LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
MEDICINOS FAKULTETAS
LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS
Žiedė Daubarienė
MIKROORGANIZMŲ IDENTIFIKAVIMO TIESIOGIAI IŠ TEIGIAMOS
KRAUJO PASĖLIO TERPĖS MASIŲ SPEKTROMETRIJOS BŪDU IR
MIKROBIOLOGINIO PASĖLIO METODU REZULTATŲ PALYGINIMAS
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas
prof. dr. A. Vitkauskienė
2
TURINYS
SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 8 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 9 SANTRUMPOS ... 10 ĮVADAS ... 12DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 14
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 15
1.1. Kraujo infekcijos. Dažniausi sukėlėjai. ... 15
1.2. Mikroorganizmų aptikimo kraujyje svarba ... 16
1.3. Mikroorganizmų aptikimo kraujyje galimybės ... 17
1.4. Kraujo pasėlis. Automatizuotos sistemos ... 18
1.5. Veiksniai, įtakojantys kraujo pasėlio rezultatus ... 20
1.6. Bakterijų identifikavimo metodai ... 21
1.6.1. Fenotipinė identifikacija ... 21
1.6.2. Imunologiniai metodai ... 22
1.6.3. Genotipinė (molekulinė) identifikacija ... 23
1.7. Masių spektrometrija ... 24
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 28
2.1. Tiriamoji grupė, tyrimo organizavimas ... 28
2.2. Mikroorganizmų identifikavimas su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu ... 29
2.2.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas ... 29
2.2.2. Matavimo ir kitos priemonės, tyrimų įrenginiai... 29
2.2.3. Reagentai, mitybos terpės ... 29
2.2.4. Tyrimo metodikos aprašymas ... 30
2.2.5. Rezultatų įvertinimas ... 31
2.3. Mikroorganizmų identifikavimas tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies su MALDI biotipavimo sistema ... 31
2.3.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas ... 31
2.3.2. Matavimo ir kitos priemonės, tyrimų įrenginiai... 31
2.3.3. Reagentai, mitybos terpės ... 32
2.3.4. Tyrimo metodikos aprašymas ... 32
3
2.4. Statistinė duomenų analizė ... 33
3. REZULTATAI ... 34
3.1. Tiriamosios grupės charakteristikos ... 34
3.2. Mikroorganizmų identifikavimas su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu ... 35
3.3. Mikroorganizmų identifikavimas tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies su MALDI biotipavimo sistema ... 38
3.4. Mikrooganizmų identifikavimo tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos būdu ir mikrobiologinio pasėlio metodu rezultatų palyginimas ... 39
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 42
IŠVADOS ... 45
4
SANTRAUKA
Baigiamojo magistro darbo autorius – Žiedė Daubarienė
Baigiamojo magistro darbo pavadinimas - MIKROORGANIZMŲ IDENTIFIKAVIMO TIESIOGIAI IŠ TEIGIAMOS KRAUJO PASĖLIO TERPĖS MASIŲ SPEKTROMETRIJOS BŪDU IR MIKROBIOLOGINIO PASĖLIO METODU REZULTATŲ PALYGINIMAS
Darbo tikslas: įvertinti mikroorganizmų identifikavimo tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos būdu ir mikrobiologinio pasėlio metodu rezultatus.
Uždaviniai:
1. Išskirti ir identifikuoti mikroorganizmus iš teigiamos kraujo pasėlio terpės mikrobiologinio pasėlio metodu.
2. Identifikuoti mikroorganizmus tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos metodu.
3. Palyginti mikrooganizmų identifikavimo tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos būdu ir mikrobiologinio pasėlio metodu rezultatus ir įvertinti metodų privalumus ir trūkumus.
Metodai ir tyrimo objektas. Tyrimui atrinkti tik teigiami kraujo pasėlio mėginiai, t. y. tie, kuriuose, naudojant automatizuotą kraujo pasėlio sistemą BACTECTM FX, aptinkamas
mikroorganizmų augimas. BACTECTM FX aparatui davus garsinį signalą apie teigiamą pasėlį, toliau
kraujo pasėlio mėginys tiriamas dviem metodais:
1) Mikroorganizmų identifikavimas su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu;
2) Mikroorganizmų identifikavimas tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies su MALDI biotipavimo sistema.
Duomenų analizė atlikta naudojant statistinės analizės SPSS 20 programinį paketą. Buvo naudoti aprašomosios statistikos metodai, bendrieji pasiskirstymai, dažnių lentelės, kokybinių duomenų vertinimui - Chi kvadrato (χ2) kriterijus. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.
Rezultatai. Ištirti 102 teigiami kraujo pasėlio mėginiai. Nustatyta, kad 85,3 proc. kraujo pasėlio mėginių atvejų, pranešimas apie aptiktus gyvybingus mikroorganizmus pasirodydavo per mažiau nei 24 valandas. Identifikuojant mikroorganizmus su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu ir tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies gauta, kad vyraujantys mikroorganizmai priklausė Enterobacteriaceae šeimai, atitinkamai 61,4 proc. ir 64,7 proc. 10,8 proc. teigiamų kraujo pasėlių buvo polimikrobiniai, 89,2 proc. – monomikrobiniai. Tyrimo metu nustatyta, kad 89,2 proc. atvejų, identifikuojant mikroorganizmus su MALDI biotipavimo sistema kraujo mikrobiologinio tyrimo metu ir tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies, rezultatai sutapo.
5 10,8 proc. atvejų rezultatai tarp šių metodų nesutapo, tačiau pastebėta, kad šį nesutapimą sąlygojo polimikrobinės bakteriemijos atvejai. Identifikuojant mikroorganizmus su MALDI biotipavimo sistema kraujo mikrobiologinio tyrimo metu, kraujo infekcijos sukėlėjų gali būti nustatoma vienas ir daugiau, o atliekant tiesioginę identifikaciją iš tiriamosios medžiagos iki rūšies, nustatomas tik vienas sukėlėjas, tačiau, taikant šį metodą, mikroorganizmų identifikacijos laikas po BACTECTM FX
pranešimo apie teigiamą kraujo pasėlio mėginį sutrumpėjo iki <4 val.
Išvados. Kraujo pasėlyje įprasto mikrobiologinio tyrimo metu galima nustatyti ne tik monomikrobinę, tačiau identifikuoti ir polimikrobinę infekciją. Tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės, neatlikus įprasto mikrobiologinio pasėlio, galima nustatyti daugumą patogeninių mikroorganizmų naudojant MALDI biotipavimo sistemą. Nors atliekant tiesioginį mikroorganizmų identifikavimą iš teigiamos kraujo pasėlio terpės naudojant MALDI biotipavimo sistemą, greičiau aptinkami mikroorganizmai, tačiau dalis patogenų nėra identifikuojami esant polimikrobinei infekcijai bei nenustatomas atsparumas antibiotikams, todėl šis metodas šiuo metu negali pakeisti rutininio mikrobiologinio pasėlio metodo.
6
SUMMARY
Author of Master Thesis: Žiedė Daubarienė
Full title of Master Thesis: COMPARISON OF MASS SPECTROMETRY METHOD DIRECTLY FROM POSITIVE BLOOD CULTURE BOTTLES AND CONVENTIONAL MICROBIOLOGICAL METHOD IN THE IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS
The goal of the study was to evaluate the results of the identification of microorganisms directly from the positive blood culture bottles by mass spectrometry and conventional microbiological method.
The objectives:
1. Recover and identify microorganisms from positive blood culture by conventional microbiological method.
2. Identify microorganisms directly from positive blood culture by mass spectrometry method.
3. Compare results of the identification of microorganisms directly from positive blood cultures by mass spectrometry and conventional microbiological method and evaluate the advantages and disadvantages of the methods.
Methods and the study subjects. Study involved only positive blood culture bottles. Incubation was performed in automated blood culture system BACTECTM FX, which detects the growth of microorganisms. After the BACTECTM FX has been veryfied for a positive blood culture, the culture sample is further analyzed by two methods:
1) Identification of microorganisms with the MALDI biotype system to the species level by conventional microbiological method;
2) Identification of microorganisms directly from the test substance to the species level with the MALDI biotype system.
Data analysis was performed using the statistical analysis SPSS 20 software package. Descriptive statistical methods, general partitions, frequency tables and Chi-square test were applied to compare the results obtained by both methods on the same samples. The results are considered statistically significant at p<0.05.
Results. 102 positive blood culture bottles were tested. It was found that 85.3% of blood cultures, the report of detected viable microorganisms appeared within less than 24 hours when using the BACTECTM FX. Identification of microorganisms to the species level with the MALDI biotype
system by conventional microbiological method and directly from positive blood cultures showed that most of the microorganisms belonged to the Enterobacteriaceae family, respectively 61.4% and 64.7%. 10.8% positive blood cultures were polymicrobial, 89.2% - monomicrobial. The study found
7 that 89.2% cases, the results between the methods coincided. 10.8% the results of these two methods did not coincide, but it was observed that this incompatibility was caused by cases of polymicrobial bacteremia. In identifying microorganisms with the MALDI biotype system by conventional microbiological method, one or more blood infection agents can be detected and only one agent is detected by direct identification from positive blood culture. However, using this direct method, the time of identification of microorganisms was shortened to less than 4 h after the BACTECTM FX
positive signal was detected.
Conclusions. In a blood culture during conventional microbiological examination it is possible to detect not only a monomicrobial, but also polymicrobial infection. Most of the pathogenic microorganisms can be detected using the MALDI biotype system directly from positive blood culture bottles, without the conventional microbiological method. Although the identification of microorganisms directly from positive blood culture samples by mass spectrometry take less time, but some of the pathogens are not identified in the presence of a polymicrobial infection and not performed bacterial resistance to antibiotics, so this method can not currently replace the conventional microbiological method.
8
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju savo mokslinio darbo vadovei LSMUL KK Laboratorinės medicinos klinikos vadovei profesorei Astrai Vitkauskienei už idėjas, pagalbą, vertingus patarimus ir pastebėjimus rengiant baigiamąjį magistro darbą.
9
INTERESŲ KONFLIKTAS
10
SANTRUMPOS
°C - Celsijaus laipsnis
DNR - deoksiribonukleorūgštis
ELISA - imunofermentinis tyrimo metodas (angl. enzyme−linked immunosorbent assay)
FISH - fluorescencinė in situ hibridizacija
HCCA - matrica (angl. α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)
IE - infekcinis endokarditas
JAV - Jungtinės Amerikos Valstijos
KFV - kolonijas formuojantys vienetai
LPS - lipopolisacharidas
MALDI-TOF MS - Lazerinės desorbcinės jonizacijos masių spektrometrija (angl. Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight Mass Spectrometry)
McF - makfarlandai
MRSA - meticilinui atsparus auksinis stafilokokas (angl. methicillin resistant Staphylococcus aureus)
MS - masių spektrometrija
MSK - minimali slopinanti koncentracija
PAMP - su patogenu susijusios molekulinės stuktūros (angl. pathogen-associated molecular patterns)
PGR - polimerazės grandininė reakcija (angl. polymerase chain reaction) PGR / ESI-MS - polimerazės grandininės reakcijos ir masių spektrometrijos metodų
derinys (angl. polymerase chain reaction / ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry)
PNA-FISH - peptidinių nukleorūgščių fluorescencinė in situ hibridizacija (angl. peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization)
PSO - Pasaulinė sveikatos organizacija
qPCR - kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (angl. quantitative polymerase chain reaction)
Q-TOF - kvadrupolio - skrydžio laiko masių spektrometras (angl. Quadruple - Time Of Flight)
rRNR - ribosominė ribonukleino rūgštis
SPSS - duomenų analizės paketas (angl. Statistical Package for Social Sciences)
11 TOF - skrydžio laiko masių spektrometras (angl. Time Of Flight)
UTI - šlapimo takų infekcijos (angl. urinary tract infection)
VRE - vankomicinui atsparūs enterokokai (angl. vancomycin-resistant enterococci)
12
ĮVADAS
Sepsis – žalingas sisteminis šeimininko atsakas į infekciją, sukeliantis visų organų sistemų pažeidimą [1]. Remiantis JAV Ligų kontrolės ir profilaktikos centrų informacija, kiekvienais metais atsiranda daugiau kaip 1 milijonas sepsio atvejų, o sepsis minimas kaip devinta pagrindinė su ligomis susijusių mirčių priežastis JAV [2]. Deja, tikslių duomenų apie sergamumą ir mirtingumą nuo sepsio Lietuvoje nėra [1]. Europoje sepsis pasireiškia daugiau kaip 35 proc. intensyvios terapijos skyriuje esančių pacientų [3].
Paradoksalu, tačiau medicinai pasiekus didelių laimėjimų, sepsis tapo jos pažangos sukelta liga. Įvairiose šalyse atlikti tyrimai patvirtino augantį sepsio pasireiškimo dažnį. Tai susiejama su ištobulėjusiomis medicinos technologijomis ir gydymo metodikomis. Anksčiau pacientai neišgyvendavo pagrindinės sudėtingos ligos pradinio etapo ir mirdavo nuo besivystančių tam tikrų organų sistemų nepakankamumo. Dabar gyvybei pavojingų būklių ir ligų atvejais (didelio nukraujavimo, politraumos, atgaivinus, kai gyvybinės funkcijos išnykusios) pacientai gauna tinkamą gydymą, tačiau vėliau ligos eiga dažnai komplikuojasi infekcinėmis komplikacijomis, sepsiu su dauginiu organų funkcijų sutrikimu [4].
Kraujo infekcijos yra pagrindinė sepsio priežastis, kuri kasmet Europoje paveikia apie 1,2 mln. žmonių [5]. Kraujo infekcijų patvirtinimas ir gydymas priklauso nuo kraujo pasėlio rezultatų. Kraujo pasėlis apibūdinamas kaip auksinis standartas aptinkant ir identifikuojant mikroorganizmus, sukeliančius kraujo infekciją [6]. Ankstyvas infekcijos sukėlėjų atpažinimas yra raktas į veiksmingą sepsio gydymą [7]. Kumar su bendraautoriais [8, 9] nustatė, kad pirmosios 24 h yra svarbiausios siekiant efektyvaus antimikrobinio gydymo. Kiekviena uždelsta valanda pradėti tikslingą gydymą antibiotikais praėjus 6 h nuo infekcijos pradžios, susijusi su 7,6 proc. sumažėjusiu išgyvenamumu, o netinkamų antibiotikų vartojimas susijęs su maždaug penkis kartus mažesniu išgyvenamumu. Dėl to gydytojai ligoniams, kuriems įtariama bakterinė infekcija, iš pradžių empiriškai paskiria plataus spektro antibiotikus. Tačiau, dėl padidėjusio mikroorganizmų atsparumo antibiotikams dažnio, apie 20 proc. sepsinio šoko pacientų iš pradžių paskiriamas netinkamas gydymas antibiotikais, ko pasėkoje didėja mirštamumas [9, 10]. Todėl, technologijos, kurios sutrumpintų kraujo infekcijos sukėlėjo nustatymo laiką, yra gyvybiškai svarbios šių pacientų mirštamumo mažinimui.
Lazerinės desorbcinės jonizacijos masių spektrometrija (angl. Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight Mass Spectrometry) (MALDI-TOF MS) rutiniškai naudojama bakterijų ir grybelių identifikacijai iš izoliuotų kolonijų daugelyje Europos sveikatos centrų, vis dažniau Šiaurės Amerikoje bei kitur [11-13]. Ši technologija sukuria būdingus masių spektrus, kurie yra unikalūs kiekvienam mikroorganizmui [14]. Palyginti su standartiniu fenotipiniu identifikavimu, ši technologija yra greita, nebrangi (po pradinio prietaiso įsigijimo) ir gali identifikuoti ant kietųjų
13 mitybinių terpių išaugusias mikroorganizmų kolonijas iki rūšies [15, 16]. Tačiau, naudojant šį metodą, išauginti mikroorganizmus ant kietųjų terpių vidutiniškai užtrunka papildomas 18-24 h po automatizuotos kraujo pasėlio sistemos signalo apie teigiamą kraujo pasėlio mėginį [17].
Naujausi tyrimai aprašo sėkmingą ir greitą mikroorganizmų rūšių identifikaciją tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės naudojant MALDI-TOF masių spektrometriją [18-20]. Šiai tiesioginei identifikacijai nebėra reikalingas mikroorganizmų auginimo etapas ant kietųjų mitybinių terpių. Pažymėtina, kad dėl greitesnių mikroorganizmų identifikavimo technologijų, žymiai sutrumpėja kraujo infekcijos sukėlėjo identifikavimui reikalingas laikas, gali būti optimizuojamas ankstyvas tinkamų antimikrobinių medžiagų vartojimas, tuo pačiu sumažinant buvimo ligoninėje laiką ir su tuo susijusias išlaidas [21, 22].
Didėjantis kraujo infekcijos sukėlėjų atsparumas antibiotikams dėl empirinio jų vartojimo bei pacientų mirštamumas dėl neveiksmingo gydymo yra aktuali medicinos, ekonominė ir socialinė problema. Siekiant sutrumpinti mikroorganizmų identifikacijos laiką, kad būtų kuo greičiau atlikta reikalinga antibiotikograma, paskirtas tikslingas gydymas antibiotikais ir sumažintos atsparių mikroorganizmų atsiradimo ir plitimo galimybės, atliktas tyrimas, įvertinantis MALDI-TOF masių spektrometrijos efektyvumą mikroorganizmų identifikavimui tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės.
14
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti mikroorganizmų identifikavimo tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos būdu ir mikrobiologinio pasėlio metodu rezultatus.
Uždaviniai:
1. Išskirti ir identifikuoti mikroorganizmus iš teigiamos kraujo pasėlio terpės mikrobiologinio pasėlio metodu.
2. Identifikuoti mikroorganizmus tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos metodu.
3. Palyginti mikrooganizmų identifikavimo tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės masių spektrometrijos būdu ir mikrobiologinio pasėlio metodu rezultatus ir įvertinti metodų privalumus ir trūkumus.
15
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Kraujo infekcijos. Dažniausi sukėlėjai.
Infekcija – tai uždegiminis atsakas į vieną ar daugiau mikroorganizmų. Kraujyje yra daug antimikrobiškai veikiančių medžiagų, tokių kaip leukocitai, lizosomos, imunoglobulinai ir komplementas, kurie sunaikina ir pašalina į kaują patekusius mikroorganizmus per trumpą laiką. Tačiau tais atvejais, kai makroorganizmo gynybiniai procesai pažeisti ir mikroorganizmai juos įveikia, išsivysto sisteminė infekcija. Mikroorganizmai į kraują gali patekti iš organizme esančio infekcinio židinio, nuo pažeistų gleivinių ar odos, kurios yra kolonizuotos normalios organizmo mikrofloros ar tiesiogiai į kraujotaką įvedant infekuotą medžiagą. Mirštamumas susijęs su infekciją sukėlusio mikroorganizmo tipu ir su makroorganizmo gretutinių ligų sunkumu. Kraujo infekcijas gali sukelti bakterijos (bakteriemija) ar grybeliai (fungemija). Sąvokos „bakteriemija“ ir „fungemija“ apibrėžiamos gyvybingų bakterijų ir grybelių buvimu kraujyje [23-25]. Bakteriemija gali būti laikinoji, periodinė arba nuolatinė. Laikinoji bakteriemija trunka keletą minučių ar kelias valandas, dažniausiai atsiranda po kontakto su nesteriliomis kūno vietomis, pavyzdžiui: dantų procedūrų metu, po virškinimo trakto biopsijos, po perkutaninės kraujagyslių, šlapimo pūslės ar bendro tulžies latako kateterizacijos ir atlikus procedūras, susijusias su užteršta arba kolonizuota oda ir (arba) gleivinės paviršiais, taip pat prasidėjus ūminei bakterinei infekcijai. Periodinė bakteriemija apibrėžiama kaip bakteriemija dėl to paties mikroorganizmo, kuris su pertaukomis diagnozuojamas tam pačiam pacientui. Dažnai siejama su uždaros organizmo erdvės infekcija, tokia kaip pilvo arba minkštųjų audinių abscesai, taip pat gali pasireikšti pacientams, sergantiems kepenų abscesu, cholangitu ir židininėmis infekcijomis, įskaitant pneumoniją ir osteomielitą [26, 27]. Nuolatinė bakteriemija yra būdinga infekciniams endokarditams (IE) ir kitoms intravaskulinėms infekcijoms, tokioms kaip kraujagyslių ligos, mikozinė aneurizma ar infekuotas trombas [28]. Nuolatinė bakteriemija taip pat atsiranda ankstyvose sisteminės bakterinės infekcijos stadijose, pavyzdžiui, bruceliozės ir vidurių šiltinės metu. Klinikinėje praktikoje bakteriemija gali varijuoti nuo savarankiškos infekcijos iki gyvybei gresiančios septicemijos, kuriai reikalingas greitas ir racionalus antimikrobinis gydymas [29].
Kraujo infekcijos paprastai klasifikuojamos į visuomenėje įgytas ir hospitalines infekcijas [30]. Visuomenėje įgyta kraujo infekcija – simptomai atsiradę, nebūnant gydymo įstaigoje arba simptomai, pasireiškę per pirmas dvi ligoninėje praleistas dienas, o hospitalinės kraujo infekcijos simptomai pasireiškia trečią parą (po 48 h) ir vėliau atvykus į ligoninę [31]. Visuomenėje įgytų infekcijų sukėlėjai dažniausiai yra Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus ir Escherichia coli [32]. Hospitalinių, su sveikatos priežiūra susijusių, infekcijų sukėlėjai priklauso nuo tos ligoninės epidemiologinės situacijos. Ligoninėje įgytos kraujo infekcijos siejamos su didesniu vaistams atsparių
16 mikroorganizmų, tokių kaip meticilinui atsparaus auksinio stafilokoko (MRSA) (angl. methicillin resistant Staphylococcus aureus), dažniu [33].
Europos tyrimai rodo, kad iš visų bakterijų sukeliančių bakteriemijas, 44-48 proc. yra gramneigiami ir 44-49 proc. gramteigiami mikroorganizmai [34, 35]. Daugiau nei 95 proc. visų kraujo infekcijų sukelia tik 15 skirtingų bakterijų rūšių. Stafilokokai ir E. coli sukelia daugiau kaip 50 proc. infekcijų [36]. Nustatyta, kad S. aureus, S. pneumoniae ir E. coli yra dažniausiai išskirti ligos sukėlėjai, siejami su kraujo infekcijomis visame pasaulyje [37].
S. aureus bakteriemija gali būti pirminė (nėra akivaizdaus infekcijos šaltinio) arba antrinė,
kurios metu infekcijos kilmė yra toliau esantis organas ar organų sistema. Teigiama kraujo kultūra su sukėlėju S. aureus visada laikoma reikšminga bakteriemija [38]. S. pneumoniae yra diplokokas, sukeliantis pneumoniją, meningitą, peritonitą ir kitas sunkias infekcijas [39]. E. coli yra labiausiai paplitęs gramneigiamas mikroorganizmas, susijęs su bakteriemija. E. coli yra dažniausia žmogaus šlapimo takų infekcijos (UTI) (angl. urinary tract infection) žarnyno infekcijų ir sisteminių infekcijų priežastis [40]. Sisteminės infekcijos apima bakteriemiją, hospitalinę pneumoniją, cholecistitą, cholangitą, peritonitą, celiulitą, osteomielitą ir infekcinį artritą. E. coli taip pat yra pagrindinė naujagimių meningito priežastis [41].
Įdomu tai, kad per pastaruosius metus, mikroorganizmų, sukeliančių kraujo infekcijas, tendencija keitėsi - daugėjo gramneigiamų bakterijų, o ypač grybelinių (Candida albicans ir non-albicans) mikroorganizmų infekcijų. Vis dėlto per pastaruosius du dešimtmečius didžiausias pasikeitimas kraujo infekcijų etiologijoje buvo ne infekuojančių mikroorganizmų tipas, o jų atsparumas antibiotikams, tai ypač išryškėjo tiriant gramneigiamas lazdeles [42]. Be to, senyvo amžiaus žmonėms dėl nepakankamos imuninės kompetencijos pastebėtas padidėjęs kraujo infekcijų atvejų skaičius [43].
1.2. Mikroorganizmų aptikimo kraujyje svarba
Kraujo infekcijos, kurias sukelia bakterijų ar grybelių buvimas kraujyje, yra viena iš rimčiausių hospitalizuotų ligonių sergamumo ir mirtingumo priežasčių. Sisteminė literatūros apžvalga atskleidė, kad Šiaurės Amerikoje nustatoma apie 600 tūkst. kraujo infekcijų atvejų per metus, o apie 1 mln. 200 tūkst. kraujo infekcijų atvejų per metus nustatomi Europoje, tai atitinkamai reikštų maždaug 86 tūkst. ir 157 tūkst. mirčių per metus [5]. Todėl mikroorganizmų aptikimas kraujyje, kraujo infekcijų diagnozė ir gydymas yra labai svarbūs.
Iš daugelio rūšių infekcijų, kraujo infekcija yra sisteminė ir gali sukelti gyvybei pavojingą sepsį. Kai labai sutrikusi imuninė homeostazė (pirminė arba antrinė imunodeficitinė būklė) ir (arba) į
17 kraują patenka daug bei labai patogeniškų mikroorganizmų (pvz., nudegus), šie nesunaikinami, išplinta po organus, juose dauginasi ir periodiškai (kartotinai) patenka į kraują, išryškėja klinikinių morfologinių bendrosios generalizuotos infekcijos požymių – tai vadinama sepsine infekcija, arba sepsiu, kuris iš esmės yra vienas iš galimų vietinės infekcijos raidos etapų [44].
Labai aukštas mirtingumas dėl kraujo infekcijų iš dalies yra dėl to, kad ankstyvose infekcijos stadijose nebuvo greitai aptiktas ir identifikuotas infekcijos sukėlėjas bei pradėtas gydymas tinkamais antibiotikais [45]. Pradinis empirinis gydymas plataus spektro antibiotikais yra ne tik nepakankamas, bet ir ilgainiui skatina išsivystyti atsparumą antibiotikams. Dėl to ankstyvas sukėlėjo aptikimas ir jo antimikrobinio jautrumo nustatymas yra būtini, siekiant padėti gydytojams parinkti veiksmingą gydymą, kuris galiausiai sumažina atsparumo antibiotikams atsiradimą, gydymo kainą, buvimo gydymo įstaigoje trukmę bei pacientų mirštamumą [46, 47].
Nustatyti infekcijos sukėlėją būtina ne tik individualios pacientų priežiūros požiūriu, bet ir dėl epidemiologiškai svarbių duomenų. Šie duomeys pasitarnauja visuomenės sveikatos institucijoms rengiant ir valdant oficialius infekcijų prevencijos ir likvidavimo planus [48].
1.3. Mikroorganizmų aptikimo kraujyje galimybės
Kraujo infekcijų patogenų aptikimo procesas pradedamas paimant kraujo pasėlio mėginius, kurių kokybė priklauso nuo tinkamos odos dezinfekcijos, tinkamo ėminio paėmimo bei kaip greitai apdorojamos jautrios kultūros [49]. Nepaisant to, kartais patogenai kraujyje neaptinkami dėl labai mažo cirkuliuojančių mikroorganizmų kiekio, dėl lepių mikroorganizmų ar gydymo antibiotikais, pradėto prieš imant kraują [50].
Mikroorganizmų invazija kraujyje dažniausiai pasireiškia vienu iš dviejų mechanizmų: nuo pirminio infekcijos šaltinio per limfinę sistemą mikroorganizmai patenka į kraujagyslių sistemą, arba tiesioginiu būdu nuo įvestos adatos (intraveninių narkotikų arba kitų užterštų intravaskulinių prietaisų, pvz., kateterių). Norint aptikti mikroorganizmus kraujo mėginiuose, galima naudoti įvairias kraujo pasėlio sistemas, tačiau siekiant geriausio rezultato, labiausiai pageidautina visiškai automatizuota sistema ir terpė, tiesiogiai inokuliuojama paciento krauju, kuriame tikimasi rasti kraujo infekcijos sukėlėjų [51].
Su patogenu susijusios molekulinės stuktūros (PAMP) (angl. pathogen-associated molecular patterns) yra molekulės randamos prokariotiniuose organizmuose, bet ne gyvūnuose. Įgimtas imunitetas priklauso nuo PAMP susirišimo su imuninių ląstelių receptoriais ir serumo baltymais, tokiais kaip manozę surišantis lektinas [52]. Cartwright ir kt. [53] sukūrė ELISA (angl. enzyme−linked
18 imunoglobulino domenas, sulietas su manozę surišančio lektino sritimi. Šis baltymas jungiasi su daugeliu gramneigiamų ir gramteigiamų bakterijų angliavandenių PAMP, įskaitant lipopolisacharidus ir lipoteicho rūgštį. Toks ELISA metodas nustato PAMP iš gyvų arba negyvų patogeninių bakterijų visame kraujyje. Šis tyrimas aptinka patogenines bakterijų molekules net antimikrobiniais preparatais gydytiems pacientams, ir gali būti atliktas per valandą naudojant gryną kraują [54].
Pastaraisiais metais klinikinės mikrobiologijos laboratorijos pradėjo pereiti prie naujų metodų - nukleorūgščių amplifikacija ir masių spektrometrija yra du dažniausiai naudojami metodai, kurie įvedami į klinikines mikrobiologijos laboratorijas įprastam organizmų aptikimui ir identifikavimui. Molekuliniai metodai vis dažniau naudojami greitai nustatyti mikroorganizmų genų sekas, kurios suteikia informacijos apie atsparumą vaistams [49]. Per pastaruosius dešimtmečius molekulinės biologijos evoliucija, ypač nukleorūgščių išskyrimo ir amplifikacijos metodų raida, leidžia nustatyti tokius sepsio etiologinius agentus, kuriuos be šių metodų aptikti būtų sunku. Be to, šiuos molekulinius metodus galima pritaikyti mikroorganizmų nustatymui tiesiogiai iš kraujo, tokiu būdu apeinant kraujo pasėlio pakopą ir sutrumpinant rezultatų gavimo laiką [55, 56].
1.4. Kraujo pasėlis. Automatizuotos sistemos
Šiuo metu kraujo pasėlio metodas laikomas „auksiniu standartu“ kraujo infekcijų diagnozei ir labai plačiai naudojamas klinikinės mikrobiologijos laboratorijose [57]. Kraujo pasėlis yra priemonė nustatyti gyvų mikroorganizmų buvimą kraujyje, žinant, kad kraujas paprastai būna sterilus, o teigiamas kraujo pasėlio rezultatas yra labai reikšmingas. Bakteriemijos ir fungemijos nustatymas, po kurio atliekami antibakterinio jautrumo tyrimai, yra svarbi klinikinių mikrobiologijos laboratorijų funkcija. Kad tai būtų įgyvendinta, reikalinga efektyviai naudoti visus turimus metodus ankstyvam mikroorganizmų aptikimui [58]. Automatizuotos kraujo pasėlio sistemos laikomos klinikinės mikrobiologijos pažanga ir yra prioritetinė kraujo kultūrų testavimo platforma visame pasaulyje [59]. Ši nepertraukiama mikroorganizmų aptikimo sistema pašalina kasdieninį pasėlio tikrinimo poreikį [60].
Šiuo metu yra trys pagrindinės komerciškai prieinamos sistemos: BacT/ALERT kraujo pasėlio sistema (BioMérieux, Durham, N.C., JAV), BACTEC 9000 serija (BD Microbiology, Cockeysville, MD, JAV) ir VersaTREK sistema (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, Ohio, JAV). Visose trijose sistemose yra išplėstiniai aptikimo įrenginiai su atskiromis inkubacinėmis kameromis, o buteliukai su turiniu nuolat minimaliai purtomi. Šių sistemų mikroorganizmų aptikimo principas grindžiamas CO2 išsiskyrimu vykstant mikroorganizmų metabolizmui [59].
19 Bact/ALERT ir BACTEC sistemos aptinka mikroorganizmų augimą priklausomai nuo pH pokyčio, kuriam turi įtakos CO2 išskyrimas. BACTEC9240 sistemų buteliuose yra dugninis jutiklis,
kuris skleidžia fluorescencinę šviesą dėl padidėjusios CO2 koncentracijos [61]. Ši šviesa perėjusi
filtrus patenka į fotodiodą. Sistema įvertina įtampą kas 10 minučių ir lygina naują vertę su ankstesne verte ir skleidžia teigiamą signalą, kai pasiekiama ribinė vertė. BacT/ALERT 3D sistema naudoja CO2
jautrų cheminį jutiklį. Kai CO2 koncentracija padidėja, spalva pasikeičia nuo žalios iki geltonos - visa
tai matuojama su šviesos daviklio detektoriumi [59].
VersaTREK sistema kas 24 minutes tikrina pasikeitimus butelio kaklelyje. Tikrinamas dujų suvartojimas ir gamyba. Dėl to kitos dujos, pvz., O2 ir H2 taip pat aptinkamos. Ši sistema skiriasi nuo
kitų sistemų tuo, kad buteliai, skirti aerobiniam kraujo pasėliui, suplakami magnetine maišymo juosta, siekiant padidinti deguonies kiekį [59].
Daugelyje sistemų naudojamos skirtingos aerobinių ir anaerobinių organizmų izoliavimo terpės. Kai kurios terpės specialiai sukurtos mikroorganizmų, tokių kaip grybeliai ir Mycobacterium spp., aptikimui [62]. Terpės sudėtis skiriasi savo antikoaguliantais, tūriu, naudojama atmosfera ir antibiotikų neutralizavimo priedais. Kai kurios terpių rūšys turi lizuojančių junginių, dėl kurių baltuosiuose kraujo kūneliuose esantys mikroorganizmai išskiriami į terpę [63].
Norint optimaliai kraujo pasėlyje išauginti įvairius kraujo infekcijų sukėlėjus, kiekvienas kraujo pasėlis turi būti imamas į specialius aerobinius ir anaerobinius kraujo pasėlio buteliukus. Aerobinis butelis turėtų būti užpildytas pirmesnis [64]. Toks pasėlis padidina tikimybę, kad bus identifikuotas infekcijos sukėlėjas. Kraujo pasėliui gauti iš suaugusių pacientų paimamas 20-30 ml kraujo, iš vaikų – nuo 1 iki 20 ml ir įšvirkščiamas į specialius kraujo pasėlio buteliukus [57]. Tyrimai parodė, kad bakterijų skaičius kraujo infekcijos metu suaugusiems yra labai mažas – dažniausiai < 1– 10 KFV/ml-1. Automatizuotose sistemose išaugančių bakterijų skaičius siekia 106 – 108 KFV/ml-1 [14]. Šiuolaikinėse automatizuotose sistemose inkubuojamiems kraujo pasėliams, paprastai prireikia 12-36 h, kad nustatyti jame gyvybingus mikroorganizmus. Kai kurioms lepioms bakterijoms, anaerobams ir grybeliams šis laikas gali būti šiek tiek ilgesnis [65, 66]. Ilgesnis inkubacinis laikas gali būti reikalingas ir kai yra įtariama dimorfinė fungemija arba bakteriemija, kurias sukelia Legiorella, Brucella, Bartonella ar Nocardia spp., Mycobacterium spp. Tokie kraujo pasėliai turėtų būti inkubuojami 4 savaites [67].
20
1.5. Veiksniai, įtakojantys kraujo pasėlio rezultatus
Kraujo infekcijos diagnozė yra viena iš svarbiausių klinikinių mikrobiologinių laboratorijų funkcijų. Todėl labai svarbu laiku ir tiksliai nustatyti kraujo infekcijos sukėlėjus, išvengiant veiksnių, kurie galėtų įtakoti kraujo pasėlio rezultatus bei vestų į klaidingą jų interpretaciją.
Dažniausiu užterštų kraujo pasėlių šaltiniu yra laikoma paciento oda toje vietoje, iš kurios imamas kraujas pasėliui [68]. Užterštame (klaidingai teigiamame) kraujo pasėlyje išauga odos mikrofloros mikroorganizmai [69]. Užterštų kraujo pasėlių pasekmės: pailgėjęs buvimo ligoninėje laikas; nereikalingas antimikrobinių vaistų vartojimas, dėl kurių padidėja paciento komplikacijų rizika, mikrofloros pakitimai; padidėjusi daugeliui antimikrobinių vaistų atsparių mikroorganizmų kolonizacija, pvz., MRSA ir vankomicinui atsparių enterokokų (VRE) (angl. vancomycin-resistant enterococci); alerginės reakcijos [70].
Keliuose atliktuose tyrimuose buvo padaryta išvada, kad periferinė venos punkcija yra pasirinkimo metodas, naudojamas tiriamai medžiagai gauti. Nustatyta, kad pasėlio užteršimo dažnis svyravo nuo 1,2 iki 7,3 proc., kai mėginiai imami venos punkcijos metu, palyginti su 3,4 - 13 proc. užteršimo dažniu, kai kraujas buvo imtas per intraveninį kateterį [71, 72]. Imant kraują per naujai įvestą intraveninį kateterį, pasėlio užteršimo dažnis mažesnis [73].
Netinkama odos antiseptika, kuri siejama su nepakankama dezinfekcinės priemonės džiūvimo trukme bei venos punkcijos vietos lietimas po dezinfekavimo priemonės panaudojimo yra pagrindinės kraujo pasėlio užteršimo priežastys [74]. Atlikti tyrimai rodo, kad jodo tinktūra išdžiūsta po 30 s, o povidono jodui reikia dviejų minučių. Chlorheksidinui, kurio sudėtyje yra alkoholio, išdžiūvimui prireikia 15-30 s [75]. Caldeira su bendraautoriais [76] padarė išvadą, kad alkoholiniai odos antiseptikai, palyginti su nealkoholiniais tirpalais, yra pranašesni siekiant išvengti kraujo pasėlio užteršimo venos punkcijos metu.
Sterilių pirštinių naudojimas turi įtakos kraujo pasėlio užteršimo dažniui ir mažina klaidingai teigiamų rezultatų skaičių iki 50 proc. [77]. Kraujo pasėliai gali būti užteršti ir tuo atveju, jei prieš mikrobiologinį kraujo pasėlį, kraujas buvo imtas į kitos rūšies vakuuminius mėgintuvėlius [71]. Pasaulinės sveikatos organizacijos (PSO) gairėse pateikiami nurodymai, kad kraujas mikrobiologiniam pasėliui turi būti imamas pirmiausiai [78].
Neadekvatus kraujo tūris pasėlio buteliuke įtakoja mikroorganizmų aptikimo jautrumą. Optimalus inokuliuojamo kraujo kiekis tarp gamintojų gali skirtis, todėl reikia griežtai vadovautis gamintojo rekomendacijomis [63].
Antibiotikų naudojimas prieš pirmąjį kraujo pasėlio mėginį yra esminis veiksnys, trukdantis mikroorganizmų išskyrimui iš kraujo. Todėl, jei įmanoma, kraujo pasėlis turi būti paimtas prieš
21 pradedant antimikrobinį gydymą [79]. Jeigu pacientas vartoja antimikrobinius preparatus, kraujo pasėlis turi būti renkamas prieš kitą dozę, kai antibiotikų koncentracija kraujyje yra mažiausia [63].
Kraujo pasėliai turėtų būti imami temperatūros šuolio metu, kuris, kaip manoma, padidina bakteriemijos diagnozavimo tikimybę. Tai grindžiama supratimu apie „bakteriemijos ciklą“, kurio metu mikroorganizmai patenka į kraujo sistemą, o organizme sekretuojamų citokinų poveikis pasireiškia padidėjusia kūno temperatūra [80].
Klaidingai teigiamas automatizuotos kraujo pasėlio sistemos signalas sutinkamas retai. Pagrindinės klaidingai teigiamų rezultatų priežastys yra didelis leukocitų skaičius, perpildyti buteliukai ir (arba) inkubavimo klaidos, dėl kurių buteliukai sistemoje stebimi netinkamu algoritmu [79].
Pagrindinis veiksnys susijęs su klaidingai neigiamu signalu yra pre-inkubavimo uždelsimas, kuris nurodomas kaip laiko skirtumas nuo buteliukų užpildymo momento iki buteliukų įkrovimo į automatizuotą sistemą. Tai grindžiama tuo, kad mikroorganizmai augdami buteliuke prieš inkubaciją, ypač esant aukštai temperatūrai (35°C), įkrovimo metu jau būna peraugę augimo fazę ir pasiekę stacionarią fazę [79].
Buteliukai paprastai inkubuojami ne ilgiau kaip 5-7 dienas [67, 81]. Per pirmąsias 48 inkubavimo valandas nustatoma daugiau kaip 90 proc. visų teigiamų kraujo kultūrų. Labai nedaug mikroorganizmų reikalinga 5 - 7 dienų inkubacija [79]. Tam, kad būtų išvengta klaidingai neigiamų rezultatų, inkubacijos laikas gali būti pratęstas kai kuriais įtariamo IE atvejais, pacientams, gydomiems antimikrobiniais preparatais, arba kai yra įtariama grybelinė infekcija (pvz., dimorfiniais grybais) [67].
Tiek klaidingai teigiami, tiek klaidingai neigiami kraujo pasėlio rezultatai yra kompleksinė ir sudėtinga problema. Rezultatai visada lieka priklausomi nuo dirbančio personalo patirties bei naudojamos įrangos.
1.6. Bakterijų identifikavimo metodai
1.6.1. Fenotipinė identifikacija
Bakterijų identifikavimas paprastai atliekamas remiantis fenotipiniais metodais, įskaitant dažymą Gramo būdu, augimo charakteristikas, kolonijų morfologiją ir biochemines savybes. Nors, kai kurie iš šių testų yra atliekami per kelias minutes, visiškas mikroorganizmo identifikavimas geriausiu atveju pasiekiamas per kelias valandas, o sudėtingesnių mikroorganizmų identifikacija reikalauja kelių dienų [82]. Fenotipinis bakterijų identifikavimas iš esmės pagrįstas nežinomų bakterijų fenotipinių savybių palyginimu su tipinės kultūros fenotipinėmis savybėmis [83].
22 Dauguma klinikinių mikrobiologijos laboratorijų, norėdamos nustatyti daugumą bakterinių patogenų iš klinikinių mėginių, vis dar remiasi pasėlio metodu. Patogenų aptikimui būtina naudoti specifines mitybines terpes. Pavyzdžiui, diferencinė mitybinė terpė parodo bakterijų metabolinio aktyvumo skirtumus, pagal kuriuos galima nustatyti konkretų patogeną. Selektyvi mitybinė terpė (įterpiant antimikrobines medžiagas), sumažina komensalinės floros augimą, taip padidinant tikimybę išskirti konkretų tikslinį patogeną [84].
Fenotipinei patogeno identifikacijai iki genties ir rūšies dažnai naudojamos komercinės biocheminių testų plokštelės. Jose esančių cukrų pagalba naudojant pH indikatorių aptinkamas rūgštėjimas (dėl oksidacijos arba fermentacijos). Kiti biocheminiai testai plokštelėse, gali būti skirti fermentų, susijusių su aminorūgščių metabolizmu (pvz., dekarboksilazės, deaminazės, triptofanazės), arba hidrolazių fermentų, tokių kaip ureazė ir β-galaktozidazė, aptikimui. Biocheminių plokštelių inokuliavimas ir interpretavimas gali būti atliekamas rankiniu būdu naudojant komercinius rinkinius arba automatizuotai (BD PhoenixTM, JAV arba Vitek® 2 BIOMÉRIEUX, JAV) sistemose, kuriose mikroorganizmai automatiškai inokuliuojami ir vykdoma biocheminių testų plokštelės interpretacija [85].
Dažnai klinikinėse laboratorijose naudojamas fenotipinis bakterijų identifikavimo metodas yra bakterijų auginimas ant chromogeninių medžiagų turinčių terpių. Jos patogios naudoti ir reikalauja santykinai mažų išlaidų. Šių mitybinių terpių sudėtyje yra chromogeninių arba fluorogeninių substratų, kurie, veikiant unikaliems bakterijų fermentams, yra hidrolizuojami, todėl stebimos bakterijų kolonijos įgyja tam tikrą spalvą. Į mitybinę terpę įdėtų substratų spalva arba fluorescencija yra neveikli iki tol, kol jų nepaveikia įtariamos infekcinės bakterijos išskiriami specifiniai fermentai [84]. Pagrindinis chromogeninės terpės trūkumas - tai laikas, per kurį identifikuojamos bakterijos. Identifikacija trunka 16-48 h – tiek, kiek prireikia išauginti bakterijų kolonijas. Šį trūkumą galima spręsti naudojant fluorogeninius substratus ar dažus. Tai galėtų leisti aptikti mikrokolonijas per 2 inkubacijos valandas naudojant jautrias priemones, tačiau ši klinikinės mikrobiologijos sritis kol kas santykinai neištirta [86].
Pasėlio metodas išlieka etalonu identifikuojant sukėlėją, kai yra įtariama kraujo infekcija. Tačiau identifikacija nėra patogi, kuomet atliekama antibiotikų vartojimo fone arba infekcija būna sukelta sunkiai kultivuojamų mikroorganizmų [84].
1.6.2. Imunologiniai metodai
Imunologiniai metodai remiasi specifinių ieškomai bakterijai antigeno-antikūno kompleksų sudarymu. ELISA – dažniausiai naudojamas metodas. Be skirtingų ELISA tipų, imunofluorescenciniai
23 tyrimai, lateksagliutinacijos reakcijos, linijiniai arba šoninio srauto imunologiniai tyrimai, visi jie susiję su spalvos pakeitimo reakcija, tarpininkaujant ieškomų mikroorganizmų fermentams. ELISA metodika pagerino klinikinę diagnozę dėl savo didelio našumo, greičio, palyginti pigios ir paprastos technologijos, taip pat dėl gebėjimo kiekybiškai įvertinti esamą patogeną. Antigenų mikroplokštelės labai pagerino diagnozę, leidžiančią vienu metu ištirti kelis patogenus [87].
Norint identifikuoti bakterijas, galima naudoti jų serologines savybes, kurios atsiranda dėl skirtingų antigenų, esančių skirtingose padermėse. Bakterijų ląstelių sienelės paviršiaus komponentai siejami su trimis potencialiais antigenais: H (angl. flagella - žiuželis), K (angl. capsule - kapsulė) ir O (angl. polysaccharides - polisacharidai). O-polisacharidai randami tik gramneigiamose bakterijose ir yra lipopolisacharido (LPS) dalis. Lipopolisacharidas yra vienas iš pagrindinių gramneigiamų bakterijų išorinės membranos komponentų. O-polisacharidų struktūra tarp įvairių gramneigiamų bakterijų padermių yra skirtinga, todėl O-polisacharidas, taip pat žinomas kaip O-antigenas, yra naudojamas serotipavimui [88].
1.6.3. Genotipinė (molekulinė) identifikacija
Molekulinės diagnostikos metodai remiasi genomo žymenų, atitinkančių nukleorūgščių seką, analize. Bakterijų taksonomija ir filogenija remiasi būdingomis rūšiai genų sekomis, ypač tomis, kurios koduoja ribosominę ribonukleino rūgštį (rRNR). Molekulinės diagnostikos technologijos pradėtos taikyti nuo 1960 m. ir teikia kliniškai svarbią informaciją apie mikroorganizmų gentis, rūšis, jautrumą antibiotikams ir gyvybingumą. Diagnostinė informacija dažniausiai gaunama (i) tiesioginiu rRNR charakterizavimu, (ii) genų amplifikavimu ir amplikonų apibūdinimu, arba (iii) tiesiogine ribosominių genų sekvenacija [84].
Hibridizacijos pagrindu veikianti mikroorganizmų aptikimo priemonė leidžia atskleisti genų buvimą ar nebuvimą [89]. Nors mėginio įvertinimui reikalingi mikroskopiniai duomenys ir mikroorganizmų aptikimo riba turi būti 103 KFV/ml, lyginant su tradiciniais metodais, sutaupoma
nemažai laiko, kuris gali būti gyvybiškai svarbus tokiose situacijose kaip sepsinė infekcija. Šis metodas buvo adaptuotas panaudojant peptidinių nukleorūgščių fluorescencinę in situ hibridizaciją (PNA-FISH) (angl. peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization), kad iš kraujo kultūrų būtų galima identifikuoti gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas, taip pat Candida rūšis [90]. Tikrinant 10 labiausiai paplitusių patogenų, susijusių su ligoninėje įgytomis kraujo infekcijomis, nustatyta, kad šio metodo tikslumas yra 100 proc. bakterijoms ir 91 proc. mieliniams grybeliams mėginiuose, kuriuose mikroorganizmų kiekis yra ne mažesnis kaip 105 KFV/ml [84].
24 Kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (qPCR) (angl. quantitative polymerase chain reaction) yra in vitro metodas, kurio veikimas pagrįstas nukleino rūgščių denatūracija ir polimerizacija su specifiškai pridėtais ir pažymėtais oligonukleotidų pradmenimis, nuo kurių formuojasi nauja analogiška dvigrandė DNR. Visas šis procesas vyksta cikliškai, o mikroorganizmai identifikuojami (nuo mėginio paėmimo iki rezultatų pateikimo) per 5-24 h arba greičiau [84]. Mikroorganizmų identifikacija atliekama taikant polimerazės grandininę reakciją (PGR) pagal 16S rRNR (susideda iš apytiksliai 1540 bp) arba 23S rRNR (susideda iš apytiksliai 2900 bp) geną [91]. Identifikuojama pagal PGR produkto nukleotidų sekos analizę, lyginant šią seką su žinomomis duomenų bazėje saugomomis sekomis [92].
Kita inovatyvi bakterijų identifikavimo platforma - tai PGR ir masių spektrometrijos derinys (PGR / ESI-MS) (angl. ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry). PGR / ESI-MS technologija jungia plataus spektro PGR amplifikaciją su elektriniu krūviu sukurtų jonų, purškiant smulkias daleles, patekimu į masių spektrometrijos analizatorių [93, 94]. Šios platformos pranašumai: nereikia mikroorganizmų auginti ant mitybinių terpių; metodas veiksmingas, kuomet mėginiai yra polimikrobiniai, naujų, necharakterizuotų patogenų buvimo atveju, leidžia juos priskirti bakterijų gentims ar šeimoms. Be to, metodas leidžia aptikti kai kuriuos virulentiškumo ir atsparumo genus bei tipuoti identifikuotus mikroorganizmus [83].
Aukštas analitinis molekulinės diagnostikos jautrumas ir specifiškumas yra ypač galingas nustatant lėtai augančius mikroorganizmus ir tuos, kuriuos sunku išskirti iš kultūros dėl jų specialių augimo poreikių, pavyzdžiui, Mycoplasma pneumoniae ir Legionella spp [95]. Nauji molekuliniai metodai, įskaitant nukleorūgščių hibridizaciją, amplifikaciją ir masių spektrometriją, sukurti siekiant greitai nustatyti kraujo pasėliuose augančius mikroorganizmus. Šiuo metu sparčiausias mikrobiologijoje naudojamas molekulinės identifikacijos metodas yra daugiafunkcinis realaus laiko PGR metodas SeptiFast, kuris per 6 val. gali nustatyti sukėlėją tiesiogiai iš kraujo mėginio [96].
1.7. Masių spektrometrija
Dažnai sąvoka “proteomika” vartojama apibūdinant vieną plačiausiai naudojamų didelio našumo baltymų tyrimo metodų – masių spektrometriją. Masių spektrometrija (MS) yra greitai besivystanti technologija ir užima pagrindinę vietą tarp proteominių metodų. Masių spektrometrijos istorija prasidėjo 19 amžiaus pabaigoje. 20 amžiaus pradžioje pradėti kurti ir tobulinti masių spektrometrai, tačiau jų principas išliko nepakitęs iki šių laikų [97]. Masių spektrometrai yra sudaryti iš trijų esminių funkcinių komponentų – jonų šaltinio, masės analizatoriaus ir jonų detektoriaus. Šių
25 sudedamųjų komponentų pobūdis skiriasi atsižvelgiant į masės spektrometro paskirtį, reikalingų duomenų tipą ir mėginio fizikines savybes [98].
Tiriamosios medžiagos molekulės pirmiausia jonizuojamos, o po to nustatoma jonizuotų molekulių ir/ar jų fragmentų masė. Tiriamąją medžiagą pavertus dujomis ir jas jonizavus, gaunami skirtingos masės jonai, kurie yra atskiriami kintamu elektriniu lauku, naudojant jonų optines sistemas, priklausomai nuo jono masės ir krūvio santykio. Gauti signalai sudaro spektrą, kuriame jų padėtis atitinka jonų masės ir krūvio santykio dydį, o signalo stipris proporcingas jonų kiekiui. Jonų skilimas į fragmentus per specifinių ryšių vietas priklauso nuo jų cheminės prigimties, todėl iš gauto spektro galima nustatyti ir tiriamosios analitės molekulės struktūrą. Tam naudojamos kompiuterinės duomenų bazės, leidžiančios supaprastinti atpažinimo procesą [99].
Masių spektrometrija puikiai tinka kokybinei ir kiekybinei įvairių kliniškai svarbių junginių analizei ir laikoma universaliu detekcijos metodu. Tyrimo masių spektrometru metu gaunama daugybė spektrų, kurie yra sumuojami ir gaunama vadinamoji bendroji jonų chromatograma. Taip pat masių spektrometrą galima suprogramuoti taip, kad jis parodytų tik pasirinktus dominančių medžiagų jonus ir/arba jų būdingus fragmentus, kurie gali būti naudojami nustatomos medžiagos identifikacijos patvirtinimui [100].
Yra daug įvairių masių spektrometrų tipų bei konstrukcijų, besiskiriančių savo veikimo principu ir konstrukcija. Vieni jų yra labiau tinkami kokybinei medžiagų analizei, t.y. junginių identifikavimui, kiti - kiekybiniams tyrimams, t.y. tiksliam mėginyje esančios medžiagos kiekio nustatymui [101].
Dažniausiai kaip kokybinės analizės masių spektrometrai yra naudojami skrydžio laiko (angl. TOF- Time Of Flight) bei kvadrupolio-skrydžio laiko (angl. Q-TOF- Quadruple-Time Of Flight) masių spektrometrai. TOF tipo masių spektrometrai yra sudaryti iš jonų šaltinio, kuriame medžiagos molekulių jonai pereina į dujinę fazę, jonų optikos, per kurią jonai keliauja, pulserio, kuris suteikia jonams impulsą ir pasiunčia į skrydį link jonų veidrodžio, kuris juos atspindi ir nukreipia link detektoriaus, kuris jonus užfiksuoja. Žinant suteikto impulso dydį, pagal skrydžio laiką galima labai tiksliai apskaičiuoti jonų mases [102]. Klinikinėje mikrobiologijoje dažniausiai naudojami TOF masės analizatoriai [99].
Yra naudojami du pagrindiniai jonizacijos metodai – tai MALDI (angl. Matrix-Assisted Laser Desorbtion/Ionisation) ir ESI (angl. Electrospray Ionization). Šie metodai leidžia jonizuoti ir išgarinti dideles biomolekules, tokias kaip baltymai [103]. Skirtingai nuo ESI, MALDI jonizacija išmuša po vieną elektroną, todėl MALDI baltymų raiškos vaizdas (masių spektras) yra platesnis [99].
Mikroorganizmai gali būti tiesiogiai analizuojami MALDI-TOF be išankstinio apdorojimo, nes dauguma vegetacinio periodo bakterijų yra lizuojamos po vandens, organinių tirpiklių ir (arba) stiprių rūgščių poveikio MALDI matricoje. Kai MALDI sistema analizuojami atsparūs
26 mikrorganizmai - kai kurie virusai, bakterinės sporos ir mielių ląstelės, į pradinį apdorojimo etapą paprastai pridedamos stiprios organinės rūgštys ir (arba) alkoholiai. Kai kurių bakterijų rūšių identifikacijai (pvz., Actinomyces) gali būti naudingas specialus pirminis apdorojimas ar baltymų išskyrimo procedūros [104].
Naudojant MALDI metodą, tiriamoji medžiaga yra užnešama ant metalinės plokštelės su matrica. Matricą sudaro mažos rūgšties molekulės, kurios stipriai optiškai absorbuoja naudojamo lazerio bangos ilgį. Po matricos ir tiriamosios medžiagos kristalizacijos, metalinė plokštelė yra įdedama į masių spektrometrą. Trumpiems lazerio impulsams veikiant matricą, peptidų molekulės pereina į dujinę fazę ir yra jonizuojamos. Lazerio jonizacija išmuša elektronus ir sukuria santykinį protonų padaugėjimą. Tada jonizuotos molekulės yra akseleruojamos elektrostatiniame lauke ir išmetamos į metalinį skrydžio vamzdelį vakuume, kuriame atsiskiria pagal masės – krūvio santykį. Mažesni jonai juda greičiau ir pasiekia jonų detektorių greičiau, nei didesni jonai. Pagal skrydžio laiką kameroje išmatuojamas išsidėščiusių dalelių masių spektas [14]. Baltymų raiškos vaizdas (masių spektras) lyginamas su visais platformos MALDI biotipavimo etalonų bibliotekoje saugomais etalonų įrašais. Identifikuojama taikant patikimą teorinę koreliaciją tarp gautojo ir etaloninio spektro. (1 pav.)
1 pav. Schematinis MALDI-TOF MS veikimo principas [modifikuota pagal 14] (Croxatto A et al.)
27 Nuo 2009 m. MALDI-TOF MS rutiniškai naudojama Europos klinikinėse laboratorijose [105]. Naudojant MALDI-TOF masių spektrometrus, sutrumpėja ligos sukėlėjo nustatymo laikas [104]. Be to, su šia technologija galima aptikti mikroorgnizmų atsparumą kai kuriems antibiotikams, pvz., β-laktamazių (įskaitant karbapenemazes), meticilinui atsparių S. aureus ir net vankomicinui atsparių Enterococcus spp. buvimą tiriamoje medžiagoje [106, 107]. Apskaičiuota, kad MALDI-TOF MS reikalinga apie 105 KFV, kad būtų pakankamas kiekis bakterijų ribosominių baltymų, jog būtų
galima gauti patikimą baltymų modelį, kuris būdingas tam tikram patogenui [108].
MALDI-TOF masių spektrometrijos gebà greitai identifikuoti mikroorganizmus, leidžia panaudoti šį metodą daugelyje sričių, įskaitant medicininę diagnostiką, aplinkos monitoringą ir maisto kokybės kontrolę. Ši technologija gali būti tiesiogiai taikoma klinikiniams ėminiams, tokiems kaip kraujas, šlapimas, smegenų, pleuros, pilvaplėvės, sinovijos skysčiai. MALDI-TOF MS tinka greitam mikroorganizmų identifikavimui mažomis sąnaudomis ir yra alternatyva įprastoms laboratorinėms biocheminėms ir molekulinės biologijos identifikavimo sistemoms [14].
28
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tiriamoji grupė, tyrimo organizavimas
Tyrimas atliktas LSMU ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikoje. Tiriamoji grupė – visi pacientai, kuriems reikalingas kraujo infekcijos sukėlėjo identifikavimas. Tyrimui atrinkti tik teigiami kraujo pasėlio mėginiai, t. y. tie, kuriuose, naudojant automatizuotą kraujo pasėlio sistemą BACTECTM FX (BD Diagnostic Systems, JAV), aptinkamas mikroorganizmų augimas.
Tiriamoji medžiaga inokuliuojama į BACTEC mėgintuvėlius, kurie įstatomi į BACTECTM
FX automatinį termostatą inkubuoti ir periodiškai analizuoti. Kiekviename mėgintuvėlyje yra cheminis jutiklis, kuris nustato didėjantį CO2, išskiriamą augančių mikroorganizmų. Prietaisas kas dešimt
minučių tikrina jutiklį pagal fluorescencijos, proporcingos esamo CO2 kiekiui, intensyvumo didėjimą.
Padidėjusio CO2 santykio ir kiekio tyrimas leidžia BACTEC rūšies fluorescencinės serijos prietaisu
nustatyti, ar tiriamosios medžiagos rezultatas yra teigiamas, t. y., ar tyrimo mėginyje yra gyvybingų mikroorganizmų. Nustatomi tik mikroorganizmai, augantys konkrečioje terpėje.
BACTECTM FX aparatui davus garsinį signalą apie teigiamą pasėlį, toliau kraujo pasėlio mėginys tiriamas dviem skirtingais metodais:
1) Mikroorganizmų identifikavimas su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu;
2) Mikroorganizmų identifikavimas tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies su MALDI biotipavimo sistema.
Kiekvienu metodu ištirti 102 automatizuotoje kraujo pasėlio sistemoje BACTECTM FX užregistruoti
teigiami kraujo pasėlio mėginiai.
2 pav. Tyrimo schema Teigiamas kraujo pasėlio mėginys automatizuotoje kraujo pasėlio sistemoje BACTECTM FX (n=102)
Mikroorganizmų
identifikavimas iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo
metu (n=102)
Mikroorganizmų identifikavimas iki rūšies
tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos (n=102)
29
2.2. Mikroorganizmų identifikavimas su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies
kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu
Šio tyrimo metodo paskirtis - identifikuoti bakterijas ar grybelius, išaugintus ant standžių mitybos terpių, iki rūšies.
2.2.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas
Mėginys turi būti imamas steriliais metodais, kad sumažėtų užteršimo galimybė. Rekomenduojamas mėginio kiekis yra 8–10 ml. Aerobiniais ir anaerobiniais mikroorganizmais inokuliuoti BACTEC mėgintuvėliai turi būti nedelsiant nuvežti į laboratoriją ir sudėti į BACTECTM FX fluorescencinės serijos prietaisą inkubuoti ir tirti. Iki tyrimo transportuojama ir laikoma kambario temperatūroje.
2.2.2. Matavimo ir kitos priemonės, tyrimų įrenginiai
Automatinės vienkanalės kintamo tūrio pipetės, mikrobiologinės kilpelės, MALDI identifikavimo plokštelė, Eppendorf mėgintuvėlai, mediniai pagaliukai, Petri lėkštelės, dejonizuotas vanduo, neaustinės medžiagos tamponėliai.
Tyrimų įrenginiai: BACTECTM FX automatinė kraujo pasėlio sistema (BD Diagnostic
Systems, JAV), termostatas (Binder, Vokietija), CO2 inkubatorius (Binder, Vokietija),Vortex putryklė
(Biosan, Latvija), MALDI-TOF MS biotipavimo sistema (Bruker Daltonics, JAV).
2.2.3. Reagentai, mitybos terpės
Reagentai: skruzdžių rūgštis, standartinis tirpiklis, standartas (Escherichia coli DH5 alpha, Nr 8290190), matrica („HCCA – portioned“).
Mitybos terpės: 5 proc. kraujo agaras, šokoladinis agaras (pagal mikroskopijos rezutatus), BACTEC terpė (aerobinė), BACTEC terpė (anaerobinė), MacConkey agaras (pagal mikroskopijos rezutatus), Scheadler agaras (pagal mikroskopijos rezutatus).
30
2.2.4. Tyrimo metodikos aprašymas
Mėginių ruošimas tiesioginio perkėlimo metodu:
1. Nustačius teigiamus kraujo pasėlio mėginius BACTECTM FX aparate, mėginys
mikroskopuojamas 1000 padidinimu, nustatomas mikroorganizmų buvimas, jų judrumas, dažoma Gramo būdu, iš kurio matyti mikroorganizmų dažymosi pobūdis, forma.
2. Pagal mikroskopijos rezultatus mikroorganizmai išsėjami ant standžių mitybos terpių:
2.1. Gramneigiamos lazdelės (mažos ir nejudrios) – 5 proc. kraujo su stafilokoko brūkšniu, šokoladinis ir MacConkey agarai.
2.2. Gramneigiamos lazdelės (didelės ir judrios ar nejudrios) – 5 proc. kraujo ir MacConkey agarai.
2.3. Gramneigiami kokai – 5 proc. kraujo ir šokoladinis agarai.
2.4. Gramteigiami kokai grandinėlėmis – 5 proc. kraujo ir šokoladinis agarai.
2.5. Gramteigiami kokai kekėmis – 5 proc. kraujo agaras, plazmos koagulazės testas. 2.6. Gramteigiamos lazdelės – 5 proc. kraujo ir šokoladinis agarai.
3. 5 proc. kraujo agaras su stafilokoko brūkšniu ir šokoladinis agaras inkubuojami 24 – 48 h 35°C temperatūroje CO2 inkubatoriuje. MacConkey agaras inkubuojamas 18 – 24 h 35°C
temperatūroje termostate. Scheadler agaras inkubuojamas 24 – 48 h 35°C temperatūroje anaerobinėmis atmosferos sąlygomis anaerostate.
4. Ant išvalytos MALDI identifikavimo plokštelės šulinėlio mediniu pagaliuku plonu sluoksniu užtepama tiriamoji medžiaga (mikroorganizmų kolonija);
5. Ant mėginio užpilama 1 µl matricos ir leidžiama išdžiūti kambario temperatūroje;
6. Kai mėginys paruoštas identifikuoti, MALDI identifikavimo plokštelė įdedama į MALDI- TOF masių spektrometrą.
Mėginių ruošimas skruzdžių rūgštimi metodu:
Ekstrakcijos skruzdžių rūgštimi metodas taikomas nepavykus identifikuoti tiesioginio perkėlimo metodu. Naudojamas tas pats mėginys, kaip ir taikant tiesioginio perkėlimo metodą.
1. Ant išvalytos MALDI identifikavimo plokštelės šulinėlio mediniu pagaliuku plonu sluoksniu užtepama tiriamoji medžiaga (mikroorganizmų kolonija);
2. Ant mėginio užpilama 1 µl 70 proc. skruzdžių rūgšties vandeninio tirpalo, leidžiama išdžiūti kambario temperatūroje;
3. Ant mėginio užpilama 1 µl matricos, leidžiama išdžiūti kambario temperatūroje;
4. Kai mėginys paruoštas identifikuoti, MALDI identifikavimo plokštelė įdedama į MALDI- TOF masių spektrometrą.
31
2.2.5. Rezultatų įvertinimas
Ataskaitos rezultatų lentelėje rodomos detalizuotos rangavimo lentelės su dešimčia kiekvieno mėginio geriausių atitikties rezultatų.
Jeigu balų skaičius lygus arba didesnis nei 2,0 (žalia spalva), vadinasi šį rezultatą galima interpretuoti kaip tikėtiną rūšies identifikavimą ir jį turi nuodugniai peržiūrėti patyręs klinikinės mikrobiologijos specialistas.
Jei balų skaičius mažesnis nei 2,0 (ne žalia spalva), šį mėginį reikia pakartotinai analizuoti ekstrakcijos skruzdžių rūgštimi metodu.
Mėginiai, kurių balų skaičius mažesnis nei 1,7, (raudona spalva) ir matomas pranešimas „nepatikimas identifikavimas“.
2.3. Mikroorganizmų identifikavimas tiesiogiai iš tiriamosios medžiagos iki rūšies
su MALDI biotipavimo sistema
Šio tyrimo metodo paskirtis – identifikuoti iš teigiamo kraujo pasėlio kultivuojamo HB&L terpėje augančius mikroorganizmus iki rūšies naudojant kultūrą iš susidariusių nuosėdų po centrifugavimo.
2.3.1. Ėminio ėmimas, gabenimas ir laikymas
Žr. skyrių 2.2.1.2.3.2. Matavimo ir kitos priemonės, tyrimų įrenginiai
Automatinės vienkanalės kintamo tūrio pipetės. MALDI identifikavimo plokštelė, Eppendorf mėgintuvėlai, mediniai pagaliukai, Petri lėkštelės, dejonizuotas vanduo, neaustinės medžiagos tamponėliai.
Tyrimų įrenginiai: BACTECTM FX automatinė kraujo pasėlio sistema (BD Diagnostic
32 Italija), Vortex putryklė (Biosan, Latvija), McFarland densitometras (Biosan, Latvija), mikrocentrifuga (Biosan, Latvija), MALDI-TOF MS biotipavimo sistema (Bruker Daltonics, JAV).
2.3.3. Reagentai, mitybos terpės
Reagentai: acetonitrito rūgštis, skruzdžių rūgštis, standartinis tirpiklis, standartas (Escherichia coli DH5 alpha, Nr 8290190), matrica (,,HCCA – portioned‘‘).
Mitybos terpės: Mitybos skystos BACTEC (aerobinė ir anaerobinė) ir HB&L terpės.
2.3.4. Tyrimo metodikos aprašymas
Mėginių ruošimas skruzdžių rūgštimi metodu:1. Nustačius teigiamus kraujo pasėlio mėginius BACTEC aparate, mėginys mikroskopuojamas. 2. Su švirkštu iš BACTEC terpės 10 µl skysčio suleidžiamas į HB&L terpę, kuri dedama į
UROQUATTRO aparatą, kuriame ši terpė su mikroorganizmais inkubuojasi iki 1 ±0,25 McF (McFarland), atitinkančio 3,0x108 KFV/ml. Tuomet iš HB&L terpės 1 ml skysčio inokuliuojamas į Eppendorf mėgintuvėlį ir centrifuguojama 5 min. 13 000 aps./min greičiu, supernatantas nusiurbiamas.
3. Ant išvalytos MALDI identifikavimo plokštelės šulinėlio mediniu pagaliuku plonu sluoksniu užtepamos centrifugavimo metu susidariusios nuosėdos.
4. Ant mėginio užpilama 1 µl 70 proc. skruzdžių rūgšties vandeninio tirpalo, leidžiama išdžiūti kambario temperatūroje;
5. Ant mėginio užpilama 1 µl acetonitrito rūgšties, leidžiama išdžiūti kambario temperatūroje; 6. Ant mėginio užpilama 1 µl matricos, leidžiama išdžiūti kambario temperatūroje;
7. Kai mėginys paruoštas identifikuoti, MALDI identifikavimo plokštelė įdedama į MALDI- TOF masių spektrometrą.
2.3.5. Rezultatų įvertinimas
Žr. skyrių 2.2.5.33
2.4. Statistinė duomenų analizė
Tyrimo duomenys buvo analizuojami statistiniu duomenų apdorojimo paketu ,,SSPS‘‘ (angl. Statistical Package for Social Sciences), 20 versija. Tyrimo rezultatų analizei buvo naudoti aprašomosios statistikos metodai, bendrieji pasiskirstymai, dažnių lentelės. Kokybinių duomenų vertinimui buvo naudotas Chi kvadrato (χ2) kriterijus. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, kai
34
3. REZULTATAI
Tyrimo metu iš viso buvo vertinami 102 pacientų teigiami kraujo pasėlio mėginiai, užfiksuoti automatizuotoje kraujo pasėlio sistemoje BACTECTM FX. Esantys mikroorganizmai buvo
identifikuojami masių spektrometrijos būdu iš kolonijos, išaugusios ant kietosios terpės bei tiesiogiai iš teigiamos kraujo pasėlio terpės ekstrakcijos skruzdžių rūgštimi metodu.
3.1. Tiriamosios grupės charakteristikos
Didžiąją dalį visų tiriamųjų sudarė pacientai, gydomi terapiniuose skyriuose, tokiuose kaip gastroenterologijos, pulmonologijos, neurologijos, hematologijos ir kt. (50,4 proc.) ir intensyvios terapijos skyriuje (30,7 proc.). Likusią dalį (18,9 proc.) tiriamųjų pacientų populiacijos sudarė pacientai, gydomi chirurgijos bei vaikų ligų skyriuje (3 pav.).
3 pav. Tiriamųjų pacientų procentinis pasiskirstymas pagal skyrių
41 pacientui prieš tiriamosios medžiagos paėmimą buvo paskirtas gydymas antibiotikais, 9 pacientams antibiotikai nebuvo skirti. Kitų pacientų (51,0 proc.) duomenų apie paskirtą gydymą antibiotikais prieš tiriamosios medžiagos paėmimą nebuvo rasta (4 pav.).
Terapinis skyrius, 50,4 proc. (n=51) Intensyvios terapijos skyrius, 30,7 proc. (n=31) Chirurgijos skyrius, 13,9 proc. (n=14) Vaikų ligų skyrius, 5,0 proc. (n=5)
35 4 pav. Pacientų gydymo antibiotikais procentinis pasiskirstymas
Laiko trukmė nuo patekimo į laboratoriją iki automatizuotos kraujo pasėlio sistemos BACTECTM FX pranešimo apie teigiamą kraujo pasėlio mėginį svyravo nuo 2 iki 92 h. Todėl teigiami mėginiai buvo suskirstyti į tris laiko intervalus. Vertinant laiko trukmę nustatyta, kad daugumos kraujo pasėlio mėginių atvejų, pranešimas apie aptiktus gyvybingus mikroorganizmus patikimai dažniau pasirodydavo per mažiau nei 24 valandas (p<0,05). 15 iš 102 kraujo pasėlio mėginių prireikė daugiau nei 24 valandų BACTECTM FX sistemos teigiamam signalui gauti (1 lentelė).
1 lentelė. Laiko trukmė iki automatizuotos kraujo pasėlio sistemos BACTECTM FX signalo apie teigiamą kraujo pasėlio mėginį
Laiko intervalas, h Teigiamų kraujo pasėlio mėginių skaičius, proc.
≤ 10 41,2 (n=42)*
11 – 24 44,1 (n=45)*
> 24 14,7 (n=15)**
* lyginant su **, p<0,05.
3.2. Mikroorganizmų identifikavimas su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies
kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu
Kraujo pasėlyje identifikuoti mikroorganizmai priklausė 26 skirtingoms mikroorganizmų rūšims, 2 mikroorganizmai identifikuoti tik iki genties. Enterobacteriaceae šeima: Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; Klebsiella oxytoca; Salmonella enteritidis; Serratia marcescens; Citrobacter freundii; Citrobacter braakii; Proteus mirabilis; Enterobacter kobei; Enterobacter aerogenes. α ir β
40,2 8,8 51 0 10 20 30 40 50 60 Skirtas gydymas antibiotikais Neskirtas gydymas antibiotikais Nėra duomenų Pa ci en tų s ka ič iu s, p ro c. n=41 n=9 n=52
36 hemoloziniai streptokokai: Streptococcus anginosus; Streptococcus salivarius; Streptococcus agalactiae; Streptococcus constellatus; Streptococcus oralis; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis; Streptococcus mutans. Plazmos nekoaguliuojantys stafilokokai: Staphylococcus succinus; Staphylococcus epidermidis. Enterokokai (Enterococcus spp.): Enterococcus faecium; Enterococcus faecalis. Nefermentuojančios bakterijos: Acinetobacter spp.; Acinetobacter baumanni; Pseudomonas aeruginosa. Kiti: Moraxella catarrhalis; Corynebacterium urealyticum; Bacteroides spp.
Išskyrus ir identifikavus mikroorganizmus su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu gauta, kad Enterobacteriaceae šeimai priklausantys mikroorganizmai (61,4 proc. (n=70)) patikimai dažniau vyravo lyginant su kitų identifikuotų mikroorganizmų grupėmis (p<0,05). Enterokokai identifikuoti 14 mėginių (12,3 proc.), nefermentuojančios bakterijos sudarė 11,4 proc., (n=13), α ir β hemoliziniai streptokokai – 10,5 proc., (n=12), plazmos nekoaguliuojantys stafilokokai nustatyti 2 mėginiuose, o kiti sukėlėjai – 3 mėginiuose. Mikroorganizmų rūšių pasiskirstymas pateiktas 5 paveiksle.
* lyginant su kitomis identifikuotų mikroorganizmų grupėmis p<0,05.
5 pav. Mikroorganizmų procentinis pasiskirstymas identifikuojant su MALDI biotipavimo sistema iki rūšies kraujo pasėlio mikrobiologinio tyrimo metu
Iš 102 teigiamų kraujo pasėlių, 11 kraujo pasėlių (10,8 proc.) buvo polimikrobiniai, tai reiškia, kad mėginyje buvo dvi ir daugiau kraujo infekcijos sukėlėjų rūšys, likę kraujo pasėlio mėginiai – monomikrobiniai – juose nustatyta 1 sukėlėjo rūšis.
Enterobacteriaceae šeima*, 61,4 proc. (n=70) α ir β hemoliziniai streptokokai, 10,5 proc. (n=12) Plazmos nekoaguliuojantys stafilokokai, 1,8 proc. (n=2) Enterokokai, 12,3 proc. (n=14) Acinetobacter spp. + P.aeruginosa, 11,4 proc. (n=13) Kiti, 2,6 proc. (n=3)
