FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GINETA JANUŠAUSKAITĖ
DIAZEPAMO, METAMIZOLO NATRIO IR OMEPRAZOLO MIŠINIO TYRIMAS INSTRUMENTINĖS ANALIZĖS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Andrejus Ževžikovas
KAUNAS, 2014
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas dr. prof. Vitalis Briedis
DIAZEPAMO, METAMIZOLO NATRIO IR OMEPRAZOLO MIŠINIO TYRIMAS INSTRUMENTINĖS ANALIZĖS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Andrejus Ževžikovas
Recenzentas Darbą atliko Doc. G. Kasparavičienė Magistrantė
Gineta Janušauskaitė
KAUNAS, 2014
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS ... 10
DARBO UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Bendros žinios ... 12
1.1.1. Omeprazolas ... 12
1.1.2. Diazepamas ... 12
1.1.3. Metamizolo natris ... 1.2. Omeprazolo, diazepamo bei metamizolo natrio farmakologinis veikimas ... 14
1.3. Mišinio komponentų farmakokinetika ir metabolizmas ... 15
1.4. Apsinuodijimų reiškiniai ... 18
1.4.1. Omeprazolas ... 18
1.4.2. Diazepamas ... 19
1.4.3. Metamizolo natris ... 20
1.5. Vaistinių preparatų kokybinis nustatymas ... 20
1.5.1. Omeprazolo, metamizolo natrio ir diazepamo spalvinės reakcijos ... 20
1.6. Preparatų identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 21
1.7 Preparatų identifikavimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 21
1.8 Preparatų identifikavimas UV - spektroskopijos metodu ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 23
2.1. Tyrimo planavimas ... 23
2.2. Tyrimo objektas ... 23
2.3. Tyrimo metodai ... 23
2.4. Tiriamų medžiagų išskyrimas iš tablečių ... 23
2.4.1. Metamizolo natrio išskyrimas iš tablečių ... 23
2.4.2 Omeprazolo išskyrimas iš tablečių ... 24
2.5 Plonasluoksnės chromatografijos metodo eiga ... 24
2.6 Diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinio atskyrimas ir identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 25
2.7. Diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinio atskyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 27
2.8. Diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinio komponentų identifikavimas UV -
spektroskopijos metodu ... 28
2.9. Statistinė duomenų analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Plonasluoksnės chromatografijos analizės rezultatai ... 30
3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės rezultatai ... 30
3.3 UV- spektroskopijos analizės rezultatai ... 33
3.4. Statistinės analizės aptarimas ... 36
4. IŠVADOS ... 39
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
SANTRAUKA
G. Janušauskaitės magistro baigiamasis darbas „Diazepamo, metamizolo natrio ir omeprazolo mišinio tyrimas instrumentinės analizės metodais“ / mokslinis vadovas doc. dr. A. Ževžikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Šio darbo tikslas buvo pritaikyti instrumentinės analizės metodus (plonasluoksnės chromatografijos, UV - spektroskopijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos) apsinuodijimą sukeliančio mišinio - diazepamo, metamizolo natrio druskos ir omeprazolo tyrimui. Buvo siekiama identifikuoti bei atskirti mišinyje esančius komponentus: diazepamą, metamizolo natrį ir omeprazolą. Remiantis literatūroje pateiktais duomenimis, suradus atskirų mišinio komponentų nustatymo bendrumus bei modifikavus metodikas, buvo bandoma atskirti mišinio komponentus, naudojant instrumentinės analizės tyrimo metodus: plonasluoksnę chromatografiją bei efektyviąją skysčių chromatografiją. Identifikuoti apsinuodijimą sukeliančio mišinio komponentus: diazepamą, metamizolo natrį ir omeprazolą UV – spektroskopijos metodu. Gauti rezultatai parodė, kad UV spektroskopijos metodas tinkamas atskirų mišinį sudarančių komponentų omeprazolo, diazepamo, metamizolo natrio identifikavimui. Tačiau plonasluoksnės chromatografijos metodas buvo pritaikytas metodikos kūrime tirtų medžiagų mišinio identifikavimui ir atskyrimui suradus ir modifikavus dvi tirpiklių sistemas: etilacetatas : etanolis: 25%
NH4OH santykiu 17:2:1; etilacetatas : etanolis : 25% NH4OH : benzenas santykiu 16:3:1:4. Sukurta metodika tinkanti omeprazolo, metamizolo natrio ir diazepamo atskyrimui ir identifikavimui efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Minėtam metodui naudoto eliuento sudėtis: fosfatinis buferis, kurio pH 7,43 ir acetonitrilas. Sistema gradientinė, tirpiklių santykis pirmąsias 3 min. 95:5, 25- tą, -27-tą min. 40 : 60; 31-mą min. 95:5. Naudota kolonėlė - ACE 5 C18, matmenys 250-4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5 µm.
SUMMARY
G. Janušauskaitė‘s master thesis "Diazepam, metamizol sodium and omeprazole assay mixture of instrumental methods of analysis / research director doc. dr. A. Ževžikovas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Analytical and Toxicological Chemistry. - Kaunas.
This work was undertaken to instrumental analytical methods (thin-layer chromatography, UV - spectroscopy and high performance liquid chromatography) poisoning causes mix - diazepam, metamizol sodium and omeprazole test. The aim was to identify and separate the components in a mixture of : diazepam, metamizol sodium and omeprazole. According to the literature data, finding the individual components of the mixture for determining similarities and modification techniques, attempts were made to separate components of a mixture by using instrumental analytical test methods: thin-layer chromatography and high performance liquid chromatography. It also summarizes the results of the work and assess the usefulness of instrumental methods of analysis of diazepam, metamizol and omeprazole formulations. The results showed that the UV – spectroscopy method is suitable individual components fixing of the latter. However, the thin-layer chromatographic method has been applied to investigate the creation of methods for identification and mixture separation and finding a modification of the two solvent systems: ethyl acetate: ethanol: 25% NH4OH 17:2:1 ratio; ethyl acetate: ethanol: 25%
NH4OH: benzene ratio of 16: 3:1:4. Also was created solvent system suitable for omeprazole, metamizol sodium and diazepam separation and identification using high-performance liquid chromatography.
Above approach used method composition of the eliuent : phosphate buffer at pH 7.43 and acetonitrile.
Gradient system, the solvent ratio of the first 3 minutes. 95:5, 25th and the 27th-minute 40: 60; 31-st min. 95:5. Used column - ACE 5 C18, size 250 to 4.6 mm, sorbent particle size - 5 µm.
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovui, doc. dr. Andrejui Ževžikovui, už konsultacijas bei pagalbą padedant rašyti magistrinį darbą. Taip pat dėkoju, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros darbuotojams.
SANTRUMPOS
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija CNS - centrinė nervų sistema
UV- ultravioletinė šviesa
ĮVADAS
Žmonės serga įvairiomis ligomis, dažnai net keliomis iš karto, todėl vartoja skirtingus vaistus joms gydyti. Pastarieji gali sąveikauti tarpusavyje, slopinti ar stiprinti vieni kitų veikimą.
Be to, nesunkius sveikatos sutrikimus dauguma žmonių gydosi patys, vartoja nereceptinius vaistus, kurie taip pat gali turėti įtakos prieš tai vartotų vaistų veikimui, lėtinių ligų gydymui. Neatsakingas vaistų vartojimas, gali sukelti apsinuodijimus, o kartais net ir mirtį. Ne išimtis kad, vis dažniau nerimą kelia apsinuodijimas alkoholiu ir psichotropiniais preparatais.
Padaugėjo apsinuodijimų ne tik viena medžiaga bet ir vaistų mišiniais, kurie sudaryti iš keleto tai yra dviejų, trijų ir daugiau komponentų [3]. Dažniausiai pasitaikanti atsitiktinių apsinuodijimų priežastis – benzodiazepinai [2]. Lengvai apsinuodijus jaučiami tokie CNS sutrikimai: mieguistumas, svaigimas, ūžimas ausyse, ataksija, neramumas, nesunkūs ekstrapiramidiniai simptomai. Taip pat lengvi cholinerginiai ar anticholinerginiai simptomai [6].
Higienos instituto sveikatos informacijos centro duomenimis 2012 metais 49 % visų apsinuodijusiųjų stacionare gydytų ligonių apsinuodijo alkoholiu, 35 % vaistais, biologinėmis medžiagomis bei narkotikais [1]. 2006 metais buvo išanalizuota Mykolo Riomerio universiteto Teismo medicinos instituto pateikta informacijoje apie narkotines ir psichotropines medžiagas, pažymima, kad iš 56 mirties liudijimų, kuriuose mirties priežastis buvo įvardinta kaip„atsitiktinis arba tyčinis apsinuodijimas narkotinėmis ar psichotropinėmis medžiagomis, arba ilgalaikio narkotinių ar psichotropinių medžiagų vartojimo pasekmės“, 15 atvejų buvo aptiktas morfinas su kitomis medžiagomis (diazepamu, kodeinu, amfetaminu ir kt.), 6 atvejais buvo aptiktas diazepamas, oksazepamas ir metamizolo natris [5].
Taip pat 2006 metais Lietuvoje buvo nustatytas 121 mirties atvejis, kurio pagrindinė mirties priežastis nebuvo apsinuodijimas psichotropiniais vaistais, tačiau buvo aptiktos šių medžiagų liekanos: diazepamo (52 atvejai), oksazepamo (22 atvejai) ir kt [5].
Taigi, medžiagų mišiniais apsinuodijama, todėl aktualu juos tirti, kad būtų galima greitai identifikuoti apsinuodijimą sukėlusias medžiagas. Tai padaryti galima pasinaudojant instrumentinės analizės metodais - tokiais, kaip plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų-dujų, dujų skysčių chromatografija, UV- spektroskopija. Mišinių tyrimo metodikos kiekvienu atveju yra skirtingos, pastarąsias reikia optimizuoti taip, kad būtų galima greitai ir tiksliai identifikuoti bei atskirti tiriamas medžiagas mišinyje. Literatūroje nėra duomenų apie tiriamo vaistinių medžiagų mišinio sudėties analizę, todėl šio darbo tikslas yra pritaikyti instrumentinės analizės metodus (plonasluoksnės chromatografijos, UV-spektroskopijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos) mišinio, sudaryto iš diazepamo, metamizolo natrio ir omeprazolo kokybiniam tyrimui.
DARBO TIKSLAS
Darbo tikslas - pritaikyti instrumentinės analizės metodus (plonasluoksnės chromatografijos, UV-spektroskopijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos) mišinio sudaryto iš diazepamo, metamizolo natrio ir omeprazolo kokybiniam tyrimui.
DARBO UŽDAVINIAI
Darbo uždaviniai :
1) Remiantis literatūroje pateiktais duomenimis, suradus atskirų mišinio komponentų nustatymo bendrumus bei modifikuojant metodikas, atskirti omeprazolą, metamizolo natrį ir diazepamą, plonasluoksnės chromatografijos metodu.
2) Remiantis literatūroje pateiktais duomenimis, suradus atskirų mišinio komponentų nustatymo bendrumus bei modifikuojant metodikas, atskirti omeprazolą, metamizolo natrį ir diazepamą, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
3) Identifikuoti apsinuodijimą sukeliančio mišinio komponentus: diazepamą, metamizolo natrį ir omeprazolą UV – spektroskopijos metodu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bendros žinios
1.1.1.Omeprazolas
Bruto formulė: C17H19N3O3S [30]
Molekulinė masė = 345.4 [30]
Antiopinis, protonų siurblio inhibitorius.
IUPAC pavadinimas 6-Metoksi-2-[(4-metoksi-3,5dimetilpiridin-2-yl)metilsulfinil]-1H- benzimidazolas.[30]
Savybės : balti ar beveik balti kristaliniai milteliai. Labai lengvai tirpūs vandenyje, tirpūs etilo alkoholyje, metilo alkoholyje ir dichlormetane. Omeprazolas labai tirpus šarminiuose tirpaluose.
Lydymosi temperatūra 156 °C. [30]
Sinonimai:Antra; Gasec• ; Gastracid; Gastrogard; Gastroloc; Losec; Mepral; Mopral;
Omebel•;Omediprol•;Omep•;Omep Uno•; Omeprazol Actavis•;Omeprazole Aurobindo•; Omeprazole Inteli•; Omeprazole STADA•;Omeprazole Uqfar•;Omeprazole-ratiopharm•; Omolin•;Omebeta; Omepral; Omeprazen; Parizac; Pepticum; Prilosec; Zegerid; Zoltum, Remostar•;Ultop•;Xantrazol• .[30][8]
Vaisto formos: kietosios kapsulės
Dozės: paprastai nuo 20 mg iki 40 mg. [30]
• - šiuo ženkleliu pažymėti firminiai omeprazolo pavadinimai registruoti Lietuvos Respublikoje.
1.1.2.Diazepamas
Bruto formulė:C16H13ClN2O [28].
Molekulinė masė = 284.8 [28].
Diazepamas yra 1,4-benzodiazepinas.
IUPAC pavadinimas-7-Chloro-1,3-dihidro-1-metil-5-fenil-3H-1,4 benzodiazepinas.
Savybės : balti arba geltoni kristaliniai milteliai, lengvai tirpūs vandenyje; tirpūs 1 : 25 etanolyje, 1 : 2 trichlormetane, 1 : 39 eteryje [28].
Sinonimai:Antenex, Anxicalm, Apozepam, Dialar, Diapam, Diazemuls,
Diazep, Ducene, Faustan, Gewacalm, Hexalid, Lamra, Medipam, Novazam, Novodipam, Pro-Pam, Psychopax, Rimapam, Serenack, Stesolid, Tensium, Tranquase, Umbrium,
Valaxona, Valclair, Valiquid, Valium, Vivol,Apaurin•, Diazepex•, Relium•, Relanium•, Seduxen• [28; 8].
Vaisto formos: injekcinis tirpalas, tabletės, plėvele dengtos tabletės, geriamoji suspensija.
Dozės: nuo 5 iki 30 mg [28].
• - šiuo ženkleliu pažymėti firminiai diazepamo pavadinimai registruoti Lietuvos Respublikoje.
1.1.3.Metamizolo natris
Bruto formulė:C13H16N3NaO4S,H2O [29].
Molekulinė masė =351.4 [29].
IUPAC pavadinimas Natrio[(–1,5dimetil-3-okso-2fenilpirazol 4) –metil amino]metansulfonatas Savybės: balti arba silpnai gelsvo atspalvio kristaliniai milteliai, vandenyje tirpsta santykiu 1: 1,5;
etanolyje 1:30. Praktiškai netirpsta eteryje, acetone, benzene, trichlormetane. Lydymosi temperatūra 172 °C [29].
Sinonimai:Algi; Analgin; Baralgin; Berlosin; Conmel; Dolemicin;
Dolocalma; Inalgon Neu; Lasain; Metilon; Minalgin; Neo Melubrina; Nevralgina;
Nolotil; Novalgin(e); Novaminsulfon; Optalgin; Pyril; Trisalgina; Unagen. Analginas L•, Analginas SANITAS •, Analgin Sopharma • [29;8].
Vaisto formos: tabletės po 500 mg, injekcinis tirpalas 1g/2ml Dozės: 0,5 – 4g [29].
• - šiuo ženkleliu pažymėti firminiai metamizolo natrio pavadinimai registruoti Lietuvos Respublikoje.
1.2. Omeprazolo, diazepamo bei metamizolo natrio farmakologinis veikimas
Omeprazolas yra selektyvus vandenilio/kalio ATP-azės inhibitorius skrandžio parietalinėse ląstelėse, plačiai naudojamas esant įvairiems su skrandžio rūgštingumu susijusiems sutrikimams gydyti [34]. Omeprazolas blokuoja paskutinę skrandžio rūgšties gamybos stadiją. Šis poveikis yra priklausomas nuo dozės ir slopina skrandžio rūgšties sekreciją nepriklausomai nuo dirgiklio [12]. Dažniausiai vartojamas, gydant dispepsijas, skrandžio ir dvylikapirštės žarnos opas, gastroezofaginį refliuksą. Gydymas ne visada būna sėkmingas. Tai gali nulemti netinkamas omeprazolo vartojimas su nesuderinamais vaistais [24].
Vaistų sąveikos mechanizmas apima kepenų fermentų sistemos citochromo P450 aktyvinimą arba inhibavimą, slopinamas P-glikoproteino baltymo medijuojamas vaistų transportas, slopinama absorbcija. Pastaroji sulėtėja dėl skrandžio rūgštingumo sumažėjimo.
Kartais, omeprazolas nesukelia protonų siurblio inhibitoriaus klasės efekto. Neatsižvelgiant į tai, kad omeprazolas yra vienas iš plačiausiai naudojamų vaistų tarptautiniu mastu, reikia pagerinti klinikinį rizikos valdymą dėl nepalankios vaistų sąveikos su omeprazolu ir garantuoti saugų omeprazolo derinio naudojimą, racionaliai nurodant alternatyvas, tikrinant gydytojo nurodymų tinkamumą prieš paskyrimą bei terapinės vaistų kontrolės atlikimą [24].
Diazepamas yra vaistas, priklausantis farmakologinių junginių - benzodiazepinų grupei, kurie yra plačiai naudojami nerimo, nemigos gydymui, traukulių slopinimui, bei premedikacijai prieš operacijas [4]. Pastarasis yra 1,4-benzodiazepinas, kuris selektyviai jungiasi prie GABAA
receptorių smegenyse sumažindamas sujaudinimą ir veikdamas emocijas [33]. GABAA
receptorius yra chlorido jonų kanalo makromolekulinis kompleksas, sudarytas iš penkių subvienetų, o GABA yra labiausiai slopinantis neurotransmiteris centrinėje nervų sistemoje, kuris jungiasi prie α irβ subvienetų ir atidaro tarp jų esantį chlorido jonų kanalą, sukeldamas membranos depoliarizaciją. GABA jungiasi daugiausiai prie α subvieneto, o diazepamas jungiasi prie β subvieneto, γ subvienetas yra taip pat būtinas chlorido transporto moduliacijai. Diazepamas nulemia pagrindinio slopinančio neurotransmiterio – gama amino sviesto rūgšties kiekio padidėjimą palengvindamas chlorido jonų tekėjimą per jonų kanalus, ko pasekoje sulėteja GABA metabolizmas [21].
Nuolat vartojami benzodiazepinai gali sukelti priklausomybę. Žmonės piktnaudžiauja šios grupės vaistais derindami pastaruosius su kitų grupių vaistais, siekdami svaigintis. Kaip alternatyva benzodiazepinams vartojami vaistai, kurie taip pat sukelia priklausomybę, pavyzdžiui, antidepresantai, antikonvulsiniai preparatai, buspironas, antihipertenziniai vaistai ir naujesni
neuroleptikai. Įdomu ir tai, kad selektyvūs serotonino reabsorbcijos inhibitoriai padidina diazepamo koncentraciją kraujyje [25].
Metamizolo natris yra bendras skausmą malšinantis ir karščiavimą mažinantis vaistas.
Tačiau jo vartojimas gali sukelti agranulocitozę ir aplastinė anemiją. Nepageidaujamos reakcijos yra retos ir nenuspėjamos [27]. Farmakologiškai aktyvūs metamizolo natrio metabolitai - 4- metil- aminoantipirinas ir amino-antipirinas neinhibuoja ciklooksigenzės aktyvumo in vitro kaip klasikiniai ciklooksigenazės inhibitoriai, bet pakeičia prostaglandinų sintezę, tiesiogiai prisijgundami prie jos aktyvios vietos. Nustatyta, kad 4 - metilamino antipirinas ir amino - antipirinas suformuoja stabilius kompleksus su krauju ir kraujyje reaguoja su geležies jonais Fe2+
arba ciklooksigenaze. Be to, 4 - metil amino antipirinas redukuoja Fe 3 + į Fe2+ ir atitinkamai padidina lipidų peroksidaciją bei anitoksidantinių fermentų ekspresiją kultivuotose ląstelėse bei gyvame organizme [34]. Dėl nepageidaujamų poveikių hemodinamikai metamizolo natris neturėtų būti pirmo pasirinkimo vaistas nuo karščiavimo pacientams, kurių būklė nestabili [16].
1.3. Mišinio komponentų farmakokinetika ir metabolizmas
Omeprazolas yra gerai absorbuojamas virškinamajame trakte. Po absorbcijos pastarasis yra metabolizuojamas į tris pagrindinius metabolitus: omeprazolo sulfoną, omeprazolo sulfidą ir hidroksiomeprazolą, kurie gali būti identifikuojami žmogaus kraujo plazmoje [31]. Omeprazolas metabolizuojamas kepenyse, vyrauja oksidaciniai procesai dalyvaujant citochromo P - 450 fermentinei sistemai, veikiant fermentams CYP2C19 ir CYP3A4. CYP2C19 yra polimorfinis, mutavęs recesyvinis genas. Homozigotai neturi CYP2C19 fermento ir jų omeprazolo plazmos koncentracijos didesnės, palyginus su greitai šį vaistą metabolizuojančiais [32].
Iš pradžių omeprazolas yra metabolizuojamasCYP2C19 į 5- hidroksiomeprazolą, o šis junginys verčiamas į 5- hidroksiomeprazolo sulfoną veikiant fermentui CYP3A4. Dalį omeprazolo fermentas CYP3A4 tiesiogiai metabolizuoja į omeprazolo sulfoną, o pastarasis veikiant CYP2C19 fermentui transformuojamas į 5-hidroksiomeprazolo sulfoną [15].
Omeprazolas inhibuoja savo paties sukeltą izofermento CYP2C19 medijuojamą tarpinį metabolizmą, o taip pat gali paveikti ir kitų vaistų suirimą, kurie metabolizuojami dalyvaujant minėtam izofermentui - CYP2C19. Viena iš svarbiausių sąveikų yra omeprazolo sąveika su diazepamu, dėl 25 - 50 % sumažėjusio diazepamo klirenso, kurį nulemia, prieš tai minėtas, omeprazolo sukeltas izofermento CYP2C19 inhibavimas. Tačiau ši sąveika nepastebėta lėtai omeprazolą metabolizuojantiems asmenims [18]. Per os vartojamo omeprazolo bioprieinamumas
maždaug 40-50 %, o gyvavimo pusperiodis nuo 0,5 iki 2 valandų. Maksimali koncentracija kraujyje labai priklauso nuo vaisto formos [31].
Diazepamas yra greitai absorbuojamas. Per os bioprieinamumas yra maždaug 100 %.
Minėta vaistinė medžiaga 99 % surišama kraujo plazmoje. Diazepamo gyvavimo pusperiodis yra 43±13 valandų, bet svyruoja nuo 40-100 valandų, jei sudėtyje yra aktyvus metabolitas.
Diazepamas yra metabolizuojamas į nordiazepamą. Tai aktyvus metabolitas, kurio gyvavimo pusperiodis 40-99 valandos. Temazepamas ir oksazepamas yra mažai aktyvūs diazepamo metabolitai. Diazepamas yra šalinamas su šlapimu kaip oksazepamo konjugatas (~33 %), bei kaip temazepamo konjugatas, kartu su šiais metabolitais gali būti randami diazepamo ir nordiazepamo likučiai [33].
Diazepamo vartojimas vyresnio amžiaus pacientams yra rizikingas dėl padidėjusios rizikos kauptis pastarojo metabolitams, kurie gali sukelti apsinuodijimą. Taip pat pažymėtina, kad diazepamas turi ilgesnį gyvavimo pusperiodį palyginus su kitais benzodiazepinais, pavyzdžiui, lorazepamu, klonazepamu, todėl gali sukelti nepageidaujamus poveikius [35].
Molekulinės sąveikos: Diazepamas yra demetilinamas į nordiazepamą per citochromo P-450 2C19 ir citochromo P-450 3A4 sistemas (Žr. 1 pav.). Diazepamas 3-hidroksilinimas į temazepamą ir oksazepamą, tai įvyksta per citochromo P-450 3A4 sistemą. Potencialūs citochromo P-450 2C19 ir citochromo P- 450 3A4 inhibitoriai gali sumažinti diazepamo pašalinimo tempą, jei aktyvinami minėtos kepenų sistemos fermentai ekskrecijos tempas gali padidėti [33].
1pav. Diazepamo metabolizmas [19]
Oksazepamas yra dviejų pirminių metabolitų galutinis medžiagų apykaitos produktas ir todėl gali būti laikomas diazepamo medžiagų apykaitos galutiniu produktu. Nordiazepamas, temazepamas ir oksazepamas šlapime gali būti nustatytas, kai neseniai vartotas diazepamas.
Dažnai ar kasdien vartojantiems diazepamo atlikus paprastą bendrą testą bus teigiamas rezultatas visiems trims metabolitams. Jei pacientui atliekami tyrimai po diazepamo vartojimo praėjus kelioms dienoms, aptinkami oksazepamo pėdsakai (<300 ng/mL) [17]
Metamizolo natrio farmakokinetika apibūdinama kaip greita šios medžiagos hidrolizė į pagrindinį aktyvų metabolitą - 4-metilaminoantipiriną. Metamizolo natrio bioprieinamumas siekia 85 % vartojant tabletes per os, o maksimali sisteminė koncentracija pasiekiama maždaug po 1,2 - 2 valandų [23]. Žinomi keturi pagrindiniai metamizolo natrio metabolitai:4-metilaminoantipirinas, 4-aminoantipirinas , 4-formilaminoantipirinas ir 4-acetilaminoantipirinas [26]. Metamizolo natrio metabolitas - 4-metilaminoantipirinas yra demetilinamas į 4-aminoantipiriną bei oksiduojamas į 4-formilaminoantipiriną , o 4–aminoantipirinas yra toliau acetilinamas polimorfinės – N- acetiltransferazės -2 į 4-acetilaminoantipiriną [22]. (Žr. 2 pav.) Šių keturių metabolitų kiekis šlapime atspindi 60 % suvartotos metamizolo natrio dozės [23].
2 pav. Metamizolo natrio metabolizmas žmogaus organizme [22]
1.4. Apsinuodijimų reiškiniai
1.4.1. Omeprazolas
Norint įvertinti omeprazolo saugumą buvo atlikti tyrimai su keliomis gyvūnų rūšimis.
Bendra graužikams nustatyta mirtina dozė per os apie 4g/kg . Ryškių klinikinių nepageidaujamų reiškinių nebuvo nustatyta, tik tam tikri sumažėję hematologiniai rodikliai, pavyzdžiui pelėms ir žiurkėms sumažėjo eritrocitų skaičius. Hematokrito ir hemoglobino kiekis kraujyje sumažėjo,
kai dozė buvo 125 μmol/kg/per dieną ir didesnė. Teratogeniškumas nenustatytas. Apsinuodijimo reiškiniai reti [13].
1.4.2. Diazepamas
Diazepamas bei alprazolamas yra du daugiausiai skiriami benzodiazepinai - anksiolitikai Jungtinėse Amerikos Valstijose. Pažymėtina ir tai, kad tai raminamieji vaistai, kuriais ypač piktnaudžiaujama [37]. Specifinės dozės, susijusios su mirtimi nėra. Apžvelgus 914 su benzodiazepinais susietų mirčių atvejų Šiaurės Amerikoje, tik du atvejai buvo susiję su vienu diazepamu. Perdozavus šio benzodiazepino 450 - 500 mg, 2000 mg dozėmis dviem atvejais, pacientai sveiko be specifinės terapijos nuo 24 iki 48 valandų. Nuodingumas, siejamas su greita intravenine injekcija, nepriklauso nuo dozės, tačiau gali atsirasti vartojant ir terapines vaisto dozes [20].
Diazepamas vartojamas vienas retai sukelia mirtį, tačiau kur kas daugiau nepageidaujamų reiškinių ir sąveikų atsiranda kartu vartojant kitus vaistus. Švedijoje atliktas dvigubai aklas tyrimas (dalyvavo dvi pacientų grupės, kurios vartojo omeprazolą ir placebą, tačiau nei viena grupė nežinojo ar vartoja placebą ar ne). Buvo tiriama kaip diazepamo koncentraciją kraujyje veikia omeprazolo greitas arba lėtas metabolizmas, kurio greitis priklauso nuo to ar žmogus turi izofermentą CYP2C19. Jei asmuo jo neturi tada omeprazolo plazmos koncentracijos didesnės.
Buvo tiriami keturi lėtai omeprazolą metabolizuojantys ir šeši greitai omeprazolą metabolizuojantys asmenys.
Viena intraveninė diazepamo dozė (0.1 mg/kg) buvo injekuojama po 1 savaitės gydymo omeprazolu per os ir placebu. Kraujas buvo paimtas praėjus 120 valandų po gautos diazepamo dozės - 0,1mg/kg ( kasdien buvo duota omeprazolo 20 mg arba placebo), kad būtų išmatuota diazepamo ir jo pagrindinio metabolito desmetildiazepamo koncentracija. Lėtai omeprazolą metabolizuojantys taip pat lėtai metabolizavo ir diazepamą, nustatyta tik pusė reikiamo diazepamo plazmos klirenso palyginus su kitais tiriamaisiais. Vidutinis diazepamo klirensas sumažėjo 26 % po omeprazolo vartojimo tiriamiesiems, kurie greitai metabolizuoja omeprazolą, tuo tarpu lėtai metabolizuojanti grupė neparodė jokios matomos sąveikos. Vidutinės plazmos desmetildiazepamo koncentracijos grečiau susidarė greit metabolizuojančiai grupei palyginus su lėtai metabolizuojančia, kas yra logiška diazepamo medžiagų apykaitos normos pasekmė [9].
Galima daryti išvadą, kad lėtai metabolizuojantys omeprazolą asmenys gali stipriau apsinuodyti diazepamu dėl sumažėjusios jo ekskrecijos ir padidėjusios koncentracijos kraujo plazmoje.
Diazepamas yra vienas iš medžiagų, kuria paprastai piktnaudžiaujama. Yra duomenų, kad diazepamas mažina ciklinio nukleotido fosfodiesterazės fermento skirtingų izoformų aktyvumą, o be to stiprina adrenalino ir noradrenalino inotropinį poveikį, ko pasekoje gali padidėti miokardo susitraukimo jėga. Manoma, kad dvigubas apsinuodijimas amfetaminu ir benzodiazepinais veikia širdies audinius ir koronarines arterijas, kas nulemia stipresnį miokardo pažeidimą [36].
1.4.3. Metamizolo natris
Aprašytas atvejis apie šio vaisto apsinuodijimo atvejį, kai buvo suvartotos 98 Novalgino tabletės (atitinkančios 49 g metamizolo) . Po skrandžio išplovimo buvo atlikta keturiolika valandų trukusi forsuota diurezė. Metamizolo natrio metabolitai kraujo serume ir šlapime buvo nustatyti plonasluoksnės chromatografijos metodu. Po 24 valandų kraujo serume metamizolo metabolitų koncentracija buvo dar ryškiai padidėjusi. Per inkstus buvo pašalinta vienuolika gramų metamizolo. Pacientė išgyveno sunkų apsinuodijimą be reikšmingų organų pažeidimų. Šis palankus atvejis skiriasi nuo pranešimų apie mirtiną apsinuodijimą kitais pirazolono išvestiniais dariniais, ypač kai metamizolo natris vartojamas su kitais vaistais. Metamizolo metabolitų pašalinimas ir biotransformacija tęsėsi ir po 24 valandų po apsinuodijimo. Šiuo atveju forsuota diurezė buvo pakankama procedūra, kad būtų pašalinti nuodingi metabolitai, tačiau to ne visada pakanka [39].
Kai vartojama metamizolo natrio dozė yra 7,5 g galimas gastroenterinis apsinuodijimas (skrandžio ir plonosios žarnos uždegimas) [11]. Metamizolo natrio perdozavimas yra dažnas ir gali lemti stiprų ne oligurinį inkstų nepakankamumą [10].
1.5. Vaistinių preparatų kokybinis nustatymas
1.5.1. Omeprazolo, metamizolo natrio ir diazepamo spalvinės reakcijos
Omeprazolas Nėra
Diazepamas
Formaldehidas - sieros rūgštis - oranžinė spalva [28]
Metamizolo natris
Spalvos testai [29] : Su FeCl3 – violetinė spalva
Su Folino reagentu – mėlyna spalva Su Libermano reagentu – mėlyna spalva Su Mandelino reagentu – ruda spalva
Su nitrato rūgštimi – greitai nykstanti mėlyna spalva
1.6. Preparatų identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu
Remiantis literatūros duomenimis [28;29;] tyrinėjamas medžiagas galima identifikuoti plonasluoksnės chromatografijos metodu, tačiau nėra duomenų apie bendras sistemas, pagal kurias būtų galima identifikuoti keletą analizuojamų medžiagų kartu. Lentelėje pateiktos atskirų medžiagų identifikavimui taikomos plonasluoksnės chromatografijos tirpiklių sistemos. Žr. 1 lentelę
1 lentelė. Judančių fazių tirpiklių sistemos ir tiriamų medžiagų Rf reikšmės tose sistemose
1.7 Preparatų identifikavimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Naudojantis literatūros duomenimis ESC (efektyviosios skysčių chromatografijos) metodo sąlygos aprašytos atskirai kiekvienam junginiui. Antroje lentelėje pateikta bendros tirpiklių sistemos sudėtis atskirų mišinį sudarančių medžiagų identifikavimui ESC metodu. [28,29,30]. Žr. 2 lentelė.
Judanti fazė Tiriamų medžiagų Rf reikšmės
Tirpiklių sistema Diazepamas Metamizolo natris
Metanolis - 25% NH4OH 0,75 0,84
Etilacetatas - metanolis - 25% NH4OH
0,76 0,02
Acetonas 0,59 0,02
2 lentelė. Judrios fazės sudėtis, standartinių tirpalų sulaikymo laiko reikšmė
1.8 Preparatų identifikavimas UV spektroskopijos metodu
Šis analizės metodas yra tikslus, jautrus, todėl tyrinėjamas medžiagas galima identifikuoti užrašius jų šviesos sugerties spektrus. Išanalizuotoje literatūroje nustatyta, kad metamizolo natris ir diazepamas identifikuojami UV spektroskopijos metodu parūgštintame vandenyje, omeprazolas 0,2 mol/l NH2SO4 tirpale. Trečioje lentelėje pateikti šių medžiagų sugertos šviesos bangos ilgio maksimumai [28,29,30]
3 lentelė. Medžiagų absorbuotos UV šviesos bangos ilgių maksimumai atitinkamuose tirpikliuose
Medžiagos Tirpiklis Bangos ilgis (nm)
Metamizolo natris Parūgštintas vanduo 258
Omeprazolas 0,2 mol/l NH2SO4 vandeninis tirpalas
277, 303,279
Diazepamas Parūgštintas vanduo 284, 366
Judrios fazės sudėtis
Sulaikymo laikas
Metamizolo natris
Diazepamas Omeprazolas
146 µl trietilamino ir 750µl fosfato rūgšties, 530 ml vandeninis tirpalas. Tirpalo pH 3,3, koreguojamas 10%
KOH tirpalu.
470 ml acetonitrilo.
1,4 min
8.4 min
2.8 min.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo planavimas
Tyrimo planą suskirstėme į etapus:
1. Omeprazolo ir metamizolo natrio išskyrimas iš tablečių.
2. Mišinio sudaryto iš diazepamo, metamizolo natrio ir omeprazolo identifikavimas ir atskyrimas plonasluoksnės chromatografijos metodu.
3. Mišinio susidedančio iš diazepamo, metamizolo natrio ir omeprazolo identifikavimas ir atskyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
4. Diazepamo, omeprazolo, metamizolo natrio identifikavimas UV spektroskopijos metodu.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas yra diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinys. Pastarasis pagamintas ekstrahuojant dvi veikliąsias medžiagas – omeprazolą ir metamizolo natrį iš tablečių. Omeprazolas buvo išekstrahuotas iš 40 mg omeprazolo kapsulių „Omep“, o metamizolo natris iš 500 mg metamizolo natrio tablečių „Analgin Sopharma“. Diazepamas- standartinė medžiaga DIA 107 -100 LIPOMED AG, ARLESHEIM SWITZERLAND.
2.3. Tyrimo metodai
Tyrimas atliktas panaudojant šiuos metodus:
1. Plonasluoksnę chromatografiją 2. Efektyviąją skysčių chromatografiją 3. UV- spektroskopiją
2.4. Tiriamų medžiagų išskyrimas iš tablečių
2.4.1. Metamizolo natrio išskyrimas iš tablečių
500 mg metamizolo natrio tabletė buvo sutrinta grūstuvėlėje su grūstuvėliu, po to gauti milteliai ištirpinti 20 ml distiliuoto vandens. Tada gauta suspensija buvo nufiltruota. Gautas filtratas buvo perpiltas į dalomąjį piltuvą ir ekstrahuojamas su 20 ml trichlormetanu. Ekstrahuojant veikliąją medžiagą dalomasis piltuvas buvo vartomas 60 kartų, kas 20 kartų atidarant dalomojo piltuvo kamštį, kad susivienodintų slėgis. Išekstrahavus, dalomasis piltuvas paliekamas kol atsiskiria trichlormetano ir tiriamojo tirpalo sluoksniai, o paskui trichlormetano tirpalas buvo nufiltruotas. Filtratas paliktas traukos spintoje, kad išgaruotų trichlormetanas. Taip pagamintas pirmasis metamizolo natrio mėginys.
2.4.2 Omeprazolo išskyrimas iš tablečių
Keturių 40 mg omeprazolo kapsulių turinys buvo sutrintas grūstuvėlėje, ištirpintas 20 mililitrų distiliuotame vandenyje ir nufiltruotas. Filtratas buvo pilamas į dalomąjį piltuvą ir ekstrahuojamas su 20 ml trichlormetanu 60 kartų vartant dalomajį piltuvą. Kas 20 kartų buvo nuimamas dalomojo piltuvo kamštis, kad susivienodintų slėgis. Paulaukiama, kol atsiskiria trichlormetano ir vandeninio tirpalo sluoksniai. Išekstrahuotas trichlormetano tirpalas buvo nufiltruotas ir paliktas traukos spintoje, kol išgaruoja trichlormetanas.
2.5 Plonasluoksnės chromatografijos metodo eiga
Išekstrahuotų veikliųjų medžiagų omeprazolo iš „Omep“ 40 mg kapsulių ir metamizolo natrio iš „Analgin sopharma“ 500 mg tablečių, sausi likučiai buvo ištirpinti keliuose lašuose trichlormetano tirpalo. Diazepamo standartas taip pat ištirpintas keliuose lašuose trichlormetano. Tyrmui buvo naudojamos DC – Fertigfolien Alugram SIL G/UV254 aliuminio plokštelės. Minėtų medžiagų tirpalai mikrokapiliaru buvo lašinami ant chromatografinės plokštelės linijos, kuri nubrėžta taip, kad atstumas nuo plokštelės krašto ir nuo jos pagrindo būtų nemažesnis nei 1,5 cm.Mišinys gautas mikrokapiliaru (skersmuo 10 µm) užlašinus 1 lašą diazepamo trichlormetaninio tirpalo ant chromatografinės plokštelės linijos, palaukiama kol dėmė išdžius, po to į ta pačią vietą buvo lašinamas 1 lašas omeprazolo ištirpinto trichlormetane, vėl palaukiama kol dėmė išdžius ir tuomet buvo užlašinamas 1 lašas metamizolo natrio triclormetaninio tirpalo. Po to chromatografinė plokštelė buvo dedama į tirpiklių sistema įsotintą chromatografinę kamerą ir laikoma, kol tirpiklis pakils 10 cm nuo pradinės linijos. Tada plokštelė buvo išimama ir džiovinama traukos spintoje. Plokštelės buvo ryškinamos su UV šviesoje (bangų intervalas 254-365 nm).
2.6 Diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinio atskyrimas ir identifikavimas plonasluoksnės chromatografijos metodu
Šiuo tyrimo metodu buvo siekta sukurti tokią tirpiklių sistemą, kurią naudojant būtų galima identifikuoti visas mišinį sudarančias medžiagas bei jas atskirti. To siekiant, buvo tiriamos įvairios tirpiklių sistemos, TA; TC; TD; TL; TE; TF, TAE [7]. Minėtos sistemos sudarytos iš: acetono, trichlormetano, etilacetato, etanolio, benzeno, amonio hidroksido. Keičiant tirpiklius, jų kiekio santykius buvo sukurtos dvi sistemos, tinkančios ir atskirti mišinį sudarančias medžiagas ir jas identifikuoti.
Siekiant įvertinti tiriamo mišinio komponentų atsiskyrimą ir naudojamos sistemos tinkamumą buvo skaičiuojamos vaistinių preparatų ir analizuojamo mišinio sudedamųjų dalių Rf reikšmės. Rf yra pasiskirstymo koeficientas, kuris rodo santykį tarp tiriamo preparato poslinkio L1 ir tirpiklio poslinkio L2. Naudotos sistemos ir tiriamo mišinio sudedamųjų dalių Rf reikšmės nurodytos 4 lentelėje.
4 lentelė. Tiriamų medžiagų Rf reikšmės naudotose tirpiklių sistemose Naudota tirpiklių sistema Medžiagų Rf reikšmės
Diazepamas Omeprazolas Metamizolo natris Trichlormetanas : acetonas
4:1
0,842 0,289 0,315
Etilacetatas 0,730 0,12 0,09
Etilacetatas : etanolis: 25 %NH4OH 17:2:1
0,939 0,515 0,343
Etilacetatas : etanolis : 25 % NH4OH : benzenas
16: 3:1:4
0,818 0,250 0,011
Dauguma analizuotų tirpiklių sistemų netinka mišinio sudaryto iš diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio identifikavimui ir atskyrimui. Todėl remiantis literatūros šaltiniais buvo atrinktos tos sistemos, kurios yra bendros bent dviems mišinį sudarančioms medžiagoms. Pastarąsias modifikavus, pridėjus kitų tirpiklių gautos dvi sistemos, kurios labiausiai tiko šio mišinio atskyrimui. Tai yra šios sistemos :
1sistema - etilacetatas : etanolis: 25% NH4OH santykiu 17:2:1
2 sistema - etilacetatas : etanolis : 25% NH4OH : benzenas santykiu 16: 3:1:4 (Žr. 3, 4 pav.)
3 pav. 1 sistema 4 pav. 2 sistema
D – diazepamas O - omeprazolas A - metamizolo natris M – mišinys
Mišinio komponentai nurodytose sistemose atsiskiria. Penktoje lentelėje, nurodytos mišinyje buvusių atsiskyrusių medžiagų Rf reikšmės, panaudojus sistemas, kuriose buvo tiriami analizuojamų medžiagų standartiniai tirpalai.
5 lentelė. Mišinį sudarančių medžiagų Rf reikšmės tinkamose sistemose
Lentelėje nurodytos nustatytos tiriamojo mišinio medžiagų Rf reikšmės buvo palygintos su atskirų tirpalų Rf reikšmėmis ir pagal tai buvo padaryta išvada, kad mišinį sudarančios medžiagos yra tapačios standartinėms medžiagoms. Sistemos tinka pasirinktos mišinio sudėties analizei, nes atskirų mišinį sudarančių medžiagų Rf reikmšės tarpusavyje skiriasi, todėl jas galima lengvai atskirti, panaudojus anksčiau minėtas sistemas.
2.7. Diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinio atskyrimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Tai vienas populiariausių ir tiksliausių instrumentinės analizės metodų, kuris taikomas farmacijoje, toksikologijoje, analizuojant bei identifikuojant tiriamas medžiagas. Metodas naudojamas įvairios struktūros cheminiams junginiams bei jų mišiniams atskirti ir identifikuoti. Tyrimo metu buvo pagaminti etaloniniai omeprazolo, diazepamo ir metamizolo natrio tirpalai, kurių koncentracija 0,1 mg/ml, tirpiklis 96 % etanolis. Panaudojant tą patį tirpiklį pagamintas tiriamasis omeprazolo, metamizolo natrio ir diazepamo tirpalas. Metodui naudotų eliuentų sudėtis : acetonitrilas, 0,1 % trifluoracto rūgštis, fosfatinis buferis, kurio pH 7,4 bei išgrynintas vanduo.
Eksperimentai buvo atliekami efektyviosios skysčių chromatografijos chromatografu Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 (210-400 nm bangų diapazonas). Naudota kolonėlė - ACE 5 C18, kurios matmenys 250-4,6 mm, sorbento dalelių dydis 5 µm. Tiriamus mišinius ir atskirų medžiagų tirpalus analizavome naudojant dvi eliuentų sistemas.
Pirmoji sistema - 0,1% trifluoracto rūgštis ir acetonitrilas. Naudotas gradientinis eliuavimo rėžimas. Duomenys pateikti 6 lentelėje.
Sistema Mišinį sudarančių medžiagų Rf reikšmės
Diazepamas Omeprazolas Metamizolo natris Etilacetatas : etanolis: 25% amonio hidroksidas
santykiu 17:2:1
0,919 0,505 0,333
Etilacetatas : etanolis : 25% amonio hidroksidas : benzenas
santykiu 16: 3:1:4
0,806 0,272 0,011
6 lentelė.0,1% trifluoracto rūgšties ir acetonitrilo gradientinio eliuavimo rėžimas Laikas
minutėmis
Eliuento tėkmės greitis ml/min
0,1% Trifluoracto rūgštis %
Acetonitrilas %
0-3 1 95 5
25-28 1 10 90
29 1 95 5
Chromatografavimo sąlygos :
Eliuento tėkmės greitis 1 ml per minutę,
Injekcijos tūris 10 µl
Antroji sistema- fosfatinio buferio, kurio pH 7,4 ir acetonitrilas. Buferis buvo pagamintas tirpinant vandenyje 6 g Na2HPO4 *12H20; 0,193g KH2PO4; 8g NaCl. Gautas tirpalas buvo praskiedžiamas vandeniu iki 1 litro ir pH-metru išmatuojamas tirpalo pH, kuris turi būti 7,4. Ši reikšmė pasiekta pridėjus KH2PO4 druskos. Tyrimo metu buvo keičiama eliuento sudėtis ir santykis, naudotas gradientinis eliuavimo rėžimas. Duomenys nurodyti 7 lentelėje:
7 lentelė.Fosfatinio buferio ir acetonitrilo gradientinio eliuavimo rėžimas
Chromatografavimo sąlygos :
Eliuento tekėjimo greitis 1 ml per minutę
Injekcijos tūris 10 µl
2.8. Diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio mišinio komponentų identifikavimas UV -spektroskopijos metodu
Žinoma, kad UV – spektroskopijos metodas yra taikomas medžiagų identifikavimui cheminėje, farmacinėje analizėje. Literatūros šaltiniuose nurodyti atskirų medžiagų UV šviesos absorbcijos
Laikas minutėmis
Eliuento tėkmės greitis ml/min
Fosfatinis buferis
%
Acetonitrilas % Vanduo %
0-3 1 95 5 0
25 -27 1 40 60 0
27,1-30 1 0 0 100
31,00 1 95 5 0
maksimumai skirtinguose tirpikliuose. Tačiau kaip identifikuoti vaistinių medžiagų mišinio komponentus šiuo metodu duomenų nėra. Tiriamų medžiagų identifikavimui mišinyje buvo parinkti skirtingi tirpikliai:
1. 0,1 N NaOH 2. 0,1N HCl 3. 96% C2H5OH
Vaistinių medžiagų ir jų mišinio spektrai buvo užrašyti spektrometru „ HALO DB -20 UV-VIS DOUBLE BEAM SPECTROPHOTOMETER‘‘. Darbui panaudotos kvarcinio stiklo kiuvetės, kurių sluoksnio storis buvo 1 cm. UV šviesos bangos ilgio intervalas buvo nuo 190 iki 400 nm. Nustatytas UV šviesos absorbcijos maksimumas -1,2. Atskiri mišinio komponentai buvo ištirpinti anksčiau minėtuose tirpikliuose. Pradiniai medžiagų tirpalai buvo pagaminti 0,1mg/ml koncentracijos, o po to skiedžiami santykiu 1:5 arba 1:10 atitinkamu tirpikliu, taip kad absorbcijos maksimumas siektų iki 1,2 absorbcijos vienetų. Po to buvo pagamintas tirpalų mišinys atitinkamuose tirpikliuose ir užrašytas UV šviesos absorbcijos spektras.
2.9. Statistinė duomenų analizė
Statistinis gautų duomenų vertinimas atliktas apskaičiavus plonasluoksnės chromatografijos metodu nustatytų tirto mišinio komponentų Rf reikšmių vidutinį kvadratinį nuokrypį, vidurkį, pasikliautinąjį intervalą (pasikliovimo lygmuo 0,95), bei vidurkio vidutinę kvadratinę paklaidą.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo įvertinimui taip pat atlikta statistinė analizė, kurios metu apskaičiuotas nustatytų sulaikymo laiko reikšmių vidutinis kvadratinis nuokrypis, vidurkis, santykinės standartinės paklaidos. Duomenys buvo suvesti į kompiuterinę programą Microsoft Office Excel 2003 ir jos pagalba buvo apskaičiuotos minėtos skaitinės charakteristikos.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Plonasluoksnės chromatografijos analizės rezultatai
Dauguma tirtų tirpiklių sistemų netinka mišinio, sudaryto iš diazepamo, omeprazolo ir metamizolo natrio identifikavimui ir atskyrimui. Remiantis literatūros šaltiniais buvo atrinktos tos sistemos, kurios yra bendros bent dviems mišinį sudarančioms medžiagoms. Tačiau eksperimentai parodė, kad pastarosios sistemos naudojamos diazepamo ir metamizolo natrio atskyrimui mišinyje yra netinkamos, todėl panaudojant bendras plonasluoksnėje chromatografijoje naudojamas tirpiklių sistemas ir jas modifikavus, tai yra pakeitus ar pridėjus kitų tirpiklių buvo sukurtos dvi tirpiklių sistemos, kurios labiausiai tiko šio mišinio atskyrimui. Pirmoji sistema sudaryta iš etilacetato, etanolio, 25% amonio hidroksido sumaišytų santykiu 17:2:1. Atlikus analizę šioje tirpiklių sistemoje buvo apskaičiuotas mišinio tiriamosios medžiagos dėmės poslinkio ir tirpiklio poslinkio santykis – pasiskirstymo koeficientas sutrumpintai žymimas Rf. Diazepamo Rf =0,939, omeprazolo Rf =0,515, metamizolo natrio druskos Rf =0,343. Tirpiklių sistemos yra naujos, neminimos literatūros šaltiniuose ir tinkančios būtent šio mišinio sudėties medžiagų identifikavimui ir atskyrimui. Antroji sistema sudaryta iš etilacetato, etanolio, 25 % amonio hidroksido ir benzeno sumaišytų santykiu 16:3:1:4. Diazepamo Rf
= 0,818, omeprazolo Rf = 0,250, metamizolo natrio druskos Rf = 0,011. Sistema taip pat tinka visų trijų medžiagų atskyrimui ir identifikavimui.
3.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės rezultatai
Atlikus šį analizės metodą gavome atskirų analizuojamų medžiagų ir tiriamojo mišinio, sudaryto iš omeprazolo, metamizolo natrio ir diazepamo chromatogramas. Kaip jau buvo minėta tiriamųjų medžiagų tirpalai buvo analizuojami panaudojus dvi tirpiklių sistemas. Panaudojus pirmąją sistemą, sudarytą iš 0,1% trifluoracto rūgšties tirpalo ir acetonitrilo santykiu 90:10 ir 95:5 gavome tirto mišinio chromatogramą. Žr. 3 pav.
3 pav. Tirto mišinio chromatograma kaip eliuentą panaudojus 0,1 % trifluoracto rūgštį ir acetonitrilą
Iš chromatogramos matome, kad medžiagos vienos nuo kitų atsiskiria. Tačiau ši sistema netinka omeprazolo identifikavimui. Pastarasis šios tirpiklių sistemos poveikyje skyla, todėl pastaroji panaudota mišinio atskyrimui ir identifikavimui anksčiau nurodytomis sąlygomis yra netinkama. Pasinaudojant išanalizuotos literatūros duomenimis [38] buvo pasirinkta kita tirpiklių sistema, kurios sudėtyje yra KH2PO4 ar K2HPO4, o pH 7,4. Šios medžiagos panaudotos tiriant omeprazolo skilimo komponentus farmaciniuose produktuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Panaudojus antrąją tirpiklių sistemą kaip eliuentas buvo tirpiklių sistema - fosfatinis buferis acetonitrilas.Tai yra gradientinė tirpiklių sistema sudaryta iš 1 litro fosfatinio buferio, kurio sudėtis: 6 g Na2HPO4 *12H20; 0,193g KH2PO4; 8g NaCl,o pH 7,43 ir acetonitrilo. Gradientinio rėžimo duomenys : pirmas 3 min fosfatinio buferio ir acetonitrilo santykis procentais buvo 95:5, po to 24 minutes santykis buvo 40:60, nuo dvidešimt septintos iki trisdešimtos minutės sistemos sudėtis 100 % vanduo, o jau tridešimt pirmąją minutę santykis procentais tarp fosfatinio buferio ir acetonitrilo buvo 95:5. Iš pavaizduotos chromatogramos matyti, kad omeprazolo sulaikymo laikas panaudojus nurodytą tirpiklių sistemą yra 15,472 min. Žr. 4 pav.
4 pav. Omeprazolo chromatograma, panaudojus fosfatinio buferio ir acetonitrilo tirpiklių sistemą
Diazepamo standarto, kurio koncentracija 0,1 mg/ ml sulaikymo laikas,panaudojus tą pačią eliuentų sistemą yra 20,503 min. Žr. 5 pav.
5 pav.Diazepamo chromatograma, panaudojus fosfatinio buferio ir acetonitrilo tirpiklių sistemą Metamizolo natrio sulaikymo laikas esant toms pačioms chromatografavimo sąlygoms yra 11,501 min.
Žr. 6 pav.
6 pav. Metamizolo natrio chromatograma panaudojus fosfatinio buferio ir acetonitrilo tirpiklių sistemą
Taigi, bendra analizuojamo mišinio, sudaryto iš metamizolo natrio (analgino), diazepamo ir omeprazolo chromatogramoje matyti, kad medžiagos pilnai atsiskiria panaudojus tirpiklių sistemą sudarytą iš fosfatinio buferio ir acetonitrilo. Žr. 7 pav.
7 pav.Mišinio, sudaryto iš metamizolo natrio (analgino), diazepamo ir omeprazolo chromatograma, panaudojus fosfatinio buferio ir acetonitrilo tirpiklių sistemą
Pateiktoje chromatogramoje matyti, kad pirmasis iš analizuojamų medžiagų mišinio, atsiskyrė metamizolo natris, kurio sulaikymo laikas yra 11,557 min. Antrasis atsiskyrė omeprazolas, kurio sulaikymo laikas 14,474 min., o trečiasis diazepamas, kurio sulaikymo laikas yra 20,517 min.
Vykdant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą buvo užrašyti anlizuojamo mišinio medžiagų UV spektrai. Pagal gautus UV spektrus buvo identifikuotos tiriamos medžiagos. Grafike matome medžiagų mišinio spektrus gautus iš skysčių chromatografo. Žr. 8 pav.
8 pav. Metamizolo natrio, omeprazolo ir diazepamo UV spektrai
Tiriamų medžiagų UV- šviesos spektrų absorbcijos maksimumai atitinka literatūros duomenis.
Apibendrinant šį analizės metodą, galima teigti, kad pastaroji sistema tinkama šio mišinio atskyrimui
3.3 UV- spektroskopijos analizės rezultatai
Atlikus šį metodą buvo gauti atskiri vaistinių medžiagų etaloninių tirpalų ir tiriamojo mišinio UV šviesos absorbcijos spektrai skirtinguose tirpikliuose.Po to kai buvo užrašyti tiriamojo mišinio ir
standartinių tirpalų UV šviesos absorbcijos spektrai, nustatėme, kad diazepamas turi tris šviesos absorbcijos maksimumus, kai bangos ilgiai yra 240 nm, 283 nm ir 362 nm, kaip tirpiklį panaudojus 0,1N HCl. Tačiau kaip tirpiklį panaudojus 99,6 % etanolį, nustatytas vienas diazepamo absorbcijos maksimumas, kai bangos ilgis yra 312 nm. 0,1 N NaOH tirpale diazepamas turi 2 absorbcijos maksimumus, kai bangos ilgis yra 252 nm ir 310 nm. Metamizolo natriui etanolio tirpale būdingi du absorbcijos maksimumai kai bangos ilgiai 233 nm ir 268 nm . 0,1 N HCl tirpiklyje metamizolo natris taip pat turi du absorbcijos maksimumus, kai bangos ilgis yra 241 nm ir 257 nm. 0,1 N NaOH aplinkoje metamizolo natrio absorbcijos maksimumai nustatyti kai bangos ilgis 248 nm ir 311 nm. Omeprazolui etanolio tirpale būdingas vienas absorbcijos maksimumas kai bangos ilgis - 302 nm. Omeprazolo tirpalas 0,1N HCl ir 0,1 N NaOH turi sutampančius šviesos absorbcijos maksimumas esant bangos ilgiams 276 nm ir 304 nm. Europos farmakopėjoje [14] taip pat pažymėta, kad omeprazolo tapatybės nustatymui būdingas UV šviesos absorbcijos spektras kai bangos ilgiai – 276; 305 nm, kas praktiškai sutampa su mūsų gautais duomenimis. Taip pat prieš tai nagrinėtuose literatūros šaltiniuose [27,28,29]
teigiama, kad parūgštintame vandenyje metamizolo natrio šviesos absorbcijos maksimumas nustatytas esant bangos ilgiui 258 nm, o diazepamo naudojant tą patį tirpiklį šviesos absorbcijos maksimumai, kai bangos ilgiai 284 ir 366 nm, kas praktiškai sutampa su eksperimento metu gautais rezultatais. Vis dėlto naudoti skirtingi tirpikliai turėjo įtakos šviesos absorbcijos maksimumų padėčiai ypač identifikuojant diazepamą. Svarbu paminėti kad, identifikuoti visas tiriamas medžiagas mišinyje pagal gautą pastarojo UV šviesos absorbcijos spektrą nepavyko. Taip galėjo įvykti dėl to, kad tiriamojo mišinio komponentų smailės dengia viena kitą, nepriklausomai nuo to, kurį tirpiklį naudojome. Žemiau parodytas vaistinių medžiagų mišinio UV- šviesos absorbcijos spektras kaip tirpiklį panaudojus 96 % etanolį. Žr. 9 pav.
9pav. Mišinio spektras etanolio tirpale
UV šviesos absorbcijos maksimumai išryškėja kai bangos ilgis 203 nm ir 233 nm. Pagal gautus etaloninių tirpalų spektrus galima daryti išvadą, tai yra metamizolo natris, kurio šviesos absorbcijos šiame tirpiklyje buvo nustatytas kai bangos ilgis buvo 233 nm. Kitų medžiagų esančių mišinyje šiame tirpiklyje identifikuoti nepavyko. Todėl tiriamas mišinys buvo analizuojamos pasirinkus kitą tirpiklį. Tai yra 0,1 N HCl. Žr. 10 pav.
10 pav. Mišinio spektras 0,1N HCl tirpale
Pagrindinis UV šviesos absorbcijos maksimumas yra kai bangos ilgis - 242 nm. Pastarasis artimiausias prieš tai analizuotos medžiagos – metamizolo natrio spektrui 0,1 N HCl tirpale. Taigi, panaudojus kaip tirpiklį 0,1 N HCl rūgšties tirpalą medžiagų mišinyje galime nustatyti tik vieną iš trijų tiriamųjų medžiagų, todėl analogiška analizė buvo atlikta panadojus kitą tirpiklį. Tai yra 0,1 N NaOH tirpalą. Analizuojant mišinio tirpalą 0,1 N NaOH aplinkoje buvo stebimas vienas pagrindinis absorbcijos maksimumas. Žr. 11 pav.
11 pav. Mišinio spektras 0,1 N NaOH tirpiklyje
Mišinio šviesos absorbcijos maksimumas nustatytas, kai bangos ilgis yra 305 nm. Šis maksimumas būdingas omeprazolo standartiniam tirpalui, kai tirpiklis yra 0,1 N NaOH. Todėl darome išvadą, kad naudojant pastarąjį tirpiklį identifikuojamas omeprazolas, o kitos dvi medžiagos metamizolo natris ir omeprazolas mišinyje neidentifikuojamos, nes jų spektrai persidengia.
3.4. Statistinės analizės aptarimas
Eksperimentai buvo pakartoti tris kartus kiekvienai tinkančiai plonasluoksnės chromatografijos sistemai. 9 lentelėje nurodyti duomenys parodo, kad mišinio tyrimui taikytos sistemos yra tinkamos jo sudėtinių dalių (omeprazolo, diazepamo, metamizolo natrio) tapatybės nustatymui ir atskyrimui, nes nustatytos santykinės paklaidos neviršija leistinų ribų. Abi plonasluoksnės chromatografijos sistemos yra tinkamos minėto mišinio tyrimui. Žr. 9 lentelę.
