Listeria monocytogenes padermių, išskirtų iš mažmeninėje rinkoje parduodamų žuvų produktų, identifikavimas ir serotipavimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Aušra Lozoraitytė

Listeria monocytogenes padermių, išskirtų iš mažmeninėje rinkoje parduodamų žuvų produktų, identifikavimas ir serotipavimas

molekuliniais tyrimo metodais

The molecular research methods in the identification and serotyping of Listeria monocytogenes strains in fish products in retail

Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof. dr. Artūras Stimbirys

KAUNAS 2014

2

DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Listeria monocytogenes padermių, išskirtų iš mažmeninėje rinkoje parduodamų žuvų produktų, identifikavimas ir serotipavimas

molekuliniais tyrimo metodais“ .

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

2014 – 05 – 05 Aušra Lozoraitytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

2014 – 05 – 05 Aušra Lozoraitytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

prof. dr. A. Stimbirys

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE prof. dr. M. Malakauskas

(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

(gynimo komisijos sekretorės (-riaus) parašas)

3

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 7

ĮVADAS ... 8

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Listeria genties bakterijų charakteristika ... 10

1.1.1 Listeria monocytogenes biologinės savybės ... 11

1.1.2. Listeria monocytogenes patogeniškumą lemiantys veiksniai... 12

1.2. Listeria monocytogenes paplitimas ir epidemiologija ... 12

1.2.1 Žmonių listeriozės epidemiologija ... 13

1.2.2. Gyvūnų listeriozės epidemiologija ... 15

1.2.3. Listeriozės protrūkiai pasaulyje ir Lietuvoje ... 15

1.3. Listerijų paplitimas maisto produktų perdirbimo procesuose ir galutiniuose produktuose ... 18

1.4. Bakterijų išskyrimo, identifikavimo ir skaičiavimo metodai ... 19

1.4.1. Bakteriologiniai listerijų nustatymo metodai iš produktų ir įmonių aplinkos ... 19

1.4.2. Bakterijų išskyrimui, identifikavimui naudojami molekuliniai tyrimo metodai ... 20

1.4.2.1. PGR ir kiti genetiniai bakterijų tyrimo metodai ... 21

1.4.2.1.1. Listerijų identifikavimas PGR tyrimo metodu ... 25

1.4.2.1.2. Kiti bakterijoms taikomi PGR metodai ... 26

1.4.3. Serologiniai listerijų tyrimo metodai... 27

1.5. Kiti molekuliniai Listeria monocytogenes tyrimo metodai ... 28

1.5.1. Genotipavimo metodų apžvalga ... 28

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 32

2.1. Mėginių ėmimas iš mažmeninėje rinkoje parduodamų šaltai rūkytų žuvų produktų ... 32

2.2. Listeria spp. išskyrimas LST EN ISO 11290-1:2033/A1:2005 metodu ... 32

4

2.2.1. Tyrimo eiga ... 32

2.2.2. Išskirtų bakterijų izoliatų atrinkimas molekuliniam tyrimui ... 33

2.3. Listeria spp. identifikavimas naudojant dauginę PGR ... 33

2.3.1. Dauginės PGR tyrimo eiga ... 34

2.3.2. Gautų dauginės PGR rezultatų analizė elektroforezės gelyje ... 34

2.4. Listeria monocytogenes serotipavimas ... 35

2.4.1. Serotipavimo tyrimo eiga ... 35

2.5. Statistinė duomenų analizė ... 36

3. GAUTI TYRIMO REZULTATAI ... 37

3.1. Šaltai rūkytų žuvų (lašišų) produktų užkrėstumas Listeria spp. ... 37

3.2. Šaltai rūkytų žuvų produktų užkrėstumas Listeria spp. pagal tirtų produktų rūšis ... 37

3.3. Listeria genties rūšių identifikavimas dauginės PGR metodu ... 38

3.4. Listeria monocytogenes padermių serotipavimas ... 43

REZULTATŲ APTARIMAS ... 45

IŠVADOS ... 47

REKOMENDACIJOS ... 48

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49

5

SANTRAUKA

Autorius: Aušra Lozoraitytė

Tema: Listeria monocytogenes padermių, išskirtų iš mažmeninėje rinkoje parduodamų žuvų produktų, identifikavimas ir serotipavimas molekuliniais tyrimo metodais

Darbo vadovas: prof. dr. Artūras Stimbirys

Atlikimo vieta: Darbas 2012-2014 metais atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje.

Darbo dydis: 52 puslapiai, 10 lentelių, 17 paveikslų.

Darbo tikslas: palyginti Listeria monocytogenes identifikavimui naudotus standartinį ir molekulinį metodus.

Atlikto darbo tyrimų objektas yra Listeria monocytogenes, kuri buvo išskiriama iš mažmeninėje rinkoje parduodamų šaltai rūkytų žuvų (lašišų) produktų. Tyrimai atlikti tarpusavyje derinant standartinius mikroorganizmų kultivavimo metodus ir molekulinius DNR analizės metodus.

Tyrimų metu buvo ištirta 160 šaltai rūkytų žuvų produktų, t. y. lašišų papilvės, lašišų gabalėliai, lašišų file ir lašišų nugarėlės.

Tyrimo metu nustatyta, kad šaltai rūkytų žuvų užkrėstumas listerijomis priklauso nuo produkto rūšies. Šaltai rūkytų lašišų papilvėse užkrėstumas listerijomis yra 7,5 karto didesnis nei lašišų nugarėlėse (p<0,05), 1,8 karto nei lašišų gabalėliuose (p<0,05) ir 30 kartų didesnis nei lašišų file (p<0,05).

Mikrobiologinių tyrimų metu nustatyta, kad 32,5 % (p<0,05) žuvų produktų mėginių buvo užkrėsti L. monocytogenes, o atlikus dauginę PGR nustatyta, kad L. monocytogenes buvo užkrėsti 23,13 % mėginių (p<0,01). Tai įrodo, kad molekuliniai tyrimo metodai 9,37 % yra tikslesni už mikrobiologinius tyrimo metodus.

Identifikavus L. monocytogenes padermes nustatyti du serotipai: 4b (94,6 %) ir 1/2a (5,4%).

Nustatyta, kad mažmeninėje prekyboje 31,25 % parduodamų šaltai rūkytų lašišų produktų yra užkrėsti listerijomis. Aukštas produktų užkrėstumas listerijomis rodo, kad gamyboje ir prekyboje nepakankamai laikomasi higienos reikalavimų ir toks maistas gali tapti žmonių susirgimų priežastimi.

Raktažodžiai: L. monocytogenes, lašišų produktai, molekuliniai tyrimo metodai.

6

SUMMARY

Author: Ausra Lozoraityte

Subject: The molecular research methods in the identification and serotyping of Listeria monocytogenes strains in fish products in retail

Supervisor of the work: prof. dr. Arturas Stimbirys

Location: The study was conducted in the Food Safety and Quality Department of Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences, in 2012-2014.

Scope of the work: 52 pages, 10 tables, 17 figures.

The aim of the work: Identification of the Listeria monocytogenes by comparing molecular and standard methods.

The study object is Listeria monocytogenes, which is found in the cold smoked fish (salmon) products, sold in the retail market. The study has been carried out combining standard micro- culture cultivation and molecular DNA analysis methods.

160 cold-smoked fish products, i. e. underbellies of the salmon, salmon pieces, salmon fillet and backs of the salmon was investigated during in the study.

Also it was found that contamination of the cold smoked fish products with listeria depends on the type of the product. Contamination with listeria in the underbellies of the salmon is 7.5 times higher, than in the backs of the salmon (p<0.05), 1.8 times higher, than in the pieces of salmon (p<0.05) and 30 times higher, than in the salmon fillet (p<0.05).

Microbiological researches showed that 32.5 % (p<0.05) of the fish products samples were infected with L. monocytogenes, and after the multiplex PCR was found that 23.13 % of samples (p<0.01) were infected with L. monocytogene. This prove, that molecular methods are 9.37 % more accurate, than microbiological methods.

After the identification of the L. monocytogenes strains was set two serotypes: 4b (94.6%) and 1/2A (5.4%).

It was found that 31.25 % of cold smoked salmon products that are on sale in the retail market are infected with listeria. High contamination of the products with listeria shows non- compliance with hygiene requirements at the production and trade stages, and such food may be the cause of the human disease.

Keywords: L. monocytogenes, salmon products, molecular methods.

7

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS

AFLP – amplifikuoto fragmento ilgio polimorfizmas (angl. Amplified fragment length polymorphizm, AFLP);

bp – bazių pora;

DGGE – denatūruojančio gradientinio gelio elektroforezė (angl. Denaturing – gradient gel electrophoresis, DGGE);

DNR – dezoksiribonukleorūgštis;

dNTP – nukleotidas;

IFA – imunofermentinės analizės metodas (IFA) (angl. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA);

HN – Higienos norma;

NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas;

PGR – polimerazės grandinės reakcija (angl. Polymerase chain reaction, PCR);

PLGE – pulsuojančio lauko gelio elektroforezė (angl. Pulse – field gel electrophoresis, PFGE);

RFIP – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmai (angl. Restriction fragment length polymorphism, RFLP);

RNR – ribonukleorūgštis;

rRNR – ribosominė ribonukleorūgštis;

RVASVT – rizikos veiksnių analizė svarbiuose valdymo taškuose;

SSCP – viengrandės struktūros poliformizmas (angl. Single strand conformation polymorphisms);

Š/R – šaltai rūkyta;

TGGE – temperatūros gradientinio gelio elektroforezė (angl. Temperature gradient gel electrophoresis);

T – RFLP – ribinis restrikcijos fragmentų polimorfizmas (angl. Terminal – restriction fragment length polymorphisms);

ULAC – užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras;

µl – mikrolitras;

µm – mikrometras.

8

ĮVADAS

Listeria monocytogenes – gramteigiama lazdelė, kuri geriausiai auga + 37 °C temperatūroje aerobinėse sąlygose, ir kuri yra plačiai paplitusi aplinkoje. Iš septynių Listeria genties rūšių (Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri, Listeria marthii ir Listeria grayi) potencialiai patogeniška yra Listeria monocytogenes.

Listeria monocytogenes bakterijos gali sukelti gyvūnų ir žmonių užkrečiamą ligą – listeriozę (ULAC, 2014). Šiai ligai imlios visos žmonių grupės, tačiau kai kurie asmenys šiai ligai imlesni: vyresnio amžiaus, turintys silpną imuninę sistemą, nėščios moterys, infekuoti ŽIV ir kt.

Listeriozė yra laikoma potencialiai sunkiu susirgimu, nes mirtingumas nuo šios ligos gali siekti iki 30 % (Jeyaletchumi et al., 2010).

Užteršti listerijomis maisto produktai yra dažnas infekcijos plitimo kelias. Laikoma, kad žmonės dažniausiai užsikrečia nuo šių produktų grupių: pieno produktų grupė (minkšti sūriai, ledai), mėsos produktų grupė (šaltai rūkyta, vytinta mėsa), žuvų produktų grupė (šaltai rūkytos, sūdytos, vytintos žuvys). Taip pat riziką užsikrėsti kelia vartojimui paruoštos salotos ir daržovės. Šaltai rūkyti mėsos ir žuvų produktai yra laikomi potencialiai rizikingiausiomis produktų grupėmis žmonių sveikatai, nes manoma, kad juos apdirbant nesudaromos pakankamos listerijų apdorojimo sąlygos (Gombas et al., 2003).

Bakterijų, esančių mus supančioje aplinkoje ir patenkančių į maisto produktus, identifikavimui dažniausiai yra naudojami įvairūs bakteriologiniai mikroorganizmų kultivavimo ir analizės metodai. Plačiausiai taikomas Listeria monocytogenes kultivavimo metodas yra LST EN ISO 11290-1:2003/A1:2005. Tiriant šiuo metodu laikotarpis iki rūšies patvirtinimo gali užtrukti iki šešių dienų. Tai yra gana ilgas laiko tarpas, todėl šio metodo pagrindu yra kuriamos alternatyvios diagnostinės sistemos (RAPID' L. mono ™ (Bio Rad, England) selektyvi chromogeninė terpė Listeria monocytogenes ir Listeria spp. bakterijoms aptikti ir suskaičiuoti tiesioginiai iš maisto ir aplinkos mėginių per 24 – 48 h. ir kt.). Ir vis tik šios aptikimo sistemos nėra tokios jautrios, greitos ir tikslios lyginant su molekuliniais tyrimo metodais.

Molekuliniai tyrimo metodai yra greiti ir leidžia per trumpiausią laiko tarpą identifikuoti

bakterijas iki rūšies ar serotipo (Cetecioglu et al., 2012). Atskiroms bakterijų padermėms identifikuoti

ir charakterizuoti naudojami PGR paremti metodai (Liu, 2006). PGR – tai šiuolaikinis ir modernus

molekulinės biologijos metodas, įgalinantis tiksliai, greitai ir patikimai gauti norimą rezultatą

(Ambrasienė, 2008).

9 Atlikto darbo tyrimų objektas yra Listeria monocytogenes, kuri buvo išskiriama iš mažmeninėje rinkoje parduodamų šaltai rūkytų žuvų (lašišų) produktų. Tyrimai atlikti tarpusavyje derinant standartinius mikroorganizmų kultivavimo metodus ir molekulinius DNR analizės metodus.

Darbo tikslas: palyginti L. monocytogenes identifikavimui naudotus standartinį ir molekulinį metodus.

Darbo uždaviniai:

1. Išskirti listerijas standartiniu metodu iš šaltai rūkytų žuvų (lašišų) produktų;

2. Nustatyti tiriamų mėginių užkrėstumą listerijomis;

3. Molekuliniais metodais išskirti L. monocytogenes padermes ir įvertinti metodo jautrumą;

4. Palyginti molekulinį ir standartinį identifikavimo metodus tarpusavyje;

5. Molekuliniais metodais nustatyti išskirtų L. monocytogenes padermių serotipus.

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Listeria genties bakterijų charakteristika

Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) - trumpos 0,5 x 1,0-2,0 μm dydžio lazdelės, kurios gali būti truputį lenktos ir turėti apvalius galus. Mikropreparate jos dažniausiai išsidėsto kampu ar lygiagrečiai viena su kita (Pavilonis ir kt., 2000).

Listerijos yra judrios, turi 1 – 4 žiuželius, sporų nesudaro, kapsulės neturi, gramteigiamos, senose kultūrose gali būti gramneigiamos (Liu, 2006).

1 pav. Listeria monocytogenes skenuota elektroniniu mikroskopu

( http://en.wikipedia.org/wiki/Listeria)

L. monocytogenes yra fakultatyvinis anaerobas, Geriausiai augantis mikroaerofilinėmis sąlygomis, bet gerai auga ir aerobinėmis, ir anaerobinėmis sąlygomis (Narkevičius, 2004).

Šią gentį sudaro šešios rūšys: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri ir Listeria grayi.

Tačiau, 2009 metais iš natūralios aplinkos

„Finger Lakes National Forest“ JAV buvo

išskirta nauja rūšis ir nustatyta kaip Listeria

marthii (Garrido et al., 2010). L. monocytogenes

ir L. ivanovii yra patogeninės bakterijos, bet iš jų

tik L. monocytogenes yra pagrindinis patogenas,

sukeliantis žmogaus ir gyvūnų susirgimus (Liu,

2006). Nors būna retų pranešimų apie ligas,

kurias sukelia L. seeligeri, L. ivanovii, L. innocua

(Jeyaletchumi et al., 2010).

11

1.1.1 Listeria monocytogenes biologinės savybės

L. monocytogenes paprastose mitybinėse terpėse dauginasi silpnai. Gerai dauginasi terpėse, turinčiose avino kraujo, gliukozės. Kraujo agare matoma beta – hemolizė. Kolonijos gali būti S ar R formos. Pereinant iš S į R kolonijų formą mažėja hemolizinis aktyvumas ir prarandamas virulentiškumas (Pavilonis ir kt., 2000).

Minimalus augimą užtikrinantis vandens aktyvumas A w = 0,92. Gali augti terpėje, kurioje NaCl koncentracija 10 % ir apie metus išgyventi terpėje, kurioje NaCl koncentracija 16 %.

Priklausomai nuo rūgšties tipo, gali augti terpėje, kurios pH yra nuo 4,0 iki 9,5 (optimalus 7 – 7,4).

Tinkamiausia jų kultivavimo temperatūra yra + 30 – 37 °C, nors gali augti ir esant temperatūrai nuo minus 0,4 iki + 45 °C (Narkevičius, 2004). Esant + 37 °C temperatūrai listerijos praranda gebą judėti. Jos judriausios + 22 °C temperatūroje. Po ilgos inkubacijos tam tikros padermės gali išskirti gelsvo ar rausvo pigmento (Pavilonis ir kt., 2000).

Listerijos fermentuoja gliukozę, maltozę, ramnozę, tam tikros padermės – krakmolą.

Galutinis angliavandenių skaldymo produktas laktatas (Atil et al., 2011). Listerijos negamina indolo, neskystina želatinos, neredukuoja nitratų ir nitritų (Pavilonis ir kt., 2000).

Garrido ir kiti (2010) teigia, kad hemolizę sudaro trys listerijų genties rūšys: L.

monocytogenes, L. ivanovii ir L. seeligeri (1 lentelė), visos, kurių sudėtyje yra LIPI – 1 virulentiškumo genas. Tačiau tik dvi iš šių rūšių (L. monocytogenes ir L. ivanovii) yra potencialiai patogeninės. L.

seeligeri yra retai siejama su ligomis, kurias gali sukelti žmonėms ar gyvūnams.

1 lentelė. Biocheminis listerijų rūšių identifikavimas (Garrido et al., 2010)

Rūšys Beta-

hemolizė

CAMP testo reakcija (2 pav.) Rūgšties gamyba S. aureus R. equi L - Ramnozė D - Ksilozė

L. welshimeri - - - +/- +

L. innocua - - - +/- -

L. monocytogenes + + - + -

L. seeligeri + + - - +

L. ivanovii ++ - + - +

L. grayi - - - - -

L. marthii ^a + - - - -

Pastabos:

a 16S ribosomos RNR sekos analize ir DNR-DNR hibridizacija L. marthii patvirtino savo artimesnius filogenetinius santykius labiau su L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii ir L. grayi, nei kad su L.

monocytogenes ir L. innocua.

12 2 pav. CAMP testo reakcija ant kraujo agaro

(http://www.microrao.com/micronotes/camp_test.pdf)

Listerijos gali daugintis atšaldytame (+4 – 6 °C) piene, bet greitai žūsta verdančiame vandenyje (Pavilonis ir kt., 2000). Kaitinamos 62 °C temperatūroje žūva per 35 minutes (ULAC, 2014). Listeriozės sukėlėjai jautrūs daugeliui antibiotikų, mažiau jautrūs benzilpenicilinui ir sulfanilamidams (Pavilonis ir kt., 2000). Veikiamos tiesioginių saulės spindulių žūva per 2 – 15 parų.

Jas inaktyvuoja chloro turinčios dezinfekcinės medžiagos (Atil et al., 2011). L. monocytogenes rūšies bakterijos sūdytoje mėsoje gali išgyventi iki 400 dienų, kopūstų sultyse – iki 25 dienų. Tvenkinių vandenyje listerijos išgyvena iki 3,5 mėnesio (NMVRVI, 2014).

1.1.2. Listeria monocytogenes patogeniškumą lemiantys veiksniai

L. monocytogenes gamina α ir β hemolizinus:

 α hemolizino nustatyta listerijų padermėse, išskirtose iš avių. Jis termostabilus, hemolizuoja žmogaus ir arklio eritrocitus, jam būdingas lecitinazinis aktyvumas. Šis toksinas ardo fagosomų membranas, saugodamas listerijas nuo fagosomų fermentų. Listerijos dauginasi ir, patekusios į ląstelės paviršių, „perduodamos“ pseudopodijomis kitoms ląstelėms.

 β hemolizinas yra termolabilus ir jautrus deguonies poveikiui toksinas. Hemolizinai veikia panašiai kaip endotoksinai.

 Monocitus skatinantis veiksnys susijęs su ląstele ir išsiskiria tik jai suirus. Tai yra atsparus temperatūrai (termostabilus) baltymas.

 Listerijos turi medžiagų, skatinančių alergines lėtąsias reakcijas (Pavilonis ir kt., 2000).

1.2. Listeria monocytogenes paplitimas ir epidemiologija

L. monocytogenes buvo aptikta triušių bei jūros kiaulyčių organizme daugiau kaip prieš

90 metų, tačiau ilgai nebuvo nustatyta, kad tai svarbus patogeninis mikroorganizmas, kuriuo galima

13 užsikrėsti per maisto produktus (Narkevičius, 2004). Tik po 1981 metų įvykusių kelių didelių protrūkių Šiaurės Amerikoje bei Europoje listeriozė yra žinoma, kaip svarbi per maistą plintanti liga ir nustatyta jos svarba (Zunabovic, 2011).

Listeriozės sukėlėjai plačiai paplitę visame pasaulyje, tačiau sergamumas šia sunkia infekcine liga nėra didelis palyginus su listerijų paplitimu maisto produktuose (Pavilonis ir kt., 2000).

1.2.1 Žmonių listeriozės epidemiologija

Žmonėms listeriozę sukelia L. monocytogenes genties bakterijos. Į žmogaus organizmą jos patenka alimentiniu (per vandenį ir maisto produktus, užterštus gyvūnų išmatomis), per orą (aerogeniniu) ar sąlyčio (kontaktiniu) keliu (Pavilonis ir kt., 2000).

Morobe ir kt. autoriai (2012) teigia, kad pagrindinis listeriozės plitimo kelias ─ užsikrėtimas maistu, nes žmogus gali užsikrėsti vartodamas nepakankamai termiškai apdorotus produktus.

Schlech ir kiti autoriai (1993) nurodo, kad buvo atlikti tyrimai su L. monocytogenes bakterijomis užkrėstu maistu, kad nustatyti koks užterštumo lygis galėtų būti pavojingas žmonių sveikatai. Eksperimentais su gyvūnais nustatyta, kad užkrečiamoji dozė galėtų būti apie 109 bakterijos.

Šiuo metu manoma, kad minimali žmogui pavojinga L. monocytogenes koncentracija yra nuo 100 iki 1000 KSV/1g arba 1 ml produkto (ULAC, 2014). Sergamumas šia liga yra 0,3 – 10 atvejų 1000000 gyventojų (Gombas et al., 2003).

JAV kasmet šia liga suserga apie 2500 žmonių, iš jų – 500 miršta. Europos maisto saugos tarnybos duomenimis, Europos Sąjungos šalyse 2007 m. užregistruoti ir patvirtinti 1554 žmonių susirgimo listerioze atvejai, 20 proc. sirgusių šia liga ─ mirė. Lietuvoje 2012 m. listerioze susirgo 8 žmonės (NMVRVI, 2014) ir du iš jų mirė, 2013 m. mirusiųių nebuvo (ULAC, 2014 ).

Žmonės taip pat gali būti infekcijos šaltiniu. Listerijos gali būti išskiriamos ir iš sveikų žmonių (gimdos kaklelio, nosies, išmatų) (Pavilonis ir kt., 2000). Jos aptinkamos net iki 21 % suaugusių žmonių išmatose (iki 5 % tokių nešiotojų išskiria bakterijas į aplinką, tapdami besimtomiais nešiotojais) (Gombas et al., 2003).

Listerijomis užkrėstas maistas, patekęs į žmogaus organizmą, gali pakenkti daugeliui

organų. Liga gali pasireikšti karščiavimu, raumenų skausmais, angina, akių junginės uždegimo

požymiais, limfmazgių uždegimu, kartais vėmimu ar viduriavimu (Miettinen, 2006). Jei pakenkiama

nervų sistemai, liga pasireiškia stipriais galvos skausmais, sprando sustingimu, pusiausvyros sutrikimu,

net traukuliais. (ULAC, 2014).

14 Listeriozė, kurią sukelia L. monocytogenes, gali turėti dvi formas:

1) neinvazinė listeriozė – gastroenteritinė liga su tipiškais simptomais, tokiais, kaip karščiavimas, viduriavimas ir vėmimas, trunkantis 2 – 3 dienas. Šios formos infekcija paprastai pajaučiama praėjus apie 20 valandų po listerijomis užteršto maisto produktų vartojimo (Garrido et al. 2010).

Gastroenteritine ligos forma gali susirgti visos žmonių grupės: sveiki asmenys, vyresnio amžiaus, ligoniai su nusilpusia imunine sistema bei vartojantys imuninę sistemą slopinančius preparatus, tačiau rizikos grupės asmenims listeriozės forma gali buti kaip septicemija arba meningoencefalitas (Disson et al., 2008).

2) invazinė listeriozė – pripažįstama kaip rimta per maistą plintanti liga dėl savo simptomų sunkumo (septicemija, meningitas ir kt.) ir didelio mirtingumo, nuo 20 % iki 30 %. Inkubacinis laikotarpis invazinės formos paprastai yra daug ilgesnis nei neinvazinės, nuo 20 iki 30 dienų (Garrido et al. 2010). Invazinę listeriozės formą motinos gali perduoti vaisiui per placentą (Disson et al., 2008).

Tikimybė susirgti listerioze priklauso nuo žmonių populiacijos (2 lentelė), kurios suskirstytos į rizikos grupes ir tokius duomenis pateikia Miettinien ( 2006).

2 lentelė. Tikimybė susirgti listerioze pagal rizikos grupes (Miettinen, 2006)

Populiacija Rizikos grupių sergamumas (100000

asmenų per metus) Suaugę, neturintys nusiskundimų asmenys

Vyresnio amžiaus asmenys Alkoholikai

Diabetikai Nėščios moterys

Vėžiu sergantys asmenys Turėję inkstų transplantaciją Su lėtine limfine leukemija Sergantys AIDS

Leukemija (ūmi)

0,7

2

5

5

12

15

100

200

600

1000

15

1.2.2. Gyvūnų listeriozės epidemiologija

Listerijų turi laukiniai, naminiai gyvūnai ir graužikai, todėl šios bakterijos plačiai paplitusios gamtoje. Laukiniai ir naminiai gyvūnai yra pagrindinis ligos sukėlėjų rezervuaras (Atil et al., 2011). Gyvūnai dažniausiai užsikrečia per maistą alimentinių būdu, nors galimas ir transmisinis – įkandus erkei (Pavilonis ir kt., 2000). L. monocytogenes bakterijų daugiausia aptinkama dirvožemyje ir pūvančioje žolėje, kuria minta laukiniai gyvūnai. Fermose auginamų galvijų pagrindinis infekcijos šaltinis yra silosas (CIDRAP, 2014).

Nors L. monocytogenes gali infekuoti daugelio rūšių gyvūnus, tačiau listerioze dažniausiai serga atrajotojai (avys, ožkos, karvės). Paukščiai dažniausiai yra bakterijų nešiotojai, tačiau sporadiniai listeriozės atvejai užfiksuoti ir tarp paukščių rūšių (ULAC, 2014). Galime teigti, kad listeriozė yra svarbi veterinarijos problema, kadangi L. monocytogenes yra dažna galvijų ligų priežastis.

Daugeliui gyvūnų bakterija nesukelia sunkių infekcijų, tačiau būna ir epizootijų, sukeliančių savaiminius abortus, turinčių septinę ligos formą ir meningitus. Listerijas gyvūnai į aplinką išskiria su pienu, šlapimu, išmatomis, nosies išskyromis (Pavilonis ir kt., 2000).

1.2.3. Listeriozės protrūkiai pasaulyje ir Lietuvoje

Listeriozė nėra dažnai registruojama infekcinė liga, tačiau ji labai pavojinga žmonėms, kurie yra rizikos grupėje. Lietuvoje kasmet užregistruojami pavieniai šios infekcinės ligos atvejai.

Europos Sąjungos (ES) šalyse kasmet užregistruojama per 1,5 tūkstančio listeriozės atvejų, iš kurių daugiau kaip 50 proc. atvejų tarp žmonių, vyresnių nei 65 metų. Europos ir kitose pasaulio šalyse kilę šios infekcijos protrūkiai rodo, kad maistu plintanti listeriozė yra svarbi problema daugelyje pasaulio šalių.

Garrido ir kt. autorių (2010) nuomone dauguma pasitaikančių listeriozės atvejų yra

atsitiktiniai, tačiau pasitaiko nemažai protrūkių. Protrūkiai tiriami nedelsiant, kadangi jų dėka gali būti

nustatyti užsikrėtimo šaltiniai (kurie labai sunkiai nustatomi pavieniais atvejais). Liu (2006) teigia, kad

serotipai 4b yra dažniausiai išskiriami žmonių epidemijų metu, o 1/2a ir 1/2b atsakingi už pavienius

atvejus. Dauguma protrūkių ES per paskutinius 30 metų buvo susiję su šiais maisto produktais: pienu ir

jo produktais, minkštaisiais sūriais, paštetais, dešromis, rūkyta žuvimi, salotomis, delikatesais ir

paruoštais vartoti produktais.

16 3 lentelė. Listeriozės protrūkiai 2000 – 2010 m. Europoje (Garrido et al. 2010)

Metai Šalis Maisto

produktas

Atvejų

skaičius Serotipas 2000 ^a Naujoji

Zelandija

Delikatesinė paruošta vartojimui mėsa

31 1/2

2000 JAV Delikatesinė

kalakutiena 30 1/2a

2000 – 2001

JAV Meksikietiškas

sūris 13 4b

2001 ^a Švedija Pieno

produktai 42 1/2a

2001 ^a Japonija Sūris 38 1/2b

2002 ^a JAV Delikatesinė

kalakutiena 16 4b

2002 Kanada Sūris 17 4b

2003 JAV Sūris iš žalio

pieno 12 4b

2003 Jungtinė Karalystė

Sumuštiniai

4 1/2

2005 Šveicarija Sūris 10 1/2a

2006 Čekija Sūris ir salotos 75 1/2b

2007 JAV Pasterizuotas

pienas 5 N ^b

2006 – 2007

Vokietija Dešrelės

16 4b

2008 Kanada Paruošta

vartoti mėsa 57 1/2a

2008 Čilė Brie ir

Kamambero sūris

119 N ^b

2009 Danija Jautiena 8 N ^b

2008 Austrija Šaltiena 19 4b

2009 – 2010

Vokietija, Austrija ir Čekija

„Quargel“

sūris 34 1/2a

Pastabos:

a - Virškinamojo trakto listeriozė; ^b – Nenustatyta

17 Iš 3 lentelės matome, kad dauguma pateiktų protrūkių yra susiję su apdorotu maistu:

delikatesais, paruoštais vartoti mėsos ir sūrio produktais. Du iš 3 lentelėje pateiktų protrūkių sukėlė maistas, kuris vartojamas ligoninėse (Jungtinė Karalystė 2003 metai ir Vokietija 2006-2007 metai). Šie protrūkiai įrodo RVASVT svarbą maisto produktų gamybos metu norint užtikrinanti, kad gaunamas maistas būtų saugus (Garrido et al., 2010).

Galime pastebėti, kad daugumą listeriozės atvejų sukelia serotipas 4b, kuris izoliuotas nuo užterštų maisto produktų. O didžiausią paplitimą turi serogrupė 1/2. Naujausi tyrimai rodo, kad didėja maisto produktų užterštumas serotipu 1/2a.

2009 m. birželio – 2010 m. vasario mėn. Austrijoje, Vokietijoje ir Čekijoje užregistruotas L. monocytogenes protrūkis, kurio priežastis buvo užkrėsto listerijomis sūrio „Quargel“ vartojimas.

Protrūkio metu užregistruoti 34 žmonių susirgimo listerioze atvejai (ULAC, 2014).

Daugiausia atvejų užregistruota Austrijoje. Šioje valstybėje L. monocytogenes užsikrėtė 25 žmonės (iš jų 4 išsivystė infekcijos komplikacija – meningitas). Vokietijoje užregistruoti – 8, o Čekijoje – 1 susirgimo listerioze atvejis. Nustatyta, kad vidutinis susirgusiųjų amžiaus vidurkis – 72 metai, daugumą jų sudarė vyrai.

Protrūkio metu vaisiaus užkrėtimo listerioze nuo nėščios motinos atvejų neužregistruota.

Iš 34 susirgimo listerioze atvejų 8 atvejais infekcija baigėsi mirtimi (ULAC, 2014).

Siekiant sustabdyti protrūkio plitimą, sūris „Quargel“ buvo išimtas iš Austrijos, Vokietijos, Slovakijos ir Čekijos rinkų. Šis protrūkio tyrimas atskleidė keletą svarbių aspektų. Vienas jų – L. monocytogenes molekulinio tipavimo svarba. Protrūkis liktų neišaiškintas, jei nebūtų atliekamas įprastinis iš žmogaus klinikinės medžiagos išskirtos L. monocytogenes tipavimas (Garrido et al., 2010).

Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras pateikia duomenis apie sergamumą listerioze

Lietuvoje 2004 – 2012 metais (3 paveikslas). Iš pateiktų duomenų matome, kad per paskutinius devynis

metus Lietuvoje buvo užregistruoti 42 listeriozės atvejai, sergamumas listerioze per šį laikotarpį

padidėjo nuo 0,02 iki 0,3 atvejų 100 tūkstančių gyventojų. Didžiausi sergamumo rodikliai buvo

vyresnių nei 65 metų žmonių grupėse. Apie 70 proc. ligonių pradžioje ligos nebuvo įtariama listeriozės

diagnozė. Mirštamumas nuo listeriozės Lietuvoje apie 25 proc.

18 3 pav. Susirgimų listerioze skaičius Lietuvoje 2004 – 2012 metais (ULAC, 2014)

1.3. Listerijų paplitimas maisto produktų perdirbimo procesuose ir galutiniuose produktuose

L. monocytogenes yra labai plačiai paplitęs mikroorganizmas aplinkoje. 2008 m.

kiaulienos užkrėstumas L. monocytogenes bakterijomis ES šalyse vidutiniškai siekė iki 9 proc., vištienos ir kitos paukštienos – apie 16 proc., žuvies – apie 18 proc., sūrių – iki 4 proc. (ULAC, 2014 ).

Tai rodo, kad listerijų atžvilgiu turi būti kontroliuojami visi galimi aplinkos ir maisto produktų gamybos procesai.

L. monocytogenes yra aptinkama upių, kitų gėlojo vandens telkinių, jūrų vandenyje.

Daugiausia L. monocytogenes bakterijomis yra užteršti vidaus vandens telkiniai, į kuriuos patenka pramonės arba kaimo vietovių nuotekos, tuo tarpu toli nuo pakrančių esančiame vandenyno ar šaltinių vandenyje šių mikroorganizmų neaptikta. Žuvų mikroflora priklauso nuo aplinkos, kurioje jos gyvena ir kur sužvejojamos (Lunden et al., 2004).

L. monocytogenes gali plisti maisto pramonės įmonėse patekusi su žaliava taip

užteršdama įrenginius, gamybos aplinką, sūrymą, darbuotojų pirštines, peilius ir t. t. (Narkevičius,

2004). Reikia pabrėžti, kad L. monocytogenes ant nerūdijančio plieno įrenginių paviršiaus gali sudaryti

taip vadinamą „bioplėvelę“, dėl ko mikroorganizmas tampa daug atsparesnis plovimo bei

dezinfekavimo medžiagoms. Pagrindinės maisto produktų gamybos proceso operacijos, galinčios turėti

įtakos L. monocytogenes augimui, yra terminis apdorojimas, šaldymas (žaliavos arba produkto),

sūdymas ir rūkymas (Narkevičius ir kt., 2004).

19 L. monocytogenes buvo aptikta šviežiose, šaldytose, rūkytose, vytintose ir sūdytose jūros gėrybėse. Ligos protrūkių įvairiose pasaulio šalyse priežasčių analizė parodė, kad sukėlėjas dažniausiai plinta per maistą, kuris prieš vartojimą papildomai neapdorojamas karščiu (Bremer et al., 2003).

Ši bakterija skirtingai nei kitų rūšių bakterijos, kurios taip pat plinta per maistą, turi unikalią savybę kauptis maisto produktuose, kurie laikomi šaldytuvuose. Ilgai šaldytuve laikomas maistas, kuris yra užterštas L. monocytogenes bakterijomis, kelia susirgimų ir protrūkių riziką (Lorber et al., 2005).

Noriega Orozco (2000) teigimu, L. monocytogenes plitimas žuvų produktuose priklauso nuo keleto veiksnių, kuriuos galima skirstyti:

a) vidiniai: pH, vandens aktyvumas, konservantai, maisto priedai ir pan;

b) išoriniai: laikymo temperatūra, atmosfera pakuotėje ir pan;

c) kiti veiksniai: konkuravimas su kitais mikroorganizmais.

Klæboe ir kiti (2010) atliko tyrimą Norvegijos šaltai rūkytų lašišų ir kitų žuvies produktų įmonėse ir nustatė, kad aptikimo norma tarp atskirų produktų svyruoja nuo 5 iki 15 % per pastaruosius 10 metų.

1.4. Bakterijų išskyrimo, identifikavimo ir skaičiavimo metodai

Norint garantuoti vartotojų saugumą ir produktų kokybę, reikalingi greiti ir patogesni metodai bakterijoms nustatyti ir identifikuoti. Išskyrimo metodai:

 Klasikiniai kultivavimo;

 Greitieji: serologiniai (imunologiniai) ir molekuliniai (genetiniai) tyrimo metodai.

Molekulinių metodų taikinys ląstelėje tai: chromosomos, ribosomos ir plazmidės. Tiriamos bakterijų DNR ir RNR.

1.4.1. Bakteriologiniai listerijų nustatymo metodai iš produktų ir įmonių aplinkos

Bakteriologiniai tyrimai atliekami pagal LST EN ISO 11290-1:2003/A1: 2005 Maisto ir pašarų mikrobiologija. Monocitogeninių listerijų (Listeria monocytogenes) aptikimas ir skaičiavimas.

Bendrasis metodas. 1 dalis. Aptikimo metodas. 1 keitinys. Išskiriamos terpės ir hemolizės tyrimo

pakeitimas, glaudumo duomenų pateikimas.

20 Šio metodo tikslas – grynosios mikroorganizmų kultūros iš tiriamojo ėminio išskyrimas ir identifikavimas. Išskiriant grynąsias bakterijų kultūras sudaromos sąlygos, kuriomis geriausiai dauginasi ieškomas mikroorganizmas. Tiriamasis bandinys sėjamas į mikroorganizmų dauginimosi poreikius atitinkančias mitybines terpes ir kultivuojama tam tikroje temperatūroje.

Tyrimui imamas standartinis kiekis tiriamosios medžiagos (25 gramai) ir sėjamas į pirminį selektyvųjį gausinimo sultinį (225 mililitrų pusės stiprumo Frazerio sultinio (Oxoid, England)).

Toliau pagal standartą atliekami persėjimai į antrinį pagausinimą ir selektyviąsias terpes. Šiame tyrime išskiriamos listerijos iš šaltai rūkytų žuvų gaminių.

Bakteriologiniai tyrimai turi neigiamų pusių: reikalauja daug rankų darbo, ilga analizės trukmė, subjektyvus duomenų vertinimas (susijęs su asmens stebėjimais), vidutiniškas pakartojamumas (priklauso nuo laboratorijos programos, personalo įgūdžių). Metodų privalumai: maža aparatūros ir medžiagų kaina, paprasta atlikti (Jonkuvienė ir kt., 2009).

1.4.2. Bakterijų išskyrimui, identifikavimui naudojami molekuliniai tyrimo metodai

Molekuliniai metodai plačiai pritaikyti aplinkos mikroorganizmams tirti. Iki šiol buvo išskirta apie 19,000 aplinkos mikrobų rūšių, tačiau reikia pripažinti, kad šis skaičius yra tik maža dalis iš didžiulės įvairovės (Cetecioglu et al., 2012). Bakterijų, esančių mus supančioje aplinkoje ir patenkančių į maisto produktus, analizei dažniausiai yra naudojami įvairūs bakteriologiniai mikroorganizmų kultivavimo ir analizės metodai.

Tiriant sudėtingas ir labai skirtingas mikroorganizmų sankaupas jų natūraliose ekosistemose, buvo suprasta, kad klasikiniai kultivavimo metodai turi nemažai trūkumų. Nepaisant visų atsiradusių trūkumų, klasikiniai metodai yra nepakeičiami, kai reikia nustatyti mikroorganizmų morfologinius, fiziologinius ir biocheminius požymius bei ištirti metabolines savybes (O'Sullivan, 2000).

Bakterijoms charakterizuoti ir nustatyti labai svarbūs molekuliniai metodai, ypač polimerazės grandinės reakcija (PGR) (angl. Polymerase chain reaction, PCR) paremti metodai (Beasley, 2004). Kadangi, šiuo metu bakterijų klasifikacija remiasi 16S ribosominės RNR (rRNR) geno sekų analize.

Dažniausiai naudojami greitieji molekuliniai metodai bakterijoms:

• Polimerazės grandinės reakcija (angl. Polymerase chain reaction, PCR);

21

• Denatūravimo gradiento gelio elektroforezė (angl. Denaturing – gradient gel electrophoresis, DGGE);

• Temperatūros gradiento gelio elektroforezė (angl. Temperature – gradient gel electrophoresis, TGGE);

• Viengrandės struktūros poliformizmas (angl. Single strand conformation polymorphisms SSCP);

• Ribinis restrikcijos fragmentų polimorfizmas (angl. Terminal-restriction fragment length polymorphisms T-RFLP).

Šie metodai pritaikyti identifikuoti mikrobų įvairovę įvairiose aplinkose. (Cetecioglu et al., 2012).

1.4.2.1. PGR ir kiti genetiniai bakterijų tyrimo metodai

Besivystant biomedicinos ir kitoms mokslo kryptims buvo išvystyta daug molekulinės biologijos ir biotechnologinių metodų, kuriais buvo siekiama sumažinti tyrimų išlaidas ir gauti tikslesnius ir greitesnius tyrimų rezultatus. Jie buvo pritaikyti medicinoje, biologijoje, teisminėje ekspertizėje ir veterinarijoje, o tai įgalino gerokai sumažinti tyrimus in vivo. Vienas iš veiksmingiausių ir dažniausiai pastaruoju metu moksliniuose tyrimuose naudojamų tyrimo metodų yra polimerazės grandinės reakcija (PGR) (Ambrasienė, 2008).

PGR - genetinis metodas, naudojamas bakterijoms nustatyti maisto produktuose. Tai metodas, leidžiantis in vitro gauti didelį kiekį specifinių DNR fragmentų iš mažo kiekio kompleksinio junginio. Polimerazinei grandininei reakcijai vykdyti reikalingi du pradmenys, apribojantys tiriamą seką ir orientuoti 5’→ 3’ kryptimi. Pradmenys hibridizuojasi su priešingomis DNR grandinėmis ir, pridėjus DNR polimerazės, sintezės reakcija vyksta ant abiejų pradinės DNR grandinių, apribotų pradmenimis (Jonkuvienė ir kt., 2009). PGR metodas remiasi fermentiniu DNR fragmentų dauginimu naudojant oligonukleotidų pradmenis. Šie pradmenys leidžia padauginti tam tikras DNR sekas.

Iš pradžių aukšta temperatūra atskiriamos DNR grandinės. Vėliau temperatūra

pažeminama ir pradmuo prisijungia prie komplementaraus DNR fragmento. Po to vyksta

polimerizacijos reakcija ir gaminamos komplimentarinės grandinės. Vyksta trijų žingsnių ciklai, kurie

kartojami 30-40 kartų 4 pav. (Somma et al., 2014).

4 pav. Polimerazės grandinės reakcijos žingsniai (Somma et al., 2014)

Yra trys pagrindiniai PGR žingsniai, kurie kartojasi 30 arba 40 ciklų. Tai daroma automatizuotai termocikleryje, kuris gali šildyti ir vėsinti reakcijos mišinį per labai trumpą laiką. PGR etapai:

1. DNR denatūracija. DNR denatūruojama, kad būdama viengrandė vėliau galėtų prisijungti pradmenis. Denatūracijai naudojama + 94 – 95 ^o C temperatūra. Pradinė denatūracija vykdoma 3 – 5 min., siekiant pilnai denatūruoti taikinio DNR. Vėliau, kiekvieno ciklo metu, denatūracijai užtenka 30 – 50 sekundžių (http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html).

2. Pradmenų prijungimas. Šio etapo efektyvumas priklauso nuo pradmenų sekos teisingo parinkimo ir tinkamos prijungimo temperatūros parinkimo. Pradmenys yra viengrandžiai oligodeoksiribonukleotidai (tiesioginis ir grįžtamasis). Pradmenų prijungimas yra komplementarus jų prisijungimas prie „taikinio“ DNR. Tarp adenino (A) ir timino (T) bazių susidaro dvi, o tarp guanino (G) ir citozino (C) – trys vandeniliniai ryšiai. Paprastai pradmenys prijungiami + 55 – 60 ^o C temperatūroje. Jei pradmenys nėra visiškai komplementarūs, jie hibridizuosis žemesnėje temperatūroje ir su tokiais pradmenimis gaunamas mažesnis PGR jautrumas ir specifiškumas (Somma et al., 2014).

3. DNR sintezė. DNR polimerizacija atliekama + 72 ^o C temperatūroje. DNR sintezės laikas

priklauso nuo amplikono ilgio ir naudojamos DNR polimerazės greičio. Paskutinio ciklo metu

paprastai naudojamas trigubai ilgesnis polimerizacijos laikas, kad būtų pilnai užbaigtas

23 paskutinio ciklo metu gautas didelis DNR kopijų skaičius, esant jau sumažėjusiam nukleotidų kiekiui. (http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html).

Taip kartojant ciklus per kelias valandas galima pagaminti tūkstančius specifinių DNR fragmentų kopijų.

5 pav. Polimerazinės grandinės reakcijos pradinių ciklų schema (Somma et al., 2014)

PGR privalumai ir trūkumai. Tai ypač tikslus, greitas, jautrus ir pasižymintis specifiškumu metodas. Iki šiol nebuvo tokio metodo, kuriam reiktų tiek mažai tiriamosios medžiagos.

Reakcijos sąlygos sumodeliuojamos taip, kad būtų dauginamas tik ieškomas DNR fragmentas (McPherson et al., 2000).

Ambrasienė (2008) pabrėžia apie didžiulį metodo jautrumą, kuris kelia ir problemų: reikia labai saugotis, kad į reakcijos mišinį nepatektų šalutinės DNR priemaišos. Todėl tyrimams ir laboratorijoms, kuriose taikomas šis metodas, keliami labai aukšti reikalavimai. Kad reakcija vyktų sklandžiai, reikia labai tiksliai parinkti reakcijos sąlygas (temperatūrą, koncentracijas, ciklų kiekį ir trukmę), visi reagentai turi būti itin aukšto švarumo laipsnio.

Denatūravimo/temperatūros gradiento gelio elektroforezė (DGGE/TGGE). Pradėtas taikyti maisto mikrobiologijoje nuo 1999 metų. Šie metodai paremti tam tikrų 16S rRNR geno sekų palyginimu. 200 – 500 bp fragmentai atskiriami poliakrilamidiniame gelyje naudojant skirtingus temperatūros gradientus. Dėl skirtingos tirpimo temperatūros, kuri priklauso nuo fragmento ilgio, GC kiekio ir sekos, fragmentai išsidėsto skirtingai (Seidavi, 2012). Metodo principas pavaizduotas 6 pav.

Šiuo metodu tiriami maisto produktai tokie kaip: mineralinis vanduo, vynas, dešros, pieno produktai, jautiena, žuvis (Cetecioglu et al., 2012).

Pagrindiniai metodo privalumai: pasižymi aukštu atskiriamumu bei lengvu rezultatų

interpretavimu; fragmentai gali būti sekvenuojami. Trūkumai: žemas pakartojamumas – daug rankinio

24 darbo; mažas jautrumas – prarandama daug fragmentų; sudėtinga parinkti atitinkamus pradmenys, kad atspindėti kuo didesnę bakterijų populiaciją; dvigubi fragmentai; nedidelių (iki 500 bp) fragmentų atskyrimas (Cetecioglu et al., 2012; Seidavi, 2012).

6 pav. DGGE principas (A: organizmas a, B: organizmas b, C: organizmas c, D: organizmas d, E: organizmas E, M:sumaišytas mėginys) (Cetecioglu et al., 2012)

Viengrandės struktūros poliformizmas (SSCP). Dažnai populiaciniuose tyrimuose kaštai ir pastangos pilnai sekvenuoti visus PGR produktus yra per didelės. Tam buvo sukurtas SSCP metodas. Jo esmė yra ta, kad denatūruota viengrandė kelių šimtų bazių ilgio DNR grandinė sudaro skirtingą struktūrą, net jei skiriasi tik vienu nukleotidu (7 pav.). Skirtingos struktūros gali buti aptinkamos elektroforezės pagalba. SSCP – panašus į DGGE. SSCP dažniausiai naudojamas siekiant nustatyti mikrobų rūšį įvairiose aplinkose, natūralioje ekosistemoje. Maisto produktų tyrimuose pritaikytas tirti sūrius. Pagrindinis trūkumas, kad susidaro dvigubi fragmentai (Cetecioglu et al., 2012).

7 pav. SSCP žingsniai (a: denatūracija ds DNR, b: elektroforezė) (Cetecioglu et al., 2012)

25 Ribinis restrikcijos fragmentų polimorfizmas (T-RFLP). T-RFLP tai DNR žymenų sistema, leidžianti nustatyti nukleotidų sekų skirtumus tarp DNR molekulių (genetinius skirtumus), pagal restriktazėmis sukarpytų ir specialių markerių pažymėtų DNR fragmentų dydį.

RFLP veikimas pagrįstas DNR molekulės sukarpymu restriktazių pagalba (restriktazės tai specialūs enzimai (fermentų rūšis) kurie kerpa DNR grandinę specifinėse vietose) ir veikiant elektros laukui įvairaus dydžio DNR fragmentai juda nevienodai, sudarydami specifinius DNR fragmentų profilius (8 pav.). Sukarpyta DNR hibridinama su radioaktyviais žymenimis, kurie jungiasi tik prie tam tikrą seką turinčių DNR fragmentų (http://www.plantbionet.lt/index.php?page=details&id=63%29). Šis metodas tinka dideliam mėginių kiekiui tirti. Atskiriamumas priklauso nuo naudojamų restrikcijos fermentų ir jų kiekio. Trūkumai – per didelis fragmentų kiekis kiekvienai populiacijai tirti, reikalingas optimizavimas. Pritaikytas žuvies, jogurto, sūrių ir cukraus mikroorganizmams tirti (Cetecioglu et al., 2012).

8 pav. Restriktazė EcoRI kerpa DNR grandinę ties seka GAATTC.

(http://www.plantbionet.lt/index.php?page=details&id=63)

1.4.2.1.1. Listerijų identifikavimas PGR tyrimo metodu

PGR metodai yra jautrūs ir labai specifiniai, tai pagerina tikimybę greitai aptikti listerijų

rūšis (Kaur et al., 2007). Šis metodas padeda nustatyti patogeninius mikroorganizmus maisto

produktuose (Ambrasienė, 2008). Be to, Kaur ir kitų mokslininkų (2007) teigimu PGR metodai buvo

sėkmingai taikomi aptikti ir identifikuoti patogeninius organizmus iš klinikinių ir aplinkos mėginių.

26 L. monocytogenes genams nustatyti gali būti taikomi skirtingi PGR metodai (McPherson et al., 2000). Šiame tyrime listerijos iki rūšies buvo identifikuotos naudojat dauginę PGR (angl.

multiplex PCR).

Dauginė PGR. Gausinimo reakcija, kurios metu padauginami ne vienas, o keletas DNR sekų yra vadinama daugine PGR. Tokio tipo PGR leidžia sutaupyti eksperimentinio darbo ir laiko sąnaudas, nes į reakcijos mišinį yra dedamos kelios ar keliolika pradmenų porų. Dauginė PGR pakankamai dažnai naudojama ir mokslinėje, ir medicininės diagnostikos praktikoje. Dauginės PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dėmesio reakcijos sąlygų optimizacijai. Tai pradmenų koncentracija, PGR buferio sudėtis, magnio chlorido ir nuleozidtrifosfatų (dNTP) koncentracijų balansas, DNR mėginio ir termostabilių polimerazių koncentracija bei gausinimo režimas. Sėkminga dauginių PGR optimizacija padidina reakcijos jautrumą, specifiškumą, netolygų analizuojamų sričių gausinimo efektyvumą ( Ambrasienė, 2008).

1.4.2.1.2. Kiti bakterijoms taikomi PGR metodai

Yra žinoma daugybė PGR modifikacijų, kurios naudojamos eksperimentinėje biologijoje, medicinoje, mikrobiologijoje bei kitose srityse.

PGR metodų modifikacijos:

 Lizdinė PGR (angl. nested PCR) – atliekamos dvi PGR reakcijos, kurių metu naudojamos dvi skirtingos pradmenų poros. Iš pradžių atliekama PGR su viena pradmenų pora. Tada šios reakcijos produkto dalis yra įnešama į antrą gausinimo reakciją (Lelešius ir kt., 2007);

 Atvirkštinė PGR – tai RNR dauginimo būdas. Fermento atvirkštinės transkriptazės pagalba RNR yra verčiama į DNR. Susintetinta DNR toliau naudojama antros grandinės sintezei ir dauginimui (Ambrasienė, 2008);

 Karšto taško PGR (angl. hot start PCR) – ši PGR naudojama norint sumažinti pašalinių produktų kiekį ir foną ir padidinti reakcijos jautrumą. Pradmenys žemoje temperatūroje gali prilipti prie DNR (gali prasidėti DNR fragmento sintezė). Jei prieš prasidedant sintezei mišinį pakaitinsime, galime išvengti nespecifinių produktų sintezės (Ambrasienė, 2008);

 Asimetrinė PGR – naudojama, kai norima padauginti vieną DNR grandinę. Toks PGR

produktas kai kada naudojamas sekvenavimui ar hibridizacijai, kai reikalinga viena iš

komplimentarių grandinių (Ambrasienė, 2008);

27

 Kiekybinė tikro laiko PGR – naudojamame, kai norime nustatyti PGR produkto kiekį. Šiuo metodu yra nustatomas ne tik produkto susidarymas, bet ir kiek jo susidarė. Susidariusio produkto kiekis esamu laiku matuojamas naudojant fluorescuojančius žymenis (Seidavi, 2012);

 Ir kt.

1.4.3. Serologiniai listerijų tyrimo metodai

Imunofermentinės analizės (IFA) (angl. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) metodas yra pastarojo dešimtmečio imunologijos, biochemijos, molekulinės biologijos pasiekimų rezultatas. Tai vienas iš greitųjų imunologinių metodų. IFA yra vienas jautriausių imunocheminių metodų, prilygstantis radioimuniniam metodui (http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA). IFA testai yra naudojami medžiagoms, turinčioms antigeninių savybių (hormonų, bakterinių antigenų ir antikūnių), nustatyti. Yra daug šio metodo variacijų, bet pagrindinis veikimo principas yra antigeno fiksavimas ant kieto paviršiaus ir antikūnio nuplovimas nuo sorbento paviršiaus. Antikūnis yra sujungtas su fermentu, kuris, pridėjus reikiamo substrato, virsta į aptinkamą signalą, nurodantį antigenų buvimą mėginyje.

Substratais gali būti naudojami chromogenai arba fluorogenai, dėl kurių įvyksta spalvinė tirpalo reakcija (9 pav.) (Jonkuvienė ir kt., 2009). IFA testas gali būti naudojamas kaip greitas būdas identifikuoti bakterijų kolonijas, išskirtas nuo selektyvaus agaro (http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA).

9 pav. IFA metodo pagrindiniai etapai (Jonkuvienė ir kt., 2009)

Serotipavimas. Listerijų rūšys turi termiškai stabilius somatinius O ir šilumai neatparius H antigenus, kuriais remiantis jos skirstomos į serotipus (Doumith et al., 2004). Yra žinoma 15 somatinių (O) antigenų potipių (I-XV), o žiuželiniai (H) antigenai sudaro keturis potipius (A-D).

Individualūs Listeria padermių serotipai nustatomi pagal jų unikalias O ir H antigenų kombinacijas.

Yra žinoma 13 L. monocytogenes serotipų: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e ir 7

(Narkevičius, 2004). Jeyaletchumi ir kiti autoriai (2010) teigia, kad serotipai 1/2a, 1/2b ir 4b sudaro 98

28

% iš žmonių ir gyvūnų išskirtų L. monocytogenes bakterijų, o serotipai 4a ir 4c yra retai siejami su ligos protrūkiais. O Doumith ir kiti (2004) ištyrė, kad serotipai 1/2a, 1/2b, 1/2c ir 4b sudaro 95 % iš žmonių ir maisto produktų išskirtų L. monocytogenes bakterijų. 4b yra Europoje, Kanadoje bei JAV dominuojantis serotipas, sukeliantis didžiąją dalį listeriozės susirgimų (Narkevičius, 2004). Anot Pavilonio ir kitų autorių (2000) nustatyta, kad 4b serovaro listerijos sukelia listeriozės epidemijas, susijusias su sūriu, gaminamu iš netinkamai pasterizuoto pieno.

4 lentelė. Listerijų serotipų somatinių O ir žiuželinių H antigenų kombinacijos (Liu, 2006) Serotipai O antigenai H antigenai

1/2a I, II A, B

1/2b I, II A, B, C

1/2c I, II B, D

3a II, IV A, B

3b II, IV A, B, C

3c II, VI B, D

4a (V), VII, IX A, B, C

4b V, VI A, B, C

4c V, VII A, B, C

4d (V), VI, VIII A, B, C

4e V, VI, (VIII), (IX) A, B, C

7 XII, XIII A, B, C

5 (V), VI, (VIII), X A, B, C

6a V, (VI), (VII), (IX), XV

A, B, C 6b (V), (VI), (VII), IX,

X, XI

A, B, C

1.5. Kiti molekuliniai Listeria monocytogenes tyrimo metodai 1.5.1. Genotipavimo metodų apžvalga

Genetinė patogenų charakteristika yra viena iš svarbiausių dalių epidemiologiniuose

tyrimuose protrūkių metu. Gauti duomenys apie bakterijų genetinę įvairovę gali būti naudojami

vykdant vietinius epidemiologinius tyrimus ir naudojami pasauliniu lygiu. Vienas iš pagrindinių

29 privalumų bakterijoms charakterizuoti DNR pagrindu paremtuose molekuliniuose metoduose yra duomenų gavimas kompiuterinių sistemų pagalba, kurie gali būti saugomi ir dalijami skirtingoms laboratorijoms visame pasaulyje. Tipavimo metodai yra pasirenkami atsižvelgiant į keletą veiksnių:

tipavimą, diskriminacinę galią ir pakartojamumą. Tipavimas yra apibūdinamas kaip gebėjimas interpretuoti rezultatus; diskriminacinė galia - kaip metodas gebantis atskirti nekloninius izoliatus ir pakartojamumas – galimybė gauti tuos pačius rezultatus tarp skirtingų laboratorijų ir personalo (Foley et al., 2009). DNR fragmentų analize paremti genotipavimo metodai: PFGE, RFLP, AFLP, ribotipavimas ir kt metodai.

Amplifikuoto fragmento ilgio polimorfizmas (angl. Amplified fragment length polymorphizm, AFLP) tai DNR žymenų sistema, leidžianti nustatyti nukleotidų sekų skirtumus tarp DNR molekulių (genetinius skirtumus), pagal specialiais enzimais sukarpytų, specialių žymenų atrinktų ir polimerazės grandinės reakcijos (PGR) pagausintų DNR fragmentų dydį. AFLP tai restriktazių karpymo tikslumo ir PGR efektyvumo derinys. Dominantinė sistema, nes polimorfizmas nustatomas pagal tam tikrų sekų buvimą arba nebuvimą (PGR pradai jungiasi arba ne). Tai tiksli technologija, leidžianti nustatyti skirtumus tarp individualių genotipų. Galima analizuoti tiek bendrą genominę DNR (tDNR) tiek komplimentarią DNR (cDNR) (Jeyaletchumi et al., 2010).

Metodo privalumai: gebėjimas atskleisti polimorfizmą (generuoja daug fragmentų) ir geras rezultatų pakartojamumas (ne taip jautrūs reakcijos sąlygoms kaip RAPD); nereikia iš anksto žinoti pradų sekų; ypač naudinga norint greitai sukurti genolapius ir nustatyti tikslius cDNR polimorfizmus.

Metodo trūkumai: generuoja daug fragmentų, kurių analizei gali reikėti kompiuterizuotos sistemos; pagrinde dominantiniai žymenys; gonolapiuose AFLP dažnai randasi netoli telomerų (chromosomų galų) ar cetromerų (vidurio); aukštos darbo sąnaudos ir sudėtinga techninė įranga (Wiedmann, 2002).

Atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR (angl. Randomly amplified polymorhic DNA, RAPD) tai polimerinės grandininės reakcijos būdu pagausinti DNR fragmentai, naudojant 10 bp dydžio atsitiktinės sekos pradmenį (naudojamas vienas pradmuo – vienos grandinės trumpa DNR atkarpa).

Paprastai amplifikuotų fragmentų dydis 500-5000 bp (vidutinio dydžio genomuose pagausinama 5 – 10

skirtingo dydžio DNR fragmentų). Pagausinti fragmentai sudaro pakankamai DNR, kas leidžia juos

30 atskirti agarozės gelio elektroforezės būdu, pažymint pradus etidžio bromidu, kuris šviečia UV šviesoje (Jeyaletchumi et al., 2010).

RAPD privalumai: nereikia iš anksto žinoti prado sekų (galima įsigyti pradus iš komercinių įmonių); pakanka palyginti nedidelio DNR kiekio (5-20 μg); darbo ir kaštų požiūriu efektyvi polimorfizmo paieška; nereikia darbo su radioaktyviomis medžiagomis; paprastesnis ir pigesnis nei RFLP (Wiedmann, 2002).

RAPD trūkumai: negalima atskirti homozigotinių ir heterozigotinių genotipų (dominantinis žymuo); jautrumas aplinkos sąlygoms ir prastas pakartojamumas (dėl jautrumo DNR kokybei, PGR sąlygoms- gaunami skirtingi fragmentai); vienodo ilgio DNR fragmentai, gali būti skirtingos nukleotidų sudėties (Wiedmann, 2002).

Pulsuojančio lauko gelyje elektroforezės (PLGE) metodas (angl. Pulsed field gel electrophoresis, PFGE) yra veiksmingas molekulinis metodas, kuris leidžia genetinę medžiagą palyginti tarp tų pačių bakterijų skirtingų izoliatų. Bakterijų izoliatų DNR fragmentai (pvz.

chromosomų) yra izoliuoti ir išskirti pagal dydį restrikcijos fermentų. Šios DNR dalys yra atskiriamos agarozės gelyje. Elektroforezė leidžia atskirti DNR fragmentų dydžius. Bakterijų genomo DNR gali duoti šimtus fragmentų, kurie vėliau atskiriami agarozės gelio elektroforezėje ir formuoja savitus atskirų kamienų modelius. Bakterijos patekusios į agarozės gelį pirmiausia lizuoja, o vėliau DNR suardomas pasirinktų restrikcijos fermentų.

PLGE yra ypač naudinga nustatyti serotipo 4b izoliatus, kurie nėra randami daugumos kitų metodų (Jeyaletchumi et al., 2010). Dažniausiai nukleorūgščių elektroforezės agaroziniame gelyje metodas yra taikomas DNR ar RNR vientisumui patikrinti, nagrinėti fermentinių reakcijų (pvz., restrikcijos endonukleazių, polimerazinės grandininės reakcijos) produktus. Agaroziniuose geliuose galima frakcionuoti didesnius kaip 100 bp DNR fragmentus. Trumpesnėms molekulėms atskirti tinkamesnis elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje metodas (Foley et al., 2009).

Metodo privalumai: lengvai pritaikomas skirtingoms bakterijų rūšims; nesudėtingas atkuriamumas; didelis atskiriamumo rodiklis;

Metodo trūkumai: sudėtingas metodas; ilgai užtrunkantis; netinkamas nustatant filogenetinius ryšius (Doumith et al., 2004).

Ribotipavimas, tai kitas DNR fragmentų analize paremtas metodas, kai iš pradžių

bakterijos DNR fragmentai yra sukarpomi restrikcijos fermentų. PFGE yra sukarpyti bakterijų DNR

31 fragmentai į nedaugelį didelių fragmentų, o ribotipavime pradiniai DNR fragmentai sukarpomi į daugelį (> 300-500 ). DNR fragmentai yra atskiriami pagal dydį agarozės gelyje, o vėliau paženklinti DNR zondų susekami tie DNR fragmentai, kuriuose bakterijų genai koduoja ribosomų RNR ( rRNR ) (Foley et al., 2010).

Metodo privalumai: visiškai automatizuota sistema; užtikrina aukštą atkuriamumą ir standartizavimą.

Metodo trūkumai: pritaikytas didesnio masto tyrimams; sunkus tyrimo metodas,

reikalaujantis aukštų kvalifikacinių žinių (Wiedmann, 2002).

32

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS

2.1. Mėginių ėmimas iš mažmeninėje rinkoje parduodamų šaltai rūkytų žuvų produktų

Mokslinis tiriamasis darbas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje 2012 m. sausio mėn. – 2014 m. balandžio mėn.

Tyrimams buvo pasirinkti didieji ir mažieji šaltai rūkyti žuvų produktų gamintojai Lietuvoje, kurių gaminiai buvo perkami jų neįspėjant.

Iš įvairių Lietuvos prekybos centrų ir turgaviečių nuo 2013 metų sausio mėnesio iki 2013 metų spalio mėnesio, kas savaitę buvo perkami įvairūs šaltai rūkyti žuvų produktai. Iš viso buvo ištirta 160 šaltai rūkytų žuvų produktų.

2.2. Listeria spp. išskyrimas LST EN ISO 11290-1:2033/A1:2005 metodu

Kiekvieną savaitę pirkti mėginiai buvo tiriami listerijų atžvilgiu. Iš kiekvieno mėginio bakterijos buvo išskiriamos pagal LST EN ISO 11290-1:2033/A1:2005.

2.2.1. Tyrimo eiga

Bakteriologinis tyrimas. Listerijos išskiriamos etapais. Pirmiausia, tiriamoji mėginio dalis (25 gramai) pasėjama į selektyvųjį pusės stiprumo Fraserio sultinį (Oxoid, England) (225 ml.) ir inkubuojama 24 h ± 3h 30 °C ± 0,5 °C temperatūroje. Iš pirminio pagausinimo gauta kultūra persėjama į antrinį pagausinimą Fraserio sultinį (0,1 ml. kultūros į 10 ml. Fraser) ir inkubuojama 48 h ± 3h 37 °C

± 0,5 °C temperatūroje. Iš antrinio pagausinimo gauta kultūra persėjama į dvi selektyvias sėjimo terpes:

ALOA (Biolife, Italija) ir PALCAM (Oxoid, England) (10 pav.). Inkubuojama 24 h ± 3h ir, jeigu

reikia, dar papildomai 24h ± 3h 37 °C ± 0,5 °C temperatūroje. Numanomų listerijų kolonijos sėjamos

ant mitybinio agaro (TSMEA inkubuojama 24h ± 3h 37 °C ± 0,5 °C temperatūroje), kad gerai išaugtų

pavienės kolonijos. Identifikuojamos ne mažiau penkios kolonijos, o jei vienoje lėkštelėje yra mažiau

nei penkios tirtos kolonijos, patvirtinimui imamos visos (LST EN ISO 11290-1:2033/A1:2005, 2014).

33 10 pav. Listerijos ant PALCAM ir ALOA terpių

(https://www.google.lt/search?q=listeria+monocytogenes&biw=1366&bih=654&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=530o U8v8I4TNygOAi4GYCQ&ved=0CAcQ_AUoAQ#q=listeria+monocytogenes+ant+palcam&tbm=isch&imgdii=_)

2.2.2. Išskirtų bakterijų izoliatų atrinkimas molekuliniam tyrimui

Bakteriologiniu tyrimo metodu buvo išskirtos listerijų genties bakterijos, kaip potencialios L. monocytogenes padermės. Šaldymui nuo ALOA lėkštelės paimta viena kolonija perkeliama ant TSMEA terpės ir inkubuojama 37 °C ± 0,5°C temperatūroje 24 val. Po inkubavimo gryna kultūra buvo saugoma BHI su 30 % glicerolio – 80 °C temperatūroje krio mėgintuvėliuose.

Tyrimui naudojamų medžiagų gamintojas Oxoid, England ir Biolife, Italia.

2.3. Listeria spp. identifikavimas naudojant dauginę PGR

Listerijos buvo identifikuojamos iki rūšies naudojant Bubert ir kt. (1999) aprašytą metodą. Tyrimui buvo naudotas iap genetinis elementas, kuris yra bendras visoms listerijų rūšims, nes visų iap genų duomenų palyginamas parodė, kad genų dalių 5‘ ir 3‘ galiniai fragmentai neveiklūs, o vidinės dalys rūšims specifinės. Aprašytas metodas leidžia vienu metu aptikti skirtingas listerijų rūšis ir identifikuoti L. monocytogenes ir L. innocua į dvi atskiras grupes, o L. seeligeri, L. welshimeri, L.

ivanovii aptinkamos vienoje grupėje kaip ir L. grayi, L. grayi subsp. Murrayi. Remiantis iap DNR sekų palyginimu, buvo pasirinkti pradmenų deriniai (5 lentelė) L. monocytogenes identifikuoti.

Pradmuo Lis1B jungiasi su visų listerijų iap geno elemento 3‘ pabaiga, todėl buvo pasirinktas kaip fiksuotas pradmuo dauginės PGR mišinyje kartu su kitais keturiais pradmenimis.

Darbui su DNR reikalingi reagentai ir kiti fermentai buvo gauti iš Thermo Scientific (JAV).