LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA
EGLö VERTINSKAITö
GYVŪNINöS KILMöS ŽALIUOSE MAISTO PRODUKTUOSE
APTINKAMŲ BAKTERIJŲ JAUTRUMO ANTIMIKROBINöMS
MEDŽIAGOMS TYRIMAI
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. M. Ružauskas
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas GYVŪNINöS KILMöS
ŽALIUOSE MAISTO PRODUKTUOSE APTINKAMŲ BAKTERIJŲ JAUTRUMO
ANTIMIKROBINöMS MEDŽIAGOMS TYRIMAI 1. yra atliktas mano pačios;
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO Darbas gali būti teikiamas gynimui.
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros ved÷joo vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
(gynimo komisijos sekretoriaus parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
TURINYS
Summary ...4
Įvadas...6
1. Literatūros apžvalga ...9
1.1. Antimikrobin÷s medžiagos ir antimikrobinis bakterijų atsparumas...9
1.1.1. Svarbiausios antimikrobin÷s medžiagos naudojamos žmon÷ms ir gyvūnams...9
1.2. Antimikrobinis bakterijų atsparumas ir jo vertinimo interpretacija...10
1.2.1. Klinikinis bakterijų atsparumas...10
1.2.2. Mikrobiologinis atsparumas...11
1.2.3. Įgimtas atsparumas...11
1.2.4. Įgytas atsparumas...11
1.3. Atsparių antibiotikams bakterijų keliama gr÷sm÷ žmon÷ms maisto grandin÷je...12
1.4. Patogeninių ir komensalinių atsparių antimikrobin÷ms medžiagoms bakterijų, randamų maisto produktuose epidemiologin÷ situacija...14
1.4.1. Patogenin÷s bakterijos...14
1.4.1.1. Salmonella enterica...14
1.4.1.2. Termofilin÷s kampilobakterijos...16
1.4.1.3. Vertoksigenin÷s Escherichia coli...16
1.4.1.4. MASA...17
1.4.2. Komensalin÷s bakterijos...18
1.4.2.1. Escherichia coli...18
1.4.2.2. Enterococcus spp...19
2. Tyrimo metodika ir organizavimas ...20
2.1. Tyrimų vieta ir objektai...20
2.2. Tiriamųjų bakterijų išskyrimas, identifikacija ir atranka tyrimams...21
2.3. Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimas...23
3. Rezultatai...27
3.1. Tiriamųjų bakterijų rūšių nustatymas parenchiminiuose organuose, realizuojamuose mažmenin÷je prekyboje ir šių bakterijų atranka tyrimams...27
3.2. Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimų rezultatai...27
3.2.1. Salmonella enterica jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms...27
3.2.2. Enterococcus spp. jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms...31
3.2.3. Escherichia coli jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms...34
4. Rezultatų aptarimas...39
SUMMARY EGLö VERTINSKAITö
MSc Thesis
“Investigations on antimicrobial susceptibility of bacteria spread in raw food products of animal origin“
Key words: antimicrobial susceptibility, resistance, food products, bacteria, contamination. Investigations were carried out in Lithuanian University of Health Sciences (formerly Lithuanian Veterinary Academy) and Veterinary Institute of Lithuanian Veterinary Academy during 2008-2010.
Mentor: Dr. Modestas Ružauskas
Lithuanian University of Health Sciences Kaunas, Lithuania 2010
The extent of the thesis – 50 pages. It contains 9 Tables and 12 Figures.
The aim of the study – to investigate bacterial contamination of raw food products (variety meat) realized in retail markets and to determine antimicrobial susceptibility of isolated bacteria.
Pathogenic bacteria (Salmonella enterica) as well as commensal species (Escherichia coli and Enterococcus spp.) were selected as representative bacterial species in this study. Separate raw products (mostly liver) of poultry, pigs and cattle were randomly collected all over the country at the retail level. Isolation was carried out using classical methods and appropriate nutrient media. Single isolates were tested for antimicrobial susceptibility using microdilution method with SENSITITRE (TREK Diagnostic Systems) plates. Results were interpreted according to clinical breakpoints approved by CLSI.
Three hundred and forty eight bacterial isolates from raw products were selected for antimicrobial testing. Enterococci were the most common isolated bacteria (92 %) in retail variety meat. E. faecium, E.faecalis and E. hirae/durans were the species among this genera of bacteria. Contamination by Escherichia coli was detected almost exlusively from poultry products with frequency of 69 %. Salmonella were isolated in rare cases. By this reason additional strains of S.enterica isolated from food products were collected at National Food and Veterinary Risk Assessment Institute and tested for antimicrobial susceptibility.
Results revealed resistance of tested bacteria to certain classes of antimicrobials, including critically and highly important for humans and animals. Half of the tested E. coli and 46.3 % of S. enterica strains of poultry origin demonstrated resistance to nalidixic acid; 52,2 % of all
tested enterococci from products of all animal species were resistant to erythromycin. Resistance of gram-negative bacteria to the third generation cephalosporins remains law – 2.5 % of salmonella and 3 % of E. coli isolates from poultry products were resistant to ceftiofur however, all strains demonstrated susceptibility to ceftriaxone.
Conclusions
1. Contamination of raw products by salmonella was detected only in products of poultry origin and reached 2.6 % from all tested samples.
2. Raw products of poultry origin are frequently contaminated by Escherichia coli (69 %). Products from poultry, pork and beef are very frequently contaminated by Enterococcus spp. with a total number of 92 %.
3. Salmonella enterica demonstrated susceptibility to most antimicrobials tested. Isolates from poultry origin demonstrated most frequent resistance to nalidixic acid (46.3 %), ampicillin (22.5 %) and tetracycline (15 %); isolates from pork – to ampicillin (45 %), sulphonamides (45 %), chloramphenicol (25 %) and nalidixic acid (20 %).
4. E. coli isolated from raw poultry products demonstrated most frequent resistance to ampicillin (57 %), nalidixic acid (50 %), tetracycline (45 %), sulphonamides (41 %) and streptomycin (32 %).
5. Enterococci isolated from poultry products demonstrated frequent resistance to tetracycline (84.5 %), tylosin (64.5 %), erythromycin (63.8 %) and ciprofloxacin (36.2 %); from pork products – to tetracycline (72.5 %), erythromycin (55 %), tylosin (35 %) and chloramphenicol (25 %); from beef products – to tetracycline (45 %), erythromycin (32.5 %), chloramphenicol (30.0 %) and ciprofloxacin (20 %).
6. Raw products from all tested animal species are contaminated by resistant bacteria. The most frequent multiresistance was observed among salmonella (35 %) isolated from pork products and E. coli isolated from poultry products (46 %). Frequent resistance to antimicrobials used both in human and veterinary medicine was also observed among enterococci.
ĮVADAS
Daugiau nei 60 metų trunkantis gausus antimikrobinių preparatų vartojimas medicinoje ir žem÷s ūkyje l÷m÷ tai, kad mikroorganizmai išvyst÷ nepaprastai efektyvius būdus gyventi antibiotikų apsupties sąlygomis. Sparčiai gaus÷janti informacija apie bakterijų genomų sekas ir genų struktūrą liudija apie didžiulį genetinį potencialą adaptacijai. Nuolat veikiamas ir keičiamas genų evoliucijos ir pernašos bei genetin÷s rekombinacijos, šis potencialas sąlygoja tam tikromis savyb÷mis pasižyminčių bakterijų atsiradimą ir įsitvirtinimą gamtoje bei šeimininkų organizme. Pastaraisiais dešimtmečiais d÷l gausios antibiotikų ir kitų antibakterinių preparatų pasiūlos ir intensyvaus, dažnai netikslaus, jų vartojimo klinikin÷je praktikoje bei žem÷s ūkyje, pasikeit÷ patogeninių bakterijų ekosistemos balansas. Sumaž÷jo jautrių padermių dalis, bet padid÷jo dalis padermių, atsparių įvairių grupių antibiotikams, dezinfekcin÷ms medžiagoms bei kitiems baktericidiniams ar bakteriostatiniams poveikiams. Antibiotikai teb÷ra viena didžiausių vaistų klasių, kurios pardavimai pasaulyje kasmet sudaro nuo 7 iki 22 milijardų JAV dolerių. Iš šios sumos 4-5 milijardai kasmet skiriami antibiotikams atsparių bakterijų sukeltoms infekcijoms gydyti. Antimikrobin÷ms medžiagoms atsparios bakterijos priskiriamos biologin÷s rizikos veiksniams, siejamos su did÷jančiu žmonių bei gyvūnų sergamumu ir mirtingumu. Tai neatsiejama visuomen÷s sveikatos dalis.
Antimikrobinių medžiagų naudojimas gyvulininkyst÷je, augalininkyst÷je, maisto ar pašarų gamybos pramon÷je neigiamai veikia visuomen÷s sveikatingumą, kurdamos antimikrobin÷ms medžiagoms atsparių bakterijų ar bakterin÷s kilm÷s atsparumą perduodančių genų rezervuarus. Šie gali būti tiesiogiai ar netiesiogiai perduodami žmogui. Tokie rezistentiškumo faktoriai nepaiso filogenetinių, geografinių ar ekologinių ribojimų. Tod÷l svarbūs ne tik bakterijų padermių atsparumo atsiradimo ir vystymosi mechanizmai bet ir jo plitimo keliai.
Pastaraisiais metais išskirtine problema tapo bakterijų, pasižyminčių daugiaatsparumu antibiotikams plitimas, kuris kelia ypatingą riziką žmonių sveikatai, nes tokie ligų suk÷l÷jai yra atsparūs įprastinei terapijai. Atsparumo determinant÷s kartu su mobiliais genetiniais elementais gali greitai plisti tarp sausumos gyvūnų, persiduoti nuo žuvų žmogui ar plisti buitin÷je aplinkoje – virtuv÷je.
Šio šimtmečio pradžioje buvo parengta „ES strategija prieš atsparumą antibiotikams“. Remdamasi šia strategija, ES patvirtino ir nuolat atnaujina rekomendacijas, kurios nurodo ES valstyb÷se rinkti duomenis apie antibiotikų suvartojimą, atsparių antibiotikams žmogui ir gyvūnams bakterijų plitimą. Molekulin÷s epidemiologijos moksliniai tyrimai, besiremiantys gausiomis žiniomis apie bakterijų genomų struktūrą bei atsparumo genetinių determinančių savybes ir pagrįsti molekulin÷mis technologijomis, pogenomin÷je eroje tapo neatsiejama bakterijų atsparumo
antibiotikams problemos sprendimo dalimi, nes atskleidžia atsparumo priežastis, plitimo būdus ir evoliuciją. Apie tyrimų svarbą liudija tai, kad ES nuo 1999 metų tyrimams kasmet skiria ~ 20 milijonų eurų.
Žem÷s ūkio industrijoje naudojami dideli antibiotikų kiekiai, ypatingai gyvulininkyst÷s sektoriuje. Pavyzdžiui, vien Jungtin÷je Karalyst÷je per 2007 metus sunaudota 387 tonos antibiotikų. Daugelis antibiotikų skirtų žmon÷ms gydyti naudojami taip pat ir gyvūnams gydyti. Naujos kartos cefalosporinai ir fluorochinolonai išrašomi gyvūnams gydyti, nors jie labai svarbūs ir žmon÷ms. Antimikrobinių medžiagų naudojimas gyvūnams gydyti, neabejotinai tur÷jo įtakos visuomen÷s sveikatai, ypatingai d÷l antibiotikams atsparių bakterijų. Tokios gyvūnuose paplitusios bakterijos žmon÷ms nors gali būti perduotos ir tiesioginio kontakto metu, tačiau vis d÷lto bene svarbiausią įtaką turi maisto grandin÷.
Maisto produktų užkr÷timas mikroorganizmais netinkamai juos laikant ar apdorojant akcentuojamas jau eilę metų, tačiau nepaisant to, infekcin÷s kilm÷s susirgimų skaičius tiek Lietuvoje tiek ir kitose išsivysčiusiose šalyse, iš esm÷s, nemaž÷ja. Tai rodo, jog bakterijos sugeba prisitaikyti prie aplinkos sąlygų, dezinfekcinių ir kitų medžiagų naudojamų maisto produktų apdirbimo technologijose. Kartu su šiomis bakterijomis plinta ir gali būti žmon÷ms perduoti atsparumo antibiotikams veiksniai, tokie kaip plazmid÷s ar integronai. Atliekant steb÷seną tiriami zoonozių suk÷l÷jai bei indikatorin÷s bakterijos – Salmonella enterica, Campylobacter spp., Escherichia coli, Enterococcus spp. Salmonella spp. ir Campylobacter spp. bakterijos yra klasikiniai per maistą plintančių zoonozių suk÷l÷jai. Tačiau maistu plintančias infekcines ligas taip pat gali sukelti antibiotikams atsparios E. coli bakterijos, meticilinui atsparūs stafilokokai, vankomicinui atsparūs enterokokai, kurie gali būti perduoti iš gyvūnų per virškinamąjį traktą arba tiesiogiai kontakto metu.
Pagrindinis zoonozių suk÷l÷jų ir per maistą plintančių infekcijų užsikr÷timo rezervuaras yra gyvūnų virškinamasis traktas, kai skerdžiant ir apdorojant skerdieną m÷sa yra užteršiama išmatomis. Nors atsparumo antibiotikams vystymasis yra susijęs su antimikrobinių medžiagų naudojimu žmon÷ms ir gyvūnams, tačiau atsparumo genus gali perduoti ir oportunistin÷s bakterijos (pvz., Pseudomonas, Klebsiella, Proteus ir tt.). Kol kas n÷ra daug mokslinių duomenų apie atsparumo plitimą tarp bakterijų esančių žarnyne. Geriausiai ištirta E. coli ir Enterococcus spp. geb÷jimas perduoti atsparumą koduojančius genetinius elementus kitoms bakterijoms. Atlikti bandymai su savanoriais patvirtino, kad laboratorin÷s pel÷s žarnyno E. coli K12 paderm÷ gali perduoti atsparumo genus žmogaus E. coli, o Enterococcus faecium paderm÷ išskirta iš viščiuko žarnyno gali perduoti vanA geną žmogaus žarnyne esančioms enterokokų paderm÷ms (Laster at al., 2006). Šie faktai ir daugyb÷ kitų eksperimentinių duomenų aptinkamų literatūros šaltiniuose rodo,
kitas bakterijas paplitusias gyvūnuose ir gyvūnin÷s kilm÷s misto produktuose atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms atžvilgiu. Tam reikalingi moksliniai tyrimai, nes įvairios higienos normos paprastai yra skirtos tik patogenin÷ms bakterijoms ar indikatorinių bakterijų skaičiaus nustatymui. Kai kurių duomenų, pavyzdžiui, kokios rūšies gyvūnų produkcija yra dažniausiai užteršta atspariomis bakterijomis yra nedaug arba toks palyginimas yra komplikuotas d÷l atskirų studijų skirtingose šalyse, kur antimikrobinių medžiagų naudojimo politika yra skirtinga.
2007-2009 metais Lietuvoje buvo vykdytas prioritetinių mokslo krypčių projektas „Lietuvoje paplitusių patogeniškų bakterijų atsparumas antibiotikams: molekulin÷ epidemiologija ir plitimo prevencija“ (LIETANTIBAKTAS), kurio pagrindiniai tikslai buvo susiję su žmon÷se ir gyvūnuose paplitusių patogeninių bakterijų atsparumo antibiotikais tyrimais, molekuline epidemiologija ir kontrol÷s priemonių paieška. Projekto metu atskiru punktu buvo numatyta ištirti bakterijų paplitimą ir gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktuose (subproduktuose), atkreipiant d÷mesį į bakterijų atsparumo antibiotikams pobūdį ir dažnį. Būtent, subproduktų tyrimai ir buvo šio magistrinio darbo pagrindas. Subproduktai kaip maisto produktų kategorija (dažniausiai kepenys) pasirinkti tod÷l, kad juos patogu surinkti kaip atskirų gyvūnų pavyzdžius, jie yra pakankamai populiarus produktas vartotojų tarpe, tai apibr÷žto dydžio ir nebrangus produktas. Subproduktai skerdimo metu dažnai gali būti kontaminuoti įvairiomis bakterijomis, tod÷l laikyta, jog jie gali būti vienas iš svarbesnių potencialios rizikos produktų. Darbo tikslas ir uždaviniai suplanuoti taip, kad gautieji rezultatai papildytų vykdomo projekto tematiką. Tod÷l atliktas darbas buvo integracinio pobūdžio, bet tuo pačiu apimantis ir atskirą maisto saugos tematiką.
Šio darbo tikslas – ištirti Lietuvoje realizuojamų gyvūnin÷s kilm÷s žalių maisto subproduktų užterštumą atspariomis antimikrobin÷ms medžiagoms bakterijų paderm÷mis.
Darbo uždaviniai:
1. Surinkti ir išanalizuoti esamus literatūros duomenis apie atsparių antimikrobin÷ms medžiagoms bakterijų paplitimo gyvūnuose ir gyvūniniuose maisto produktuose situaciją ir problematiką.
2. Laboratoriškai ištirti gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktų, realizuojamų mažmenin÷je prekyboje, užterštumą patogenin÷mis (Salmonella enterica) ir sąlyginai patogenin÷mis (E. coli, Enterococcus spp.) bakterijomis.
3. Nustatyti išskirtų padermių jautrumą antimikrobin÷ms medžiagoms.
4. Palyginti atskirų gyvūnin÷s kilm÷s maisto žaliavų (paukštiena, jautiena, kiauliena) užterštumą atspariomis antimikrobin÷ms medžiagoms bakterijomis.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Antimikrobin÷s medžiagos ir antimikrobinis bakterijų atsparumas
1.1.1. Svarbiausios antimikrobin÷s medžiagos naudojamos žmon÷ms ir gyvūnams
Antimikrobin÷s medžiagos – tai gana plati cheminių ir biologinių medžiagų grup÷, slopinanti įvairių mikroorganizmų, tokių kaip bakterijos ir virusai, grybai ar mikroskopiniai parazitai gyvybinę veiklą arba juos žudo. Bakteriologijos srityje kalbant apie antimikrobines medžiagas dažniausiai omenyje turima antibiotikai ir sintetin÷s medžiagos, kurių poveikis identiškas antibiotikų veikimo mechanizmams. Šios medžiagos pagal savo struktūros giminingumą skirtomos į klases, o klas÷s savo ruožtu pagal svarbą žmon÷ms ir gyvūnams yra skirstomos į kritiškai svarbias, labai svarbias ir svarbias (WHO, 2007; OIE, 2007). Dauguma antibiotikų klasių naudojamų gyvūnams gydyti yra naudojamos ir žmon÷ms gydyti. 1 lentel÷je pateiktos žmon÷ms kritiškai svarbių antimikrobinių medžiagų klas÷s, bei nurodyta kokie šių medžiagų klasių antibiotikai ir kitos medžiagos naudojamos veterinarin÷je medicinoje.
1 lentel÷. Žmon÷ms kritiškai svarbios antimikrobin÷s medžiagos (pagal PSO)
Antibiotikų klas÷ Pavyzdžiai naudojami žmonių medicinoje Pavyzdžiai naudojami veterinarijoje Aminoglikozidai Amikacinas, gentamicinas, streptomicinas, tobramicinas, neomicinas Amikacinas, gentamicinas, streptomicinas, neomicinas, dihidrostreptomicinas
Ansamicinai Rifabutinas, rifamtinas Rifampicinas
Karbepenemai (ir kt. penemai) Imipenemas, meropenemas Leistinų n÷ra
III kartos cefalosporinai Cefotaksimas, ceftriaksonas Ceftiofuras, cefovecinas IV kartos cefalosporinai Cefipimas, cefpiromas Cefkvinomas
Lipopeptidai Daptomicinas Leistinų n÷ra
Glikopeptidai Vankomicinas, teikoplaninas Avoparcinas
Makrolidai Azitromicinas,
klaritromicinas, eritromicinas, spiramicinas
Eritromicinas, spiramicinas, oleandomicinas, tilozinas
Oksazolidinonai Linezolidas Leistinų n÷ra
Aminopenicilinai ampicilinas/sulbaktamas, amoksicilinas/klavulanatas,
ampicilinas/sulbaktamas, amoksicilinas/klavulanatas Penicilinai Penicilinas G, penicilinas V Penicilinas G, penicilinas V
Chinolonai
Nalidikso rūgštis, pipemido rūgštis, ciprofloksacinas, norfloksacinas, ofloksacinas
Nalidikso rūgštis, pipemido rūgštis., enrofloksacinas, marbofloksacinas
Streptograminai Kvinupristinas/dalfopristinas, pristinamicinas
Virginiamicinas
Iš labai svarbių žmon÷ms antimikrobinių medžiagų klasių pamin÷tini tetraciklinai, amfenikoliai, sulfonamidai ir trimetorimas, kurie taip pat labai plačiai naudojami ir gyvūnams gydyti ar profilaktiškai.
1.2. Antimikrobinis bakterijų atsparumas ir jo vertinimo interpretacija
Antimikrobinio bakterijų atsparumo sąvokos ir supratimas apie šį procesą reikalingas geriau suprasti tai, kokiu būdu vystosi ir plinta bakterijų atsparumas ir kokie tyrimai tur÷tų būti atliekami, siekiant labiau pažinti šį reiškinį.
Antimikrobinis bakterijų atsparumas yra tiriamas ir apibr÷žiamas pagal tam tikrus taikomuosius ar teorinius fundamentinius reiškinius ir pagal tai skirstomas į įvairias kategorijas. Literatūroje dažniausiai aprašomas klinikinis bakterijų atsparumas, tačiau taip pat išskiriamas ir mikrobiologinis, įgytas ar įgimtas atsparumas.
1.2.1. Klinikinis bakterijų atsparumas
Klinikinis bakterijų atsparumas suprantamas kaip nustatytomis gydymui skirtomis doz÷mis naudojamo antibiotiko poveikis ligos eigai ir baigčiai apibr÷žti. Klinikinis atsparumas n÷ra vienkomponentis, išreiškiamas tik antibiotiko poveikiu bakterijoms in vitro; jis priklauso ir nuo farmakokinetinių ir kitų parametrų organizme (EFSA, 2008). Visgi, klinikiniam atsparumui įvertinti naudojamas rodiklis – mažiausia slopinanti antibiotiko koncentracija (MSK), kuri parodo koks mažiausias antibiotiko kiekis slopina bakterijų dauginimąsi in vitro. Nustačius mažiausią slopinančią antibiotiko koncentraciją, rezultatas įvertinamas konkrečiam antibiotikui ir konkrečiam suk÷l÷jui, naudojant visuotinai pripažintus rodiklius – klinikinius lūžio taškus. Klinikinius lūžio taškus nustato Laboratorinių ir klinikinių standartų institutas (CLSI, JAV), o Europoje – ir neseniai šiuos rodiklius aprobavęs Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų
komitetas (EUCAST) (CLSI, 2009; EUCAST, 2010; Kahlmeter et al., 2006). Klinikinis atsparumas siejamas su ypatingai praktiniu požiūriu svarbiu rodikliu t.y. susijęs su klinikine praktika, gydant žmones ir gyvūnus. To d÷l klinikinis atsparumas yra dažniausiai aprašytas tiek mokslin÷s, tiek klinikin÷s praktikos ir kito pobūdžio literatūros šaltiniuose.
1.2.2. Mikrobiologinis atsparumas
Mikrobiologiniu atsparumu vadinamas atskirų bakterijų padermių geb÷jimas toleruoti didelių koncentracijų antibiotikus, lyginant su įprastin÷mis tos rūšies bakterijų paderm÷mis, kurios paprastai tiems antibiotikams yra jautrios (Acar, Röstel, 2003). Tokios atsparios paderm÷s yra įgavę atsparumą antimikrobin÷ms medžiagoms per genų perdavimą arba mutacijų metu. Mikrobiologiniam atsprumui nustatyti yra ištiriama tiriamosios paderm÷s MSK ir ji lyginama su taip vadinamų „laukinių“ t.y. įprastai jautrių tos rūšies bakterijų MSK reikšm÷mis. Atsparia šiuo atveju laikoma tokia paderm÷, kuriai reikalinga didesn÷ MSK nei nustatyta laukinių padermių jautrumo riba. Šios jautrumo ribos yra vadinamos epidemiologin÷mis ribin÷mis reikšm÷mis. Kadangi šios reikšm÷s yra nustatomos atskiroms bakterijų rūšims, jos nekinta priklausomai nuo šalies, regiono bei standarto (Kahlmeter et al., 2003). Mikrobiologinis atsparumas tiriamas siekiant nustatyti ar apibr÷žtoje teritorijoje vystosi bakterijų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms. Mikrobiologinį atsparumą rekomenduojamas tirti monitoringo būdu, vienu metu tiriant bakterijų jautrumą skirtingose šalyse, d÷l lengvai interpretuojamų rezultatų ir aiškios vienodos metodikos (EFSA, 2008).
1.2.3. Įgimtas atsparumas
Įgimtas atsparumas yra įgimta bakterijų rūšies savyb÷ pasireiškianti atsparumu atskirų klasių antimikrobin÷ms medžiagoms. Įgimtas atsparumas gali būti įvairaus pobūdžio, pavyzdžiui tuomet, kai bakterijoje visai n÷ra taikinio, į kurį nukreipta antimikrobin÷ medžiaga. Tokios bakterijos iš esm÷s n÷ra tiriamos jautrumo atžvilgiu atitinkamoms antimikrobin÷ms medžiagoms, o išreiškiant jų atsparumą, rekomenduojama vartoti terminą „nejautrios“, vietoje termino „atsparios“ (EFSA, 2008).
1.2.4. Įgytas atsparumas
bakterijų padermių. Tokie genai gali koduoti fermentus, kurie modifikuoja antimikrobinių medžiagų cheminę struktūrą. paversdami juos neaktyviais (penicilinaz÷s, cefalosporinaz÷s) ir daugelis kitų. Šie genai paprastai yra nesunkiai perduodami vienų bakterijų kitoms. Perdavimo mechanizmai susiję su konjugacija ir kitais žinomais atsparumo perdavimo veiksniais. Bakterijose yra mobilūs elementai, turintys genetinę informaciją, tokie kaip plazmid÷s ar transpozonai, kurie išsivyst÷ evoliucijos eigoje ir lengvai atlieka savo vaidmenį saugant bakterijas nuo joms nepalankių veiksnių (Gold, Moelleering, 1996).
Be aukščiau aprašytų bakterijų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms kategorijų, literatūroje dar aprašomas bakterijų kryžminis atsparumas (atsparumas tų pačių antibiotikų klasių atstovams) ir bakterijų koatsparumas (atsparumo ryšys tarp skirtingų antibiotikų klasių) (Aarestrup, 2006). Taip pat galima dažnai aptikti terminą bakterijų daugiaatsparumas. Šiuo atveju turima omenyje bakterijų paderm÷s atsparumas keletui antimikrobinių medžiagų, tačiau aiškaus daugiaatsparumo apibr÷žimo kol kas matomai neegzistuoja, o skirtingi autoriai pakankamai nevienodai interpretuoja šį reiškinį, vieni skaičiuodami antimikrobinių medžiagų kiekį, (nepriklausomai nuo klas÷s) kuriam nustatytos atsparios bakterijų paderm÷s, o kiti – antimikrobinių medžiagų klasių kiekį (EFSA, 2008).
1.3. Atsparių antibiotikams bakterijų keliama gr÷sm÷ žmon÷ms maisto
grandin÷je
Gr÷sm÷ žmon÷ms užsikr÷sti atspariomis antimikobin÷ms medžiagoms bakterijomis gali būti tiesiogin÷, kuomet atsparios bakterijos, galinčios kolonizuotis žmogaus organizme ar jį infekuoti patenka tiesiogiai per virškinamąjį (rečiau kv÷pavimo takus) traktą arba netiesiogin÷, kuomet komensalin÷s ar kitos bakterijos patekę į organizmą perduoda žmogaus mikrobiotai atsparumo veiksnius (EFSA, 2008). Atsparumo veiksniai pagal mechanizmą skirstomi į fermentinę inaktyvaciją/degradaciją (pvz. penicilinaz÷ suardo peniciliną), membranų pralaidumo sumaž÷jimą, taip pat efliuksą (išmetimą) ir kitus (Randall et al., 2007).
Daugelis šiuolaikinių maisto gamybos technologijų padeda sumažinti bakterijų kiekį produkcijoje, tame tarpe ir atsparių. Tačiau maistui vartojami maisto produktai labai skiriasi savo apdorojimo lygiu ir būdu. Tyrimais įrodyta, jog kai kurios maisto ruošimo technologijos, tokios kaip apdorojimas radiacija, pulsiniu elektriniu lauku ar sl÷giu gali įtakoti bakterijų membranų pralaidumą, tokiu būdu, tokios alternatyvios maisto apdorojimo technologijos gali įtakoti lengvesnį bakterijų atsparumo determinančių plitimą tarp bakterijų (Rodrigo et al., 2007; McMahon et al., 2007). Kai kurie produktai iš pradžių visai neapdorojami, tik atšaldomi, o v÷liau jie apdorojami namuose. Namų sąlygomis produktai apdorojami be aiškiai aprašytų
technologijų ar procesų, labai skirtingai. Dažniausiai apdorojama patikimu mikroorganizmų naikinimo būdu – karščiu. Tačiau iki šio apdorojimo, produktai pereina tam tikrus technologinius etapus, pavyzdžiui, yra smulkinami. Pjaustymo lentel÷s yra plačiai aprašytas pavyzdys, ant kurių gali likti žalios m÷sos produkcijos dalių, kartu su bakterijomis, tame tarpe ir atspariomis (Rayner et all., 2004; Cruse, Sorum, 1994; Walsh et al., 2008; Bunevičien÷ et al, 2010). Kryžmin÷ maisto produktų kontaminacija antibiotikams atspariomis bakterijomis paprastai vyksta netinkamai laikantis higienos, sanitarijos ir maisto ruošimo technologijos. Pavyzdžiui, yra pakankamai gerai žinoma jog žalios salotos neretai yra užteršiamos kampilobakterijomis po to, kai jos supjaustomos ant pjaustymo lentel÷s ant kurios prieš tai buvo pjaustoma žalia vištiena (Kusumaningrum et al., 2004; Mylius et al., 2007. Taip pat aprašyti ir kiti kryžmin÷s kontaminacijos patogeniškomis bakterijomis būdai, susiję su virtuv÷s rankšluosčiais, šaldytuvų ar stalų paviršiais (EFSA, 2008, Kruse, Sorum, 1994). Aišku, jog tokiu būdu gali plisti ir kitos atsparios antibiotikams bakterijos. Toks plitimas kur kas sunkiau pastebimas, nes, pavyzdžiui, komensalin÷s bakterijos patekę į žmogaus organizmą nesukelia jokių susirgimo simptomų.
Ypač didelį susirūpinimą kelia daugiaatsparios bakterijos, tokios kaip, kad Salmonella enterica Typhimurium DT 104 arba atsparios naujausios kartos antibiotikams, kaip, kad pavyzdžiui 3 ir 4 kartos cefalosporinams bakterijos (Doorduyn et al., 2006; Varma et al., 2006; Greco et al., 2009).
Tam, kad nustatyti galimą maisto užteršimą atspariomis bakterijomis ir įvertinti keliamą riziką, dažnai yra akcentuojama kokių grupių bakterijos tur÷tų būti tiriamos, atliekant bakterijų jautrumo tyrimus. Paprastai literatūroje yra išskiriamos 3 pagrindin÷s grup÷s, kurios iš esm÷s skiriasi savo patogeniškumu. Pirmąjai grupei priklauso virulentiškos žmogui bakterijos ir zoonozių suk÷l÷jai, tokie, kaip Salmonella enterica ir Campylobacter jejuni. Šios bakterijos kelia didžiausią tiesioginę gr÷smę, kadangi būdamos patogeniškos, dažnai sukelia ligas, kurios reikalauja antimikrobinio gydymo. Jei jos yra atsparios antibiotikams, problema gali būti ypač didel÷, sukelianti net žmonių mirtį (Butaye et al., 2006). Antrąjai grupei priklauso komensalin÷s bakterijos, tokios kaip, kad enterokokų genties bakterijos, kurių pakankamai dideli kiekiai gali patekti su maistu ir kurios organizme gali paskleisti atsparumo veiksnius ir juos perduoti žmogaus mikrobiotai ar patogenin÷ms bakterijoms (EFSA, 2008). Nors literatūroje dažniausiai aprašomi atvejai apie atliktus tokio galimo perdavimo eksperimentus in vitro, tačiau yra įrodymų, jog komensalinių bakterijų atsparumo veiksniai gali būti perduoti ir in vivo (Lester et al., 2006). Komensalin÷s bakterijos tyrimų antimikrobin÷ms medžiagoms plotm÷je dažnai įvardijamos kaip indikatorin÷s bakterijos, rodančios bendrą maistu užterštumą antibiotikais atspariomis bakterijomis. Pagal šių bakterijų atsparumą skirtingiems antibiotikams ir atsparumo
lygį, dažnai galima numanyti apie antibiotikų naudojimo intensyvumą skirtinguose gyvulininkyst÷s regionuose ar objektuose (Bywater, 2004; Ružauskas ir kt., 2008).
Trečiąjai grupei priskiriamos taip vadinamos pramonin÷s bakterijos, kurios naudojamos kaip probiotikai ar atlieka fermentacijos vaidmenį maisto gamybos technologijose. Tokios bakterijos, kurias žmogus gali gauti su maistu turi būti ištirtos d÷l galimų genetinio atsparumo veiksnių (EFSA, 2007, FAO/WHO, 2001).
1.4. Patogeninių ir komensalinių atsparių antimikrobin÷ms medžiagoms
bakterijų, randamų maisto produktuose epidemiologin÷ situacija
1.4.1. Patogenin÷s bakterijos
Maisto produktuose ar žaliavose gali būti aptinkamos įvairios patogenin÷s bakterijos. Vienos iš jų gali būti patogeniškos tik žmon÷ms arba gyvūnams, o kitos – ir gyvūnams ir žmon÷ms arba tik žmon÷ms. Didžiausia svarba yra teikiama toms bakterijų rūšims, kurios yra pavojingos žmon÷ms. Iš jų bene labiausiai aprašytos yra Salmonella enterica ir bent dvi termofilinių kampilobakterijų rūšys (C. jejuni ir C. coli), kurios kelia didžiausią riziką žmon÷ms apsikr÷sti per paukštienos produktus (Jorgensen F. et al., 2002). Taip pat dažnai minimas S. aureus, kuris gali būti ne tik apsinuodijimo maistu priežastimi, bet ir pavojingas tuo, jog gali būti atsparus visiems beta-laktaminiams antibiotikams, kuris paprastai įvardijamas kaip meticilinui atsparus S. aureus (MASA). Kai kurios patogeninių ešerichijų grup÷s (verotoksigenin÷ E. coli) taip pat yra vienas iš žinomiausių per maisto produktus plintančių žmonių patogenų.
1.4.1.1. Salmonella enterica
Salmonel÷s pagal pavojingumą žmon÷ms (ligos patogenezę ir sunkumą) ir serologinę priklausomybę išskiriamos į netifines salmoneles ir tifą (vidurių šiltinę) sukeliančias salmoneles. Mūsų šalyje paplitę netifiniai salmonelių serotipai. Žem÷s ūkio paskirties (maistui naudojami) gyvūnuose dažniausiai Lietuvoje buvo aptinkami šie salmonelių serotipai: S. Choleraesuis, S. Derby, S. Agona, pas kiaules, S. Enteritidis pas naminius paukščius, S. Dublin pas galvijus, nors serotipų įvairov÷ svyruoja priklausomai nuo periodo (kas keli metai gali būti aptinkami skirtingi vyraujantys serotipai). Iš maisto produktų dažniausiai būdavo išskiriamos S. Derby, S. Agona, S. Enteritidis bei S. Typhimurium (Ružauskas et al., 2005; Ružauskas et al., 2006).
Nors salmonelioze susirgusius žmones teoriškai nerekomenduojama gydyti antibiotikais, jei ligos eiga n÷ra sunki, tačiau praktikoje, visgi, d÷l šių suk÷l÷jų hospitalizuotiems žmon÷ms gydymas antibiotikais dažniausiai taikomas (EFSA, 2008). Tod÷l salmonel÷s, būdamos patogeniškomis bakterijomis nuolat susidūrę su naujo šeimininko organizmu, dažnai iššaukia ligą, tod÷l dažnai joms tenka tur÷ti kontaktą su antibiotikais. Literatūroje dažniausiai minima, jog salmonelių bei kitų bakterijų genčių atsparumui antibiotikams didžiulę įtaką turi ir antibiotikų naudojimas veterinarijoje (Zhao et al., 2007; Gilchrist, 2007). Atsparių salmonelių, išskirtų iš produkcijos gyvūnų, kuriomis buvo užfiksuoti ir žmonių susirgimai salmonelioze buvo fiksuojami praeito amžiaus pabaigoje. Maždaug nuo 1984 iki 1986 metų buvo aprašomi pavieniai žmonių užsikr÷timo atvejai ampicilinui ir tetraciklinui atspariomis salmonel÷mis, o kiek v÷liau pasirod÷ gausios publikacijos apie daugiaatsparių salmonelių pasirodymą, kuriomis užsikr÷sdavo žmon÷s per gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktus (EFSA, 2008). Kai kurie autoriai nurodo, jog salmonelių atsparumas skirtingų klasių antimikrobin÷ms medžiagoms priklauso nuo jų serotipo. Dažniausiai daugiaatsparių salmonelių nustatoma S. Typhimurium, S. Wirchow, S. Derby, S. Newport ir S. Hadar tarpe (Threlfall et al., 2003; Varma et al., 2006). Tuo tarpu nurodoma, jog kiti serotipai, kaip kad pavyzdžiui S. Enteritidis retai būna daugiaatsparūs, nors ir šio serotipo salmonelių atsparumas nalidikso rūgščiai ir ciprofloksacinui ES šalyse nuo 2000 metų did÷ja (Meakins et al., 2008). Literatūroje pakankamai daug d÷mesio skirta daugiaatsparioms S. Typhimurium DT104 fagotipo salmonel÷ms. Jos, kaip taisykl÷ yra atsparios bent 5 grupių (ampicilinas, chloramfenikolis/florfenikolis, streptomicinas/spektinomicinas, sulfonamidai ir tetraciklinai) antimikrobin÷ms medžiagoms. Šio fagotipo salmonel÷s tik pastaraisiais metais buvo nustatytos ir Lietuvoje (Povilonis at al., 2010). Prapl÷sto spektro beta laktamaz÷ms salmonelių atsparumas taip pat paskutiniaisiais metais plačiai prad÷tas aprašyti. Tokios salmonel÷s buvo išskirtos tiek iš žmonių, tiek iš gyvūnų (Bertrand et al., 2006; Greco et al., 2009). Lietuvoje salmonelių, išskirtų iš maisto produktų jautrumo antibiotikams situacija iki šiol aiški nebuvo. Netgi Europos maisto saugos tarnybos ataskaitoje už 2004-2008 metus, Lietuva žem÷lapiuose žymima kaip šalis, nepateikusi duomenų (EFSA, 2010-2). 1995 metais yra publikuoti duomenys apie salmonelių, išskirtų iš gyvūnų ir maisto produktų atsparumą antimikrobin÷ms medžiagoms, tačiau juose n÷ra atskirtų iš gyvūnų ir maisto produktų išskirtų salmonelių atsparumo duomenų. Publikuoti duomenys rodo, jog tuo metu išskirtos salmonel÷s dažniausiai atsparios buvo chinolonams (34 proc.), tetraciklinui (33 proc.), streptomicinui (30 proc.) ir ampicilinui (18 proc.). Tačiau didžiausią atsparių šių padermių kiekį sudar÷ S. Choleraesuis serotipo salmonel÷s, tuo metu labiausiai buvę paplitusios kiaul÷se (Ružauskas et al., 2005).
1.4.1.2.Termofilin÷s kampilobakterijos
Paskutiniaisiais metais maisto sukeltų infekcijų tarpe, Europos Sąjungos šalyse kampilobakterijos užima pirmąją vietą pagal nustatytus dažniausius žmonių susirgimus. Europos maisto saugos agentūros duomenimis, kampilobakteriozių atvejai ES siek÷ 40,7 atvejus/100 000 gyventojų. Panašius duomenis pateikia ir Ligų kontrol÷s bei prevencijos centras iš JAV, kur susirgimų dažnis šia liga siekia 13 atvejų/100 tūkstančių gyventojų (EFSA, 2010-1). Dažniausiai žmon÷s užsikrečia per termiškai neapdorotus paukštienos produktus, o ligos suk÷l÷jas yra C. jejuni rūšies kampilobakterijos (Habib et al., 2009). Nors kampilobakterioz÷ normalią imuninę sistemą turintiems žmon÷ms dažnai n÷ra labai pavojinga liga, tačiau kaip ir salmonelioz÷s atvejais, į ligonines paguldyti pacientai dažniausiai sulaukia antimikrobinio gydymo. Šis gydymas gali tapti komplikuotas, kai ligą sukelia antibiotikams atsparios kampilobakterijos, nes jų sukeltų ligų gydymui antibiotikų pasirinkimas n÷ra platus. Atsparių kampilobakterijų sukelti susirgimai susiję su ilgesne žmonių gydymo trukme (Engberg et al., 2004). Visgi, analizuojant kampilobakterijų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms duomenis, aišku, jog šios genties bakterijos dažniau yra atsparios tik tam tikroms antibiotikų klas÷ms, būtent – chinolonams ir tetraciklinams (Bardon et al., 2009; Cokal et al., 2009; Luangtongkum et al., 2006). Atsparumas aminoglokozidams ir amfenikoliams nustatomas retai, dažniausiai tik pavieniais atvejais, nors kai kuriose šalyse, pavyzdžiui Ispanijoje 2000 metais buvo aprašyta, jog net 12 proc. tirtų C. jejuni buvo atsparios gentamicinui (EFSA, 2010-2; Saenz et al., 2000).
Lietuvoje yra aprašyta, jog kampilobakterijos labai dažnai išskiriamos iš naminių paukščių, nors publikuotų mokslinių straipsnių apie jų atsparumą Lietuvoje iki šio laikotarpio rasti nepavyko (Kudirkien÷ et al., 2010). Europos maisto saugos tarnybos ataskaitoje apie 2008 metais atliktus kampilobakterijų atsparumo duomenis, kuriuos atsiunt÷ net 23 šalys, Lietuva šiame šalių sąraše nefigūruoja (EFSA, 2010-2).
1.4.1.3. Vertoksigenin÷s Escherichia coli
Verotoksigenin÷s E. coli (VTEC) atskirai kaip ešerichijų grup÷ buvo išskirta po to, kai 1982 metais Jungtin÷se Valstijose kilo apsinuodijimų banga, vartotojams valgiusiems jautienos produktus (Riley et al., 1983). Iš šios grup÷s dažniausiai aprašomos ir laikoma, kad turi didžiausią reikšmę žmonių sveikatai E. coli O157:H7 serotipo ešerichijos. Šios bakterijos sukelia hemoraginį storųjų žarnų uždegimą ir hemolizinį-ureminį sindromą (Mead, Griffin, 1998). Kasmet šių suk÷l÷jų susirgimų skaičius n÷ra vienodas, bet pavyzdžiui, Jungtinių Valstijų Ligų kontrol÷s ir prevencijos centro duomenimis, jie sukeldavo apie 73 400 susirgimų ir 60 mirčių atvejų kasmet (Mead et al., 1999). VTEC rezervuaras dažniausiai yra galvijai, tačiau atsparios šių bakterijų paderm÷s gali kolonizuoti ir žmonių žarnyną, kas vyksta per maisto grandinę. Senesn÷se publikacijose teigiama,
kad O157 serotipo E. coli dažnai pasižymi padid÷jusiu atsparumu antibiotikams (Aarestrup, Wagner, 1999; White, 2002), tačiau v÷lesn÷se publikacijose kai kurie autoriai nurodo, jog antimikrobinis VTEC atsparumas n÷ra didelis (Walsh et al., 2006). Nevienodai situacija aprašoma ir tarp šalių. Pavyzdžiui, Klein, Bülte (2003) Vokietijoje nenustat÷ daugiaatsparių VTEC, o tuo tarpu toje pačioje šalyje kiti autoriai nustat÷, jog daugiau nei 50 proc. iš kiaulių išskirtų VTEC izoliatų ir 25 proc. iš galvijų išskirtų izoliatų buvo daugiaatsparūs (von Müffling et al., 2007). Nevienodi duomenys rodo, jog netgi toje pačioje šalyje vienu tyrimu pasikliauti negalima, jau nekalbant apie tai, kad tokie tyrimai tur÷tų būti atliekami visose šalyse ir regionuose.
1.4.1.4. MASA
Meticilinui atsparios Staphylococcus aureus kaip ir jautrios šios rūšies stafilokokų paderm÷s paprastai kolonizuojasi ant odos ir žmonių nosiarykl÷je. paprastai jos n÷ra pavojingos, bet kartais sukelia pooperacinių žaizdų ar kitas komplikacijas žmon÷ms (EFSA, 2008). MASA problema atsirado maždaug prieš pora dešimtmečių. jei anksčiau tai buvo dažniausiai nozokomialin÷s (hospitalin÷s) infekcijos suk÷l÷jas, tai pastaruoju metu atsirado net nauji terminai, vartojami apibūdinti tai, kokios kilm÷s MASA infekcija buvo vienu ar kitu atveju. Taip yra tod÷l, kad MASA prad÷jo plisti ir visuomen÷je (ne tik ligonin÷se) (visuomen÷je įgyta MASA infekcija), taip pat paskutiniuoju metu vis dažniau šios rūšies bakterijos išskiriamos ir iš įvairių rūšių gyvūnų (galvijų, kiaulių, vištų, arklių bei gyvūnų-kompanjonų). MASA plinta atskirais klonais, iš kurių vieni yra siejami su gyvūnais (pavyzdžiui ST 398 paplitę tarp kiaulių ir kitų naminių gyvūnų kai kuriose ES šalyse), o neseniai nustatyta, jog gyvūnai taip pat užsikrečia ir tomis paderm÷mis, kurios yra priskiriamos hospitalinių infekcijų suk÷l÷jams (Catry B. at al., 2010). MASA sukeltos infekcijos pastaruoju metu vis dažniau nustatomos gyvulių prižiūr÷tojams, veterinarams t.y. tiems žmon÷ms, kurie turi tiesioginį kontaktą su gyvūnais, nešiojančiais MASA. Tokiu būdu įsitikinta, kad MASA yra zoonotinis suk÷l÷jas, kuris plinta tiek iš gyvūnų žmon÷ms, tiek ir atvirkščiai. MASA, ypač ST398 klono paplitimas atskirose šalyse labai skiriasi. Labiausiai jis išplitęs Vokietijoje, Nyderlanduose, taip pat neseniai rastas ir Belgijoje. Šiose šalyse atskirų gyvūnų rūšių užsikr÷timas gali svyruoti nuo 12 proc. (kiaul÷s) iki 31 proc. (kalakutai) (EFSA, 2008). Nustatyta, kad MASA gali plisti ir maisto grandin÷je, o dažniausiai aprašomi atvejai, jog šis plitimas dažniausiai vyksta per pieną ir jo produktus. Piene nustatomi paprastai kiti klonai, nei paplitę visuomen÷je ar ST 398 (Kwon et al., 2006).
1.4.2. Komensalin÷s bakterijos
1.4.2.1. Escherichia coli
Komensalin÷s E. coli esančios žmonių ir gyvūnų žarnyne po gyvulių skerdimo kontaminuoja gyvūnin÷s kilm÷s maisto produkciją, kaip, kad ir daržoves bei vandenį ir gali tur÷ti savyje perduodamus atparumą antibiotikams koduojančius genus (Sunde, Norström, 2006). Tokio perdavimo pavyzdžių mokslin÷je literatūroje aprašyta nemažai. Pavyzdžiui, nustatyta, jog ešerichijų atsparumas apramicinui, kuris buvo naudojamas vien gyvuliams, buvo nustatyta įvairių rūšių enterobakterijose, išskirtose iš žmonių ir aplinkos (EFSA, 2008; Hunter et al., 1994). Maža to, yra duomenų ir apie tai, kad iš gyvūnų žmon÷ms patekę komensalin÷s E. coli bent laikinai, gali būti aptinkamos žmogaus organizme (EFSA, 2008).
Infekcijos, sukeltos daugiaatsparių gramneigiamų bakterijų kelia didelę gr÷smę įvairiose pasaulio šalyse, tame tarpe ir Europoje. Patogeniškos gramneigiamos bakterijos kaip atsparumo genų iš komensalinių E. coli recipientai sukelia ne tik rimtas infekcijas, susijusias su virškinimo, kv÷pavimo ir šlapimo sistemomis, bet ir sunkiai yra gydomos, jei jos sukeltos atsparių padermių(Livermore et al., 2007). Kadangi tai pačiai E. coli rūšiai priklauso ir patogenin÷s bakterijos, joms rūšies viduje, be abejo, dar lengviau įgauti atsparumo veiksnius iš komensalinių E. coli. Jei patogeninių bakterijų sukeltos ligos yra gydomos, paprastai iki gyvūno pasveikimo (tuo pačiu ir patogeniškų bakterijų sunaikinimo) tai komensalai išlieka gyvybingi virškinamąjame trakte ir, be abejo, turi kontaktą (dažnai subterapin÷mis doz÷mis) su įvairiais antibiotikais. Toks kontaktas su antibiotikais veda į atsparumo did÷jimą ir aprašoma, jog žarnyne esančios E. coli ir yra didžiausias daugiaatsparumo genų rezervuaras (Osterblad et al., 2000).
Fenotipinis komensalinių E. coli atsparumas antimikrobin÷ms medžiagos yra tirtas įvairiuose atskirų mokslininkų ir jų grupių darbuose (Bywater et al., 2004), o taip pat ir atliekant tarpvalstybiniu monitoringinius tyrimus, kuriuos inicijuoja įvairios atsakingos organizacijos, pavyzdžiui Europos maisto saugos agentūra. Atskirų šalių pateikiami duomenys ne visuomet gali būti lyginami tarpusavyje, nes neretai naudojamo nevienodos metodikos, interpretacin÷s reikšm÷s (EFSA, 2008). Galima manyti, kad šiuo atveju rezultatai gali būti nepatikimi ir d÷l to, jog tyrimus atlieka ir duomenis kartais teikia ne nepriklausomos institucijos, bet laboratorijos, susijusios su valstybin÷mis atsakingomis institucijomis. Tačiau apie tai, pavyzdžiui Europos maisto saugos tarnyba savo ataskaitose duomenų nepateikia. Nepaisant to, iš daugelio šalių pateikiamų duomenų galima susidaryti pakankamai aiškią nuomonę, apie Europoje paplitusių komensalinių E. coli, išskirtų iš gyvūnų ar gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktų atsparumą atskiroms antimikrobin÷ms medžiagoms. Dažniausiai nustatomas šių bakterijų atsparumas ampicilinui, tetraciklinams, streptomicinui ir trimetoprimui. Kai kuriose šalyse santykinai dažnas atsparumas nustatomas
fluorochinolonams (iš paukščių išskirtos E. coli). Tuo tarpu, komensalinių E. coli atsparumas 3 ar 4 kartos cefalosporinams dar n÷ra dažnas. Visgi, yra pranešimų, jog Nyderlanduose ir Kanadoje buvo užfiksuotas dažnas atsparumas šios klas÷s antibiotikams tų E. coli, kurios buvo išskirtos iš paukštienos produktų (EFSA, 2008). Analizuojant literatūros duomenis, apie Lietuvoje išskirtų iš maisto produktų E. coli atsparumą antibiotikams, duomenų rasti nepavyko, tačiau yra aprašytas komensalinių E. coli, išskirtų iš sveikų žem÷s ūkio paskirties gyvūnų atsparumas antibiotikams (Ružauskas ir kt., 2007). Šio tyrimo metu nustatyta, jog komensalin÷s E. coli dažniausiai atsparios buvo cefalotinui (18,5 proc.), ampicilinui (14,8 proc.) ir tetraciklinui, chloramfenikoliui bei nalidikso rūgščiai (po 11,1 proc.).
1.4.2.2. Enterococcus spp.
Enterokokai yra labai plačiai paplitę, nes yra natūralūs komensalai, aptinkami žmonių ir gyvūnų žarnyne. Jie aptinkami ir žaliuose maisto produktuose, kurie yra kontaminuojami gyvulių skerdimo ar technologinio proceso metu. Šios bakterijos taip pat yra naudojamos kaip parūgštinantys terpę mikroorganizmai gaminant fermentuotus maisto produktus, bei kaip probiotin÷s bakterijos.
Enterokokai yra nejautrūs (t.y. turi įgimtą atsparumą) cefalosporinams, nedidel÷ms aminoglikozidų koncentracijoms, klindamicinui, o taip pat nedidel÷ms fluorochinolonų bei sulfametoksazolio-trimetoprimo koncentracijoms (EFSA, 2008). Kai kuriems antibiotikams, tokiems kaip tetraciklinai ar chloramfenikolis, enterokokai taip pat dažnai turi atsparumo genetinius elementus. Visgi literatūroje daugiausiai d÷mesio skiriama enterokokų atsparumui glikopeptidiniams antibiotikams, ypač vankomicinui. Taip yra tod÷l, kad vankomicinui atsparūs enterokokai greitai išplito ir yra aptinkami tiek klinikiniuose medžiagos pavyzdžiuose, tiek ir maisto produktuose (Bates, 1997).
Duomenų apie tai, ar enterokokai, paplitę gyvūnuose gali apsigyventi ir žmonių organizme yra nedaug ir iki šiol šis klausimas lieka atviras (EFSA, 2008). Genetiniai tyrimai rodo, jog tarp iš žmonių išskiriamų ir iš kiaulių, galvijų bei naminių paukščių išskirtų enterokokų egzistuoja tam tikri bendrieji bruožai (Bruinsma et al., 2002). Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, kad in vivo atsparumą koduojantis vanA genas iš vištos išskirto izoliato buvo perduotas žmon÷se esantiems enterokokams (Lester et al., 2006). Tai rodo, jog žmonių saugai yra potencialiai pavojingi žali maisto produktai, kurie yra užteršti komensaliniais enterokokais. Enterokokų paderm÷s, naudojamos maisto produktams gaminti, kaip probiotin÷s bakterijos taip pat gali būti kaip atsparių antibiotikams genų rezervuaras, tačiau naujausi reikalavimai nurodo, jog šiuo metu naudojamos gamybin÷s enterokokų paderm÷s, skirtos maisto produkcijai, neturi tur÷ti perduodamų genetinių
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimų vieta ir objektai
Tyrimai atlikti skirtingose apskrityse, skirtinguose respublikos rajonuose, siekiant apimti platesnę geografinę vietovę, kurioje realizuojami gyvūniniai produktai mažmenin÷je prekyboje. Medžiagos rinkimui pasirinktos prekybos vietos, kuriose daugiausiai realizuojama produkcijos – specializuotos m÷sos prekybos vietos turgaviet÷se ir didieji prekybos centrai. Renkant m÷ginius turgaviet÷se, buvo stengiamasi juos surinkti kiek galima iš platesnio gamintojų rato, nes dažnai įvairiose prekybos vietose realizuojama tų pačių gamintojų produkcija, nepriklausomai nuo regiono. Pasirinktos skirtingos mažmenin÷s prekybos vietos, kurios ap÷m÷ tiek turgaviet÷se, tiek ir didžiuosiuose prekybos centruose realizuojamus maisto produktus. Tyrimams pasirinkta žalios paukštienos, kiaulienos ir galvijienos, kaip trijų tradicinių šalies gyvulininkyst÷s šakų produkcija. Kaip tyrimo pavyzdžiai buvo pasirinkti žali subproduktai – kepenys (90 proc. visų m÷ginių), ir inkstai (10 procentų m÷ginių). Kepenys ir inkstai yra parenchiminiai organai, pro kuriuos nuolat cirkuliuoja kraujas, tod÷l, iš esm÷s, šiuose produktuose gali būti sukaupta daugelis bakterijų rūšių, cirkuliuojančių gyvūno viduje. Taip pat, ant parenchiminių organų bakterijos gali patekti ir iš aplinkos apdorojant produkciją, o taip pat ir esant pardav÷jo kontaktui, tiesiogiai parduodant produktą pirk÷jui.
M÷giniai surinkti iš anksto neįsp÷jus pardav÷jų ir gamintojų, juos perkant mažmenin÷s prekybos vietose. Iš kiekvienos prekybos vietos, buvo paimta po vieną m÷ginį iš vieno gamintojo vienos partijos. Iš vištų ir kalakutų buvo imamos visos kepenys, iš kiaulių ir galvijų – dalis kepenų arba visas inkstas. M÷giniai surinkti iš pardav÷jų, deklaravusių kad parduoda nacionalinių gamintojų produkciją (iš anksto buvo nustatyta, kad didžioji dalis atitinkamose prekybos vietose realizuojamos produkcijos yra nacionalinių gamintojų).
Surinkti m÷giniai buvo dedami į šaldytuvą ir v÷liau (paros laikotarpyje) arba iš karto, pristatomi į laboratoriją (didžioji dalis tyrimų atlikta LVA Veterinarijos instituto Mikrobiologijos ir maisto saugos laboratorijoje). Iš anksto buvo pasirinktos tiriamosios bakterijų rūšys, kurias sudar÷ Salmonella enterica, kaip patogenin÷s bakterijos, Escherichia coli ir Enterococcus genties bakterijų rūšys, kaip komensalin÷s ar sąlyginai patogenin÷s bakterijos.
Kadangi tyrimų eigoje buvo nustatyta, jog salmonel÷s gyvūnin÷s kilm÷s produktuose aptinkamos tik retais atvejais, dalis salmonelių padermių, išskirtų iš tiriamųjų gyvulių rūšių (galvijai, kiaul÷s ir naminiai paukščiai) maisto produktų, bendradarbiavimo pagrindais, buvo gautos
iš Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto tam, kad gauti didesnę salmonelių imtį.
2.2. Tiriamųjų bakterijų išskyrimas, identifikacija ir atranka tyrimams
Laboratorijoje tiriamoji medžiaga buvo išd÷liota atskirai, prieš tai išpakavus atskirai surinktus organus ir steriliu vatos tampon÷liu išvedžiota tiek išorin÷, tiek ir vidin÷ (įpjovus atskiru arba kaskart dezinfekuotu skalpeliu) organo dalis. Tampon÷lis buvo resuspenduotas mažame sterilaus fiziologinio tirpalo kiekyje (1 ml) ir tuo pačiu tampon÷liu atlikti s÷jimai į atitinkamas kiekvienai rūšiai terpes.
Ešerichijoms išskirti atlikti s÷jimai į Endo Agar (Oxoid, Jungtin÷ Karalyst÷) ir McConkey Agar (Oxoid) standžias terpes. Enterokokams išskirti naudotos taip pat standžios terp÷s – Slanetz-Bartley Agar (Liofilchem, Italija) ir Aesculine Agar (Biolife, Italija).
Kadangi salmonelių aptikimas m÷sos produktuose yra sud÷tingesnis tuo aspektu, kad medžiagoje neretai jų gali būti santykinai mažas kiekis, o pašalinių, greitai augančių bakterijų (pvz. Proteus spp.) dažnai būna žymiai daugiau, naudojome priešpagausinimo terpę (Buffered Peptone Water, LabM, Jungtin÷ Karalyst÷), selektyvią gausinimo terpę Rappaport-Vassiliadis Broth (Oxoid, Jungtin÷ Karalyst÷) bei selektyvias standžias terpes – SS Agar (Oxoid), XLD Agar (Oxoid) ir chromogeninę Colorex (Biolife) terpę (1 pav.).
Visos bakterijos buvo kultivuotos atitinkamose temperatūrose, kuriose geriausiai išreiškiamas jų augimas, kurios nurodomos standartuose (salmonel÷s), o jei jų nebuvo – auginta +35 ºC temperatūroje.
Bakterijų identifikacija atlikta klasikiniais metodais, nustatant biochemines jų savybes (1-3 lentel÷s), o sud÷tingesniais atvejais – naudojant identifikacijos sistemas „Microbact” (Oxoid), greitąją bakterijų identifikacijos sistemą (Remel, JAV) arba „Enteropluri Test“ (Liofilchem, Italija). Naudojant identifikacines sistemas rezultatai interpretuoti naudojant kompiuterines programas Microbact 2000 ir Electronics RapID Compendium.
1 lentel÷. Tirtų E. coli biochemin÷s savyb÷s jas identifikuojant
Testo pavadinimas Reakcija
Oksidaz÷s gamyba Katalaz÷s gamyba
Sieros vandenilio gamyba Nitratų redukcija
Lizino dekarboksilaz÷s gamyba Gliukoz÷s skaidymas
Manitolio skaidymas Laktoz÷s skaidymas Indolio gamyba Ureaz÷s gamyba
Metilo raudonojo testas Voges-Proskauerio testas ONPG testas Citratų skaidymas Sorbitolio skaidymas Inozito skaidymas Sacharoz÷s skaidymas - + - + v + + + + - + - + - v - v
+ – reakcija teigiama ne mažiau nei 90 % atvejų - – reakcija neigiama ne mažiau nei 90 % atvejų v – varijuojanti reakcija
2. lentel÷. Salmonelių biochemin÷s savyb÷s
Cheminis substratas Reakcija
Lizino dekarboksilaz÷ +
Ornitino dekarboksilaz÷ +
Sieros vandenilio (H2S) susidarymas +
d-Gliukoz÷s skaldymas + d-Manitolio skaldymas + d-Ksiloz÷s skaldymas + ONPG [−] Indolio susidarymas − Ur÷ja −
Voges Proskauer reakcija −
Citrato skaldymas + Želatinos hidroliz÷ − Malonato skaldymas [−] Inozito skaldymas d d-Sorbitolio skaldymas + L-Ramnoz÷s skaldymas [+] Sacharoz÷s skaldymas − Laktoz÷s skaldymas - L-Arabinoz÷s skaldymas + Judrumas +
+ – 90 % padermių teigiama reakcija; − – 90 % padermių neigiama reakcija; [−] – 11-25 % padermių teigiama reakcija; d – 11-89 % padermių teigiama reakcija;
3 lentel÷. Pagrindin÷s skirtingų enterokokų rūšių biochemin÷s savyb÷s
Testas ar
savyb÷ Enterokokų rūšis
faecalis faecium hirae durans avium casseliflavus flavescens L-arabinoz÷ Manitolis Riboz÷ Ramnoz÷ Sorbitolis Sacharoz÷ Geltonas pigmentas - + + v + + - + + + - - + - - - + - - + - - - + - - d - + + + + + (+) - + + + (+) d + + + + - + - + +
+ - teigiama reakcija,- - neigiama reakcija, (+) 75-89 % padermių reaguoja teigiamai, v – 26-74 % padermių reaguoja teigiamai, d – galimos variacijos.
Tolimesniems tyrimams paimtos ir ats÷tos tos bakterijų kolonijos, kurios prieš tai buvo išaugintos iš vienos tipiškos kolonijos ir kurių rūšys buvo patvirtintos biocheminiais testais.
1 pav. Tipiškos salmonelių kolonijos ant XLD agaro
2.3. Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimas
Tyrimai atlikti mikroatskiedimų metodu, naudojant SENSITITRE (TREK Diagnostic Systems) plastikines plokšteles, su skirtingomis antibiotikų koncentracijomis. Enterobakterijoms ir enterokokams naudotos plokštel÷s su atitinkamoms bakterijoms skirtais antimikrobinių medžiagų rinkiniais. Suspensijos tankiui matuoti naudoti Remel (JAV) kompanijos bakterijų suspensijos tankio standartai (McFarlando vienetais) ir elektroninis
pagaminimui (naudota 0,5 McFarlando vieneto tankio suspensija) naudotas demineralizuotas vanduo ir Mueller Hinton sultinys (to paties gamintojo, kaip ir plokštel÷s su antimikrobin÷mis medžiagomis). Suspensijai į plokšteles lašinti naudotos daugiakanal÷s automatin÷s pipet÷s (Finnpipette, Suomija).
Tyrimų rezultatai vertinti pagal tai, kokia koncentracija slopina (neslopina) bakterijų augimą (2 pav.). Minimalia slopinančia koncentracija buvo laikoma tokia mažiausia antimikrobin÷s medžiagos koncentracija, kurioje bakterijų paderm÷ neaugo.
2 pav. SENSITITRE plokštel÷ su antibiotikais ir matomomis MSK
Nors tyrimai buvo atlikti kiekybiškai, nustatant kokia kiekvienos antimikrobin÷ms medžiagos koncentracija slopina atskirų bakterijų padermių dauginimąsi, tačiau aiškesnei rezultatų interpretacijai užtikrinti, rezultatai buvo įvertinti kokybiškai. Vertinant kokybiškai, vertinta pagal klinikinių lūžio taškų reikšmes. Klinikinių lūžio taškų reikšm÷s buvo pasirinktos pagal galiojančius CLSI (Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas) nurodymus. Rezultatai interpretuoti šiuo būdu: jautri paderm÷; vidutiniškai jautri paderm÷ ir atspari paderm÷. Vertintos tik tos antimikrobin÷s medžiagos esančios plokštel÷se, kurios yra naudojamos kliniškai gydyti atitinkamos kilm÷s infekcijas. Atsižvelgiant į tai, kad tiriamieji produktai buvo parduodami žmonių maistui, išskirtų padermių jautrumo vertinimo interpretacija buvo pagal klinikinį efektyvumą žmon÷ms, juolab, kad CLSI standartas, pagal kurį vertintas klinikinis atsparumas numato klinikinį atsparumą žmon÷ms, bet ne atskiroms gyvūnų rūšims. Tik tuo atveju, jei plokštel÷se esančios antimikrobin÷s medžiagos yra skirtos tik gyvūnams gydyti, rezultatai interpretuoti pagal klinikinį jautrumą gyvūnams.
Vertinant enterokokų jautrumą, vertinimas buvo atliktas atsižvelgiant ir į enterokokų rūšį, nes skirtingoms enterokokų rūšims kai kurių antimikrobinių medžiagų atžvilgiu vertinimo reikšm÷s skiriasi d÷l nevienodo rūšinio atsparumo.
4-6 lentel÷se pateiktos reikšm÷s atskiroms bakterijų rūšims, pagal kurias buvo interpretuoti gauti rezultatai.
4 lentel÷. Tirtų medžiagų koncentracijų ribos ir E. coli jautrumo interpretacijai naudotos reikšm÷s
Antimikrobin÷ Tirtų Klinikinis lūžio taškas
medžiaga koncentracijų spektras, mg/L J V A Ampicilinas 0,25 - 32 ≤8 16 ≥32 Ciprofloksacinas 0,008 - 4 ≤1 2 ≥4 Nalidikso rūgštis 0,5 - 128 ≤16 ─ ≥32 Gentamicinas 0,25 - 64 ≤4 8 ≥16 Ceftiofuras 0,12 - 16 ≤2 4 ≥8 Streptomicinas 2 - 256 ─ ─ ≥64 Tetraciklinas 0,5 - 64 ≤4 8 ≥16 Kanamicinas 2 - 64 ≤16 32 ≥64 Sulfisoksazolis 16 - 2048 ≤256 ─ ≥512 Chloramfenikolis 1 - 128 ≤8 16 ≥32 Amikacinas 0,5 - 32 ≤16 32 ≥64 Amoksi/Klav. 1/0,5 - 32/16 ≤8/4 16/8 ≥32/16 Ceftriaksonas 0,25 - 64 ≤8 16-32 ≥64 Trimeto/Sulfa 0,12/238 - 4/76 ≤2/38 ─ ≥4/76 Cefoksitinas 0,5 - 32 ≤8 16 ≥32
5 lentel÷. Tirtų medžiagų koncentracijų ribos ir Salmonella enterica jautrumo interpretacijai naudotos reikšm÷s
Antimikrobin÷ Tirtų Klinikinis lūžio taškas
medžiaga koncentracijų spektras, mg/L J V A Ampicilinas 0,25 - 32 ≤8 16 ≥32 Ciprofloksacinas 0,008 - 4 ≤1 2 ≥4 Nalidikso rūgštis 0,5 - 128 ≤16 ─ ≥32 Ceftiofuras 0,12 - 16 ≤2 4 ≥8 Tetraciklinas 0,5 - 64 ≤4 8 ≥16 Sulfisoksazolis 16 - 2048 ≤256 ─ ≥512 Chloramfenikolis 1 - 128 ≤8 16 ≥32 Amoksi/Klav. 1/0,5 - 32/16 ≤8/4 16/8 ≥32/16 Ceftriaksonas 0,25 - 64 ≤8 16-32 ≥64 Trimeto/Sulfa 0,12/238 - 4/76 ≤2/38 ─ ≥4/76
6 lentel÷. Tirtų medžiagų koncentracijų ribos ir enterokokų jautrumo interpretacijai naudotos reikšm÷s
Antimikrobin÷ Tirtų Klinikinis lūžio taškas
medžiaga koncentracijų spektras, mg/L J V A Tigeciklinas 0,015 - 0,5 ≤0,25 0,5 ≥1 Chloramfenikolis 2-32 ≤8 16 ≥32 Eritromicinas 0,5 - 8 ≤0,5 1 - 4 ≥8 Penicilinas 0,5 - 16 ≤8 ─ ≥16 Tetraciklinas 4 - 32 ≤4 8 ≥16 Vankomicinas 0,5 - 32 ≤4 8 - 16 ≥32
Tilozino tartratas 0,25 - 32 (U) ≤8 16 ≥32
Ciprofloksacinas 0,12 - 4 ≤1 2 ≥4
Linezolidas 0,5 - 8 ≤2 4 ≥8
Nitrofurantoinas 2 - 64 ≤32 64 ≥128
Vertinant kiekybinio bakterijų atsparumo reikšmes, kadangi buvo naudotos komercin÷s sistemos, su ribotomis antimikrobinių medžiagų koncentracijomis, buvo gauti ir ribiniai duomenys su reikšm÷mis > arba <. Tod÷l lentel÷se, kuriose nurodyti bakterijų kiekybiniai duomenys atitinkamoms koncentracijoms, nustačius mažesnę koncentraciją nei plokštel÷se esančių medžiagų koncentracijų reikšm÷s, paderm÷s atsparumą priskyr÷me viena skiedimo pakopa mažesnei reikšmei ir atvirkščiai – gavus didesnę koncentraciją nei yra plokštel÷se antimikrobinių medžiagų koncentracijos, padermę traktavome kaip viena skiedimo pakopa didesnio atsparumo. Pavyzdžiui, jei nustatyta, kad E. coli paderm÷s MSK chloramfenikoliui yra >128 mg/L, tai lentel÷je ši paderm÷ buvo priskirta 256 mg/L koncentracijai.
Bakterijų daugiaatsparumas yra susijęs su konkrečiomis problemomis parenkant vaistus gydymui. Daugiaatsparumu pasižyminčiomis laikytos tos bakterijų paderm÷s, kurios, vertinant klinikinį atsparumą, buvo atsparios ne mažiau kaip trims skirtingų antibiotikų klasių antimikrobin÷ms medžiagoms, naudojamoms gydymui.
3. REZULTATAI
3.1. Tiriamųjų bakterijų rūšių nustatymas parenchiminiuose organuose,
realizuojamuose mažmenin÷je prekyboje ir šių bakterijų atranka tyrimams
Darbo metu ištirtos 348 bakterijų paderm÷s, išskirtos iš maisto produktų. Tyrimais nustatyta, kad žmonių mitybai skirti žali gyvūnin÷s kilm÷s produktai (subproduktai) dažniausiai buvo užteršti enterokokais (92 proc.). Nustatyta, jog išskirtos enterokokų paderm÷s priklaus÷ E. faecalis, E. faecium ir E. harae/durans rūšims, kurių santykis genties viduje buvo maždaug vienodas. Ešerichijomis užteršti m÷giniai nustatyti beveik išskirtinai tik paukštienos produktuose, kurių užterštumas siek÷ 69 proc. Iš kiaulių ir galvijų parenchiminių organų išskirtos tik pavien÷s ešerichijų paderm÷s. Salmonel÷s išskirtos tik pavieniais atvejais ir tik iš paukštienos produktų (4 atvejai iš maždaug 150 produktų), tačiau projekto metu, surinktos visos galimos Lietuvoje išskirtos salmonel÷s iš maisto produktų (paderm÷s gautos iš NMVRVI). Viso buvo surinkta 104 salmonelių paderm÷s: 80 padermių iš paukštienos produktų, 20 – iš kiaulienos produktų ir 4 paderm÷s iš galvijų produktų. Antimikrobinio jautrumo tyrimams buvo atrinktos tik tos produktų ir tiriamųjų bakterijų kategorijos, kurių imtis buvo pakankama, t.y. tirtas salmonelių išskirtų iš kiaulienos ir paukštienos produktų, ešerichijų – iš paukštienos, o enterokokų – iš kiaulienos, jautienos ir paukštienos produktų jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms.
3.2. Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimų
rezultatai
3.2.1. Salmonella enterica jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms
3-4 pav. pateikti Salmonella enterica padermių, išskirtų iš paukštienos ir kiaulienos produktų jautrumo duomenys.
77,5 91,2 88,7 97,5 51,3 100 100 98,7 85 97,5 2,5 1,3 22,5 8,8 11,3 2,5 46,3 15 2,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AMP SXT FIS TIO NAL CIP AUG AXO TET CHL A N T IB IO T IK A I % Jautrios Vidutiniškai jautrios Atsparios
AMP-ampicilinas, SXT- trimetoprimas/sulfametoksazolis, FIS-sulfisoksazolis, TIO-ceftiofuras, NAL-nalidikso rūgštis, CIP-ciprofloksacinas, AUG- amoksicilinas/klavulano rūgštis, AXO- ceftriaksonas, TET-tetraciklinas, CHL-chloramfenikolis
3 pav. Iš paukštienos produktų išskirtų S. enterica jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms, % (n=80).
Iš paukštienos išskirtos salmonel÷s (3 pav.) pasižym÷jo dažnu atsparumu nalidikso rūgščiai (46,3 proc.). Maždaug dvigubai mažiau izoliatų buvo atsparūs ampicilinui (22,5 proc.). Atsparumas tetraciklinui (15,0 proc.), sulfisoksazoliui (11,3 proc.) ir trimetoprimui/sulfametoksazoliui (8,8 proc.) buvo dar mažesnis. Salmonelių, atsparių ceftiofurui ir chloramfenikoliui kiekis buvo mažas (po 2,5 proc.), o ceftriaksonui salmonel÷s pasižym÷jo tik vidutiniu jautrumu (1,3 proc.). Amoksicilino/klavulano rūgščiai ir ciprofloksacinui visos tirtos salmonel÷s buvo jautrios.
55,0 85,0 55,0 100 80,0 100 80,0 100 85,0 75,0 20,0 45,0 15,0 45,0 20,0 15,0 25,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 AMP SXT FIS TIO NAL CIP AUG AXO TET CHL A N T IB IO T IK A I % Jautrios Vidutiniškai jautrios Atsparios
AMP-ampicilinas, SXT- trimetoprimas/sulfametoksazolis, FIS-sulfisoksazolis, TIO-ceftiofuras, NAL-nalidikso rūgštis, CIP-ciprofloksacinas, AUG- amoksicilinas/klavulano rūgštis, AXO- ceftriaksonas, TET-tetraciklinas, CHL-chloramfenikolis
4 pav. Iš kiaulienos produktų išskirtų S. enterica jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms, % (n=20).
Iš kiaulienos produktų išskirtos salmonel÷s (4 pav.) pasižym÷jo dažniausiu klinikiniu atsparumu ampicilinui ir sulfisoksazoliui (45,0 proc.). Ketvirtadalis tirtų padermių buvo atsparios chloramfenikoliui (25,0 proc.), o 20,0 proc. – nalidikso rūgščiai. Nustatytas vienodas skaičius padermių atsparių tetraciklinui (15,0 proc.) ir trimetoprimui/sulfametoksazoliui (15,0 proc.). Amoksicilino-klavulano rūgšties kombinacijai nustatyta 20,0 proc. vidutinį jautrumą turinčių salmonelių. Kitiems trims antibiotikams: ceftiofurui, ciprofloksacinui ir ceftriaksonui visos salmonel÷s buvo jautrios.
5 pav. pateiktas iš skirtingos kilm÷s maisto produktų išskirtų salmonelių jautrumo palyginimas.
22,5 8,8 11,3 2,5 46,8 1,3 15,0 2,5 45,0 15,0 45,0 20,0 15,0 25,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
AMP SXT FIS TIO NAL AXO TET CHL
ANTIBIOTIKAS
%
Paukštiena
Kiauliena
AMP-ampicilinas, SXT- trimetoprimas/sulfametoksazolis, FIS-sulfisoksazolis, TIO-ceftiofuras, NAL-nalidikso rūgštis, AUG- amoksicilinas/klavulano rūgštis, AXO- ceftriaksonas, TET-tetraciklinas, CHL-chloramfenikolis
5 pav. Iš kiaulienos ir paukštienos produktų išskirtų salmonelių atsparių padermių skaičiaus palyginimas, %
Kaip matyti iš 5. pav. vieniems antibiotikams dažniau salmonel÷s buvo atsparios išskirtos iš paukštienos (ceftiofurui, nalidikso rūgščiai, ceftriaksonui), o kitiems – iš kiaulienos (ampicilinui, trimetoprimui/sulfametoksazoliui, sulfisoksazoliui, chloramfenikoliui).
7 lentel÷je pateiktas daugiaatsparių salmonelių padermių, išskirtų iš kiaulienos ir paukštienos, palyginimas.
7 lentel÷. Daugiaatsparių salmonelių išskirtų iš paukštienos ir kiaulienos maisto produktų palyginimas, %
Antimikrobinių medžiagų
skaičius 0 1 2 3 4 5 6
Paukštiena 40,0 38,8 8,8 2,9 6,3 2,9 1,3
Kiauliena 49,0 10,0 10,0 10,0 20,0 5,0 -
Kaip matoma iš gautų duomenų, (7 lentel÷), iš paukštienos produktų išskirta 13,4 proc. daugiaatsparių padermių, o iš kiaulienos – 35 proc. Tai rodo, jog salmonelių daugiaatsparumas kiaulienoje yra dažnesnis nei paukštienoje.
3.2.2. Enterococcus spp. jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms
6 pav. pateikta visų Enterococcus genties padermių, išskirtų iš žalių maisto produktų jautrumo antimikrobin÷me medžiagoms duomenys
81,2 77,5 34,8 85,5 26,8 99,3 55,1 45,7 62,3 13 5,1 52,2 14,5 69,6 97,1 0,7 3,6 10,9 25,4 31,2 13,8 2,9 2,9 12,3 42 23,2 11,6 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% TGC CHL ERY PEN TET VAN TYL CIP LZD NIT A N T IB IO T IK A I
Susceptible Intermediate Resistant
NIT – nitrofurantoinas, LZD – linezolidas, CIP – ciprofloksacinas, TYL – tilozinas, VAN – vankomicinas, TET – tetraciklinas, PEN – penicilinas, ERY – eritromicinas, CHL – chloramfenikolis, TGC – tigeciklinas.
6 pav. Visų iš maisto produktų išskirtų Enterococcus spp. padermių jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms, %, (n=138)
Kaip matyti iš 6 pav. iš žalių gyvūnin÷s kilm÷s produktų išskirti enterokokai dažnai yra atsparūs įvairioms antimikrobin÷ms medžiagoms. Kai kurioms jų, dažnumas yra ypač dažnas: 69,6 proc. buvo kliniškai atsparūs tetraciklinui, 52,2 proc. – eritromicinui, 23,2 proc. – ciprofloksacinui, t.y. antibiotikams, kurie plačiai naudojami gydyti žmon÷ms. Nustatytos enterokokų paderm÷s, atsparios tigeciklinui.
7-9 pav. pateikta enterokokų, išskirtų iš skirtingos kilm÷s maisto produktų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms situacija.
56,9 84,5 25,9 74,1 15,5 100 34,5 27,6 37,9 10,3 12,1 63,8 25,9 84,5 93, 1 8,6 50 36,2 31 1,4 6,9 12,1 64,5 36,2 6,9 0% 10% 20% 3 0% 40% 50% 60% 70% 8 0% 90% 100% TGC CHL ERY PEN TET VAN TYL CIP LZD NIT A N T IB IO T IK A I
Jautrios Vidutiniškai jautrios Atsparios
NIT – nitrofurantoinas, LZD – linezolidas, CIP – ciprofloksacinas, TYL – tilozinas, VAN – vankomicinas, TET – tetraciklinas, PEN – penicilinas, ERY – eritromicinas, CHL – chloramfenikolis, TGC – tigeciklinas.
7 pav. Iš žalios paukštienos produktų išskirtų Enterococcus spp. padermių jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms, %, (n=58)
Kaip matyti iš 7 pav. paukštienos produktai, kurie parduodami Lietuvoje, mažmenin÷je prekyboje, užkr÷sti antibiotikams atspariais enterokokais. Kai kuriems jų – tetraciklinui, eritromicinui, ciprofloksacinui ir penicilinui atsparumas yra labai dažnas.
100 70 52,5 95 50 100 80 60 85 15 32,5 5 45 100 5 7,5 20 5 7,5 15 20 30 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% TGC CH L E RY PEN TE T VAN TYL CIP LZD NIT A N T IB IO T IK A I
Jautrios Vidutiniškai jautrios Atsparios
NIT – nitrofurantoinas, LZD – linezolidas, CIP – ciprofloksacinas, TYL – tilozinas, VAN – vankomicinas, TET – tetraciklinas, PEN – penicilinas, ERY – eritromicinas, CHL – chloramfenikolis, TGC – tigeciklinas.
8 pav. Iš žalios jautienos produktų išskirtų Enterococcus spp. padermių jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms, %, (n=40) 97,5 75 30 92,5 20 97,5 60 57,5 75 15 55 7,5 72,5 100 2,5 7,5 7,5 35 2,5 5 17,5 35 7,5 25 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% TGC CH L E RY PEN TE T VAN TYL CIP LZD NIT A N T IB IO T IK A I
Jautrios Vidutiniškai jautrios Atsparios
NIT – nitrofurantoinas, LZD – linezolidas, CIP – ciprofloksacinas, TYL – tilozinas, VAN – vankomicinas, TET – tetraciklinas, PEN – penicilinas, ERY – eritromicinas, CHL – chloramfenikolis, TGC – tigeciklinas.
9 pav. Iš žalios kiaulienos produktų išskirtų Enterococcus spp. padermių jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms, %, (n=40)
