LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Greta Pšemeneckienė
UŽDEGIMO MEDIATORIŲ GENŲ
POLIMORFIZMO, BIOŽYMENŲ IR
KITŲ RIZIKOS VEIKSNIŲ SĄSAJOS,
SERGANT ALZHEIMERIO LIGA
Daktaro disertacija Medicinos ir sveikatos mokslai,
medicina (M 001)
Disertacija rengta 2009–2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Neurologijos klinikoje.
Mokslinė vadovė
prof. habil. dr. Daiva Rastenytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkas
prof. habil. dr. Limas Kupčinskas (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, Medicinos akademija, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Nariai:
prof. dr. Jūratė Macijauskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, medicinos ir sveikatos mokslai, slauga – M 005); doc. dr. Vesta Steiblienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medi-cinos akademija, mediMedi-cinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001); prof. dr. Pille Taba (Tartu universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001);
prof. dr. Algirdas Utkus (Vilniaus universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).
Disertacija bus ginama viešame Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. gruodžio 20 d. 11 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų Neurologijos klinikos 4056 auditorijoje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Greta Pšemeneckienė
ASSOCIATIONS BETWEEN GENETIC
POLYMORPHISMS OF
PROINFLAMMATORY MEDIATORS,
BIOMARKERS AND OTHER RISK
FACTORS IN ALZHEIMER’S DISEASE
Doctoral Dissertation Medical and Health Sciences,
Medicine (M 001)
Dissertation has been prepared at the Department of Neurology of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2009–2019.
Scientific Supervisor:
Prof. Habil. Dr. Daiva Rastenytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).
Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson:
Prof. Habil. Dr. Limas Kupčinskas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).
Members:
Prof. Dr. Jūratė Macijauskienė (Lithuanian University of Health Scien-ces, Medical Academy, Medical and Health ScienScien-ces, Nursing – M 005); Assoc. Prof. Dr. Vesta Steiblienė (Lithuanian University of Health Scien-ces, Medical Academy, Medical and Health ScienScien-ces, Medicine – M 001);
Prof. Dr. Pille Taba (University of Tartu, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001);
Prof. Dr. Algirdas Utkus (Vilnius University, Medical and Health Scien-ces, Medicine – M 001).
Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council at 11 a. m. on the December 20th, 2019 in the auditorium 4056 of the Department of Neurology of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno klinikos.
5
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1. Alzheimerio ligos epidemiologija, rizikos veiksniai ... 13
1.1.1. Alzheimerio ligos paplitimas ... 13
1.1.2. Alzheimerio ligos rizikos veiksniai ... 13
1.2. Pagrindiniai Alzheimerio ligos patogenezės mechanizmai ir biožymenys ... 16
1.2.1. Alzheimerio ligos patogenezės hipotezės ... 16
1.2.2. Alzheimerio ligos biožymenys ... 21
1.3. Uždegimo mediatorių polimorfizmai ir jų sąsajos su Alzheimerio liga ... 26
1.3.1. Tumoro nekrozės faktroriaus alfa -850 nukleotido polimorfizmo sąsajos su Alzheimerio liga ... 26
1.3.2. Interleukino 1 alfa -889 nukleotido polimorfizmo sąsajos su Alzheimerio liga... 27
1.3.3. Interleukino 6 -174 nukleotido polimorfizmo sąsajos su Alzheimerio liga... 28
2. METODIKA ... 30
2.1. Tiriamųjų grupės ... 30
2.2. Tyrimo schema ir pacientų ištyrimo metodai ... 32
2.2.1. Tiriamųjų atranka ir įtraukimas į tyrimą ... 32
2.2.2. Tiriamųjų apklausa ir ištyrimas ... 32
2.2.3. Kraujo mėginių paėmimas ... 34
2.2.4. Juosmeninė punkcija ir smegenų skysčio mėginių paėmimas ... 34
2.3. Alzheimerio ligai būdingų biožymenų koncentracijos semegenų skystyje ir kraujo serume tyrimas ... 35
2.3.1. Amiloido beta 1-42 peptido koncentracijos smegenų skystyje nustatymas ... 35
2.3.2. Bendro Tau baltymo koncentracijos smegenų skystyje nustatymas .. 36
2.3.3. Fosforilinto Tau baltymo koncentracijos smegenų skystyje nustatymas ... 37
6
2.4. Dezoksiribonukleino rūgščių išskyrimas ir genų polimorfizmo tyrimas ... 39
2.4.1. Dezoksiribonukleino rūgščių išskyrimas ... 39
2.4.2. Tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T polimorfizmo tyrimas .... 39
2.4.3. Interleukinų IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C polimorfizmo tyrimas ... 41
2.4.4. Apolipoproteino E ε alelio polimorfizmo nustatymas ... 42
2.5. Statistinė analizė ... 44
2.5.1. Tyrimo imtis ... 44
2.5.2. Duomenų analizė ... 44
3. REZULTATAI ... 46
3.1. Tiriamųjų grupių aprašymas ... 46
3.2. Tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T ir interleukinų IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C polimorfizmai tarp sergančiųjų Alzheimerio liga ir kontrolinių tiriamųjų ir jų sąsajos su Alzheimerio liga ... 52
3.3. Smegenų skysčio ir kraujo serumo biožymenų pokyčiai sergantiesiems Alzheimerio liga ... 65
3.4. Uždegimo mediatorių TNFα -850C>T, IL1α -889C>T, IL6 -174G>C polimorfizmų sąsajos su smegenų skysčio ir kraujo serumo biožymenimis sergantiesiems Alzheimerio liga ... 71
3.5. Uždegimo mediatorių TNFα -850C>T, IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C polimorfizmų ir Alzheimerio ligos sąsajos, priklausomai nuo APOE ε4 alelio buvimo ... 72
3.6. Uždegimo mediatorių TNFα -850C>T, IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C genotipų ir APOE ε4 alelio bei kitų rizikos veiksnių derinių vertė Alzheimerio ligos rizikai ... 75
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 81
IŠVADOS ... 94
SUMMARY ... 95
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 113
MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 128
CURRICULUM VITAE ... 176
7
SANTRUMPOS
AL – Alzheimerio liga
ADNI – Alzheimerio ligos neuro-vaizdinių tyrimų iniciatyva (mokslinė studija) (angl. Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative)
AMPA – 2-amino-3- (3-hidroksi-5-metilizoksazolilo-4) propanoinė rūgštis APAL – ankstyvos pradžios Alzheimerio liga
APOE – apolipoproteinas E
APP – amiloido pirmtako baltymas (angl. amyloid precursor protein) Aβ – amiloidas beta
BACE1 – beta-sekretazė 1
(angl. beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1) BDS – Blesedo demencijos skalė
Bp – bazių pora CLU – klusterinas
CNS – centrinė nervų sistema DNR – dezoksiribonukleino rūgštis DPL – demencija sergant Parkinsono liga EDTA – etilendiamintetraacetatas
ELISA – imunofermentinis tyrimo metodas
(angl. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) EKSS – ekstrakranijinių kraujagyslių spalvinė sonografija FTD – frontotemporalinė demencija
GDS – geriatrinė depresijos skalė
GWAS – plataus masto genomo asociacijos tyrimai (angl. genome wide association studies)
hFABP – riebiąsias rūgštis sujungiantis širdies tipo baltymas (angl. heart-type fatty acid-binding protein) IL – interleukinas
IP-10 – interferono gama indukuotas baltymas 10 (angl. interferon-γ-induced protein 10) IS – išsėtinė sklerozė
YKL-40 – chitinazė-3-1 baltymas (angl. chitinase-3-like protein 1) KMI – kūno masės indeksas
KS – kraujo serumas
LR – logistinė regresinė analizė LKD – Levy kūnelių demencija LPS – lengvas pažinimo sutrikimas
MMSE – protinės būklės mini testas (angl. Mini Mental State Exam) MSA – multisisteminė atrofija
NMDA – N-metil-D-aspartatas
NFκB – branduolio kappa B faktorius (angl. Nuclear factor kappa B) NFL – neurofilamentas
NFT – neurofibriliniai tinkleliai PET – pozitronų emisijos tomografija PGR – polimerazių grandininės reakcijos PL – Parkinsono liga
8
RFIP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas
SNAP25 – su sinaptosomomis susijęs presinapsinio poliaus baltymas 25 (angl. synaptosome-associated protein 25)
SNP – vieno nukleotido polimorfizmas
(angl. single nucleotide polymorphism, SNP) SS – smegenų skystis
ŠAS – šoninė amiotrofinė sklerozė
Tau – Tau baltymas (bTau – bendras Tau, fTau – fosforilintas Tau) TGFβ – transformuojantis augimo faktorius beta
(angl. transforming growth factor beta)
TL-PGR – tikro laiko polimerazių grandininių reakcijų polimorfizmo nustatymo metodas
TMB – tetrametilbendizinas
TMTA – skaičių sujungimo testo A dalis (angl. Trail Making Test A) TNFα – tumoro nekrozės faktorius alfa
9
ĮVADAS
Alzheimerio liga (AL) – labiausiai paplitusi neurodegeneracinė centrinės nervų sistemos (CNS) liga ir dažniausia demencijos priežastis [1]. Ji pasi-reiškia progresuojančiu, neišnykstančiu pažinimo funkcijų blogėjimu, elgse-nos pokyčiais, pažeidžia socialinius įgūdžius, savarankiškumą, gebėjimą apsitarnauti, funkcionuoti kasdienėje veikloje. Šiuo metu pasaulyje yra apie 50 mln. žmonių, sergančių Alzheimerio liga ir, ilgėjant vidutinei gyvenimo trukmei, šis skaičius nuolat auga [1, 2]. Didėjant visuomenės patiriamai su AL susijusiai naštai, didžiųjų pasaulio šalių (G8) lyderiai dar 2013 m. apibrė-žė Alzheimerio ligą kaip visuotiną prioritetą, tikintis iki 2025 m. sukurti ligos eigą modifikuojantį gydymą [1, 3, 4]. Daugėja įrodymų, kad AL patofiziolo-giniai procesai prasideda keletu dešimtmečių anksčiau, negu atsiranda pirmieji klinikiniai AL simptomai [4], todėl rizikos veiksnių išaiškinimas, ankstyvos diagnostikos ir efektyvaus bei savalaikio gydymo metodų paieška tapo daugelio mokslinių tyrimų objektu. Pagrindine AL patogenezės grandi-mi laikograndi-mi toksinis agrandi-miloido beta (Aβ) kaupimasis ir Tau baltymo (Tau) pokyčiai. Uždegiminiai procesai taip pat būdingi AL neurodegenerecijai, ir galimai inicijuoja bei palaiko amiloido beta (Aβ) ir Tau baltymo patogenezės kaskadą galvos smegenyse [5, 6]. Transgeninių pelių modeliuose įrodyta, kad patologinio Aβ1-42 poveikyje didėja tumoro nekrozės faktoriaus alfa (TNFα), interleukinų IL1 ir IL6 koncentracijos [7]. Amiloido sankaupų aplinkoje aktyvuojama mikroglija, intensyvėja uždegimo mediatorių TNFα, IL1, IL6, sintezė [8, 9]. Sergantiesiems Alzheimerio liga nustatytos padidėjusios šių uždegimo mediatorių koncentracijos tiek CNS, tiek periferijoje [5, 8, 10, 11]. Be to, TNFα, IL1 siejami su patologiniu amiloido pirmtako baltymo (angl.
amyloid precursor protein, APP) skilimo keliu [12–15], o IL6 pasižymi
10
11
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Įvertinti uždegimo mediatorių – tumoro nekrozės faktoriaus alfa, inter-leukino 1 alfa ir interinter-leukino 6 vieno nukleotido polimorfizmų, biožymenų ir kitų rizikos veiksnių sąsajas, sergant Alzheimerio liga.
Darbo uždaviniai
1. Nustatyti uždegimo mediatorių – tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T, interleukino 1 alfa -889C>T, interleukino 6 -174G>C, polimorfizmų pasiskirstymą tarp sergančiųjų Alzheimerio liga ir kontrolinių asmenų, ir įvertinti šių polimorfizmų sąsajas su Alzheimerio liga.
2. Nustatyti biožymenų (amiloido beta 1-42 peptido, bendro Tau balty-mo ir fosforilinto Tau baltybalty-mo) koncentracijas smegenų skystyje ir jų santykius (bTau/Aβ1-42, fTau/Aβ1-42) bei amiloido beta 1-40 peptido koncetracijas kraujo serume sergantiesiems Alzheimerio liga ir palyginti jas grupėse pagal ligos klinikinius požymius bei eigą.
3. Įvertinti tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T, interleukino 1 alfa -889C>T, interleukino 6 -174G>C polimorfizmų sąsajas su smegenų skysčio bei kraujo serumo biožymenimis sergantiesiems Alzheimerio liga.
4. Įvertinti tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T, interleukino 1 alfa -889C>T, interleukino 6 -174G>C polimorfizmų sąsajas su Alzheimerio ligos rizika, priklausomai nuo apolipoproteino E ε4 alelio buvimo.
5. Įvertinti tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T, interleukino 1 alfa -889C>T ir interleukino 6 -174G>C genotipų, apolipoproteino E ε4 alelio ir kitų rizikos veiksnių derinių vertę Alzheimerio ligos rizikai.
Darbo aktualumas ir mokslinis naujumas
12
modifikuojančio AL gydymo [22, 23]. Nauji duomenys, papildantys žinias apie genetinius rizikos veiksnius, galėtų būti naudingi įvertinant personali-zuotą riziką sirgti AL ir tuo remiantis tiksliau parinkti tiriamuosius kliniki-niams tyrimams ar asmenis, kuriems galimai būtų indikuotinas ligos eigą modifikuojantis gydymas ikiklinikinėje stadijoje. Uždegimo mediatorių TNFα, IL1α, IL6 polimorfizmų pasiskirstymo ir sąsajų su AL rizika analizė gali būti vertinga detalizuojant neurouždegimo procesus, jų ryšį su amiloido ir Tau baltymo patogeneziniais mechanizmais, neurodegeneracija.
Mūsų tyrime pirmą kartą Lietuvos populiacijoje nagrinėti uždegimo mediatorių vieno nukleotido polimorfizmai sergantiesiems AL. TNFα ir IL10 polimorfizmai Lietuvoje buvo tirti tik ieškant sąsajų su krūties vėžiu [24]. Iki šiol nėra publikuotų Baltijos šalyse (Lietuva, Latvija, Estija) atliktų tyrimų, kuriuose būtų tirti TNFα -850C>T, IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C polimor-fizmai ar vertintos jų derinių sąsajos ir su kitomis neurodegeneracinėmis CNS ligomis. Šiame tyrime, mūsų žiniomis, pirmą kartą Baltijos šalių regione įvertinti smegenų skysčio amiloido beta ir Tau baltymo, bei kraujo serumo amiloido beta pokyčiai sergantiesiems AL ir jų ypatumai, atsižvelgiant į ligos formą bei išreikštumą. Taip pat nustatytas TNFα -850C>T, IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C alelių ir genotipų pasiskirstymas Lietuvos populiacijoje, paro-dytos IL1α -889 ir IL6 -174 genotipų derinių su APOEε4 bei TNFα -850 ir IL6 -174 genotipų tarpusavio derinių sąsajos su AL rizika.
Darbo praktinė reikšmė
13
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Alzheimerio ligos epidemiologija, rizikos veiksniai 1.1.1. Alzheimerio ligos paplitimas
Skirtingų autorių duomenimis, Alzheimerio liga sudaro 50–80 proc. visų demencijos atvejų. Niu H. su bendraautoriais atliktoje meta – analizėje nurodo, jog Europoje Alzheimerio ligos paplitimas yra apie 5 proc. visos populiacijos virš 50 metų, jis didėja su amžiumi ir siekia atitinkamai 3,18 proc. ir 14,04 proc. amžiaus grupėse iki 79 m., ir nuo 80 m. [2]. Autoriai taip pat nurodo, kad AL paplitimas ir dažnis skiriasi grupėse pagal lytį (vyrų yra apie 3 proc., moterų – apie 7 proc.) bei pagal geografinę padėtį (Šiaurės Europos šalyse AL beveik 2 kartus dažnesnė). Jungtinėse Amerikos Valstijo-se nurodomas dar didesnis Valstijo-sergamumas AL [1, 21], taip pat pastebėta, jog senyvo amžiaus (virš 70 m.) juodaodžiams Alzheimerio tipo ir kita demencija yra beveik du kartus, o meksikiečių kilmės amerikiečiams – pusantro karto dažnesnė nei Europidų rasės atstovams. Tai dažniau siejama su bendrų sveikatos rodiklių, gyvenimo būdo, socioekonominiais skirtumais [25], tačiau yra duomenų, kad skirtingai išreikšti genetiniai rizikos veiksniai ir polinkis sirgti širdies – kraujagyslių ligomis bei cukriniu diabetu, gali sąlygoti rasinius skirtumus sirgti Alzheimerio liga [26].
Pagal pažinimo funkcijų sutrikimo pasireiškimo, diagnozės nustatymo amžių, išskiriamos dvi Alzheimerio ligos formos – vėlyvos pradžios AL, kai susergama 65 m. ir vyresniame amžiuje, ir ankstyvos pradžios AL, kuomet AL kliniškai pasireiškia iki 65 m. amžiaus. Ankstyvos pradžios AL yra gana reta patologija, sudaro iki 10 proc. AL atvejų, duomenų apie jos paplitimą nedaug. Skirtingų autorių duomenimis, ankstyvos demencijos (visų tipų) dažnis svyruoja nuo 81 iki 113 atvejų 100 tūkst. asmenų nuo 45 m. iki 64 m. [27]. Tik nedidelė dalis (5–10 proc.) ankstyvos pradžios AL yra susijusi su retomis genų mutacijomis (amiloido pirmtako baltymo (APP), presenilino 1 ir 2 (PSEN1, PSEN2) baltymo,) ir vadinama šeimine Alzheimerio liga [28]. Taigi didžiąją Alzheimerio ligos atvejų dalį (virš 90 proc.) sudaro sporadinė vėlyvos pradžios Alzheimerio liga.
1.1.2. Alzheimerio ligos rizikos veiksniai
14
Amžius. Senėjimas laikomas svarbiausiu AL rizikos veiksniu, varančiąja AL degeneracijos grandimi [29]. Savaime normalus senėjimas reikšmingai pažinimo funkcijų nesutrikdo, tačiau sudaro sąlygas demencijos vystymuisi [30].
Genetiniai rizikos veiksniai. Progresuojantys genų analizės metodai nulėmė didelę pažangą genetinių AL rizikos veiksnių tyrimuose. Plataus masto genomo asociacijos tyrimais (angl. Genome wide association studies,
GWAS) identifikuotus rizikos genų lokusus dažnai sudaro keletas genų, bet
ne visi iš jų gali būti reikšmingai susiję su AL patologija. Tuo tarpu vieno nukleotido polimorfizmų tyrimas (angl. single nucleotide polymorphisms,
SNPs) leidžia nustatyti genetines asociacijas su AL endofenotipais
(biožyme-nų profilis, smege(biožyme-nų struktūriniai pokyčiai, pažinimo funkcijų sutrikimo pobūdis), kurie nusako ligos progresavimą ir patologinius procesus [18].
Apolipoproteino E genotipas (APOE) – reikšmingiausias sporadinės vėlyvos pradžios AL genetinis rizikos veiksnys [31]. APOE dalyvauja lipidų metabolizmo procesuose, svarbus cholesterolio transportui, neuroplastišku-mui ir uždegineuroplastišku-mui, jis jungiasi su Aβ ir įtakoja tirpaus Aβ šalinimą ir agre-gaciją [32]. APOE genas lokalizuojasi 19q13.2 chromosomoje, koduojamas trimis aleliais – ε2, ε3, ε4. Skirtingi APOE genotipo variantai lemia nevienodą AL riziką – ε2/2 genotipas apsprendžia mažiausią tikimybę sirgti AL, ir net gali būti laikomas apsauginiu AL veiksniu [33]. Bent vieno ε4 alelio nešiotojams AL rizika 2–3 kartus didesnė, o APOE ε4 homozigotams gali lemti apie 10–12 kartų didesnę AL riziką [34, 35]. Kitų baltymų, susijusių su lipidų transportu (klusterino (CLU), ABCA7 (angl. ATP-binding cassette
transporter A7)), genų polimorfizmai taip pat siejami su AL rizika [36–40].
Nustatyta, jog efektyvią endocitozę, sinapsių funkciją, neurotransmiterių išsiskyrimą sąlygojančių baltymų genų (SORL1 (angl. Sortilin-related
recep-tor L), BIN1 (angl. Bridging integrarecep-tor 1), CD2AP (angl. CD2-associated protein), PICALM (angl. Phosphatidylinositol-binding clathrin assembly gene), EPHA1 (Ephrin receptor A1)) mutacijos taip pat yra susiję su AL
rizika [18, 31]. Imuninius procesus ir neurouždegimo sąlygotus patologinius pokyčius įtakojantys ir su AL rizika siejami genai – CR1 (angl. Complement
receptor 1), CD33, MS4A (angl. Membrane-spanning 4-domains, subfa-mily A) ir TREM2 (angl. Triggering receptor expressed on myeloid cells 2)
[18, 31, 41].
15
Kognityvinis ir smegenų rezervas priklauso nuo gebėjimo efektyviai panaudoti esamą funkcinį neuronų tinklą, net esant smegenų struktūriniams pokyčiams [45, 46]. Didesnis smegenų rezervas laikomas apsauginiu Alzhei-merio ligos rizikos veiksniu ir yra nusakomas tokiais psichosocialiniais veiks-niais, kaip aukštesnis išsilavinimas ir palankesnė socioekonominė padėtis, protinį aktyvumą stimuliuojanti veikla, sudėtinga darbinė veikla, platūs socialiniai ryšiai ir užimtumas, aktyvus laisvalaikis [47–49].
Galvos smegenų kraujagyslių ligos, cukrinis diabetas, arterinė hiperten-zija, nutukimas ir dislipidemija priskiriami įgytiems, koreguojamiems Alzhei-merio ligos rizikos veiksniams. Post mortem patologiniais tyrimais nustatyta amiloidinė Aβ angiopatija ir smulkiųjų kraujagyslių (arteriolių) skleroziniai pakitimai, sirgusiųjų AL smegenų parenchimoje, kartu su hemoraginiais ir smegenų infarkto požymiais daugiau nei 50 proc. atvejų [50, 51]. Arterinės hipertenzijos sąlygoti kraujagyslių sienelės pakitimai lemia smegenų hipoperfuziją, išemiją ir hipoksiją, hematoencefalinio barjero pažeidimą, kas veikia kaip paleidžiantysis veiksnys (trigeris) AL patogenezei [45, 52]. Epi-demiologiniuose tyrimuose buvo nustatyta, kad sergantieji antro tipo CD dažniau serga AL, lyginant su bendra populiacija [53]. Remiantis Por-fenno L. A. ir kt. atliktos meta-analizės rezultatais, nutukimas – reikšmingas ir nepriklausomas AL rizikos veiksnys [54]. Kitų autorių duomenimis, antsvoris ir nutukimas, kaip ir per maža kūno masė (KMI < 20 kg/m2), viduti-niame amžiuje, didina riziką susirgti AL, o nutukimas vyresviduti-niame amžiuje, atvirkščiai, susijęs su mažesne AL rizika [55, 56]. Alzheimerio liga sergan-tiems pacientams nustatoma iki 10 proc. didesnė cholesterolio koncentracija kraujyje, lyginant su kontroliniais asmenimis, taigi dislipidemija laikoma vienu iš AL riziką didinančių veiksnių [57–59].
16
Kiti rizikos veiksniai. Lėtinis stresas, depresija jaunystėje ar vidutiniame amžiuje, našlystė taip pat siejami su didesne rizika sirgti Alzheimerio liga [73–75]. Kaip galimi AL rizikos veiksniai literatūroje nurodomi ir trauminis smegenų pažeidimas anamnezėje, nesaugi darbinė aplinka (labai žemų dažnių elektromagnetinis laukas, sunkieji metalai), lėtinės infekcijos (herpes simplex virusas, spirochetos, chlamidijos), ir kt. [76–78]. Miego sutrikimas būdingas net 25–45 proc. lengvos – vidutinės Alzheimerio ligos pacientų [79, 80] ir yra vienas iš neurodegeneracijos simptomų. Kita vertus, miego – būdravimo ciklo sutrikimas palaiko amiloido kaupimąsi smegenyse, yra susijęs su smegenų hipoksija, oksidaciniu stresu, cirkadinio ritmo sutrikimu, hematoencefalinio barjero pokyčiais [79].
Apibendrinant, galima teigti, jog pagrindiniai sporadinės Alzheimerio li– gos riziką didinantys veiksniai yra amžius, moteriška lytis, šeiminė anamnezė ir genetinė predispozicija (APOE ε4, CLU, ABCA7, BIN1, CD2AP, CR1, TREM2 ir kt.), arterinė hipertenzija ir antsvoris, hipercholesterolemija, rūkymas ir piktnaudžiavimas alkoholiu, gausi sočiosiomis rūgštimis dieta, vitaminų ir antioksidantų deficitas, lėtinis stresas ir miego sutrikimas, depre-sija, nesaugi darbinė aplinka. Apsauginiais AL veiksniais laikomi APOE ε2 alelis ir kiti protekciniu veikimu pasižymintys genetiniai polimorfizmai, geras kognityvinis rezervas, platūs socialiniai ryšiai ir užimtumas, fizinis aktyvu-mas, Viduržemio jūros dieta ir kiti. Apsauginiams veiksniams taip pat priski-riama ir kai kurių medikamentų vartojimas – pakaitinė hormonų terapija, nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo, antihipertenziniai vaistai, statinai [45, 81, 82].
1.2. Pagrindiniai Alzheimerio ligos patogenezės mechanizmai ir biožymenys
1.2.1. Alzheimerio ligos patogenezės hipotezės
17
todėl tęsiami moksliniai tyrimai, įvairiais aspektais aiškinantys amiloidoge-nezės kelią, bei ieškoma kitų patogeamiloidoge-nezės mechanizmų, lemiančių AL būdin-gus pakitimus galvos smegenyse.
Amiloido kaskados hipotezė, pirmą kartą pasiūlyta 1992 m. [90], remiasi laipsnišku amiloidinių plokštelių formavimusi smegenyse. Aβ sankaupos indukuoja uždegiminį atsaką, jonų homeostazės sutrikimą, oksidacinį stresą, kinazių / fosfatazių aktyvumo pokyčius, lemia neurofibrilinių tinklelių kaupimąsi, išplitusią sinapsių disfunkciją ir neuronų žūtį [91, 92]. Didžiąją amiloidinių plokštelių dalį sudaro amiloido beta peptidai iš 42 ar 40 amino-rūgščių (Aβ1-42 ir Aβ1-40) – amiloido pirmtako baltymo (APP) metaboliz-mo produktai. Amiloidogeninį APP skilimetaboliz-mo kelią palaiko beta ir gama sekretazės, kurių veikimo pasekoje Aβ 38-42 amino rūgščių ilgio monomerai lieka tarpląsteliniame tarpe, o vėliau agreguojasi į toksinius oligomerus ir formuoja amiloidines plokšteles. Amiloidogenezės procese itin svarbus ir genetinių veiksnių vaidmuo. Sporadinei AL reikšmingiausias – APOE geno-tipas, kuris įtakoja Aβ metabolizmą, amiloidinių plokštelių atsidėjimo laiką, vietą ir Aβ agregacijos apimtis galvos smegenyse [93, 94]. Sunderland T. su kolegomis, tyrę vidutinio amžiaus asmenis be pažinimo funkcijų sutrikimo, įrodė smegenų skysčio Aβ1-42 koncentracijos mažėjimą, didėjant APOE ε4 alelių skaičiui [94]. Vėliau APOE genotipo nuo dozės priklausomas skatina-masis poveikis amiloido fibrilių formavimuisi patvirtintas amiloido vaizdi-niais tyrimais [95]. Kurios Aβ formos yra svarbesnės neurodegeneraciniam procesui, iki šiol nėra visai aišku, tačiau pastaraisiais metais daugėja duome-nų, kad tirpūs Aβ oligomerai gali būti labiau toksiški nei monomerai ir netirpios amiloidinės fibrilės [91, 96]. Taip pat nėra nustatyta tiesioginio ryšio tarp Aβ sankaupų ir neuronų žūties bei pažinimo funkcijų sutrikimo [91, 97].
18
lemia augantį susidomėjimą Tau baltymu, kaip galimu taikiniu AL vaistų tyrimuose [92].
Neurouždegimo teorija. Sergančiųjų AL smegenų audinio autopsijos tyrimais ir gyvūnų modeliuose įrodyta, kad be Aβ plokštelių ir NFT, AL būdingi ir lėtinio uždegimo požymiai [5, 6, 104]. Neurouždegimas siejamas ne tik su AL, bet ir kitų neurodegeneracinių ligų (Parkinsono liga, šoninė amiotrofinė sklerozė, išsėtinė sklerozė, lėtinė trauminė encefalopatija) pato-geneze. Ūminis uždegiminis atsakas smegenyse veikia kaip apsaugos mechanizmas prieš infekciją, toksinus, trauminį pažeidimą. Užsitęsus uždegi-miniam aktyvumui, sutrikus balansui tarp anti- ir pro-uždegiminių procesų, uždegimas tampa lėtiniu, pasireiškiančiu glijos ląstelių aktyvacija ir įvairių citokinų išsiskyrimu [5, 92, 105]. Anksčiau manyta, kad AL metu lėtinis uždegimas yra antrinis, kaip atsakas į ląstelių žūtį, tačiau daugėja duomenų, kad ne tik Aβ ir Tau baltymo pokyčiai indukuoja uždegiminius procesus sme-genyse, bet ir pats uždegimas palaiko ryšį tarp Aβ patologijos ir NFT forma-vimosi, skatina Aβ sintezę ir Tau baltymo fosforilinimą [5, 106]. Mikroglijos ląstelės dalyvauja sinapsių palaikyme, neurogenezėje, smegenų homeostazės, pažinimo funkcijų reguliavime, yra svarbios imuniniam atsakui. Normalio-mis sąlygoNormalio-mis jos reziduoja CNS ramybės būsenoje. Mikroglijos ląstelių receptoriams atpažinus patologinį stimulą (invazija, audinio pažeidimas, liga) ar uždegiminį signalą, mikroglija aktyvuojasi, keičia savo morfologiją ir migruoja. Patologinio amiloido beta buvimas aktyvuoja mikroglijos ląsteles AL metu, jos migruoja Aβ plokštelių link ir fagocituoja Aβ [107, 108]. Ilgai-niui mikroglijos ląstelės padidėja, nebesugeba apdoroti Aβ, kuris kaupiasi Aβ plokštelėse, o išliekantis užsitęsęs uždegimo mediatorių ir neurotoksinų poveikis pažeidžia neuronus, toliau cikliškai skatina uždegiminius procesus, naujų mikroglijos ląstelių aktyvaciją [109, 110]. Yra duomenų, kad mikro-glija yra heterogeniška skirtingose galvos smegenų vietose [105], ir galimai neurouždegiminiai procesai nevienodai pažeidžia atskiras smegenų sritis.
19
astrocitų aktyvacijos [116]. Taigi manoma, kad astrocitai turi dvejopą poveikį amiloido beta metabolizmui. Kita vertus, astrocitų funkcija pakinta toksiškoje Aβ aplinkoje [117]. Patogeniškų Aβ formų buvimas sutrikdo kalcio homeo-stazę, ląstelių energetinį balansą, didina oksidacinį distresą, su uždegimu susijusių medžiagų, tokių kaip azoto oksido (NO), interleukino 1 alfa ir beta (IL1α, IL1β), interleukino 6 (IL6), tumoro nekrozės faktoriaus alfa (TNFα) išsiskyrimą [111, 118, 119].
Oksidacinis stresas ir sinapsių disfunkcija. Sinapsių disfunkcija ir sinap-sių skaičiaus mažėjimas yra ankstyvi AL patogenezės reiškiniai [120, 121]. Aktyviosios deguonies formos, Aβ oligomerai, fosforilintas Tau, veikdami atskirai ir sinergistiškai, keičia N-metil-D-aspartato (NMDA) receptorių aktyvumą ir lemia per didelius ekstrasinapsinio glutamato kiekius [122, 123]. Žinoma, kad NMDA receptorių funkcija silpsta su amžiumi, bet AL metu, toksiško Aβ poveikyje, amžiniai procesai paryškėja, NMDA receptorių mažėja, sutrinka kalcio jonų homeostazė, didėja oksidacinis stresas, keičiasi energetinis metabolizmas, pakinta genų, atsakingų už neuronų vystymąsi ir plastiškumą, transkripcijos reguliacija [123].
Sinukleinas alfa (α-sinukleinas) – neuronų baltymas, kuris lokalizuojasi presinapsinėse galinėse ataugose ir yra svarbus neurotransmiterių išskyrimo procesui [124]. Sinukleino alfa agregatai aptinkami beveik pusei sporadinės AL atvejų [125], ir beveik visiems šeiminės AL su PSEN1 mutacija asme-nims [126]. α-sinukleino oligomerams būdingas įvairialypis toksinis povei-kis, apimantis neurouždegimą, sinapsių disfunkciją, ląstelės membranos vientisumo pažeidimą, viduląstelinio baltymų skaidymo sutrikimą. AL metu α-sinukleinas gali veikti sinergistiškai tiek su Tau baltymu, tiek su Aβ, ir palaikyti jų agregaciją ir kaupimąsi [92, 97]. Be to, manoma, kad α – sinukleinas gali turėti savybę, panašią į būdingą prionams – plisti iš ląstelės į ląstelę [127, 128].
Galvos smegenų kraujotakos autoreguliacijos pokyčiai jau kurį laiką sie-jami su AL patogeneze. Remiantis ADNI kohortos tyrimų rezultatais, teigia-ma, kad kraujagysliniai pakitimai yra anksčiausias ir stipriausias patologinis sporadinės vėlyvos pradžios AL veiksnys, kurį lydi Aβ sankaupos, gliukozės metabolizmo reguliacijos, smegenų funkcijos sutrikimas ir pilkosios medžia-gos atrofija [129]. Sutrikus kraujotakos reguliacijos funkcijai, sumažėja de-guonies, gliukozės, mikroelementų patekimas į smegenis, o tai lemia ląstelių pažaidą ir hematoencefalinio barjero disfunkciją, uždegimo aktyvaciją ir oksidacinį stresą. Hipoksijos sąlygose aktyvuojamos beta ir gama sekretazės, skatinama amiloidogenezė ir Aβ kaupimasis [92, 130].
20
glutamatu, kurie skatina amiloido peptidų agregaciją. Vario jonai išsiskyrę sinapsėse taip pat veikia kaip potencialūs Aβ agregacijos mediatoriai nežy-mios acidozės sąlygomis. Aliuminio ir AL sąsajos išlieka neaiškios [97, 131]. Geležis svarbi normaliai smegenų veiklai, tačiau jos perteklius skatina neuro-degeneraciją [132]. Viduląsteliniai geležies jonai dalyvauja APP skilimo procese, jungiasi su fosforilintu Tau ir skatina Tau baltymo agregaciją [131, 133].
Metabolizmo pokyčiai – dar viena AL patogenezės grandis. Apolipopro-teinas E (APOE) yra vienas svarbiausių plazmos apolipoproteinų ir pagrin-dinis cholesterolio pernešėjas smegenyse, kurio pagrindinė funkcija – amiloi-do metabolizmo reguliavimas. APOE palaiko amiloiamiloi-dogeninį APP skilimo kelią, jungiasi su Aβ, įtakoja amiloido kaupimo ir šalinimo procesus, o esant APOE ε4 – rizikos aleliui, nulemia Aβ plokštelių formavimąsi. Kita vertus, APOE netiesiogiai veikia AL pradžią ir progresavimą, moduliuodamas kardiovaskulinę būklę [32]. Pozitronų emisijos tomografijos (PET) tyrimuose stebėtos gliukozės hipometabolizmo zonos (medialinėse temporalinėse skiltyse) siejamos su APOE veikimu, tačiau ar jos išryškėja dėl tiesioginio APOE poveikio smegenų metabolizmui, ar dėl poveikio amiloido formavi-muisi, išlieka neaišku [32, 134, 135]. In vitro ir in vivo tyrimuose įrodytas ir su amiloidu beta nesusijęs APOE vaidmuo – jis dalyvauja neurouždegimo procese, indukuoja sinapsių disfunkciją, keičia atsaką į neurono pažaidą [97, 136].
Cholesterolio vaidmenį AL patogenezėje patvirtina faktas, kad viduląste-linis cholesterolis reguliuoja APP skilimą per sekretazių aktyvinimą ir viduląstelinio tarnsporto mechanizmus. Padidėjusi cholesterolio koncentra-cija aktyvina gama sekretazes ir nulemia amiloidogeninį APP skilimo kelią [136, 137]. Cholesterolio metabolitų oksisterolių 24 ir 27 (24-OH, 27-OH) koncentracijų pokyčiai nustatyti sergančiųjų AL plazmoje ir smegenų skys-tyje, nes hipercholesterolemija susijusi su oksidaciniu stresu ir hematoence-falinio barjero disfunkcija [137]. Oksisterolių koncentracija smegenų skysty-je priklauso ne tik nuo plazmos cholesterolio koncentracijos, bet ir skiriasi ankstyvos ir pažengusios AL stadijose, todėl AL patogenezei svarbiausias yra oksisterolių homeostazės – pusiausvyros tarp 24-OH ir 27-OH, sutrikimas [138, 139]. Metabolizmo pokyčiais paremtoje AL patogenezės hipotezėje svarbus vaidmuo tenka rezistentiškumui insulinui, adipocitų funckijos sutrikimui, nutukimo sąlygotiems adiponektino koncentracijos pokyčiams, dėl įvairių metabolinių sutrikimų susilpnėjusiems antioksidaciniams apsauginiams mechanizmams [134, 140, 141].
21
AL sunkumu ir yra susijęs su amiloido kaskada ir Tau fosforilinimu [142]. Glutamato NMDA ir AMPA (2-amino-3-(3-hidroksi-5-metilizoksazolilo-4) propanoinė rūgštis) receptorių pokyčiai susiję su sinapsių disfunkcija [143].
Mikrobiotos ir AL ryšys dar labai mažai ištirtas. Padidėjęs žarnyno bei hematoencefalinio barjero pralaidumas, sukeltas mikrobiotos disbiozės, gali palaikyti ar įtakoti AL ir kitų, su amžiumi susijusių ligų, patogenezinius kelius. Be to, žarnyno mikrobiotos bakterijos gali išskirti didelius amiloido ir lipopolisacharidazių kiekius, kurie skatina uždegimo mediatorių išsiskyrimą [144, 145].
Infekcijų vaidmuo AL patogenezėje taip pat kol kas išlieka prieštaringas. Tačiau yra publikuota studijų rezultatų, nurodančių AL ir infekcijų (herpes virusų, citomegalo viruso, Ebštein-Baro, hepatito C virusų, Clamydia
pneu-moniae, Helicobacter pylori, Borelia burgdorferi, Candida albicans ir kt.)
patogenenzines sąsajas. Labiausiai tikėtinas mechanizmas – uždegimo me-diatorių (IL1, IL6, TNFα) išsiskyrimas, sisteminis uždegiminis atsakas, hematoencefalinio barjero pokyčiai, lemiantys mikroglijos aktyvaciją, neuro-uždegimą, ir lydintys į neurodegeneraciją [146].
1.2.2. Alzheimerio ligos biožymenys
22
tyrimais, kita vertus, biožymenų pokyčiai neatspindi atitinkamų sričių – patogeografinių smegenų pokyčių, kurie itin reikšmingi ankstyvos AL metu [153]. Juosmeninė punkcija, būtina smegenų skysčio mėginiams paimti, yra kitas SS biožymenų panaudojimo apribojimas. Tai skatina ieškoti KS ar plaz-mos biožymenų, kad būtų galima įvertinti naudą didesnės apimties tyrimuose ar plačiau taikyti klinikinėje praktikoje. Be to, iki šiol išlieka tyrimų atsikartojamumo klausimas, skirtingose laboratorijose gauti rezultatai negali būti tiesiogiai lyginami, nėra nustatytų universalių ribinių verčių. Biožymenų diagnostinė ir prognozinė vertė turėtų būti vertinama atsižvelgiant į amžių, genotipą, stebėjimo trukmę ir kitus rizikos veiksnius bei klinikinius požymius [148]. Sumažėjusi amiloido beta 42 peptido (Aβ1-42) koncentracija ir padidėjusios bendro Tau (bTau) ir fosforilinto ties treoninu 181 Tau baltymo (pTau) koncentracijos smegenų skystyje nusako taip vadinamą AL biožy-menų profilį, tačiau pastaraisiais metais daugėja įrodymų, kad ir kitus patofi-ziologinius mechanizmus charakterizuojantys žymenys gali būti svarbūs AL tyrimų kontekste.
Amiloido beta koncentracijų pokyčiai SS ir KS sergantiesiems Alzhei-merio liga laikomi amiloidogeninio APP skilimo kelio sąlygoto smegenų pažeidimo žymeniu, skaitine amiloido patologijos išraiška. Buchhave P. su kolegomis nustatė, kad Aβ1-42 koncentracija SS sumažėja keleriais metais anksčiau nei randama su Tau baltymu susijusi patologija [154]. Tuo remiantis daroma prielaida, kad amiloido patologija prasideda anksčiau nei neuronų disfunkcija ir neurodegeneracija. Keleto skirtingų tyrėjų grupių atliktų tyrimų (AL sergančiųjų autopsijų bei amiloido PET) duomenimis, smegenų skysčio Aβ1-42 koncentracija atvirkščiai koreliuoja su amiloido sankaupų kiekiu [92, 155]. Jansen W.J. ir kt. meta-analizėje (2015) nurodė, kad amiloidogeniniai procesai, prasideda 20–30 m. anksčiau nei pasireiškia demencija, ir kad Aβ1-42 koncentracija SS mažėja su amžiumi [155].
Tyrimų, vertinant trumpesnės grandinės amiloido peptidų (Aβ1-40 ir Aβ1-38) koncentracijų SS ir AL ryšį, rezultatai prieštaringi. Aβ1-40 peptidas yra mažiau patogeniškas nei Aβ1-42, ir galimai turi apsauginį poveikį nuo Aβ plokštelių formavimosi [156]. Olsson B. meta-analizėje (2016) nurodoma, kad AL ir Aβ1-40 smegenų skystyje sąsajos abejotinos, reikia detalesnių tyrimų Aβ1-40 reikšmei įvertinti [157]. Kita vertus, Aβ1-42/Aβ1-40 koncent-racijų smegenų skystyje santykis geriau, negu vienas Aβ1-42 (SS) nuspėja Aβ patologiją vaizdinimo (PET) tyrimuose ir galimai turi panašią diagnostinę vertę kaip ir bTau ar fTau santykis su Aβ1-42 [92, 148]. Kai kurių autorių teigimu, Aβ1-42/Aβ1-40 santykis (SS) taip pat padeda geriau diferencijuoti AL nuo kitų demencijų, negu vienas Aβ1-42 [158, 159].
23
amiloido tyrimus, reikšmingų sąsajų nenustatyta daugumoje tyrimų, tačiau yra duomenų, kad plazmos Aβ1-42/Aβ1-40 santykis koreliuoja su SS Aβ biožymenimis bei amiloido sankaupomis išmatuotomis PET tyrimais, bei yra susijęs su pažinimo funkcijų sutrikimo progresavimu į LPS ar demenciją asmenims, nurodantiems subjektyvų pažinimo funkcijų sutrikimą (SPS) [160].
Sumažėjusi Aβ1-42 koncentracija SS laikoma patikimu diagnostiniu AL biožymeniu, diferencijuojant AL nuo sveikų pažinimo funkcijų požiūriu asmenų [155, 157] ir jis siūlomas taikyti ne tik moksliniuose tyrimuose, bet ir klinikinėje praktikoje. Paterson RW. su bendraaut. taip pat nurodo, kad Aβ1-42, ir ypač Aβ1-42/ Aβ1-40 ir bTau/ Aβ1-42 santykiai, gali būti naudin-gi diferencijuojant AL su elgesiniu FTD variantu ar semantine demencija [161]. Tačiau kol kas yra atlikta per mažai tyrimų, kad būtų galima teigti, jog vien tik Aβ1-42 sumažėjimas SS patikimai diferencijuoja AL nuo kitų neurodegeneracinės kilmės demencijų. Kraujo plazmos amiloido biožymenys (Aβ1-42, Aβ1-40 ir jų santykis), galėtų būti naudingi pacientų atrankai klinikiniuose tyrimuose ar ikiklinikinės AL ankstyvai diagnostikai.
Beta-sekretazė 1 (BACE1, angl. beta-site amyloid precursor protein
cleaving enzyme 1) – inicijuoja amiloidogeninį APP skilimo kelią, todėl jo
aktyvumo pokyčiai siejami su AL patologija. Didesnis BACE1 aktyvumas ir / ar koncentracija smegenų skystyje buvo stebėtas LPS pacientams lyginant su AL, bei AL sergantiesiems lyginant su kontroliniais [162, 163]. Kitų auto-rių duomenimis, BACE1 aktyvumo reikšmingų skirtumų tarp LPS, AL ir kontrolinės grupių negauta [164, 165]. Kol kas atlikta per mažai tyrimų, kad būtų galima daryti išvadas dėl BACE1, kaip AL patogenezės biožymens, reikšmės.
24
prognozuojant LPS progresavimą ir diferencijuojant AL su kitomis neurode-generacinėmis ligomis [161, 167]. Padidėjus bTau koncentracija kraujo plaz-moje taip pat siejama su AL, tačiau daugelyje atliktų tyrimų reikšmingai nesiskyrė lyginant LPS ir kontrolinę grupes. Keliose studijose buvo nustatyta padidėjusi fTau koncentracija (KS) AL sergantiesiems, tačiau kraujo fTau kaip vienas AL biožymenų dar turi būti tiriamas [168].
Keletas naujų biožymenų, susijusių su uždegiminiais AL patogenezės pro-cesais buvo pasiūlyta pastaruoju metu – TREM2, YKL-40 (angl.
chitinase-3-like protein 1), IP-10 (angl. interferon-γ-induced protein 10), TNFα,
inter-leukinai (IL), TGF-β ir kiti. Yra publikuoti keleto studijų rezultatai, kuriose nustatyta saikiai padidėjusi tirpaus TREM2 koncentracija smegenų skystyje AL ir LPS pacientams, lyginant su sveikais pažinimo požiūriu asmenimis, tačiau kitų autorių rezultatai šios tendencijos nepatvirtino [86, 92]. YKL-40 AL sergančiųjų smegenyse išsidėsto astrocituose, esančiuose greta Aβ plokštelių ir tiesiogiai koreliuoja su Tau patologija, todėl siejamas su imuniniu / uždegiminiu atsaku AL ir kitų su Tau baltymu susijusių ligų metu [169]. Keletoje tyrimų buvo nustatytos aukštesnės YKL-40 koncentracijos smegenų skystyje AL grupės tiriamiesiems lyginant su kontroline grupe. Šiuo metu nepakanka įrodymų, tačiau YKL-40, ypač derinyje su Tau, turėtų būti tiriamas kaip galimas patofiziologinis AL žymuo [170]. Duomenys apie kitų neurouždegimo žymenų vertę AL diagnostikai ar progresavimo prognozei taip pat kol kas prieštaringi ir nepakankami.
Dar vienas potencialus AL biožymuo – hFABP (angl. heart-type fatty
acid-binding protein). Smegenų skysčio hFABP galimai prognozuoja LPS
progresavimą į AL, koreliuoja su smegenų atrofija, gali būti naudingas diferencijuojant AL ir LKD nuo PL ir kitų neurodegeneracinių patologijų [171].
25
Alfa sinukleinas (α-sinukleinas) labiau žinomas kaip galimas Parkinsono ligos biožymuo. Tačiau ir sergantiesiems AL bei LPS buvo nustatytos dides-nės α-sinukleino koncentracijos smegenų skystyje, lyginant su sveikais pažinimo požiūriu asmenimis [177, 178]. ADNI kohortos tyrime, AL sergan-tiesiems α-sinukleino koncentracija (SS) stipriai koreliavo su bTau (SS) ir, mažiau, su pTau koncentracija [179]. Alfa sinukleino koncentracijų skirtumų kraujo serume ar plazmoje AL ir kontrolinėje grupėse nenustatoma [92]. Iki šiol α-sinukleinas yra nepakankami ištirtas kaip potencialus AL biožymuo.
Neuronų kalcio jutiklio baltymas VILIP-1 (angl. visinin-like protein 1) buvo nustatytas genetiniais tyrimais pelių modeliuose, susijęs su sinapsių plastiškumu, koreliuoja su smegenų skysčio bTau ir fTau, ir galimai naudin-gas kaip neurodegeneracijos biožymuo. Nurodoma padidėjusi VILIP-1 kon-centracija SS ir kraujo plazmoje AL sergantiesiems lyginant su pažinimo funkcijų sutrikimo neturinčiais asmenimis [174, 180, 181]. Taip pat stebėta teigiama VILIP-1 vertė prognozuojant pažinimo funkcijų sutrikimo progresa-vimą bei diferencijuojant AL nuo kitos kilmės demencijų [180, 181], bet kol kas šis baltymas išlieka tyrimų stadijoje, mažai duomenų apie VILIP-1 ir AL sąsajas.
Neurofilamentai (NFL) yra būtini aksonų augimui, struktūros palaikymui ir nervinio impulso perdavimui. Lengvųjų NFL kiekio padidėjimas smegenų skystyje yra aksonų pažaidos žymuo [182]. AL būdingas NFL padidėjimas SS ir kraujo plazmoje, tačiau jis nėra specifiškas AL, nes panašūs pokyčiai galimi ir esant kitoms neurodegeneracinėms ligoms (PSP, ŠAS, Huntingtono liga, IS) [182–184].
26
1.3. Uždegimo mediatorių polimorfizmai ir jų sąsajos su Alzheimerio liga
1.3.1. Tumoro nekrozės faktroriaus alfa -850 nukleotido polimorfizmo sąsajos su Alzheimerio liga
Tumoro nekrozės faktorius alfa (TNFα) yra pleotropinis citokinas, produkuojamas įvairių tipų ląstelių, ir yra svarbus uždegimo mediatorius įvairiuose audiniuose. Centrinėje nervų sistemoje (CNS) reziduojantys makrofagai, astrocitai bei mikroglijos ląstelės geba išskirti TNFα [15]. Gyvū-nų modeliuose nustatyta, kad TNFα padidėjimas yra esminis uždegiminės kaskados elementas, skatinantis su Aβ ir Tau susijusius patologinius pokyčius [19, 185]. Sergantiesiems AL smegenų skystyje nustatoma padidėjusi TNFα koncentracija, lyginant su sveikais tiriamaisiais [10]. In vitro tyrimuose, TNFα indukuoja neurotoksinio Aβ gamybą [12]. Kita vertus, nurodomas ir apsauginis TNFα poveikis AL patogenezės procese, siejamas su mikroglijos ląstelių – Aβ fagocitozės aktyvinimu [19, 186]. TNFα susijęs su neuronų ir sinapsių disfunkcija, palaiko amiloido patologijos sąlygotus molekulinius procesus, apsprendžiančius pažinimo funkcijų blogėjimą [187].
Tumoro nekrozės faktoriaus alfa genas yra 6 chromosomos trumpajame petyje (1.3.1 pav.).
1.3.1 pav. 6 chromosoma ir TNFα geno lokalizacija
(https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=TNF)
27
pacientai, 81 tiriamasis sergantis kraujagysline demencija, 65 asmenys patyrę galvos smegenų insultą (neturintys pažinimo funkcijų sutrikimo) ir 235 kontrolinės grupės tiriamieji, nustatyta, kad bent vieno TNFα -850 T alelio nešiojimas reikšmingai didina APOE ε4 alelio apspręstą riziką sirgti AL, o reikšmingo sinergistinio APOE ε4 aleliui poveikio kraujagyslinės demencijos rizikai nenustatyta [188]. Laws S. tyrime, kuriame dalyvavo 506 sergančių AL ir 277 pažinimo sutrikimo neturinčių asmenų, nustatyta ne tik didesnė tikimybė sirgti AL turintiems bent vieną TNFα -850 T alelį (C/T ir T/T lyginant su C/C genotipu), sinergistinis poveikis su APOE ε4 aleliu, bet ir sąsajos su Aβ1-42 koncentracija smegenų skystyje [189]. Publikuoti ir keleto tyrimų, paneigiančių TNFα -850C>T reikšmę AL rizikai, rezultatai [190, 191]. TNFα -850C>T polimorfizmo sąsajos su AL ir kitais jos rizikos veiks-niais mažai ištirtos.
1.3.2. Interleukino 1 alfa -889 nukleotido polimorfizmo sąsajos su Alzheimerio liga
Interleukinas 1 (IL1) – uždegimimo mediatorius, sekretuojamas amiloido sankaupas supančių mikrogijos ląstelių ir astrocitų, inicijuojantis ir palai-kantis neurouždegiminius procesus. IL1 priskiriami du agonistiniu poveikiu pasižymintys citokinai – IL1α ir IL1β, kurie jungdamiesi prie specifinių membranos receptorių aktyvuoja uždegiminio atsako ląsteles [192]. Padidė-jusi IL1β koncentracija smegenų skystyje ir parenchimoje buvo nustatyta pirmomis valandomis po smegenų pažeidimo tiek žmonėms, tiek gyvūnų modeliuose [13, 14]. Be to, įrodytas ir IL1 vaidmuo neurodegeneracijai. IL1 didina APP sintezę mitochondrijų RNR endotelio ląstelėse, yra tiesiogiai susijęs su Aβ plokštelių formavimusi [15]. Astrocituose IL1 indukuoja IL6 gamybą, stimuliuoja azoto oksido sintazių aktyvumą, sustiprina neuronų acetilcholinesterazės veikimą, skatina mikroglijos aktyvaciją ir papildomo IL1 išsiskyrimą, astrocitų aktyvaciją – lemia save palaikantį uždegimo proce-sų ciklą [16, 193].
Manoma, kad interleukino 1 genų ekspresija taip pat įtakoja neurodege-neraciją ir amiloido metabolizmą per mikroglijos aktyvaciją, neurouždegi-minį procesą [19, 194]. Interleukino 1 alfa genas yra 2 chromosomos ilgajame petyje (1.3.2 pav.).
28
Sąsajos tarp Alzheimerio ligos rizikos ir IL1α -889C>T polimorfizmo analizuotos skirtinguose regionuose, įvairiose etninėse grupėse. Rezultatai išlieka prieštaringi. Keletoje tyrimų nustatyta, kad IL1α -889 T alelis yra susijęs su didesne AL rizika [195–197]. Tačiau pateikiama ir neigiamų rezul-tatų, kad IL1α -889C>T polimorfizmas AL rizikos reikšmingai neįtakoja [198, 199]. Dviejose meta-analizėse buvo nustatytos reikšmingos IL1α -889C>T polimorfizmo sąsajos su AL tik Europidų rasės, bet ne azijiečių kilmės, tiriamiesiems [200, 201]. Yra duomenų, kad IL1α -889C>T polimor-fizmas skirtingai pasireiškia priklausomai nuo APOE ε4 genotipo [202], galimai apsprendžia skirtingą klinikinę eigą, progresavimo greitį [203]. Tačiau IL1α -889C>T polimorfizmo sąsajos su AL rizika ir progresavimu nėra pakankamai ištirtos, reikia tolesnių tyrimų, galbūt ne atskirai vertinant IL1α polimorfizmo reikšmę, bet ieškant genetinių rizikos veiksnių derinių.
1.3.3. Interleukino 6 -174 nukleotido polimorfizmo sąsajos su Alzheimerio liga
Interleukinas 6 (IL6) yra už keletą funkcijų atsakingas citokinas, atlie-kantis svarbų apsauginį vaidmenį reguliuojant uždegiminį atsaką, pasi-žymintis tiesioginiu ir netiesioginiu neurotrofiniu poveikiu neuronams [16]. IL6 skatina astrogliozę, aktyvuoja mikroglijos ląsteles, stimuliuoja ūminės fazės uždegiminių baltymų produkciją [15–17], gali indukuoti neuronų diferenciaciją [204]. IL6 siejamas su Alzeimerio liga, nes IL6 suaktyvėjimas stebimas AL pacientams tiek periferinėje, tiek centrinėje nervų sistemoje [205, 206].
IL6 genas lokalizuojasi 7 chromosomos trumpajame petyje (1.3.3 pav.).
1.3.3 pav. 7 chromosoma ir IL6 geno lokalizacija (https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IL6)
In vitro tyrimuose nustatyta, kad padidėjusi IL6 geno ekspresija aktyvina
29
su pažinimo funkcijų neturinčiais asmenimis [210]. Tačiau kai kuriuose tyrimuose reikšmingų sąsajų su AL rizika nenustatyta [197, 211]. Licastro F. su kolegomis, tyrime, kuriame dalyvavo 332 AL pacientai ir 393 kontrolinės grupės tiriamieji, nustatė, kad IL6 -174 C/C genotipas susijęs su didesne rizika sirgti AL [212]. Kol kas nepakanka tyrimais pagrįstų įrodymų dėl IL6 -174G>C polimorfizmo reikšmės Alzheimerio ligai [197]. Dar mažiau analizuotos IL6 -174G>C sąsajos su APOE ε4 polimorfizmu vertinant AL riziką. Nors ir buvo stebėta, kad IL6 -174G>C polimorfizmas lemia kluste-rino, kuris susijęs su AL rizika ir Tau/Aβ santykiu, koncentracijos smegenų skystyje pokyčius [213], nepakanka įrodymų IL6 veikimo mechanizmui AL patogenezėje ir ryšiui su amiloido kaskada bei Tau patologija paaiškinti.
30
2. METODIKA
Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų (toliau – Kauno klinikos) Neurologijos klinikoje 2009–2018 m.
Tyrimas pradėtas Lietuvos mokslo tarybos (LMT) projekto (AUT-15/2010) „Patogeninių beta-amiloido oligomerų detekcija Alzheimerio ligos diagnos-tikai (AMILOIDE)“, vėliau LMT projekto „Molekuliniai Alzheimerio ligos patogenezės mechanizmai (MALPAMA)“ projekto (LIG-04/2012) tyrimo rėmuose (Kauno regioninio biomedicinos tyrimų etikos komiteto leidimas Nr. P1-71/2010, išduotas 2011-12-12). Disertaciniam tyrimui tęsti buvo gautas Kauno regioninio biomedicinos tyrimų etikos komiteto leidimas (2017-12-19, Nr. BE-2-47, papildymas 2018-03-22, Nr. P1-BE-2-47/2017) bei Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos leidimas atlikti asmens duomenų tvarkymo veiksmus (2018-04-10, Nr. 2R-2603 (2.6-1.)).
Alzheimerio ligai būdingų biožymenų iš kraujo ir smegenų skysčio laboratoriniai tyrimai atlikti Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikos Klinikinės chemijos ir genetikos sekt. laboratorijoje (prof. dr. Astra Vitkaus-kienė, gyd. Rasa Steponavičiūtė).
Uždegimo mediatorių nukleotidų, apolipoproteino E (APOE) genotipa-vimas atliktas Kauno klinikų Genetikos ir molekulinės medicinos klinikoje (doc. dr. Virginija Ašmonienė, dr. Laimutis Kučinskas, klinikinė chemikė Rima Vainorienė, medicinos biologė asistentė Inga Valančiūtė).
2.1. Tiriamųjų grupės
31
2.1.1 lentelė. Įtraukimo ir neįtraukimo į tyrimą kriterijai
Įtraukimo kriterijai Neįtraukimo kriterijai
Bendri:
1. Amžius nuo 50 m. iki 90 m. 2. Gera funkcinė ir somatinė būklė. 3. Sutikimas dalyvauti tyrime.
Bendri:
1. Aktyvus uždegiminis procesas (ūmi ar aktyvi lėtinė infekcinė ar autoimuninė liga).
2. Sunki somatinė būklė (išplitusi onkologinė liga, dekompensuotas širdies, inkstų ar kepenų funk-cijos nepakankamumas ir kt.).
3. Išreikštas psichikos sutrikimas (šizoafektiniai sutrikimai, sunki depresija, priklausomybės). 4. Pastovus ir / ar ilgalaikis pažinimo funkcijas
veikiančių medikamentų vartojimas.
5. Grubus neurologinis deficitas (regos sutrikimas, afazija, parezė, ryški ataksija, išreikšta ekstra-piramidinė simptomatika).
6. Paciento / jo atstovo nesutikimas dalyvauti tyrime.
Alzheimerio ligos (AL) grupė:
− Nustatyta sporadinė tikėtina AL, remiantis diagnostikos kriterijais. − MMSE įvertis 24 balai ir mažiau. − Pažinimo funkcijų sutrikimas
prog-resuoja.
Alzheimerio ligos (AL) grupė:
− Įgimtas pažinimo funkcijų sutrikimas (nepakan-kamumas).
− Antrinis pažinimo funkcijų sutrikimas (dėl hipo-tireozės, vit. B12 stokos, kitos CNS patologijos,
depresijos ar kt. ligų).
Kontrolinė (K) grupė:
− Pažinimo funkcijos nesutrikę (MMSE įvertis 25–30 balų). − Savarankiškas kasdienėje veikloje.
Kontrolinė (K) grupė:
− Įtariama / nustatyta uždegiminė ar neurodegene-racinė nervų sistemos liga (PL, AL, FTD, IS ir kt.).
Pagal amžių Alzheimerio ligos diagnozės nustatymo metu, AL grupės tiriamieji buvo išskirti į du pogrupius – ankstyvos pradžios Alzheimerio ligos (APAL) ir vėlyvos pradžios (VPAL) Alzheimerio ligos pacientai. Ankstyvos pradžios AL diagnozė nustatoma asmenims, susirgusiems Alzheimerio liga iki 65 m., vėlyvos pradžios AL – susirgusiems 65 m. amžiaus ir vyresniems. Pagal pažinimo funkcijų ir kasdienės veiklos sutrikimo sunkumą, AL grupės tiriamieji buvo skirstomi į lengvo (lengva AL), vidutinio (vidutinė AL) ir sunkaus (sunki AL) sutrikimo grupes. Lengvos AL grupei priklausė pacientai, kurių Protinės būklės mini tyrimo (MMSE, angl. Mini Mental State
Exami-nation) įvertis buvo 20–24 balų, o Blesedo demencijos skalės (BDS) įvertis
32
Visi tiriamieji buvo europidų rasės Lietuvos piliečiai, ilgą laiką nuola-tinai gyvenantys Lietuvos Respublikoje, laisvai kalbantys ir skaitantys lietu-vių kalba. Didžioji dalis tiriamųjų buvo lietulietu-vių tautybės.
2.2. Tyrimo schema ir pacientų ištyrimo metodai
Disertaciniam darbui suplanuotas atvejo kontrolės tyrimas, kuriame išskirti trys pagrindiniai etapai: 1) Tiriamųjų atranka ir įtraukimas į tyrimą; 2) Tiriamųjų apklausa ir ištyrimas, mėginių paėmimas; 3) Genotipavimas, biožymenų koncentracijos tyrimas ir duomenų analizė. Tyrime taip pat buvo numatyta stebėti AL ir kontrolinės grupės asmenis 6–24 mėn. laikotarpiu. Tiriamieji buvo kviečiami pakartotinam vizitui, kurio metu dinamikoje vertinti nusiskundimai, papildoma anamnezė (išryškėję naujos būklės ar ligos), neurologinė simptomatika, pažinimo funkcijos, aptarti atliktų tyrimų rezultatai.
2.2.1. Tiriamųjų atranka ir įtraukimas į tyrimą
Pacientai, kurie buvo tiriami ir gydomi Kauno klinikų NSLAS ar hospi-talizuoti į Neurologijos skyrių, atitinkantys įtraukimo kriterijus, su gydančio gydytojo sutikimu ir pritarimu, buvo įtraukiami į tyrimą, asmeniškai pakvie-čiant ir supažindinant su tiriamojo darbo tikslu, eiga, metodais. Visi AL grupės pacientai buvo konsultuojami ir kviečiami į tyrimą dalyvaujant lydin-čiam asmeniui (paciento atstovui), dažniausiai sutuoktiniui arba vaikui. Keleto pacientų atstovais buvo asmenys, nesusiję giminystės ryšiais (draugai, kaimynai), kuomet tiriamasis tiesioginių giminaičių neturėjo arba nepalaikė ryšių. Tiriamieji taip pat informuoti ir apie galimybę pasitraukti iš tyrimo bet kuriame jo etape, bei kad gali būti sustabdytas jų dalyvavimas tyrime, paaiškėjus naujai medicininei informacijai (pvz., išryškėjus kitai patologijai, galinčiai pasireikšti ar imituoti demencijos sindromą). Gavus rašytinį tiriamo-jo sutikimą, buvo numatoma pirmotiriamo-jo vizito data ir laikas.
2.2.2. Tiriamųjų apklausa ir ištyrimas
33
vidurinio ir aukštesniojo / aukštojo išsilavinimo programas). Šeiminė anam-nezė laikyta teigiama, jei buvę patvirtintų demencijos atvejų pirmos (tėvai – broliai / seserys – vaikai) ir antros eilės (seneliai – anūkai – dėdės / tetos – sūnėnai / seserėnai) giminaičių tarpe. Bendrųjų duomenų anketoje taip pat vertinta, ar tiriamasis nurodo subjektyvų pažinimo funkcijų sutrikimą, kiek laiko jis vargina, ar atžymi miego sutrikimą.
Standartinio neurologinės būklės vertinimo metu objektyvizuota židininė ir ekstrapiramidinė simptomatika. Siekiant ekskliuduoti pacientus su pseudodemencija, kuomet psichikos ligos ar sindromai imituoja demenciją, visus AL grupės tiriamuosius konsultavo gydytojas psichiatras ir medicinos psichologas.
Pažinimo funkcijos vertintos pirmoje dienos pusėje, išlaikant sąlygą, kad 30–90 min. iki neuropsichologinių testų taikymo nebūtų atliekamos kitos diagnostinės procedūros ar išplėstinės konsultacijos. Vertinimui taikyti standartizuoti testai ir klausimynai:
− Protinės būklės mini testas (angl. Mini Mental State Exam, MMSE) – nuo 0 iki 30 balų skalėje vertinamos pagrindinės pažinimo funkcijos – orientacija, atmintis, dėmesys, konstrukcinis praksis, kalba;
− laikrodžio piešimo testas (angl. Clock Drawing Test, CDT) – verti-namas balais, nuo 0 iki 4, skiriant po vieną balą už kiekvieną teisingai nupieštą laikrodžio komponentą (apskritimą, skaičius, skaičių seką, rodykles tinkamoje padėtyje);
− skaičių sujungimo testo A dalis (angl. Trail Making Test A, TMTA) – regos–motorinių procesų greičio tyrimas, vertinamas laikas, per kurį atliekama užduotis (sek.);
− raidės ir kategorijos sklandumo testas naudotas kalbos sklandumo tyrimui, atskirai įvertinant per 1 min. išvardintų žodžių, praside-dančių raide P, bei gyvūnų pavadinimų skaičių (žodžiai / min.). AL grupės pacientams buvo atliekamas kasdienės veiklos, įgūdžių, asmenybės pokyčių tyrimas, taikant Blessedo demencijos skalę. Vertinta balais nuo 0 iki 28, kur didesnis balų skaičius atspindi labiau išreikštą sutrikimą.
Depresinei simptomatikai įvertinti, taikyta Geriatrinės depresijos skalės trumpoji versija (GDS), kur balų suma didesnė nei 5 balai reiškia galimą depresiją, daugiau nei 10 balų – depresiją. Asmenys, surinkę 10 ir daugiau balų buvo papildomai nukreipti psichiatro konsultacijai, detalesniam ištyri-mui dėl pseudodemencijos ir depresijos gydymo, arba neįtraukti į tyrimą.
34
ir stenozių lokalizaciją, laipsnį. Asmenys, kuriems nustatyta arterijos stenozės virš 70 proc. vienoje iš magistralinių arterijų (vidinėse miego arterijose, slankstelinėse arterijose), nebuvo įtraukti į tyrimą.
2.2.3. Kraujo mėginių paėmimas
Alzheimerio ligos ir kontrolinės grupės tiriamiesiems buvo paimti veninio kraujo mėginiai apolipoproteino E (APOE) ir uždegimo mediatorių (TNFα, IL1α, IL6) genų polimorfizmo tyrimui. Vienkartinę periferinės venos (vidurinė alkūnės vena, vena cubiti medialis) punkciją atliko Neurologijos klinikos medicinos slaugytoja, laikantis reglamentuotų procedūros atlikimo metodikos reikalavimų. Paimti trys kraujo mėginiai (iš viso 15 ml kraujo):
− du vakuuminiai mėgintuvėliai su etilendiamintetraacetatu (EDTA, violetiniu kamšteliu, 5 ml talpos) DNR tyrimui;
− vienas vakuuminis mėgintuvėlis be priedų (raudonu kamšteliu, 5 ml talpos), amiloido beta 1-40 peptido (Aβ1-40) koncentracijos kraujo serume (KS) tyrimui. Kraujo mėginys Aβ1-40 tyrimui, centrifuguo-tas kambario temperatūroje 15 min. 4700 aps./min. (2200 g), gaucentrifuguo-tas serumas padalintas į du Ependorf tipo polipropileno mėgintuvėlius (2 ml talpos), užšaldytas ir saugotas – (36–40) ºC temperatūroje, specialiai pritaikytoje patalpoje Neurologijos klinikoje.
2.2.4. Juosmeninė punkcija ir smegenų skysčio mėginių paėmimas Juosmeninė punkcija ir smegenų skysčio (SS) tyrimas – invazinė proce-dūra, ir buvo atliekamas tik tiems AL ir kontrolinės grupės tiriamiesiems, kuriems jis buvo reikalingas diferencinei diagnostikai ar gydymo tikslu, paaiškinus procedūros eigą, riziką, galimus nepageidaujamus reiškinius ar komplikacijas, gavus rašytinį sutikimą procedūrai atlikti. Juosmeninė punkci-ja buvo atliekama Kauno klinikų Neurologijos skyriuje, gydytojo neurologo, pirmoje dienos pusėje (10–14 val.), laikantis reglamentuotos procedūros atlikimo metodikos, prieš tai įvertinus paciento bendrą būklę (temperatūrą, arterinį kraujo spaudimą, pulsą, kvėpavimo dažnį). Steriliai paruošus lauką, vietinėje Sol. Lidocaini 1 proc. – 2 ml nejautroje, 20G 0,9 × 90 mm spinaline punkcine adata punktuota L3 / L4 tarsplanksteliniame tarpe, paimti keturi SS mėginiai (kiekvienas po 1 ml, iš viso 4 ml):
35
− du mėginiai į Ependorf tipo polipropileno mėgintuvėlius (2 ml talpos), skirti Alzheimerio ligos biožymenų (Aβ1-42, bTau, fTau) tyrimui. Šie mėginiai užšaldyti ir saugoti – (36–40) ºC tempe-ratūroje, specialiai pritaikytoje patalpoje Neurologijos klinikoje. Po procedūros buvo prašoma pagulėti kelias valandas ir rekomenduota per pirmąsias 12–24 val. vartoti daugiau skysčių, siekiant išvengti galimo popunkcinio galvos skausmo.
2.3. Alzheimerio ligai būdingų biožymenų koncentracijos semegenų skystyje ir kraujo serume tyrimas
Alzheimerio ligai būdingų biožymenų tyrimui panaudoti šaldyti KS ir SS mėginiai. Jie buvo atitirpinti kambario temperatūroje ir pakartotinai nebeuž-šaldyti. Biožymenų koncentracija tirta imunofermentiniu ELISA (angl.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) metodu pagal gamintojo nurodytą
tyrimo protokolą. Biožymenų koncentracija matuota pg/ml.
2.3.1. Amiloido beta 1-42 peptido koncentracijos smegenų skystyje nustatymas
36
2.3.1.1 pav. Kalibracinė amiloido beta 1-42 peptido kreivė
2.3.2. Bendro Tau baltymo koncentracijos smegenų skystyje nustatymas
37
2.3.2.1 pav. Kalibracinė bendro Tau baltymo kreivė
2.3.3. Fosforilinto Tau baltymo koncentracijos smegenų skystyje nustatymas
Fosforilinto Tau baltymo (fTau) koncentracijos smegenų skystyje nu-statymui naudotas rinkinys INNOTEST PHOSPHO-TAU(181P) (Fujirebio, Belgija). Naudotos 96 šulinėlių ELISA plokštelės, dengtos monokloniniu antikūnu (HT7). Šulinėliai papildyti po 25 µl konjugato (su anti – fosfo – Tau (181P) antikūnais, AT270Bio) ir padengti skirtingų koncentracijų kalibraci-niais tirpalais (fosfo – Tau (181P) baltymo), teigiama ir neigiama kontrole bei tiriamųjų smegenų skysčio mėginiais (po 75 µl), kiekvieną mėginį kartojant po du kartus, inkubuoti 14–18 val. 2–8 ºC temperatūroje. Penkis kartus pra-plovus 400 μl plaunančiuoju buferiu, papildyti 100 μl konjugato su peroksi-daze žymėtu streptovidinu ir 60 min. inkubuoti kambario temperatūroje. Šulinėliai kartotinai penkis kartus praplauti 400 μl plaunančiuoju buferiu, ir tamsoje 30 min. inkubuoti su 100 μl substrato tirpalo (su TMB) kambario temperatūroje. Imunofermentinė reakcija sustabdyta užpylus kiekvieną šuli-nėlį 50 μl sieros rūgšties tirpalo (0,9N H2SO4). Mėginių optinis tankis nusta-tytas 15 min. bėgyje mikroplokštelių skaitytuvu (BioTek Elx800, Bio-Tek
Instruments, Vokietija), naudojant 450 nm bangos ilgį. Tikroji fosforilinto
Tau baltymo koncentracija smegenų skystyje nustatyta remiantis kalibracine kreive (2.3.3.1 pav.), pažymėjus kreivėje mėginio optinį tankį sužinota tiria-mosios medžiagos koncentracija. Gamintojo nurodyta ribinė vertė (cut-off
38
2.3.3.1 pav. Kalibracinė forforilinto Tau baltymo kreivė
2.3.4. Amiloido beta 1-40 peptido koncentracijos kraujo serume nustatymas
Amiloido beta 1-40 (Aβ1-40) peptido koncentracija kraujo serume nusta-tyta taikant Amyloid-beta (1-40) High Sensitive ELISA (IBL International, Vokietija) reagentų rinkinį, pagal gamintojo protokolą. Naudotos 96 šulinėlių ELISA plokštelės, kurios padengtos specifiniu pelių monokloniniu antikūnu. Tyrimo metu naudoti skirtingų koncentracijų kalibraciniai amiloido beta 1-40 tirpalai, teigiama ir neigiama kontrolės bei praskiesti (1:16) tiriamųjų kraujo serumo mėginiai (po 100 µl). Kiekvienas tyrimas kartotas du kartus. Inkubuota 4 °C temperatūroje 14–18 val. Tuomet šulinėliai 4 kartus praplauti plaunančiuoju buferiu (bent po 350 μl), padengti 100 μl konjugato (su pelės monokloniniais antikūnais prieš Aβ1-40, klonas: 82E1) ir inkubuoti 60 min. 4 °C temperatūroje. Šulinėliai kartotinai penkis kartus praplauti 350 μl plau-nančiuoju buferiu, ir inkubuoti su substrato (TMB) tirpalu (100 μl) kambario temperatūroje 30 min. Imunofermentinė reakcija sustabdyta užpylus kiekvie-ną šulinėlį 100 μl sieros rūgšties tirpalo (1N H2SO4). Mėginių optinis tankis nustatytas 30 min. bėgyje mikroplokštelių skaitytuvu (BioTek Elx800,
Bio-Tek Instruments, Vokietija), naudojant 450 nm bangos ilgį. Tikroji Aβ1-40
39
2.3.4.1 pav. Kalibracinė amiloido beta 1-40 peptido kreivė
2.4. Dezoksiribonukleino rūgščių išskyrimas ir genų polimorfizmo tyrimas
2.4.1. Dezoksiribonukleino rūgščių išskyrimas
Dezoksiribonukleino rūgštys (DNR) išskirtos iš periferinio kraujo limfo-citų atomatiniu silikagelio kolonėliniu metodu, naudojant komercinį standar-tinį DNR išskyrimo rinkinį QIAmp®DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Vokie-tija), pagal gamintojo rekomendacijas ir protokolus, taikant QIAcube išskyri-mo robotą. DNR išskyriišskyri-mo laikas 30–60 min. Gautas DNR kiekis iki 60 µg/ml. DNR koncentracija išmatuota spektrofotometru „QIAxpert“ sistema (Qiagen, Vokietija). DNR, RNR, oligonukleotidų ir mononukleotidų kiekis nustatytas „AE“ eliucijos tirpale, matuojant tirpalo absorbciją (optinį tankį) ultraviole-tinių bangų ilgyje. Nukleino rūgštys nustatytos panaudojant 260 nm bangos ilgio spindulius. Baltyminės tirpalo priemaišos įvertintos matuojant santykį bangos ilgių prie 260 nm ir 280 nm.
2.4.2. Tumoro nekrozės faktoriaus alfa -850C>T polimorfizmo tyrimas
40
tyrimo metodu (RFIP). Galimi TNFα -850C>T genotipo variantai – C/C, C/T, T/T. Naudoti TNFα -850 pradmenys:
a) tiesioginis (T) – 5’-TCG AGT ATC GGG GAC CCC CCG TT-3’; b) atvirkštinis (A) – 5’-CCA GTG TGT GGC CAT ATC TTC TT-3’
(Integrated DNA Technologies, IDT, Belgija).
Pradiniame etape atlikta PGR amplifikacija, naudotas reagentų rinkinys
HotStart Taq Master Mix (Qiagen, Vokietija), pagal gamintojo
rekomenda-cijas. Mišinio sudėtis vienai reakcijai (galutinis reakcijos tūris 30 µl): − HotStart Taq Master Mix (Qiagen, Vokietija) – 23 µl; − Pradmuo TNFα T – 1 µl (10 µM);
− Pradmuo TNFα A – 1 µl (10 µM); − DNR (20 ng/µl) – 5 µl.
Amplifikacija vykdyta pagal programą, pateiktą 2.4.2.1 lentelėje.
2.4.2.1 lentelė. PGR amplifikacijos programa TNFα -850C>T polimorfizmo nustatymui
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
95 ºC 15 min. 1
94 ºC 45 sek. 35
60 ºC 30 sek.
72 ºC 45 sek.
72 ºC 5 min. 1
Amplifikuotas PGR produktas buvo sukarpomas greito karpymo HincII restriktazių pagalba (FastDigest Hinc II, Thermo Fisher Scientific, Didžioji Britanija, konc. 10 U/µl, restrikcijos seka GTT▲AAC). Esant C aleliui, PGR pagausintą produktą fermentas kerpa į du fragmentus – 105 bp ir 23 bp. Esant T aleliui, pagausintas DNR fagmentas liko 128 bp ilgio (nesukarpytas). Atliekant karpymą PGR-RFIP metodu, reakcija vyko 37 ºC temperatūroje 4 val., naudojant 10μl PGR produkto. Gauti fragmentai buvo vizualizuojami 4 proc. agarozės gelyje elektroforezės būdu (100 V, 60 min.), dažant etidžio bromidu, naudojant elektroforezės indo maitinimo šaltinį „Biorad Power Pac
1000“ (BioRad Laboratories, Hercules, CA, JAV). Gelis vizualizuotas ir
41
2.4.2.1 pav. TNFα -850C>T genotipo vizualizavimas elektroforezės būdu
2.4.3. Interleukinų IL1α -889C>T ir IL6 -174G>C polimorfizmo tyrimas
Interleukinų IL1α -889C>T (rs1800587) ir IL6 -174G>C (rs1800795, Introno tipo) genotipavimas atliktas tikro laiko PGR (TL-PGR) metodu. Nau-dotas TL-PGR rinkinys Type-it Fast SNP Probe PCR Kit (Qiagen, Vokietija) bei nukleotidų pradmenys ir zondai (TaqMan ®, ThermoFischer Scientific, Didžioji Britanija). Pradmenų sekos:
a) IL1α -889C>T (rs1800587) – GAT TTT TAC ATA TGA GCC TTC AAT G[A/G]T GTT GCC TGG TTA CTA TTA TTA AAG (TaqMan ®, ThermoFischer Scientific, Didžioji Britanija); galimi IL1α -889 genotipo variantai – C/C, C/T, T/T.
b) IL6 -174G>C (rs1800795) – ACT TTT CCC CCT AGT TGT GTC TTG C[C/G]A TGC TAA AGG ACG TCA CAT TGC ACA (TaqMan ®, ThermoFischer Scientific, Didžioji Britanija); galimi IL6 genotipo variantai – G/G, G/C, C/C.
Į Ependorf tipo mėgintuvėlį (laikant šaltai, ant šaldomo blokelio) buvo ruošiamas TL-PGR mišinys reikiamam mėginių skaičiui – tiriami mėginiai ir kontroliniai mėginiai (neigiama kontrolė – vanduo). Mišinio sudėtis vienai reakcijai:
