1
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Virginija Ašmonienė
SERGANČIŲJŲ GLIOBLASTOMA HOXA9,
HOXA11, NDRG2 IR MGMT GENŲ
PROMOTORIAUS METILINIMO IR
KLINIKINIŲ VEIKSNIŲ PROGNOZINĖS
VERTĖS TYRIMAS
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
medicina (06B)
2
Disertacija rengta 2007–2013 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos (iki 2010 metų rugsėjo 1 d. Kauno medicinos univer-sitete) Neuromokslų instituto, Neuroonkologijos ir genetikos laboratorijoje (iki 2011 metų liepos 1 d. Biomedicininių tyrimų instituto, Neuromokslų laboratorijoje).
Mokslinis vadovas
prof. habil. dr. Algimantas Sinkus (Lietuvos sveikatos mokslų univer-siteto Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
Konsultantas
prof. habil. dr. Arimantas Tamašauskas (Lietuvos sveikatos mokslų uni-versiteto Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
3
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS... 7
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS ... 11
3. DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 12
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
4.1. Glioblastomos epidemiologija ... 13
4.2. Glioblastomos rizikos veiksnių apžvalga ... 14
4.3. Glioblastomų klasifikacija ... 15
4.4. Glioblastomos patogenezės mechanizmai ... 18
4.4.1. Trumpi vėžio genetikos istorijos faktai ... 18
4.4.2. Molekulinių pažaidų glioblastomose apžvalga ... 18
4.4.3. Pagrindinių glioblastomos patogenezės grandžių ypatybės ... 20
4.4.4. Epigenetinių mechanizmų apžvalga ... 21
4.4.5. MGMT genas ... 24
4.4.6. HOXA9 ir HOXA11 genai ... 26
4.4.7. NDRG2 genas ... 27
4.5. Sergančiųjų glioblastoma klinikos savitumai ... 28
4.6. Glioblastomos diagnostika ... 31
4.7. Glioblastomos gydymo taktika ... 33
4.8. Sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumas ... 34
4.9. Glioblastomos prognoziniai išgyvenamumo veiksniai ... 35
5. TIRTŲJŲ KONTINGENTAS IR TYRIMO METODIKA ... 40
5.1. Tirtųjų kontingentas ... 40
5.1.1. Pagrindinės tiriamųjų klinikinės charakteristikos ... 41
5.1.2. Imties tūrio apskaičiavimas ... 42
5.2. Tyrimo metodika ... 42
5.2.1. DNR išskyrimas iš navikinio audinio ... 42
5.2.2. DNR bisulfitinė modifikacija ... 44
4
5.2.4. MSP produktų analizė gelio elektroforezės metodu ... 51
5.2.5. Agarozės gelio vizualizavimas ... 53
5.3. Statistinė duomenų analizė ... 54
6. TYRIMO REZULTATAI ... 56
6.1. Sergančiųjų glioblastoma demografinės ir klinikinės charakteristikos ... 56
6.2. HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo dažnumas tiriamųjų navikiniame audinyje ... 62
6.3. Sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmės po operacijos priklausomai nuo HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo tyrimas ... 66
6.4. HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo prognozinės vertės sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumui tyrimas ... 72
6.5. Sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmės po operacijos priklausomai nuo pacientų demografinių ir klinikinių veiksnių analizė ... 74
6.6. Pacientų demografinių ir klinikinių veiksnių prognozinės vertės išgyvenamumui tyrimas ... 81
6.7. HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo ir reikšmingų demografinių ir klinikinių veiksnių sąsajų prognozinės vertės sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumui tyrimas ... 83 7. REZULTATŲ APTARIMAS ... 91 IŠVADOS ... 100 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 102 PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 114 PRIEDAI ... 117 1 priedas ... 117 2 priedas ... 120 PADĖKA ... 122
5
SANTRUMPOS
A – adeninas
ACNU – nimustinas
ANXA – aneksinas A (angl. Annexin A) BCNU – karmustinas
BTBD2 – angl. BTB (POZ) domain containing 2
C – citozinas
CBTRUS – angl. Central Brain Tumor Registry of the United States CDK4 – angl. Cyclin-dependent kinase 4
CDKN2 – angl. Cyclin-dependent kinase inhibitor 2 (2A, 2B) CHI3L1 – angl. Chitinase 3-like 1 (Cartilage glycoprotein-39) CMV – citomegalo virusas
CNS – centrinė nervų sistema
DGKI – angl. Diacylglycerol kinase, iota DNMT – DNR metiltransferazė
DNR – deoksiribonukleorūgštis
EGFR – epiderminio augimo veiksnio receptorius (angl. Epidermal growth
factor receptor)
EtBr – etidžio bromidas
FNDC3B – angl. Fibronectin type III domain containing 3B
FSD1 – angl. Fibronectin type III and SPRY domain containing 1
G – guaninas
GBM – multiforminė glioblastoma
GSCs – kamieninės glijos ląstelės (angl. Glioma Stem Cells) HMGA2 – angl. High mobility group AT-hook 2
HOX – HOX genų šeima, kurioje išskyriamos A, B, C, D genų grupės:
HOXA, HOXB, HOXC, HOXD (angl. Homeobox)
HOXA9 – HOX šeimos A grupės 9 genas (angl. Homeobox A9) HOXA11 – HOX šeimos A grupės 11 genas (ang. Homeobox A11) ICD-O – tarptautinė onkologinių ligų klasifikacija (angl. International
Classification of Diseases for Oncology)
IDH1 – izocitrato dehidrogenzė 1 (angl. Isocitrate dehydrogenase 1) IGFBP-2 – angl. Insulin-like growth factor binding protein 2
kDa – kilodaltonas
KT – kompiuterinės tomografijos tyrimas LIG4 – angl. Ligase IV, DNA, ATP-dependent
LOH – heterozigotiškumo praradimas (angl. Loss of Heterozygosity) LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno klinikos M – geno promotorius metilintas
MAPK – mitogenų aktyvuojama proteinų kinazė (angl. Mitogen-activated protein kinase) MGMT – O6-metilguanino-metiltransferazė
(angl. O-6-methylguanine-DNA methyltransferase) MDM2 – angl. Mouse double minute 2 homolog
MET – angl. MET proto-oncogene (Hepatocyte growth factor receptor) MIIP – angl. Migration and Invasion Inhibitory Protein gene (sin. IIp45)
6
Mikro-RNR – viengrandės 18-24 nukleotidų ilgio RNR sekos (angl. Micro-RNA,
miRNA)
MMP – matrikso metaloproteinazės (angl. Matrix metalloproteinases) MRT – magnetinio rezonanso tyrimas
MSH6 – angl. mutS homolog 6 (E. coli)
MSP – metilinimui specifinė polimerazinė grandininė reakcija N – geno promotorius nemetilintas
NDRG2 – angl. N-myc downstream-regulated gene 2 NF1 – neurofibrominas 1 (angl. neurofibromin 1)
NOTCH – genų šeima, koduojanti transmembraninius baltymus (NOTCH1-NOTCH4)
PGR – polimerazinė grandininė reakcija PDGF – angl. Platelet-derived growth factor
PDGFRA – angl. Platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide PI3K – fosfatidilinozitidino-3-kinazė (angl. Phosphatidylinositide 3-kinase) PIK3CA – angl. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase catalytic
subunit alpha isoform
PI – pasikliautinasis intervalas
PTEN – angl. Phosphatase and tensin homolog
PSO – Pasaulinė sveikatos organizacija (angl. World Health Organization, WHO)
RB – retinoblastoma RNR – ribonukleorūgštis
RTEL1 – angl. Regulator of telomere elongation helicase 1
SDF-1/CXCL12 – angl. Stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine ligand 12 SNP – vieno nukleotido pilimorfizmas (angl. Single nucleotide
polymorphism)
T – timinas
TBX3 – angl. T-box 3
TMZ – temozolamidas (ang. Temozolomide) TNFR – angl. Tumour necrosis factor receptor TP53 – angl. Tumor protein p53
VEGFA – angl. Vascular endothelial growth factor A vs. (versus) – lot. palyginti
7
ĮVADAS
Glioblastoma – tai dažniausias pirminis piktybinis suaugusiųjų galvos smegenų navikas, lemiantis ypač trumpą išgyvenamumą nuo diagnozės nustatymo datos (pagal 2007 m. PSO CNS navikų klasifikaciją – IV laipsnio astrocitoma) (Louis ir kt., 2007). Glioblastomos sudaro apie 50 proc. visų pirminių gliominių navikų (Louis ir kt., 2007). Europoje bei Šiaurės Ameri-koje kasmet nustatomi 3–5 nauji glioblastomos atvejai 100 000 gyventojų (CBTRUS, 2009; Wohrer ir kt., 2009). Europoje sergančiųjų glioblastoma yra beveik dukart daugiau nei Afrikos, Pietų Amerikos bei Azijos žemynų populiacijose. Nepaisant nuolat tobulėjančių chirurginio, spindulinio ir che-moterapijos gydymo metodų, sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmė išlieka vos 12–14 mėn. po diagnozės nustatymo (Johnson ir kt., 2012). Tai-komi brangūs ištyrimo bei gydymo metodai turi tik nedidelę įtaką sergan-čiųjų išgyvenimo trukmei. Glioblastoma dažnai tampa neįgalumo priežas-timi, todėl tokiems pacientams reikalinga nuolatinė kitų asmenų priežiūra.
Siekiant pagerinti šios ligos gydymo rezultatus, visame pasaulyje atlie-kami moksliniai tyrimai bandant išsiaiškinti ligos prigimtį bei pagerinti pro-filaktikos, diagnostikos, gydymo metodus, kartu prailginant sergančiųjų išgyvenimo trukmę. Deja, iki šiol glioblastomos etiologija ir patogenezė ne-pakankamai ištirta. Neabejojama, kad glioblastoma kaip ir kitų lokalizacijų navikai yra daugiaveiksnės etiologijos liga, kurios vystymuisi įtakos turi įvairūs išoriniai veiksniai (pavyzdžiui, jonizuojamoji radiacija ir kt.), tiek paties organizmo (pavyzdžiui, senėjimas ir kt.) pokyčiai. Manoma, kad onkogenezinis procesas prasideda genetiniame ir epigenetiniame lygme-nyse, ko pasekoje gaminami pakitę baltymai nebeatlieka įprastų funkcijų ir ląstelė tampa vėžine ląstele (Carvalho ir kt., 2012). Per paskutinį dešimtmetį sukaupta nemažai įrodymų apie epigenomo pažaidų įtaką onkogenezei bei jų sąsajas su atsaku į gydymą. Pakitęs DNR metilinimas yra vienas iš pa-grindinių epigenetinių modifikacijų tipų vėžinėse ląstelėse (Jones ir kt., 2007). MGMT geno promotoriaus metilinimas yra vienas iš dažnai tyrinėja-mų epigenetinių žymenų sergantiesiems glioblastoma. Įvairių autorių duo-menimis, esant metilintam MGMT genui stebimas geresnis sergančiųjų glio-blastoma atsakas į gydymą alkilinamaisiais preparatais bei keliais mėnesiais prailgėjęs išgyvenamumas (Chen ir kt., 2013). Lietuvoje sergančiųjų glio-blastoma MGMT geno promotoriaus metilinimo dažnumas navikiniame audinyje nenustatytas. Publikuotas vienas Laurinavičienės ir bendraautorių tyrimas (n=20), kuriame metilintas MGMT genas nustatytas 89,5 proc. atvejų (Laurinavičienė ir kt., 2009). Vis dėlto, remiantis literatūros duomenimis, MGMT geno metilinimas nepakankamai paaiškina skirtingą
8
sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmę po operacijos, todėl kiti papil-domi epigenetiniai žymenys reikalingi individualiam pacientų prognozės įvertinimui (Hegi ir kt., 2005). MGMT geno metilinimo nustatymas tapo auksiniu standartu analizuojant bei lyginant naujų potencialių epigenetinių žymenų vaidmenį ligos patogenezėje bei jų įtaką sergančiųjų išgyvenimo trukmei po diagnozės nustatymo. HOXA9, HOXA11 ir NDRG2 genų metilinimas – tai vieni iš naujų ir potencialių epigenetinių žymenų, kurie gali būti reikšmingi sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumui. HOXA9 ir HOXA11 genai priklauso HOX genų šeimai, kurią sudaro 39 genai, suskirstyti į keturis genominius klasterius: HOXA (7p15.3), HOXB (17q21.3), HOXC (12q13.3), ir HOXD (2q31). Nustatyta, kad šios šeimos genai turi didelę įtaką smegenų vystymuisi embriogenezės metu (Vinci ir kt., 2011). Abdel-Fattah ir bendraautorių duomenimis, daugelio HOX šeimos genų raiška yra padidėjusi glioblastomos ląstelių kultūroje ir pirminėse astrocitomose, lyginant su normaliu smegenų audiniu, todėl galima įtarti jų svarbą gliomagenezei, tačiau mechanizmas, lemiantis HOX genų aktyvaciją, nepakankamai ištirtas (Abdel-Fattah ir kt., 2006). Manoma, kad individuali paciento metilintų ir nemetilintų HOX genų „mozaika“ (deriniai) gali būti prognoziškai reikšmingu žymeniu sergantiesiems glioblastoma, taip pat parenkant gydymą tiek spinduline, tiek individua-lizuota chemoterapija (Murat ir kt., 2008). Costa ir bendraautoriai pastebėjo, kad padidėjęs transkripcinis HOXA domeno aktyvumas susijęs ne tik su sveikų audinių fiziologinėmis funkcijomis, bet ir su onkogeneziniais mecha-nizmais, kurie galimai inicijuojami per grįžtamąsias epigenetines histotinių baltymų modifikacijas, reguliuojamas per PI3K patogenezinę grandį (kaip ir daugelyje kitų navikų), tokiu būdu pažeidžiama ir normali HOXA9 geno raiška, kuri, savo ruožtu, susijusi su ląstelių piktybėjimu bei gana sparčiu glioblastominio naviko progresavimu (Chakravarti ir kt., 2004; Costa ir kt., 2010). Tuo tarpu HOXA11 geno metilinimo įtaka sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumui nenagrinėta, iki šiol žinomas tik šio geno promotoriaus metilinimo dažnumas glioblastomos navikiniame audinyje (Martinez ir kt., 2009). Remiantis literatūros duomenimis, HOXA11 geno metilinimas susijęs su trumpesniu sergančiųjų kiaušidžių vėžiu ir endometriumo adenokarci-noma išgyvenamumu (Fiegl ir kt., 2008; Whitcomb ir kt., 2003) Todėl vienas iš šio darbo uždavinių yra įvertinti HOXA šeimos HOXA9 ir HOXA11 genų promotoriaus metilinimo, kaip potencialių žymenų įtaką ser-gančiųjų glioblastoma išgyvenamumui. NDRG2 genas yra vienas iš pro-apoptozinių, naviko supresorinis genas, dalyvaujantis dendritinių ląstelių ir neuronų diferencijacijoje. Nustatyta, kad NDRG2 raiška glioblastomose yra sumažėjusi, tuo tarpu padidėjusi šio geno raiška aktyviai slopina glioblas-tominių ląstelių proliferaciją in vitro (Deng ir kt., 2003). Remiantis Tepel ir
9
bendraautorių duomenimis, epigenetinis NDRG2 geno inaktyvinimas ran-damas daugelyje pirminių glioblastomų, bet antrinėse glioblastomose retai (Tepel ir kt., 2008). Sumažėjusi NDRG2 geno raiška – jau įrodytas prognozinis žymuo skrandžio karcinomos atveju (Hwang, 2011). Tuo tarpu, duomenų apie NDRG2 geno promotoriaus metilinimo vertę sergančiųjų glioblastoma prognozei yra mažai.
Glioblastomos laikomos vienais agresyviausių ir heterogeniškiausių na-vikų, todėl šiame paieškomajame darbe siekėme įvertinti kelių naujų epige-netinių veiksnių įtaką sergančiųjų išgyvenamumui. Nustatyti MGMT geno promotoriaus metilinimo dažnumą sergančiųjų glioblastoma navikiniame audinyje bei įtaką išgyvenamumui sąlyginai didesnėje Lietuvos gyventojų imtyje. Taip pat siekėme nustatyti nepriklausomus veiksnius, susijusius su ilgesniu ar trumpesniu sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumu, ne tik atskirose tiriamų genų ir klinikinių veiksnių grupėse, bet ir šių veiksnių tarpusavio sąsajų grupėse, kurie padėtų sergančiųjų būklės vertinimui bei gydymo taktikos pasirinkimui.
10
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Įvertinti sergančiųjų glioblastoma HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo dažnumą navikiniame audinyje ir nustatyti šių genų metilinimo bei jų ir pacientų demografinių bei klinikinių veiksnių tarpusavio sąsajų įtaką sergančiųjų išgyvenamumui.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo dažnumą sergančiųjų glioblastoma navikiniame audi-nyje.
2. Įvertinti sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmę po operacijos priklausomai nuo HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų pro-motoriaus metilinimo.
3. Nustatyti HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo prognozinę vertę sergančiųjų glioblastoma išgyvena-mumui.
4. Įvertinti sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmę po operacijos priklausomai nuo pacientų demografinių ir klinikinių veiksnių. 5. Nustatyti pacientų demografinių ir klinikinių veiksnių prognozinę
vertę sergančiųjų glioblastoma išgyvenimumui.
6. Nustatyti HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų promotoriaus metilinimo ir pacientų demografinių bei klinikinių veiksnių tarpu-savio sąsajų prognozinę vertę sergančiųjų glioblastoma išgyvena-mumui.
11
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS
Pradedant vykdyti tyrimus daktaro disertacijai parengti, pasaulinėje literatūroje buvo publikuoti pavieniai straipsniai, analizuojantys HOXA9 ir NDRG2 genų metilinimo įtaką sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmei nuo diagnozės nustatymo datos. Tuo tarpu informacijos apie HOXA11 geno metilinimo įtaką sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmei nebuvo publikuota. Atlikus šį mokslinį tyrimą gauta naujų žinių, kurios padės tiksliau įvertinti molekulinius glioblastomos onkogenezės mechanizmus. Šio tyrimo metu įvertinome naujų ir potencialių epigenetinių žymenų: HOXA9, HOXA11 ir NDRG2 genų, metilinimo įtaką sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmei po operacijos bei išanalizavome šių genų tarpusavio derinius, kurių prognozinė vertė iki šiol nebuvo tirta. Šiame tyrime pirmą kartą analizuota HOXA9, HOXA11, NDRG2 ir MGMT genų metilinimo bei jų ir pacientų demografinių bei klinikinių veiksnių įtaka sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumui. Nustatėme MGMT geno promotoriaus metilinimo dažnumą navikiniame audinyje sąlyginai didesnėje Lietuvos gyventojų imtyje. Duomenų apie analogiškus tyrimus prieinamose informacinėse duomenų bazėse nepavyko rasti.
12
3. DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ
Glioblastoma yra daugiaveiksnės etiologijos liga, kurios atsiradimą le-mia ne tiek išorinės aplinkos veiksniai, kiek vidiniai, vieni iš kurių yra epigenetiniai veiksniai. Šiuo tyrimu pradėti moksliniai MGMT, HOXA9, HOXA11 ir NDRG2 genų metilinimo tyrimai galvos smegenų glioblastomų navikiniame audinyje Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Neuroonkologijos ir genetikos laboratorijoje. Šio mokslinio tyrimo rezultatai suteikė išsamesnės ir atskleidė naujos informacijos apie sergan-čiųjų glioblastoma epigenetinių pažaidų dažnumą navikiniame audinyje bei jų įtaką sergančiųjų išgyvenamumui, kuri yra reikšminga ne tik Lietuvoje, bet ir pasaulyje. Tirtos epigenetinių žymenų ir pacientų demografinių bei klinikinių veiksnių sąsajos prisidės prie individualizuotos diagnostikos ir gydymo medicinos krypties plėtojimo, taip pat ir vertinant sergančiųjų glioblastoma prognozę. Be to, tyrimo rezultatai yra svarbūs bendram glioblastomos patogenezės supratimui ir tolesniems šios ligos molekulinių mechanizmų tyrimams.
13
4. LITERATŪROS APŽVALGA
Glioblastoma (GBM) – tai dažniausias ir agresyviausias galvos smege-nų navikas, kuriam būdingas greitas ligos progresavimas bei trumpa sergan-čiųjų išgyvenimo trukmė nuo diagnozės nustatymo datos, nepaisant taikomo kompleksinio gydymo, suaugusiems (Villalva ir kt., 2012). Pagal PSO CNS navikų klasifikaciją GBM priskiriama astrocitinės kilmės didžiausio pikty-biškumo laipsnio navikams (IV laipsnis), remiantis imunohistocheminėmis naviko charakteristikomis (WHO, 2007).
4.1. Glioblastomos epidemiologija
Bendrasis sergamumas pirminiais CNS navikais yra 18,16 atvejo 100 000 gyventojų per metus Jungtinėse Amerikos Valstijose (JAV) (CBTRUS, 2010). Iš jų 7 proc. susirgimų tenka vaikams (0–19 metų) ir 93 proc. su-augusiesiems (20 metų ir vyresniems) (CBTRUS, 2010). Bendrasis serga-mumas pirminiais piktybiniais CNS navikais varijuoja nuo 4,52 iki 8,84 atvejo 100 000 gyventojų per metus JAV (skirtingose valstijose) (CBTRUS, 2010). Suaugusiųjų sergamumas piktybiniais CNS navikais yra nuo 5,12 iki 11,10 atvejo 100 000 gyventojų per metus JAV lyginant skirtingas valstijas (CBTRUS, 2010). 2007 m. Furnari ir bendraautorių duomenimis, bendrasis sergamumas smegenų navikais pasaulyje sudaro apie 7 atvejus 100 000 gyventojų per metus, o tai sudaro mažiau kaip 2 proc. visų lokalizacijų pirminių navikų ir 7 proc. mirčių, sąlygotų naviko iki 70 metų amžiaus pa-cientų grupėje (Furnari ir kt., 2007). Europoje sergamumas CNS navikais yra 11,8 atvejo 100 000 gyventojų per metus, tuo tarpu sergamumas pirmi-niais piktybipirmi-niais navikais yra 7,9 atvejo 100 000 gyventojų per metus (Sant ir kt., 2011). Lietuvoje sergamumas CNS navikais bendrojoje navikų struk-tūroje sudaro apie 2–3 proc. tiek vyrų, tiek moterų grupėse (Gaižauskienė ir kt., 2005; VUOI, 2012).
Glioblastomos yra dažniausiai diagnozuojamas pirminis galvos smege-nų navikas, sudarantis apie 18 proc. visų intrakranijinių navikų ir 50–60 proc. visų gliominių navikų JAV (CBTRUS, 2010). Europoje GBM serga-mumas yra 2–3 atvejai 100 000 gyventojų ir sudaro 33 proc. visų gliominių navikų (Sant ir kt., 2011).
Sergamumas GBM įvairiose pasaulio šalyse yra panašus. Šiuo metu pa-stebimas didesnis sergamumo GBM dažnumas JAV, Skandinavijoje, Izrae-lyje nei Azijos šalyse. Europoje sergančiųjų GBM nustatoma beveik dukart daugiau nei Afrikos, Pietų Amerikos bei Azijos žemynų populiacijose (Ohgaki ir kt., 2005; CBTRUS, 2010). Manoma, jog tam įtakos gali turėti
14
įgimti veiksniai, aplinkos veiksniai, diagnostikos galimybės, sveikatos prie-žiūros sistemos bei ligos epizodų apskaitos praktika.
Skirtingų tyrimų duomenimis, sergamumas GBM ilgainiui išlieka pa-stovus arba net mažėja, tačiau Australijoje per pastaruosius du dešimtmečius sergančiųjų GBM skaičius auga (Dobes ir kt., 2011).
Sergamumas GBM vyrų ir moterų grupėse šiek tiek skiriasi. Dažniau serga vyrai, sergamumo santykis tarp lyčių – 3:2. (Ohgaki ir kt., 2005; Koshy ir kt., 2011; Dubrow ir kt., 2011). Lietuvoje moterų sergamumas GBM kiek didesnis nei vyrų, tai galima paaiškinti bendrąja Lietuvos gyventojų demografine situacija (Gaižauskienė ir kt., 2005).
Glioblastoma gali pasireikšti bet kurio amžiaus žmonėms, tačiau daž-niausiai, t. y. daugiau nei 70 proc., nustatoma 45–70 metų suaugusiesiems (Ohgaki 2005). Kai kurie autoriai isškiria du sergančiųjų GBM amžiaus pikus, vienas jų, kai GBM pasireiškia apie 65 gyvenimo metus (amžiaus mediana – 64 metai), kitas – kiek jaunesniems (amžiaus mediana 45 metai) (Wohrer ir kt., 2009; Furnari ir kt., 2007).
4.2. Glioblastomos rizikos veiksnių apžvalga
Iki šiol GBM etiologija nepakankamai ištirta. Kaip ir kitų lokalizacijų navikai GBM priskiriama daugiaveiksnės etiologijos ligoms, kurių pasireiš-kimui įtakos turi ne tik išoriniai veiksniai (radiacija, virusai ir kt.), bet ir vidiniai organizmo pokyčiai (įgimtos ir de novo genų mutacijos bei kt.) (Fisher ir kt., 2007).
Vienas iš neabejotinų rizikos veiksnių yra paciento amžius. Nors GBM gali pasireikšti bet kurio amžiaus žmonėms, visgi dažniausiai GBM diag-nozuojama apie 60–65-uosius gyvenimo metus (Ohgaki ir kt., 2005).
Labai svarbus rizikos veiksnys yra anksčiau diagnozuota žemesnio laipsnio astrocitoma (pilocitinė astrocitoma, difuzinė astrocitoma ir kt.), iš kurių gali vystytis antrinės GBM-os. Pastebėta, kad tokių antrinių GBM yra apie 10 proc. (Furnari ir kt., 2007).
Įgimti rizikos veiksniai. Dažniausiai GBM vystosi savaime, be jokių atpažįstamų priežasčių, tačiau pastebėta, kad rizika susirgti GBM padidėja tų šeimų nariams, kuriose yra sergančiųjų labai retomis ligomis: Li-Frau-meni sindromu, neurofibromatoze (1 tipas), tuberozine skleroze, Von Hippel Lindau liga, Turcot sindromu bei kt. (Kniffin, 2013). Vis dėlto paveldėtus sindromus daugeliu atvejų sunku diagnozuoti sergantiesiems GBM. Šeimi-nis smegenų gliominių navikų pasikartojimas randamas 5 proc. sergančiųjų GBM (Wrensch ir kt., 1997).
15
Aplinkos rizikos veiksniai: terapinė jonizuojamoji radiacija, darbas kau-čiuko, gumos pramonėje, naftos valymo ir produktų gamybos pramonėje, darbas su pesticidais, įvairios virusinės infekcijos (citomegalo virusas, CMV) bei kt. (Wrensch ir kt., 2002). Dėl CMV įtakos GBM pasireiškimui 2012 m. pasirašytas susitarimas (konsensusas), kuriame teigiama, kad šiuo metu turimų duomenų apie CMV sekų buvimą bei virusinių genų raišką GBM pakanka, todėl galima pereiti prie atitinkamos terapijos (anti-CMV) kūrimo (Dziurzynski ir kt., 2012). Terapinė jonizuojamoji radiacija yra stiprus rizikos veiksnys susirgti GBM. Vienos studijos duomenimis net 17 proc. GBM pacientų dėl įvairių priežasčių anksčiau buvo gydyti jonizuoja-mąja radiacija, kitų autorių duomenimis, rizika susirgti GBM po leukemijos gydymo jonizuojamąja radiacija vaikystėjė taip pat žymiai padidėja (Wrensch, 2002). Tikimybę susirgti GBM didina ir pasyvus rūkymas, tačiau tai kol kas nepakankamai pagrįstas rizikos veiksnys (Wrensch ir kt., 2002).
Hardell ir bendraautorių publikuota metaanalizė (apimanti 2 kohortų ir 16 atvejų-kontrolės tyrimų), nagrinėjusi mobiliųjų telefonų, naudotų 10 metų, įtaką, smegenų navikų vystymuisi, nustatė didesnę gliomų ir neurino-mų atsiradimo riziką (Hardell ir kt., 2007).
4.3. Glioblastomų klasifikacija
Pagal 2007 PSO CNS navikų klasifikaciją, remiantis navikinio audinio histologijos savitumais glioblastomos skirstomos į tris ICD-O grupes:
1. Glioblastomos – 9440/3.
2. Gigantinių ląstelių glioblastoma – 9441/3. 3. Gliosarkoma – 9442/3.
Šiuo metu, suteikiant naują ICD-O kodą, bandoma atskirti dar vieną GBM histologinį subtipą – tai smulkiųjų ląstelių glioblastoma, kuriai būdin-ga smulkių, apvalių bei kiek pailgų, tankiai išsidėsčiųsių ląstelių grupių buvimas su švelniai hiperchromatiniais branduoliais. Kraujagyslių proliferacija, nekrozė ir GFAP imunoreakcija gali būti minimali, nors navikinių ląstelių proliferacija yra ryški (PSO, 2007). Perry ir bendraautorių duomenimis, šis GBM tipas pasižymi blogesne prognoze (Perry ir kt., 2004), nors kitoje populiacinėje studijoje reikšmingo sergančiųjų išgyvenamumo trukmės skirtumo, lyginant su nesmulkiųjų ląstelių GBM, nenustatyta (Homma ir kt., 2006).
Kitas GBM subtipas, kurį bandoma išskirti į atskirą grupę, yra glio-blastomos su oligodendroglialiniu komponentu. Šiam tipui būdingi didesni arba mažesni oligodendrogliomos plotai. Vis dėlto kol kas yra per mažai klinikinių patologinių duomenų, jog šis GBM tipas yra susijęs su ilgesniu
16
išgyvenamumu, todėl ar tikslingas šio tipo išskyrimas, abejojama (Krauss ir kt., 2001, Hegi ir kt., 2012).
Pagal patogenezę, genetinių pažaidų pobūdį, dažnumą ir išgyvenamumo tendencijas GBM skirstomos į pirmines (de novo) ir antrines, pastarosios vystosi iš žemesnio laipsnio astrocitomų – I, II, III laipsnio astrocitomų. Šioms grupėms būdingas skirtingas GBM pasireiškimo laikas: pirminės GBM dažniausiai diagnozuojamos vyresnio amžiaus pacientams, apie 60– 70 gyvenimo metus, tuo tarpu antrinės GBM diagnozuojamos jaunesnio amžiaus pacientams – apie 45–50 gyvenimo metus (Furnari ir kt. 2007). Pir-minės ir antrinės GBM histologiškai neatskiriamos, tačiau randama reikš-mingų skirtumų molekuliniame lygmenyje: epigenetinių ir genetinių pažai-dų, genų raiškos ir proteomikos (Tso ir kt., 2006; Furuta ir kt., 2004). Pirminėse GBM dažniau nustatomos EGFR (epiderminio augimo veiksnio receptoriaus) geno pažaidos, MDM2 (angl. Mouse double minute 2 homo-log) duplikacijos, PTEN (angl. Phosphatase and tensin homohomo-log) mutacijos ir homozigotinės CDKN2 (angl. Cyclin-dependent kinase inhibitor 2) geno delecijos/iškritos (Ohgaki ir kt., 2004). Tuo tarpu MET (angl. met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor)) amplifikacija, padidėjusi PDGFRA (angl. platelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide) geno raiška ir IDH1 (izocitrato dehidrogenzės 1), TP53 (angl. tumor protein p53) genų mutacijos būdingos antrinėms GBM (Maher ir kt., 2006; Ohgaki ir kt., 2007; Bleeker ir kt., 2009; Nobusawa ir kt., 2009) (4.3.1 pav.).
2011 m. Verhaak R. ir bendraautoriai, remdamiesi genų raiškos poky-čiais (PDGFRA, IDH1, EGFR, NF1), išskyrė keturias GBM morfologines subgrupes: proneuralinę, neuralinę, klasikinę ir mezenchiminę (Verhaak ir kt., 2011). Kitų autorių nuomone, molekulinių GBM tipų gali būti išskiria-ma dar daugiau, nes GBM nors ir panašios histologijos, molekuliniame lyg-menyje yra labai heterogeniška liga (Dunn ir kt., 2012). Šių glioblastomos tipų kilmė kol kas neaiški, nors manoma, kad navikas vystosi iš sveikų glialinių ląstelių, vis dėlto šiuo metu vyrauja nuomonė, kad GBM vystosi iš nervinių-kamieninių arba pirmtakinių ląstelių (Louis, 2006; Martinez, 2009; Knights ir kt., 2012).
17
4.3.1 pav. Chromosominės ir molekulinės pažaidos nustatomos
pirminėse ir antrinėse GBM
Šiame paveiksle parodytas ryšys tarp sergančiųjų glioblastoma išgyvenimo trukmės, po diagnozės nustatymo ir naviko patomorfologijos ir molekulinių pažaidų, kurios susiję su pirminės (de novo) arba antrinės GBM vystymųsi. Nors histologiškai skirtumo tarp šių GBM nėra, jos pasireiškia skirtingose amžiaus grupėse, o glioblastomos navikiniame audinyje nustatomos skirtingos genetinės pažaidos. Pavyzdžiui, antrinėse GBM – p53 funkcija inaktyvuojama įvykus TP53 geno mutacijoms, pirminėse (de novo) GBM – INK4aARF geno mutacijoms arba MDM2 geno amplifikacijai ir kt. PI3K patogenezinis kelias aktyvuojamas per kelis kooperuojančius mechanizmus, pvz., per EGFR amplifikaciją ir PTEN geno mutacijas (dažnai nustatoma padidėjusi PTEN geno raiška netgi nesant specifinės mutacijos) (adaptuota pagal Furnari ir kt., 2007).
18
4.4. Glioblastomos patogenezės mechanizmai 4.4.1. Trumpi vėžio genetikos istorijos faktai
Vėžys ir genetinė, ir epigenetinė liga. Vėžys tikriausiai yra daugiausia tyrinėjama liga su stipriu epigenetiniu komponentu (Jones ir kt., 2002). Naviko formavimasis yra daugiaetapis procesas, kurio vien iniciacijai reikalingi keli veiksniai, „sustiprinantys“ priešvėžinę būklę (Lewin, 2004). Tolesnis naviko formavimasis vyksta atrankos principu, atrenkant pačias piktybiškiausias, agresyviausias ląsteles, dėl to sergančiųjų išgyvenamumo trukmė žymiai sutrumpėja. Prie šio mechanizmo prisideda daugybė pokyčių molekuliniame lygmenyje (Lewin, 2004). Deja, iki šiol vėžio patogenezė nėra aiški. Istoriškai nuo 1970 m. nagrinėjamos trys pagrindinės vėžio kilmės teorijos. Viena teorija aiškina vėžio kilmę tik dėl sutrikusios ląstelių diferencijacijos. Ši teorija teigia, kad navikinių ląstelių formavimasis sutrikdomas dėl įvykusių epigenetinių pokyčių, bet ne genų DNR sekos mutacijų. Kita virusologų pateikta vėžio kilmės teorija teigia, kad vėžys vystosi ląstelę “veikiant” virusams panašiems į SV40 arba Rous sarkomos virusą. Šie atradimai lėmė protoonkogenų nustatymą. Trečioji teorija teigia, kad navikas formuojasi dėl koreliacijos tarp cheminių ir fizinių veiksnių stiprių mutageninių ir kancerogeninių savybių (Weinberg ir kt., 2008). Iki 1982 m. paskelbta mutageninė vėžio vystymosi teorija teigia, kad ir taškinės mutacijos gali turėti lemiamą vaidmenį vėžio genezėje, pvz., taškinė H-Ras onkogeno mutacija, kai proto-onkogenas virsta onkogenu (Reddy ir kt., 1982). Vėliau Knudsonas ir bendraautoriai pateikė „dviejų smūgių“ modelį, pagal kurį, inaktyvuojant naviko supresorius, vyksta tolesnė vėžio genezė (Cavenee ir kt., 1983). Po šio atradimo buvo nustatyta daugybė onkogenų ir naviko supresorių (Weinberg ir kt., 1988). Kaip paaiškėjo vėliau, onkogenų aktyvacija ir naviko supresorių deaktyvacija neapima visų pokyčių navikiniame audinyje. Tolesni tyrinėjimai parodė, kad galimai įgimti poky-čiai vėžinėse ląstelėse priklauso epigenetiniams pažeidimams, t.y. mecha-nizmams, kurie apima ne mutacinį onkogenų aktyvavimą ir supresorių de-aktyvavimą (Kim ir kt., 2003, Zhang ir kt., 2007). Pastaruoju metu jau nekelia abejonių teiginys, kad epigenetiniai pažeidimai tikrai yra atsakingi už daugelį pokyčių navikiname audinyje, atgaivindama vieną iš pirmųjų vėžio patogenezės teorijų (Bradley-Smith ir kt., 2010).
4.4.2. Molekulinių pažaidų glioblastomose apžvalga
Genominis nestabilumas (chromosominis ir mikrosatelitinis) yra svar-bus požymis visų lokalizacijų ir histologijos navikams. GBM nustatomas beveik diploidinis chromosomų rinkinys (Hanahan ir kt., 2011).
Citogene-19
tiniai GBM tyrimai parodė, jog skaitinių ir struktūrinių chromosomų pokyčių randama visose chromosomose tik skirtingu dažniu – nuo 2 iki 80 proc. (Fonnet ir kt., 2011; Okezie ir kt., 2009). Heterozigotiškumo praradimas (angl. LOH) GBM-ose dažniausiai nustatomas 1p, 6q, 9p, 13q, 14q, 15q, 17p, 18q, 19q, 22q, Y chromosomose (Vranova ir kt., 2007; Mizoguchi ir kt., 2012), tuo tarpu 10p ir (ar) 10q heterozigotiškumo praradimo, iškritų (delecijų) skirtinguose regionuose, kuriuose išsidėstę EGFR inhibitoriaus, PTEN, MGMT, ANXA (aneksino A) genai, nustatoma ypatingai daug – nuo 60 iki 80 proc. atvejų (Rasheed ir kt., 1995; Ohgaki ir kt., 2007). EGFR geno amplifikacija būdinga pirminėms (de novo) GBM-oms (Yin ir kt., 2009). 12q13-15 srities amplifikacija, kurioje lokalizuojasi CDK4 (angl. Cyclin-dependent kinase 4) ir MDM2 onkogenai, lemia RB (retinoblastomos) ir TP53 patogenezinių kelių užblokavimą (Yin ir kt., 2009). Be amplifikacijos ir iškritų (delecijų) galimos somatinės genų, įtrauktų į GBM genezę, onkogenų, naviko supresorių, mutacijos (Parsons ir kt., 2008). TP53 ir PTEN genų mutacijos dažnai randamos GBM, bet jos neturi prognozinės reikšmės (Krex ir kt., 2007). Randamos ir glioblasto-moms specifinės somatinės mutacijos, pvz., pakitusiam EGFRvIII recepto-riui signalo perdavimui nebereikalingas jį aktyvuojamasis specifinis ligan-das, receptorius aktyvuojasi savaime (Babu ir Adamson, 2011). Taškinės mutacijos nustatomos NF1 (angl. neurofibromin 1) (iki 17 proc.), EGFR (~15 proc.), PIK3CA (angl. Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform) (~10 proc.) genuose, kurie svarbūs sergan-čiųjų išgyvenamumui (Parsons ir kt., 2009). Somatinių mutacijų dažnumas GBM yra mažesnis nei solidiniuose navikuose (Greenman ir kt., 2007), išskyrus hipermutantinį GBM fenotipą, kuris randamas po gydymo alkilina-maisiais preparatais. Manoma, kad tam įtakos turi MGMT geno metilinimas arba mutacinis DNR reparacinių fermentų inaktyvavimas, pvz., MSH6 (angl. mutS homolog 6, E. coli) (Hunter ir kt., 2006). IDH1 geno mutacija, koduojanti izocitrato dehidrogenazę-1, dalyvaujančią ląstelės energijos metabolizme, yra specifinė antrinėms GBM (Ichimura ir kt., 2009). Vieno nukleotido polimorfizmas (SNP, angl. Single Nucleotide Polymorphism), t.y. vienos bazių poros pažaida specifinėje DNR sekos vietoje, gan dažnas genetinis pokytis GBM. Pavyzdžiui, MDM2 geno SNP309 polimorfizmas susijęs su padidėjusia rizika susirgti skirtingų tipų vėžiu, tuo tarpu Hallani ir bendraautorių atlikto tyrimo duomenimis, sergantiems glioblastoma sąsajų nei rizikos, nei prognozės atžvilgiu nenustatyta (Ma ir kt., 2013; Hallani ir kt., 2007). Liu ir bendraautoriai tyrinėjo 100 genų polimorfizmo įtaką sergančiųjų GBM (n=590) prognozei ir nustatė, jog LIG4 (angl. ligase IV, DNA, ATP-dependent), BTBD2 (angl. BTB (POZ) domain containing 2), HMGA2 (angl. high mobility group AT-hook 2) ir RTEL1 (angl. regulator
20
of telomere elongation helicase 1) genų polimorfizmas buvo susijęs su pa-cientų išgyvenimo trukme (Lui ir kt., 2010). Genų raiškos tyrimai parodė, kad padidėjusi IGFBP-2 (angl. insulin-like growth factor binding protein 2), VEGFA (angl. vascular endothelial growth factor A) ir CHI3L1 (angl. chitinase 3-like 1 (cartilage glycoprotein-39)) bei kt. genų raiška buvo susi-jusi su trumpesne sergančiųjų išgyvenimo trukme nuo diagnozės nustatymo datos (Santosh ir kt., 2010; Hormigo ir kt., 2006). Tuo tarpu NOTCH šeimos genų padidėjusi raiška susijusi su sąlyginai geresne sergančiųjų prognoze (Lee, ir kt., 2008). Epigenetinis naviko supresorių „nutildymas“ yra paplitęs genominio nestabilumo fenomenas navikuose (Hanahan ir kt., 2010). Paprastai navikuose, taip pat ir GBM-ose, nustatomas globalinis genų hipometilinimas, tačiau navikų supresoriai, pavyzdžiui, CDKN2A, CDKN2B, RB1, PTEN ir TP53 yra hipermetilinami, t. y. šie genai „nutildo-mi“ (Esteller, 2008; Nagarajan ir kt., 2009; Martinez ir kt., 2010). Skirtingų genų promotorių metilinimas nustatomas pirminėse ir antrinėse GBM, trumpai ir sąlyginai ilgiau išgyvenusių pacientų grupėse, pirminių ir recidy-vinių glioblastomų pacientų grupėse (Martinez ir kt., 2010; Etcheverry ir kt., 2010; Martinez ir kt., 2007).
4.4.3. Pagrindinių glioblastomos patogenezės grandžių ypatybės Įvairios genetinės pažaidos gali būti nustatomos keliose GBM patoge-nezės grandyse, atsakingose už ląstelės proliferaciją, ląstelės gyvybingumą (apoptozę ir nekrozę), invaziškumą arba angiogenezę (Furnari ir kt., 2008). Dažnai nustatomos ląstelės ciklo reguliacijoje dalyvaujančių genų pažaidos rodo šių genų svarbą GBM patogenezėje. Retinoblastomos (RB) ir TP53-MDM2-CDKN2A signalo perdavimo kelių genai, reguliuojantys ląstelės ciklo G1 – S fazes, yra pagrindiniai inaktyvuojamųjų mutacijų taikiniai GBM (4.4.3.1 pav.). Dėl šių pažeidimų sutrinka ląstelės dalijimasis, valdo-mas aktyvių mitogeninių efektorių, tokių kaip fosfatidilinozitolio 3-kinazės (PI3K) ir mitogenų aktyvuojamos proteinų kinazės (MAPK, angl. Mitogen-activated protein kinase) (Furnari ir kt., 2008; Wen ir kt., 2012). GBM ląstelėms būdingas atsparumas mirtį sukeliantiems veiksniams (spindulinei terapijai arba chemoterapiniams preparatams), kurį lemia už lastelės apoptozę atsakingų genų pažaidos, koduojančios TNFR (angl. Tumour necrosis factor receptor) superšeimos receptorių grupes (Furnari ir kt., 2008). Kas lemia GBM ląstelių invaziškumą, kol kas neištirta, manoma, kad tam įtakos turi MMP (matrikso metaloproteinazių) genų pažaidos, integri-nai, naviko supresoriaus MIIP (angl. migration and invasion inhibitory protein gene, sin. IIp45) geno pažaidos bei kt. (Wang ir kt., 2003; Kanamori ir kt, 2004). Manoma, kad pirminių ir antrinių GBM genominiai skirtumai
21
ilgainiui susilieja į vieną bendrą angiogenezės patogenezinį mechanizmą, apimantį taip vadinamuosius teigiamus (interleukinas-8, VEGF, PDGF (angl. Platelet-derived growth factor), SDF-1/CXCL12 (angl. Stromal cell-derived factor-1/CXC chemokine ligand 12) ir neigiamus (trombospondinas-1, trombospondinas-2, endostatinas, tumstatinas, interferonai) šio proceso reguliatorius (Nyberg ir kt., 2005) (4.4.3.1 pav.).
4.4.3.1 pav. Trys pagrindinės glioblastomos patogenezės grandys:
viršuje – augimo faktorių receptorių/PI3K/AKT grandis; apačioje dešinėje – RB grandis; apačioje, kairėje – TP53 grandis. Potencialūs naviko
supresoriai – žaliame fone, onkobaltymai – raudoname (adaptuota pagal Bleeker ir kt., 2012)
4.4.4. Epigenetinių mechanizmų apžvalga
Taigi, epigenetika apima daugybę pokyčių, kurie reguliuoja genų raišką, bet kurie nėra paremti pirminės DNR grandinės pokyčiais. Kol kas žinomiems epigenetiniams mechanizmams priklauso nekoduojančios RNR, histoninių baltymų modifikacijos, genominis imprintingas ir DNR metili-nimas (Kreth ir kt., 2012; Dubuc ir kt., 2012).
22
Klasikinė RNR funkcija yra DNR transliacija į tam tikrą baltymą. Vis dėlto nekoduojančios RNR sekos taip pat atlieka tam tikras funkcijas: dalyvauja ląstelės augime, DNR metilinimo reguliacijoje, chromatino remo-deliavime, transkripcijos reguliacijoje, per mikro-RNR dalyvauja translia-cijos reguliavime (Pezer, 2008). Manoma, kad būtent mikro-RNR, kurias sudaro maždaug 22 nukleotidų sekos, vaidina labai svarbų vaidmenį ląstelių augime ir diferencijacijoje, o nustatyti skirtumai tarp sveikų ir vėžinių ląstelių rodo, kad mikro-RNR turi labai didelę įtaką ir kancerogenezei (Nikaki ir kt., 2012). Kol kas mikro-RNR veikimo mechanizmas nėra aiškus, nors jau įrodytas mikro-RNR ryšys ir įtaka reguliuojant onkogenų ir naviko supresorinių genų aktyvumą (Finoux, 2008).
Genominis imprintingas yra fenomenas, kontroliuojamas DNR metili-nimo lygio, kai vykdoma tik vieno iš tėvo ar motinos paveldėto unikalaus genetinio lokuso raiška, t.y. vieno alelio (Morison, 2005). Mažiau nei 1 proc. genų yra imprintinti. Įdomu tai, kad reiškinys kuomet ekspresuojami abu aleliai (loss of imprinting, LOI), t.y. „nutildomas“ imprintinguojamas genas, yra ypač dažnas visų histologijų navikuose (Feinberg, 2006).
Dar vienas epigenetinis mechanizmas apima histoninių baltymų modifikacijas. Chromatino erdvinis išsidėstymas, kuriam įtakos turėjo įvairiausių histoninių baltymų modifikacijos, taip pat vaidina labai svarbų vaidmenį genų raiškoje ir kancerogenezėje (Santos, 2005). Histoniniai baltymai koordinuoja DNR prieinamumo transkripcijos faktoriams poky-čius – stipriai „supakuota“ DNR (heterochromatinas), kuri nepasiekiama transkripcijos faktoriams ir „atidengta“ DNR (euchromatinas), kuri prieina-ma transkripcijos faktoriams. Histoninių baltymų funkcija yra reguliuojaprieina-ma keleto mechanizmų: metilinimo, acetilinimo, biotinilinimo, ubikvitinilinimo bei kitų, kuriais remiantis buvo sukurta “histoninio kodo” teoriją (Couture, 2004). Erdviniai histoninių baltymų išsidėstymo ir strukūros pokyčiai daro prieinamus transkripcijai geną arba genų grupes, tokiu būdu reguliuodami daugelį onkogenezei svarbių patogenezinių grandžių veiklą (Tollefsbol ir kt., 2011).
DNR metilinimas yra vienas svarbiausių epigenetinių mechanizmų, kuris turi įtakos vieno geno raiškai, o sąveikaudamas su nukleosomomis, gali veikti ir visą DNR domeną. Dažniausiai hipermetilinimu genas nutildo-mas. DNR metilinama, kai, veikiant DNR metiltransferazei (DNMT) prie 5`-CpG-3` salose esančio citozino (penktoje pirimidino žiedo pozicijoje) prijungiama metilo grupė –CH3, nuo metilo grupės donoro S-adenozil-metionino (SAM) (4.4.4.1 pav.). Sveikose ląstelėse, visoje DNR sekoje apie 4 proc. citozinų yra metilinti (Ehrlich, 1982). Metilinimo procesas vyksta veikiant trims pagrindiniams fermentams metiltransferazėms: DNMT1, DNMT3A ir DNMT3B. DNR metilinimas yra grįžtamasis procesas,
23
manoma, kad, esant tam tikroms sąlygoms, vyksta aktyvūs subalansuoti metilinimo ir demetilinimo procesai (Molloy, 2009). Deja, demetilinimo procesas molekuliniame lygmenyje nepakankamai ištirtas, manoma, kad jame gali dalyvauti DNMT3A ir DNMT3B (Kangaspeska, 2008). Vėžio atveju nustatomas globalinis genomo demetilinimas ir manoma, kad tai skatina ir palaiko onkogenezę, per chromosominį nestabilumą bei padidėjusį onkogenų transkripcijos aktyvumą (Hanahan ir kt., 2011). Globalinį genomo demetilinimą paprastai lydi dauginis specifinio regiono arba kelių genų hipermetilinimas (Esteller, 2008). Jau yra žinomas didelis skaičius genų, dalyvaujančių kancerogenezėje, kurie „valdomi“ hipermetilinant jų pro-motorių sritis. Metilinant DNR, deaktyvuojami tam tikri genai dalyvau-jantys signalų perdavime, DNR reparacijoje, ląstelės ciklo reguliacijoje, ląstelės diferencijacijoje, angiogenezėje, apoptozės mechanizmuose.
4.4.4.1 pav. DNR metilinimo procesas: prie citozino,
esančio 5`-CpG-3` salose, veikiant DNMT, prijungiama metilo grupė –CH3;
24 4.4.5. MGMT genas
Glioblastomose MGMT (O6-metilguanino-metiltransferazės) geno promotoriaus metilinimas yra susijęs su geresniu atsaku į gydymą temozolamidu (alkilinamasis preparatas) ir spinduline terapija [II,B], ir, kartu su sąlyginai geresne sergančiųjų prognoze (Hegi ir kt., 2005; Weller ir kt., 2009; Stupp ir kt., 2009). MGMT geno metilinimas, skirtingų autorių duomenimis, nustatomas 20-57 proc. GBM atvejų (Bleeker ir kt., 2011; Zawlik ir kt., 2009; Eoli ir kt., 2007). MGMT geno metilinimas dažnesnis antrinėse GBM, moterims ir ilgiau, nuo diagnozės nustatymo datos, išgyvenusiems pacientams, tuo tarpu retai (apie 5 proc.) nustatomas recidyvinėse GBM (Zawlik ir kt., 2009; Christmann ir kt., 2010). MGMT genas lokalizuotas 10q26.3, sudarytas iš 300 824 bazių porų (4.4.5.1 pav.). Geną sudaro penki egzonai, iš kurių tik pirmasis (MGMT-001) koduoja baltymą O(6)-metilguanino-DNR metiltransferazę, 1759 aminorūgščių ilgio, kuris dalyvauja DNR reparacijos procesuose (Sharma ir kt., 2009; Pegg ir kt., 2007). Šis fermentas pašalina alkilinimo pažaidas, perkeldamas alkilo grupę iš O6 pozicijos guanino liekanoje (O6-alkilguanino) į cisteino liekaną fermente. Tai suicidinė reakcija, nes tokiu būdu pats fermentas tampa negrįžtamai inaktyvinamas (Martinez, 2012) (4.4.5.2 pav.). Ši fermento funkcija gali komplikuoti vėžio gydymą, kai skiriami alkilinamieji preparatai, todėl tikslinga kartu skirti MGMT inhibitorius (pvz.: tiriamas antiepileptinio preparato levetiracetamo, kaip MGMT inhibitoriaus, veiksmingumas) (Martinez, 2012; Bobustuc ir kt., 2010).
4.4.5.1 pav. MGMT geno lokalizacija 10 chromosomoje (10q26.3)
(GeneCard. Prieiga intenete: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MGMT&search=MGMT)
25
4.4.5.2 pav. Alkilinamieji preparatai temozolamidas (TMZ), nimustinas
(ACNU) ir karmustinas (BCNU) veikia pažeistoje DNR sekoje, atpažindami alkilo grupes guanino O6 pozicijoje bei toje vietoje atskirdami DNR grandis. MGMT prisijungia alkilo grupes prie savo aktyvaus MGMT-cisteino, tokiu būdu inaktyvuodamas vieną MGMT molekulę kiekvienai atitaisytai pažaidai. Alkilintas MGMT degraduojamas ubikvitinilinimo būdu
(adaptuota pagal Martinez, 2012)
Temozolamidas ir kiti alkilinamieji preparatai modifikuoja O6 pozici-joje guaniną, taip formuodami kritinį DNR pažeidimą, dėl ko nevyksta ląstelių replikacija. Esant nemetilintam MGMT genui, aktyvus MGMT fermentas pašalina alkilo grupes, o tai sąlygoja atsparumą gydymui temo-zolamidu; kai MGMT geno promotorius metilintas, t. y. neaktyvus, netrans-kribuojamas, gydymas temozolamidu tampa veiksmingu (Martinez, 2012).
Pastaruoju metu paaiškėjo, kad galimi metilintų genų deriniai, kurie, esant metilintam MGMT geno promotoriui ir neefektyviam gydymui temo-zolamidu ir spinduline terapija, turi įtakos sergančiųjų glioblastoma išgyve-namumui, tai yra FNDC3B (angl. Fibronectin type III domain containing 3B), TBX3 (angl. T-box 3), DGKI (angl. Diacylglycerol kinase, iota) ir FSD1(angl. Fibronectin type III and SPRY domain containing 1) genų
promotorių metilinimas (Etcheverry ir kt., 2010). Skirtingų autorių
26
vaidmenį yra kontraversiški (Martinez ir kt., 2010; Nagarajan ir kt., 2009;
Zawlik ir kt., 2009). Brandes ir bendraautoriai pastebėjo, kad MGMT geno
metilinimas taip pat susijęs su GBM pseudoprogresavimu po taikyto kompleksinio gydymo chemoterapija ir spinduline terapija (Brandes ir kt., 2009). GBM recidyvavimo būdas, apimantis recidyvavimo laiką ir lokalizaciją, manoma, taip pat susijęs su MGMT geno metilinimo būkle pirminiame navike (Brandes ir kt., 2008). MGMT geno „išjungimas“ turi lemiamą įtaką vėžio vystymuisi, būdamas blogos prognozės veiksniu, bet geru predikciniu žymeniu taikant gydymą alkilinamaisiais preparatais GBM sergantiems pacientams (Soejima ir kt., 2005). Pagal MGMT geno promotoriaus metilinim būklę, siūloma GBM skirstyti į MGMT teigiamas, kai MGMT genas yra metilintas, ir MGMT neigiamas, genas nemetilintas, pagal tai koreguojant gydymą bei vertinant pacientų prognozę. MGMT geno metilinimo būsenos nustatymas laikomas svarbiu veksniu, atliekant naujų ir potencialių GBM prognozinių veiksnių tyrimus.
4.4.6. HOXA9 ir HOXA11 genai
HOXA9 (angl. Homeobox 9) ir HOXA11 (angl. Homeobox 11) genų promotoriaus metilinimas yra vienas iš potencialių naujų epigenetinių sergančiųjų GBM žymenų, susijusių su išgyvenamumu. 2011 m. Di Vinci ir bendraautoriai, atlikę mokslinį tyrimą, pastebėjo, kad HOXA9 geno metilinimas susijęs su trumpesnę sergančiųjų GBM išgyvenimo trukmę (Di Vinci ir kt., 2012). Remiantis literatūros duomenimis, HOXA11 geno įtaka pacientų išgyvenamumui nenagrinėta, žinomas tik geno promotoriaus metilinimo dažnumas navikiniame glioblastomos audinyje (Martinez ir kt., 2009). HOXA9 ir HOXA11 genai priklauso HOXA genų šeimai (kurią sudaro 39 genai, suskirstyti į keturias grupes pagal lokalizaciją keturiose chromosomose: HOXA, HOXB, HOXC ir HOXD, pastarieji koduoja transkripcijos faktorius, turinčius įtakos labai svarbių embriono vystymuisi ląstelių augimui, diferencijacijai, ląstelių tarpusavio ir ląstelės-užląstelinio matrikso sąveikai (Cillo ir kt., 2001). Embriogenezės metu HOXA šeimos genai „įjungiami“ pagal tam tikrą seką, pirmiausia HOXA1-4 genai, dar vadinami ankstyvosios fazės genais, vėliau įsijungia centrinės grupės genai HOXA5-8 ir galiausiai vėlyvosios stadijos genai – HOXA9-13 (Cillo ir kt., 2001). Kadangi šie genai dalyvauja sveikų smegenų vystymęsi, manoma, kad jų epigenetinės pažaidos gali sąlygoti ir GBM raidą bei turėti įtakos sergančiųjų išgyvenamumui (Laffaire ir kt., 2011; Murat ir kt., 2008).
Tyrinėjant kiaušidžių navikus, nustatyta, jog pakitęs HOXA genų meti-linimas yra susijęs su onkogenezės procesu (Widschwendter ir kt., 2009). 2008 m. Murat A. ir bendraautorių bei 2010 m. Costa B.M. ir bendraautorių
27
tyrimų duomenimis, dėl didesnės HOXA9 ir HOXA10 genų raiškos gliomos ląstelėse, lyginant su sveikais astrocitais, bei jų įtakos trumpesniam sergančiųjų išgyvenamumui, įtartas HOXA genų vaidmuo ir smegenų ląstelių onkogenezėje (Murat ir kt., 2008; Costa ir kt., 2010). Nepaisant to, informacijos apie galimus HOXA genų metilinimo pokyčius gliomose bei jų ryšį su pacientų išgyvenamumu iki šiol yra mažai, paskelbti vos keli klinikiniai tyrimai (Di Vinci ir kt., 2012; Martinez ir kt., 2009; Noushmehr ir kt., 2010). 2011m. Di Vinci A. ir bendraautoriai nagrinėjo HOXA3,7,9 ir 10 sąsajas su gliomų laipsniu ir ligos baigtimis (n=63). Jie nustatė, kad tik HOXA9 ir 10 yra svarbūs sergančiųjų GBM išgyvenamumui (Di Vinci ir kt., 2012). HOXA11 geno metilinimo dažnumą GBM navikiniame audinyje nustatė Martinez R. ir bendraautoriai. Autorių duomenimis, HOXA11 geno promotorius buvo metilintas daugiau kaip 50 proc. atvejų (Martinez ir kt., 2009).
HOXA9 genas lokalizuotas 7 chromosomoje (7p15.2), jį sudaro 7213 bazių poros (4.4.6.1 pav.). HOXA9 koduojamą baltymą sudaro 272 amino-rūgštys (30172 Da), tai sekai specifinis transkripcijos faktorius, kuris yra vienas iš embriogenezės reguliacinės sistemos dalių (GeneCards/HOXA9).
4.4.6.1 pav. HOXA9 ir HOXA11 genai lokalizuoti 7 chromosomos
trumpajame petyje (7p15.2)
(GeneCards. Prieiga internete: bin/carddisp.pl?gene=HOXA9 ir
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=HOXA11)
HOXA11 genas lokalizuotas 7 chromosomoje (7p15.2), jį sudaro 4067 bazių poros (4.4.6.1 pav.). HOXA11 geno koduojamą baltymą sudaro 313 aminorūgštys (34486 Da), tai sekai specifinis transkripcijos faktorius, kuris taip pat yra vienas iš embriogenezės reguliacinės sistemos dalių (GeneCards/HOXA11).
4.4.7. NDRG2 genas
NDRG2 (ang. N-myc downstream-regulated gene 2) genas – vienas iš keturių NDRG šeimos genų, lokalizuotas 14 chromosomos ilgajame petyje (14q11.2), jį sudaro 54110 bazių poros (Deng ir kt., 2003) (4.4.7.1 pav.). Geno koduojamą baltymą – NDRG2, sudaro 371 aminorūgštis (40798 Da). Jis priklauso citoplazminių baltymų grupei, dalyvauja Wnt patogenezinėje
28
grandyje, jo raiška didėja postnataliniu smegenų vystymosi laikotarpiu. Gali būti įtrauktas į dendritinių ląstelių (padidėjusi raiška) ir neuronų diferenci-jaciją, galimai atlieka naviko supresoriaus funkciją. NDRG2 reguliuoja histonų acetilinimo lygį, taip reguliuodamas gliominių ląstelių augimą (Li ir kt., 2012). NDRG2 geno dalyvavimas GBM kancerogenezėje pirmą kartą pastebėtas 2003 m. Deng ir bendraautorių (Deng ir kt., 2003). Tyrinėdami jie nustatė NDRG2 geno raišką sveikame smegenų audinyje ir žemesnio laipsnio astrocitomose, bet GBM-ose ir šešiose GBM ląstelių kultūrų linijose NDRG2 geno raiška buvo reikšmingai sumažėjusi. Autoriai taip pat pastebėjo, kad padidėjusi NDRG2 geno raiška U373 ir U118 ląstelių kultūrose lemia ryškų naviko augimo sulėtėjimą, o tai rodo, kad NDRG2 gali stabdyti ląstelių proliferaciją (Deng ir kt., 2003). Nustatyta, kad NDRG2 genas atsakingas už naviko invaziškumą krūties vėžio atvejais, astroci-tomose, piktybiškumą meningiomose (Li ir kt., 2011; Lorentzen ir kt., 2011). Dažniausiai NDRG2 genas „išjungiamas“ epigenetiškai, pvz., kolo-rektalinio, hepatoceliuliarinio vėžio atvejais ir kt. (Feng ir kt., 2011; Lee ir kt., 2008). 2008 m. Tepel ir bendraautoriai, tyrinėdami GBM, nustatė, kad NDRG2 geno promotoriaus metilinimas yra dažnas reiškinys pirminėse GBM, bet ne antrinėse GBM (Tepel ir kt., 2008). Kadangi šio geno funkcija nėra iki galo aiški, tikslingi tolesni šio geno tyrinėjimai, ieškant sąsajų ir su GBM sergančiųjų išgyvenimo trukme, nes iki šiol atlikti tik pavieniai tyrimai. 2011 m. Li ir bendraautorių atliktas tyrimas parodė, kad padidėjusi NDRG2 geno raiška koreliuoja su ilgesniu išgyvenamumu sergantiems I-II laipsnio astrocitomomis (Li ir kt., 2011).
4.4.7.1 pav. NDRG2 genas lokalizuotas 14 chromosomos ilgajame petyje
(14q11.2) (GeneCards. Prieiga per internetą:
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=NDRG2) 4.5. Sergančiųjų glioblastoma klinikos savitumai
Specifinių nusiskundimų bei klinikinių požymių, sergant tiek pirmi-nėmis, tiek antrinėmis GBM, nėra (Stark ir kt., 2012). Visi simptomai skirs-tomi į tris dideles grupes: bendriniai (galvos skausmas, pykinimas, vėmi-mas, asmenybės pokyčiai, kognityvinių funkcijų pokyčiai ir kt.); židininiai (hemiparezė, regos, jautrumo pokyčiai, afazija ir kt.) ir traukulių priepuoliai (atsiradę pirmą kartą gyvenime arba pakitęs jų pobūdis). Remiantis Stark ir
29
bendraautorių tyrimo duomenimis (n=492), sergantieji GBM dažniausiai skundėsi galūnių nusilpimu (apie 40 proc.), neuropsichiniais sutrikimais (apie 37 proc.), afazija (apie 34 proc.), šie sutrikimai buvo reikšmingai susiję su trumpesniu sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumu. Tuo tarpu galvos skausmas kartu su pykinimu ir vėmimu (apie 32 proc.), pirmą kartą gyvenime atsiradę traukulių priepuoliai (apie 23 proc.) buvo susiję su ilgesniu sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumu (Stark ir kt., 2012). GBM lokalizacija nėra specifinė, dažniausiai šis navikas diagnozuojamas jau gana išplitęs, apėmęs kelias smegenų skiltis (apie 42 proc.) (Stark ir kt., 2012). GBM lokalizavusi pavienėse smegenų skiltyse dažniausiai apima smilkininę skiltį (apie 27 proc.), kaktinę skiltį (apie 19 proc.) ir kt. Autorių duomeni-mis, daugiažidininis GBM augimo pobūdis, nustatytas 22 proc. atvejų, buvo susijęs su trumpesne pacientų išgyvenimo trukme po operacijos (Stark ir kt., 2012). Sergant pirmine GBM, būdinga trumpa nusiskundimų, klinikinių simptomų pasireiškimo trukmė, iš kurių apie 50 proc. atvejų trumpesnė nei 3 mėn., be ankstesnių astrocitinės kilmės navikinių pokyčių CNS (Kleihues ir kt., 1999). Priešingai, antrinės GBM vystosi lėtai, keletą metų, iš žemesnio laipsnio astrocitinių navikų (Kleihues ir kt., 1999). GBM gali susirgti bet kurio amžiaus suaugusieji, tačiau pirminės GBM dažniau pasi-reiškia jaunesnio amžiaus žmonėms, apie 45–50 gyvenimo metus, antrinės – apie 60–70 gyvenimo metus (Furnari ir kt., 2007) (žr. aukščiau). Remiantis literatūros duomenimis, sergančiųjų GBM bendroji būklė vertinama taikant Karnovskio indeksą prieš ir po operacijos (4.5.1 lentelė) (Lis ir kt., 2009; Fillipini ir kt., 2008; Stark ir kt., 2005). Tačiau pooperacinio Karnovskio indekso verte abejojama, nes Karnovskio indekso įverčiai prieš ir po operacijos yra glaudžiai susiję parametrai ir kartu jų vertinti daugiaveiks-niais Kokso regresijos modeliais negalima, naudojant vienaveiksnę analizę pooperacinis Karnovskio indeksas taip pat reikšmingai koreliuoja su sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumu (Stark ir kt., 2012). Iki šiol vieningos nuomonės nėra, koks priešoperacinio Karnovskio indekso ribinis balas turėtų būti vertinant sergančiųjų GBM išgyvenamumą: vienų autorių nuomone, Karnovskio indeksas turėtų būti ≥ 70 balų, kitų – ≥ 60 balų ir pan. (Lutterbach ir kt., 2003; Chaichana ir kt., 2013).
30
4.5.1 lentelė. Karnovskio indekso apskaičiavimo lentelė (Kriščiūnas,2008).
Taikant Karnovskio indeksą įvertinama paciento būklė pagal paciento akty-vumą bei specialios pagalbos poreikį. Skiriami balai nuo 0 (miręs) iki 100 (nėra skundų ar ryškių ligos požymių) (Karnofsky ir kt., 1949; Kriščiūnas, 2008). Minimalus 70 balų Karnovskio indeksas reikalingas norint skirti pacientui agresyvią terapiją (Olson ir kt., 2009; Stark ir kt., 2012)
Bendrieji požymiai Indeksas Specifiniai kriterijai
Normalus aktyvumas, nereikia specialios pagalbos
100 Nėra skundų ar ryškių ligos požymių
90 Normalus aktyvumas, nežymūs simptomai ar ligos požymiai
80 Normalus aktyvumas su pastangomis, simptomai ir ligos požymiai
Negali dirbti, gali gyventi namuose, reikia tam tikros pagalbos
70 Apsitarnauja, normalus dienos aktyvumas sutrikdytas, negali dirbti
60 Būtina protarpinė pagalba, tačiau daugumą funkcijų atlieka pats
50 Reikalinga kitų pagalba ar medicininės priežiūra Negali apsitarnauti,
reikalinga priežiūra institucijoje ar ligoninėje
40 Neįgalus, reikalingos specialios priežiūros ir pagalbos
30 Sunki negalia, gresia mirtis
Liga sparčiai progresuoja 20 Labai silpnas, būtina hospitalizacija, būtinas palaikomasis gydymas
10 Mirštantis 0 Miręs
Manoma, kad sergančiųjų glioblastoma grupavimas pagal klinikinius požymius padėtų vertinant paciento būklę, leistų parinkti individualią gy-dymo taktiką bei nusakyti prognozę. Todėl tolesni klinikinių veiksnių, kaip ir naviko molekulinių žymenų, tyrimai būtini siekiant visaverčio pacientų būklės įvertinimo (Stark ir kt., 2012).
31
4.6. Glioblastomos diagnostika
Iki šiol GBM-os diagnostika yra paremta radiologiniais (KT, MRT) ir imunohistocheminiais biopsinės (stereobiopsija) ir (ar) pooperacinės navi-kinės medžiagos tyrimais (Stupp ir kt., 2010). Kompiuterinės tomografijos ir magnetinio rezonanso tyrimų vaizduose matomas tūrinis procesas smege-nyse, paprastai be aiškių naviko ribų, kaupiantis kontrastą, heterogeniškas, dažnai su nekrozės plotais bei apgaubtas plačia vazogenine smegenų edema (Cha ir kt., 2007) (4.6.1 pav.). Pirmą kartą diagnozavus didelį GBM naviką, apimantį kelias smegenų skiltis arba daugiažidininę GBM, su dideliais nekrozės plotais, jau leidžia galvoti apie trumpesnį sergančiųjų išgyvena-mumą (Li ir kt., 2009). Tobulėjant radiologiniai technikai, įtarti GBM galima atlikus MRT-spektroskopiją. Dėl smegenų audinio destrukcijos nustatomas reikšmingai sumažėjęs N-acetil-aspartato (NAA) kiekis bei žymiai padidėjęs cholino (Cho) kiekis, susijęs su navikinių ląstelių proli-feracija (Grunwald ir kt., 2007). Vis dėlto tiksli glioblastominių navikų identifikacija, remiantis MRI-spektroskopija, yra ribota. GBM diagnozė patvirtinama tik atlikus navikinio audinio imunohistocheminį tyrimą. Diag-nozuojant GBM, vertinami šie patologiniai histologiniai navikinio audinio kriterijai: branduolių atipija, mitotinis aktyvumas, kraujagyslių endotelio proliferacija, įvairaus dydžio ir formos nekrozės plotai (Louis ir kt., 2007) (4.6.2 pav.). Nekrozė yra vienas svarbiausių blogos prognozės veiksnių (Louis ir kt., 2007). Stebint neaiškų histologinį navikinio audinio vaizdą, lyg yra (nėra) nekrozė, kartu esanti išreikšta kraujagyslių proliferacija taip pat lemia panašią blogą sergančiųjų glioblastoma prognozę (Barkel ir kt., 1996).
32
4.6.1 pav. Smegenų magnetinio rezonanso vaizdai prieš operaciją (su
kontrastu), kuriuose matoma dešinėje pakaušinėje ir momeninėje skiltyse posteromedialiai – heterogeninė navikinės infiltracijos sritis su didele nekrozine ertme centre, apie kurią matomas netolygaus storio kontrastinės
medžiagos kaupimo ruožas. Apie naviką – vidutiniškai išreikšta edeminė reakcija. Dėl masės poveikio deformuota ir suspausta dešiniojo šoninio skilvelio užpakalinė dalis, (b) dešiniojoje smilkininėje skiltyje matomi du
netaisyklingo žiedo pavidalo navikiniai mazgai, gerai kaupiantys kontrastinę medžiagą, su nekrozinėmis ertmėmis centre. Vienas iš mazgų
matomas ties skilties anterolateraline dalimi, palei dešiniojo šoninio skilvelio smilkininio rago lateralinį kraštą. Kitas navikinis mazgas – ties smilkininio rago medialiniu kraštu, su lokalios subependiminės infiltracijos
požymiais sukelia temporalinio rago obstrukciją, dėl kurios matoma izoliuota smilkininio rago distalinės dalies hidrocefalija. Apie naviką –
33
4.6.2 pav. Paveiksle matomi tipiniai GBM požymiai: (a) nekrozės plotai
su pseudopalisadinėmis struktūromis; (b) kraujagyslių proliferacija, ryškus mitotinis aktyvumas, didelis ląstelingumas (H+E)
4.7. Glioblastomos gydymo taktika
Standartinis GBM gydymas apima kiek galima radikalesnį chirurginį naviko pašalinimą (visiškas naviko pašalinimas negalimas dėl infiltratyvaus GBM augimo pobūdžio), spindulinę terapiją ir chemoterapiją (neoadjuvan-tinę, adjuvantinę) (Sathornsumetee ir kt., 2007; Preusses ir kt., 2011; Moli-terno ir kt., 2012; Altaner ir kt., 2012). Galimi įvairūs šių gydymo metodų deriniai, atsižvelgiant į paciento klinikinę būklę bei pageidavimus. Pavyz-džiui, vyresniems nei 70 metų pacientams gali būti taikoma monoterapija spinduliais arba chemoterapija (Keime-Guibert ir kt., 2007; Scott ir kt., 2012). GBM recidyvo gydymo taktika panaši: atliekama pakartotinė naviko šalinimo operacija, taikomi įvairūs spindulinės terapijos, chemoterapijos, biologinės arba eksperimentinės terapijos deriniai (Weller ir kt., 2012). Standartinė spindulinei terapijai taikoma spindulių dozė yra 6000 cGy (1.8-2.0 Gy per dieną) (Stupp ir kt., 2007; Buatti ir kt., 2008). Recidyvinių GBM gydymui taikomos spindulinės terapijos nauda yra abejotina ir nuomonės dėl jos taikymo skiriasi, manoma, kad didesnė nauda galima taikant stereotaksinę radiochirurgiją arba frakcijinę stereotaksinę reiradiaciją (Butowski ir kt., 2006, Mavridis, 2012, Thumma ir kt., 2012). Spindulinės terapijos poveikį gali didinti naujai sukurti chemoterapiniai junginiai, tiksliniai molekuliniai junginiai arba antiangiogeniniai junginiai (Stupp ir kt., 2007; Chi ir kt., 2007; Duda ir kt., 2007). Kol kas veiksmingo chemote-rapijos algoritmo, gydant GBM sergančius pacientus nėra. Vienas patvir-tintų ir vartojamų preparatų yra temozolamidas (TMZ). Temozolamidas (kiti pavadinimai Temodal, Temodar) geriamasis (peroralinis) alkilinamasis
34
preparatas, patvirtintas Jungtinių Amerikos Valstijų maisto ir vaistų valdy-bos (FDA, angl. Food and Drug Administration,) 2005 m. GBM gydymui (Hegi ir kt., 2005). Keletas tyrimų įrodė, kad TMZ gerai toleruojamas ir prailgina sergančiųjų išgyvenamumą (Stupp ir kt., 2005; Mrugala ir kt., 2008; Trinh, 2009; Hegi ir kt., 2005, Ronning ir kt., 2012). Deja, gydymas TMZ neišsprendžia GBM gydymo problemų, išgyvenamumo trukmė ir toliau išlieka trumpa. Ohka ir bendraautoriai apibendrino GBM atsparumo gydymui priežastis: 1 – aktyvus MGMT genas; 2 – pažeistos iškart kelios patogenezinės grandys; 3 – kamieninių glijos ląstelių (GSCs angl. Glioma Stem Cells) egzistavimas; 4 – hematoencefalinis barjeras (Ohga ir kt., 2012). Atliekama keletas mokslinių tyrimų, ieškant naujų terapijos taikinių bei cheminių junginių, pvz., nitrosoureos preparatai, karmustino ir cis-platinos deriniai, bevacizumabo ir irinotekano deriniai, gefitinibas, erlotinibas bei MGMT geno inhibitoriai, integrino inhibitoriai, valproinė rūgštis, antiepilep-tiniai preparatai ir kt. (Westphal ir kt., 2006; Fadul ir kt., 2008, Hegi ir kt., 2008; Chamberlain ir kt., 2012; Berendsen ir kt., 2012). Kitų terapijų galimybės, tokių kaip, genų terapijos, dendritinių ląstelių skiepai, peptidų prieš EGFRvarIII antigenus skiepai (pvz., preparatas rindopepimutas), sinte-tinių chlorotoksinų, radioaktyvių vaistų ir antikūnų, polimerinių implantų, CED technikos, degraduojančių nanodalelių dar analizuojamos, kuriamos (Fulci ir kt., 2007; Ferguson ir kt., 2007; Polivka ir kt., 2012; Lima ir kt., 2012; del Vecchio ir kt., 2012; Zhou ir kt., 2012). Didelio laipsnio GBM naviko genominis nestabilumas, atsirandantis dėl daugelio patogenezinių grandžių išsireguliavimo, apimančio ląstelės proliferacijos, diferencijacijos, gyvybingumo (nekrozės, apoptozės) mechanizmus, sunkina naujų diagnos-tinių ir terapinių modelių kūrimą (Mao ir kt., 2012, Binda ir kt., 2012). Manome, kad vieni iš potencialių terapijos taikinių galėtų būti HOXA bei NDRG šeimų genai, reikšmingi sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumui (di Vinci ir kt., 2011; Li ir kt., 2011).
4.8. Sergančiųjų glioblastoma išgyvenamumas
Glioblastoma – tai vienas prasčiausios prognozės navikų. Lyginant ser-gančiųjų kitais astrocitiniais navikais išgyvenamumo trukmę, GBM pasižy-mi agresyviausia eiga ir trumpiausia išgyvenimo trukme nuo diagnozės nustatymo datos. Nepaisant chirurginio, spindulinio bei chemoterapinio gydymo progreso, GBM sergančiųjų prognozė iki šiol išlieka bloga, išgyvenamumo trukmės mediana vos 12-14 mėn.. Penkerių metų sergančiųjų išgyvenamumas yra mažesnis nei 5 proc. atvejų (CBTRUS, 2010; Anton ir kt., 2012). Ronning ir bendraautorių duomenimis, taikant
