LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDRA
VIKTORIJA SURDOKAITö
BAKTERIJŲ JAUTRUMO ANTIMIKROBINöMS
MEDŽIAGOMS TYRIMAI ŽALIUOSE PAUKŠTIENOS
PRODUKTUOSE
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: dr. Modestas Ružauskas
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas BAKTERIJŲ JAUTRUMO
ANTIMIKROBINöMS MEDŽIAGOMS TYRIMAI ŽALIUOSE PAUKŠTIENOS
PRODUKTUOSE
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2013 m. geguž÷s 1 d. Viktorija Surdokait÷
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2013 m. geguž÷s 1 d Viktorija Surdokait÷
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
2013 m. geguž÷s 1 d Dr. Modestas. Ružauskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
(data) (gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) vardas, pavard÷)
(parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS
TURINYS SANTRAUKA...5 SUMMARY...6 SANTRUMPOS...7 ĮVADAS...8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ...11
1.1. Bendrieji bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms aspektai ir atsparumo vystymasis bei plitimas ...11
1.1.1. Antimikrobin÷s medžiagos naudojamos žmon÷ms ir gyvūnams...11
1.1.2. Antimikrobinį bakterijų atsparumą įtakojantys veiksniai...12
1.1.3. Atsparių bakterijų plitimo ryšiai...13
1.1.4. Antimikrobinio bakterijų atsparumo praktinis skirstymas...15
1.1.5. Atsparių bakterijų temos aktualumas ...17
1.2. Tiriamųjų bakterijų genčių atsparumo antibiotikams apžvalga ir reikšm÷...18
1.2.1. Staphylococcus spp...18
1.2.2. Meticilinui atsparus S.aureus...19
1.2.3. Escherichia coli...21
1.3. Iš naminių gyvūnų išskirtų E. coli jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms situacija Europoje...22
1.3.1. E. coli paukščiuose...22
1.4. E. coli išskirtų iš paukščių m÷sos atsparumas, antimikrobin÷ms medžiagoms kitose šalyse...23
1.4.1. E. coli paukštienoje (broilerių m÷sa)...23
1.5. Antimikrobinių medžiagų naudojamų veterinarijoje, skirtingose ES šalyse palyginimas...25
2.1. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS...25
2.1.1. Tyrimų vieta ir objektai...25
2.2. Tiriamųjų bakterijų išskyrimas, identifikacija ir atranka tyrimams...25
2.3. Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimas...27
3. TYRIMO REZULTATAI...30
3.1 Tiriamųjų bakterijų paplitimas naminių paukščių kepen÷l÷se ir šių bakterijų atranka tyrimams...30
3.2.1. Staphylococcus spp. ir E. coli jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms naminių
paukščių kepen÷l÷se (bendrieji jautrumo duomenys)...34
3.2.2. Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms kalakutienos kepen÷l÷se...35
3.2.3. E. coli jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms kalakutienos kepen÷l÷se...37
3.2.4. Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms vištų kepen÷l÷s...38
3.2.5. E. coli jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms vištienos kepen÷l÷se ...41
3.3. Escherichia coli išskirtų iš paukštienos subproduktų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms kitimai dviejų metų laikotarpyje ...42
4.REZULTATŲ APTARIMAS...44
IŠVADOS...47
SANTRAUKA Viktorija Surdokait÷
„Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimai žaliuose paukštienos produktuose” Raktažodžiai: antibiotikai, antimikrobin÷s medžiagos, atsparumas, bakterijos, E. coli,
Staphylococcus;
Darbo vadovas: dr. Modestas Ružauskas
Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Veterinarijos akademija. Anatomijos ir fiziologijos katedra. Tilž÷s g. 18, LT - 47181, Kaunas, Lietuva, 2012-2013 m.
Darbą sudaro 53 puslapiai, pateiktos 8 lentel÷s bei 31 paveikslas.
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje realizuojamų gyvūnin÷s kilm÷s žalių paukštienos produktų (kepenų) užterštumą atspariomis antimikrobin÷ms medžiagoms Escherichia coli rūšies bei Staphylococcus genties bakterijų paderm÷mis.
Darbas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, sl÷nio „Nemunas“ atviros prieigos centro mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje. Iš paukštienos subproduktų (kepenų) buvo išskirtos ir identifikuotos 209 bakterijų paderm÷s. Paplitimo dažnis E. coli: kalakutienoje – 60 proc., vištienoje – 62,2 proc.; stafilokokų: kalakutienoje – 90 proc., vištienoje – 87,6 proc. Nustatytas šių bakterijų jautrumas įvairiems antibiotikams naudojant kokybinį tyrimų metodą, duomenis interpretuojant pagal EUCAST klinikinius lūžio taškus.
E. coli išskirtos iš paukštienos subproduktų pasižym÷jo dažniausiu atsparumu ampicilinui (64,2 proc.), ciprafloksacinui (25,4 proc.), sulfametoksazoliui-trimetoprimui (37,7 proc.), aztreonamui (23,9 proc.), cefoksitinui (22,4 proc.) bei kur kas retesniu atsparumu gentamicinui (6 proc.). Staphylococcus genties bakterijos dažniausiai buvo atsparios sulfametoksazoliui-trimetoprimui (57,4 proc.), penicilinui G (54,5 proc.), eritromicinui (28,7 proc.). Kiek retesnis atsparumas nustatytas tetraciklinui (13,9 proc.), cefoksitinui (atsparumas meticilinui) (11,9 proc.), gentamicinui (8,9 proc.) ir ciprofloksacinui (7,9 proc.). Tarp Staphylococcus spp. padermių buvo aptikta ir S. aureus paderm÷s (kalakutienoje – 55,6 proc., vištienoje – 19,6 proc.). Šių bakterijų atsparumas kalakutienoje ir vištienoje dažniausiai nustatytas penicilinui G (atitinkamai 60 proc. ir 77,8 proc) bei sulfametoksazoliui – trimetropinui, atitinkamai (40 proc. ir 55,6 proc.). Meticilinui atparių S. aureus padermių rasta 4 proc. Tyrimų duomenys atskleid÷, jog mažmenin÷je prekyboje realizuojamos paukščių kepenys dažnai užkr÷stos atspariomis žarnyno lazdelių ir stafilokokų paderm÷mis. Ypatingas d÷mesys atkreiptinas į žarnyno lazdelių dažną atsparumą kritiškai svarbiai žmon÷ms antimikrobinių medžiagų grupei – fluorochinolonams: net ketvirtadalis visų išskirtų E. coli izoliatų buvo atsparūs ciprofloksacinui.
Taip pat atkreiptinas d÷mesys ir į tai, kad paukštienos produktuose cirkuliuoja MASA paderm÷s.
SUMMARY
Viktorija Surdokait÷
“Investigations on bacterial susceptibility to antimicrobial agents in raw poultry products ” The keywords: antibiotics, antimicrobial agents, resistance, bacteria, E. coli, Staphylococcus; Work tutor: Dr. Modestas Ružauskas
Lithuanian University of Health Sciences. Academy of Veterinary Science. Department of Anatomy and Physiology, Tilž÷s st. 18, LT - 47181, Kaunas, Lietuva, 2012-2013 m. This work is 53 pages long, with 8 tables and 31 pictures included.
The aim of this study was to investigate contamination of raw puoltry products (liver) sold in retail markets by antimicrobial resistant Escherichia coli and Staphylococcus.
The research was carried out at Microbiological Research Laboratory of open access Center “Nemunas” of Lithuanian University of Health Sciences. Two hundred and nine isolates from poultry liver were isolated and identified. The prevalence of E. coli was 60% in turkey and 62.2% in chicken, while staphylococci were found in 90% in turkey and 87.6% in chicken liver samples. The susceptibility of these bacteria to various antibiotics was estimated by using antibiotic disc method; the data obtained was interpreted according to clinical breakpoints presented by EUCAST.
E. coli isolated from poultry were the most frequently resistant to ampicillin (64.2%), ciprofloxacin (25.4%), sulfamethoxazole - trimethoprim (37.7%), aztreonam (23.9%), cefoxitin (22.4%) and with a lesser extent to gentamicin (6%). Staphylococci demonstrated frequent resistance to sulfamethoxazole - trimethoprim (57.4%), penicillin G (54.4%) and erythromycin (28.7%). Slightly lower resistances were observed to tetracycline (13.9%), cefoxitin (11.9%), gentamicin (8.9%) and ciproflaxicin (7.9%). Staphylococcus aureus prevalence was determined in 55.6% of turkey and in 19.6% of chicken liver products. This species demonstrated frequent resistance to penicillin G (60% from turkey and 77.8% from chicken) and to sulfamethoxazole - trimethoprim (40% and 55.6% respectively). Four isolates of S. aureus was methicillin resistant. The data revealed that chicken and turkey liver sold in retail markets are frequently contaminated with resistant Escherichia coli and staphylococcus. The particular attention should be paid to the fact that E. coli spread in retail poultry products are frequently resistant to the critically important class of antimicrobials for humans – fluoroquinolones. Even 25 percent of isolates demonstrated resistance to ciprofloxacin. MRSA strains in retail poultry products are of concern as well.
SANTRUMPOS
EMST – Europos maisto saugos tarnyba
MASA – meticilinui atsparus Staphylococcus aureus MSK – mažiausia slopininanti antibiotikų koncentracija VETC – verotoksigenin÷ E. coli
SETC – šigatoksin÷ E. coli P – penicilinas FOX – cefoksitinas CIP – ciprofloksacinas E – eritromicinas CN – gentamicinas TE – tetraciklinas SXT – sulfametoksazolis-trimetoprimas ATM – aztreonamas AMP – ampicilinas
ĮVADAS
Mikroorganizmų atsparumas antibiotikams pripažinta viena opiausių globalių visuomen÷s sveikatos problemų, kuri sąlygoja nes÷kmingą gydymą ir su tuo susijusias mirtis bei išaugusias gydymo išlaidas. Europos Sąjungos (ES) valstyb÷se daug d÷mesio skiriama šiai vis didesnį rūpestį keliančiai aktualijai. Nuo vaistams atsparių bakterijų sukeltų infekcijų ES kasmet miršta apie 25 000 pacientų, o susijusios sveikatos priežiūros išlaidos bei našumo nuostoliai viršija
1,5mlrd. eurų per metus
(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Report/2009/11/WC500008770.pdf). XX a. penktajame dešimtmetyje atrastas penicilinas pad÷jo žymiai sumažinti sergamumą užkrečiamosiomis ligomis ir mirčių nuo jų skaičių. Tuomet buvo sukurta daug naujų antibiotikų, kurių dauguma prarado savo veiksmingumą d÷l steb÷tino bakterijų geb÷jimo mutuoti arba perimti kitų organizmų atsparumo genus ir ilgainiui tapti atspariomis antibiotikams. D÷l did÷jančio atsparumo antibiotikams problemos buvo kuriamos vis naujos antibiotikų rūšys. Šiuo metu antibiotikų vartojimas tapo viena svarbiausių visuomen÷s sveikatos problemų apimanti maisto grandines, gyvūnus ir žmones (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012).
Platus ir dažnai nepagrįstas antibiotikų vartojimas sąlygoja antibiotikams atsparių mikroorganizmų padermių vystymąsi. Toks bakterijų prisitaikymas išlikti siejamas su gausiu antimikrobinių medžiagų vartojimu tiek veterinarijoje, tiek medicinoje. D÷l pastarosios priežasties mikroorganizmų populiacijoje atsirado atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms genų cirkuliacija.
Antibiotikams atsparių bakterijų galima aptikti visuomen÷je ( gydymo įstaigose) taip pat tarp naminių gyvulių bei paukščių ( Pavilonyt÷ et al., 2008; EFSA, 2012).
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad bakterijos, turinčios atsparumo antibiotikams genų, gali būti perduodamos iš gyvulio gyvuliui ir iš gyvulio žmogui, pavyzdžiui, karvių mastito gydymui dažnai naudojami vaistai, kurių sud÷tyje gali būti naudojami cefalosporinų, aminoglikozidų, makrolidų, linkozamidų, beta laktamų, jų derinio su beta laktamazių inhibitoriais, svarbiais ir žmogaus medicinoje. Antibiotikais karv÷ms, sergančioms mastitu, gydyti gyvūnai gali atsparias bakterijas per maisto grandinę perduoti žmon÷ms (Klimien÷ et al., 2008).
Infekcin÷s kilm÷s susirgimų skaičius išlieka aktualus, d÷l mikroorganizmų patekimo ant maisto produktų nesilaikant technologinių r÷žimų ar netinkamai juos apdorojant. Tuo galime pagrįsti, jog bakterijos sugeba prisitaikyti prie joms įvairių aplinkos sąlygų, įvairių medžiagų naudojamų valymo, plovimo darbuose bei naudojamų maisto produktų apdirbimo technologijose. Tokios bakterijomis gali perduoti žmon÷ms atsparumo antibiotikams veiksnius. Žmonių apsinuodijimo atvejais per maistą plintančių zoonozių suk÷l÷jai priskiriami: Escherichia coli,
Salmonella spp., Campylobacter spp. (EFSA, 2011; EFSA 2009). Antibiotikams atsparūs stafilokokai, enterokokai, o kai kuriais atvejais ir žarnyno lazdel÷s nors ir nesukelia žmon÷ms infekcijų, patekę į organizmą per gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktus, tačiau yra svarbūs kaip potencialus atsparumo determinančių šaltinis, kurio d÷ka klasikiniais plazmidžių perdavimo ar kitais būdais gali patekti ir į žmogaus mikrobiotą. Surinkti 2010 metų duomenys iš ES šalių rodo, kad did÷ja zoonozinių bakterijų, tokių kaip Salmonella ir Campylobacter antimikrobinis atsparumas. Šios bakterijos yra dažniausi per maistą plintančių infekcijų suk÷l÷jai Europos šalyse. Ataskaitoje taip pat pateikiama informacija apie meticilinui atsparaus Staphylococcus aureus (MASA) atsiradimą gyvūnuose ir maiste. MASA nešiotojai buvo skirtingų rūšių naminiai gyvūnai ir paukščiai, šio suk÷l÷jo taip pat rasta ir kai kuriuose gyvūnin÷s kilm÷s maisto produktuose (EFSA, 2012).
Siekiant kontroliuoti antibikrobinių vaistų sunaudojimo mastus, Europos šalyse, Europos Vaistų Agentūra vykdo projektus, kuriuose skelbiama informacija apie sunaudojamų antimikrobinių medžiagų kiekius veterinarijos srityse, kur galima su žmonių medicinoje naudojamų antimikrobinių medžiagų steb÷sena ( European Medicines Agency, 2012).
Europos maisto saugos tarnyba (EMST) teikia nepriklausomą mokslinę paramą ir rekomendacijas susijusias su pavojumi žmonių ar gyvūnų sveikatai, d÷l galimo antimikrobinio rezistentiškumo atsiradimo, išplitimo ir perdavimo žmon÷ms ar gyvūnams per maisto grandinę arba per gyvūnus. Šiam darbui (EMST) taiko integruotus metodus, dirba daug mokslinių grupių kurios stebi bei nagrin÷ja šią problemą visoje maisto grandin÷je. 2006 metais uždrausta naudoti antibiotikus pašaruose, gyvulių augimo skatinimui. 2008 metais (EMST) pateik÷ išvadą, kaip maistas gali tapti priemone perduoti antimikrobines rezistencines bakterijas žmon÷ms. Šiuo atveju kaip esminis prevencijos taikymas akcentuojamas geros higienos praktikos laikymasis visuose maisto grandin÷s etapuose.
2010 metais (EMST) išleido pirmuosius ES ataskaitinius paranešimus apie 2004-2008 metais ištirtų zoonozinių bakterijų gyvūnuose ir maiste antimikrobinį rezistentiškumą. (http://vmvt.lt/uploads/file/EFSA/Rezistentiskumas_antimikrobams-EFSA.pd).
Lietuvoje iki šiol yra atlikti kai kurių gyvūnuose paplitusių bakterijų jautrumo antibiotikams tyrimai, tačiau nepaisant to, ši situacija nuolat kinta, tod÷l tokia steb÷sena turi būti atliekama jei ne nuolat, tai bent periodiškai. Šiam magistriniam darbui buvo pasirinktos dvi bene labiausiai paplitusios bakterijų gentys – Escherichia ir Staphylococcus, siekiant nustatyti jų jautrumo antibiotikams situaciją žalios m÷sos produktuose. Kaip produktai pasirinkti paukštienos kepenys, kurios reprezentuoja situaciją žaliuose naminių paukščių produktuose (ar skerdenose); be to, kepenys yra santykinai nebrangios, jos neretai kontaminuojamos skerdimo, transportavimo ar
mažmenin÷s realizacijos metu, tod÷l tiek medžiagos surinkimas, tiek ir jos įsigijimo ekonominis aspektas yra optimalus tokio tipo tyrimams.
Darbo pobūdis atitinka veterinarin÷s maisto saugos tematiką, jis paremtas moksliniais tyrimais mikrobiologijos laboratorijoje. Šio darbo metu, ne tik atlikau mokslinius eksperimentus, bet ir įgijau eksperimentų planavimo, jų atlikimo, statistinio skaičiavimo, mikrobiologinio darbo patirties specializuotoje laboratorijoje.
Šio darbo tikslas – ištirti Lietuvoje realizuojamų gyvūnin÷s kilm÷s žalių paukštienos produktų (kepenų) užterštumą atspariomis antimikrobin÷ms medžiagoms Escherichia coli rūšies bei Staphylococcus genties bakterijų paderm÷mis.
Darbo uždaviniai:
1. Surinkti ir išanalizuoti esamus literatūros duomenis apie atsparių antimikrobin÷ms medžiagoms bakterijų paplitimo gyvūnuose ir gyvūniniuose maisto produktuose situaciją ir problematiką.
2. Laboratoriškai ištirti žalios m÷sos (subproduktų) realizuojamų mažmenin÷s prekybos vietose pavyzdžių, užterštumą stafilokokais ir žarnyno lazdel÷mis.
3. Nustatyti išskirtų stafilokokų ir žarnyno lazdelių padermių jautrumą svarbiausiems žmonių gydymui naudojamiems antibiotikams.
4. Palyginti išskirtų Escherichia coli rūšies bakterijų jautrumo duomenis su ankstesniųjų metų tyrimų duomenimis.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bendrieji bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms aspektai ir
atsparumo vystymasis bei plitimas
1.1.1. Antimikrobin÷s medžiagos naudojamos žmon÷ms ir gyvūnams
Antimikrobin÷s medžiagos – tai plati cheminių ir biologinių medžiagų grup÷, slopinanti įvairių mikroorganizmų gyvybinę veiklą arba juos žudo, veikiantys kaip antivirusiniai, priešgrybiniai, antiparazitiniai vaistai, būtini žmonių ir gyvūnų gydymui. Jie taip pat gali būti vartojami kaip dezinfekantai, antiseptikai ir kiti higienos produktai infekcinių ligų gr÷smei mažinti (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012).
Antibiotikai gali būti gamtin÷s ar sintetin÷s arba pusiau sintetin÷s kilm÷s antimikrobinių medžiagų grup÷ veikianti bakterijas. Pagal veikimą mechanizmą bei struktūrą antibiotikai skirstomi į klases, o šios pagal svarbą gyvūnams ir žmon÷ms į svarbias, labai svarbias ir kritiškai svarbias (Lasinskait÷ - Čerkašina et al., 2003; WHO, 2007; http://antibioticsfor.com).
Dauguma antibiotikų klasių naudojamos žmon÷ms gydyti, tačiau iš tų pačių klasių kai kurie gali būti naudojami ir gyvūnams gydyti (1 lentel÷je pateiktos antibiotikų klas÷s, jų klasių atstovai, naudojami tiek žmonių medicinoje tiek veterinarijoje).
1 lentel÷. Žmon÷ms kritiškai svarbios antimikrobin÷s medžiagos (pagal PSO)
Antibiotikų klas÷s Pavyzdžiai naudojami žmonių
medicinoje
Pavyzdžiai naudojami veterinarijoje
III kartos cefalosporinai Cefotaksimas, ceftriaksonas Ceftiofuras, cefovecinas
IV kartos cefalosporinai Cefepimas, cefpiromas Cefkvinomas
Karbepenemai (ir kt. penemai) Imipenemas, meropenemas Leistinų n÷ra
Glikopeptidai Vankomicinas, teikoplaninas Avoparcinas
Ansamicinai Rifabutinas, rifamtinas Rifampicinas
Lipopeptidai Daptomicinas Leistinų n÷ra
Makrolidai Azitromicinas, eritromicinas,
spiramicinas Eritromicinas, spiramicinas, oleandomicinas, tilozinas Aminopenicilinai Ampicilinas, amoksicilinas, ampicilinas/sulbaktamas, amoksicilinas/klavulanatas, Ampicilinas, amoksicilinas, ampicilinas/sulbaktamas, amoksicilinas/klavulanatas
Aminoglikozidai Amikacinas, gentamicinas, streptomicinas, tobramicinas, neomicinas, kanamicinas, netilmicinas Amikacinas, gentamicinas, streptomicinas, neomicinas, dihidrostreptomicinas
Oksazolidinonai Linezolidas Leistinų n÷ra
Streptograminai Kvinupristinas/dalfopristinas, pristinamicinas
Virginiamicinas
Penicilinai Penicilinas V, penicilinas G Penicilinas V, penicilinas G
Chinolonai Nalidikso rūgštis, ciprofloksacinas, pipemido rūgštis, ofloksacinas, pefloksacinas Nalidikso rūgštis, enrofloksacinas, pipemido rūgštis, marbofloksacinas
1.1.2. Antimikrobinį bakterijų atsparumą įtakojantys veiksniai
Gydant bakterijų sukeltas infekcijas antibiotikais, dauguma bakterijų žūva, tačiau dalis jų išlieka gyvybingos ir įgyja atsparumą vartotiems vaistams (European Commission, 2011).
Kai kurios bakterijos gali būti atsparios daugeliui, arba visiems tos pačios klas÷s, o kartais ir daugelio klasių antibiotikams.
Bakterijų jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms priklauso nuo mechanizmų ir ląstel÷s struktūros. 2 lentel÷je pateikta informacija, koks antibiotikas ar kita antimikrobin÷ medžiaga gali veikti, tam tikrą ląstel÷s dalį ar fiziologinę funkciją (Levy, Marshal , 2004).
2. lentel÷. Pagrindin÷s antibiotikų klas÷s ir jų veikimo mechanizmai
Veikimo mechanizmas Antibiotikų klas÷s
Ląstel÷s sienel÷s sintez÷s slopinimas Penicilinai, cefalosporinai, karbapenemai; Daptomicinas, monobaktamai, glikopeptidai Baltymų sintez÷s slopinimas Tetraciklinai, aminoglikozidai,
oksazolidanonai, streptomicinas, ketolidai, makrolidai, linkozamidai
DNR sintez÷s slopinimas Fluorochinolonai
Folio rūgšties sintez÷s slopinimas Sulfonamidas, trimetropimas
RNR sintez÷s slopinimas Rifampinas
Kita Metronidazolis
Mikroorganizmų atsparumas antibiotikams priklauso nuo daugelio su žmogaus ar gyvūno susijusių veiksnių (antibiotikų vartojimo, trukm÷s, dozavimo, infekcijų kontrol÷s priemonių, kelionių, socialinių ir ekonominių sąlygų, gyvulin÷s kilm÷s maisto produktų paplitimo rinkoje, naujų alternatyvių antimikrobinių priemonių vartojimo galimybių) naudojamų antibiotikų bei
bakterijų atsparumo genetikos, 1 paveiksl÷lyje pateikti veiksniai galintys įtakoti antibiotikų atsparumo vystimąsi (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012).
Bakterijos, kurios priklauso įprastinei žmonių ar gyvūnų mikrobiotai, jos neveikia žalingai, tačiau susidūrusios su antibiotiku, gali perimti tam tikrus veiksnius, kurie įtakoja bakterijų atsparumą antibiotikams. Tai taip pat priklauso nuo žmonių grupių; jauni ir pagyvenę žmon÷s yra imlesni, nes jų imunitetas silpnesnis (Grundmann, 2011).
1 pav. Mikroorganizmų atsparumą antibiotikams įtakojantys veiksniai
Atsparių bakterijų įtakos žmonių infekcijų kontrolei nustatymas – nuolatinis rizikos veiksnys, nes daugelio rūšių antimikrobiniai preparatai, vartojami maistui auginamų gyvulių ir paukščių pramon÷je, kai kurie iš jų priklausantys ir žmonių vaistams, tod÷l šios bakterijos gali sudaryti panašius atsparius fenotipus, kurie kelia gr÷smę visuomen÷je (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012; EFSA, 2012).
1.1.3. Atsparių bakterijų plitimo ryšiai
Atsparių genų arba bakterijų patekimas iš aplinkos per maistą į žmogaus organizmą kelia didelį susirūpinimą. Mokslinių tyrimų duomenimis nustatyta, kad galvijų, kuriems duoda antibiotikų, žarnyne gyvenančios bakterijos atsparios antibiotikams (Galland et al., 2001; Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012).
Atsparumas antibiotikams gali būti perduodamas kitiems gyvūnams ir žmon÷ms per tiesioginį sąlytį, tačiau jis gali plisti ir netiesiogiai – per maisto grandinę, orą, vandenį, m÷šlu
arba dumblu tręšiamą dirvožemį, 2 paveiksl÷lyje pateikiamas atsparumą bakterijų antibiotikams turinčios sąsajos su aplinka, per kurią galimi plitimo keliai (Hawkey, Jones, 2009).
2 pav. Antibiotikų galimi plitimo keliai aplinkoje
Didel÷ suvartotų antibiotikų dalis patenka į nuot÷kų vandenį, kur selektyvus antibiotikų spūdis gali paspartinti mikroorganizmų atsparumo vystymąsi. Nuot÷kose plačiai aptinkama atsparių antibiotikams bakterijų ir atsparumą antibiotikams koduojančių genų, dažnai jų koncentracija gerokai didesn÷ nei paviršiniuose vandens telkiniuose. Nuot÷kų vandenyje sąlygos įvairių bakterijų bendrijų augimui itin palankios, šios bendrijos kaip tik ir sudaro pagrindą bakterijų atrankai ir atsparumui antibiotikams formuotis. Tod÷l manoma, kad nuot÷kų valomieji įrenginiai yra viena iš antibiotikams atsparių bakterijų vystimosi ir plitimo ekosistemų veiksnių, galinčių taip pat įtakoti mikroorganizmų vystymąsi (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012; Boczek, et al., 2007).
Antibiotikai gyvulininkyst÷je gali būti naudojami ne tik gydymo tikslais, tačiau kaip ir augimo skatinimą leidžiami preparatai (kai kuriose, ne ES šalyse jie dar leidžiama naudoti). Tyrimai parod÷, kad gyvulininkyst÷s sektoriuje, antibiotikai patekę į aplinką per gyvūno šlapimą, fekalijas, gali pad÷ti formuoti atsparių mikroorganizmų populiacijas, kartu su žarnyno mikroorganizmais gali perduoti atsparius genus, dirvožemio ir vandens mikroorganizmams per
Dirvožemis Antibiotikai Vanduo Nutekamasis vanduo Srutos Gyvūnai Veterinariniai antibiotikai Maistas Žmonių gerosios bakterijos Klinikiniai antibiotikai
mobilius genetinius elementus. Taip sukuriamas atsparių bakterijų plitimo aplinkoje reiškinys (Lopez et al., 2012).
Atsparios antibiotikams atrastos ir bakterijos maisto produktuose, pagamintuose iš antibiotikų gavusių galvijų , paukštienos bei kiaulienos m÷sos (EFSA, 2012).
Antimikrobiniai vaistai nuo pat jų atradimo plačiai vartojami gyvulinkyst÷s bei paukštininkyst÷s sektoriuose: gydymui, ligų prevencijai, kontrolei ir gamybai ( skatina augimą, gerina pašaro pasisavinimą). D÷l nuolatinio sąlyčio su antimikrobiniais preparatais maistui vartojamų naminių gyvulių ir paukščių fekalijų mikrobiotoje aptinkamos bakterijos gali būti labai atsparios. Taip pat, daugelis antimikrobinių vaistų vartojami ir naminių gyvūnų gydymui, žuvininkyst÷je (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012).
1.1.4. Antimikrobinio bakterijų atsparumo praktinis skirstymas
Klinikinis bakterijų atsparumas
Klinikinis atsparumas siejamas su gautais klinikiniais rodikliais gydant žmones ir gyvūnus. Dažnai tokie tyrimai aprašomi mokslin÷je spaudoje ir klinikin÷je gydimo praktikoje.
Klinikinis bakterijų atsparumas tai nustatytos tam tikros gydymui skirtos doz÷s, kurios nusakomos ligos procesui įvertinti. Klinikiniam atsparumui įvertinti naudojamas rodiklis – mažiausia slopinanti antibiotiko koncentracija (MSK), kuri parodo koks mažiausias antibiotiko kiekis slopina bakterijų dauginimąsi in vitro ( EFSA, 2008). MSK - kuriai esant žūva 90 proc., tiriamųjų mikroorganizmų padermių (Aldona et. al., 2003) kaip rodiklis taip pat yra naudojamas praktikoje. Klinikinis atsparumas išreiškiamas tik antibiotiko poveikiu bakterijoms in vitro, nors jis priklauso ir nuo farmakokinetinių ir įvairų kitų parametrų gydančiojo organizme. Patys rezultatai yra įvertinami konkrečiam antibiotikui ir konkrečiam suk÷l÷jui, nustačius MSK, naudojant tarptautiniu pripažintus - klinikinius lūžio taškus. Europoje klinikinius lūžio taškus nustato, Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komitetas (EUCAST) (EFSA, 2008; EUCAST, 2013).
Mikrobiologinis atsparumas
Mikrobiologinis atsparumas, atskirų bakterijų padermių savyb÷ toleruoti didelių koncentracijų antibiotikus, lyginant su įprastin÷mis tos rūšies bakterijų paderm÷mis, kurios dažnai tiems antibiotikams yra jautrios. Atsparumas įgaunamas per genų perdavimą arba mutacijas. Mikrobiologiniam atsparumui nustatyti yra ištiriamos tiriamosios paderm÷s MSK ir ji lyginama su „laukinių“ t.y. įprastai jautrių tos rūšies bakterijų MSK rodiklių reikšm÷mis. Atsparia laikoma tokia paderm÷, kuriai reikalinga didesn÷ MSK nei nustatyta laukinių padermių
jautrumo riba. Šios jautrumo ribos yra vadinamos epidemiologin÷mis ribin÷mis reikšm÷mis (angl. epidemiological cut-off value) (EFSA, 2008).
Įgytas atsparumas
Įgytas atsparumas vienam arba keliems antibakteriniams vaistams yra savyb÷, būdinga tam tikrai padermei, pasikeitus jos genomui. Vienas iš genų pokyčių variantų yra susijęs su mikroorganizmų tam tikrų genų bakterijos chromosomoje mutacijomis, d÷l kurių atakuojamojo geno produktas nustoja buvęs to antibiotiko „taikiniu“. Taip atsitinka arba d÷l „taikinio“ baltymo struktūros pokyčio, arba d÷l to, kad „taikinio“ antibiotikas nepasiekia. Kitas genų pokyčių variantas susijęs su tuo, kad atsparumą vienam ar keliems antibiotikams mikroorganizmas įgyja, kai jame atsiranda papildomų genų, dažniausia R plazmidžių (atsakinga už atsparumą daugeliui antibiotikų) (Lasinskait÷ - Čerkašina et al., 2003).
Įgimtas atsparumas
Įgimtas atsparumas yra bakterijų rūšies savyb÷.( menkas bakterijų ląstelių išorin÷s membranos laidumas), kuri pasireiškia atsparumu skirtingų klasių antimikrobin÷ms medžiagoms. Toks atsparumas gali būti įvairus, pavyzdžiui, kai bakterijoje n÷ra jokio kontakto, į kurį nukreipta antimikrobin÷ medžiaga. Tokios bakterijos n÷ra tiriamos jautrumo atžvilgiu tam tikroms antimikrobin÷ms medžiagoms, tačiau išreiškiant jų atsparumą, labiau vartotinas terminas „nejautrios“, nei įprastas vartoti terminas „atsparios“ (EFSA, 2008; Lasinskait÷ - Čerkašina et al., 2003 ).
Kryžminis atsparumas
Kryžminis bakterijų atsparumas gali būti skirstomas į visišką kryžminį atsparumą ir dalinį kryžminį atsparumą.
Visiškas kryžminis atsparumas – mikroorganizmų paderm÷, atspari vienam antibiotikui, kartu tampa atspari visiems tos grup÷s antibiotikams. Jis būdingas tetraciklinams.
Dalinis kryžminis atsparumas – mikroorganizmų paderm÷, įgijusi atsparumą vienam antibiotikui, yra atspari tik kai kuriems tos pačios grup÷s antibiotikams. Jis būdingas makrolidams (Lasinskait÷ - Čerkašina et al., 2003).
Bendras atsparumas (koatsparumas)
Tokiais atvejais, kuomet atsparumo genas( integronai, plazmin÷s, transpozonai) yra perduodamas vienu veiksmu. Kai dviejų ar daugiau skirtingų atsparumų gerai yra fiziškai susieti, tai vadinami „ bendro atsparumo“ bakterijomis, kurios yra atsparios tam tikrom antimikrobin÷ms medžiagoms, nepriklausomai nuo antibiotikų klas÷s (EFSA, 2008).
Dauginis atsparumas
Tai tokia praktin÷ atsparumo interpretacija, kai bakterijų paderm÷s yra atsparios keletui skirtingų antibiotikų. Kuomet vadinti padermę pasižyminčią dauginiu atsparumu sprendžia
patys tyr÷jai. Neretai paderm÷ laikoma pasižyminčia dauginiu atsparumu, kai ji atspari ne mažiau nei trijų skirtingų antibiotikų klasių atstovams (EFSA 2008).
1.1.5. Atsparių bakterijų temos aktualumas
Pasaulyje daug÷ja žmonių su sutrikusia imunine sistema – sergančių imuninę sistemą išsekinančiomis ligomis, patyrusių organų transplantacijas. Pagrindin÷ infekcijų plitimo priežastis, kad ligas sukeliančios bakterijos įgyja vis didesnį atsparumą antibiotikams ir tampa labiau pavojingesn÷mis. Nors bet kurioje bakterijų populiacijoje yra vaistams nejautrių bakterijų, antibiotikai, įveikdami jautriąsias, palengvina imunin÷s sistemos kovą su atspariosiomis. Moksliniuose straipsniuose pranešama apie bakterijų padermes, atsparias gydymui vartojamiems antibakteriniams junginiams. Tokių atsparių bakterijų sąraše jau yra Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp. atstovų (Köck et al., 2010; WHO, 2009; Cercenado, 2011; Zvonimir, Punda-Polic, 2000; Subhash, 2010). Didžiuliai kiekiai antibiotikams atsparių bakterijų, ypač virulentiškų jų padermių, sukelia rimtą gr÷smę ir žmon÷ms su sveika imunine sistema. Antibiotikams atsparių bakterijų sukeliamos infekcijos prailgina ligonių hospitalizacijos trukmę ir, tuo pačiu, padidina antibiotikams atsparių patogenų perdavimo aplinkiniams tikimybę.
Meticilinui atsparios Staphylococcus aureus susijusios su ligonių hospitalizavimu ir su jų gydymu susijusiomis procedūromis. S. aureus gali sukelti rimtas infekcijas, tokias kaip pneumonija (plaučių uždegimas) ar bakteriemija (kraujo infekcija). Iš nudegimų sukeltų žaizdų S. aureus atsparumas meticilinui nustatytas - 25,3 proc. Iš metilicinui jautrių S. aureus padermių nustatytas atsparumas 28 - 30 proc. gentamicinui bei kanamicinui (Grigait÷, 2006).
Pseudomonas aeruginosa taip pat gali sukelti bakteriemiją ir turi sąsajas su įvairiais infekcijų židiniais. Bakteriemijos židiniuose nustatyta - 81,1 proc., žaizdose - 39,4 proc. Daugumoje atvejų nustatytas atsparumas ciprofloksacinui (Dambrauskien÷ et al., 2009).
Lietuvoje ešerichijų atsparumas antibiotikams paplitęs taip pat pakankamai plačiai. Tirtosios paderm÷s, išskirtos iš gyvūnų pasižym÷jo klinikiniu atsparumu ampicilinui 97 proc., sulfametoksazolio ir trimetoprimo deriniui 45 proc., ciprofloksacinui 32 proc. (Ružauskas et al., 2009). Dažnai nustatomas gyvūnin÷s kilm÷s Enterococcus genties bakterijų atsparumas streptomicinui - 57,9 proc., tetraciklinui - 56,1 proc., eritromicinui – 43,9 proc., neomicinui - 42,1 proc. (Ružauskas et al., 2008). Enterokokai turi atsparumą cefalosporinams, klindamicinui, o taip pat nedidel÷ms sulfametoksazolio-trimetoprimo, fluorochinolonų koncentracijoms, chloramfenikoliui, tetraciklinams (EFSA, 2008).
Analizuodami bakterijų atsparumą antibiotikams Lietuvoje nustat÷me, jog n÷ra daug duomenų skelbiančių apie ištirtų bakterijų atsparumą iš maisto produktų. Atsparios antibiotikams bakterijos plačiai paplitusios aplinkoje, įskaitant tarp gyvūnų ir žmonių, tod÷l svarbu, kad šios nepatektų į žmonių organizmą iš gyvūninių kilm÷s šaltinių, tokių kaip vištiena, jautiena, pieno produktai .
1.2. Tiriamųjų bakterijų genčių atsparumo antibiotikams apžvalga ir reikšm÷ 1.2.1. Staphylococcus spp.
Stafilokokai yra gana plačiai paplitę aplinkoje (Masteikien÷, 2002). Nuo 30-50% žmonių populiacijoje yra stafilokokų nešiotojai (Le Loir et al., 2003; Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012 ). Stafilokokai paprastai yra randami ant odos ir gleivinių paviršiaus, ar net ant maisto produktų.
Stafilokokai rutuliškos ~ 1 µm skersmens ląstel÷s. Jie nejudrūs, sporų nesudaro, turi ląstel÷s sienelę, fakultatyvūs anaerobai, dauginasi daugelyje mitybinių terpių +37 ˚C temperatūroje, gamina vandenyje netirpų kremo spalvos, baltą ar geltoną pigmentą. Tepin÷lyje išsid÷sto netaisyklingomis kek÷mis, kolonijos gali būti geltonos, raudonos, oranžin÷s. Jaunos kokų paderm÷s yra gramteigiamosios, sen÷damos stafilokokų ląstel÷s gali virsti gram neigiamosiomis. Dažnai tai būna saprofitinių rūšių bakterijos, tačiau jų tarpe pasitaiko ir patogeniškos atmainos.
Patogeniniai stafilokokai gali gaminti egzotoksinus, galinčius tur÷ti tam tikras nuodingas frakcijas, tokius kaip, leukocidinas (veikia leukocitus ir makrofagus), hemolizinai (ardo eritrocitus, veikia lygiuosius kraujagyslių raumenis), enterotoksinai (sukelia viduriavimą), toksinio šoko sindromo toksinas (sukelia šoką), pirogeniniai egzotoksinai (sukelia alpimą, šoką). Žmogaus organizmą žalingai veikia α ir β egzotoksinai, tačiau α toksinas yra termostabilus. Tokie patogeniški stafilokokai kaip Staphylococcus aureus kamienai gali gaminti ir egzotoksinus, kurie kaupiasi ir susitelkia maisto produktuose (Pavilonis, et. al., 2000, Pavilonis et. al., 2007; Butkevičius, 2008).
Išskiriamos svarbiausios trys pagrindin÷s stafilokokų rūšys kliniškai svarbios žmon÷ms: Staphylococcus aureaus, Staphylococcus saprophyticus ir Staphylococcus epidermidis.
S. epidermidis ir S. saprophyticus yra aptinkami kaip natūrali odos mikrobiota. Tačiau šios rūšys yra pavojingos nusilpusiam imunitetui, nes gali sukelti nosies arba šlapimo takų infekcijas. Patogeniškiausiu ir dažniausiu yra laikomas S. aureus, kuris gali sukelti įvairius susirgimus: pūlines infekcijas, sepsį, endokarditą, furunkulus, toksinį šoką, maisto intoksikacijos, odos bei kitus uždegimus. S. aureus, patekęs į pieno, m÷sos, žuvies ir kitus
maisto produktus, palankiomis sąlygomis gamina enterotoksinus, tod÷l suvalgius tokį maisto produktą galima apsinuodyti. Tuo grindžiama, kad bakterija gali augti plačiame temperatūrų diapazone (7 ° iki 48,5 ° C su 30 optimalus iki 37 ° C (Schmitt et al., 1990), PH (4,2 – 9,3 optimalus iki 7,5 (Bergdoll, 1989) ir natrio chlorido koncentracija (iki 15% NaCl). Šios savyb÷s leidžia S. aureus augti įvairiuose maisto produktuose (Le Loir et al., 2003). Kaip buvo nustatyta, kad gali išlikti gyvybingi, net šaldytame maiste (Virgin et al., 2009). 3 - 5 pav. pateiktos stafilokokų bakterijos.
3 pav. 4 pav. 5 pav. 3,4,5 pav. Staphylococcus genties bakterijos
(http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Staphylococcus_aureus_biofilm_01.jpg;
http://www.bioquell.com/technology/microbiology/methicillin-resistant-staphylococcus-aureus-mr/; http://www.solabia.fr/solabia/produitsDiagnostic.nsf)
1.2.2. Meticilinui atsparus S. aureus
Meticilinui atsparios Staphylococcus aureus (MASA) bakterijos yra beta laktamų grup÷s antibiotikams atsparių S. aureus bakterijų grup÷. Šias bakterijas nuolat arba laikinai gali platinti sveiki žmon÷s ir gyvūnai. S. aureus atsparumo antibiotikams laipsnis yra labai įvairus. Skirtingose pasaulio šalyse apie 30 – 60 proc. S. aureus padermių, suk÷lusių pūlines infekcijas, yra atsparios meticilinui (oksacilinui) (Pavilonyt÷ et al., 2008). S. aureus bakterijo atsparumu pasižymi, d÷l savo genomo, kuriame aptinkami atsparūs antibiotikų veikimui genai pavyzdžiui, kaip mecA, bla Z genai (Malachowa, DeLeo, 2010; Olsen et al., 2006). Šios patogenin÷s bakterijos dažniausi pasitaikantis hospitalinių infekcijų suk÷l÷jai ligoninių sveikatos priežiūros įstaigose (Chambers , DeLeo, 2009). Kai kurioms šalims (Austrijai, Kiprui, Latvijai, Estijai, Prancūzijai, Airijai, Didžiajai Britanijai) pavyko sumažinti ir stabilizuoti atsparių meticilinui S. aureus infekcijų skaičių, tačiau problema
lieka aktuali (Čaplikas, Andziukevičiūt÷, 2012). 2005 m. pirmą kartą pranešta žmon÷ms apie MASA aptikimą kiaul÷se. (Voss et al., 2005). Netrukus po paskelbimo vieno MASA kiaulių klono aprašymas buvo paplatintas įvairiuose pasaulio regionuose (De Neeling et al., 2007; Sergio et al., 2007; Crombé et al., 2013). Beveik visi su gyvūnais susijusiuose-MASA (LA-MASA) izoliatai priklauso MASA klonų sekos tipui 398 (ST398) kompleksas 398 (CC398) kaip labiausiai paplitęs sekos tipas. Per ST398 skirtingų sekos tipų buvo daugiausia aprašyta t011, t034, t108, t899 ir t1254 (De Neeling et al., 2007; Graveland et al., 2008). Klonas yra aptinkamas ne tik kiaul÷se, bet ir naminiuose paukščiuose, arkliuose, galvijuose (Graveland et al., 2008; Persoons et al., 2009; Van Den Eede et al., 2009; Cuny et al., 2008). Moksliniuose pranešimuose skelbiama, kad platus antimikrobinių priemonių vartojimas infekcijų prevencijai gyvulininkyst÷je yra pagrindinis MASA plitimo veiksnys. MASA paplitę tarp gyvūnų, jų randama ir gyvūnin÷s kilm÷s maiste, tad problema išlieka MASA randamo klono CC 398, kuris aptinkamas melžiamose karv÷se, kiaul÷se, veršeliuose, viščiukuose broileriuose. Dauguma paplitimo rizika lieka neaiški, tačiau pagrindinis aktualumas, d÷l plitimo žmon÷ms. MASA CC 398 aptiktas m÷soje suk÷l÷, daug diskusijų, kaip pilnai prisitaik÷ prie gyvūnų šeimininkų. Šio klono kilm÷ ir išsivystimas yra nežinomas (Chambers, Deleo, 2009; Van Loo et al., 2007). Tačiau Europos maisto saugos tarnyba informavo ES nares rinkti duomenis ir steb÷ti situaciją .
3 lentel÷. MASA CC 398 klono aptikimas skirtingose šalyse (Cuny et al., 2010)
Šalis Gyvūnai Metai
Danija Kiaul÷s 2005
Singapūras Kiaul÷s 2005
Nyderlandai Kiaul÷s, veršeliai 2006,2007
Vokietija Kiaul÷s, šunys 2007
Austrija Arkliai 2007
Belgija Arkliai, viščiukai 2007,2008
Kanada Kiaul÷s 2007
JAV Kiaul÷s 2007
Naujausi duomenys skelbia apie S. aureus MASA atsparų meticilinui, aptikimą maisto produktuose buvo pranešta iš dviejų ES narių (Austrijos ir Vokietijos), remiantis 2010 metų tyrimo duomenimis. Vokietijoje atlikti tyrimai iš kalakutų skerdenų. Buvo aptikti SPA tipai t011, t034, priskirtam CC398 klonui ir SPA tipai ST5 ir ST 9.
Austrija stafilokokų aptikimui tyr÷ skirtingas maisto produktų grupes (duonos gaminiai, g÷rimai, pieno ir sūrių iš skirtingų rūšių pieno ir pieno produktų, grudai, šokolas, kakava ir kakavos gaminiai, arbata ir kava, skirtingų m÷sos rūšių, žuvys, v÷žiagyviai, vaisiai , daržov÷s, sultys ir kiti). Aptikti koaguliazę gaminantys stafilokokai (sudar÷ 3,8 proc.), tirti kaip MASA, tačiau n÷ vienas m÷ginys nepasitvirtino (EFSA, 2012) .
1.2.3. Escherichia coli
E. coli bakterijos yra paplitę aplinkoje ir randamos kaip normali organizmo virškinamojo trakto mikrobiota visų žmonių ir šiltakraujų gyvūnų žarnyne (Doyle et al., 2006).
Tai gramneigiamos, polimorfiškos 2-3 µm ilgio ir 0,4-0,6 µm storio apvaliais galais lazdel÷s, sporų nesudaro (morfologija pateikta 6, 7, 8 pav.), tam tikros paderm÷s turi kapsulę, gerai dauginasi paprastose mitybin÷se terp÷se +37 ˚C temperatūrai ir 7,2-7,4 ph (Pavilonis et al., 2007).
Kai kurios E. coli patogenin÷s atmainos gali sukelti rimtas ligas bei komplikacijas.
Verotoksigenin÷ ir šigatoksin÷ E. coli(VETC/ŠETC) išskiria verotoksinus, šigatoksinus, kurie gali sukelti itin rimtų pasekmių organizmui (Doyle et al., 2006).
E. coli patogeniškų variantų žmon÷ms nešiotojai dažiausiai yra galvijai. Žmogui ši bakterija gali patekti per maistą, vandenį, kontaktus su užkr÷stais gyvuliais. E. coli (VETC/ŠETC) šių bakterijų sukeltos ligos paprastai pasireiškia labai intensyviu viduriavimu, su kraujo priemaiša, stipriais pilvo spazmais, dideliu karščiavimu. 3 - 5 proc. susirgusiųjų, pra÷jus keletui savaičių nuo ligos pradžios, gali išsivystyti hemolizinis ureminis sindromas, pasireiškia gausus kraujavimas, inkstų nepakankamumas, anemija (Jackovikien÷, 2006).
Escherichia coli sekos tipas t131 (ST131) yra pasauliniu mastu sukeliantis daugiausia antimikrobinių atsparumo infekcijų: pandeminis klonas, nustatytas 2008 m., susijęs su CTX-M-15 platesnio spektro beta laktamazių, tapo tarptautiniu mastu kaip daugeliui vaistų atspariu patogenu.
Tyrimai atlikti Jungtin÷se Amerikos valstijose parod÷, kad 67 proc. – 69 proc. izoliatų yra atsparūs plataus spektro cefalosporinaims, fluorochinolonams, 55 proc. ir trimetoprimui-sulfametoksazoliui, o 52 proc. daugeliui vaistų (Jahnson et al., 2010).
Japonijoje per 2008 – 2009 metus atliktų klinikinių tyrimų duomenimis atsparumą tur÷jo 23,4 proc. levoksacinui, apie 80 proc. buvo atsparūs fluorochinolonams. Aktyvų atsparumą tur÷jo citaflaksacinui (Yokota, 2012).
Taip pat buvo įrodytas platus pasiskirstymas tarp antimikrobiškai atsparių E. coli, išskirtų iš užkr÷tusiųjų žmonių Europoje (ypač Jungtin÷je Karalyst÷je), Šiaur÷s Amerikoje, Kanadoje,
Japonijoje ir Kor÷joje. Aukštas rodiklis nurodomas Azijoje, Artimuosiuose Rytuose ir Afrikoje. ST131 klonas buvo nustatytas naminiams gyvūnams, taip pat aptiktas ir maisto produktuose. Ligos klinikinis spektras yra panašus į kitų E. coli, vyraujančio šlapimo takų infekciją. Infekcija pasireiškia visų amžiaus grupių žmon÷ms (Rogers, 2011).
6 pav. 7 pav. 8 pav.
6, 7, 8 pav. E. coli (http://io9.com/5877774/bugs-from-your-colon-could-produce-the-worlds-next-great-energy-source;
http://www.fotogeriatria.net/images/laboratorio/e%20coli%20en%20macconkey1.JPG; http://www.portal24hs.net/2011/how-to-avoid-infection-with-e-coli-bacterium/)
1.3. Iš naminių gyvūnų išskirtų E. coli jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms situacija Europoje
1.3.1. E. coli paukščiuose
Atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms, E. coli izoliatų išskirtų iš paukščių (vištų) remiantis 2010 m. pateiktais tyrimų duomenimis, kuriuose dalyvavo 6 Europos sąjungos(ES) nar÷s ir viena ne ES nar÷, pateiktas 4 lentel÷je. ES nar÷se atsparumas ampicilinui buvo 35 proc., sulfonamidams 34 proc., ciprofloksacinui 29 proc., nalidikso rugščiai 26 proc., tetraciklinui 31 proc., streptomicinui 26 proc., gentamicinui 4 proc., cefotaksimui 5 proc., chloramfenikoliui 8 proc. Tarp šalių ES tyrimų rezultatų mažiausiu atsparumu iš paukščių izoliatų, pasižym÷jo Švedija (EFSA, 2012).
4 lentel÷. E. coli izoliatų išskirtų iš paukščių, atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms tarp ES šalių
* Broileriai **Vištos dedekl÷s
1.4. E. coli išskirtų iš paukščių m÷sos atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms kitose šalyse
1.4.1 E. coli paukštienoje (broilerių m÷sa)
Danijoje bei Švedijoje atliktų tyrimų rezultatai d÷l atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms viščiukų broilerių (Gallus gallus) m÷soje, pateikti žemiau tekste.
Atsparumas E. coli viščiukų broilerių m÷soje sulfanamidams nustatytas Danijoje - 15 proc., o Švedijoje - 17 proc. Danijoje ampicilinui - 16 proc., streptomicinui - 15 proc., tetraciklinui - 13 proc., o Švedijoje šiek tiek mažesnis, ampicilinui - 10 proc., streptomicinui - 4 proc., tetraciklinui - 8 proc. Abiejose šalyse užfiksuotas mažas atsparumas nalidikso rūgščiai (4 proc.), chloramfenikoliui (0,6 proc.). Atsparumą broilerių m÷soje ciprofloksacinui - 4 proc. aptiko Danijoje, o Švedijoje ciprofloksacinui atsparumo nerado. N÷ vienoje šalyje nenustatytas gentamicino atsparumas viščiukų broilerių m÷soje (EFSA, 2012).
Šalys Ampic-ilinas% Cefotaksimas % Chloramfeni-kolis % Ciprofloksa-cinas % Gentami-cinas % Nalidikso- r. % Streptomi-cinas % Sulfana-midas% Tetracik-linas% Austrija 33 0,6 7 80 4 79 37 40 28 Danija 21 0 3 9 0 8 14 20 15 Prancūzija 49 4 5 27 2 25 32 51 75 Vokietija* 78 14 21 54 6 54 61 4 57 Vokietija** 19 3 3 7 3 6 9 16 16 Nyderlandai 76 18 26 64 10 63 67 71 60 Švedija 6 1 0 - 0 13 7 7 8 Viso ES(6) 35 5 8 29 4 26 26 34 31 Šveicarija 19 1 3 35 2 34 16 31 30
1.5. Antimikrobinių medžiagų naudojamų veterinarijoje, skirtingose ES šalyse palyginimas
Suvartojamų antimikrobinių medžiagų kiekiai skirtingose pasaulio šalyse pateikti 5 lentel÷je ir skiriasi priklausomai nuo sergamumo (gydomų gyvūnų populiacijos) bei skirtingose šalyse skirtingai užauginamų skirtų maisto produkcijai gyvūnų.
Daugiausiai antibiotikų sunaudoja: Ispanija, Prancūzija, Nyderlandai, Anglija, Belgija.
5 lentel÷. Antibiotikų sunaudojami kiekiai šalyse, tonomis (European Medicines Agency, 2012)
Šalis Antibiotikų sunaudojimas (tonomis)
Austrija 63 Belgija 299 Čekija 71 Danija 119 Estija 8 Suomija 13 Prancūzija 997 Vengrija 206 Islandija 0,9 Airija 93 Latvija 7 Lietuva 16 Nyderlandai 461 Norvegija 6 Portugalija 176 Slov÷nija 8 Ispanija 1,746 Švedija 13 Anglija 456
Kaip matyti iš lentel÷s duomenų, Lietuva yra 13-toje vietoje iš 19-kos ES šalių, pagal oficialiai surinktą medžiagą d÷l antibiotikų sunaudojimo gyvulininkyst÷je.
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimų vieta ir objektai
Darbas atliktas 2011 - 2013 metais LSMU Veterinarijos akademijos Anatomijos ir fiziologijos katedroje ir LSMU atviros prieigos centro „Nemunas“ Mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje.
Tyrimo objektas – paukštienos subproduktai (kepenys) atsitiktine tvarka, prieš tai neįsp÷jus pardav÷jų, įsigyti įvairiose prekybos vietose: prekybos centruose ir turguose, kur prekiaujama žalios m÷sos produktais. Iš viso tyrimams naudota 115 maistui skirtų subproduktų m÷ginių: 10 kalakutų ir 105 vištų. Atrenkant produktus tyrimams buvo laikomasi principo, kad būtų surinkti produktai iš skirtingų tiek÷jų (pardav÷jų bei paukštynų) ir būtų iš skirtingų partijų. D÷l šios priežasties produktai rinkti skirtingais m÷nesiais. M÷giniai rinkti iš tų prekybos vietų, kurios deklaravo, jog prekiauja Lietuvoje išaugintų paukščių produkcija.
Kepenys yra parenchiminiai organai, pro kuriuos nuolat teka kraujas, tod÷l, iš esm÷s, šiuose produktuose gali būti aptinkama daugelis bakterijų rūšių, cirkuliuojančių gyvūno organizme. Taip pat, ant parenchiminių organų bakterijos gali patekti ir iš aplinkos apdorojant produkciją, o taip pat ir esant pardav÷jo kontaktui, tiesiogiai parduodant produktą pirk÷jui.
Surinkti m÷giniai buvo dedami į šaldytuvą (0 – +4 ºC temperatūroje) ir paros laikotarpyje arba iš karto, pristatomi į laboratoriją. Iš anksto buvo pasirinktos tiriamosios bakterijų rūšys, Staphylococcus genties ir Escherichia coli rūšies bakterijos.
2.2. Tiriamųjų bakterijų išskyrimas, identifikacija ir atranka tyrimams
Laboratorijoje tiriamoji medžiaga steriliose laboratorin÷se Petrio l÷kštel÷se buvo išd÷liota atskirai. Išpakavus atskirai surinktus subproduktus ir steriliu bakteriologiniu tampon÷liu išvedžiota tiek išorin÷, tiek ir vidin÷ organo (kepen÷lių) dalis (įpjovus atskiru arba kaskart dezinfekuotu skalpeliu). Sterilia bakteriologine kilpele atlikti s÷jimai į atitinkamas kiekvienai tiriamųjų bakterijų rūšiai parinktas bendro naudojimo ir selektyvias terpes.
Stafilokokams išskirti naudojome Manitolio druskos agarą (Liofilchem, Italija). Ešerichijoms išskirti atlikti s÷jimai į McConkey Agar (Oxoid)ir Endo Agar (Oxoid, Jungtin÷ Karalyst÷) – standžias mitybines terpes.
Visos bakterijos buvo kultivuotos termostate +35 ºC temperatūroje, kurioje geriausiai išreiškiamas jų augimas. Ešerichijos buvo auginamos parą laiko, o stafilokokų kultūros – 48
valandas. Escherichia coli bakterijų identifikacija atlikta klasikiniais metodais, nustatant biochemines jų savybes (6 lentel÷), o sud÷tingesniais atvejais – naudojant identifikacijos sistemą Microgen Gram-Negative Plus (Jungtin÷ Karalyst÷).
Stafilokokų genties rūšys identifikuotos nustačius, kad tiriamosios bakterijos priklauso stafilokokų genčiai. Rūšiai identifikuoti naudotos identifikavimo sistemos STAPH ID (Microgen, Jungtin÷ Karalyst÷). Genčiai nustatyti tirta bakterijų kolonijų morfologija, įvertintas jų augimas selektyviose ir universaliose terp÷se, chromogenin÷s savyb÷s, dažymasis pagal Gramą, katalaz÷s gamyba, reikalui esant, kiti bendrai priimti testai. Stafilokokų grupių nustatymui taip pat naudotas plazmos koaguliaz÷s testas, o auksinių stafilokokų identifikacijai dar ir latekso agliutinacijos reakcija naudojant kompanijų „Oxoid“ ir „Microgen“ latekso agliutinacinius serumus.
6 lentel÷. Tirtų E. coli biochemin÷s savyb÷s jas identifikuojant (Quinn et al., 1994)
Testo pavadinimas Reakcija
Laktoz÷s skaidymas Oksidaz÷s gamyba Katalaz÷s gamyba
Sieros vandenilio gamyba Nitratų redukcija
Gliukoz÷s skaidymas Manitolio skaidymas Indolio gamyba Ureaz÷s gamyba Metilo raudonojo testas Voges-Proskauerio testas ONPG testas Citratų skaidymas Inozito skaidymas Sorbitolio skaidymas Sacharoz÷s skaidymas
Lizino dekarboksilaz÷s gamyba
+ - + - + + + + - + - + - - v v v
+ – reakcija teigiama ne mažiau nei 90 % atvejų - – reakcija neigiama ne mažiau nei 90 % atvejų v – varijuojanti reakcija
Tolimesniems tyrimams paimtos ir ats÷tos tos bakterijų kolonijos, kurios prieš tai buvo išaugintos iš vienos tipiškos kolonijos ir kurių rūšys buvo patvirtintos biocheminiais testais.
2.3 Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimas
Tyrimai atlikti s÷jant grynas kultūras ant Mueller Hinton Agar (Liofilchem, Italija). Naudotas terp÷s storis l÷kštel÷se 4 mm, o jos ph tarp 7,2 ir 7,6. Atliekant jautrumo tyrimą buvo pagaminama 0,5 McFarland standarto tankio bakterijų suspensija fiziologiniame tirpale, kuria buvo suvilgomas sterilus bakteriologinis tampon÷lis ir juo išvedžiojamas visas terp÷s paviršius. Vienalytei suspensijai gauti naudota kratykl÷ (9 pav.), o optinis tankis matuotas McFarlandometru Biosan (10 pav.). Pradžiovinus terpes keletą minučių ant jų specialiu dispenseriu (Oxoid, Jungtin÷ Karalyst÷) buvo uždedami antibiotikų diskai. Šiuose diskuose esančios antimikrobinių medžiagų koncentracijos parinktos pagal EUCAST (Europos) rekomendacijas klinikiniams lūžio taškams (angl. clinical breakpoints) nustatyti. Optinio tankio patikrinimui naudoti Remel (JAV) optinio tankio standartai.
Tyrimų rezultatai vertinti matuojant milimetrine liniuote (11 pav.) sterilios zonos diametrą. Zona, kurioje bakterijų paderm÷ matomai neaugo, buvo laikoma sterilia zona.
Rezultatai interpretuoti remiantis EUCAST standartais, vertinant klinikinius lūžio taškus t.y. įvertinta atskirai kiekvienos medžiagos efektyvumas (arba bakterijų jautrumas) kiekvienai tirtai bakterijų rūšiai. Interpretacijos reikšm÷s, naudoti antibiotikų diskai ir antimikrobinių medžiagų koncentracijos juose pateiktos 7,8 lentel÷se.
7 lentel÷. Tirtų antimikrobinių medžiagų koncentracija diskuose (µg) ir jautrumo interpretacijos ribos (mm) E. coli bakterijoms
Antibiotikas S (jautri)
≥
I (vidutiniškai jautri) R (atspari) < < < < SXT (25) 16 13-15 13 GEN (10) 17 14-16 14 CIP (5) 22 19-21 19 CEFOX (30) 19 netaikoma 19 AZTREO (30) 27 24-26 24 AMP (10) 14 netaikoma 14
SXT-sulfametoksazolis-trimetoprimas, GEN-gentamicinas, CIP-ciprofloksacinas, CEFOX-cefoksitinas, AZTREO -aztreonamas, AMP-ampicilinas.
8 lentel÷. Tirtų antimikrobinių medžiagų koncentracija diskuose (µg) ir jautrumo interpretacijos ribos (mm) stafilokokų jautrumo interpretacijai nustatyti
Antibiotikas S (jautri)
≥
I (vidutiniškai jautri) R (atspari) < << < P(1) 26 netaikoma 26 CEFOX(30) 22 netaikoma 22 CIP(5) 20 netaikoma 20 E(15) 21 18-20 18 GEN(10) 18 netaikoma 18 TET(30) 22 19-21 19 SXT(25) 17 14-16 14
P-penicilinas,CEFOX- cefoksitinas, CIP-ciprofloksacinas, E-eritromicinas, GEN-gentamicinas, TET-tetraciklinas, SXT-sulfametoksazolis-trimetoprimas
9 pav. Kratykl÷ 10 pav. Mikroorganizmų suspensijos tankio matuoklis
Tam, kad palyginti gautus ešerichijų jautrumo duomenis su ankstesniųjų metų gautais duomenimis ir įvertinti pokyčius šios rūšies bakterijų populiacijose, buvo atliktas palyginimas su identiška metodika atliktais tyrimais, kurie 2008-2009 metais buvo atlikti LSMU Veterinarijos instituto mikrobiologijos laboratorijoje (Vernickait÷, 2010). Ansktesniojo tyrimo metu tyrimams naudotos vištų kepenys paimtos iš mažmenin÷s prekybos vietų, tod÷l eksperimentų dizainas (tiriamoji medžiaga, bakterijų išskyrimas ir identifikacija, jautrumo tyrimo metodas) idealiai sutampa, išskyrus kai kurių antimikrobinių medžiagų pasirinkimą.
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Tiriamųjų bakterijų paplitimas naminių paukščių kepen÷l÷se ir šių
bakterijų atranka tyrimams
Darbo metu ištirta 115 m÷ginių (105 vištų subproduktų m÷ginių ir 10 kalakutienos subproduktų m÷ginių). Iš viso atlikta 230 s÷jimų po 115 stafilokokams ir ešerichijoms išskirti.
Iš visų naminių paukščių tirtų m÷ginių (12 pav.) 93,3 proc. išaugintos enterobakterijos, o stafilokokai išauginti 87,8 proc. atvejų.
Iš vištų kepen÷lių m÷ginių enterobakterijos išskirtos 93,3 proc. atvejų (n=98), o stafilokokai – 87,6 proc. atvejų (n=92) (13pav.). Visuose kalakutų kepen÷lių m÷giniuose aptiktos enterobakterijos - 100 proc. (n=10), o stafilokokai nustatyti 90 proc. atvejų (n=9) (14 pav.).
12 pav. Enterobakterijų ir stafilokokų paplitimo dažnis naminių paukščių kepen÷l÷se (n=115)
93,3% 6,7%
87,6% 12,4%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Enterobakerijos Stafilokokai
Tinkami m÷giniai tyrimui Nerasta
13 pav. Enterobakterijų ir stafilokokų paplitimo dažnis naminių vištų kepen÷l÷se (n=105)
100%
90% 10%
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Enterobakerijos Stafilokokai
Tinkami m÷giniai tyrimui Nerasta
14 pav. Enterobakterijų ir stafilokokų paplitimo dažnis kalakutų kepen÷l÷se ( n=10)
Tyrimų metu įvairiuose m÷giniuose augo ne po vieną tiriamųjų bakterijų grupių koloniją, tačiau siekiant, kad bakterijų paderm÷s nesikartotų, iš kiekvienos l÷kštel÷s, kuriose nustatytas ešerichijų ir stafilokokų augimas atrinkta tik po vieną kiekvienos bakterijų genties koloniją tolimesniems tyrimams. Kolonijos parinktos pagal tipišką tiriamajai genčiai ar rūšiai augimą. Tokiu būdu, atsparumo antibiotikams ir bakterijų identifikacijos tyrimams atrinkta 230 bakterijų izoliatų. Atrenkant stafilokokų kolonijas tolimesniems tyrimams atkreiptas d÷mesys į manitolio skaldymą pirminio s÷jimo terp÷je (manitolio-druskos agare) ir jei buvo šį angliavandenį skaldančių kolonijų, pirmenybe atrenkant kolonijas buvo teikta manitolį skaldančioms kolonijoms. Tai atlikta siekiant atrinkti galimai Staphylococcus aureus rūšies stafilokokus, kadangi šį rūšis laikoma patogenine žmon÷ms ir dažniausiai aprašoma kaip atspari
antibiotikams, lyginant su kitomis stafilokokų rūšimis. Atrenkant enterobakterijų padermes, pirmiausiai atkreiptas d÷mesys į laktoz÷s skaldymą pirmin÷je terp÷je, kadangi šio angliavandenio skaldymu pasižymi Escherichia coli, kurios yra žinomos kaip itin gerai aplinkoje prisitaikę bakterijos, turinčios mobilius genetinius elementus (integronus ir plazmides), kurie koduoja atsparumą įvairiems antibiotikams ir kurie gali būti perduoti kitoms bakterijoms.
Iš visų m÷ginių, kuriuose augo stafilokokai, atrinkus manitolį skaldančias kolonijas ir atlikus agliutinacijos testus auksiniam stafilokokui patvirtinti, preliminariai identifikuotos 23 auksinių stafilokokų paderm÷s. Šios paderm÷s buvo pateiktos Veterinarijos instituto Mikrobiologinių tyrimų laboratorijos darbuotojams, kur buvo patvirtintos kaip auksiniai stafilokokai atlikus polimeraz÷s grandininę reakciją su rūšiai būdingais 16 subvieneto pradmenimis.
Atrinkus laktozę skaldančias bakterijų kolonijas ir atlikus papildomus identifikavimo testus 6 lentel÷, identifikuotos ir tolimesniems tyrimams atrinktos 67 Escherichia coli rūšies kultūros. Iš jų 6 paderm÷s išskirtos iš kalakutų kepen÷lių, o likusios iš vištų (17 ir 18 pav.). Šiuose pav. taip pat pateiktas E. coli paplitimo dažnis lyginant su visomis enterobakterijų šeimos bakterijomis, kurios buvo aptiktos mitybin÷se terp÷se.
Iš tirtų kalakutienos kepen÷lių auksinis stafilokokas nustatytas - 55,6 proc. atvejų (15 pav.), o vištų m÷giniuose - 19,6 proc. (16 pav.)
55,6% 44,4%
Aptik ta S.aureus Neaptik ta
19,6%
79,3%
Aptik ta S.aureus Neaptik ta
16 pav. S. aureus aptikimas vištų m÷giniuose, proc. ( n=92)
60% 40%
Skaldo laktozę Neskaldo laktoz÷s
17 pav. Enterobakterijos kalakutienos kepen÷l÷se (n=10)
62,2% 37,8%
Skaldo laktozę Neskaldo
3.2. Bakterijų jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimo
rezultatai
3.2.1. Staphylococcus spp. ir E. coli jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms naminių paukščių kepen÷l÷se (bendrieji jautrumo duomenys)
Staphylococcus spp. atsparumas naminiuose paukščiuose buvo nustatytas visiems tiriamiems antibiotikams. Kaip matome iš 19 pav., dažniausiai atsparumas pasireišk÷ sulfametoksazoliui-trimetoprimui - 57,4 proc., penicilinui - 54,5 proc., eritromicinui - 28,7 proc. 54,5% 45,5% 13,9% 12,9% 73,2% 11,9% 88,1% 7,9% 92,1% 8,9% 91,1% 28,7% 8,9% 62,4% 57,4% 1,0% 41,6% 0% 20% 40% 60% 80% 100% P TE FOX CIP CN E SXT A n ti b io ti k a i Atsparios Vidutiniškai atsparios Jautrios
CN - gentamicinas, TE - tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas, P - penicilinas, FOX - cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
19 pav. Stafilokokų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms, išskirtų iš naminių paukščių subproduktų (n=101)
Mažiausiai stafilokokų padermių buvo atsparios fluorochinolonui ciprofloksacinui (7,9 proc.), cefoksitinui (11,9 proc.) ir aminoglikozidų grup÷s antibiotikui gentamicinui (8,9 proc).
E. coli išskirtos iš naminių paukščių subproduktų dažniausiai buvo atsparios ampicilinui - 64,2 proc., sulfametoksazolio-trimetoprimui dariniui - 37,3 proc., ciprofloksacinui - 25,4 proc. aztreonamui - 23,3 proc. ir cefoksitinui - 22,4 proc. (20 pav.). Rečiausiai tirtosios ešerichijos buvo atsparios gentamicinui – 6 proc., nors dar 9 proc. tiriamųjų ešerichijų buvo vidutiniškai atsparios šiam antibiotikui.
64,2% 35,8% 22,4% 77,6% 25,4% 4,5% 70,1% 6,0% 9,0% 85,0% 37,3% 62,7% 23,9% 3,0% 73,1% 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP FOX CIP CN SXT ATM A n ti b io ti k a i Atsparios Vidutiniškai atsparios Jautrios
CN - gentamicinas, CIP - ciprofloksacinas, FOX - cefoksitinas, ATM - aztreonamas, AMP - ampicilinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas
20 pav. E. coli atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms, išskirtų iš naminių paukščių subproduktų (n=67)
3.2.2. Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms kalakutienos kepen÷l÷se
Iš kalakutienos kepen÷lių išskirtų Staphylococcus bakterijų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms rezultatai parod÷ (21 pav.), jog dažniausiai stafilokokai buvo atsparūs sulfametoksazoliui-trimetoprimui - 55, 5 proc. bei penicilinui G - 33,3 proc. Neaptikta padermių atsparių fluorochinolonams (ciprofloksacinas). Mažas atsparumo procentas tarp šių padermių nustatytas eritromicinui, gentamicinui, tetraciklinui ir cefoksitinui. Vidutiniškai atsparių Staphylococcus bakterijų padermių kalakutų kepen÷l÷se nebuvo rasta.
66,7% 33,3% 88,9% 11,1% 88,9% 11,1% 100% 88,9% 11,1% 88,9% 11,1% 44,4% 55,5% 0% 20% 40% 60% 80% 100% P TE FOX CIP CN E SXT A n ti b io ti k a i Jautrios Atsparios
CN - gentamicinas, TE - tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas,P - penicilinas, FOX - cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
21 pav. Stafilokokų genties bakterijų, išskirtų iš kalakutų kepen÷lių, jautrumo antibiotikams duomenys (n= 9)
22 pav. pateikta auksinių stafilokokų, išskirtų iš kalakutų kepen÷lių jautrumo antimikrobin÷ms medžiagoms tyrimų rezultatai.
40% 60% 80% 20% 80% 20% 100% 80% 20% 80% 20% 60% 40% 0% 20% 40% 60% 80% 100% P TE FOX CIP CN E SXT A n ti b io ti k a i Jautrios Atsparios
GEN - gentamicinas, TET - tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas, P - penicilinas, FOX - cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
22 pav. S. aureus jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms kalakutienos kepen÷l÷se (n= 5 ) Lyginant 21 ir 22 paveikslus matosi, jog auksiniai stafilokokai buvo dažniau atsparūs antibiotikams nei bendras stafilokokų genties bakterijų vidurkis. Bendras S. aureus atsparumas
kalakutų kepen÷l÷se buvo didžiausias penicilinui 60 proc. bei sulfametoksazoliui - trimetropinui 40 proc. Analizuojant iš kalakutų kepen÷lių išskirtų auksinių stafilokokų atsparumą skirtingoms antimikrobin÷ms medžiagoms nustatyta, kad kiekviena paderm÷ pasižym÷jo nevienodu atsparumu skirtingiems antibiotikams, o viena paderm÷ buvo atspari ne mažiau nei 4 skirtingų klasių antibiotikams (23 pav.). Viena paderm÷ buvo jautri visoms tirtosioms antimikrobin÷ms medžiagoms. Vienas izoliatas buvo atsparus cefoksitinui, kas rodo, jog ši paderm÷ turi būti traktuojama kaip atspari visiems beta-laktaminiams antibiotikams t.y. meticilinui atsparus S. aureus. D÷l šios priežasties, buvo paruoštas izoliato DNR tolimesniems molekuliniams tyrimams, kurie atlikti Veterinarijos instituto Mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje. Tyrimai parod÷, jog ši paderm÷ tur÷jo beta-laktaminiams antibiotikams koduojamą atsparumo geną mecA. 0 1 2 3 4 Antibiotikų atsparumas vnt. 1 2 3 4 5 S.aureus m÷giniai SXT E CN FOX TE P
CN - gentamicinas, TE - tetraciklinas, SXT – sulfametoksazolis - trimetoprimas, P - penicilinas, FOX - cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
23 pav. S. aureus išskirtų iš kalakutų kepen÷lių atsparumas skirtingų antibiotikų klasių atstovams
3.2.3 E. coli jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms kalakutienos kepen÷l÷se
Kaip matome 24 pav., jog E. coli išskirtų iš kalakutienos subproduktų atsparumas dažniausiai pasireišk÷ ampicilinui - 50 proc., aztreonamui - 66, 7 proc., kiek mažesnis sulfametoksazoliui-trimetoprimui - 33,3 proc. Mažiausias atsparumas nustatytas ciprofloksacinui bei cefoksitinui.
50% 50% 83,3% 16,7% 83,3% 16,7% 100% 66,7% 33,3% 33,3% 66,7% 0% 20% 40% 60% 80% 100% AMP FOX CIP CN SXT ATM A n ti b io ti k a i Jautrios Atsparios
CIP - ciprofloksacinas, FOX - cefoksitinas, ATM - aztreonamas, AMP - ampicilinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas; CN - gentamicinas
24 pav. E. coli išskirtų iš kalakutienos kepen÷lių, jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms (n=6)
3.2.4. Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobin÷ms medžiagoms vištų kepen÷l÷se
Analizuojant Staphylococcus spp. bakterijų atsparumą vištų subproduktuose, matome (25 pav.), jog dažniausiai atsparumas pasireišk÷ sulfametoksazoliui-trimetoprimui - 57,6 proc., penicilinui G - 56,5 proc., eritromicinui - 30,4 proc. Žymiai rečiau stafilokokai buvo atsparūs gentamicinui ir ciprofloksacinui (8,7 proc.). Nustatyta, net 12 procentų padermių atsparių cefoksitinui.
56,5% 43,5% 14,1% 14,1% 71,8% 12,0% 88,0% 8,7% 91,3% 8,7% 91,3% 30,4% 9,8% 59,8% 57,6% 1,0% 41,4% 0% 20% 40% 60% 80% 100% P TE FOX CIP CN E SXT A n ti b io ti k a i Atsparios Vidutiniškai atsparios Jautrios
CN gentamicinas, TET tetraciklinas, SXT sulfametoksazolistrimetoprimas, P penicilinas, FOX -cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
25 pav. Stafilokokų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms vištų kepen÷l÷se (n=92)
Kaip matome iš 26 pav., iš visų paukštienos subproduktų dažnesnis stafilokokų atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms nustatytas vištienoje negu kalakutienoje visiems antibiotikams, išskyrus gentamiciną. Ciprofloksacinui atsparios paderm÷s rastos tik vištienos subproduktuose.
CN - gentamicinas, TET - tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas, P - penicilinas, FOX - cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
26 pav. Stafilokokų atsparumo antimikrobin÷ms medžiagoms palyginimas, paukštienos kepen÷lių subproduktuose
Iš vištienos kepen÷lių subproduktų m÷ginių, kuriuose buvo aptiktos S. aureus (27 pav.) nustatyta, jog šios bakterijos dažniausią atsparumą tur÷jo penicilinui G - 77,8 proc., sulfametoksazoliui-trimetoprimui - 55,6 proc., eritromicinui - 38,9 proc. Šie auksiniai stafilokokai buvo nustatyti kaip vidutiniškai atsparūs eritromicinui - 5,6 proc. ir tetraciklinui - 38,9 proc. 77,8% 22,2% 16,7% 38,9% 44,4% 11,1% 88,9% 11,1% 88,9% 22,2% 77,8% 38,9% 5,6% 55,5% 55,6% 44,4% 0% 20% 40% 60% 80% 100% P TE FOX CIP CN E SXT A n ti b io ti k a i Atsparios Vidutiniškai atsparios Jautrios
CN - gentamicinas, TET - tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas, P - penicilinas, FOX - cefoksitinas, CIP - ciprofloksacinas, E - eritromicinas
27 pav. S. aureus atsparumas antimikrobin÷ms medžiagoms vištų kepen÷l÷se (n=18)
Kaip matome, (28 pav.) vištienos subproduktuose ir kalakutienos subproduktuose S. aureus atsparumo dažnis buvo skirtingas. Bendra tendencija, ta, jog S. aureus dažnu atsparumu pasižym÷jo penicilinui, eritromicinui, gentamicinui, sulfametoksazoliui-trimetoprimui. S. aureus bakterijų, išskirtų iš vištienos subproduktų, atsparumas buvo dažnesnis, nei išskirtų iš kalakutienos. Iš kalakutienos subproduktų išskirtos S. aureus bakterijos dažniau buvo atsparios tik tetraciklinui bei cefoksitinui, o ciprofloksacinui atsparių padermių kalakutienoje visai nerasta.
