Smulkių gyvūnų enteritus sukeliančių bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Aistė Kanonovaitė

Smulkių gyvūnų enteritus sukeliančių bakterijų

atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Antimicrobial resistance of enteric bacteria in small

animals

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: Dr. Rita Šiugždinienė

2 DARBAS ATLIKTAS MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Smulkių gyvūnų enteritus sukeliančių bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms“:

1. yra atliktas mano paties (pačios).

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Aistė Kanonovaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Jolanta Šmitienė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Dr. Rita Šiugždinienė

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Dr. Raimundas Mockeliūnas

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas Prof. dr. Modestas Ružauskas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1. Sveikų šunų ir kačių žarnyno mikroflora ... 9

1.2. Smulkiųjų gyvūnų enteritų priežastys... 10

1.3. Pagrindiniai šunų ir kačių bakterinių enteritų sukėlėjai ... 10

1.3.1. Clostridium difficile... 11

1.3.2. Clostridium perfringens ... 11

1.3.4. Salmonella spp. ... 12

1.3.4. Campylobacter spp. ... 13

1.3.5. Patogeninės Escherichia coli ... 13

1.3.6. Proteus mirabilis ... 14

1.3.7. Citrobacter spp. ... 15

1.3.7. Klebsiella spp... 15

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 17

2.1. TYRIMŲ MEDŽIAGA... 17 2.2. TYRIMŲ EIGA ... 17 2.3. Statistinė analizė... 20 3. TYRIMO REZULTATAI ... 21 REZULTATŲ APTARIMAS ... 29 IŠVADOS... 31 PASIŪLYMAI / REKOMENDACIJOS ... 32 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 33

4 SMULKIŲ GYVŪNŲ ENTERITUS SUKELIANČIŲ BAKTERIJŲ ATSPARUMAS

ANTIMIKROBINĖMS MEDŽIAGOMS

Aistė Kanonovaitė Magistro baigiamasis darbas

SANTRAUKA

Bakterinį smulkiųjų gyvūnų enteritą gali sukelti įvairios bakterijos. Dažniausiai tokie enteritai yra susiję su Clostridium spp, Campylobacter spp., Salmonella spp. bei E. coli., tačiau yra žinoma, kad enteritus gali sukelti ir kitos bakterijos. Bakterinių enteritų gydymui yra naudojamos įvairios antimikrobinės medžiagos, kurios turi būti paskiriamos prieš tai ištyrus, koks mikroorganzimas sukėlė enteritą. Šio darbo tikslas - nustatyti smulkiųjų gyvūnų enteritus sukeliančių bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.

Tyrimas truko 2 metus, per tą laiką surinkti 35 šunų bei kačių išmatų mėginiai iš įvairių klinikų. Tyrimo metu Mikrobiologijos ir virusologijos institute buvo išskiriamos bakterijos, identifikuojamos ir įvertinamas bakterijų padermių jautrumas / atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Iš mėginių buvo išskirta 33% enteritus sukėlusios patogeninės mikrofloros ir 67% nepatogeninės mikrofloros. Atlikus bakterijų identifikavimą, buvo nustatyti pagrindiniai šunų bei kačių bakterinių enteritų sukėlėjai – Proteus mirabilis 51,6%, β-hemolizinė E. coli 16,1%,

Citrobacter spp. 12,9%, Klebsiella spp. 12,9%, Clostridium spp. 3,2%, Vibrio spp. 3,2%. Nustatyta,

kad išskirtos tam tikrų bakterijų padermės buvo labiausiai atsparios: P. mirabilis – cefoksitinui 50,0%, β-hemolizinė E. coli – gentamicinui 54,5%, Citrobacter spp. – amoksicilinui kartu su klavulano rūgštimi 60,0%, Klebsiella spp. – amoksicilinui 100% bei amoksicilinui su klavulano rūgštimi 100%.

5 ANTIMICROBIAL RESISTANCE OF ENTERIC BACTERIA IN SMALL ANIMALS

Aistė Kanonovaitė Master‘s Thesis

SUMMARY

Bacterial enteritis can be caused by a variety of bacteria in small animals. Most commonly, such enteritis is associated with Clostridium spp., Campylobacter spp., Salmonella spp. and E. coli. but it is known that enteritis can be caused by other bacteria too. Various antimicrobials are used to treat bacterial enteritis, which must be prescribed after examining which bacterium or bacteria caused the enteritis. The aim of this work was to determine antimicrobial resistance of enteric bacteria in small animals.

The study lasted 2 years, during that time faecal samples from 35 dogs and cats were collected from various clinics. During the study, bacteria were isolated at the Institute of Microbiology and Virology, and the susceptibility / resistance of bacterial strains to antimicrobials was identified and evaluated. There were isolated 33% of the pathogenic microflora causing enteritis and 67% of the non-pathogenic microflora from the faecal samples. After the identification of bacteria, the main causes of bacterial enteritis in dogs and cats were identified - Proteus mirabilis 51,6%, β - hemolytic E. coli 16,1%, Citrobacter spp. 12,9%, Klebsiella spp. 12,9%, Clostridium spp. 3,2%, Vibrio spp. 3,2%. The isolated strains of certain bacteria were found to be the most resistant:

P. mirabilis - to cefoxitin 50,0%, β-hemolytic E. coli - to gentamicin 54,5%, Citrobacter spp. – 60,0%

for amoxicillin in combination with clavulanic acid, Klebsiella spp. 100% for amoxicillin and 100% for amoxicillin with clavulanic acid.

6

SANTRUMPOS

E. coli – Escherichia coli

C. difficile – Clostridium difficile

C. perfringens – Clostridium perfringens

TcdA – Clostridium difficile toksinas A TcdB - Clostridium difficile toksinas B CDT – C. difficile toksinas

CPE – Clostridium perfringens enterotoksinas NetB – nekrozinio enterito toksinas B

NetE – nekrozinio enterito toksinas E NetF - nekrozinio enterito toksinas F NetG - nekrozinio enterito toksinas G

S. enterica – Salmonella enterica S. salamae – Salmonella salamae S. arizonae – Salmonella arizonae S. diarizonae – Salmonella diarizonae S. houtenae – Salmonella houtenae S. indica – Salmonella indica C. gracilis - Campylobacter gracilis C. showae – Campylobacter showae

C. upsaliensis – Campylobacter upsaliensis C. jejuni – Campylobacter jejuni

C. helveticus – Campylobacter helveticus

AIEC – adhezinė – invazinė Escherichia coli EAEC – enteroagregatinė Escherichia coli EHEC – enterohemoraginė Escherichia coli EIEC – enteroinvazinė Escherichia coli EPEC – enteropatogeninė Escherichia coli ETEC – enterotoksinė Escherichia coli NTEC – nekrotoksinė Escherichia coli

P. mirabilis – Proteus mirabilis

ZapA – metaloproteinazė A IgA – imunoglobulinas A IgG – imunoglobulinas B

C. farmeri – Citrobacter farmeri C. braakii – Citrobacter braakii

7

C. freundii – Citrobacter freundii C. koseri – Citrobacter koseri

C. amalonaticus – Citrobacter amalonaticus C. gilleni – Citrobacter gilleni

C. murliniae – Citrobacter murliniae C. redentium – Citrobacter redentium C. sedlakii – Citrobacter sedlakii

C. werkmanii – Citrobacter werkmannii C. youngae – Citrobacter youngae

AMP – ampicilinas SXT – sulfametoksazolis / trimetoprimas CN – gentamicinas ENR – enrofloksacinas FOX – cefoksitinas AML – amoksicilinas

AMC – amoksicilinas + klavulano r. CL – cefaleksinas

8

ĮVADAS

Enteritas yra plonųjų žarnų uždegimas, kurio metu taip pat gali pasireikšti gastritas ar kolitas. Dažniausiai enteritus sukelia parazitai, bakterijos, virusai, alergijos ar žarnyno mikrofloros disbalansas, dėl to gyvūnui pasireiškia viduriavimas. Kiti simptomai gali būti: karščiavimas, pykinimas, vėmimas, įtemptas, skausmingas gyvūno pilvas (1). Pasireiškus viduriavimui ir jam nesibaigiant dvi dienas, rekomenduojama kreiptis su augintiniu į veterinarijos kliniką tyrimų atlikimui bei gydymui. Esant bakterinės kilmės enteritams, reikia atlikti išsamius tyrimus, išsiaiškinti, kokia bakterija sukėlė enteritą, neatmetant tikimybės, kad jį galėjo sukelti ir paprastas žarnyno mikrofloros disbalansas. Todėl svarbu žinoti, kokia yra šunų bei kačių mikroflora normaliomis sąlygomis. Bakterinės kilmės enteritų gydymui būtina naudoti antimikrobines medžiagas.

Šunų normalią žarnyno mikroflorą sudaro bakteroidai (37–38%), firmikutai (31–35%), proteobakterijos (13–15%), fusobakterijos (7–9%) ir aktinobakterijos (1%). Kačių žarnyno mikroflora normaliomis sąlygomis gali atrodyti maždaug taip - firmikutai (36–50%), bakteroidai (24– 36%) ir proteobakterijos (11–12%). Bakterijos sudaro 99% mikrofloros, o kiti mikroorganizmai gali būti virusai, archėjos ir grybai (2).

Pagrindiniai enteritų sukėlėjai, kurie dažniausiai išskiriami esant šunų bei kačių viduriavimo atvejams yra: Campylobacter spp., Clostridium spp., Salmonella spp., β- hemolizinė E.

coli, taip pat, kaip enteritų sukėlėjos, dažnai pasitaiko ir kitos bakterijos - Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp., Vibrio spp., Clostridium spp (3). Prieš skiriant antimikrobinį

gydymą, esant enteritui, būtina nustatyti sukėlėją, nes kiekvienos bakterijos padermės pasižymi skirtingomis savybėmis ir gali skirtis savo jautrumu / atsparumu tam tikroms antimikrobinėms medžiagoms.

Darbo tikslas: išskirti bakterijas iš enteritais sergančių smulkių gyvūnų išmatų ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.

Darbo uždaviniai:

1. Išskirti ir identifikuoti iš šunų mėginių enteritus sukeliančias bakterijas; 2. Ištirti kačių mėginius ir nustatyti enteritus sukeliančias bakterijas;

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1.

Sveikų šunų ir kačių žarnyno mikroflora

Palyginus su žmonėmis ir kitomis gyvūnų rūšimis, šunys ir katės evoliucionavo kaip mėsėdžiai, tad jų virškinimo traktas yra gana paprastas ir nereikalaujantis išskirtinių mikroorganizmų žarnyne tam, kad galėtų virškinti pašarą ir palaikyti energijos balansą (2). Visų žinduolių virškinimo trakte yra daugybė sudėtingų įvairių mikroorganizmų, tokių kaip: bakterijos, archėjos, virusai, grybai ir pirmuonys (4). Nepaisant šios didelės žarnyno mikroorganizmų įvairovės, neabejotinai, gausiausi atstovai yra bakterijos (5). Jos vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant šeimininko sveikatą, saugant organizmo imuninę sistemą, nepraleisdamos besibraunančių patogenų, teikia maistinę naudą šeimininkui (4).

Manoma, kad gyvūnų žarnyne gyvena netgi keletas tūkstančių bakterijų filotipų. Paprastai nustatoma nuo 10 iki 12 skirtingų bakterijų klasių (4,6,7,8). Iš jų didžiausią dalį žarnyno mikrobiotos sudaro firmikutai, bakteroidai ir fusobakterijos (maždaug 95%), likusius 1-5% sudaro proteobakterijos ir aktinobakterijos (6,7).

Tyrimais įrodyta, kad šunų ir kačių proksimalinėje plonosios žarnos dalyje gali būti net 11 skirtingų bakterijų klasių (6). Maždaug 95% sudaro firmikutai (gramteigiamos bakterijos, turinčios ląstelės sienelę) - pagrinde bakterijos iš Clostridiales ir Lactobacillales eilių, taip pat bakteroidai, proteobakterijos ir aktinobakterijos. Kačių dvylikapirštėje žarnoje yra didesnis bakterijų skaičius nei pas šunis ir vyrauja anaerobinės bakterijos (Bacteroides spp., Fusobacterium spp.,

Eubacterium spp.) (4).

Šunų ir kačių gaubtinėje žarnoje bei išmatų mėginiuose vyrauja firmikutai (daugiausiai

Clostridiales eilės), bakteroidai ir fusobakterijos.Taip pat, atliekant metagenominę analizę, nustatyta,

kad tiek pas kates, tiek pas šunis storajame žarnyne randama ir proteobakterijų, aktinobakterijų (Bifidobacterium spp.) (4).

Molekuliniai tyrimai parodė, kad kiekvienas šuo ir katė yra individualus ir turi savo unikalią, stabilią mikrobinę ekosistemą žarnynuose. Visi gyvūnai turi panašias bakterijų grupes, kai jie analizuojami aukštesniu filogenetiniu lygiu (t.y. šeimos ar genties lygiu), tačiau kiekvieno gyvūno mikrobiomas labai skiriasi pagal rūšį / padermę, paprastai tarp atskirų gyvūnų bakterijų rūšys sutampa tik nuo 5% iki 20%.

10

1.2. Smulkiųjų gyvūnų enteritų priežastys

Enteritas yra plonojo žarnyno uždegimas, kuris gali būti sukeliamas daugelio priežasčių. Dažniausiai enteritus sukelia parazitai, bakterijos, virusai ar alergijos (1 lentelė), ko pasekoje gyvūnui pasireiškia viduriavimas. Gyvūnas pradeda viduriuoti dėl vandens pertekliaus, kuris atsiranda pablogėjus žarnyno absorbcijai arba dėl padidėjusios žarnyno sekrecijos (1).

1 lentelė. Smulkių gyvūnų enteritų priežastys (1) Smulkių gyvūnų

enteritų priežastys Sukeliantys veiksniai

Virškinimo sutrikimai

Nevalgomų daiktų ėdimas, padidėjęs jautrumas tam tikram produktui, alergija pašarui, maisto nuodai/toksiškumas, pašaro

keitimas, pašaro perteklius; šiukšlių ėdimas.

Metabolizmo sutrikimai/uždegimai

Stresas, sepsis, uždegiminė žarnyno liga, pankreatitas, limfangiektazija, stresinis kolitas, hemoraginis gastroenteritas,

hepatitas, cholangiohepatitas, lėtinė inkstų liga, hipertiroidizmas, hipoadrenokorticizmas, egzokrininis kasos

nepakankamumas. Vėžiniai dariniai

žarnyne Karcinoma, limfoma, žarnos stromos navikas.

Medikamentai Vidurių laisvinamieji vaistai, chemoterapija, NVNU, antibiotikai

Infekcijos

• Virusinės: parvovirusas, koronavirusas, maras, kačių leukemijos virusas, kačių imunodeficito virusas;

• Parazitinės: giardijos, helmintai;

• Bakterinės: Campylobacter spp., Clostridium spp.,

Salmonella spp., E. Coli (1)

1.3. Pagrindiniai šunų ir kačių bakterinių enteritų sukėlėjai

Pagrindiniai mėsėdžių enteropatogenai yra Clostridium difficile, Clostridium perfringens,

Salmonella spp., Campylobacter jejuni ir Escherichia coli, kuri siejama su granuliomatoziniu kolitu.

Paprastomis sąlygomis, diagnostikai naudojant greituosius testus, aptikti šiuos patogenus yra gana sudėtinga, kadangi dažniausiai veterinarijos klinikose naudojami testai yra ne tokie jautrūs ir jiems trūksta specifiškumo, palyginus su specialiais metodais, kurie atliekami laboratorijose (9).

Daugelis Campylobacter spp. padermių, C. difficile, C. Perfringens ir E. coli gali būti aptinkamos žarnyne ir kaip normali gyvūno žarnyno mikroflora (9).

11

1.3.1. Clostridium difficile

Clostridium difficile yra gramteigiama, sporas formuojanti bakterija, kuri gali sukelti enteritus

įvairioms gyvūnų rūšims, taip pat ir žmonėms (10). Anksčiau buvo manyta, kad toksigeninės C.

difficile padermės yra vienos dažniausių enteritus sukeliančių mikroorganizmų žmonėms, tačiau

pastaruosius 15 metų teigiama, kad enteritus C. difficile sukelia tiek žmonėms, tiek gyvūnams (11). Kol kas C. difficile sukeliamos infekcijos žarnyne patofiziologija dar nėra iki galo išaiškinta, kadangi toksinių padermių bei jų toksinų yra randama tiek sveikų gyvūnų organizmuose, tiek sergančių (9,10). Žinoma, kad enteritus gyvūnams iššaukia pakankamus toksinų kiekius sukelti ligai gaminančios C. difficile padermės, kurios išskiria enterotoksiną A (TcdA) ir citotoksiną B (TcdB) (9). Kai kurios padermės gamina ir C. difficile toksiną arba CDT, kuris susideda iš dviejų skirtingų polipeptidų - CdtA ir CdtB, kurie kartu turi citotoksinį ir enterotoksinį poveikį (12).

Informacijos apie C. difficile padermių, išskirtų iš šunų ar egzotinių gyvūnų rūšių, jautrumą antimikrobinėms medžiagoms yra labai nedaug (13,14). Dažniausiai gydymui naudojamas metronidazolas, tačiau, jei padermės yra atsparios šiai antimikrobinei medžiagai, galima naudoti vankomiciną. Atsparumas metronidazolui didėja tais atvejais, kai gyvūnams nuolat pasikartoja C.

difficile sukelti enteritai (10).

1.3.2. Clostridium perfringens

C. perfringens yra plačiai paplitusi gramteigiama anaerobinė bacila, dažniausiai randama

gyvūnų ir žmonių žarnyno normali mikrobiotos dalis (15). Ji taip pat gali būti skirstoma į penkis biotipus nuo A iki E pagal išskiriamus savo toksinus – alfa, beta, epsilon ir jota (16). Be to, kad C.

perfringens bakterijos gamina pagrindinius toksinus, jos taip pat išskiria papildomus virulentiškumo

faktorius, kurie gali būti susiję su žmonių ir gyvūnų ligų patogenezėmis, t.y. - enterotoksinas, beta-2 toksinas, NetB, NetE, NetF ir NetG (17). Kiekvienas biotipas gali išskirti mažiausiai 10 kitų toksinų, įskaitant C. perfringens citotoksinį enterotoksiną (CPE). Dauguma padermių priklauso A tipui, tik vienoje ataskaitoje rašoma apie C tipo sukeltą infekciją, kuri pasireiškė penkiems šunims, sergantiems lėtiniu hemoraginiu enteritu. Enterotoksigeninis biotipas A siejamas su žmonių apsinuodijimais maistu bei atsitiktiniu viduriavimu, šunų ūmiu ar lėtiniu viduriavimu esant plonosios ir storosios žarnų pažeidimams, taip pat ūmiu hemoraginiu viduriavimo sindromu (9).

Nors tyrimai įrodė, kad ryšys tarp CPE ir šunų viduriavimo egzistuoja, C. perfringens sukelto viduriavimo patogenezė dar nėra išaiškinta, kadangi CPE yra aptinkamas ir sveikų šunų išmatų mėginiuose. Atliktas preliminarus tyrimas parodė, kad iš 54 tiriamųjų sveikų kačių, 2% savo žarnynuose turėjo CPE (9).

12 Smulkių gyvūnų C. perfringens infekcijoms gydyti dažniausiai yra naudojami metronidazolas ir tilozinas, taip pat galima naudoti amoksiciliną, tetracikliną, eritromiciną ir cefaleksiną. Tyrimai parodė, kad dauguma C. perfringens padermių yra labai jautrios metronidazolui, o makrolidams ir tetraciklinams atsparumas yra gana dažnas (18,19).

1.3.4. Salmonella spp.

Salmonelės yra gramneigiamos, judrios, sporų neformuojančios fakultatyvinės anaerobinės bacilos, kurios priklauso Enterobacterales šeimai (9). Salmonella spp. gali gyventi daugelio žinduolių, žuvų žarnynuose bei tulžies pūslėse, nesukeldamos jokių simptomų, tačiau gyvūnai jas nuolat išskiria į aplinką besituštindami (20). Salmonella gentis susideda iš 2 rūšių: Salmonella

enterica ir Salmonella bongori. S. enterica turi dar 6 porūšius: S. enterica spp. enterica, S. enterica

spp. salamae, S. enterica spp. arizonae, S. enterica spp. diarizonae, S. enterica spp. houtenae, and S.

enterica spp. indica. Žinoma, kad ne visos Salmonella genties padermės gali sukelti ligą, taip pat

neaišku, kokį kiekį toksinų turi išskirti žarnyne, kad šeimininkui pasireikštų simptomai (9).

Šių bakterijų paplitimas šunų bei kačių tarpe buvo tiriamas metų metus. Didelė turimų tyrimų dalis atskleidė, kad salmonelių kiekis sveikų šunų bei kačių žarnynuose gali būti labai panašus į viduriuojančių gyvūnų. Tyrimais įrodyta, kad išmatų mėginiuose esantys salmonelių skaičiai priklauso nuo geografinės padėties, kurioje gyvena gyvūnas ir nuo mėginių tyrimo būdo (9).

Salmonelės yra vienos pagrindinių bakterijų, sukeliančios žmonių ir gyvūnų gastroenteritus ir septicemijas. Jos gali kolonizuotis gyvūnų virškinamajame trakte, tačiau nėra įprasta žmonių, kačių ar šunų mikrofloros dalis. Šunys ir katės gali užsikrėsti per užterštą maistą (žalią, džiovintą, netinkamai paruoštą mėsą, šunų maistą, skanėstus, kiaušinius ir pieno produktus) arba vartodami užterštą vandenį. Tyrimais įrodyta, kad katės yra atsparesnės infekcijoms, o benamiai šunys, klajojantys, ėdantys pūvančius maisto produktus, gali turėti daug didesnę infekcijos riziką. Jaunesniems ir senesniems gyvūnams gali pasireikšti sunkesnė infekcijos forma (21).

Salmonella spp. padermės gali būti labai įvairiai jautrios / atsparios tam tikroms

antimikrobinėms medžiagoms, todėl, nustačius užsikrėtimą, tyrimais reikėtų nustatyti, kokią antimikrobinę medžiagą naudoti gydymui. Lingling ir kt. (2020) Atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad iš 25 salmonelių padermių 92% buvo atsparios tetraciklinui, 88% – azitromicinui, 84% – cefazolinui, 80% – ampicilinui, 80% nalidikso rūgščiai ir ceftriaksonui.. Visos 25 tirtos padermės buvo jautrios arba vidutiniškai jautrios meropenemui ir amoksicilinui su klavulano rūgštimi. Iš viso daugiau nei 64% Salmonella padermių buvo atsparios mažiausiai 11 antimikrobinių medžiagų. Skirtingi serotipai turėjo skirtingą jautrumą ir atsparumą įvairiems antibiotikams (22). Dažnais

13 atvejais Salmonella spp. sukeltų enteritų gydymui tinka doksiciklinas, chloramfenikolis bei enrofloksacinas (21).

1.3.4. Campylobacter spp.

Kampilobakterijos yra plonos, gramneigiamos lazdelės formos bakterijos, kurios gali būti su vienu žiuželiu savo poliuje arba su pora žiuželių, kurie sudaro „kirų sparnų“ vaizdą, arba išsidėsčiusios grandinėmis, kurios sudaro spiralių vaizdą. Taip pat egzistuoja nejudančios rūšys, bakterijos be žiuželių (pvz., C. gracilis) arba rūšys su daugybe žiuželių (pvz., C. showae) (23). Vertinant pagal genotipinius ir fenotipinius požymius, Campylobacter ir Arcobacter gentys priklauso tai pačiai šeimai – Campylobacteraceae. Campylobacter gentį šiuo metu sudaro daugiau nei 30 skirtingų rūšių ir porūšių, išskiriamų iš žmonių ir gyvūnų visame pasaulyje, kurios turi skirtingus arba dar visai nepatvirtintus patogeniškumo faktorius (23).

Nuo 1977 m. Campylobacter spp. buvo pripažinta kaip viena dažniausių ūminių viduriavimų sukėlėjų žmonėms, o kiek vėliau šios bakterijos buvo išskirtos ir iš viduriuojančių šunų bei kačių išmatų. Nuo to laiko buvo teigiama, kad kampilobakterijos yra viena iš rūšių, galinčių sukelti enteritus ir smulkiesiems gyvūnams. Gyvūnai infekciją perduoda vieni kitiems tiesiogiai kontaktuodami arba netiesiogiai oraliniu-fekaliniu būdu per išmatas. Užsikrėtimo šaltiniai gali būti blogai termiškai apdorotas žalias maistas, nepasterizuotas pienas, vanduo (23).

Remiantis paskelbtais tyrimų duomenimis, dažniausiai iš šunų ir kačių išmatų mėginių išskiriama: C. upsaliensis, C. jejuni ir C. helveticus (9,24,25). Campylobacter spp. vyravimas šunų bei kačių išmatose priklauso nuo gyvūnų amžiaus, rūšies, laikymo sąlygų, gretutinių ligų buvimo, mėginių ėmimo sezono, geografinės padėties ir tyrimo būdų (9,23,25).

Kai nėra duomenų apie jautrumą tam tikroms antimikrobinėms medžiagoms, Campylobacter spp. sukeltą enteritą rekomenduojama gydyti eritromicinu arba azitromicinu (9,26). Šunys, kurie yra užsikrėtę C. jejuni, sėkmingai gydomi cefoksitinu, eritromicinu arba enrofloksacinu (23,27).

1.3.5. Patogeninės Escherichia coli

Escherichia coli yra lazdelės formos gramneigiamos, sporų neformuojančios bakterijos,

kurios priklauso Enterobacterales šeimai. Enteritus sukeliančios E. coli yra plačiai paplitusios žemės ūkio aplinkoje, gyvūnai užsikrečia per užterštą maistą, vandenį, išmatas (21).

Patogeninėms E.coli bakterijoms priklauso daugybė padermių, kurios sukelia gyvūnų enteritus, yra žinomi mažiausiai septyni štamai: enteropatogeninė E. coli (EPEC), enterotoksinė E.

14

coli (EIEC), enteroagregatinė - skirtingas padermes ar rūšis prisijungianti E. coli (EAEC) ir adhezinė

- invazinė E. coli (AIEC). Dažniausiai už gyvūnų enteritus yra atsakinga ETEC, jos sukelia iki 31% šunų viduriavimų (21). ETEC geba gaminti dviejų tipų virulentiškumo faktorius: adhezinus, kurie skatina prisirišimą ir kolonizaciją prie žarnyno epitelio, ir enterotoksinus, kurie atsakingi už skysčių išskyrimo sutrukdymą. ETEC gamina dvi pagrindines enterotoksinų klases: didelės molekulinės masės šilumai jautrius toksinus, kurie inaktyvuojamai kaitinant 15 min. 60°C temperatūroje ir mažos molekulinės masės termostabilius toksinus, kurie nesuyra kaitinant 15 minučių 100°C (9). Šunims, kurie valgo žalią mėsą, EHEC padermės gali sukelti odos ir inkstų glomerulų vaskulopatiją. AIEC padermės yra siejamos konkrečiai su jaunų bokserių, prancūzų buldogų ir kolių granulomatoziniu kolitu (21).

Enterotoksigeninės ir hemoraginės E. coli padermės yra jautrios daugeliui antimikrobinių medžiagų, tačiau žmonių medicinos tyrimai rodo, kad antibiotikai gali padidinti hemolizinio ureminio sindromo išsivystymo riziką. Wiebe (2015) tyrimų duomenimis, daugelis pacientų pasveiksta be gydymo antimikrobinėmis medžiagomis per 5-10 dienų, taikant specialią neperdirbtų produktų dietą. Šunis, kurie užsikrėtę AIEC sukeltu granuliomatoziniu kolitu, rekomenduojama gydyti fluorochinolonais, skiriant juos 8 savaites (21).

1.3.6. Proteus mirabilis

Proteus mirabilis pirmą kartą atrado Gustavas Hauseris 1885m. Ši rūšis pavadinta pagal

„Homero odisėją“ dėl savo savybės keisti formą, nes Proteus gali keisti savo formą iš lazdelės formos vegetatyvinės ląstelės į pailgą, labai judrią ląstelę. P. mirabilis priklauso Enterobacterales šeimai, o

Proteus gentis sujungta kartu su Morganella, Providencia gentimi (28). Proteus mirabilis dažniausiai

gyvūnams sukelia žaizdų infekcijas, enteritus, šlapimo takų infekcijas, reumatoidinį artritą ir meningitą kūdikiams. Šios bakterijos patogeniškumą lemia unikalūs virulentiškumo faktoriai, tokie kaip: adhezinai, ląselės žiuželis, išskiriami toksinai ir fermentai (29). P. mirabilis išskiria toksiną hemoliziną, kuris patekęs į ląstelių membranas ardo jas sukurdamas poras, ko pasekoje ląstelės yra pažeidžiamos. P. mirabilis turi du hemolizino genus hpmA ir hpmB. HpmA yra periplazmos erdvėje, o HpmB yra šeimininko ląstelės išorinėje membranos dalyje ir yra susijęs su HpmA sekrecijos procesu. Proteus mirabilis koduoja metaloproteinazę ZapA, kuri nutraukia imunoglobulinų A1 (IgA1), IgA2 ir IgG grandinę. ZapA genų mutacija gali susilpninti imuninę sistemą, kad bakterija surastų ląstelę šeimininkę, tokiu būdu bakterijos gali fimbrijomis ar žiuželiais padidinti savo sukibimą su įvairių organų epitelinėmis ląstelėmis (30).

15

Proteus mirabilis yra jautri daugumai antibiotikų klasių, tokių kaip penicilinai, cefalosporinai,

aminoglikozidai, rifampicinas ir fluorochinolonai ir tuo pačiu yra atspari amoksicilinui, cefotaksimui ir karbenicilinui (30).

1.3.7. Citrobacter spp.

Gramneigiamos, fakultatyvios anaerobinės, lazdelės formos, priklausančios Enterobacterales šeimai. Jos neturi kapsulės, yra judrios, viename savo poliuje gali turėti 5 žiuželius (31,32).

Šiuo metu Citrobacter gentis apima C. farmeri, C. braakii, C. freundii, C. koseri, C.

amalonaticus, C. gilleni, C. murliniae, C. redentium, C. sedlakii, C. werkmanii ir C. youngae rūšis

(32). Šunims ir katėms infekcijas dažniausiai sukelia C. freundii, C diversus ir C. koseri rūšys (21). Dauguma Citrobacter padermių iš sergančių pacientų yra išskiriamos kaip antrinis patogenas, jos taip pat gali priklausyti normaliai žarnyno mikroflorai. Užsikrėtusiems pacientams gali pasireikšt i smegenų abscesai, meningitai, endokarditai, C. koseri yra enteropatogeniška ir dažniausiai sukelia enteritus (32).

Antimikrobinių medžiagų pasirinkimas Citrobacter spp. sukeltoms infekcijoms gydyti yra pagrįstas kultūros išskyrimo rezultatais. Trečiosios kartos cefalosporinai ir plataus spektro penicilinai gali būti veiksmingi, tačiau atsparumas šioms antimikrobinėms medžiagoms taip pat pastebimas. Gydymui gali tikti karbapenemai ir fluorochinolonai (21).

1.3.7. Klebsiella spp.

Klebsiella genties bakterijos, kurios priklauso Enterobacterales šeimai, yra gramneigiamos,

toksinus išskiriančios bacilos, turinčios polisacharidines kapsules. Aptinkamos gėlavandenėse aplinkose, nuotekose, dirvožemyje, taip pat gyvūnų gleivinėse. Padermės, anksčiau identifikuotos kaip K. pneumoniae, buvo suskirstytos į filogenetines grupes, pavadintas KpI, KpII ir KpIII. Neseniai buvo pasiūlyta šias filogenetines grupes pertvarkyti kaip atskiras rūšis - K. pneumoniae (KpI), K.

quasipneumoniae (KpII) ir K. variicola (KpIII), kurios bendrai vadinamos K. pneumoniae kompleksu

(KP) (33,34). Klebsiella spp. smulkiems gyvūnams dažniausiai sukelia šlapimo takų infekcijas, enteritus, piometrą, viršutinių kvėpavimo takų infekcijas ir septicemiją, taip pat pastebėta, kad ši gentis yra atsakinga už suaugusių šunų daugelio organų nepakankamumą. Neretai šunų veislynuose pasitaiko Klebsiella spp. protrūkiai dėl užkrėstų pašarų naudojimo šunų šėrimui (35).

Klebsiella spp. mikroorganizmai dažniausiai jautrūs daugeliui antimikrobinių medžiagų,

įskaitant pirmosios ir trečiosios kartos cefalosporinus, tačiau hospitaliniai patogenai dažnai būna labai atsparūs antibiotikams ir gydymas tampa apsunkintas. Gydymui taip pat tinka:

16 • Fluorochinolonai;

• Plataus spektro penicilinai; • Imipenemas;

• Meropenemas;

17

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1. TYRIMŲ MEDŽIAGA

Tyrimai buvo atliekami 2017 – 2019 metais Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Tyrimams transportinėse terpėse, kartu su lydraščiais, iš įvairių veterinarijos klinikų buvo gauta viduriuojančių 26 šunų bei 9 kačių išmatų mėginiai. Veterinarijos klinikos išmatų mėginius siuntė tam, kad nustatyti, kokią antimikrobinė medžiagą yra tikslinga skirti gyvūnui sergant bakterinės kilmės enteritu. Lydraščiuose buvo pateikta informacija apie gyvūnų amžių bei veisles, šie duomenys buvo labai įvairūs ir reikšmės tyrimų atlikimui bei rezultatams neturėjo, kadangi tyrimų tikslas buvo išskirti bakterijas, jas identifikuoti bei nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.

2.2. TYRIMŲ EIGA

Į laboratoriją atvežti smulkių gyvūnų išmatų mėginiai buvo sėjami ant įvairių standžių terpių (1pav.).

1pav. Išmatų mėginių sėjimas į standžias mitybines terpes

Ant Kraujo agaro buvo sėjama, kad pamatyti išaugusių bakterijų įvairovę, tai svarbu nustatant disbakteriozes. Enterobakterijų išskyrimui tiriamoji medžiaga buvo sėjama ant standžių diferencinių

18 diagnostinių terpių: MacConkey (Liofilchem) agaro – diferencijuoti laktozę skaldančias bakterijas nuo laktozės neskaldančių, Tryptone Bile X-Gluc (TBX) agaro, kur ešerichijos dėl gaminamo fermento gliukoronidazės auga žalios spalvos kolonijomis. Salmonelių išskyrimui buvo sėjama ant SS (Salmonella-Shigella Agar, Oxoid) agaro. Stafilokokų išskyrimui tiriamoji medžiaga buvo sėjama ant Manito druskos (Liofilchem, Italija) agaro. Tiriamos medžiagos pasėliai Petri lėkštelėse buvo kultivuojami aerobinėmis sąlygomis termostate esant 35,5 °C temperatūrai parą laiko.

Kampilobakterijų išskyrimui naudotas Campylobacter Blood Free Medium Base (Oxoid) agaras su suplementu SR0155. Kultivuojama termostate mikroaerofilinėmis sąlygomis vieną-dvi paras esant 35°C temperatūrai.

Klostridijų išskyrimui tiriamoji medžiaga buvo sėjama ant selektyvios standžios terpės klostridijoms kultivuoti (Reinforced Clostridial Agar, Oxoid). Termostate anaerobinėmis sąlygomis esant 35°C temperatūrai buvo kultivuojama 24-48 val.

Išaugusios pavienės bakterijų kolonijos buvo gryninamos ir gausinamos (2, 3pav.).

19 3pav. Bakterijų augimas mitybinėje terpėje (autoriaus nuotrauka)

Bakterijų morfologinės savybės nustatytos dažant Gramo būdu. Išskirti mikroorganizmai buvo identifikuoti iki rūšies pagal jų biochemines savybes, t.y. gebėjimą skaldyti angliavandenius. Bakterijų identifikacijai buvo naudota enterobakterijoms skirta identifikacijos sistema „Microgen“ (Microgen, JK). Rezultatams įvertinti naudota kompiuterinė programa Microgen Ver 1.2.

Identifikuotoms bakterijoms jautrumas antimikrobinėms medžiagoms nustatytas Kirby-Bauer diskų difuzijos į agarą metodu. Naudoti antibiotikų diskai: ampicilinas (AMP 10µg), sulfametoksazolis / trimetoprimas (SXT 25µg), gentamicinas (CN 10µg), enrofloksacinas (ENR 5µg), cefoksitinas (FOX 30µg), amoksicilinas (AML 30µg), amoksicilinas su klavulano rūgštimi (AMC 30µg), cefaleksinas (CL 30µg), cefovecinas (CVN 30µg).

Bakterijų jautrumo antibiotikams rezultatai buvo vertinami remiantis EUCAST (Europos jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimo komitetas) 2020 m. standartu (36). Jautrumas veterinarijoje naudojamoms antimikrobinėms medžiagoms nustatytas remiantis CLSI Vet08 standartu (37). Naudoti antibiotikai ir vertinimo kriterijai pateikti 2 lentelėje.

20 2 lentelė. Naudoti antibiotikai ir vertinimo kriterijai

Antibiotikai Antib. disko

koncentracija Jautru ≥ Vidut. jautru Atsparu ≤ Ampicilinas 10 µg 14 - 13 Sulfametoksazolas / trimetoprimas 25 µg 14 11-13 10 Gentamicinas 10 µg 17 - 16 Enrofloksacinas* 5 µg 23 17-22 16 Cefoksitinas 30 µg 19 - 18 Amoksicilinas 10 µg 14 - 13

Amoksicilinas su klavulano rūgštimi 30 µg 19 - 18

Cefaleksinas 30 µg 14 - 13

Cefovecinas* 30 µg 24 21-23 20

* - jautrumas antimikrobinėms medžiagoms vertintas remiantis CLSI VET08 ir EUCAST standartais

2.3. Statistinė analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atliekama naudojant kompiuterinę programą „Microsoft Excel 2016“. Išsikeltų hipotezių patikrinimui buvo paskaičiuota Stjudento t statistinis kriterijus, vidurkiai. Tyrimo duomenys laikyti statistiškai patikimi, kai p<0,05, ir nereikšmingi, kai p>0,05.

21

3. TYRIMO REZULTATAI

Tyrimo metu buvo tirti 35 gyvūnų išmatų mėginiai. Išmatos buvo surinktos iš 26 šunų ir 9 kačių. Iš 35 mėginių buvo išskirta ir identifikuota 115 mikroorganizmų. Nepatogeninių mikroorganizmų (n=77), kurie sudarė 67% visų išskirtų mikroorganizmų, buvo išskirta daugiau, nei patogeninių (n=38), kurie sudarė 33% mikroorganizmų (4pav.).

4pav. Patogeninių ir nepatogeninių mikroorganizmų pasiskirstymas

Analizuojant nepatogeninius šunų ir kačių išmatų mėginiuose buvusius mikroorganizmus, galima teigti, kad daugiausiai buvo aptikta nepatogeninių E. coli 44,2% (n=34), toliau sekė 20,8% (n=16) Staphylococcus spp. koaguliazei neigiami stafilokokai (KNS), 15,6% (n=12) Enterococcus spp., 6,5% (n=5) Enterobacter spp., 3,9% (n=3) Streptococcus spp., 3,9% (n=3)

Pseudomonas aeruginosa, 2,6%, (n=2) Staphylococcus pseudintermedius, 1,3% (n=1)

Corynebacterium spp. ir 1,3% (n=1) Bacillus spp. (5pav.)

33,0% 67,0% Patogeniniai mikroorganizmai Nepatogeniniai mikroorganizmai

22 5pav. Nepatogeninių mikroorganizmų pasiskirstymas

Nustatyta, kad iš 38 išskirtų patogeninių šunų ir kačių mikroorganizmų, viduriavimus dažniausiai sukėlė P. mirabilis 42,1% (n=16), β - hemolizinės E. coli 28,9% (n=11), rečiau pasitaikė

Citrobacter spp. 13,2% (n=5), Klebsiella spp. 10,5% (n=4), Vibrio spp. 2,6% (n=1) ir Clostridium

spp. 2,6% (n=1) (6pav.).

6pav. Patogeninių mikroorganizmų pasiskirstymas

Nepatogeninės E. coli; 44,2% Corynebacterium spp.; 1,3% Enterobacter spp.; 6,5% Enterococcus spp.; 15,6% Pseudomonas aeruginosa; 3,9% Staphylococcus spp. KNS; 20,8% Staphylococcus pseudintermedius; 2,6% Streptococcus sp.; 3,9% Bacillus spp.; 1,3% Nepatogeninės E. coli Corynebacterium spp. Enterobacter spp. Enterococcus spp. Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. KNS Staphylococcus pseudintermedius Streptococcus sp. Bacillus spp. β - hemolizinė E. coli; 28,9% Proteus mirabilis; 42,1% Citrobacter spp.; 13,2% Klebsiella spp.; 10,5% Vibrio spp.; 2,6% Clostridium spp.; _2,6% β - hemolizinė E. coli Proteus mirabilis Citrobacter spp. Klebsiella spp. Vibrio spp. Clostridium spp.

23 Nagrinėjant šunų enteritų sukėlėjus, nustatyta, kad, iš visų 26 šunų išmatų mėginių, dažniausias enteritų sukėlėjas buvo Proteus mirabilis 51,6% (n=16), kitas dažnesnis sukėlėjas, atsakingas už 16,1% šunų enteritų, buvo β-hemolizinė E. coli (n=5). Rečiau viduriavimus sukėlė

Citrobacter spp. 12,9% (n=4) ir Klebsiella spp. 12,9 % (n=4). Pavieniais atvejais išskirta Clostridium

spp. 3,2% (n=1) ir Vibrio spp. 3,2% (n=1) (7pav.).

7pav. Iš šunų išmatų išskirtų patogeninių mikroorganizmų pasiskirstymas

Nustačius šunų enteritų patogeninius sukėlėjus, toliau buvo atliekami tyrimai bakterijų rezistentiškumo antibiotikams nustatymui. Vienas pagrindinių šunų enteritų sukėlėjų buvo Proteus

mirabilis, atsakinga už 51,6% šunų bakterinių enteritų atvejų. Patogeninės P. mirabilis padermės

buvo išskirtos iš 16 mėginių. Vertinant išskirtų P. mirabilis atsparumą antimikrobinėms medžiagoms nustatyta, kad didžiausias antimikrobinis rezistentiškumas buvo cefoksitinui 50%, (n=8), didžiausias jautrumas nustatytas cefaleksinui (n=13). Atlikus statistinę duomenų analizę ir, lyginant antimikrobinių medžiagų poveikį P. mirabilis padermėms, nustatyta, kad cefaleksino veikimas skyrėsi nuo enrofloksacino bei cefovecino (p<0,05). Taip pat statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi cefovecino veikimas palyginus su cefoksitinu, ampicilinu, gentamicinu ir amoksicilinu su klavulano rūgštimi (8pav.). β-hemolizinė E. coli; 16,1% Proteus mirabilis; 51,6% Citrobacter spp.; 12,9% Klebsiella spp.; 12,9% Clostridium spp.; 3,2% Vibrio spp.; 3,2% β-hemolizinė E. coli Proteus mirabilis Citrobacter spp. Klebsiella spp. Clostridium spp. Vibrio spp.

24 8pav. Iš šunų išmatų išskirtų Proteus mirabilis atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

AMP – a mpicilina s, SXT – sulfa metoksazola s / trimetoprima s, CN – genta micina s, ENR – enrofloksa cina s, FOX – cefoksitina s, AML – a moksicilina s, AMC – a moksicilina s su kla vula no r., CL – cefa lekcina s, CVN – cefovecina s

Kita dažnesnė šunų enteritų sukėlėja buvo β-hemolizinė E. coli. Iš 26 šunų išmatų mėginių buvo išskirta 5 β-hemolizinės E. coli padermės. Vertinant jų atsparumą antibiotikams, išsiaiškinta, kad daugiausiai padermių buvo atsparių cefaleksinui 40% (n=2) bei gentamicinui 40% (n=2). 80% išskirtų β-hemolizinių E. coli padermių buvo jautrios cefovecinui (n=4), amoksicilinui su klavulano rūgštimi (n=4), amoksicilinui (n=4), cefoksitinui (n=4), enrofloksacinui (n=4), sulfametoksazoliui / trimetoprimui (n=4) bei ampicilinui (n=4). Atlikus statistinę duomenų analizę ir lyginant antimikrobinių medžiagų poveikį nustatyta, kad enrofloksacino veikimas skyrėsi nuo ampicilino, gentamicino, amoksicilino, amoksicilino su klavulano rūgštimi bei cefaleksino (p<0,05). Taip pat pastebėtas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) tarp ampicilino ir amoksicilino su klavulano rūgštimi (9pav).

9 12 9 11 6 8 10 13 11 3 1 1 1 7 4 4 5 8 7 5 3 5 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP10 SXT25 CN10 ENR5 FOX30 AML30 AMC30 CL30 CVN30

25 9pav. Iš šunų išmatų išskirtų β-hemolizinių E. coli atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

AMP – a mpicilina s, SXT – sulfa metoksazola s / trimetoprima s, CN – genta micina s, ENR – enrofloksa cina s, FOX – cefoksitina s, AML – a moksicilina s, AMC – a moksicilina s su kla vula no r., CL – cefa lekcina s, CVN –

cefovecina s

Kitas, rečiau išskiriamas šunų enteritų sukėlėjas buvo Citrobacter spp. 50 proc. šių bakterijų pasižymėjo atsparumu cefaleksinui (n=2), amoksicilinui su klavulano rūgštimi (n=2), amoksicilinui (n=2), gentamicinui (n=2) bei ampicilinui (n=2). Visos išskirtos Citrobacter spp. padermės buvo jautrios enrofloksacinui (n=4). Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad enrofloksacino veikimas skyrėsi nuo ampicilino, gentamicino, amoksicilino, amoksicilino su klavulano rūgštimi bei cefaleksino (p<0,05) (10pav.).

10pav. Iš šunų išmatų išskirtų Citrobacter spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

4 4 2 4 4 4 4 3 4 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP10 SXT 25 CN10 ENR5 FOX30 AML30 AMC30 CL30 CVN30

Jautru, % Vidutiniška, % Atsparu, %

2 3 1 4 3 2 1 2 3 1 1 2 1 2 1 2 2 2 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP10 SXT25 CN10 ENR5 FOX30 AML30 AMC30 CL30 CVN30

26

AMP – a mpicilina s, SXT – sulfa metoksazola s / trimetoprima s, CN – genta micina s, ENR – enrofloksa cina s, FOX – cefoksitina s, AML – a moksicilina s, AMC – a moksicilina s su kla vula no r., CL – cefa lekcina s, CVN – cefovecina s

Klebsielės buvo išskirtos tik iš šunų išmatų. Ištyrus šių bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, nustatyta, kad visos Klebsiella spp. padermės pasižymėjo atsparumu dviems antibiotikams - amoksicilinui su klavulano rūgštimi (n=4) bei amoksicilinui (n=4). Visos išskirtos klebsielės buvo jautrios enrofloksacinui (n=4). Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad enrofloksacino veikimas skyrėsi statistiškai reikšmingai (p<0,05) nuo ampicilino, gentamicino, amoksicilino, amoksicilino su klavulano rūgštimi bei cefaleksino. Taip pat pastebėta, kad amoksicilino veikimas skyrėsi nuo amoksicilino su klavulano rūgštimi, cefoksitino bei gentamicino (p<0,05) (11pav.).

11pav. Iš šunų išmatų išskirtų Klebsiella spp. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

AMP – a mpicilina s, SXT – sulfa metoksazola s / trimetoprima s, CN – genta micina s, ENR – enrofloksa cina s, FOX – cefoksitina s, AML – a moksicilina s, AMC – a moksicilina s su kla vula no r., CL – cefa lekcina s, CVN – cefovecina s

Iš 35 tyrimui gautų išmatų mėginių, 9 mėginiai priklausė katėms. Atliekant tyrimus su kačių išmatomis, buvo ištirtos ir identifikuotos 6 β-hemolizines E. coli padermės (n=6), kurios sudarė 85,7% visų patogeninių mikroorganizmų, išskirtų iš kačių išmatų. Kitas patogeninis mikroorganizmas, kuris bakterinį enteritą sukėlė vienai katei, buvo Citrobacter spp. 14,3% (n=1) (12pav.). Likę du kačių išmatų mėginiai buvo be patogeninių mikroorganizmų, išsiaiškinta, kad šiems gyvūnams enteritai pasireiškė dėl disbakteriozės.

1 2 4 3 3 3 1 3 2 3 1 4 4 1 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP10 SXT25 CN10 ENR5 FOX30 AML30 AMC30 CL30 CVN30

27 12pav. Iš kačių išmatų išskirtų patogeninių mikroorganizmų pasiskirstymas

Analizuojant iš kačių išmatų išskirtas β-hemolizines E. coli padermes, pastebėta, kad didžiausiu atsparumu šie sukėlėjai pasižymėjo amoksicilinui 66,7% (n=4) ir gentamicinui 66,7% (n=4). 33,3% bakterijų buvo vidutiniškai jautrios cefovecinui. Nustatyta, kad visos išskirtos β-hemolizinės E. coli padermės buvo jautrios cefoksitinui (n=6). Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad cefoksitino veikimas statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi nuo ampicilino, gentamicino, amoksicilino, amoksicilino su klavulano rūgštimi bei cefaleksino. Taip pat pastebėta, kad skyrėsi cefovecino poveikis palyginus su ampicilinu, gentamicinu, amoksicilinu, amoksicilinu su klavulano rūgštimi bei cefaleksinu (p<0,05) (13pav.).

13pav. Iš kačių išmatų išskirtų β-hemolizinių E. coli atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

β-hemolizinė E. coli, %; 85,7% Citrobacter spp., %; 14,3% β-hemolizinė E. coli, % Citrobacter spp., % 3 5 1 4 6 2 4 6 4 1 1 1 2 3 1 4 1 4 1 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP10 SXT25 CN10 ENR5 FOX30 AML30 AMC30 CL30 CVN30

28

AMP – a mpicilina s, SXT – sulfa metoksazola s / trimetoprima s, CN – genta micina s, ENR – enrofloksa cina s, FOX – cefoksitina s, AML – a moksicilina s, AMC – a moksicilina s su kla vula no r., CL – cefa lekcina s, CVN – cefovecina s

29

REZULTATŲ APTARIMAS

2017– 2019 metais Mikrobiologijos ir virusologijos institute atlikto tyrimo metu, kurio tikslas buvo nustatyti smulkiųjų gyvūnų enteritus sukeliančių bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, buvo gauta 35 gyvūnų - 26 šunų (74,3%) ir 9 kačių (25,7%) išmatų mėginiai. Tyrimo metu enteritų priklausomybė nuo gyvūno rūšies, veislės ir amžiaus nebuvo nustatoma dėl to, kad buvo gauti labai įvairių enteritais sergančių gyvūnų išmatų mėginiai ir, norint nustatyti išskirtų patogenų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, reikšmės neturėjo.

Iš visų 35 išmatų mėginių buvo išskirta 115 įvairų mikroorganizmų, iš jų identifikuoti 38 patogeniniai (33%) smulkiųjų gyvūnų enteritus sukėlę mikroorganizmai ir 77 nepatogeniniai mikroorganizmai (67%). Iš 35 išmatų mėginių pasitaikė 3 mėginiai, kuriuos tiriant nebuvo aptikti patogeniniai mikroorganizmai, vėliau nustatyta, kad 2 katėms ir 1 šuniui enteritai pasireiškė dėl žarnyno disbakteriozės. Kituose išmatų mėginiuose buvo bent po vieną patogeninį, bakterinį enteritą sukėlusį, mikroorganizmą. Analizuojant nepatogeninius šunų ir kačių išmatų mėginiuose buvusius mikroorganizmus, galima teigti, kad daugiausiai buvo aptikta nepatogeninių E. coli 44,2% , toliau sekė Staphylococcus spp. KNS 20,8%, Enterococcus spp. 15,6%, Enterobacter spp. 6,5%,

Streptococcus spp. 3,9%, Pseudomonas aeruginosa 3,9%, Staphylococcus spp. KTS 2,6%, Corynebacterium spp. 1,3% ir Bacillus spp. 1,3% .

S. L. Marks ir kiti (2011) teigia, kad pagrindinės, dažniausiai pasitaikančios bakterijos, galinčios sukelti smulkiųjų gyvūnų enteritus, yra Clostridium difficile, Clostridium perfringens,

Salmonella spp. Campylobacter spp. ir patogeninės Escherichia coli. Atlikto tyrimo duomenys tai

patvirtina. Šio tyrimo metu buvo aptiktos patogeninės β - hemolizinės E. coli bei Clostridium spp. Kitos, viduriavimus smulkiems gyvūnams sukėlusios bakterijos buvo Proteus mirabilis, Citrobacter spp., Klebsiella spp. ir Vibrio spp. Nustatyta, kad iš 38 išskirtų patogeninių šunų ir kačių mikroorganizmų didžiausią dalį sudarė P. mirabilis 42,1%, kitas dažnesnis sukėlėjas buvo β - hemolizinės E. coli 28,9%, rečiau pasitaikė Citrobacter spp. 13,2%, Klebsiella spp. 10,5%, Vibrio spp. 2,6% ir Clostridium spp. 2,6%. Nustatyta, kad dažniausias šunų enteritų sukėlėjas buvo P.

mirabilis ir β - hemolizinės E. coli. Vertinant kačių duomenis, dažniausias sukėlėjas buvo β -

hemolizinės E. coli.

Tiriant iš šunų mėginių išskirtas bakterijas, nustatyta, kad P. mirabilis didžiausiu atsparumu pasižymėjo cefoksitinui (50%), nors Z. Ubreen (2019) teigimu P. mirabilis sukeltiems enteritams gydyti vieni tinkamiausių antibiotikų yra būtent cefalosporinai. Tiriant išskirtų P. mirabilis padermių jautrumą, nustatyta, kad didžiausias jautrumas buvo cefaleksinui (81,25%), cefovecinui (68,75%) ir enrofloksacinui (68,75%), kas atitiko Z. Umbreen (2019) atliktų tyrimų rezultatus.

30

Citrobacter genties bakterijos buvo jautrios enrofloksacinui. Panašius duomenis

pateikia ir J. V. Wiebe (2015). Jų tyrimų duomenimis, išskirtos Citrobacter genties bakterijos pasižymėjo jautrumu enrofloksacinui. Pastebėtas gana didelis (50%) Citrobacter spp. atsparumas tokioms antimikrobinėms medžiagoms kaip cefaleksinas, amoksicilinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi, gentamicinas ir ampicilinas.

K. Harada ir kt. (2016) teigė, kad dažniausiai Klebsiella spp. bakterijos yra jautrios cefalosporinams. Atlikto tyrimo duomenys sutampa su minėtų autorių duomenimis. Visos iš šunų išskirtos Klebsiella genties bakterijos pasižymėjo jautrumu enrofloksacinui ir dauguma buvo jautrios cefovecinui, cefaleksinui ir cefoksitinui. Taip pat literatūroje (35) buvo minima, kad Klebsiella spp. sukeltoms infekcijoms gydyti tinka penicilinai ir aminoglikozidai, tačiau, atlikus tyrimą, buvo nustatyta, kad visos išskirtos šios genties bakterijos buvo atsparios amoksicilinui ir amoksicilinui su klavulano rūgštimi. 75% išskirtų klebsielių nustatytas atsparumas gentamicinui ir ampicilinui. Vadinasi, jeigu, neatlikus bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms testo, skirsime šiuos antibiotikus, gydymas gali būti neefektyvus.

Iš kačių išmatų mėginių buvo išskirta β - hemolizinės E. coli ir Citrobacter freundii Pasak V. J. Wiebe (2015), patogeninių E. coli sukeltų enteritų gydymo metu efektyviausiai veikia fluorochinolonai. Atlikus tyrimus su išskirtomis β - hemolizinėmis E. coli padermėmis, galima teigti, kad labiausiai tinkamos antimikrobinės medžiagos enteritų gydymui buvo cefaleksinas ir cefoksitinas, kadangi jautrumas šioms antimikrobinėms medžiagoms siekė 100%. O tuo tarpu jautrumas enrofloksacinui siekė 66,7%. Dažniausiai β - hemolizinės E. coli buvo atsparios amoksicilinui, gentamicinui bei ampicilinui.

Citrobacter freundii pasižymėjo jautrumu cefaleksinui ir sulfametoksazolui /

trimetoprimui. Ir nors V. J. Wiebe (2015) teigė, jog Citrobacter genties bakterijų sukeltiems enteritams labiausiai tinkami fluorochinolonai, tyrimo metu gauti duomenys tai paneigia. Citrobacter

freundii pasižymėjo atsparumu enrofloksacinui ir amoksicilinui su klavulano rūgštimi. Minėti

antibiotikai Lietuvoje dažnai naudojami įvairių infekcijų gydymui, todėl ir stebimas didėjantis bakterijų atsparumas šioms antimikrobinėms medžiagoms.

31

IŠVADOS

1. Ištyrus 26 šunų išmatų mėginius nustatyta, kad dažniausias enteritų sukėlėjas buvo Proteus

mirabilis (51,6%), kita dažnesnė patogeninė bakterija buvo 16,1% β-hemolizinė E. coli. Rečiau

viduriavimus sukėlė Citrobacter spp. 12,9% ir Klebsiella spp. 12,9 %. Pavieniais atvejais buvo išskirta Clostridium spp. 3,2% ir Vibrio spp. 3,2%.

2. Iš 9 kačių išmatų mėginių, didžiąją patogeninės mikrofloros dalį sudarė β-hemolizinės E. coli (85,7%). Kitas patogeninis išskirtas mikroorganizmas, kuris bakterinį enteritą sukėlė vienai katei, buvo Citrobacter spp. 14,3%. Dviejuose viduriuojančių kačių išmatų mėginiuose patogeniai mikroorganizmai nebuvo išskirti, nustatyta, kad viduriavimai pasireiškė dėl disbakteriozės. 3.1. Iš šunų mėginių išskirtas P. mirabilis (81,3%) pasižymėjo jautrumu cefaleksinui ir dažniausiai

(50%) buvo atsparus cefoksitinui. Beta - hemolizinės E. coli buvo atspariausios gentamicinui ir cefaleksinui (40%), o 80% išskirtų padermių buvo jautrios cefovecinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi, amoksicilinui, cefoksitinui, enrofloksacinui, sulfametoksazoliui / trimetoprimui bei ampicilinui. Visos išskirtos Citrobacter spp. ir Klebsiella spp. padermės buvo jautrios enrofloksacinui. 50% Citrobacter spp. bakterijų didžiausiu rezistentiškumu pasižymėjo cefaleksinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi, amoksicilinui, gentamicinui bei ampicilinui. Visos išskirtos Klebsiella spp. padermės buvo atsparios amoksicilinui bei amoksicilinui su klavulano rūgštimi.

3.2. Iš kačių mėginių visos išskirtos β-hemolizinės E. coli padermės buvo jautrios cefoksitinui, o didžiausiu atsparumu pasižymėjo amoksicilinui ir gentamicinui (66,7%). Visos išskirtos

Citrobacter spp. buvo atsparios amoksicilinui su klavulano rūgštimi bei enrofloksacinui ir

32

PASIŪLYMAI / REKOMENDACIJOS

Pasireiškus smulkiųjų gyvūnų enteritams, rekomenduojama atlikti bakteriologinį išmatų tyrimą, kad nustatyti infekcijos sukėlėją ir jo jautrumą antimikrobinėms medžiagoms. Tokiu būdu bus pasiektas efektyviausias paskirto gydymo rezultatas.

33

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Luis Tello, Rossana Perez-Freytes. Fluid and Electrolyte Therapy During Vomiting and Diarrhea. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. 2017; 47(2): p. 505–519. 2. Ping Deng, Kelly S. Swanson. Gut microbiota of humans, dogs and cats: current knowledge and

future. British Journal of Nutrition. 2015;: p. 6-17.

3. S.L. Marks, S.C. Rankin, B.A. Byrne, J.S. Weese. Enteropathogenic Bacteria in Dogs and Cats: Diagnosis. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2011;: p. 1195–1208.

4. Suchodolski JS. Intestinal microbiota of dogs and cats: a bigger world than we thought. The Veterinary clinics of North America. Small animal practice. 2011;: p. 261-72.

5. Suchodolski JS. Diagnosis and interpretation of intestinal dysbiosis in dogs and cats. The veterinary journal. 2016;: p. 30-37.

6. Handl, S., Dowd, S.E., Garcia-Mazcorro, J.F., Steiner, J.M., and Suchodolski, J.S. Massive parallel 16S rRNA gene pyrosequencing reveals highly diverse fecal bacterial and fungal communities in healthy dogs and cats. FEMS Microbiology Ecology. 2011;: p. 301-310.

7. Ingmar S Middelbos, Brittany M Vester Boler, Ani Qu, Bryan A White, Kelly S Swanson, George C Fahey Jr. Phylogenetic characterization of fecal microbial communities of dogs fed diets with or without supplemental dietary fiber using 454 pyrosequencing. Public Library of Science. 2010 Kovas.

8. Ritchie L.E., Burke K.F., Garcia-Mazcorro J.F. Characterization of fecal microbiota in cats using universal 16S rRNA gene and group-specific primers for Lactobacillus and Bifidobacterium spp. Veterinary microbiology. 2010;: p. 140-146.

9. S.L. Marks, S.C. Rankin, B.A. Byrne, and J.S. Weese. Enteropathogenic bacteria in dogs and cats: diagnosis, epidemiology, treatment, and control. American College of Veterinary Internal Medicine. 2011;: p. 1195-1208.

10 .

Sara Andrés-Lasheras, Inma Martín-Burriel, Raúl Carlos Mainar-Jaime, Mariano Morales, Ed Kuijper, José L ir kt. Preliminary studies on isolates of Clostridium difficile from dogs and exotic pets. BMC Veterinary Research. 2018;(77).

11 .

Rodriguez-Palacios A, Borgmann S, Kline TR, LeJeune JT. Clostridium difficile in foods and animals: history and measures to reduce exposure. Animal health research reviews. 2013;: p. 11-29.

12 .

Robert J. Carman a, Adam L. Stevens, Matthew W. Lyerly, Megan F. Hiltonsmith, Bradley G. Stiles, Tracy D. Wilkins. Clostridium difficile binary toxin (CDT) and diarrhea. Anaerobe. 2011;: p. 161-165.

13 .

Álvarez-Pérez S, Blanco JL, Martínez-Nevado E, Peláez T, Harmanus C, Kuijper E, ir kt. Shedding of Clostridium difficile PCR ribotype 078 by zoo animals, and report of an unstable metronidazole-resistant isolate from a zebra foal (Equus quagga burchellii). Veterinary microbiology. 2014;: p. 218–222.

34 14

.

Orden C, Blanco JL, Álvarez-Pérez S, Garcia-Sancho M, Rodriguez-Franco F, Sainz A ir kt. Isolation of Clostridium difficile from dogs with digestive disorders, including stable metronidazole-resistant strains. Anaerobe. 2017;: p. 78-81.

15 .

Popoff M. R., Bouvet P. Genetic characteristics of toxigenic Clostridia and toxin gene evolution. Toxicon. 2013;: p. 63-89.

16 .

Francisco A Uzal, Bruce A McClane, Jackie K Cheung, James Theoret , Jorge P Garcia, Robert J Moore ir kt. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary microbiology. 2015;: p. 23-33.

17 .

Gohari I. M., Parreira V. R., Nowell V. J., Nicholson V. M., Oliphant K., Prescott J. F. A novel pore-forming toxin in type A Clostridium perfringens is associated with both fatal canine hemorrhagic gastroenteritis and fatal foal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 2015;(4).

18 .

Rodrigo Otávio Silveira Silva, Francisco Carlos Faria Lobato. Clostridium perfringens: A review of enteric diseases in dogs, cats and wild animals. Anaerobe. 2015;: p. 14-17.

19 .

S. Gobeli, C. Berset, I. Burgener, V. Perreten. Antimicrobial susceptibility of canine Clostridium perfringens strains from Switzerland. Schweiz. Arch. Tierheilk. 2012;: p. 247-250.

20 .

Kahya, S., Eyigör, A. & Çarlı, K.T. Comparison of Different Sample Types for Salmonella Detection. Vet. Med. 2013;: p. 19-24.

21 .

Wiebe VJ. Drug Therapy for Infectious Diseases of the dog and cat; 2015.

22 .

Lingling Wei, Cheng Yang, Wangfeng Shao, Tongzheng Sun, Jianyu Wang, Zhengkun Zhou ir kt. Prevalence and drug resistance of Salmonella in dogs and cats in Xuzhou, China. J Vet Res. 2020;(64).

23 .

Acke E. Campylobacteriosis in dogs and cats: a review. New Zealand Veterinary Journal. 2018;: p. 221-228.

24 .

Queen EV, Marks SL, Farver TB. Prevalence of selected bacterial and parasitic agents in feces from diarrheic and healthy control cats from northern California. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2012;: p. 54-60.

25 .

Bojanić K, Midwinter AC, Marshall JC, Rogers LE, Biggs PJ, Acke E. Isolation of campylobacter spp. from client-owned dogs and cats, ad retail raw meat pet food in the Manawatu, New Zealand. Zoonoses and Public Health. 2017;: p. 438-449.

26 .

JS W. Bacterial enteritis in dogs and cats: diagnosis, therapy, and zoonotic potential. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. 2011;: p. 287-309.

27 .

Sykes J, Marks S. Campylobacteriosis. In: Canine and Feline Infectious Diseases; 2013.

28 .

Antoni Różalski, Agnieszka Torzewska, Magdalena Moryl ir kt. Proteus sp. – an opportunistic bacterial pathogen – classification, swarming growth, clinical significance and virulence factors. Folia Biologica et Oecologica. 2012;: p. 1-17.

35 29

.

Cristiani Baldo, Sérgio Paulo Dejato Rocha. Virulence Factors Of Uropathogenic Proteus. International Journal of Scientific and Technology Research. 2014;: p. 24-27.

30 .

Umbreen Zafar, Muhammad Kamran Taj, Imran Nawaz, Ashiq Hussain, Imran Taj, Zain-ul-Abideen ir kt. Proteus mirabilis as a pathogenic organism. International Journal of Biosciences. 2019;: p. 443-450.

31 .

Swanson K.S., Dowd S.E., Suchodolski J.S. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. International Society for Microbial Ecology. 2011;: p. 639–649.

32 .

Robert Washabau MJD. In Canine and Feline Gastroenterology.; 2013. p. 99-108.

33 .

Brisse S., Passet V., Grimont P. A. Description of Klebsiella quasipneumoniae sp. nov., isolated from human infections, with two subspecies, Klebsiella quasipneumoniae subsp. quasipneumoniae subsp. nov. and Klebsiella quasipneumoniae subsp. similipneumoniae subsp. nov., and demonstration th. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014;: p. 3146-3152.

34 .

Holt, K. E., Wertheim, H., Zadoks, R. N., Baker, S., Whitehouse, C. A., Dance ir kt. Genomic analysis of diversity, population structure, virulence, and antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae, an urgent threat to public health. PNAS. 2015;: p. E3574–E3581.

35 .

Kazuki Harada, Takae Shimizu, Yujiro Mukai, Ken Kuwajima, Tomomi Sato, Masaru Usui. Phenotypic and Molecular Characterization of Antimicrobial Resistance in Klebsiella spp. Isolates from Companion Animals in Japan: Clonal Dissemination of Multidrug-Resistant Extended-Spectrum β-Lactamase-Producing Klebsiella pneumoniae. 2016;(7).

36 . http://www.eucast.org. [Online].; 2020. 37 . http://vet01s.edaptivedocs.net/GetDoc.aspx?doc=CLSI%20VET01S%20ED5:2020&scope=use r. [Online].; 2020.