
1.6.1. Surfaktantai
Surfaktantai padidina molekulių poliškumą. Literatūros analizė atskleidė, kad hidrofilinių vaistų poliškumas didesnis, lyginant su lipofilinių vaistų molekulėmis. Surfaktantai gali padidinti ME plastiškumą, taip pat gali padėti reguliuoti tirpumo galimybes, bei prisidėti prie galimybės sumodeliuoti temperatūriniam režimui nejautrias ME [49].
Mokslinių publikacijų duomenys atskleidė, kad nejoniniai surfaktantai yra pripažinti kaip saugesni, mažiau toksiški, todėl yra labiau pageidaujami farmacijos pramonėje. Nejoniniai surfaktantai veikia skysdindami raginiame odos sluoksnyje esančius lipidus, taip padidindami vaistinių molekulių skvarbą į odos gilesnius sluoksnius. Nejoninių surfaktantų pavyzdžiai: „Tween“, „labrasol“, „labrafac CM 10“, „cremophore“, Pluronic F127, Pluronic F68 ir kt [30,47,49].
Anijoninės paviršiaus aktyvios medžiagos stipriau sąveikauja su stratum corneum odos sluoksniu. Anijoninės paviršiaus aktyvios medžiagos sąveikauja su keratinocitais ir stratum corneum sluoksnio ląstelių lipidais, padidina odos hidrataciją dėl hidrofobinės alkilo grandinės sąveikos su odos struktūra [4,12]. Anijoninių paviršiaus aktyvių medžiagų pavyzdžiai: dioktilo sulfosukcinatas, natrio laurilo sulfatas, dekodecilmetilsulfoksidas ir kt.
Katijoninės paviršiaus aktyvios medžiagos vietinio veikimo preparatams retai naudojamos, kadangi sukelia dirginantį poveikį odos paviršiuje, taip pat stipriai sąveikauja su keratinocitais bei sukelia stratum corneum lipidinės matricos pažeidimus [45,49]. Katijoninių surfaktantų pavyzdžiai: alkiltrimetilamonio halogenidai ir kt. Paskelbtų mokslinių duomenų analizė atskleidė, kad cviterjoninės paviršiaus aktyvios medžiagos yra retai naudojamos vietiniams preparatams, keletas jų pavyzdžių: dodecil-betainas, heksadecil-betainas, heksadecilsulfobetinas, N-dimetil-N-dodecilamino oksidas, dodeciltrimetilamonio bromidas ir kt.
1.6.2. Kosurfaktantai
Kosurfaktantai į ME sudėtį įterpiami norint susitiprinti surfaktanto poveikį, kadangi daugeliu atvejų vien tik vienos grandinės paviršinio aktyvumo medžiaga negali pakankamai sumažinti paviršiaus įtampos, kad susidarytų mikroemulsija [46,49]. Kosurfaktantas sumažina mikroemulsijos klampumą, suteikia lankstumo mikroemulsijos lašelių sąsajai, padeda susidaryti sferinei lašelių formai. Kosurfaktantas padeda suformuoti norimą ME tipą bei pasiekti norimas savybes. Papildomas tirpiklis padidina ME stabilizavimą bei sumažina pusiausvyros laiką [46]. Kaip kosurfkatantas dažniausiai naudojami trumpos ir vidutinės anglies grandinės ilgio alkoholiai, tokie kaip etanolis, propan-1,2-diolis. Vidutinio anglies grandinės ilgio veiksmingiausiu skvarbos skatintoju pripažįstamas 1-butanolis [9,28,48].
1.6.3. Lipofilinė fazė
Modeliuojant mikroemulsijų sistemas labai svarbu pasirinkti su paviršiaus aktyviomis medžiagomis ir vaistine medžiaga derančią aliejinę fazę. Pageidautina, kad aliejinė fazė didintų vaistinės medžiagos tirpumą [46]. Trumpesnės anglies grandinės lipofilinės medžiagos pasižymi geresniu skvarbumu ir didesniu sistemos stabilumu. Sočiosios riebalų rūgštys – kaprilo, lauro, miristato rūgštys ir nesočiosios riebalų rūgštys, tokios kaip, oleino, linolo, linoleno rūgšys pasižymi ženkliai didesniu skvarbumu [4,12].
1.7. Apibendrinimas
Norint suformuoti stabilias mikroemulsijas paviršiaus aktyvių medžiagų koncentracija sistemoje turi būti 30 – 60 proc. [30]. Kadangi didžiąją sistemos dalį sudaro paviršiaus aktyvios medžiagos surfaktantą buvo pasirinktas toks, kuris nesukeltų dirginančio poveikio odai ir neturėtų toksiško poveikio. Surfaktantas buvo pasirinktas iš nejoninių paviršiaus aktyvių medžiagų klasės – Labrasol® (PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai). Šio surfaktanto HLB vertė yra 12 ir kadangi buvo siekiama sumodeliuoti stabilią sistemą, prie surfaktanto buvo derinamas trumpą anglies grandinę turintis kosurfaktantas, todėl buvo pasirinktas organinis junginys propan-1,2-diolis.
Kadangi sistema buvo modeliuojama su mažu tirpumu vandenyje (1,41 mg/ml) turinčiu vaistu ciklopirokso olaminu aliejinė fazė buvo pasirinkta tokia, kuri galėtų padidinti vaistinės medžiagos tirpumą. Lipofilinė fazė buvo pasirinkta remiantis mokslininkų P. Hauhano ir T. R. Saino bei S. Kumaro su bendraautoriais paskelbtų publikacijų, kuriose nurodomas ciklopirokso tirpumo aliejinėse fazėse duomenimis. Mokslinių duomenų analizė atskleidė, kad ciklopirokso olaminas tirpus oleino rūgštyje 31,12 mg/g, izopropilo miristate – 10,45 mg/g, izopropilo palmitate – 6,80 mg/g, alyvuogių aliejuje – 5,30 mg/g, sezamų sėklų aliejuje – 4,60 mg/g, todėl dėl didžiausio tirpumo lipofilinė fazė buvo pasirinkta oleino rūgštis. Kumaras su bendraautoriais ištyrė, kad ciklopirokso olamino tirpumas yra didesnis gvazdikėlių aliejuje lyginant su oleino rūgštimi, tačiau gvazdikėlių aliejus gali sukelti sistemos spalvos pokyčius.
Ciklopirokso olamino terapinės dozės dermatofitų, mielių grybelinėms infekcijoms gydyti svyruoja nuo 0,98 µg/ml iki 3,9 µg/ ml, todėl į eksperimentines formuluotes buvo inkorporuota 1 ir 2 proc. ciklopirokso olamino. Falonas Nakaratė ir kiti teigia, kad siekiant padidinti vaistinės medžiagos sisteminį poveikį reikia pasirinkti skvarbą dididančias medžiagas ir ciklopirokso olamino skvarbai gerinti pasiūlė oleino rūgštį.
Analizuojant paskelbtų mokslinių publikacijų rezultatus nebuvo aptikta duomenų apie ciklopirokso olamino skvarbą į odą ex vivo bei vaistinės medžiagos atpalaidavimo iš sistemų in vitro iš mikroemulsijų, todėl šiame darbe bus palyginta ciklopirokso olamino atpalaidavimas ir skvarbumas iš liposomų bei losjonų.
2. Medžiagos ir tyrimų metodai 2.1. Tyrimo objektas
Lietuvos sveikatos mokslų universitete, farmacijos fakultete, klinikinės farmacijos katedroje buvo sumodeliuotos eksperimentinės mikroemulsijos su vaistine medžiaga ciklopirokso olaminu.
2.2. Reagentai ir medžiagos
Reagentai mikroemulsijų formulavimui:
Ciklopirokso olaminas, Chemical point, Vokietija. Oleino rūgštis, Sigma-Aldrich, Vokietija.
Propan–1,2–diolis, Alfa Aesar GmbH & Co KG,Vokietija.
PEG-8 kaprilo/kaprio gliceridai (Labrasol®), Gattefosse, Prancūzija Distiliuotas vanduo, Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Kaunas.
Reagentai ME kiekybiniam įvertinimui ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodu: Trifluoracto rūgštis (99,9 proc.), Sigma-Aldrich, Jungtinės Amerikos Valstijos. Acetonitrilas (≥ 99,9 proc.), Sigma-Aldrich, Izraelis.
Etanolis, 96 proc. (v/v), AB ,,Stumbras“, Lietuva Reagentai ME skvarbos įvertinimui ex vivo:
Natrio chloridas, Carl Roth GmbH, Vokietija. Natrio azidas, POCh, Lenkija.
Metanolis (≥ 99,9), Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija. 2.3. Naudoti įrenginiai
Ultra-efektyvusis skysčių chromatografas su PDA detektoriumi: Waters Acquity UPLC System, Waters, JAV.
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga: IKAMAG C-MAG HS7, IKA-Werke GmbH & Co. KG, Vokietija.
Termostatinė spinta su purtymo funkcija: GEL, Vokietija.
Svarstyklės: Scaltec SBC 31, Scaltec Instruments GmbH, Vokietija. Ultragarsinė vonelė: USC1200THD, VWR, JAV.
pHmetras: ph-meter 766 su elektrodu Knick SE 104 N, Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija.
Viskozimetras: Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija. Konduktometras: Cond 3110 SET 1, Vokietija.
Dinaminės šviesos sklaidos analizatorius: Zetasizer Nano ZS, Malvern, Didžioji Britanija. MRL-58 UVB lempa: UVP, JAV.
Radiometras: UVP, JAV.
Modifikuotos Bronaugh pratakios difuzinės celės sujungtos su cirkuliacine vandens vonele Grant GD120 (Grant Instruments Ltd., JK), peristaltiniu siurbliu (Masterflex L/S) bei daugiakanale siurblio galva (ColeParmer Instrument Co., JAV).
2.4. Ciklopirokso olamino kiekinio nustatymo metodas
Ciklopirokso olaminas kiekybiškai įvertintas ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Kiekybinė analizė atlikta naudojant ultra-efektyvųjį skysčių chromatografą (Waters, MA, USA) su fotodiodų matricos (PDA) detektoriumi. Ciklopirokso olamino atskyrimas buvo vykdytas UPLC BEH C18 kolonėlėje (kolonėlės ilgis – 10 cm, dalelių dydis – 1,7 µm, 2,1x50 mm). CPO analizei naudota mobilioji fazė sudaryta iš 0,5 proc. trifluoracto rūgšties (tirpiklis A) ir 0,2 proc. acetonitrilo (tirpiklis B). Remiantis mokslinių publikacijų duomenimis mobilios fazės gradientas buvo pasirinktas nuo 40 proc. iki 60 proc. acetonitrilo [23,50]. Analizės trukmė – 2 minutės, ciklopirokso olamino sulaikymo trukmė – 0,94 min. (3 pav.). CPO detekcijos UV bangos ilgis – 300 nm. Mobilios fazės tėkmės greitis 0,7 ml/min, injekcijos tūris – 5,0 µl. Kolonėlės temperatūra - 25 ºC, mėginių temperatūra 10 ºC. Metodo validacija atlikta remiantis ICH Q2 gairių rekomendacijomis.
2.5. Ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo ciklopirokso olamino nustatymui validacija
Ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodo validacija atlikta nustatant šiuos parametrus: tiesiškumą, aptikimo (LoD) ir kiekybinio nustatymo (LoQ) ribas, tikslumą bei glaudumą.
2.5.1. Tiesiškumas
Tiesiškumas buvo nustatytas vertinant ciklopirokso olamino smailės priklausomybę nuo koncentracijos. Kalibracinei kreivei sudaryti buvo pagaminti 5 koncentracijų tirpalai (4, 12, 36, 108, 324 µg/ ml) praskiedžiant standartinį tirpalą. Kiekviena serija buvo pakartota po 5 kartus. Kalibracinės kreivės lygtis: y=7,89*103x – 7,41*103. Kalibracinės kreivės tiesiškumas apibūdinamas determacijos koeficientu: R2 = 0,999317.
2.5.2. Aptikimo (LoD) ir kiekybinio nustatymo (LoQ) ribos
Aptikimo (LoD) ir kiekybinio nustatymo (LoQ) buvo ribos įvertintos lyginant smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu. Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos apskaičiuotos analizuojant keturių koncentracijų (4 μg/ml, 8 μg/ml, 16 μg/ml ir 32 μg/ml) tirpalus. Tyrimo metu nustatyta aptikimo riba buvo 0,0521 μg/ml, o kiekybinio nustatymo riba – 0,1738 µg/ml.
2.5.3. Tikslumas ir glaudumas
Metodo tikslumas ir glaudumas buvo vertinamas atliekant pakartojamumo validaciją ir atkuriamumo validaciją. Pakartojamumo validacija atlikta ruošiant 3 serijas 3 skirtingų koncentracijų
(4, 36, 324 μg/ml) tirpalus tą pačią dieną, o akuriamumo – po vieną seriją tokios pačios koncentracijos tirpalus 3 skirtingomis dienomis. Tikslumas buvo vertinamas pagal nustatytą procentinį ciklopirokso olamino kiekį, o glaudumas – pagal santykinį standartinį nuokrypį (SSN, proc.). Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Metodo tikslumo ir glaudumo rezultatai
Pakartojamumas Atkuriamumas
Tikslumas (proc.) Glaudumas, SNN (proc.) Tikslumas (proc.) Glaudumas, SNN (proc.) 96,91 – 104,61 0,39 – 4,92 95,43 – 100,82 0,39 – 1,55
Tikslumo ir glaudumo tyrimų rezultatai parodė, kad metodo pakartojamumo tikslumas pakartojamumo validacijoje buvo nuo 96,91 proc. iki 104,61, o vykdant atkuriamumo validaciją – nuo 95,43 proc. iki 100,82 proc. Kadangi vykdant pakartojamumo ir atkuriamumo validaciją glaudumo reikšmės nebuvo didesnės nei 5 proc. ši metodas yra tinkamas ciklopirokso olamino kiekiniam įvertintimui tolimesniuose biofarmaciniuose tyrimuose in vitro ir ex vivo.
2.6. UV spinduliuotės poveikis ciklopirokso olaminui
Mokslinių tyrimų rezultatai atskleidė, kad ciklopirokso olaminas yra jautrus šviesos poveikiui ir gali susidaryti skilimo produktai [51]. Norint tai įvertinti buvo ištirtas ciklopirokso olamino tirpalo jautrumas šviesos poveikiui laikant jo tirpalą po UVB lempa. UVB šviesos absorbcija intensyviausiai vyksta kai bangos ilgis svyruoja nuo 290 nm iki 320 nm, o ciklopirokso olamino absorbcija intensyviausiai vyksta esant bangos ilgiui 300 nm [52]. Tyrimui atlikti buvo paruoštas ciklopirokso olamino tirpalas 96 proc. etanolyje ir 25 ml šio tirpalo buvo veikiamas UVB spinduliais. Tyrimas buvo vykdomas 4 valandas imant mėginius po 30 min, 1, 2, 3 ir 4 valandų.
2.7. Ciklopirokso olamino tirpumo vertinimas
Ciklopirokso olamino tirpumo įvertinimui buvo ruošiami prisotinti tirpalai vandenyje, 10 proc., 20 proc., 30 proc. etanolyje bei skirtinguose S:koS santykiuose. Į 25 ml chemines stiklines buvo įpilama 10 ml tirpiklio ir dedamas CPO perteklius. Cheminės stiklinės buvo sandarinamos parafilm sandarinimo plėvele bei uždengiamos folija, taip apsaugant vaistinę medžiagą nuo šviesos poveikio. Prisotinti tirpalai purtomi 72 val. termostatinėje spintoje su purtymo funkcija palaikant +25 ± 1 °C temperatūrą. Po 72 val. tirpalai filtruojami per membraninius filtrus, vykdomi skiedimai ir atliekama analizė ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
2.8. Eksperimentinių mikroemulsijų susidarymo ribos aptikimas
Analizuojant paskelbtų mokslinių tyrimų rezultatus, mikroemulsijų su ciklopirokso olaminu, kurių sudėtyje kaip surfaktantas būtų naudojamas Labrasol® nebuvo aptikta, todėl ekperimentiškai buvo nustatytos mikroemulsijų susidarymo ribos kintant S:koS kiekiui sistemoje nuo 30 iki 70 proc. Formuojant eksperimentines sistemas buvo naudojami skirtingi surfaktanto ir kosurfaktanto santykiai: 4:1, 5:1, 6:1, 7:1. Modeliuojant sistemas buvo matuojmas vidutinis dalelių dydis (VDD) bei polidispersiškumo indeksas (PDI). Susidariusi sistema buvo laikoma mikroemulsija tada, kai sistema buvo skaidri, VDD buvo mažesnis nei 200 nm bei PDI < 0,5. Nustačius ME susidarymo ribas buvo braižomos pseudo-trinarės diagramos.
2.9. Mikroemulsijų gamyba
Mikroemulsijų gamybai buvo pasirinkti S:koS santykiai 5:1, 6:1 ir 7:1. Modeliuojant sistemas kaip surfaktantas buvo pasirinktas Labrasol®, kosurfaktantas – propan-1,2-diolis. Aliejinė fazė – oleino rūgštis. Mikroemulsijos buvo gaminamos taikant titravimo metodą lipofiline faze. Pradedant mikroemulsijų gamybą tikslus kiekis ciklopirokso olamino buvo tirpinamas S:koS mišinyje maišant magnetine maišykle 4 val. Ištirpus vaistinei medžiagai tikslus kiekis S:koS buvo maišomas su vandenine faze ir po lašą lašinama aliejinė fazė maišant magnetine maišykle 1250 aps./min greičiu. Sistemos nuskaidrėjimas buvo laikomas mikroemulsijos susidarymo tašku. Pagamintos ME buvo paliekamos 24 valandoms ekvilibracijos laikotarpiui termostate 24 ± 1° C temperatūroje.
2.10. Mikroemulsijų vertinimas IR spektroskopijos metodu
IR spektroskopijos metodu buvo užrašyti ciklopirokso olamino, mikroemulsijos komponentų bei mikroemulsijos be ciklopirokso olamino ir su mikroemulsijos su vaistine medžiaga IR spektrai. Šio tyrimo metu buvo siekiama įvertinti ar vaistinė medžiaga nesąveikauja su mikroemulsijos komponentais. Mažas junginio kiekis buvo užnešamas ant deimanto kristalo ir užrašomas IR spektras esant 450-4000cm-1 bangos ilgiui. Gauti komponentų IR spektrai buvo analizuojami Essential FTIR programa.
2.11. Modelinių sistemų fizikinių savybių nustatymas
Po ekvilibracijos laikotarpio norint įvertinti pagamintų sistemų kokybę buvo nustatomos sekančios mikroemulsijų fizikinės savybės:
Vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas buvo nustatomas dinaminės šviesos sklaidos analizatoriumi Zetasizer (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Didžioji Britanija).
pH reikšmė buvo įvertinama pH-metru (ph-meter 766, Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija).
Elektrinis laidis buvo įvertinamas konduktometru (Cond 3110 SET 1, Vokietija).
Dinaminė klampa buvo įvertinta viskozimetru (Vibro viscometer SV- 10, A&D Company ltd, Japonija).
2.12. Mikroemulsijų stabilumo vertinimas
Sumodeliuotoms sistemoms buvo atliktas stabilumo tyrimas. Visų kompozicijų buvo gaminama po dvi serijas. Vienos iš jų buvo uždengiamos folijos lakštu, taip apsaugant nuo šviesos poveikio, o kitos buvo paliekamos skaidriuose buteliukuose. Sumodeliuotos mikroemulsijos buvo laikomos termostate 24 ± 1° C temperatūroje, eksperimentinių sistemų stabilumas buvo tiriamas po 7, 14, 21, 28 dienų. Kiekvieną savaitę mikroemulsijos buvo vertinamos vizualiai ar nėra spalvos pokyčių, fazių atsiskyrimo bei buvo matuojamas vidutinis dalelių dydis ir polidispersiškumo indeksas.
2.13. Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo vertinimas
Sumodeliuotų mikroemulsijų kokybė buvo įvertinta atlikus termodinaminio stabilumo tyrimą. Termodinamis stabilumas buvo įvertintas vykdant užšaldymo – atšildymo ciklus. Tyrimui atlikti buvo paimta 2 ml mikroemulsijos ir perkelta į Eppendorf mėgintuvėlį, kuris buvo 30 min laikomas -21 ° C temperatūroje, tuomet 30 min. kambario temperatūroje. Po 30 min. ME vertinamos vizualiai, ar nėra fazių atsiskyrimo ir drumstumo, matuojamas VDD bei PDI. Toks ciklas visoms sistemoms buvo kartojamas po 3 kartus.
2.14. Akceptorinės terpės parinkimas
Akceptorinė terpė in vitro tyrimui turi būti parinkta tokia, kuri užtikrintų ,,sink‘‘ sąlygas. Tai sąlygos, kuomet akceptorinė terpė neriboja vaistinės medžiagos tirpumo [53]. ICH gairės nurodo, kad akceptorinės terpės tūris turi būti 10 – 30 proc. didesnis, nei įsotinto tirpalo tūris. Ciklopirokso olamino tirpumas buvo nustatytas vandenyje, bei 10 proc., 20 proc., 30 proc. etanolio tirpaluose ir pagal UESC metodu nustatytas koncentracijas buvo apskaičiuojamas įsotinto tirpalo tūris. Rezultatai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. Akceptorinės terpės kiekis reikalingas ištirpinti mėginyje esantį CPO
Tirpiklis UESC metodu nustatyta CPO konc. μg/ml CPO konc. ME, proc. Donorinės terpės tūris, ml Įsotinto tirpalo tūris, ml H2O 19,77 1 0,1 50,6 10 proc. EtOH 27,50 1 0,1 36,4 20 proc. EtOH 82,97 1 0,1 12,05 30 proc. EtOH 170,64 1 0,1 5,9
Apskaičiavus tiriamųjų tirpalų koncentracijas nustatyta, kad didėjant etilo alkoholio kiekui tirpale didėja ciklopirokso olamino tirpumas. Todėl buvo nuspręsta kaip akceptorinę terpę in vitro tyrimui pasirinkti etanolio tirpalą. In vitro tyrimui buvo parinkta akceptorinė terpė 20 proc. etanolio tirpalas, kadangi akceptorinę terpę pasirinkus distiliuotą vandenį ar 10 proc. etanolio tirpalą akceptorinė terpė galėtų riboti vaistinės medžiagos tirpumą, todėl reikėtų didesnio akceptorinės terpės kiekio.
2.15. Ciklopirokso olamino atpalaidavimo in vitro iš eksperimentinių mikroemulsijų tyrimai Prieš atliekant CPO atpalaidavimo tyrimą in vitro buvo ruošiamos celiuliozinės membranos Cuprophan® (Medicell International Ltd., Londonas, Didžioji Britanija). Prieš eksperimentą membranos buvo kaitinamos 80 °C temperatūroje 1 valandą ir tuomet paliekamos išbrinkti išgrynintame vandenyje.
Ciklopirokso olamino atpalaidavimo tyrimams in vitro buvo naudojamos modifikuotos Franz tipo difuzinės celės. Tyrimams atlikti pasirinkta akceptorinė terpė – 20 proc. etanolio tirpalas. Pradedant eksperimentą į kiekvieną celę buvo įnešama po 0,1 g kiekvienos ekperimentinės ME ir atviroji celės dalis uždengiama celiuliozine membrana Cuprophan®. Membranos difuzijos plotas – 1,33 cm2. Tyrimo metu naudojamos akceptorinės terpės kiekis – 40 ml. Paruošus akceptorinę terpę į ją patalpinama donorinė fazė, įdedamas magnetukas, skirtas magnetinei maišyklei ir pradedamas tyrimas. Preparatams, kurie skirti odos ligoms gydyti rekomenduojama in vitro atpalaidavimo tyrimo temperatūra 32 – 37 °C [54,55]. Ciklopirokso olamino atpalaidavimo tyrimas iš eksperimentinių ME buvo vykdomas +37 ± 0,5° C temperatūroje. Akceptorinės terpės mėginiai imami po 0,5, 1, 2, 4 ir 6 valandų. Mėginio tūris – 1 ml. Mėginiai filtruojami membraniniais filtrais į 2 ml talpos jautriems šviesos poveikiui mėginiams skirtus chromatografinius buteliukus. Paėmus 1 ml mėginį iš akceptorinės terpės grąžinamas toks pat tūris šviežios akceptorinės terpės. Pabaigus tyrimą mėginiai analizuojami ultra-efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Eksperimentas buvo kartojamas 3 kartus.
2.16. Ciklopirokso olamino skvarbos į žmogaus odą tyrimai ex vivo
Ciklopirokso olamino skvarbos į žmogaus odą ex vivo tyrimams atlikti buvo pasirinktos dvi ME kompozicijos kurioje S:koS santykis buvo 6:1 ir kurių sudėtyje buvo 1 ir 2 proc. ciklopirokso olamino. Tyrimams atlikti buvo naudota baltaodžių moterų (25 – 40 metų amžiaus) plastinių operacijų metu pašalinta oda. Prieš atliekant tyrimus, oda buvo laikoma –20 °C temperatūroje ne ilgiau kaip šešis mėnesius.
Skvarbos į žmogaus odą tyrimui atlikti naudota akceptorinė terpė, susidedanti iš 0,9 proc. NaCl ir 0,005 proc. NaN3. Akceptorinės terpės tūris – 5 ml. Skarbos tyrimams ex vivo buvo naudotos modifikuotos Bronaugh tipo pratakios difuzinės celės. Odos difuzijos plotas celėse – 0,64 cm2. Difuzinės celės su jose patalpintais žmogaus odos mėginiais pritvirtinamos ant šildomo metalinio bloko, kuriame palaikoma +37 ± 1° C temperatūra. Naudojant peristaltinį siurblį su daugiakanale siurblio galva buvo palaikomas pastovus akceptorinės terpės cirkuliacijos greitis – 0,6 ml/min.
Eksperimentas pradedamas ekvilibracijos faze, jos metu akceptorinė terpė cirkuliuoja po oda. Ekvilibracijos trukmė – 30 min. Po ekvilibracijos laikotarpio ant odos paviršiaus užnešama ~0,5 g pasirinktos ME, celės sandarinamos parafilm plėvele, uždengiamos folija ir paliekamos 24 valandoms. Po 24 valandų mėginys pašalinamas nuo odos paviršiaus, odos paviršius plaunamas 5 kartus 0,9 proc. NaCl. Nuplauta oda nusausinama, vykdomas odos sluoksnių atskyrimas. Epidermis nuo dermos atskiriamas sauso karščio metodu, atskirti odos mėginiai ekstrahuojami 1 ml metanolyje 30 min. ultragarsinėje vonelėje 24 ± 1° C temperatūroje. Epidermio ir dermos ekstraktai filtruojami membraniniais filtrais ir vykdoma analizė UESC metodu.
2.17. Statistinė duomenų analizė
Duomenys pateikti apskaičiuojant rezultatų vidutines reikšmes, standartinius nuokrypius ir santykinius standartinius nuokrypius. Mažiausias atliktų matavimų skaičius – 3. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant Microsoft Office Excel 2013 ir IBM SPSS 22 programas. Duomenų analizei pritaikytas analizės modelis ANOVA naudojant LSD kriterijų. Nustatytas Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientas. Statistinis duomenų reikšmingumas nustatytas kai p < 0,05.
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas
3.1. UV spinduliuotės poveikis ciklopirokso olaminui
Mokslinių publikacijų duomenys teigia, kad ciklopirokso olaminas yra jautrus šviesos poveikiui ir veikiant UV spinduliams gali susidaryti skilimo produktai [50,51]. Todėl pradedant modeliuoti sistemas būtina įvertinti šviesos poveikį vaistinei medžiagai. Eksperimento metu buvo nustatyta, kad ciklopirokso olaminas skyla veikiant UVB spinduliais. Ciklopirokso olamino tirpalą (96 proc. etanolyje) veikiant UVB spinduliais jau po 30min susidaro didelis kiekis skilimo produkto ir ženkliai sumažėja ciklopirokso olamino kiekis tirpale. 4 paveikslėlyje pavaizduota ciklopirokso olamino skilimo kinetika.
Pateiktame grafike pavaizduota, kad po 30 minučių CPO koncentracija tirpale sumažėjo daugiau nei 90 proc. ir susidarė skilimo produktas. Tyrimą vykdant toliau ciklopirokso olamino koncentracija sumažėjo iki 5,62 μg/ml, tai yra 93,7 proc. mažiau nei UV spinduliais nepaveiktame tirpale. Susidariusio skilimo produkto sulaikymo trukmė – 0,58 min. 5 paveikslėlyje pateikta UESC chromatograma, kuri gauta CPO tirpalą paveikus UV spinduliais 4 val.
0 0,5 1 2 3 4 CPO 88,85 8,53 8,78 8,03 6,63 5,62 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 C P O konc entra cij a, μg /m l Laikas, valandomis UV poveikis vaistinei medžiagai
4 pav. Ciklopirokso olamino skilimo kinetika
