LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Aldona Auškalnytė
Iš Lietuvoje auginamų avių išskirtų bakterijų atsparumas antibiotikams
Antimicrobial resistance in bacteria extracted from sheep in Lithuania
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Dr. Marius Virgailis
Kaunas, 2021
2 DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Iš Lietuvoje auginamų avių išskirtų bakterijų atsparumas antibiotikams“:
1. yra atliktas mano paties (pačios).
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Aldona Auškalnytė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
Jonas Jurjonas
(data) (vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data)
Marius Virgailis
(darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Raimundas Mockeliūnas
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas Jūratė Šiugždaitė
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
SANTRAUKA ... 6
ĮVADAS... 8
Darbo tikslas: ... 9
Uždaviniai: ... 9
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Antibiotikų istorija ... 10
1.2 Bakterijų atsparumo perdavimo būdai ... 12
1.3 Antibiotikų atsparumo mechanizmai ... 13
1.3.1 Antibiotiko molekulės modifikavimas ... 13
1.3.2 Sumažėjęs antibiotiko praeinamumas ir jo išstūmimas iš ląstelės ... 15
1.3.3 Pokyčiai taikinio vietoje ... 16
1.4 Stafilokokai ... 18
1.5 Enterobakterijos ... 18
1.5 Enterokokai ... 19
2.TYRIMO METODIKA ... 20
2.1 Tyrimo eiga, vietos ir objektai ... 20
2.2 Mėginių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją ... 21
2.3 Mėginių kultivavimas ir identifikavimas ... 21
2.4 Bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymas ... 22
2.5 Duomenų statistinis vertinimas ... 24
3.TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1 Stafilokokų tyrimas ... 25
3.1.1 Stafilokokų rūšys... 25
3.1.2 Stafilokokų atsparumas antibiotikams ... 26
3.2 E.coli tyrimas... 29
3.2.1 E.coli atsparumas antibiotikams ... 29
3.3 Enterokokų tyrimas ... 32
3.3.1 E. faecalis atsparumas antibiotikams ... 32
3.3.2 E. faecium atsparumas antibiotikams ... 34
3.3.3 Enterococcus spp. antibiotikų atsparumas ... 36
4
4.REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
4.1 Stafilokokų atsparumas antibiotikams avių populiacijoje ... 37
4.2 E. coli atsparumas antibiotikams avių populiacijoje ... 37
4.3 Enterokokų atsparumas antibiotikams avių populiacijoje ... 38
IŠVADOS ... 39
LITERATŪROS SARAŠAS ... 40
5
SANTRUMPOS
AML – amoksicilinas AMP – ampicilinas arm – armadilo proteinas ATP – adenozino trifosfatas CIP – ciproflosacinas
CLSI – klinikinių ir laboratorinių standartų institutas CN – gentamicinas
CoA – kofermentas A
DHFR – dihidrofolato reduktazė DHPS – dihidropteroato sintazė DNR – deoksiribonukleorūgštis E – eritromicinas
ENR – enrofloksacinas
erm – eritromicinui atspari metilazė
EUCAST – Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komitetas FOX – cefoksitinas
GTP – guanozin-5'-trifosfatas LPS – lipopolisacharidas LZD – linezolidas
MD – Manitolio druskos agaras MY – linkomicinas
PC-1 – proteinų konvertazė RNR – ribonukleorūgštis SB – Slanetz Bartley agaras
SXT - sulfonamido ir trimetoprimo derinys TBX - TermBase eXchange agaras
TE – tetraciklinas
Tet(M) – tetraciklinui atsparus proteinas M
6 IŠ LIETUVOJE AUGINAMŲ AVIŲ IŠSKIRTŲ BAKTERIJŲ ATSPARUMAS
ANTIBIOTIKAMS
Aldona Auškalnytė
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Darbo apimtis: 44 puslapiai, 6 lentelės, 15 paveikslų.
Darbo tikslas: Iš Lietuvoje auginamų avių išskirtų Staphylococcus spp., E. coli ir Enterococcus, bakterijų atsparumo antibiotikams įvertinimas.
Antibiotikai yra moderniosios medicinos pagrindas, o jų atsparumas yra rimta problema su kuria yra susiduriama. Viena iš pagrindinių priežasčių antibiotikų atsparumo vystymuisi yra perteklinis jų naudojimas veterinarijoje, ypač produkcijos gyvūnuose.
Atliktas tyrimas su avimis iš 3 Lietuvos ūkių. Paimti 65 išmatų mėginiai, po 20 ar 25 vnt. iš kiekvieno ūkio. Buvo išskirtos 65 Staphylococcus spp padermės, 65 E. coli padermės ir 95 Enterococcus padermės. Išskirtos stafilokokų rūšys buvo: S. aureus, S. xylosus, S. vitulinus, S.
warneri, S. capitis, S. sciuri, S. lentus, S. hyicus. S. aureus sudarė 41 proc. išskirtų stafilokokų padermių. Enterokokų išskirtos 65 E. faecalis padermės ir 30 E. faecium. 28 proc. Staphylococcus spp. padermių atsparios tetraciklinui, o 22 proc. – amoksicilinui. 69 proc. išskirtų E. coli padermių atsparios amoksicilinui, o 17 proc. – tetraciklinui. 11 proc. Enterococcus spp. išskirtų padermių buvo atsparios tetraciklinui. Buvo nustatytos 6 dauginį antibiotikų atsparumą turinčios Staphylococcus padermės, E. coli – 6 padermės. Enterococcus dauginį atsparumą turinčių padermių nustatyta nebuvo.
Raktažodžiai: avys, Staphylococcus, E. coli, Enterococcus, atsparumas antibiotikams.
7 ANTIMICROBIAL RESISTANCE IN BACTERIA EXTRACTED FROM SHEEP
IN LITHUANIA
Aldona Auškalnytė
Master thesis
SUMMARY
Scope of the thesis: 44 pages, 6 tables, 15 figures.
Goal of the thesis: Evaluation of antimicrobial resistance of Staphylococcus spp., E. coli and Enterococcus spp. extracted from sheep in Lithuanian farms.
Antibiotics are the base of modern medicine and bacterial resistance to it is the leading problem that health industry is currently facing. One of the main reasons for it is the excess use of antibiotics in the veterinary field, especially in livestock animals.
The research was done using sheep from 3 different farms in Lithuania. Overall, 65 samples were taken, 20 or 25 units from each place. 65 strains were isolated of Staphylococcus spp., 65 of E.
coli and 95 of Enterococcus strains. Isolated species of Staphylococcus spp. where: S. aureus, S.
xylosus, S. vitulinus, S. warneri, S. capitis, S. sciuri, S. lentus, S. hyicus. The majority of them were S. aureus making 41%. Only E. faecalis and E. faecium species were isolated from Enterococcus family, respectively 65 and 30 isolates. 28% of Staphylococcus spp. strains had resistance to tetracycline, 22% to amoxicillin. 69% of the E. coli isolates were resistant to amoxicillin and 17% to tetracycline. 11% of Enterococcus strains also were resistant to tetracycline. 6 Staphylococcus strains were identified to have multi-resistance to antibiotics, out of E. coli strains such were 6 as well. There were no multi-resistance Enterococcus strains identified.
Keywords: sheep, Staphylococcus, E. coli, Enterococcus, antimicrobial resistance.
8
ĮVADAS
Yra du pagrindiniai būdai, kurių pagalba modernioji medicina sugeba išgelbėti gyvybes.
Pirmasis tai infekcinių ligų gydymas naudojant antibiotikus. Antrasis - aukšto lygio medicininių ir chirurginių procedūrų atlikimas kartu apsaugai naudojant ir antimikrobines medžiagas. Antibiotikai sėkmingai išgydė ar padėjo išvengti infekcinių ligų atsiradimo pacientams, kurie yra gydomi chemoterapija, kurie turi chroniškas ligas tokias kaip, diabetas, paskutinės stadijos inkstų nepakankamumas, reumatoidinis artritas (1). Taip pat palengvino galimas komplikacijas po sudėtingų chirurginių procedūrų kaip, organų transplantacija, sąnarių keitimas. Auksinė antibiotikų era minima nuo 1930 metų iki 1960 metų. Auksinė ji yra vadinama todėl, nes sėkmė tuo metų atrodė įprastas dalykas, o era vadinama dėl to, kad ji jau pasibaigė. Žmonija nesugebėjo išlaikyti to tempo naujų antibiotikų kūrime, kurį nustatė patogenai nuolatos išvystydami atsparumo savybę vis naujai sukurtam antibiotikui. Pokyčiai įvyko tuo metu, kai industrija pakeitė strategiją nuo senų antibiotikų pakoreguotų variantų gamybos į paieškas į visiškai naujų antibiotikų grupių, kurios turėtų poveikį mikroorganizmams, kurie jau išvystė atsparumą seniesiems antibiotikams (2).
Nuolatinis naujų antibiotikų ieškojimo ir efektyvumo patvirtinimo yra brangus procesas.
Antibiotikų paieškos ir gamybos nesėkmės bei sąlyginai greitas bakterijų atsparumo antibiotikams išsivystymas privertė farmacininkus persiorientuoti į kitų vaistų gamybą, kurie yra naudojami ne infekcinėms ligoms gydyti ar švelninti simptomus, bet kurių veiksnumas ir aktualumas rinkoje išlieka ilgą laiką ir yra daug kartų pelningesnė investicija farmacijos bendrovėms. Dėl prarasto susidomėjimo naujų medžiagų pasižyminčių antibakterinių veikimu paieškos sulėtėjo. (2,3).
Mikroorganizmų atsparumas antibiotikams yra dinamiška ir greitai auganti problema, ne tik atskiruose regionuose, bet ir visame pasaulyje. Globalaus atsparumo priežastys yra gyventojų perteklius, laisvas judėjimas, perteklinis antibiotikų naudojimas klinikinėje medicinoje ir produkcijos gyvūnuose bei netinkamas jų pasirinkimas, prastos sanitarijos sąlygos, laukinės gyvūnijos migracija, netinkamos atliekų naikinimo sistemos (4). Tiksliai apskaičiuoti sunku, tačiau yra manoma, kad pagrindinės antibiotikų atsparumo pasekmės koncentruojasi trijose kategorijose: ilgesnė ligos trukmė ir didesni mirčių kiekiai infekcinėmis ligomis sergančių pacientų, padidėję tokių infekcinių ligų gydymo kaštai bei negalėjimas atlikti procedūrų, kurių sėkmė paremta antibiotikų veiksmingumu siekiant išvengti tolimesnių komplikacijų (5).
Pasaulyje yra fiksuojama vis daugiau bakterinių infekcijų protrūkių. Ekonominės išlaidos skirtos antibiotikams atsparių bakterinių infekcijų gydymui yra milžiniškos, o mirčių skaičius nuolatos kyla (6). Europoje suskaičiuojama kasmet apie 25 tūkstančiai žmonių mirčių dėl
9 antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų ligų. Europos sąjungos šalims papildoma ligonių, sergančių keliems antibiotikams atsparių bakterijų sukelta infekcija, papildoma sveikatos priežiūra kasmet kainuoja apie 1,5 milijardus eurų (7). Jungtinėse Amerikos Valstijose šie skaičiai dar didesni.
Antibiotikams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų šioje šalyje per metus užfiksuojama apie 2.8 milijono atvejų, iš kurių vidutiniškai apie 35 tūkstančius žmonių neišgyvena (8). Manoma, kad mirčių skaičius pasaulyje gali siekti iki 700 tūkstančių (7). Medicinos ekspertai perspėja apie grįžimą į laikotarpį, kuris buvo prieš antibiotikų egzistavimą. Pasaulyje jau yra užfiksuota daugiau nei 20 tūkstančių skirtingų genų, kurie potencialiai atsakingi už antimikrobinį atsparumą (9). Viena iš pagrindinių priežasčių antibiotikų atsparumo vystymuisi yra perteklinis jų naudojimas veterinarijoje, ypač produkcijos gyvūnuose (10).
Bakterinių patogenų padermės turinčios daugybinį atsparumą antibiotikams yra aptinkamos visose didžiausiose Gram-neigiamų ir Gram-teigiamų bakterijų klasėse, tarp kurių yra ir Staphylococcus spp., Enterococcus spp.,beiEnterobacteriaceae šeimos (11).
Darbo tikslas:
Iš Lietuvoje auginamų avių išskirtų Staphylococcus spp., E. coli ir Enterococcus, bakterijų atsparumo antibiotikams įvertinimas.
Uždaviniai:
1. Išskirti mikroorganizmų kultūras, esančias avių išmatose.
2. Nustatyti, kokios mikroorganizmų padermės vyrauja tirtuose mėginiuose 3. Ištirti išskirtų mikroorganizmų jautrumą pagrindinėms antibiotikų klasėms.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Antibiotikų istorija
Pirmuosius įrodymus apie antibakterines kai kurių medžiagų savybes galima aptikti nuo senų laikų, tačiau medicininė šių medžiagų panaudojimo pradžia yra 20 amžiaus pirmojo dešimtmečio pabaiga. Pirmoji sintetinė medžiaga, kuri pasižymėjo antibakteriniu veikimu, buvo išgauta panaudojant arseno cheminius darinius ir pavadinta salvarsanu. Jį atrado mokslininkai Ehrlich ir Bertheim (12). Šis atradimas leido pradėti gydyti žmones, sergančius sifiliu bei tripanosomoze. Per ateinančius 20 metų nuo jo atradimo šiuo preparatu buvo išgydyta du trečdaliai visų sifilių užsikrėtusių žmonių pasaulyje (13).
Protonzilis yra pirmasis sulfonamidų klasės sintetinis antibiotikas, sukurtas 1932 metais Bayer kompanijos mokslininkų (12). Vokiečių mokslininkas Domagk atliko bandymus su pelėmis naudodamas šią medžiagą kaip efektyvią priemonę apsaugančią nuo pavojingos Streptococcus pyogenes infekcijos ir už šį savo darbą buvo apdovanotas Nobelio taikos premija (13). Netrukus Bayer pristatė ir kitų sulfonamidų klasės vaistų, tokių kaip sulfapiridinas. Jis buvo leidžiamas naudoti gyvūnų gydyme jau 1938 metais (14).
1929 metais mokslininkas Fleming atrado peniciliną, tačiau plačiai gaminti jis buvo pradėtas tik po dešimties metų. Pirmieji sėkmingai išgydyti žmonės naudojant peniciliną buvo antrojo pasaulinio karo kareiviai (12). Jo atradimas yra vienas reikšmingiausių momentų medicinos istorijoje, kuris drastiškai pakeitė žmonių išgyvenimo galimybes.
Pirmieji antibiotikų atsparumo atvejai buvo užfiksuoti trečiame 20 amžiaus dešimtmetyje netrukus po penicilino ir sulfonamidų klasės antibiotikų atradimo (15). Užtruko 25 metus kol antibiotikų atsparumas tapo rimta problema. Didžiausias pavojus buvo hospitalizuotiems pacientams.
Staphylococcus aureus ir kitos hospitalinės infekcijos žaibišku greičiu išvystė atsparumą tuo metu populiariems penicilinų ir sulfonamidų klasės antibiotikams. Taip pat situaciją apsunkino ir faktas, kad šios bakterijos sugebėjo išgyventi ligoninių aplinkoje, kur maksimaliai stengiamasi užtikrinti aukštus higienos reikalavimus ir saugią aplinką (15). Atsiradus amino glikozidų antibiotikų klasei, vos po šešerių metų buvo fiksuojamos jiems atsparios Staphylococcus aureus padermės (16). Antibiotikų atsparumo vystymasis istorijoje pateiktas pirmame paveiksle.
Viena iš pagrindinių priežasčių antibiotikų atsparumo vystymuisi buvo ir vis dar yra jų naudojimas maisto industrijoje ir veterinarinėje praktikoje. Šeštajame dešimtmetyje buvo pastebėta, kad maisto pramonėje naudojamų gyvulių auginimas gali būti paspartintas ir sumažinti šėrimo kaštai (17). Jų naudojimas labas greitai išpopuliarėjo pramoninių gyvulių auginime. Antibiotikai naudojami
11 agrokultūroje dažnai yra tokie patys arba panašios sudėties kaip ir tie, kurie naudojami medicininėje praktikoje. Maisto grandinė yra svarbus ryšys antibiotikams atsparių bakterijų plitime iš gyvūnų į žmonių populiaciją (16).
Pav. 1 Bakterijų atsparumo antibiotikams vystymosi istorinių datų lyginimas su antibiotikų atradimo metais (1).
R – atsparus (angl. resistant), PDR – pilnai atsparus antibiotikams (angl. pan drug-resistant), XDR – plataus atsparumo diapazono (angl. extensively drug-resistant)
12 1.2 Bakterijų atsparumo perdavimo būdai
Yra žinoma mažiausiai 17 skirtingų antibiotikų klasių. Visose šiose klasėse yra aptinkamas bent vienas bakterijų išvystytas atsparumo mechanizmas. Dažnai bakterijos išvysto skirtingus atsparumo mechanizmus vienu metu. Todėl tampa atspariomis net kelioms antibiotikų klasėms. Dėl šios priežasties tokių bakterinių infekcijų gydymas tampa ypač sudėtingas (15)
Bakterijų atsparumas antibiotikams būna savybinis arba įgytas. Savybinis atsparumas yra gana retas ir nusakomas kaip ląstelės savybė būdinga kažkuriai bakterijų rūšiai kaip natūralus evoliucijos eigoje susiformavęs fenomenas. Ši savybė būdinga visoms tos rūšies bakterijoms. Įgytas atsparumas gali būti: išsivystęs per reguliavimo ar struktūrinių genų mutacijas, iš šalies gautas atsparumą antibiotikams koduojantis genas arba šių dviejų mechanizmų kombinacija. Jis pasireiškia ne visoje tam tikroje bakterijų rūšyje, o tik dalyje populiacijos, tiksliau grupėje bakterijų kurios yra vienos kilmės ir turi bendrą protėvį (18).
Chromosomų mutacijos sukuria atsparumą struktūriniams junginiams. Jos atsiranda kaip atsitiktinė klaida replikacijos procese arba klaidingu pažeistos DNR taisymo metu. Kai kurie biocheminiai atsparumo mechanizmai yra mutacijų rezultatas (19). Tam tikrose bakterijų populiacijose, esant prailgintam ne mirtinos antibiotikų dozės veikimui, organizmai gali pasiekti sustiprintų mutacijų būseną, kai bakterijos mutuoja itin greitu tempu, taip paspartindamos atsparaus geno sukūrimą (19). Atsiradus atspariai bakterijai, jos kopijos nukonkuruoja imlias bakterijas ir sukuria atsparią populiaciją. Paprastai mutacijos, sukuriančios antimikrobinį atsparumą, keičia antibiotikų veikimą per vieną iš šių mechanizmų: pakeičia antimikrobinį taikinį, sumažina antibiotiko įsisavinimą, aktyvuoja išstūmimo mechanizmus, kurie pašalina patekusią kenksmingą molekulę iš bakterijos, ar pakeičia bakterijos metabolinius kelius, pakoreguojant organizmo reguliavimo tinklus (20).
Kitas būdas patekti antibiotikams atspariems genams iš vienos bakterijos į kitą yra Horizontalus genų perdavimas (19). Dauguma antimikrobinių medžiagų naudojamų klinikinėje praktikoje yra natūralios medžiagos arba jų išskiriami dariniai natūraliai randami gamtoje. Bakterijoms tokia aplinka yra puikus šaltinis atsparių genų gavimui. Paprastai mikroorganizmai naudoja tris skirtingus būdus išorinės genetinės medžiagos įgijimui. Tai yra transformacija, transdukcija ir konjugacija (20). Transformacija tai pats nesudėtingiausias būdas horizontaliam genų perdavimui atlikti, tačiau tik labai nedidelis kiekis bakterijų rūšių sugeba tiesiogiai inkorporuoti laisvą DNR grandinės molekulę ir taip įgauti atsparumą. Dauguma, tai sugebančių bakterijų nėra kliniškai svarbios ar sveikatai pavojingos bakterijos (20). Bakteriofagai - tai virusai, kurie veikia kaip vektoriai genetinės medžiagos mainų procese per bendrinę arba specializuotą transdukciją. Specializuotos transdukcijos metu fagai
13 perneša kelis specifinius genus iš donorinės ląstelės, Tuo tarpu bendrinės transdukcijos metu yra pernešamas visas genomas (21). Kitas būdas – konjugacija, tačiau tam, kad ji įvyktų, bakterijos privalo turėti tiesioginį kontaktą viena su kita. Tam, kad šis procesas vyktų, dažniausiai reikia autonominių konjungacijos elemetų, tokių kaip plazmidė ar transpozonas (22). Aprašomas ir dar vienas pernešimo būdas, kai ląstelė naudoja savo paties sukurtus genų pernešimo agentus, kurie veikia panašiai kaip bakteriofagai. Jie yra perduodami į kitą ląstelę vykstant ląstelių lizei. Tokie agentai perneša tik nedidelį kiekį savo šeimininkės ląstelės DNR ir neturi sugebėjimo patys koduoti savo baltyminius komponentus. Kai kurie šaltiniai teigia, kad toks genų pernešimo agentų naudojimas apjungia transdukcijos ir transformacijos procesus (22).
1.3 Antibiotikų atsparumo mechanizmai
Kiekvienai antibiotikų klasei yra išsivystę keli atsparumo mechanizmai, kurie sumažina jo veikimą arba jį eliminuoja. Taip pat viena bakterijų rūšis gali tuo pačiu metu būti įgijusi keletą skirtingų mechanizmų. Tokiu būdu susidaro daugybinį antibiotikų atsparumą turinčios bakterijų padermės (22). Pagrindiniai gynybiniai mechanizmai, kuriuos naudoja mikroorganizmai atsparumui vystyti yra: sumažėjęs antimikrobinių molekulių įsisavinimas, fermentinė modifikacija ir degradacija, pakeisti penicilinus surišantys proteinai, pašalinimo pompos, pakeisti taikiniai ir stipriai suaktyvėjusi jų gamyba (19).
1.3.1 Antibiotiko molekulės modifikavimas
Vienas iš sėkmingiausių būdų bakterijoms kovoti su antibiotikų veikimu yra gaminti specifinius enzimus, kurie inaktyvuoja vaistą prijungdami specifinius cheminius fragmentus į esamą junginį arba tiesiog sunaikina pačią molekulę. Tokiu būdu yra sustabdomas antibiotiko gebėjimas sąveikauti su savo taikiniu (20).
Antibiotiko inaktyvavimas pernešant cheminę grupę. Bakterijos naudoja fermentus kurių pagalba prie silpnos antibiotiko molekulės grandies yra prijungiamos cheminės grupės ir taip sukeliamas atsparumas antibiotikui. Jam nebėra galimybės prisijungti prie proteinų taikinio nes sukuriama steriška kliūtis. Prijungiamos gali būti įvairios cheminės grupės, tokios kaip: acilų, fosfatų, nukleotidilų ir ribotilų (23).
Aciltransferazė, o ypač acetiltransferazė yra dažnas bakterijų naudojamas mechanizmas siekiant išvystyti antibiotikų atsparumą. Hidroksilų ir aminų grupės kurios yra antibiotikų molekulinėje sudėtyje yra lengvai pažeidžiamos kovalentiniu modifikavimu, kuris sukuria junginius sunaikinančius antibiotiko savybę prisijungti prie bakterijos taikinio ir tokių būdu tampa nebeaktyvūs.
Gauta amido arba esterio grupė yra biologiškai stabili ir sukuria negrįžtamąjį ryšį, be papildomo
14 giminingų esterazės ar amidazės enzimų veikimo. Didelė acetyl-CoA koncentracija ląstelėje užtikrina, kad enzimų gamybai visada bus pakankamas kiekis kosubstrato (24). Portugalų atliktame tyrime iš avių išskirtuose E. faecalis ir E. durans buvo aptiktas tet(M) genas kuris koduoja būtent tokių fermentų aktyvumą (25).
Aminoglikozidų grupės antibiotikai ypač jautrūs modifikacijai. Paprastai jie turi stambias molekules su dideliu hidroksilų ir amidų grupių kiekiu kurios yra neapsaugotos ir lengvai prieinamos.
Yra trys pagrindinės aminoglikozidus modifikuojančių enzimų klasės: acetiltransferazės, fosforotransferazės ir nukleotidiltransferazės. Šios klasės yra gana skirtingos ir gali skirtingai veikti atskirus aminoglikozidams priskiriamus antibiotikus. Kiekviena iš šių enzimų klasių gali modifikuoti skirtingas molekulės dalis. Enzimų aktyviosios vietos sugeba kopijuoti taikinio ląstelės aplinką kuri atitinka antibiotiko ribosomų prisijungimo plyšį (23). Aminoglikozidus modifikuojančių identifikuotų enzimų kiekis yra tikrai pakankamai didelis. Taipogi jau yra ir nustatyta dalis šiuos enzimus koduojančios genų sekos. Šiuos genus bakterijos įgyja transdukcijos ir transformacijos bei naudodamos integruotos konjugacijos elementus (26).
Dalis enzimų atliekančių molekulių modifikavimą evoliucionavo ir išvystė sugebėjimą atlikti skirtingas modifikacijas. Atrasta dvifunkcių ,fermentų sintetinančių acetil ir fosforotransferazes, jie buvo rasti Gram-teigiamuose organizmuose ir spėjama atsirado susijungus dviem aminoglikozidus modifikuojantiems enzimų genams (20). Kinijoje iš viščiukų buvo išskirta Campylobacter coli bakterija, kuri turėjo įgijusi net 6 skirtingus aminoglikozidus modifikuojančius enzimus priklaususius visoms trims klasėms. Tokie pokyčiai leidžia mikroorganizmui apsisaugoti nuo didžiosios dalies aminoglikozidų klasės antibiotikų (27).
Daugelis antibiotikų turi hidrolitiškai imlius cheminius junginius, tokius kaip esteriai ar amidai, kurių vientisumas yra esminis veiksnys jų biologiniam veiksnumui. Mikroorganizmai išvystė keletą fermentų tipų, kurių taikinys yra būtent šie pažeidžiami ryšiai. Juos perskeliant sunaikinamas antibiotiko veiksmingumas ir sukuriamas mikroorganizmo atsparumas. Pagrindiniai ir dažniausiai mikroorganizmų naudojami šio tipo enzimai yra amidazės, kurios perskelia ß-laktaminį žiedą penicilinų ir cefalosporinų klasės antibiotikuose. Kiti tokio enzimų veikimo pavyzdžiai yra esterazės, kurios daugiausia veikia makrolidų klasės antibiotikus, ir epoksidazės sukeliančios fosfomicinų klasės antibiotikų atsparumą. Šių enzimų veikimui vienintelė reikalinga medžiaga yra vanduo, todėl dažnai jie gali būti bakterijų išskiriami į aplinką ir blokuoti antibiotikus dar prieš jiems patenkant į mikroorganizmą (24).
ß-laktamazės pirmiausiai aptiktas antibiotikų atsparumo mechanizmas aprašytas iškart išpopuliarėjus penicilino naudojimui. Šiuo metu yra jau žinoma apie 300 skirtingų ß-laktamazių ir
15 jiems suklasifikuoti naudojamos dvi sistemos. Kliniškai svarbiausi ß-laktamazės fermentai yra gaminami gram-neigiamų bakterijų ir yra koduojami plazmidžių chromosomų. Genai, kurie koduoja ß-laktamases, yra perduodami transpozonais, tačiau jų galima rasti ir integronų sudėtyje (19).
Yra 2 ß-laktamazių klasifikavimo sistemos. Ambler sistema remiasi enzimų amino rūgščių seka identifikavimui ir suskirstymui į 4 atskiras grupes. Bush-Jacoby-Medeira klasifikacija remiasi fermentų biochemine funkcija, taipogi sugrupuoja fermentus į 4 grupes, tačiau pagal jų naudojamo substrato specifiškumą (20).
Vienas iš pirmųjų atsiradusių bakterijų enzimų buvo TEM-1 ß-laktamazė. Farmacijos kompanijos naudodamos įvairius natūralių produktų bandymus atrado klavulano rūgšties inhibitorinį veikimą. Iš Streptomyces clavuligerus išgauta klavulano rūgštis inaktyvuoja TEM-1 ir PC1 enzimus.
Enzimui reaguojant su rūgštimi susiformuoja hidrolizuota klavulano rūgštis ir laisvas jau nebeveiksnus fermentas. Vėliau buvo sukurta ir daugiau fermentų inhibitorių ar inhibitoriams atsparių patobulintų antibiotikų. Tačiau dauguma jų veikia tik Ambler A klasės ß-laktamazes (28).
1.3.2 Sumažėjęs antibiotiko praeinamumas ir jo išstūmimas iš ląstelės
Dalis antibiotikų naudojamų klinikinėje praktikoje turi viduląstelinius bakterinius taikinius.
Gram-neigiamos bakterijos tokius taikinius turi vidinėje citoplazminės membranos pusėje. Todėl antibiotokų molekulių komponentai turi prasiskverbti pro išorinę ir dažnai kartu citoplazminę membranas tam, kad galėtų paveikti bakterijas antimikrobiškai. Dalis bakterijų išvystė mechanizmus siekiančius sustabdyti antibiotiką nuo intraląstelinio ar periplazminio taikinio pasiekimo sumažindami antibiotiko molekulių praeinamumą, tai ypač svarbu Gram neigiamoms bakterijoms.
Išorinė membrana suformuoja pirmąją gynybinę struktūrą, prieš įvairių toksinių medžiagų įskaitant ir antibiotikų patekimą. Hidrofilinės molekulės tokios kaip, ß-laktamai, tetraciklinai ir dalis fluorochinololų yra ypatingai veikiami tokio praeinamumo mažinimo mechanizmo, nes išorinės membranos dažnai naudoja vandeniu pripildytus difuzinius kanalus, vadinamus porinais, tam, kad pereitų ląstelės barjerą (20). Taip pat yra ir dar du patekimo būdai į bakteriją, tai difuzija per dvisluoksnį barjerą arba paties antibiotiko inicijuotas įsiurbimas (29).
Hidrofobiniai antibiotikai pasiekia vidinius ląstelės sluoksnius, prasiskverbdami per dvisluoksnę išorinę membraną. Dažniausiai jie yra aminoglikozidai, makrolidai, rifamicinas, novobiocinas, fuzidinė rūgštis ir katijoniniai peptidai. Tetraciklinai ir chinolonai naudoja abejus lipidų ir porinų valdomus praėjimo kelius (30). Lipopolisacharidai (LPS) yra pagrindinė priežastis sumažėjusio dvisluoksnio pralaidumo hidrofobinėms molekulėms, tokioms kaip antibiotikai ar antimikrobiniai plovikliai. Lipopolisacharidai susideda iš lipido A, polisacharido centro ir O antigeno.
16 Riebalų rūgščių pakaitalai LPS yra pilnai prisotinti suteikdami jiems gelinę struktūrą su mažu takumu.
Prie mažo LPS praeinamumo taip pat prisideda anijonine prigimtimi pasižymintis O antigenas ir pereinamasis tiltas esantis centriniame regione su fosfatų grupėmis ir dvivalenčiais katijonais (29).
Yra nustatyti ir aprašyti kelių tipų porinai. Jie gali būti klasifikuojami remiantis jų struktūra (trimerinė ar monomerinė), jų selektyvumu ir praeinamumo reguliavimu. Vieni iš geriausiai apibūdintų porinų yra trys pagrindiniai E.coli gaminami proteinai. Jie yra klasikinis porinų reguliuojamo antibiotikų atsparumo pavyzdys. Porinų pokyčiai gali atsirasti veikiant kažkuriam iš šių trijų procesų: perėjimas prie kito tipo gaminamų porinų, pasikeitęs porinų gamybos lygis ir suprastėjusi porinų gamybos funkcija. Tačiau dažnai, tokie membranos pralaidumo pokyčiai patys vieni sukelia tik mažo laipsnio antibiotikų atsparumą, todėl paprastai veikia kartu su kitais atsparumo mechanizmais, pavyzdžiui išstūmimo pompos (20).
Bakterijų membraniniai išstūmimo siurbliai aktyviai transportuoja daugelį antibiotikų iš ląstelės ir yra vieni iš labiausiai prisidedančių prie esminio Gram neigiamų bakterijų atsparumo antibiotikams, kurie gali būti naudojami Gram teigiamų bakterinių infekcijų gydymui. Efektyviai veikiantys siurbliai gali sukelti ir aukšto lygio atsparumą antibiotikams, kurie anksčiau buvo efektyvūs klinikiniame gydime. Dalis siurblių turi gana siaurą substratų specifiškumą, tačiau yra nemažai siurblių, kurie sugeba transportuoti platų diapazoną struktūriškai nepanašių substratų ir yra žinomi kaip daugeliui vaistų atsparūs membraniniai siurbliai (23). Anksčiau jau minėtame portugalų tyrime iš avių išskirtuose E. faecalis ir E. durans padermėse buvo nustatyti ir tet(L) genai kurie koduoja membraninius siurblius (25).
Kadangi membraninių siurblių skirtumai ir pasiskirstymas yra itin platūs, vienintelis galimas jų klasifikavimas yra filogenetiškas grupavimas, pagal jų proteinų sekas. Tuo remiantis yra sudaryta Milton Saier klasifikacija. Tarp daugelių membraninių siurblių grupių pačios svarbiausios ir daugiausiai reikšmės bakterijų antibiotikų atsparumui turi RND (angl. resistance-nodule-division), MFS (angl. major facilitator superfamily), MATE (angl. multidrug and toxic compound extrusion), SMR (angl. small multidrug resistance) ir ABC (angl. ATP-binding cassette) šeimos (31).
1.3.3 Pokyčiai taikinio vietoje
Dažna bakterijų strategija siekiant išvystyti antimikrobinį atsparumą yra vengti antibiotiko sąveikos su jos taikinio vieta. Tam, kad tai pasiektų bakterijos naudoja skirtingas taktikas. Viena iš jų yra taikinio vietos apsauga, siekiant sumažinti antibiotiko galimybę pasiekti prisijungimo vietą.
Kita strategija yra taikinio vietos modifikavimas sumažinantis antibiotiko molekulės giminingumą (20).
17 Nors dalis genetinių determinančių, kurios koduoja baltymus atsakingus už taikinių apsaugą, buvo rastos bakterijų chromosomoje, dauguma kliniškai svarbių genų, esančių šio mechanizmo dalimi, yra pernešami mobilių genetinių elementų. Antibiotikai, nuo kurių susidaro didžiausias atsparumas bakterijai naudojant šį mechanizmą, yra tetraciklinai, fluorochinolonai ir fuzidinės rūgštys. Vienas iš klasikinių ir geriausiai išstudijuotų pavyzdžių taikinio apsaugos mechanizmų yra tetraciklinui atsparios determinantės Tet(M) ir Tet(O). Jos plačiai paplitusios tarp daugelio skirtingų bakterijų rūšių, galimai dėl to, kad taip pat buvo rastos keliose plazmidėse ir plačiame konjungacinių transpozonų spektre (20). Šios determinantės sąveikauja su ribosoma ir išstumia tetracikliną iš jo prisijungimo vietos nuo GTP priklausomu būdu. Šita trumpa sąveika taip pat pakeičia ribosomos konformaciją, užtverdama galimybę antibiotikui prisijungti dar kartą (32).
Tarp visų bakterijų šeimų labiausiai paplitęs gynybinis atsparumo mechanizmas yra taikinio vietos modifikacijos. Šie taikinio pokyčiai gali susidaryti: iš taškinių mutacijų įvykusių genuose koduojančiuose taikinio vietą, esant fermentiniams pokyčiams susijungimo vietoje, ar įvykus pilnam taikinio pakeitimui arba jo apėjimui. Nepaisant kuris iš šių pokyčių vyksta, galutinis efektas yra vienodas - tai sumažėjęs „giminingumas“ antibiotiko taikinio vietai (20).
Vienas iš gerų taikinio mutacijos pavyzdžių yra atsparumas susiformavęs oksazolidinonams.
Tai yra sintetinis bakteriostatikas veikiantis Gram teigiamus mikroorganizmus. Linezolidas yra plačiausiai naudojamas šios grupės antibiotikas. Atsparumas jam išvystomas mutavus genus koduojančiui V domenui RNR arba ribosomų proteinams, tai sumažina antibiotiko giminingumą su ląstelės taikiniu (33).
Yra keletas fermentų pagalba vykstančių taikinio vietos modifikacijos būdų. Vienas iš pavyzdžių yra kuomet fermentas, kuris užkoduotas erm genu, katalizuoja ribosomą prijungdamas metilo grupę ir taip sukeldamas atsparumą makrolidų klasės antibiotikams (20). Tokiu pačiu principu dalis bakterijų yra išvysčiusios atsparumą aminoglikozidams. Enzimams pakeitus ribosomą, prie kurios antibiotikas prisijungia. Šių fermentų jau buvo aptikta keliuose skirtinguose patogeninėse bakterijose. Pavyzdžiui armA genas, kuris koduoja metiltransferazę buvo rastas išskirtose enterobakterijose Šiaurės Amerikoje, Europoje ir Indijoje. Taip pat metiltransferazę koduojantis genas rmt buvo rastas Šiaurės Amerikoje, Centrinėje ir Pietų Amerikoje, bei Indijoje (23).
Visiškas taikinio pakeitimas įvyksta kai bakterija sugeba išvystyti naują taikinį, kuris pilnai atlieka originalaus taikinio biochemines funkcijas, bet nėra slopinamas antimikrobine molekule.
Kliniškai labiausiai svarbūs pavyzdžiai yra meticilinui atsparios S. aureus dėl įgyto išorinio PBP geno ir vankomicinui atsparūs enterokokai dėl peptidoglikano struktūros modifikavimo atlikto van genų grupių (20).
18 Kitas būdas siekiant išvengti antibakterinio veikimo yra apeiti metabolinius kelius, kuriuos jie slopina padidinat antibiotinių taikinių gamybą. Tokios strategijos tikslas yra padidinti antibiotiko molekulės stimuliavimą su esančiu ypač dideliu laisvų taikinių kiekiu. Geras tokio veikimo pavyzdys yra atsparumas trimethoprim sulfamethoxazole antibijotikams. Bakterija pradeda stipriai suaktyvintą DHFR ir DHPS genų gamybą sukeldama antibiotiko neįprastai didelę stimuliaciją ir taip sutrikdydama antibiotikui slopinti folio rūgšties gamybą ir užsitikrindama išgyvenamumą (34).
1.4 Stafilokokai
Stafilokokai yra gram teigiami kokai tepinėliuose matomi trumpomis grandinėmis ar telkiniais.
Jie yra fakultatyviniai anaerobai, nejudrūs, katalazei teigiami, oksidazei neigiami fermentatyvūs.
Staphylococcus šeimoje yra daugiau nei 47 rūšys. Reikšmingiausios rūšys veterinarijoje yra Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus ir Staphylococcus schleiferi. Stafilokokai dažnai yra natūrali mikroflora žmonių ir gyvūnų odoje ir gleivinėje (35).
S. aureus atsparus meticilinui plačiai paplitęs ir yra vienas iš pagrindinių mastito sukėlėjų smulkiuose atrajotojuose. Yra nustatyta, kad užsikrėtę gyvūnai gali perduoti atsparias padermes žmogui ne tik tiesioginiu kontaktu, bet ir perduoti per neapdorotą maistą, kuris skirtas tolimesniam vartojimui. Čekų atliktame tyrime, kur buvo ieškoma stafilokokų įvairiuose ūkio gyvūnų rūšyse, didžiausias jų skaičius užfiksuotas smulkiuose atrajotojuose (36). Tačiau, didžioji dauguma stafilokokų atrajotojuose yra randama viršutiniuose kvėpavimo takuose ir dažnai sukelia kvėpavimo takų infekcijas (37).
Kitame čekų atliktame tyrime iš pieno išskirtos 8 skirtingos Staphylococcus šeimos bakterijų rūšys. 25 proc. iš avių paimtuose mėginiuose rastas Staphylococcus aureus patogenas. 20 proc.
išgrynintų Staphylococcus aureus kultūrų buvo atsparūs eritromicinui bei 13 proc. išskirtų bakterijų kolonijų buvo atsparios gentamicinui bei ciprofloksacinui (38). Keliose Afrikos šalyse atliktame tyrime buvo aptikta Staphylococcus aureus padermių, esančių naminių gyvūnų populiacijoje, kurių kloninė giminė paprastai buvo asocijuojama su žmonių infekcijomis (39).
1.5 Enterobakterijos
Enterobakterijos yra gram neigiamos lazdelės, dauguma judrios, gali augti aplinkoje su ir be deguonies. Dauguma jų yra katalazei teigiami ir oksidazei neigiami. Taip pat dauguma redukuoja nitratus į nitritus (40). Šiai šeimai priklauso daug skirtingų genčių, tačiau viena iš svarbiausių ne tik žmonių medicinoje, bet ir veterinarinėje yra Escherichia gentis. Šioje šeimoje yra 6 bakterijų rūšys, tačiau veterinarijoje tik E.coli bakterija turi klinikinės reikšmės (35).
19 Escherichia coli yra natūrali mikroflora šiltakraujų gyvūnų storajame žarnyne. Patekusios į aplinką jos gali kurį laiką išgyventi vandenyje, nuosėdose ar dirvožemyje. Kadangi E.coli yra fakultatyvus anaerobas, todėl iš virškinamojo trakto patekus į aplinką, priešingai nei dauguma kitų virškinamojo trakto bakterijų, sugeba gerai išgyventi. E.coli yra oportunistinis patogenas, todėl esant tinkamoms sąlygoms virškinamajame trakte gali sukelti infekcinę ligą su klinikiniais simptomais (35,41). Kelios izoliuotos E.coli padermės yra pagrindinės priežastys plataus diapazono virškinamojo trakto ligų žmonių ir gyvūnų tarpe. Šiuo metu labiausiai ištirti 8 pavojingiausi patologiniai varijantai, kurie plačiai gali būti klasifikuojami į diarogenines ir ekstraintesticines E.coli padermes (42).
E.coli serogrupė O26, kuri turi Shiga toksinus produkuojančią bei enteropatogeninę E.coli atmainas, buvo išskirta Norvegijos avių bandose. Šios serogrupės bakterijos sukelia ūmius hemoraginius kolitus ir hemolizinį ureminį sindromą (43). Taip pat ir Brazilijoje iš avių buvo išskirta kelių serotipų E.coli bakterijų, patogeninių žmonėms (44). Saudo Arabijoje atliktame tyrime su avimis 80 proc. išskirtų E.coli bakterijų turėjo savyje plazmides, taip pat visos išskirtos padermės buvo atsparios bent vienam tirtam antibiotikui, o net 51 proc. mikroorganizmų turėjo išvystę daugybinį antibiotikų atsparumą, varijuojant nuo 2 iki 6 antimikrobinių medžiagų. Dalis šių bakterijų buvo išskirta iš kliniškai sveikų gyvūnų (45).
1.5 Enterokokai
Enterococcaceae šeimos bakterijos Gram teigiami, katalazei neigiami, fakultatyvūs anaerobai, kurie gali būti randamai kaip pavieniai kokai ir taip pat kokų grandinėse. Enterokokai produkuoja bakteriocinus, kurie stabdo panašių bakterinių atmainų dauginimąsi. Dėl šios savybės anksčiau jie buvo naudojami kaip probiotikas maisto industrijoje (46). Enterokokų rūšių yra net kelios dešimtys ir jų skirstymas gana sudėtingas. Viename Indijoje atliktame tyrime iš žmonių dažniausiai išskirtos rūšys buvo E. faecalis kuri sudarė daugiau nei 56 proc ir E. faecium - 34 proc (47,48).
Enterokokai yra natūrali mikroflora žmonių ir gyvūnų virškinamajame trakte, taip pat jų galima rasti vabzdžiuose bei nematoduose (49). Slovakijoje atliktame tyrime, kuriame buvo išskirtos Enterococcus bakterijos iš mastitu sergančių avių pieno 70 proc. bakterijų buvo E. faecalis, o likę 30 proc. E. faecium padermės. Kitame taip pat Slovakijoje atliktame tyrime buvo aptiktos daugiausia tos pačios padermės, nors buvo nustatyta ir E. durans, bei E. hirae, tačiau jų buvo tik keletas (50,51). Indijoje atliktame tyrime iš avių išskirtų Enterococcus bakterijų, net 90 proc. E. faecium išskirtų padermių buvo atsparios eritromicinui, o E. faecalis – 81 proc (47). Italijoje atliktame tyrime iš 89 proc. avių išskirti E. faecium turėjo daugybinį antibiotikų atsparumą: kloksacilinui, streptomicinui, kanamicinui, klindamicinui ir tetraciklinui (52).
20
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo eiga, vietos ir objektai
Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute 2019 – 2020 metais. Tiriamoji medžiaga buvo avių (Ovis aries) šeimos gyvūnų išmatų mėginiai. Jie rinkti iš trijų skirtingų avių ūkių, iš įvairaus amžiaus bei abiejų lyčių avių. Vienas avių ūkis, kuriame buvo renkami mėginiai, buvo Radviliškio rajone, kiti du ūkiai Utenos rajone. Antrame paveikslėlyje pateikta tyrimo eigos schema, kuria remiantis buvo atlikta tyrimas.
Pav. 2 Tyrimo planas
Išmatų mėginių rinkimas
Sėjimas į selektyvias terpes
Stafilokokų kultivavimas
Enterobakterijų kultivavimas
Enterokokų kultivavimas
Sėjimas antibiotikų atsparumui įvertinti Sėjimas antibiotikų
atsparumui įvertinti Sėjimas antibiotikų
atsparumui įvertinti
Gautų duomenų fiksavimas ir sisteminimas
Rezultatų analizė
21 2.2 Mėginių paėmimas ir transportavimas į laboratoriją
Išmatų mėginiai buvo renkami naudojant sterilius tamponėlius ir imami iš tiesiosios žarnos.
Sterilus tamponėlis buvo kišamas į tiesiąją žarną taip, kad nesusiliestų su išorėje esančia užteršta vilna, apie 3-5 centimetrus. Viduje perbraukiamas taip, kad liestų gleivinę ir ištraukus įdedamas į sterilią transportavimo terpę (TRANSWAB, MVE, JK), kuri yra pritaikyta aerobinių, anaerobinių, bei kitų jautrių mikroorganizmų transportavimui. Kiekvienas paimtas mėginys buvo pažymimas pagal atitinkančią avį ir ūkį iš kurio paimtas, siekiant išlaikyti atsekamumą, bei numeruojamas.
Surinkta medžiaga buvo pristatoma į laboratoriją. Transportavimo metu buvo laikoma 5 laipsnių temperatūroje esant minimaliams temperatūros svyravimais.
2.3 Mėginių kultivavimas ir identifikavimas
Pristačius į laboratoriją mėginiai iš karto buvo sėjami į mitybines terpes. Kiekvienas mėginys buvo sėjamas į tris skirtingas selektyvias ar diagnostines mitybines terpes siekiant išskirti skirtingas bakterijų rūšis. Staphylococcaceae šeimos bakterijoms išskirti buvo sėjama į Manitolio druskos (MD) agarą (Liofilchem, Italija). Manitolio druskos agaras yra specialiai sudarytas Staphylococcusšeimos bakterijų augimui. Aukštas druskos kiekis yra labai nepalankus kitoms bakterijų kultūroms.
Kultivuotos bakterijos ant šio agaro sudarė geltonos spalvos kolonijas su pasikeitusia agaro spalva aplink koloniją iš rausvos į geltoną, kas indikuoja, kad bakterijos skaido manitolį. Enterobacteriaceae šeimos Escherichia coli bakterijoms išskirti mėginiai buvo sėjamas į TBX agarą (BIOLIFE, Italija).
Šis agaras specialiai skirtas išskirti Escherichia coli bakterijai. Jos šiame agare auga specifinės mėlynos ar žalios spalvos kolonijomis. Enterococcaceae šeimos bakterijoms išskirti buvo naudojami Slanetz Bartley (Liofilchem, Italija) agaras bei Pfizer selektyvus enterokokų (Liofilchem, Italija) agaras. Pasėjus mėginį ant Slanetz Bartley agaro užaugdavo tipinės raudonos ar kaštoninės spalvos Enterococcaceae šeimai priklausančių bakterijų kolonijos. Sėjimas buvo atliekamas su tuo pačiu steriliu tamponu išėmus iš transportavimo terpės. TBX ir MD agarai buvo kultivuojami +36˚C termostate 24 valandas. Enterokokai auginti 48 valandas.
Po pirminio selektyvaus kultivavimo buvo vykdytas pakartotinis sėjimas siekiant išgryninti ir pagausinti kolonijas tolimesniam identifikavimui. E.coli gausinimui buvo naudojama MacConkey (Liofilchem, Italija) agaras. Sėjant pakartotinai, siekiant padauginti vienos kolonijos bakterijų kiekį, į MacConkey agarą, užaugdavo tipinės E.coli bakterijoms kolonijos. Jos sudarydavo rožinės ar raudonos spalvos kolonijas su aplink kolonijomis raudonomis patamsėjusiomis zonomis. o enterokokų gausinimui naudotas Kolumbijos 5 proc. avies kraujo (E&O Laboratories Limited,
22 Škotija) agaras. Stafilokokai iki rūšies identifikuoti RapID STAPH PLIUS (Remel, JAV) identifikavimo sistema. Prieš naudojant šią identifikavimo sistemą buvo atliktas katalazės testas ir patikrinama, kad bakterijos būtų Gram teigiamos. Kolonijos yra pirma praskiedžiamos specialiame skiediklyje kol yra pasiekiamas 3 MacFarland drumstumo laipsnis. Tada paruošta suspensija yra inokuliuojama į paruoštas 18 panelių, su specifinėmis reakcijomis. Įvertinus panelių spalvos pokyčius yra nustatoma tiksli stafilokokų rūšis, kuriai būdingi tokie reakcijų pokyčiai. E.coli identifikuota Microgen GnAB-ID identifikavimo sistema (Microgen Bioproducts, JK) rezultatus apdorojant Microgen kompiuterine programa (Microgen Bioproducts, JK). Enterokokų identifikavimui iki rūšies naudota Microgen STREPT-ID (Microgen Bioproducts, JK) identifikavimo sistema.
2.4 Bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymas
Siekiant nustatyti bakterijų atsparumą, naudotos bakterinės kultūros, kurios buvo padaugintos antro kultivavimo metu. Iš vienos petri lėkštelės buvo atrenkamos panašios kolonijos naudojant sterilią kilpele ir įmaišomos į 0,9 proc. sterilų fiziologinį tirpalą. Kolonijų dedama tiek kol gerai išmaišius susidaro MacFarland 0,5 drumstumas. Gautas fiziologinis tirpalas su į jį įmaišytomis kolonijomis naudojant sterilų tamponą buvo sėjamas ant mitybinių terpių. Stafilokokai bei enterokokai antibiotikų atsparumui tikrinti buvo sėjami ant Miulerio Hintono (Liofilchem, ITALIJA) agaro.
Ant pasėtos terpės paviršiaus buvo uždedami ne daugiau 7 antibiotikų (OXOID, Thermofisher, UK) diskai. Naudoti antibiotikai buvo pasirinkti siekiant įvertinti daugiausiai naudojamų antibiotikų klasių atsparumą po vieną tos antibiotikų grupės medžiagą. Naudoti antibiotikai: amoksicilinas (AML 30µg), cefoksitinas (FOX 30µg), enrofloksacinas (ENR 5µg), gentamicinas (CN 10µg), linkomicinas (MY 15µg), tetraciklinas (TE 30µg), trimetoprimo sulfonamido derinys (SXT 25µg), ciprofloksacinas (CIP 5µg), eritromicinas (E 15µg), linezolidas (LZD 30µg). Terpės su diskais kultivuojamos atitinkamai 24 ir 48 valandas. Po kultivavimo matuojama susidariusi atsparumo zona, kurioje bakterijos neaugo. Matuojamas yra apskritimo skersmuo. Atsparumo vertinimo duomenys pateikti lentelėse 1, 2 ir 3.
23 Lentelė 1.Tyrimui naudotos antimikrobinės medžiagos ir jų koncentracija, E. coli antibiotikų
atsparumo vertinimo zonos
Antibiotikas Klasė Klinikinė vertės zona E.coli
Atspari, mm Mažai jautri, mm Jautri, mm
amoksicilinas penicilinai < 14 - ≥ 14
cefoksitinas cefalosporinai < 19 - ≥ 19
enrofloksacinas fluorochinolonai <22 - ≥25
gentamicinas aminoglikozidai < 14 14-16 ≥ 17
tetraciklinas tetraciklinai ≤ 111 12-141 ≥ 151
trimetoprimo
sulfametoksazolis sulfonamidai < 11 12-13 ≥ 14
Tyrimo vertinimo rodikliai nustatyti naudojantis EUCAST rekomendacijomis.
1 – remtasi CLSI 2018m.
Lentelė 2. Tyrimui naudotos antimikrobinės medžiagos ir jų koncentracija, Staphylococcus antibiotikų atsparumo vertinimo zonos
Antibiotikas Klasė Klinikinė vertės zona Staphylococcus Atspari, mm Mažai jautri, mm Jautri, mm
amoksicilinas penicilinai < 18 - ≥ 18
cefoksitinas cefalosporinai < 22 (<18)2 - ≥ 22 (≥18)2
enrofloksacinas fluorochinolonai <16 17-22 ≥23
gentamicinas aminoglikozidai < 22 - ≥ 22
linkomicinas linkosamidai ≤ 14 15-20 ≥ 21
tetraciklinas tetraciklinai ≤ 181 19-211 ≥ 221
trimetoprimo
sulfametoksazolis sulfonamidai < 17 17-22 ≥ 23
Tyrimo vertinimo rodikliai nustatyti naudojantis EUCAST rekomendacijomis.
1 – remtasi CLSI 2018m.
2 – S. aureus vertinimas
Lentelė 3. Tyrimui naudotos antimikrobinės medžiagos ir jų koncentracija, Enterococcus antibiotikų atsparumo vertinimo zonos
Antibiotikas Klasė Klinikinė vertės zona Enterococcus Atspari, mm Mažai jautri, mm Jautri, mm
amoksicilinas penicilinai < 8 8-9 ≥ 10
ciprofloksacinas fluorochinolonai ≤ 15 16-20 ≥ 21
eritromicinas makrolidai ≤ 13 14-23 > 23
gentamicinas aminoglikozidai < 8 - ≥ 8
linezolidas oksazolidinonai < 20 20-23 > 23
tetraciklinas tetraciklinai ≤ 14 15-18 ≥ 19
Tyrimo vertinimo rodikliai nustatyti naudojantis CLSI 2018m. rekomendacijomis
24 2.5 Duomenų statistinis vertinimas
Apdoroti duomenims ir įvertinti juos statistiškai buvo naudota Microsoft Office Excel 2016 programa. Rezultatai pateikti procentinėmis ir vienetinėmis išraiškomis. Analizuojamų duomenų patikimumas apskaičiuotas naudojantis TTEST funkcija. Duomenys laikyti statistiškai patikimais esant ne didesniam 0,05 patikimumo lygmeniui. Esant p > 0,05 duomenys laikytini statistiškai nepatikimais.
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Stafilokokų tyrimas
Iš 65 tirtų mėginių buvo išskirtos 65 stafilokokų kolonijos. Po 20 mėginių iš pirmojo ir trečiojo ūkio ir 25 mėginiai iš antrojo ūkio. Buvo išskirtos 8 skirtingos stafilokokų rūšys. 32 stafilokokų padermės turėjo išvysčiusios atsparumą bent vienai tirtai antibiotikų rūšiai.
3.1.1 Stafilokokų rūšys
Lentelė 4. Stafilokokų rūšinė įvairovė
Pirmas ūkis Antras ūkis Trečias ūkis Iš viso
S.hyicus 1 0 0 1
S.xylosus 1 4 4 9
S.capitis 3 5 0 8
S.warneri 2 4 2 8
S.vitulinus 6 1 2 9
S.lentus 1 0 0 1
S.aureus 6 10 11 27
S.sciuri 0 1 1 2
Iš viso iš avių buvo išskirtos 8 stafilokokų rūšys. Lentelėje nr.: 4 matome pateiktą stafilokokų rūšinį išsidėstymą visuose ūkiuose. Pirmajame ūkyje jų įvairovė buvo didžiausia. Jame buvo rasta bent po vieną atstovą iš 7 rūšių. Antrajame ir trečiajame ūkiuose atitinkamai buvo rasto 6 ir 5 skirtingos rūšys.
Pav. 3. Stafilokokų rūšių paplitimas ūkiuose (p < 0,05)
1.5% 13.8%
12.3%
12.3%
13.8%
1.5%
41.5%
3.1%
S.hyicus S.xylosus S.capitis S.warneri S.vitulinus S.lentus S.aureus S.sciuri
26 Iš duomenų pateiktų trečiame pav. matome, kad didžiausią 41,5 proc. visų rastų stafilokokų dalį sudarė S. aureus. Po 13,8 proc. išskirtų mikroorganizmų sudarė S. xylosus ir S. vitulinus. Po 12,3 proc. bakterijų sudarė S. capitis ir S. warneri. Mažiausią dalį išskirtų stafilokokas rūšių buvo S.
sciuri, S. lentus ir S hyicus. Jos atitinkamai sudarė 3,1 proc. ir po 1,5 proc. rūšių.
3.1.2 Stafilokokų atsparumas antibiotikams
Ištyrus iš 65 mėginių išskirtas Staphylococcus spp šeimos bakterijas nustatytas atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Didžiausias atsparumas nustatytas tetraciklinui - 28 proc., o 17 proc.
padermių šiam antibiotikui buvo mažai jautrios. 22 proc. stafilokokų yra atsparūs amoksicilinui, 11 proc. –cefoksitinui, 9 proc. - gentamicinui. 5 proc. bakterijų išvystė atsparumą enrofloksacinui. 3 proc. - linkomicinui, tačiau dar 9 proc. bakterijų yra jam mažai jautrios. Mažiausiai atsparūs stafilokokai buvo sulfonamido ir trimetoprimo derinio antibiotikui. Jam išvysčiusios atsparumą buvo tik 2 proc. padermių ir 2 proc. padermių buvo mažai jautrios. Duomenys pateikti ketvirtame pav..
Pav. 4. Staphylococcus spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (p < 0,05)
5-me pav. matomas nustatytas rūšinis Staphylococcus spp. atsparumas. Apskaičiuota procentinė dalis 5 išskirtų stafilokokus rūšių. Dėl mažos imties S. sciuri, S. lentus ir S hyicus rūšių atsparumas nebuvo statistiškai patikimas. S. xylosus rūšis turi labiausiai išvystytą atsparumą amoksicilinui, 56 proc. šios rūšies padermių buvo atsparios šiam antibiotikui. Taip pat amoksicilinui buvo atsparios po 22 proc. S. aureus ir S. vitulinus padermių. Didžiausią atsparumą tetraciklinui turėjo S. aureus padermės 37 proc., Po 33 proc. atsparumą išvysčiusios S. vitulinus ir S. xylosus padermės.
S. capitis padermės didžiausią atsparumą suformavusios po 25 proc. gentamicinui ir enrofloksacinui.
89%
91%
88%
55%
97%
78%
95%
9%
17%
2%
11%
9%
3%
28%
2%
22%
5%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
FOX CN MY TE SXT AML ENR
Antibiotikai
Jautrūs Mažai jautrūs Atsparūs
27 Nei viena iš nustatytų padermių neturėjo išvystyto atsparumo sulfonamido ir trimetoprimo derinio antibiotikui.
Pav. 5 Rūšinis stafilokokų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (p < 0,05)
Pav. 6. Atsparių Staphylococcus spp. padermių pasiskirtymas ūkiuose
6-me pav. pateiktas atsparių padermių išdėstymas pagal ūkius, kuriuose mėginiai buvo rinkti. Antrame ūkyje rastas didžiausias kiekis padermių atsparių tetraciklinui ir amoksicilinui.
Atsparių padermių cefoksitinui ir gentamicinui kiekis rastas panašus visuose ūkiuose. Linkomicinui atsparios abi padermės rastos antrame ūkyje, o sulfonamido ir trimetoprimo derinio antibiotikui atspari padermė rasta trečiame ūkyje.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
FOX CN MY TE SXT AML ENR
S. aureus S. capitis S. vitulinus S. warneri S. xylosus
0 2 4 6 8 10 12
FOX CN MY TE SXT AML ENR
Padermės vnt.
Pirmas ūkis Antras ūkis Trečias ūkis
