PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ VAISTINIŲ OŽRAGIŲ (TRIGONELLA FOENUM- GRAECUM) AUGALINIŲ ŽALIAVŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO
AKTYVUMO TYRIMAS “. 1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 m. gegužės 21 d. Nerijus Litvinas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 m. gegužės 21 d. Nerijus Litvinas
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
DEIVIDAS BURDULIS
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
2020 m. gegužės 21 d. Sonata Trumbeckaitė
(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)
Baigiamojo darbo recenzentas
Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.
(vardas, pavardė) (parašas)
Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
NERIJUS LITVINAS
VAISTINIŲ OŽRAGIŲ (TRIGONELLA FOENUM- GRAECUM) AUGALINIŲ ŽALIAVŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Deividas Burdulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data:
VAISTINIŲ OŽRAGIŲ (TRIGONELLA FOENUM- GRAECUM) AUGALINIŲ ŽALIAVŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIRADIKALINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Deividas Burdulis Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas Nerijus Litvinas Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 7
SUMMARY ... 8
SANTRUMPOS... 10
ĮVADAS ... 11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA... 13
1.1. Vaistinės Ožragės apibūdinimas ir morfologiniai požymiai ... 13
1.2. Augalo paplitimas ir dauginimasis ... 13
1.3. Vaistinių ožragių žaliavos cheminė sudėtis ... 14
1.4. Vaistinės ožragės žaliavos vartojimas medicinoje ... 15
1.4.1. Panaudojimas tradicinėje medicinoje ... 15
1.4.2. Antidiabetinis poveikis ... 15
1.4.3. Antioksidantinis ir priešvėžinis poveikis ... 16
1.4.4. Antilitogeninis poveikis ... 17
1.4.5. Priešuždegimis ir antipiretinis poveikis ... 17
1.4.6. Antidislipideminis ir antihipertriglicerideminis poveikis ... 18
1.4.7. Antinociceptinis ir analgetinis poveikis ... 19
1.4.8. Antibakterinis poveikis ... 19
1.5. Vaistinės ožragės augalinės žaliavos vartojimas ir dozavimas ... 20
1.6. Toksiškumas, nepageidaujamos reakcijos ir galima sąveika su vaistais ... 20
1.7. Svarbiausių vaistiniuose ožragėse randamų biologiškai aktyvių junginių apžvalga ... 21
1.7.1. Bendra flavonoidų apžvalga ... 21
1.8. Laisvieji radikalai, antioksidantai, antiradikalinis aktyvumas ... 24
2. TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI ... 26
2.1. Tyrimo objektas ... 26
2.2. Tyrimo metodai ... 26
2.2.1. Naudoti reagentai, medžiagos ... 26
2.2.2. Naudota aparatūra ir priemonės ... 27
2.2.3. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 28
2.2.4. Ekstraktų ruošimo metodika ... 28
2.2.5. Suminis polifenolinių junginių nustatymas ... 29
2.2.6. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu ... 29
2.2.7. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas titrimetriniu metodu ... 30
2.2.8. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu... 31
2.2.10. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu... 33
2.3. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas ... 34
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35
3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis ... 35
3.2. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas polifenolinių junginių kieko nustatymui ... 36
3.3. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas suminiam flavonoidų kieko nustatymui ... 39
3.4. Suminio polifenolinių junginių kiekio nustatymas vaistinių ožragių augalinėse žaliavose spektrofotometriniu metodu ... 41
3.4.1 Suminio fenolinių junginių kitimo dinamika augalo vegetacijos laikotarpiu ... 41
3.4.2 Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos fenolinių junginių kiekybinė sudėtis ... 42
3.5. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 43
3.5.1 Flavonoidų kitimo dinamika augalo vegetacijos laikotarpiu ... 43
3.5.2. Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos flavonoidų kiekybinė sudėtis... 44
3.6. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas titrimetriniu metodu ... 45
3.6.1 Askorbo rūgšties kitimo dinamika augalo vegetacijos laikotarpiu ... 45
3.6.2 Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos askorbo rūgšties kiekybinė sudėtis ... 46
3.7. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniais metodais ... 46
3.7.1 Antiradikalinio aktyvumo kitimo dinamika pagal ABTS metodiką augalo vegetacijos laikotarpiu .... 47
3.7.2 Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos antiradikalinis aktyvumas pagal ABTS metodiką ... 48
3.7.3. Redukcinio aktyvumo kitimo dinamika augalo vegetacijos laikotarpiu pagal FRAP metodiką ... 48
3.7.4. Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos redukcinis aktyvumas pagal FRAP metodiką ... 49
3.7.5. Antiradikalinio aktyvumo, nustatyto DPPH metodu kitimo dinamika augalo vegetacijos laikotarpiu ... 50
3.7.6 Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos antiradikalinis aktyvumas nustatytas DPPH metodu ... 51
3.8. Vaistinių ožragių polifenolių kiekinės sudėties ir jų ekstraktų antiradikalinio aktyvumo koreliacinių ryšių įvertinimas ... 52
IŠVADOS... 54
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 55
SANTRAUKA
N. Litvino magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas Doc. Dr. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas.
Darbo pavadinimas: Vaistinių ožragių (Trigonella foenum-graecum) augalinių žaliavų
cheminės sudėties ir antiradikalinio aktyvumo tyrimas
Darbo tikslas: Nustatyti Lietuvos rinkoje esančių vaistinių ožragių (Trigonella
foenum-graecum) sėklų ir žolės cheminę sudėtį, bei palyginti užaugintos vaistinės ožragės polifenolinų junginių, flavonoidų ir askorbo rūgšties cheminės sudėties įvairavimą vegetacijos metu, bei įvertinti ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1. Parinkti tinkamiausią vaistinės ožragės augalinės žaliavos ekstrakcijos tirpiklį ir optimalias ekstrakcijos sąlygas, užtikrinančius didžiausią polifenolinių junginių ir flavonoidų išeigą. 2. Palyginti Lietuvos rinkoje esančią ir Lietuvos gamtinėmis sąlygomis užaugintą vaistinių ožragių augalinių žaliavų biologiškai aktyvių junginių kiekybinę ir kokybinę sudėtį. 3. Nustatyti flavonoidų, fenolinių junginių, askorbo rūgšties kiekybinės sudėties kitimo dinamiką vaistinės ožragės vegetacijos metu. 4. Įvertinti vaistinės ožragės ekstraktų antiradikalinį aktyvumą. 5. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp vaistinės ožragės fenolinių junginių, flavonoidų ir askorbo rūgšties kiekio ir jų ištraukų antiradikalinio aktyvumo.
Tyrimo metodai: Suminis polifenolių ir flavonoidų junginių kiekis nustatytas
spektrofotometriniu metodu. Askorbo rūgšties nustatymui naudotas titrimetrinis metodas. Antiradikalinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriškai ABTS, FRAP ir DPPH metodais.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Didžiausias suminis polifenolinių junginių ir flavonoidų kiekis
SUMMARY
Master thesis of N. Litvinas / associate professor Deividas Burdulis Dr.; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy – Kaunas.
The topic of master thesis: Investigation of chemical composition and antiradical activity of
herbal raw material (Trigonella foenum-graecum).
The aim of the research: To perform the qualitative and quantitative composition of
polyphenolic compounds of fenugreek (Trigonella foenum-graecum) on the Lithuanian market, and to compare the variation of qualitative and quantitative composition of polyphenolic compounds of medicinal fenugreek during vegetation, to determine the amount of ascorbic acid and their extracts.
The objectives of the research: 1. To select the most suitable solvent for the extraction of
fenugreek plant raw material and the optimal extraction conditions that ensure the highest yield of polyphenolic compounds and flavonoids. 2. To compare the quantitative and qualitative composition of biologically active substances of ryegrass raw material available on the Lithuanian market and grown under natural conditions in Lithuania. 3. To determine the dynamics of changes in the quantitative composition of flavonoids, phenolic compounds, ascorbic acid during the vegetation of fenugreek. 4. To evaluate the antiradical activity of fenugreek extracts. 5. To evaluate the correlations between the content of fenugreek phenolic compounds, flavonoids and ascorbic acid and the antioxidant activity of their extracts.
The methods of research: The total content of polyphenols and flavonoid compounds was
determined spectrophotometrically. A titrimetric method was used to determine ascorbic acid. Antioxidant activity was determined spectrophotometrically by ABTS, FRAP and DPPH methods.
Results and conclusions: The highest total content of polyphenolic compounds and flavonoids
PADĖKA
SANTRUMPOS
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo hidratas;
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia; FC – Folin-Ciocalteau metodas;
GRE – galo rūgšties ekvivalentas; RE – rutino ekvivalentas;
TE – trolokso ekvivalentas;
TPTZ – 2,4,6-tri-(2-piridil)-1,3,5-triazinas; KK – koreliacijos koeficientas;
ĮVADAS
Žmogaus organizmą nuolat veikiant žalingiems aplinkos veiksniams, susidaro dideli laisvųjų radikalų kiekiai, kurie sukelia pažaidą, vadinamą oksidaciniu stresu. Laisvųjų radikalų pagausėjimas organizme yra pagrindas širdies ir kraujagyslių, onkologinių ligų atsiradimui bei senėjimo procesų greitėjimui (1).
Vaistinių ožragių (Trigonella foenum-graecum) augalinė žaliava vartojama jau labai seniai, o lapai ir sėklos įtraukti į Europos farmakopėją, kaip vaistinės augalinės žaliavos. Vaistinės ožragės sėklos tradicinėje medicinoje laikoma kaip diuretinė, atsikosijimą bei žarnyno ir skrandžio sutrikimams lengvinanti priemonė. Augalo žaliava taip pat buvo naudojama bronchitui gydyti, karščiavimui ir gerklės skausmui mažinti, opos ir vėžio gydymui. Vaistinė ožragė šiuo metu yra komerciškai prieinama kapsulių pavidalu, kurias skiria alternatyviosios medicinos specialistai, kaip maisto papildą, siekiant kontroliuoti diabetą (2). Šis augalas kaupia daug naudingų biologiškai veiklių medžiagų – polifenolinius junginius, saponinus, vitaminus ir mineralus. Vieni iš reikšmingiausių aktyvių medžiagų yra polifenoliniai junginiai (3). Ištirta, jog jie pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, priešvirusiniu, antibakteriniu ir priešvėžiniu poveikiu (4).
Visame pasaulyje atlikta daug vaistinių ožragių gydomojo poveikio tyrimų, tačiau kiekybinių ir kokybinių polifenolinių junginių ir jų antioksidacinio aktyvumo tyrimų trūksta. Polifenolinių junginių kiekinė ir kokybinė sudėtis priklauso nuo kelių parametrų: augalo augimo vietos, klimato sąlygų ir vegetacijos periodo. Rezultatai gauti tyrimo metu suteiks žinių apie vaistinių ožragių polifenolinių junginių sudėties ir antioksidacinio aktyvumo įvairavimą vaistinių ožragių lapuose, sėklose ir stiebuose, surinktose skirtingu vegetacijos laikotarpiu.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti Lietuvos rinkoje esančiai vaistinių ožragių (Trigonella
foenum-graecum) sėklų ir žolės cheminę sudėtį, bei palyginti užaugintos vaistinės ožragės cheminės sudėties įvairavimą vegetacijos metu, nustatyti jų ekstraktų askorbo rūgšties kiekį ir antiradikalinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausią vaistinės ožragės augalinės žaliavos ekstrakcijos tirpiklį ir optimalias ekstrakcijos sąlygas, užtikrinančius didžiausią polifenolinių junginių ir flavonoidų išeigą. 2. Palyginti Lietuvos rinkoje esančia ir Lietuvos gamtinėmis sąlygomis užaugintą vastinių ožragių
žaliavos biologiškai aktyvių medžiagų kiekybinę ir kokybinę sudėtį.
3. Nustatyti flavonoidų, fenolinių junginių, askorbo rūgšties kiekybinės sudėties kitimo dinamiką vaistinės ožragės vegetacijos metu.
4. Įvertinti vaistinės ožragės ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vaistinės Ožragės apibūdinimas ir morfologiniai požymiai
Vaistinė ožragė (Trigonella foenum – graecum) yra vienmetis, ankštinis augalas, užaugantis iki 30-80 cm aukščio. Stiebas stačias, šakotas, žalios spalvos, mažai plaukuotas. Lapai – trilapiai, kiaušinio formos, 1-5cm ilgio, 0,5-1,5 cm pločio, viršūnė suapvalinta, pakraščiai dantyti, su 2-4 cm ilgio grioveliais, žalios spalvos ir skleidžia specifinį kvapą (5,6). Jauniems šviežiems lapams būdingas kartokas skonis, o džiovinti lapai – salsvi, kvepia šienu (7). Žiedai smulkūs, atskiri, susitelkę į kuokštelius stiebo ir šakelių viršūnėse. Taurelė apie 7-8 mm ilgio. Žiedų spalva varijuoja nuo šviesiai gelsvos iki violetinės spalvos. Dažniausiai žydi birželio mėnesį. Vaisiai, cilindriniai, ploni, gelsvai rudi, 5-19 cm ilgio, 3-5 cm pločio, lygus arba plaukuoti, susiaurėję į snapą. Joje daug (iki 20) rudos arba gelsvai rudos spalvos kampuotų, stačiakampių, panašių į akmenukus sėklų, 3-5 mm ilgio ir 2-5 mm pločio, kurios sunoksta rugpjūčio-rugsėjo mėnesiais (5).
1.2. Augalo paplitimas ir dauginimasis
Irake vaistinės ožragės pradėta auginti jau apie 4000 m. Pr. Kr. Tai vienas iš seniausių vaistinių augalų. Augalas tikriausiai yra kilęs iš Viduržemio jūros rytinės dalies, Vakarų Azijos arba Indijos. Augalo botaninis pavadinimas reiškia „graikiškas šienas“ (7). Senovės Egipte vaistinės ožragės buvo naudojamos kulinarijoje, medicinoje ir balzamuojant kūnus. Senovės graikai ir romėnai ožrages taip pat naudojo maistui ir ligoms gydyti. Asirijoje maždaug VII amžiuje pr. Kr. ožragė veikiausiai buvo auginama ir vertinama kaip prieskonis (7). Šiandien ji plačiai auginama Viduržemio jūros šalyse, Prancūzijoje, Indijoje, Šiaurės Afrikoje, Argentinoje ir Jungtinėse Amerikos Valstijose kaip maistas, pagardai, vaistai, dažai ir pašarų augalai. Augalas mažai auginamas Pietryčių Azijoje, bet plačiai naudojamas kaip prieskonis, kurį prieš šimtmečius pristatė arabų ir Indijos keliautojai. Indija yra didžiausia pasaulio vaistinių ožragių sėklų gamintoja. Prieskoniai eksportuojami kaip visos sėklos miltelių pavidalu, taip pat išgauto aliejaus pavidalu. Lietuvoje retai auginama vaistinė ožragė, tik botanikos sodų, mokslo ir mokymo įstaigų kolekcijose (8).
priemoliuose arba smėlio ir priemolio dirvožemiuose, kurių pH yra 5,8–8,2, taip pat auga smėlio ir žvyro dirvožemiuose, bet neauga rūgščiuose dirvožemiuose. Šaltoje temperatūroje ir drėgnose dirvožemiuose augimas sulėtėja. Kaip ankštiniam augalui, reikia labai mažai arba visiškai nereikia azoto trąšų, nes jis gali pasigaminti azotą ir tuo pačiu praturtinti dirvožemį azotu. Vaistinių ožragių sėklas rekomenduojama sėti į dirvą nuo pavasario vidurio iki jo pabaigos maždaug 6 mm gylyje, 20-25 laipsnių temperatūroje. Nupjauti sėjinukus rekomenduojama tada, kai pasirodys pirmieji lapeliai. O ankštis rinkti tada kai iš žalių jos virs rudomis, prieš išimant ir sutrinant sėklas reikia sudžiovinti (6). Iš susmulkintų sėklų gaminami milteliai, tinktūros, skystieji ekstraktai (5).
1.3. Vaistinių ožragių žaliavos cheminė sudėtis
Mokslinėje literatūroje yra pateikta nemažai vaistinių ožragių fitocheminės sudėties tyrimų. Jungtinėse Amerikos Valstijose atlikti tyrimai (USDA) 2010 m. parodė, kad vaistinių ožragių sėklų sudėtis (100 g valgomosios porcijos) yra: 8,84 g vandens, 23,00 g baltymų, angliavandenių – 58,35 g, o bendras skaidulų kiekis sudarė 24,6 g.
Taip pat iš Trigonella foenum-graecum sausų sėklų buvo išgauta bendrų lipidų – 6,413 g. Bendrą lipidų kiekį sudarė 84,1% neutralių lipidų, 5,4% glikolipidų ir 10,5% fosfolipidų. Neutralius lipidus daugiausia sudarė triacilgliceroliai (86%), diacilgliceroliai (6,3%) ir nedidelį kiekį monoacilgliceroliai, laisvosios riebalų rūgštys ir steroliai. Taip pat buvo aptikta ir mineralinių medžiagų tokių kaip Ca 176 mg, Fe 33,53 mg, Mg 191 mg, P 296 mg, K 770 mg, Na 67 mg, Zn 2,50 mg, Cu 1,11 mg, Mn 1,228 mg, Se 6,3 μg. Nustatyti ir tam tikri vitaminai: vitaminas C 3 mg, tiaminas 0,322 mg, riboflavinas 0,366 mg, niacinas 1,640 mg, vitaminas B-6 0,6 mg, bendra folio rūgštis 57 μg, vitaminas A 60 IU. Bendras sočiųjų riebalų rūgščių kiekis vaistinės ožragės sėklose: 1,46 g, fitosterolių 140 mg, triptofano 0,391 g, treonino 0,898 g, leucino 1,757 g, lizino 1,684 g, metionino 0,338 g, cistino 0,369 g, fenilalanino 1,089 g, tirozino 0,764 g, valino 1,102 g, arginino 2,465 g, histidino 0,668, alanino 1,020 g, asparagino rūgšties 2,708 g, glutamo rūgšties – 3.988 g , 1,306 g glicino, 1,198 g prolino ir 1,215 g serino (3).
(9,10).
Stiebuose yra nemažai steroidinių sapogeninų, apie 28% gleivių, 22% baltymų ir eterinių aliejų. Aptinkami du furastanolio glikozidai, F-žiedo diosgenino pirmtakai, taip pat hederagininiai glikozidai. Taip pat stiebuose yra alkaloidų tokių kaip trigonellinas, trigokumarinas, trimetilkumarinas (4).
1.4. Vaistinės ožragės žaliavos vartojimas medicinoje
1.4.1. Panaudojimas tradicinėje medicinoje
Vaistinių ožragių sėklos tradicinėje medicinoje laikoma kaip diuretinė, atsikosijimą lengvinanti, žarnyno ir skrandžio sutrikimams lengvinanti priemonė. Tradiciškai augalo sėklos naudojamos metabolizmui skatinti ir cukraus kiekiui kraujyje kontroliuoti, sergant cukriniu diabetu, skrandžio ir virškinimo sutrikimų mažinimui, kraujospūdžio mažinimui ir anemijai gydyti. Augalo lapų ekstraktai taip pat buvo naudojami bronchitui gydyti, karščiavimui ir gerklės skausmui mažinti, odos dirginimui mažinti, opos ir vėžio gydymui (2). Vaistinių ožragių sėklos taip pat naudojamos skatinti laktaciją krūtimi maitinančioms mamoms, kad kompensuotų nepakankamą krūties pieno tiekimą kūdikiui. Taip pat vaistinis augalas buvo naudojamas kaip afrodiziakas ir geriamojo insulino pakaitalas. Malaizijoje augalas buvo naudojamas širdies ligoms, lėtiniam kosuliui ir blužnies ir kepenų sutrikimams ir nudegimams gydyti. Augalas naudojamas kaip aliejų mikstūros sudedamoji dalis mažiems raupams gydyti (2).
1.4.2. Antidiabetinis poveikis
kiekį kraujyje ir jautrumą insulinui, palyginti su diabetine grupe. Po vaistinių ožragių aliejaus skyrimo diabetu sergančioms žiurkėms buvo pastebėta mažiau kasos B ląstelių pažeidimų. Vaistinių ožragių aliejus diabetu sergančioms žiurkėms atkūrė beveik iki normalaus lygio superoksido dismutazę, katalazę, glutationo peroksidazę ir sumažinto glutationo kiekį inkstuose. Diabetu sergančioms žiurkėms gydytoms vaistinio augalo aliejumi, buvo atstatyta beveik įprastą kasos ir inkstų struktūrą. Tyrimas parodė, kad vaistinių ožragių aliejus yra veiksmingas gerinant diabetą ir mažinant inkstų toksiškumą (12).
1.4.3. Antioksidantinis ir priešvėžinis poveikis
Vaistinėje ožragėje yra trigonelino, alkaloido, kuris naudojamas gydant gimdos kaklelio ir kepenų vėžį (6). Taip pat atlikus mokslinį tyrimą buvo nustatyta, kad vaistinių ožragių sėklų milteliai kuriuose yra 0,05% arba 0,1% diosgenino, slopino visą storosios žarnos nenormalų kripto židinį ir lyginant su kontrole. Diosgeninas priklausomai nuo dozės inhibavo ląstelių augimą ir indukavo apoptozę HT-29 žmogaus gaubtinės žarnos vėžio ląstelių linijoje, iš dalies slopindamas bcl-2 ir indukuodamas kaspazės-3 baltymų ekspresiją. Taigi nustatyta kad vaistinėse ožragėse esanti medžiaga diosgeninas turi potencialą gaubtinės žarnos vėžio prevencijai (13).
Kitas atliktas tyrimas buvo naudojant vaistinių ožragių sėklų ekstraktą. (10-15 ug / ml) ekstrakto dozės slopino krūties, kasos ir prostatos vėžio ląstelių linijų augimą. Taip pat ir didesnės dozės tai yra (15 – 20 µg / ml) vis dar slopino krūties ir kasos ląstelių linijų augimą, bet mažiau vėžinių prostatos ląstelių. Augimo slopinimas iš dalies buvo susijęs su vėžinių ląstelių apoptoze (14).
Dar vienas mokslinis tyrimas parodė, kad vaistinių ožragių sėklų metanolio, etanolio, acetono, heksano, dichlormetano ir etilo acetato ekstraktai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu, darant tyrimą su 1,1-difenil-2-pikil-hidrazilo (DPPH). Taip pat buvo nustatytas bendras fenolių kiekis pagal Folin Ciocalteu metodą ir flavonoidų kiekis bei chelatinis aktyvumas. Šis tyrimas parodė, kad vaistinių ožragių ekstraktai gali veikti kaip stiprus antioksidantų šaltinis (15).
1.4.4. Antilitogeninis poveikis
Kinų medicinoje teigiama, kad vaistinė ožragė yra vartojama kaip vaistai inkstų negalavimams gydyti (6). Atliktame moksliniame tyrime buvo nustatyta, kad kasdienis gydymas geriamuoju vaistinių ožragių ekstraktu gerokai sumažino kalcio oksalato kiekį žiurkių patinų inkstuose, kuris buvo sukeltas 3 % glikolio rūgšties. Rezultatai patvirtino jo naudojimą Kinijos liaudies medicinoje (17).
Kitu tyrimu buvo nustatyta vaistinių ožragių tulžies pūslės antilitogeninis poveikis. Tyrime su gyvūnais, kurių cholesterolio tulžies akmenys buvo sukelti su 10 savaičių aukšto cholesterolio kiekio mityba. Po to kai buvo šeriami 10 savaičių su didelėmis ir mažomis vaistinių ožragių sėklų miltelių dozėmis, cholesterolio tulžies akmenų dažnis buvo gerokai sumažėjęs, be to žymiai sumažėjo cholesterolio koncentraciją, kepenų cholesterolio ir tulžies cholesterolio kiekis kraujyje. Taip pat sumažėjo cholesterolio ir fosfolipido santykis bei tulžies cholesterolio ir tulžies rūgščių santykis. Tyrimas atskleidė aiškius hipolipideminių augalo sėklų veiksmingumo įrodymus, regresuojant iš anksto nustatytus cholesterolio tulžies akmenis, ir šis naudingas antilitogeninis poveikis buvo susijęs su jo pirminiu poveikiu cholesterolio kiekiui ir metabolizmui (18).
1.4.5. Priešuždegimis ir antipiretinis poveikis
Atliktu moksliniu tyrimu nustatyta, kad vaistinių ožragių lapų ekstraktas pasižymi priešuždegiminėmis ir antipiretinėmis savybėmis. Tiek lapų ekstrakto dozė (1000 ir 2000 mg/kg), tiek natrio salicilato dozė (300 mg/kg) vienkartinio arba nuolatinio dozavimo metu reikšmingai sumažino formalino sukeltą edemą. Taip pat abu preparatai gerokai sumažino alaus mielių sukeltą hipertermiją 1 ir 2 val. po dozavimo. Fitocheminiai tyrimai parodė, kad labiausiai atsakingi už šį poveikį vaistinio augalo ekstrakte yra alkaloidai, širdies glikozidai ir fenoliai (19).
frakcijos turi reikšmingą analgetinį ir priešuždegiminį poveikį (20). Taip pat etanolinis vaistinių ožragių ekstraktas pasižymėjo dideliu priešuždegiminiu ir analgetiniu poveikiu. Siekiant įvertinti tiriamojo vaistinio augalo veiksmingumą buvo vartojamas parenteraliai dvi etanolinio ekstrakto dozės 820 mg/kg ir 1640 mg/kg, karagenino sukeltam edemos tyrimui. Eksperimentas parodė, kad tiriamojo vaistinio augalo etanolinis ekstraktas žymiai sumažino uždegimą dėl karagenino sukeltos žiurkės letenos edemos. Vidutinė edemos apimtis įvairiose grupėse pastebimai sumažėjo, palyginti su kontroline grupe (21).
1.4.6. Antidislipideminis ir antihipertriglicerideminis poveikis
Vaistinių ožragių preparatai mažina ne tik cukraus kiekį kraujyje, bet ir šalina trigliceridų perteklių, taip pat vaistiniame augale esanti ląsteliena ir saponinai mažina cholesterolio kiekį kraujyje, neleidžia susiaurėti smulkioms kraujagyslėms ir taip mažina impotenciją (5).
Naudojant dvigubai aklą placebo kontroliuojamą tyrimą, buvo nustatyta, kad papildomas vaistinių ožragių sėklų vartojimas pagerino glikemijos kontrolę ir sumažino atsparumą insulinui 2 tipo diabeto pacientams. Taip pat sumažėjo B ląstelių sekrecijos procentas ir padidėjo insulino jautrumo procentas, palyginti su placebo grupe. Buvo teigiamas poveikis ir hipertrigliceridemijai, nes pacientų kraujo serume buvo nustatytas mažesnis kiekis trigliceridų ir didesnis DTL cholesterolio kiekis (22).
Kitas mokslininkas nustatė, kad vaistinių ožragių sėklų dalinai išgryninta frakcija paveikė dislipidemiją 2 tipo diabetu sergančioms žiurkėms. Frakcija sumažino fruktozamino koncentraciją serume ir aterogeninius lipidus, tokius kaip trigliceridus, cholesterolį ir MTL cholesterolį. Be to ekstraktas padidino MTL cholesterolio kiekį (23).
Taip pat buvo nustatyta, kad neįprasta aminorūgštis 4-hidroksiizoleucinas 5, išskirtas iš vaistinių ožragių sėklų, reikšmingai sumažino trigliceridų kiekį plazmoje net 33%, bendrą cholesterolio kiekį net 22% ir laisvųjų riebalų rūgščių kiekį 14% (24).
galimai identifikuojami trys flavonoidai (kaempferolio 3-O-glikozidas, apigenin-7-O-rutinosidas ir naringeninas), o naringeninas, buvo identifikuojamas kaip pagrindinis flavonoidas.
1.4.7. Antinociceptinis ir analgetinis poveikis
Gleivės, esančios vaistinių ožragių preparatuose, padengia gleivines ir slopina skausmą virškinamajame trakte (5).
Taip pat buvo keletas pranešimų apie vaistinių ožragių lapų antinociceptinį poveikį Irano tradicinėje medicinoje. Dėl nesteroidinių priešuždegiminių ir antinociceptinių vaistų šalutinio poveikio, ieškant stipresnių ir mažiau kenksmingų junginių buvo bandyta tirti vaistinių ožragių lapų antinociceptinį poveikį, naudojant formalino testus. Šiuo tyrimu buvo išsiaiškinta, kad vaistinio augalo lapų ekstraktas daro antinociceptinį poveikį per centrinius ir periferinius mechanizmus ir 2000 mg/kg ekstrakto antinociceptinis poveikis buvo stipresnis nei 300 mg/kg natrio salicilato (11).
Sekančiame tyrime buvo apžvelgta vaistinių ožragių lapų ir sėklų chloroformo, etilacetato ir metanolio ekstraktų analgetinis veikimas. Visi ekstraktai skiriami intraperitoniniu būdu pelėms dozėmis 50 mg/kg ir buvo nustatytas centrinis ir periferinis analgetinis poveikis. Iš visų ekstraktų metanolinis lapų ekstraktas parodė didžiausią analgetinį aktyvumą (27). Sekančiu atliktu tyrimu buvo siekiama ištirti vaistinių ožragių ekstraktų sukeltos analgezijos vietą ir mechanizmą. Rezultatai patvirtino centrinį vaistinio augalo ekstraktų veikimą žiurkių patinėliuose ir kad stuburo serotonerginė sistema, buvo susijusi su vaistinio augalo sukelta analgezija antrajame formalino tyrimo etape (28).
1.4.8. Antibakterinis poveikis
2016 m. buvo atliktas mokslinis tyrimas siekiant nustatyti vaistinių ožragių lapų, sėklų ir stiebo antibakterinį aktyvumą vandeniniame, metanoliniame ir acetoniniame ekstrakte prieš Escherichia coli ir Staphylococcus padermes ar kultūras. Palyginus visus ekstraktus buvo nustatyta, kad lapų ekstraktai labiausiai pasižymėjo antibakteriniu poveikiu palyginus su sėklų ir stiebų ekstraktais. Taip pat buvo nustatyta, kad metanolio ekstraktas pasižymėjo didžiausiu bakterijų slopinimu, o vandeninis ekstraktas mažiausiai. Taigi, bakteriologiniu požiūriu vaistinių ožragių lapų ir stiebų ekstraktai vaidina svarbų vaidmenį antibakteriniuose preparatuose(29).
aktyvumas prieš aštuonias bakterines padermes, nustatant mažiausiai slopinančią koncentraciją. Rezultatas parodė, kad etanolinis ekstraktas stipriai slopina abiejų gram-teigiamų ir gram-neigiamų bakterijų augimą. Nustatyta, kad mažiausia etanolinio ekstrakto slopinimo koncentracija yra 400 mg/ml, bakterijoms, tokioms kaip Escherichia coli, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Micrococcus lutea, Bacillus subtilis. Taigi tyrimo rezultatai parodė, kad etanolinis vaistinių ožragių sėklų ekstraktas pasižymi antibakteriniu poveikiu tam tikroms teigiamoms ir gram-neigiamoms bakterijoms. Antimikrobinės augalo savybės gali būti siejamos su individualiu arba bendru flavonoidų, saponinų, alkaloidų ir glikozidų poveikiu (30).
1.5. Vaistinės ožragės augalinės žaliavos vartojimas ir dozavimas
Vidiniam vartojimui 3 kartus per dieną prieš valgį vartojamos susmulkintos vaistinių ožragių sėklos po 2 g, užsigeriant nedideliu kiekiu skysčių (5,8).
Arba suaugusiems diabeto ar hipercholesterolemijos gydymui vartojama 25 g miltelių pavidalo sėklų ar lygiaverčių preparatų kasdien, o apetito stokai vartojama 1-6 g miltelių pavidalo vaistinio augalo prieš valgį iki trijų kartų per dieną, užsigeriant nedideliu kiekiu vandens (9).
Vaistinių ožragių tinktūra gaminama iš 1 dalies žaliavos ir 3 dalių 40 % alkoholio. Po to į nedidelį kiekį vandens įlašinama 15 lašų ir geriama 3 kartus per dieną valgio metu (5). Išoriniam vartojimui 50 g susmulkintos žaliavos užpilama 250 ml vandens, 5 min. pavirinama ir vartojamas kaip šiltas drėgnas kompresas 3-4 kartus per dieną (8,9).
Viename šaltinyje perdozavimo metu buvo pranešta, kad didelės dozės (pvz., 100 g vaistinių ožragių kasdien vartojimas) sukelia nedidelius virškinimo trakto simptomus, pvz., viduriavimas ir vidurių pūtimas pasireiškė 4 iš 10 atvejų (9).
1.6. Toksiškumas, nepageidaujamos reakcijos ir galima sąveika su vaistais
mirtingumas, sumažėjo dydis ir sumažėjo vaisiaus kūno svoris. Be to, padidėjo morfologinių anomalijų dažnumas (7,31).
1.7. Svarbiausių vaistiniuose ožragėse randamų biologiškai aktyvių junginių
apžvalga
1.7.1. Bendra flavonoidų apžvalga
Flavonoidai yra viena iš didžiausių ir labiausiai ištirtų fenilpropanoidinių augalų specializuotų metabolitų klasių, turinčių maždaug 10 000 skirtingų atstovų (32). Flavonoidai yra polifenoliniai junginiai, būdingi aukštesniems augalams. Augaluose jie randami vaisiuose, sėklos, stiebuose ir žieduose. Šie junginiai dažnai yra atsakingi už augalų spalvas ir veikia kaip skydas nuo galimų pažeidimų, kuriuos sukelia saulės spinduliai. Flavonoidų taip pat gausu prieskoniuose, arbatose arba raudonajame vyne, ir yra reguliarūs vaisių ir daržovių komponentai, vartojami žmonių mityboje (33). Cheminiu požiūriu flavonoidai yra fenilbenzopiranai (fenilchromanai), turintys 15 anglies atomų, su dviem aromatiniais žiedais, sujungtais trimis anglies tilteliais. Tokia struktūra yra sudaryta iš fenolio fragmento, pakeisto viena arba daugiau hidroksilo arba metoksi grupių, susietų su cinamono rūgšties fragmentu, kuri taip pat gali būti pakeista viena arba keliomis hidroksilo arba metoksi grupėmis. Hidroksi grupės gali būti dažnai glikozilintos.
Pagal skirtingus pirano žiedo oksidacijos modelius flavonoidai yra suskirstyti į flavonus, flavanonus, flavanolius, flavonolius, antocianidinus, isoflavonoidus (33,34).
Flavanoliai. Struktūra skiriasi nuo flavonoidų, nes nėra dvigubos jungties tarp C2 ir C3 atomų,
1 pav. Flavanolių pagrindinė struktūra (35)
Flavonai. Vienas iš pagrindinių flavonų šaltinių yra salieros, petražolės, raudonieji pipirai,
ramunėlės, mėtos. Luteolinas, apigeninas ir tangeritinas priklauso šiam flavonoidų poklasiui. Jie turi dvigubą jungtį tarp 2 ir 3 padėties ir ketono grupę C žiedo 4-oje padėtyje. Daugelyje daržovių ir vaisių flavonų A žiedo 5 padėtyje yra hidroksilo grupė, o hidroksilinimas vyksta kitose vietose, dažniausiai A žiedo 7 padėtyje arba B žiedo 3 ′ ir 4 ′ padėtyje (36). Flavonų pagrindinė struktūra pavaizduota 2 pav.
2 pav. Flavonų pagrindinė struktūra (34)
Flavonoliai. Flavonoliai yra flavonoidai su ketono grupe. Palyginti su flavonais, flavonoliai
turi hidroksilo grupę C žiedo 3 padėtyje, kuri taip pat gali būti glikozilinta. Flavonolių gausiai randama įvairiuose vaisiuose ir daržovėse įskaitant svogūnus, kopūstus, salotas, pomidorus, obuolius, vynuoges ir uogos. Be vaisių ir daržovių, arbata ir raudonasis vynas taip pat yra flavonolių šaltinis. Labiausiai tiriami flavonoliai yra kvercetinas, miricetinas ir fisetinas (37). Flavonolių pagrindinė struktūra pavaizduota 3 pav.
Flavanonai. Flavanonai, taip pat vadinami dihidroflavonais, turi prisotintą C žiedą; todėl,
skirtingai nuo flavonų, dviguba jungtis tarp 2 ir 3 pozicijų yra prisotinta ir tai yra vienintelis struktūrinis skirtumas. Flavanonai gausiai randami citrusiniuose vaisiuose, pavyzdžiui, apelsinuose, citrinose ir vynuogėse. Per pastaruosius 15 metų žymiai padidėjo flavanonų skaičius (37). Flavanonų pagrindinė struktūra pavaizduota 4 pav.
4 pav. Flavanonų pagrindinė struktūra (34)
Izoflavonoidai. Isoflavonoidai yra dar vienas poklasis, kur fenilo grupė yra pirano žiedo 3
padėtyje, o ne 2-oje flavonoidų padėtyje. Izoflavonoidai dažniausiai randami sojos pupelėse ir kituose ankštiniuose augaluose. Didžiausias izoflavonoidų kiekis paprastai būna šaknyse, daiguose ir sėklose. Izoflavonoidų atstovai yra genisteinas, daidzeinas ir glikitinas (38). Taip pat pranešta, kad kai kurie izoflavonoidai yra mikrobuose (39). Izoflavonoidų struktūrinė formulė pavaizduota 5 pav.
5 pav. Izoflavonoidų struktūrinė formulė (34)
Antocianidinai. Vyraujantys vaisių ir daržovių antocianinai yra cianidin-3-O-gliukozidas,
6 pav. Antocianidinų struktūrinė formulė (35)
1.8. Laisvieji radikalai, antioksidantai, antiradikalinis aktyvumas
Laisvieji radikalai yra tokios molekulės, kurios gali savarankiškai egzistuoti ir turi laisvą elektroną atominėje orbitoje. Laisvo elektrono buvimas lemia tam tikras bendrąsias savybes daugumai radikalų. Svarbiausi deguonį turintys laisvieji radikalai, kurie sukelia daugelį ligų yra hidroksilo, radionuklidų superoksido, vandenilio peroksido, hipochlorito, azoto oksido ir peroksinitrito radikalai (46). Ligos metu pasireiškia oksidacinis stresas, kurio metu patogenezėje dalyvauja laisvieji radikalai. Pavyzdžiui uždegiminės, lėtinės ligos: aterosklerozė, kancerogenezė, ypač organizmo senėjimas. Laisvieji radikalai pažeidžia audinius, kadangi jie gali oksiduoti baltymus, lipidus ir dezoksiribonukleino rūgštis (47).
Augalinėse žaliavose aptinkama stiprių antioksidantų, kurie pastaruoju metu vis plačiau naudojami maisto ir kosmetikos pramonėje kaip natūralūs priedai (50). Augalinės kilmės antioksidantų daugiausiai randama vaisiuose ir daržovėse, ypač daug jų turi obuoliai, juodieji serbentai, svogūnai, sojų pupelės, mėlynės ir t.t (51).
2. TYRIMŲ OBJEKTAI IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – vaistinių ožragių (Trigonella foenum – graecum) lapai, sėklos ir stiebai rinkti Kretingos rajone (Juodupėnų kaime) 2019 m. nuo gegužės 29d. iki liepos 28d. Lietuvos rinkoje esanti vaistinių ožragių žaliavos: lapai ir sėklos buvo įsigytos Kaune, Jurbarko g. 23 indiškų prekių parduotuvėje „Tuk Tuk Indija“, taip vaistinių ožragių lapai ir stiebai buvo įsigyti iš UAB "Jadvygos Žolės" (Virvytės g. 27, Gyvolių kaimas) Mažeikių rajonas. Vaistinių ožragių lapai, stiebai ir sėklos buvo rinktos skirtingu vegetaciniu laikotarpiu, džiovinama kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje, sausoje ir nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Išdžiovintos žaliavos buvo sudėtos į popierinius maišelius ir taip pat laikomos kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje, sausoje vietoje. Vaistinių ožragių žaliavių rinkimo duomenys pateikti pagal surinkimo datą 1 lentelėje.
1 Lentelė. Vaistinių ožragių lapų, sėklų ir stiebų rinkimo duomenys.
Surinkimo data Augalo vystymasis (vegetacijos tarpsnis)
2019.05.29 Vaistinis augalas vystosi
2019.06.16 Yra pavienių žydinčių žiedų, besiformuojančių vaisių 2019.07.05 Yra besiformuojančių ir susiformavusių vaisių 2019.07.28 Dauguma vaistinio augalo vaisių susiformavę
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Naudoti reagentai, medžiagos
1. Aliuminio chloridas („Fluka“, Vokietija);
2. Folin-Ciocalteu fenolio reagentas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Šveicarija); 3. Natrio karbonatas (Carl Roth, Karlsruhe, Vokietija);
6. Trolox® (troloksas) 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2karboksilinė rūgštis (Fluka, Seelze, Vokietija);
7. Heksametiltetraminas ( „Sigma-Aldrich”, Anglija); 8. 30 proc. acto rūgšties tirpalas( „Sigma-Aldrich”, Anglija);
9. Rektifikuotas etilo alkoholis, 96,3 proc. V/V ( „Stumbras“, Lietuva); 10. Rutinas ( „Carl Roth GmbH, 76185, Vokietija);
11. Natrio acetatas (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Vokietija) 12. Kalio persulfatas (Fluka-Chemie, Buchs, Šveicarija);
13. Praskiesta vandenilio chlorido rūgštis ( „Sigma – Aldrich”, Kanada); 14. 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalas ( „SIAL“, Kanada); 15. ABTS reagentas ( „Sigma – Aldrich”, Kanada);
16. Išgrynintas vanduo;
17. Metanolis (99,9 proc., SIGMA-ALDRICH, Vokietija); 18. Galo rūgštis (97,5 – 102,5 proc.; SIGMA, Vokietija); 19. 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ) (Alfa Aesar, Vokietija); 20. Ledinė acto rūgštis (Rusija);
2.2.2. Naudota aparatūra ir priemonės
1. Analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija); 2. Mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV);
3. Popieriniai filtrai („ODR – 9303”, Vokietija);
4. Ultragarsinė vonelė („ Bandelin electronic DK 255p”, U=230V, V=50-60Hz, I=2A,Vokietija); 5. Vakuuminė pompa („Dry vacuum pump/compressor”, Welch, 2511C – 02, 230V, 50Hz, 6A, ,
JAV);
6. Spektrofotometras („Beckman DU – 70”, 4273041, „Beckman Instruments”, JAV); 7. Mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija);
2.2.3. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje
Nuodžiūvis vertinamas remiantis Europos farmakopėjos straipsniu (Ph. Eur. 01/2008:1323). Pirmiausia džiovinimo spintoje iki pastovios masės išdžiovinami biuksai. Juose pasveriama po tris 1,000 g vaistinės augalinės žaliavos svėrinius ir džiovinama džiovinimo spintoje, kai joje temperatūra pasiekiama 100 – 105 °C. Po 2 val. džiovinimo pirmą kartą augalinės žaliavos mėginys pasveriamas, vėliau sveriama po 30 min. džiovinimo. Jeigu po paskutinio svėrimo rezultatai tarpusavyje skiriasi ne daugiau kaip ± 0,001 g, nustatoma pastovioji masė. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis % apskaičiuojamas, remiantis formule:
𝐦𝟏−𝐦𝟐
𝐦𝟎 ×𝟏𝟎𝟎
m1 - žaliavos masė (g) prieš džiovinimą; m2 – žaliavos masė (g) po džiovinimo.
2.2.4. Ekstraktų ruošimo metodika
Vaistinių ožragių (Trigonella foenum – graecum) sėklos, lapai, stiebai ir šaknys buvo susmulkinami elektriniu malūnėliu. Ekstraktai paruošti sveriant 1 g (0,001 g tikslumu) susmulkintos augalinės žaliavos ir užpilant 10 ml (ekstrakcijai pasirinktos koncentracijos tirpiklio). Atsargiai suplakama, kad ekstrahentas gerai pasiskirstytų tarp vaistinės augalinės žaliavos miltelių dalelių. Ekstrahuojama kambario temperatūroje ir užkimštuose rudo stiklo 50 ml buteliukuose. Tyrimų metu vaistinei augalinei žaliavai parinktas ekstrakcijos tirpiklis bei jo koncentracija ir ekstrakcijos trukmė ultragarso bangų vonelėje ir mechaninėje purtyklėje.
Gauti ekstraktai nufiltruojami per atitinkamu ekstrahentu sudrėkintą 0,2 µm porų dydžio filtravimo popierių. Tada išpilstomi į švarius tamsaus stiklo buteliukus, sandariai užkemšami ir laikomi kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.
2.2.5. Suminis polifenolinių junginių nustatymas
Suminis polifenolinių junginių kiekis vaistinių ožragių žaliavos ekstraktuose nustatytas Folin – Ciocalteu metodu, naudojant spektrofotometrą.
Tiriamojo tirpalo paruošimas – paimama 1,0 ml vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, kuris sumaišomas su 5,0 ml darbiniu FC reagentu bei įpilama 4,0 ml 7,5 % natrio karbonato tirpalo. Palyginamasis tirpalas paruošiamas tokiomis pat sąlygomis, tačiau vietoj 1,0 ml tiriamojo ekstrakto pilama 1,0 ml (ekstrakcijai pasirinktos koncentracijos tirpiklio). Gauti mišiniai sumaišomi ir laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 1 val., o vėliau spektrofotometro pagalba išmatuojama tiriamojo mišinio absorbcija, esant 765 nm. bangos ilgiui. Nustatytoms didesnėms absorbcijoms nei etaloninių galo rūgšties tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmėms, ekstraktai yra skiedžiami.
Tiriamasis ir palyginamieji galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamojo augalinio ekstrakto tirpalai, tačiau vietoj 1,0 ml tiriamojo ekstrakto tirpalo imama toks pat kiekis žinomos koncentracijos galo rūgšties tirpalų (0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml ir 0,1 mg/ml). Išmatavus galo rūgšties tirpalų absorbciją sudaroma kalibracinė kreivė ir lygtis. Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį.
y = 2,1533x -0,0233 R2 = 0,9993
Suminis polifenolinių junginių kiekis yra išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui žaliavos ir apskaičiuojamas remiantis šia formule:
GAE = c × V/ m mg/ml
c – galo rūgšties koncentracija mg/ ml , kuri nustatyta iš kalibracinės kreivės ; V – ekstrakto tūris mililitrais (ml) ;
m – vaistinės augalinės žaliavos kiekis (g)
2.2.6. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu
Vaistinių ožragių ekstraktuose suminis flavonoidų kiekis buvo nustatomas ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu, acto rūgštimi parūgštintoje terpėje. Suminis flavonoidų kiekis nustatytas ekstraktuose buvo išreiškiamas rutino ekvivalentu.
žaliavos ekstrakto, 10 ml 96 % (V/V) etanolio, 0,5 ml 30 % druskos rūgšties tirpalo, 2 ml 5 % heksametilentetramino ir 1,5 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo. O palyginamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml kolbutę įpylus 1,0 ml vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, 10 ml 96 % (V/V) etanolio, 0,5 ml 30 % druskos rūgšties tirpalo. Gautus abu tirpalus kolbutėse praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymos ir laikoma 30 min. tamsoje ir kambario temperatūroje. Po 30 min. spektrofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydis esant 407 nm. bangos ilgiui. Nustatytoms didesnėms absorbcijoms nei etaloninių rutino tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmėms, ekstraktai yra skiedžiami. Etaloninis rutino tirpalas gaminamas 50 ml matavimo kolboje 70 % (V/V) etanolyje ištirpinant tikslų 0,025 g išdžiovinto rutino svėrinį. Po to paruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis tiriamasis ir palyginamasis rutino tirpalai, kaip ir vaistinės augalinės žaliavos tirpalai, tik vietoje 1 ml vaistinės žaliavos ištraukos naudojame 1 ml etaloninio rutino tirpalo ir išmatuojamas rutino tirpalo absorbcijos dydis. Rutino koncentracijos ribos 0 – 0,1 mg/ml. Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentu (mg/ml) pagal kalibracijos lygtį.
y = 4,8632x -0,0346 R2 = 0,9992
Suminis flavonoidų kiekis yra išreiškiamas rutino ekvivalentais gramui žaliavos ir apskaičiuojamas remiantis šia formule:
C = c × Vm ⁄, mg/g
C – Suminis flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu, mg/g; c – rutino koncentracija, nustatyta pagal kalibravimo kreivę, mg/ml; V – tiriamojo ekstrakto tūris, ml;
m – ekstrakcijai atsvertas tikslus augalinės žaliavos kiekis, g.
2.2.7. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas titrimetriniu metodu
dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalu kol mišinys įgauna blyškia rožine spalva, neišnykstančia per 10 sekundžių. Mišinių titravimas kartojamas bent tris kartus ir išvedamas vidurkis. 1 ml natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalo atitinka 0,000088 g askorbo rūgšties.
Askorbo rūgšties kiekis procentais (X) absoliučiai sausai vaistinei augalinei žaliavai apskaičiuotas naudojantis formule:
𝑿 =𝑽 × 𝟎, 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟖𝟖 × 𝑽𝟏 × 𝟏𝟎𝟎 × 𝟏𝟎𝟎 𝐦 × 𝑽𝟐 × (𝟏𝟎𝟎 − 𝐖)
X – askorbo rūgšties kiekis, %.;
V – titravimui sunaudotas natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliato 0,001 M tirpalo kiekis ml;
𝑽𝟏 – tiriamojo ekstrakto tūris ml;
m – atsverta vaistinės augalinės žaliavos masė g;
𝑽𝟐 – tiriamojo ekstrakto, paimto titravimui, tūris ml.;
W – vaistinės augalinės žaliavos drėgmės kiekis %.
2.2.8.
Antiradikalinio
aktyvumo nustatymas ABTS metodu
Antiradikalinio poveikio įvertinimui taikoma spektrofotometrinio tyrimo metodika. Pirmiausia paruošiamas motininis ABTS tirpalas. 0,548 g ABTS miltelių suberiami į tamsaus stiklo buteliuką ir ištirpinami 50 ml distiliuoto vandens, po to į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato. Buteliukas užsukamas, jame esantis mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsoje, kambario temperatūroje 16 val.
Vėliau ruošiamas darbinis ABTS tirpalas. Motininis ABTS tirpalas po 16 val. skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų, kai bangos ilgis 734 nm. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo.
Po to 3 ml darbinio ABTS tirpalo sumaišoma su 20 µl tiriamojo ekstrakto ir laikoma tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Po to spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis esant 734 nm bangos ilgiui.
Po to atskirose po 10 ml kolbutėse eančiose po 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml bei 5 ml pirminio trolokso tirpalo, įpilame 70 % (V/V) etanolio iki žymės ir gaunami (0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml ir 0,5 mg/ml) žinomi trolokso koncentracijos tirpalai.
Vietoje 20 µl tiriamojo ekstrakto imama 20 µl tam tikros žinomos koncentracijos trolokso tirpalas ir spektrofotometru išmatuojama absorbcija esant 734 nm bangos ilgio. Išmatavus absorbciją, sudaroma trolokso tirpalų koncentracijų kalibracinė kreivė ir išvedama lygtis.
Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:
TE = c x V/m, µmol/g c – trolokso koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės mg/ml; V – ekstrakto tūris ml;
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.
2.2.9. FRAP metodas redukcinio aktyvumo nustatymui
FRAP metodo esmė trivalenčio geležies komplekso redukcija rūgštinėjė terpėje į dvivalentį geležies kompleksą. Junginių redukcinė geba vertinama pagal žinomą antioksidantą troloksą.
Pirmiausia paruošiami 3 pradiniai reagentai:
a) Atsveriama 3,1 g natrio acetato ir suberiama į 1000 ml matavimo kolba, po to įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki nurodytos žymės. Gaunamas 300 mM acetatinis buferis (pH=3,6).
b) Matavimo kolboje į 50 ml distiliuoto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties ir gaunamas 40 mM druskos rūgšties tirpalas. Po to 40 mM druskos rūgšties tirpale ištirpinama 0,1562 g TPTZ miltelių ir gaunamas 10 mM TPTZ tirpalas.
c) Atsvertas 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidratas ištirpinamas 50 ml matavimo kolboje distiliuotu vandeniu iki žymės ir gaunamas 20mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas.
Darbinis FRAP reagentas ruošiamas prieš pat tyrimą sumaišant pasigamintus pradinius reagentus a), b), ir c) santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo).
Atliekant ekstraktų redukcinio stiprumo vertinimą, priklausomybė tarp trolokso kiekio (µM) ir paruoštų standartinių tirpalų absorbcijos pokyčio intervalas yra 0-8000 µmol/ml.
Gauti rezultatai palyginti su standartinio antioksidanto trolokso tirpalų standartine kreive išreiškiami TE (μmol/g). Apskaičiuojama pagal formulę:
𝑻𝑬𝑭𝑹𝑨𝑷 = c x V/m, µmol/g c – antiradikalinis aktyvumas
,
nustatytas iš kalibracinės kreivės;V – ekstrakto tūris (L);
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.2.10. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu
Vaistinių ožragių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas vertinamas ekstraktą veikiant DPPH tirpalu taikant spektrofotometrinio tyrimo metodiką. Darbinis DPPH tirpalas paruošiamas 0,0024 g DPPH radikalo ištirpinant 100 ml tūrio matavimo kolboje 70 % (V/V) etanolyje iki nurodytos žymės. Po to darbinis DPPH tirpalas skiedžiamas tol, kol matuojant 515 nm bangos ilgio šviesos absorbciją pasiekiami 0,8 ± 0,03 absorbcijos vienetai. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 70 % (V/V) etanolis. Tiriamasis tirpalas paruošiamas 60 µl tiriamojo ekstrakto sumaišant su 3 ml darbiniu DPPH tirpalu. Palyginamajam tirpalui pagaminti panaudota 60 µl 70 % (V/V) etanolio ir 3 ml etaloninio DPPH tirpalo. Gauti mišiniai laikomi tamsoje, kambario temperatūroje 30 min. ir vėliau išmatuojamas tirpalų šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui.
Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 3 mg/ml
Antiradikalinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš formulės:
𝑻𝑬𝐃𝐏𝐏𝐇 = c x V/m, µmol/g
C - antiradikalinis aktyvumas mg TE/ml;
2.3. Tyrimo metu gautų duomenų statistinis vertinimas
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis
Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis nustatytas naudojant 3.2.3 skyriuje aprašytą metodiką. Vaistinių ožragių žaliavos: lapų, stiebų, sėklų ir šaknų vidutinės nuodžiūvio reikšmės ir rinkimo datos pavaizduota 2 lentelėje.
2 Lentelė. Vaistinės ožragės žolės nuodžiūvo įvairavimas tirtuose mėginiuose (p < 0,05) Surinkimo data Augalo dalys Nuodžiūvis % su VSN
2019.05.29 Lapai 5,8 ± 0,5 2019.05.29 Stiebai 6,1 ± 0,1 2019.05.29 Žiedai 6,2 ± 0,0 2019.06.16 Lapai 6,3 ± 0,2 2019.06.16 Stiebai 6,1 ± 0,1 2019.06.16 Sėklos, žiedai 6,4 ± 0,0 2019.07.05 Lapai 6,5 ± 0,1 2019.07.05 Stiebai 6,6 ± 0,4 2019.07.05 Sėklos 6,7 ± 0,6 2019.07.28 Lapai 6,5 ± 0,1 2019.07.28 Stiebai 6,7 ± 0,4 2019.07.28 Sėklos 6,9 ± 0,4 2019.07.28 Šaknys 6,8 ± 0,5
3 Lentelė. Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis.
Tiekėjas Augalo dalys Nuodžiūvis % su VSN
„Jadvygos žolės“ Lapai 6,7 ± 0,2
„Jadvygos žolės“ Stiebai 6,8 ± 0,3
„Tuk Tuk Indija“ Lapai 5,7 ± 0,3
„Tuk Tuk Indija“ Sėklos 5,9 ± 0,5
3.2. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas polifenolinių junginių kieko nustatymui
Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas yra svarbus tyrimo žingsnis norint gauti didžiausią vaistinės augalinės žaliavos tiriamųjų junginių išeigą. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimui naudota paskutinio rinkimo (2019.07.28) vaistinių ožragių bendra žaliava sudaryta iš lapų, sėklų ir stiebų. Ekstrakcijos sąlygos pritaikytos parenkant tinkamiausio poliškumo tirpiklį, nustatant tinkamiausią ekstrakcijos laiką atliekant maceraciją purtyklėje ir ultragarsinėje vonelėje.
Optimalaus ekstrakcijos tirpiklio ir jo koncentracijos parinkimas suminiam polifenolinių junginių kiekio nustatymui. Norint gauti didžiausią ekstrakcijos išeigą pirmiausia svarbu parinkti
tinkamo poliškumo tirpiklį. Polifenolinių junginių ekstrakcijai iš vaistinių ožragių žaliavos naudojami etanolio ir metanolio mišiniai su distiliuotu vandeniu bei distiliuotas vanduo. Buvo pasirinkti šie tirpikliai: skirtingų koncentracijų etanolio ir vandens mišiniai V/V: 30 %, 50 %, 70 %, 85 %, taip pat skirtingų koncentracijų metanolio ir vandens mišiniai: 30 %, 50 %, 70 %, 85 % ir distiliuotas vanduo. Maceracija atliekama mechaninėje purtyklėje 1 val., kambario temperatūroje. Optimalaus tirpiklio pasirinkimas polifenoliniams junginiams buvo nustatomas spektrofotometrijos metodu ir vertinamas pagal suminį polifenolių kiekį kiekviename ekstrakte. Gauti rezultatai pateikti 7 paveiksle.
7 pav. Suminio Trigonella foenum-graecum polifenolių junginių kiekio išeigos priklausomybė nuo skirtingo poliškumo ekstrahentų (p < 0,05)
Tyrimų rezultatai atskleidė, kad didžiausia polifenolinių junginių išeiga gauta naudojant 70 % etanolio tirpalą ( 3,69 ± 0,08 GAE mg/g ), tuo tarpu 50 % metanolio tirpalu ekstrahuotos vaistinės augalinės žaliavos išeiga siekė ( 3,61 ± 0,22 GAE mg/g ). Nustatyta, kad mažiausia polifenolinių junginių išeiga gaunama naudojant distiliuotą vandenį (1,18 ± 0,07 GAE mg/g)
K. Ghafoorbei kiti mokslininkai (2015) spektrofotometrijos metodu nustatė, kad efektyviausiai
1,49 1,84 3,69 2,35 1,18 1,84 3,61 2,43 1,45 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50
polifenolinius junginius iš vaistinių ožragių sėklų išskiria 33 %V/V etanolis.(52) Tyrimo rezultatai galėjo skirtis dėl naudojamų skirtingų tiriamų augalo dalių, žaliavos kokybės ir kiekio bei skirtingų ekstrahavimo metodikų. Taigi, remiantis šio atlikto tyrimo rezultatais, efektyviausiai polifenoliniai junginiai iš vaistinių ožragių žaliavos išsiskiria kaip ekstrahentą naudojant 70 % V/V etanolį ir jis yra naudojamas tolimesniems tyrimams.
Optimalaus ekstrakcijos metodo ir laiko trukmės parinkimas suminiam polifenolinių junginių kiekio nustatymui. Nustačius, kad tinkamiausias ekstrahentas yra 70 % etanolis, toliau
parenkamas efektyviausias ekstrakcijos metodas tiriamai augalinei žaliavai. Fitocheminei analizei gali būti taikomi įvairūs ekstrakcijos metodai: maceracija purtyklėje, Soksleto ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu, mikrobangų ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija ir kiti.(53) Maceracija purtyklėje ir ekstrakcija vandens vonelėje ultragarsu yra laikomi klasikiniais ekstrakcijos metodais, skirtais kietafaziams mėginiams ekstrahuoti. Maceracija mechaninėje purtyklėje yra paprasčiausias ekstrakcijos metodas dėl atlikimo paprastumo ir nereikalaujantis didelių investicijų, bet yra pats neefektyviausias metodas, palyginus su kitais ekstrakcijos metodais skirtiems kietafaziams mėginiams ekstrahuoti. Tačiau didesniu efektyvumu pasižymi ekstrakcija ultragarsu vandens vonelėje, nes veikiant ultragarsu suardomi audiniai ir geriau išsiskiria veikliosios medžiagos. Todėl pasirinkti du ekstrakcijos metodai: maceracija purtyklėje ir maceracija ultragarso vonioje. Norint palyginti, kuris metodas tinkamesnis vaistinių ožragių žaliavai ekstrahuoti, ekstrakcijos efektyvumas įvertinamas pagal suminį polifenolių kiekį, kuris nustatomas spektrofotometriniu būdu. Atliekant maceraciją purtyklėje kiekvienas ekstraktas purtomas skirtingus laiko intervalus: 30 min, 1 val, 2 val, 4 val, 8 val. kambario temperatūroje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Ekstrahentu naudotas 70 % (V/V) etanolis. Gauti rezultatai pateikti 8 paveiksle.
8 pav. Suminio Trigonella foenum-graecum polifenolinių junginių kiekio išeigos priklausomybė nuo ekspozicijos trukmės (p < 0,05)
3,88 4,30 4,59 4,76 3,99 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 30 min 1h 2h 4h 8h Su m in is p o lif en o lių ska iči u s G AE m g/g
Polifenolinių junginių išeiga tiesiogiai didėja priklausomai nuo maceracijos laiko trukmės, tačiau po tam tikro laiko išeiga pradeda mažėti. Didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis nustatytas maceruojant purtyklėje 4 val. (4,76 ± 0,07 GAE mg/g ). Maceruojant ilgiau nei 4 val. polifenolinių junginių kiekis pradeda mažėti. Nors maceracija mechaninėje purtyklėje efektyviausia, kai trunka 4 val., tačiau nėra statistiškai patikimas rodiklis (p < 0,05). Šis metodas pakankamai ilgai trunka ir nepopuliarus dėl mažesnės veikliųjų medžiagų išeigos, todėl ekstrakcija buvo atliekama ir ultragarso vonelėje. Ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje (10x10 % galia), atliekama kambario temperatūroje, skirtingomis laiko trukmėmis: 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min. Ekstrahentu naudotas 70 % (V/V) etanolis. Rezultatai pavaizduoti 9 paveiksle.
9 pav. Suminė Trigonella foenum-graecum polifenolinių junginių kiekio išeiga ekstrahuojant ultragarsinėje vonelėje skirtingomis laiko trukmėmis (p < 0,05)
Efektyviausias ekstrakcijos laikas ultragarsinėje vonelėje yra 30 min., kadangi gaunama didžiausia polifenolinų junginių išeiga (5,57 ± 0,21 GAE mg/g ). Ekstrahuojant ilgiau negu 30 min. ekstrakcijos efektyvumas mažėja, gaunamas mažesnis suminis polifenolinių junginių kiekis. Taip pat pastebimas statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05) tarp 30 ir 60 min. trukmės ekstrakcijos ultragarsu. Galima teigti, kad ilgiau trunkančios ekstrakcijos metu suminis polifenolinių junginių kiekis reikšmingai sumažėja. Atliekant ekstrakciją ultragarsinėje vonelėje nustatytas didžiausias (5,57 ± 0,21 GAE mg/g) suminis polifenolinių junginių kiekis, o dinaminės maceracijos purtyklėje būdu tik (4,76 ± 0,07 GAE mg/g ).
K. Ghafoorir kt. (2015) atliko tyrimą, kurio metu naudojant ultragarso vonelę buvo gaminami vaistinių ožrgių sėklų ekstraktai ir bandoma parinkti optimaliausią ekstrakcijos laiką didžiausiam polifenolinių junginių kiekiui išsiskirti. Tyrimo rezultatai patvirtino, kad didžiausiai polifenolinių
2,66 4,05 4,71 5,57 4,74 4,36 3,93 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
5min. 10min. 20min. 30min. 40min. 50min. 60min.
Su m in is p o lif en o lių ska iči u s G AE mg/g
junginių išeigai įtakos turi pasirinktas ekstrakcijos ekspozicijos trukmė. Gauti rezultatai patvirtino, kad efektyviausiai polifenoliniai junginiai iš vaistinių ožragių sėklų išsiskiria ekstrakcijos trukmei esant 32 min. ultragarso vonelėje. Šio tyrimo rezultatai nuo mokslininkų gautų tyrimo rezultatų skiriasi nežymiai.(52) Taigi, remiantis šio atlikto tyrimo bei kitų mokslininkų atlikto tyrimo rezultatais bei palyginus maceracijos purtyklėje ir ekstrakcijos ultragarsinėje vonelėje rezultatus tolimesniems tyrimams, buvo pasirinkta 30 min. ekstrakcija ultragarsu, kaip ekstrahentą naudojant 70 % V/V etanolį. Nes ultragarsinės maceracijos metodas yra efektyvesnis, gaunamas didesnis suminis polifenolinų junginių kiekis, be to trumpesnis (bent 8 kartus) ekstrakcijos laikas.
3.3. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas suminiam flavonoidų kieko nustatymui
Ekstrakcijos tirpiklio ir jo koncentracijos parinkimas suminiam flavonoidų kiekio nustatymui. Vaistinei augalinei žaliavai ekstrahuoti buvo naudotas įvairių koncentracijų (30 %, 50%,
70%, 85 %) (V/V) etanolis, taip pat įvairių koncentracijų (30 %, 50%, 70%, 85 %) metanolis bei distiliuotas vanduo. Buvo taikoma ekstrakcija ultragarso vonelėje 30 min., kambario temperatūroje. Tinkamiausio tirpiklio pasirinkimas įvertinamas spektrofotometriškai pagal suminį flavonoidų kiekį. Rezultatai pateikiami 10 paveiksle.
10 pav. Trigonella foenum-graecum suminio flavonoidų kiekio priklausomybė nuo ekstrahento poliškumo (p < 0,05)
Tyrimo rezultatai parodė, kad didžiausia flavonoidų išeiga gauta naudojant 70 % etanolio tirpalą, meceruojant ultragarso vonelėje 30 min. ( 1,13 ± 0,10 mg/g RE ), tuo tarpu 50 % metanolio ir
0,78 0,90 1,13 0,84 0,23 0,85 0,90 0,84 0,79 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
50 % etanolio (V/V) tirpalu ekstrahuotos vaistinės augalinės žaliavos išeiga atitinkamai siekė ( 0,90 ± 0,12 mg/g RE) ir ( 0,90 ± 0,08 mg/g RE). Nustatyta, kad mažiausia flavonoidų išeiga gaunama naudojant distiliuotą vandenį (0,23 ± 0,03 mg/g RE). Remiantis gautais tyrimų duomenimis, tinkamiausias ekstrahentas flavonoidų ekstrakcijai yra 70 % etanolis (V/V) ir jis yra naudojamas tolimesniems tyrimams.
Ekstrakcijos laiko parinkimas tiriant suminį flavonoidų kiekį. Ultragarso vonelėje buvo
tiriamas ekstrakcijos trukmė norint sužinoti, kada flavonoidų išeiga yra didžiausia. Ekstrakcija ultragarsinėje vonelėje (10x10 % galia), atliekama kambario temperatūroje, skirtingomis laiko trukmėmis: 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min. Ekstrahentu naudotas 70 % (V/V) etanolis. Rezultatai pateikiami 11 paveiksle.
11 pav. Suminio Trigonella foenum-graecum flavonoidų kiekio išeiga skirtingomis laiko trukmėmis ultragarso vonioje (p < 0,05)
Efektyviausias ekstrakcijos laikas ultragarsinėje vonelėje yra 40 min., kadangi gaunama didžiausia flavonoidų išeiga (1,24 ± 0,15 mg/g RE). Ekstrahuojant ilgiau negu 40 min. ekstrakcijos efektyvumas mažėja ir gaunamas mažesnis suminis flavonoidų kiekis. Taip pat pastebimas statistiškai reikšmingas skirtumas (p < 0,05) tarp 40 ir 60 min. trukmės ekstrakcijos ultragarsu. Galima teigti, kad ilgiau trunkančios ekstrakcijos metu suminis flavonoidų kiekis reikšmingai sumažėja, nes atliekant ekstrakciją ilgesnį laiką, gali atsirasti flavonoidų kokybiniai ir kiekybiniai struktūros pokyčiai. Atsižvelgiant į maceracijos purtyklėje ir ultragarsinėje vonelėje gautus polifenolinių junginių rezultatus, flavonoidų maceracija mechaninė purtyklėje nebuvo atliekama, nes ultragarso vonelėje ekstrakcijos efektyvumas yra didesnis ir ekstrakcijos laikas yra trumpesnis.
Taigi, remiantis gautais tyrimų duomenimis, tinkamiausias ekstrakcijos laikas flavonoidų
0,43 0,58 1,01 1,13 1,24 1,19 1,14 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1,60
5min. 10min. 20min. 30min. 40min. 50min. 60min.
Su m in is f lav an o id ų k ie kis , m g/g RE
ekstrakcijai ultragarso vonelėje yra 40 min., kaip ekstrahentą naudojant 70 % V/V etanolį ir jis yra naudojamas tolimesniems tyrimams.
3.4. Suminio polifenolinių junginių kiekio nustatymas vaistinių ožragių augalinėse
žaliavose spektrofotometriniu metodu
3.4.1 Suminio fenolinių junginių kitimo dinamika augalo vegetacijos laikotarpiu
Atliktas skirtingu vegetacijos laikotarpiu surinktų vaistinių ožragių lapų, sėklų, stiebų, mėginių suminio polifenolinių junginių kiekio tyrimas. Vaistinių ožragių augalinė žaliava šiam tyrimui rinkta Kretingos rajone (Juodupėnų kaime) 2019 m. nuo gegužės 29d. iki liepos 28d. Rezultatai pateikiami 12 paveiksle.
12 pav. Suminio fenolinių junginių kitimo dinamika augalo vegetacijos metu (2019 m. gegužės–liepos mėn.) (p<0,05)
Ištyrus Kretingos rajone, Juodupėnų kaime užaugintą ir skirtingu vegetaciniu laikotarpiu rinktą vaistinių ožragių žaliavas, nustatyta, kad didžiausias polifenolinių junginių kiekis lapuose ir stiebuose yra liepos 28 dieną riktuose mėginiuose, kai visiškai subrandinamos sėklos: lapuose – 6,77 ± 0,14 mg GRE/g ir stiebuose – 3,19 ± 0,12 mg GRE/g. Sėklose-žieduose didžiausias fenolinių junginių kiekis
4,16 5,63 2,51 4,33 5,47 2,84 4,80 4,73 2,88 6,77 2,93 3,19 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00
Lapai Žiedai Stiebai Lapai Sėklos Stiebai Lapai Sėklos Stiebai Lapai Sėklos Stiebai
2019.05.29 2019.06.16 2019.07.05 2019.07.28 Su m in is p o lif en o lių ska iči u s G AE mg/g
nustatytas gegužės 29 dieną rinktuose ėminiuose: 5,63 ± 0,14 mg GRE/g. Mažiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas gegužės 29 dieną, lapuose – 4,16 ± 0,06 mg GRE/g ir stiebuose – 2,51 ± 0,11 mg GRE/g. Liepos 28 dieną nustatytas mažiausiais fenolinių junginių kiekis sėklose 2,93 ± 0,12 mg GRE/g. Taip pat ištyrus liepos 28 dieną rinktą žaliavą, nustatytas mažiausias fenolinių junginių kiekis šaknyse 2,14 ± 0,12 mg GRE/g, lyginant su kitomis augalo dalimis. Kitų mokslininkų tyrimų duomenimis, polifenolinių junginių kiekis augale priklauso nuo vegetacijos tarpsnio. Pastebimas glaudus ryšys tarp polifenolinių junginių kiekio įvairiose augalų dalyse ir jų fenologinio vystymosi. Nors tyrimams buvo pasirinkti kiti ekstrahentai, bet F. Omezzine ir kt. patvirtino, jog didesnis polifenolinių junginių kiekis aptinkamas vaistinių ožragių žaliavų metanoliniuose ektraktuose yra surinktose sėklų formavimosi pabaigoje. (54)
3.4.2 Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinių ožragių žaliavos fenolinių junginių kiekybinė sudėtis
Atliktas Lietuvos rinkoje esančių vaistinių ožragių žaliavos suminio polifenolinių junginių kiekio tyrimas. Lietuvos rinkoje esanti vaistinių ožragių lapai ir sėklos buvo įsigytos Kaune, Jurbarko g. 23 indiškų prekių parduotuvėje „Tuk Tuk Indija“, taip pat vaistinių ožragių stiebai ir lapai buvo įsigyti iš UAB "Jadvygos Žolės" (Virvytės g. 27, Gyvolių kaimas) Mažeikių rajonas. Tyrimo rezultatai pateikti 13 paveiksle.
13 pav. Lietuvos rinkoje įsigytos vaistinės ožragės žaliavos fenolinių junginių kiekybinė sudėtis
(p<0,05)
Atlikus suminio polifenolinių junginių tyrimą Lietuvos rinkoje esančiai vaistinių ožragių žaliavai: „Jadvygos Žolės“ lapuose buvo nustatyta 9,57 ± 0,20 mg GRE/g ir stiebuose – 4,38 ± 0,14
9,16 4,82 9,57 4,38 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
Lapai Sėklos Lapai Stiebai
„Tuk Tuk Indija“ „Jadvygos žolės“
Su m in is p o lif en o lių ska iči u s G AE mg/g
