FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS
UGNĖ MOKRECKAITĖ
PAPRASTŲJŲ JUODGALVIŲ (PRUNELLA VULGARIS L.) EKSTRAKTO
ĮTAKA IZOLIUOTŲ KRAUJAGYSLIŲ IR MIOKARDO
KONTRAKTILIŠKUMUI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė:
Doc. dr. Alė Laukevičienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FIZIOLOGIJOS IR FARMAKOLOGIJOS INSTITUTAS
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
PAPRASTŲJŲ JUODGALVIŲ (PRUNELLA VULGARIS L.) EKSTRAKTO
ĮTAKA IZOLIUOTŲ KRAUJAGYSLIŲ IR MIOKARDO
KONTRAKTILIŠKUMUI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc., Dr. Alė Laukevičienė
Data
Recenzentas Darbą atliko
Data
Magistrantė
Ugnė Mokreckaitė
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 SĄVOKOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) – augalo bendrasis aprašymas ... 12
1.2. Paprastųjų juodgalvių cheminė sudėtis ... 13
1.2.1. Flavonoidai ... 13 1.2.2. Triterpenoidai ... 13 1.2.3. Steroliai ... 13 1.2.4. Fenolinės rūgštys ... 14 1.2.5. Riebalų rūgštys ... 14 1.2.6. Lakūs aliejai ... 14 1.2.7. Kiti junginiai ... 14
1.3. Paprastųjų juodgalvių žolėje dominuojantys bioaktyvūs junginiai ... 15
1.4. Bioaktyvių junginių kiekių priklausomybė nuo surinktos augalo dalies ir vegetacijos periodo ... 17
1.5. Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų juodgalvių fenolinių junginių kiekis žaliavoje .. 17
1.6. Paprastųjų juogalvių farmakologinis aktyvumas ... 18
1.6.1. Antihipertenzinis aktyvumas ... 18
1.6.2. Antioksidacinis aktyvumas ... 18
1.6.3. Priešuždegiminis aktyvumas ... 19
1.6.4. Antialerginis aktyvumas ... 19
1.6.5. Antibakterinis aktyvumas ... 19
1.6.6. Veikimas į imuninę sistemą ... 20
1.7. Kraujagysles atpalaiduojančio poveikio mechanizmai ... 20
1.7.1. NO/cGMP kelias ... 21
1.8. Poveikio į širdies raumenį mechanizmas ... 22
2.1. Tyrimo objektai ... 23
2.2. Naudoti reagentai ... 24
2.3. Žaliavos rinkimas ir tiramųjų ekstraktų gamyba ... 25
2.3.1. Žaliavos rinkimas ... 25
2.3.2. Žaliavos paruošimas ... 25
2.3.3. Etanolinio ekstrakto gamyba ... 25
2.3.4. Vandeninio ekstrakto gamyba ... 26
2.4. Poveikio širdies funkcijai tyrimai ... 26
2.5. Poveikio kraujagyslių tonusui tyrimai ... 27
2.6. Statistinė analizė ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Preparatų įtaka širdies susitaukimų dažniui ... 30
3.2. Preparatų įtaka širdies susitaukimo jėgai ... 31
3.3. Preparatų įtaka žiurkės žarnyno pasaito kraujagyslių atsipalaidavimui ... 33
3.3.1. Vandeninio juodgalvių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai ... 33
3.3.2. Etanolio poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai... 34
3.3.3. Etanolinio juodgalvių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai ... 35
3.3.4. Etanolinio sukatžolių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai ... 36
3.3.5. Tiriamųjų preparatų poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai veikiant 10-5 M/l NA tirpalu ... 37
3.3.6. Tiriamųjų preparatų poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai veikiant 5×10-6 M/l NA . 38 3.4. Preparatų įtaka žiurkės žarnyno pasaito atpalaiduotoms kraujagyslėms ... 40
4. IŠVADOS... 41
SANTRAUKA
Ugnės Mokreckaitės magistro baigiamasis darbas. Mokslinio darbo vadovė doc. Dr. Alė Laukevičienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Fiziologijos ir farmakologijos institutas – Kaunas.
Pavadinimas: Paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) ekstrakto įtaka izoliuotų kraujagyslių ir miokardo kontraktiliškumui.
Tikslas: Ištirti paprastųjų juodgavių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką kraujagyslių ir miokardo kontraktiliškumui.
Uždaviniai: 1. Nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką širdies susitraukimo dažniui. 2. Nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką širdies susitraukimo jėgai. 3. Palyginti paprastųjų juodgalvių etanolinio ir vandeninio ekstrakto poveikį miokardo funkcijai. 4. Nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikį kraujagyslių tonusui. 5. Palyginti paprastųjų juodgalvių etanolinio ekstrakto poveikį kraujagyslėms su sukatžolių ekstrakto ir etanolio (70 %) sukeliamu atpalaiduojamuoju poveikiu. Metodai: Paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikis žiurkių žarnyno pasaito smulkiųjų arterjų funkcijai, tiriamas registruojant kraujagyslių susitraukimą ir atsipalaidavimą vielinės miografijos būdu. Paprastųjų juodgalvių ekstrakto poveikis miokardui tiriamas registruojant izoliuotos širdies izometrinio susitraukimo jėgą organų vonelėje.
Rezultatai ir išvados : Šiais eksperimentais nustatyta, kad vandeninis ir etanolinis juodgalvių ekstraktas turi širdies susitraukimo dažnį ir jėgą mažinantį poveikį. Didinant ekstrakto koncentraciją, poveikis stiprėja. Vandeninio ir etanolinio juodgalvių ekstrakto poveikis miokardo funkcijai nesiskyrė. Kraujagysles sutraukiantis paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikis nenustatytas. Vandeninis paprastųjų juodgalvių ekstraktas turi silpnesnį
kraujagysles atpalaiduojantį poveikį nei etanolinis juodgalvių ekstraktas. Etanolinio juodgalvių ekstrakto kraujagysles atpalaiduojantis poveikis buvo mažesnis nei sukatžolių etanolinio ekstrakto, bei reikšmingai nesiskyrė nuo etanolio (70 %).
SUMMARY
Master thesis by Ugnė Mokreckaitė. Supervisor doc. dr. Alė Laukevičienė. Lithuanian University of Health Sciences, Department of Physiology and Pharmacology – Kaunas.
Title: The effect of Prunella vulgaris L. herb extract on contractility of isolated mesenteric arteries and myocardium.
The aim: To investigate the effect of Prunella vulgaris L. herb aqueous and ethanolic extracts on isolated mesenteric arteries and myocardium contractility.
Goals of the study: 1. To determine the impact of aqueous and ethanolic Prunella vulgaris L. extracts on the heart rate. 2. To determine the impact of aqueous and ethanolic Prunella vulgaris L. extracts on the strength of heart contraction. 3. To compare effects of aqueous and ethanolic
Prunella vulgaris L. extracts on isolated myocardium function. 4. To compare the vasorelaxating
effect of ethanolic Prunella vulgaris L. extract, ethanol (70 %) and Leonurus cardiaca L. ethanolic extract. 5. To investigate vasoconstricting effects of aqueous and ethanolic Prunella vulgaris L. extracts.
Methods: The effects of aqueous and ethanolic Prunella vulgaris L. extracts on the heart rate and the strength of contraction were measured on isolated heart using force transducer in the organ bath. The effect of investigated samples to the vasoconstriction and vasorelaxation was carried out by small blood vessels wire myography.
Results and conclusions: Aqueous and ethanolic Prunella vulgaris L. herb extracts reduce the myocardial contraction force and the heart rate. The effect depends on the concentration of investigated plant extract: the higher extract doses were applied the stronger were the effects. Any difference between the effect of ethanolic and aqueous extracts on myocardium was detected. Ethanolic Prunella vulgaris L. extract expressed higher vasorelaxing activity than aqueous extract. The results showed that ethanolic Leonurus cardiaca L. extract has stronger vasorelaxing effect than ethanolic Prunella vulgaris L. extract, it had the same effect to isolated mesenteric arteries as ethanol (70 %). According to the data obtained Prunella vulgaris L. extracts do not cause any significant vasoconstricting effect.
SANTRUMPOS
% – procentai ml - mililitrai μl - mikrolitrai g - gramai l - litrai M - moliai NA – noradrenalinas KCl – kalio chloridasNaCl - natrio chloridas
KH2PO4 - kalio dihidrofosfatas
MgSO4×7H20 – magnio sulfatas heptahidratas CaCl2 – kalcio chloridas
SĄVOKOS
Kontraktiliškumas - raumens gebėjimas susitraukti.
Prekontrakcija - raumens sutraukimas prieš atliekant kitą procedūrą.
Vazokonstrikcija - kraujagyslių susitraukimas.
Vazodilatacija - kraujagyslių atsipalaidavimas.
ĮVADAS
Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) – notrelinių (Lamiaceae) šeimos augalas, sutinkamas šiaurinio pusrutulio vidutinėse platumose ir Australijoje. Tai įprastas, nuo seno žinomas augalas, naudotas kaip vaistinis, o Amerikos indėnų – kaip maistinis augalas [20, 31]. Lietuvoje juodgalvė plačiai paplitusi, savaime veša įvairiose pievose, dirvonuose, grioviuose. Augalas žinomas lietuvių liaudies medicinai. Lietuvių žolininkai jį naudoja tulžį ir kepenis stiprinantiems antpilams gaminti, taip pat gydyti kosuliui, gerklės skausmams, viduriavimui ir nemigai [32]. Šio augalo azijinio porūšio preparatai plačiai naudojami gydimui kinų tradicinėje medicinoje. Paskutiniais dešimtmečiais pradėti augalų vaistinių savybių moksliniai tyrimai. Šiais tyrimais tikimasi surasti alternatyvų įprastiems medikamentams, kai jų naudojimą stabdo šalutinis poveikis. Taip pat daug iš žolinių preparatų tikimasi lėtinių būklių gydymui ir profilaktikai. Tyrimai vyksta skirtingomis kryptimis – kaip ieškoma vis naujų veiksmingų augalų, taip gilinamasi ir į jų poveikio mechanizmus.
Savo darbe pasirinkome tirti paprastąją juodgalvę kaip mažai tyrinėtą augalą. 2016 m LSMU buvo nustatytas Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) bendras fenolinių junginių kiekis, jų antioksidantinis aktyvumas ir identifikuoti atskiri fenoliniai junginiai [2]. Kitokio pobūdžio tyrinėjimų nepavyko rasti. Absoliuti dauguma pasiekiamų rezultatų gauti tiriant azijinį juodgalvės porūšį. Yra mokslinių duomenų, kad paprastųjų juodgalvių žolė pasižymi įvairiu farmakologiniu poveikiu: antibakteriniu, antioksidaciniu, priešuždegiminiu, priešvėžiniu, antihipertenziniu veikimu ir kt [28]. Tai rodo gana dideles galimybes pritaikyti šio augalo preparatus šiolaikinėje medicinoje. Tačiau duomenys nėra gausūs, kai kuriais atvejais – prieštaringi ar pavieniai.
Šiame darbe daugiausia dėmesio skiriama paprastųjų juodgalvių poveikiui į širdies ir kraujagyslių funkciją tirti. Kraujagyslių tonusas ir širdies susitraukimų dažnis bei stiprumas yra svarbiausi kraujospūdžio reguliavimo veiksniai. Padidėjęs kraujo spaudimas viena dažniausių sveikatos problemų visame pasaulyje. Pasaulinė sveikatos organizcija (PSO) – šią problemą įvardija „tyliuoju žudiku“ [34]. Statistiniai tyrimai rodo, kad žmonių sergančių arterine hipertenzija skaičius vis didėja. 2015 metų tyrimo duomenimis pasaulyje yra apie 1,13 milijardo žmonių, kurie gyvena su padidėjusiu kraujospūdžiu. Tai yra apytiksliai septintadalis visoje planetoje esančių žmonių [46]. Tik apie trečdalis hipertenzijos atvejų yra sėkmingai kontroliuojamas vaistais [34]. Todėl aktualu ieškoti naujų poveikio priemonių. Vienas iš galimų hipertenzijos gydimo būdų – gydymas
augaliniais produktais. Šio darbo tikslas eksperimentinėmis sąlygomis įvertinti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikį širdies ir kraujagyslių kontraktiliškumui. Darbo naujumas. Pirmą kartą tiriamas Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų juodgalvių poveikis širdies miokardo funkcijai ir kraujagyslių kontraktiliškumui. Nėra duomenų, kad literatūroje aptariamas paprastųjų juodgalvių žolės poveikis buvo vertinamas eksperimentiškai, širdies miokardą veikiant etanoliniu juodgalvių ekstraktu in vitro.
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Ištirti paprastųjų juodgavių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką kraujagyslių ir miokardo kontraktiliškumui.
Uždaviniai:
• Nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką širdies susitraukimo dažniui.
• Nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką širdies susitraukimo jėgai.
• Palyginti paprastųjų juodgalvių etanolinio ir vandeninio ekstrakto poveikį miokardo funkcijai.
• Nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikį kraujagyslių tonusui.
• Palyginti paprastųjų juodgalvių etanolinio ekstrakto poveikį kraujagyslėms su standartizuotu sukatžolių ekstraktu.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) – augalo bendrasis
aprašymas
Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) – notrelinių (Lamiaceae) šeimos augalas paplitęs šiaurės vakarų Afrikoje, šiaurės Amerikoje, šiltesniuose Europos ir Azijos regionuose, taip pat ir Lietuvoje [31, 32]. Tai daugiametis, 10-45 cm aukščio žolinis augalas. Stiebas stačias arba prie pagrindo kiek išsilenkęs, keturbriaunis, rausvas. Lapai, išskyrus viršutinę porą, kotuoti, kiaušiniški arba pailgai lancetiški, lygiakraščiai. Žiedų menturiai susitelkę į varpas. Vainikėlis violetinis arba melsvai violetinis. Augalas plinta sėklomis arba palaipomis, lapų pažastyse leisdamas šaknis. Vaisius – kiaušiniškas, 1,5-2,0 mm ilgio ir apie 1 mm skersmens, tribriaunis riešutėlis. Žydi birželio – rugsėjo mėn. Auga miškuose, pamiškėse, krūmuose, pievose [17, 43].
Kaip žaliava naudojama paprastųjų juodgalvių žolė. Renkama žydėjimo metu. Džiovinama gerai vėdinamoje vietoje, ne aukštesnėje kaip 45 0C temperatūroje. Laikoma gerai vėdinamoje, sausoje, tamsioje patalpoje [31, 32].
1.2. Paprastųjų juodgalvių cheminė sudėtis
1.2.1. Flavonoidai
Flavonoidai – didelė organinių heterociklinių junginių grupė, kurios atstovai dėl būdingo antioksidacinio poveikio, tiriami ir pritaikomi medicinos srityje. Flavonoidai, pagal įvairius C žiedo pokyčius, skirstomi į šešias grupes, kurių atstovai nustatyti ir paprastųjų juodgalvių žolėje.
Paprastųjų juodgalvių žolėje kaupiami flavonoidai: 1) Flavonai (apigeninas, luteolinas).
2) Flavanoliai (katechinas).
3) Flavonoliai (kvercetinas, rutinas, kemferolis). 4) Flavononai (hesperidinas).
5) Izoflavonai (gliciteinas).
Antocianinai (delfinidinas, cianidinas) [10, 16, 17, 18, 39 ].
1.2.2. Triterpenoidai
Triterpeninoidai – bioaktyvūs junginiai, kartu su steroidiniais glikozidais sudarantys saponinų grupę. Triterpenoidai pasižymi antibakteriniu, priešgrybeliniu, citotoksiniu, antihelmintiniu poveikiu. Paprastųjų juodgalvių žolėje vyraujantys triterpenoidai: ursolo ir oleanolo rūgštys. Taip pat nustatyta betulino rūgštis ir jos dariniai [3, 16, 17, 18, ].
1.2.3. Steroliai
Augalinės kilmės steroliai vadinami fitosteroliais. Šie junginiai medicinoje naudojami chlesteroliui mažinti bei širdies ligų profilaktikai [3, 4] . Paprastųjų juodgalvių žolėje nustatyta įvairių šios grupės atstovų. Didžiausi kiekiai aptinkami β-sitosterolio, stigmasterolio, α-spinasterolio, stigmast-7-en-3-β-olio ir šių junginių glikozidų [4, 33].
1.2.4. Fenolinės rūgštys
Fenolinės rūgštys yra dar viena didelė junginių grupė, kurios atstovus galima išskirti iš paprastosios juodgalvės žolės. Tyrimais įrodyta, kad šie junginiai pasižymi antioksidaciniu, citotoksiniu, antiproliferaciniu, priešuždegiminiu ir antibakteriniu veikimu. Paprastųjų juodgalvių žolėje nustatyti šios grupės junginiai: rozmarino rūgštis, kofeino rūgštis (cis- ir trans- izomerai), p - kumarino rūgštis ir kiti kumarino tipo dariniai, pavyzdžiui, umbeliferonas, skopoletinas ir kt [4, 10, 16, 33].
1.2.5. Riebalų rūgštys
Riebalų rūgštys – junginių grupė, kurios atstovai pasižymi antibakteriniu aktyvumu. Paprastųjų juodgalvių žolėje yra nustatytos šios riebalų rūgštys: oleino, linoleno, lauro, stearino, palmitino, arachidono ir kitos [4, 31, 33].
1.2.6. Lakūs aliejai
Lakūs aliejai pasižymi antibakteriniu, priešvirusiniu, priešuždegiminiu, antioksidantiniu, antimutageniniu ir antikarcinogeniniu poveikiu. Paprastųjų juodgalvių žolėje didžiausi kiekiai aptinkami šių lakių aliejų: 1,8 - eukaliptolio ir beta pineno. Taip pat yra nustatyti: mircenas, lanalolis, alfa kamfora, linalinacetatas, alfa felandrenas, linalolis ir kiti [4, 31, 33].
1.2.7. Kiti junginiai
Paprastųjų juodgalvių žolė kaupia tokius junginius kaip: • vitaminai: A, B1, C, K, PP;
• eteriniai aliejai: 1,8-eukaliptolis, β – pinenas, mircenas, linalilacetatas, α – felandrenas, linalolis, 1,8-eukaliptolis, β – pinenas;
• kiti junginiai: alkaloidai, taninai, lipidai, proteinai, alkaloidai, riebalų aliejai, eteriniai aliejai, angliavandeniai, baltymai [4, 31, 33].
1.3. Paprastųjų juodgalvių žolėje dominuojantys bioaktyvūs junginiai
Tyrimais nustatyti trys, juodgalvėse dažniausiai dominuojantys bioaktyvūs junginiai: ursolo rūgštis, rozmarino rūgštis ir betulinė rūgštis. Nustatyta, kad iš visų fenolinių junginių didžiausi randami kiekiai – rozmarino rūgšties [ 6, 7].
Paprastųjų juodgalvių ekstrakto antihipertenzinį aktyvumą gali lemti fenoliniai ir tritepeniniai cheminiai junginiai. Fenoliniai junginiai: rozmarino rūgštis, kavos rūgštis, kvercetinas, rutinas [37]. Fenolinių junginių struktūrinės formulės pateikiamos žemiau (2-8 pav.).
O H OH OH OH O OH O
2 pav. Rozmarino rūgštis 3. pav. Kvercetinas O H O H O H O H O O O H O H H
CH3 O H OH OH OH OH O H O OH O H O H O H O O O O O H H H H H H H H H H O H O H O OH H H
4 pav. Rutinas 5 pav. Kavos rūgštis
Triterpeniniai junginiai: ursolo ir oleanolo rūgštis. Struktūrinės formulės:
C H3 C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH 3 OH O O H H H H H C H3 C H3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH3 OH O O H H H H H H H
6 pav. Oleanolo rūgštis 7 pav. Ursolo rūgštis
C H2 CH3 CH3 CH3 C H3 CH3 CH3 OH O O H H H H H H H
1.4. Bioaktyvių junginių kiekių priklausomybė nuo surinktos augalo dalies
ir vegetacijos periodo
Kinijoje atliktas tyrimas siekiant palyginti trijų bioaktyvių junginių: ursolo rūgšties, rozmarino rūgšties ir oleinolo rūgšties kiekius skirtingais juodgalvių vegetacijos periodais. Didžiausi šių bioaktyvių junginių kiekiai nustatyti žydėjimo metu. Taip pat, tyrimo metu nustatyta, kad didesni anksčiau minėtų bioaktyvių junginių kiekiai kaupiami juodgalvių lapuose, o ne stiebuose [7].
Lietuvoje atlikti fenolinių junginių nustatymo tyrimai rodo, kad daugiausia fenolinių junginių paprastųjų juodgalvių žolė kaupia žieduose [2].
1.5. Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų juodgalvių fenolinių junginių
kiekis žaliavoje
Bendras fenolinių junginių kiekis įvairiose Lietuvos augavietėse skiriasi. Atlikus tyrimą nustatyta, kad rinktoje žolėje šių junginių kiekis varijuoja nuo 64,77±3,29 mg/g iki 91,21±2,79 mg/g (p<0,05), vidurkis būtų 73,8±2,50 mg/g [2].
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo identifikuoti šie fenoliniai junginiai: rozmarino rūgštis, rutinas, chlorogeno rūgštis. Lentelėje pateikiami skirtingose Lietuvos augavietėse augančių juodgalvių žolės atskirų fenolinių junginių kiekis žaliavoje [2].
1 lentelė. Identifikuotų fenolinių junginių kiekis Prunella vulgaris L. žolėje. Junginio pavadinimas Kiekis intervale mg/g Vidurkis mg/g
Rutinas 3,90±0,11 - 8,08±0,17 5,42±0,17
Rozmarino rūgštis 2,92±0,84 - 51,12±0,10 37,86±1,07 Chlorogeno rūgštis 0,44±0,01 - 0,94±0,03 0,64±0,02 *- 10 µl etanolinio ekstrakto atitinka 0,0001 g žaliavos
1.6. Paprastųjų juodgalvių farmakologinis aktyvumas
1.6.1. Antihipertenzinis aktyvumas
Paprastųjų juodgalvių etanolinis ir vandeninis ekstraktas pasižymi antihipertenzinėmis savybėmis. Šis aktyvumas buvo parodytas atliekant eksperimentus in vivo su žiurkėmis, kurioms buvo sukelta spontaninė hipertenzija. Šiuos gyvūnus gydant tiek vandeniniu, tiek etanoliniu ekstraktu pastebėtas reikšmingas padidėjusio kraujospūdžio rodiklius mažinantis ir nuo preparato dozės priklausomas poveikis [5]. Taip pat, paprastųjų juodgalvių antihipertenzinis poveikis aprašytas ir atlikus eksperimentus su triušiais [23]. Manoma, kad paprastųjų juodgalvių preparatų antihipertenzinį poveikį lemia tokie junginiai kaip ursolo rūgštis, oleanolo rūgštis, betulino rūgštis, kurie veikia endotelio NO sintazės aktyvumą ir sukelia kraujagyslių atsipalaidavimą [44].
Ankstesni tyrimai in vitro taip pat pagrindžia paprastųjų juodgalvių antihipertenzinį aktyvumą. Pavyzdžiui, atliekant izometrinius eksperimentus su izoliuotomis žiurkių aortos dalimis nustatyta, kad paprastųjų juodgalvių ekstraktas sukelia fenilefrinu sutrauktų šių kraujagyslių atsipalaidavimą [45].
Atlikus tyrimus in vivo su izoliuotomis varlių širdimis pastebėta, kad paprastųjų juodgalvių vandeninio ekstrakto poveikis širdies darbui nėra vienareikšmis. Tyrimo rezultatai parodė, veikiant mažomis preparato koncentracijomis paprastųjų juodgalvių ekstraktas padidina širdies susitraukimo dažnį ir susitraukimo jėgą, o veikiant didesnėmis koncentracijomis, sumažina minėtus rodiklius [12].
1.6.2. Antioksidacinis aktyvumas
Tyrimais pagrįsta, kad papratųjų juodgalvių žolė kaupia antioksidantiniu veikimu pasižyminčius polisacharidus [1, 21, 26, 27]. Paprastųjų juodgalvių 60 proc. etanolinio ekstrakto antioksidantinis aktyvumas in vitro ir in vivo buvo parodytas atliekant eksperimentus su pelėmis, kurioms sukelti vėžiniai navikai. Nustatyta, kad paprastųjų juodgalvių žolėje esantys fenoliniai junginiai stabdo naviko augimą [14, 21, 27]. Taip pat, tyrimais įrodyta, kad paprastųjų juodgalvių vandeninis
ekstraktas žiurkių inkstų ir smegenų ląstelėse reikšmingai slopina eritrocitų hemolizę ir lipidų peroksidaciją [29].
1.6.3. Priešuždegiminis aktyvumas
Paprastųjų juodgalvių etanolinio ekstrakto priešuždegiminis aktyvumas buvo stebėtas atlikus tyrimus su pelių makrofagų ląstelių kultūromis. Šis poveikis siejamas su rozmarino rūgšties priešuždegiminiu aktyvumu [25]. Augalo priešuždegiminį aktyvumą patvirtina ir tyrimas, kuriame buvo tirtas paprastųjų juodgalvių žolės etanolinio ekstrakto priešuždegiminis aktyvumas įvairiose tirpiklių frakcijose (heksano, butanolio, chloroformo ir vandens). Atlikus eksperimentus in vitro nustatyta, kad visos tirtosios frakcijos, o stipriausiai iš jų – heksano frakcija, slopina prostaglandino E2 gamybą, NO sintazės gamybą, ciklooksigenazės (COX-2), naviko nekrozės faktoriaus α mRNA ekspresiją [22]. Atlikus eksperimentus su žmogaus aortos lygiųjų raumenų ląstelėmis nustatyta, kad paprastųjų juodgalvių etanolinis ekstraktas reguliuoja TNF-α-indukuojamus procesus, kas sukelia reikšmingą priešuždegiminį poveikį. Dėl šios priežasties, paprastųjų juodgalvių ekstraktas galėtų būti naudojamas aterosklerozės profilaktikai [35].
1.6.4. Antialerginis aktyvumas
Iš paprastųjų juodgalvių vandeninio ekstrakto išgaunami triterpeniniai ir steroidiniai junginiai, pasižymintys naviko nekrozės faktoriaus (TNF-α), interleukino 6 (IL-6) ir histamino išsiskyrimą mažinančiu poveikiu [11]. Kitame tyrime iš paprastųjų juodgalvių žolės buvo išgauti triterpeniniai junginiai, betulinė rūgštis, urosolo rūgštis, 2 alfa,3 alfa-dihidroksi-12-en-28 rūgštis, ir 2 alfa- hidroksi urasolinė rūgštis. Atlikus tyrimus in vitro buvo nustatytas šių junginių antialerginis aktyvumas [38].
1.6.5. Antibakterinis aktyvumas
Paprastųjų juodgalvių ekstraktas veikia prieš gram-teigiamas bakterijas [36]. Ekstrakto poveikis mikroorganizmams priklauso nuo jų rūšies. Manoma, kad svarbiausi junginiai, lemiantys paprastųjų juodgalvių antimikrobinį aktyvumą – triterpenoidai: oleanolo rūgštis ir ursolo rūgštys [24]. Tyrimais nustatyta, kad etanolinis paprastųjų juodgalvių ekstraktas pasižymi stipresniu antimikrobiniu poveikiu, nei vandeninis ar metanolinis juodgalvių ekstraktas. Šio augalo etanolinis
ekstraktas pasižymi didžiausiu antibakteriniu aktyvumu prieš Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Bacillus cereus mikroorganizmų ir Aspergillus niger pelėsio
kultūras [30].
1.6.6. Veikimas į imuninę sistemą
Paprastųjų juodgalvių ekstrakto poveikis į įmuninį atsaką priklauso nuo eksperimento sąlygų, todėl nėra vertinamas vienareikšmiškai. Atlikti tyrimai su pelėmis parodė, kad paprastųjų juodgalvių etanolinis ekstraktas slopina tiek ląstelinį, tiek humoralinį imuninį atsaką. Tai rodo, kad ekstraktas gali būti pritaikomas siekiant imunosupresinio poveikio [40]. Kitame tyrime, naudojant įvairias monocitų ir makrofagų linijas, buvo nustatyta, kad paprastųjų juodgalvių ekstraktas reikšmingai stimuliuoja monocitų ir makrofagų aktyvumą [13]. Vėlesni tyrimai su žuvimis parodė, kad paprastųjų juodgalvių etanolinis ekstraktas aktyvina nespecifinį imuninės sistemos atsaką ir reikšmingai mažina žuvų mirtingumą nuo U. marinum sukeliamos infekcijos [19].
1.7. Kraujagysles atpalaiduojančio poveikio mechanizmai
Tyrėjai pateikia eilę mechanizmų, kurių dėka augaliniai preparati galimai atpalaiduoja kraujagysles. Dažnai tas pats preparatas pasižymi dviem ar daugiau poveikio mechanizmų. Kraujagyslės gali būti atpalaiduojamos arba nuo endotelio priklausomu, arba nepriklausomu būdu. Endotelis išskiria visą eilę kraujagyslių tonusą veikiančių faktorių. Tarp kraujagysles atpalaiduojančių faktorių dažniausiai minimi: endotelio kilmės atpalaiduojantis faktorius (EDRF), kuris identifikuotas kaip NO, prostaglandinas E2 ir endotelio kilmės hiperpoliarizuojantis faktorius (EDHF). Pastarojo nustatytas veikimo kelias – mechanizmas yra susijęs su nuo Ca++ priklausomų K+ kanalų aktyvinimu, bet cheminė EDHF prigimtis tebėra neidentifikuota. Augalinės kilmės medžiagos ir preparatai gali veikti arba nuo endotelio priklausomu būdu, arba nepriklausomu, arba abiem iš jų [42].
Literatūroje aprašyti pagrindiniai vazodilataciniai mechanizmai, kuriais aiškinamas augalų antihipertenzinis poveikis:
Veikimas NO/cGMP keliu
Veikimas PGI2/cAMP keliu. Prostaglandinas I2 (PGI2) yra kraujagysles atpalaiduojantis eikozanoidas, gaminamas fermento ciklooksigenazės (COX) iš arachidono rūgšties.
Prostaciklino gamyba prasideda, kai paveikiamas su G-baltymu susijęs receptorius, kuris aktyvina adenilatciklazę (AC) ir didina cAMP susidarymą. Taip pat yra nuorodų, kad kai kurios augalų aktyviosios medžiagos didina AC ar cAMP gamybą be PGI2 išskyrimo.
Diesterazės (PDEs) slopinimas. Ciklinių nukleotidų fosfodiesterazės (PDEs) – kontroliuoja cAMF ir cGMF lygį skaidydamos juos. Fosfodiesterazių slopinimas didina ciklinių nukleotidų lygį lygiųjų raumenų ląstelėje ir tokiu būdu juos atpalaiduoja. Eilė junginių, tarp jų flavonoidai, yra parodyti kaip PDEs inhibitoriai.
Kalio kanalų aktyvavimas. Kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelų membranose minimi skirtingų tipų K+
kanalai. K+ kanalų atidarymas didina K+ išėjimą, tokiu būdu – hiperpoliarizuoja ląstelę ir mažina Ca++
įėjimą į ląstelės vidų ir raumens susitraukimą.
Kalcio jonų koncentracijos mažinimas ląstelės viduje. Preparatai galimai veikia į kelis Ca++ kanalų tipus: membranos potencialo valdomų ir/arba su receptoriais susijusių Ca++
kanalų, o taip pat sarkoplazminio tinklo Ca++ kanalus juos blokuodami. Taip pat buvo parodytas poveikis į endotelio ir lygiųjų raumenų katijonų kanalus, reguliuojamus trumpalaikiu potencialu (Transient receptor potential (TRP) cation channels), kurie leidžia Ca++
įeiti į ląstelę nepriklausomai nuo membranos potencialo. Šių kanalų aktyvatoriai yra su maistu gaunamos molekulės, taip pat augalų veikliosios medžiagos, randamos, pvz., čiobrelių žolėje ir garstyčių sėklose [42].
Juodgalvės preparatų poveikio mechanizmas kraujagyslių atpalaidavumui, sprendžiant iš negausių literatūros šalinių, mažai tirtas. Radome duomenų, kad paprastosios juodgalvės vandeninis ekstraktas stimuliuoja endotelio NO sintazę [44].
1.7.1. NO/cGMP kelias
Tyrimais įrodyta, kad tam tikrų augalų ekstraktuose esantys komponentai geba aktyvinti net tris NO sintazės izoformas: indukuojamąją (iNOS), endotelio (eNOS) ir neuronų sintazę (nNOS). Išsiskyręs NO gali plėsti visų tipų kraujagysles. Išsiskyrus NO padidėja cGMF kiekis, sukeliamas miozino lengvosios grandinės defosforilinimas, dėl ko susilpnėja miozino sąveika su aktinu ir kraujagyslės atsipalaiduoja [42, 44].
Literatūros šaltiniuose nurodoma, kad augalinių preparatų relaksuojantis poveikis gali pasireikšti dėl endotelinės NO sintazės (eNOS) ekspresijos arba aktyvumo didinimo, o taip pat dėl poveikio į tirpiosios guanilatciklazės (sGS) aktyvumą ar ekspresiją lygiuosiuose raumenyse [42].
Nustatyti tam tikri junginiai kurie gali lemti eNOS ekspresiją. Tai pentacikliai triterpenai, betulinė rūgštis, kai kurie flavanoidai (pvz.: cinarozidas, luteolinas), alkaloidai. Taip pat, nustatyti junginiai lemiantys eNOS aktyvavimą: alfa terpineolis, metil-eugenolis ir kiti [15, 42].
1.8. Poveikio į širdies raumenį mechanizmas
Tyrimais nustatyta, kad tam tikri augalų kaupiami steroidiniai junginiai pasižymi inotropiniu poveikiu. Šis procesas aiškinamas tuo, kad augaluose esantys steroidiniai junginiai (pavyzdžiui bufalinas, oleanolo rūgštis, ursolo rūgštis) sutrikdo širdies raumens ląstelių membranose esančio Na+/K + siurblio veiklą. Dėl šios priežasties, natrio jonai kaupiasi ląstelės viduje. Šalinant Na+ jonus į ląstelės vidų patenka daugiau kalcio jonų kas sukelia intropinį poveikį (didėja širdies susitraukimo jėga) [9, 42].
Manoma, kad steroidiniai junginiai geba veikti širdies raumenį, nes jų struktūra panaši į širdies glikozidų, kurių vienas pagrindinių struktūrinių elementų yra steroidinis žiedas. Paprastųjų juodgalvių žolė pasižymi širdies susitraukimo jėgą mažinančiu poveikiu, nes kaupia triterpeninius junginius turinčius steroidinį žiedą: ursolo rūgštį ir oleanolo rūgštį [8].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektai
Tyrimams naudoti gyvūnai
Eksperimentai buvo naudojamos suaugusių (12 – 20 savaičių) vyriškos lyties 250-300 g svorio
Wistar žiurkių žarnyno pasaitos smulkiosios arterijos. Gyvūnai gauti iš LSMU VA Vivariumo,
naudoti bendradarbiaujant su LSMU MA Neuromokslų istituto Biochemijos laboratorijos mokslininkų grupėmis (vad. Prof. Vilmantė Borutaitė ir Prof. Dr. Ramunė Morkūnienė), pagal
Lietuvos maisto ir veterinarijos tarnybos leidimą. Eksperimentų su gyvūnais metu buvo laikomasi
taisyklių, nurodytų Europos konvencijoje dėl eksperimentiniais ir kitais mokslo tikslais naudojamų stuburinių gyvūnų apsaugos.
Eksperimentams buvo naudotos suaugusios pievinės varlės (lot. Rana temporaria), 18 – 25 g svorio. Gyvūnai gauti privačiai iš Lietuvos zoologijos sodo herpetologijos skyriaus. Eksperimentai atliekami laikantis nuostatų, pagal kurias buvo gautas Lietuvos maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas naudoti pievines varles mokymo tikslais Nr. 0082.
Tyrimamas naudoti gyvūnų organai:
Izoliuota varlės širdis.
Žiurkių žarnyno pasaito smulkosios arterjos.
Kiti objektai:
Vandeninis juodgalvių ekstraktas, Etanolinis juodgalvių ekstraktas, Etanolis 70 %,
2.2. Naudoti reagentai
Eksperimento metu naudojami reagentai:
Modifikuotas Ringerio tirpalas I šaltakraujams. Šis tirpalas buvo gaminamas bidistiliuotame vandenyje tirpinant reikalingas druskas. Tirpalo pH=7,3. Tirpalo sudėtis (1 litrui):
NaCl – 6,604 g;
KCl – 0,140 g;
CaCl2 – 0,120 g;
NaHCO3 – 0,210 g.
Modifikuotas Ringerio tirpalas II (žiurkių organams). Šis tirpalas buvo gaminamas bidistiliuotame vandenyje tirpinant tam tikras druskas. Tirpalo pH=7,3. Ringerio tirpalo sudėtis (1 litrui): NaCl – 7,598 g; KCl – 0,35 g; KH2PO4 - 0,16 g; MgSO4×7H20 – 0,29 g; CaCl2 – 1,6 ml; NaHCO3 – 1,25 g; gliukozės – 1,0 g; EDTA – 0,01 g.
Noradrenalinas (NA). Eksperimento metu buvo naudota noradrenalino koncentracija 10 -2 M/l.
Tiriamieji reagentai:
Vandeninis juodgalvių ekstraktas. Etanolis (70%).
Etanolinis juodgalvių ekstrakatas. Etanolinis sukatžolių ekstraktas.
2.3. Žaliavos rinkimas ir tiramųjų ekstraktų gamyba
2.3.1. Žaliavos rinkimas
Žaliava – paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) žolė, rinkta 2016 m liepos mėnesį (masinio žydėjimo metu). Pasirinkta augavietė – Jurbarko rajonas, Seredžiaus miestelis, pieva.
2.3.2. Žaliavos paruošimas
Surinkta žaliava džiovinama kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių. Sudžiovinta žaliava laikoma sausoje vietoje taip pat apsaugotoje nuo saulės spindulių.
Prieš gaminat ekstraktus žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu (Binatone, Jungtinė Karalystė).
2.3.3. Etanolinio ekstrakto gamyba
Ekstraktas gaminamas laikantis žaliavos ir ekstrahento santykio 1:100. Gaminant 30 ml ekstrakto atsveriama 0,30 g susmulkintos žaliavos (0,0001 g tikslumu) ir užpilama 30 ml tirpiklio. Etanolinio paprastųjų juodgalvių ekstrakto gamybai naudojamas 70 % V/V etanolis. Ekstrakcija vykdoma ultragarsinėje vonelėje. Ekstrahuojama 15 min 25 0C temperatūroje. Pagamintas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliukus. Ekstraktas eksperimentams sunaudojamas per 1 savaitę po pagaminimo.
2.3.4. Vandeninio ekstrakto gamyba
Ekstraktas gaminamas laikantis žaliavos ir ekstrahento santykio 1:100. Gaminant 30 ml ekstrakto atsveriama 0,30 g susmulkintos žaliavos (0,0001 g tikslumu) ir užpilama 30 ml tirpiklio. Vandeninio paprastųjų juodgalvių ekstrakto gamybai naudojamas išgrynintas vanduo. Ekstrakcija vykdoma ultragarsinėje vonelėje. Ekstrahuojama 15 min 250C temperatūroje. Pagamintas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliuką. Ekstraktas eksperimentams naudojamas 1 savaitę po pagaminimo. Laikomas šaldytuve ( +6 0C temperatūroje).
2.4. Poveikio širdies funkcijai tyrimai
Varlės dekapituojamos aštriomis žirklėmis. Suardomos stuburo smegenys įvedant adatą į stuburo kanalą. Atveriama krūtinės ertmė. Išimta širdis talpinama į organų vonelę (Radnoti), užpildytą varlių fiziologinėms savybėms pritaiktytu, modifikuotu Ringerio (I) tirpalu. Naudotas tirpalo tūris – 30 ml. Eksperimentas atliekamas kambario temperatūros sąlygomis (23 – 250C). Vonelėje širdis tvirtinama prie jėgos daviklio su stiprintuvu (AD Instruments). Duomenys fiksuojami naudojant duomenų rinkimo ir analizės programą LabChart (AD Instruments).
Eksperimento protokolas. Pritvirtinus varlės širdį prie daviklio ir panardinus ją į Ringerio (I) tirpalą, laukiama apie 30 min, kad stabilizuotųsi širdies ritmas ir jėga. Po to į vonelę pridedama noradrenalino 10 µl NA, kurio koncentracija 0,01 M/l , ir registruojamas širdies susitraukimo dažnio ir jėgos pokytis kas 3 min pridedant tam tikrą kiekį tiriamojo preparato. Širdies susitraukimo dažnis ir jėga fiksuojami, kai ekspeimentinėje vonelėje yra šios tiriamojo preparato koncentracijos (µl/ml): 0,33; 0,67; 1,67; 2,33; 3,00; 4,67; 6,33; 8,00; 10,00. Maksimali preparato koncentracija vonelėje -10,00 µL/ml, kurią pasiekus preparatas pašalinamas, vonelė kelis kartus perplaunama Ringerio (I) tirpalu. Tada, palaukus kol ŠSD ir jėga stabilizuojasi (apie 10 min.), širdis iš naujo veikiama NA tirpalu, eksperimentas kartojamas naudojant kitą tiriamąjį preparatą.
Tyrimas atliekamas siekiant nustatyti paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto įtaką širdies susitraukimų dažniui ir jėgai. Tyrimo metu, į organų vonelę patalpinta širdis veikiama skirtingomis juodgalvių vandeninio ar etanolinio ekstrakto koncentracijomis. Įlašinus tam tikrą
kiekį ekstrakto, suskaičiuojamas širdies susitraukimų dažnis ir fiksuojama širdies susitraukimo jėga (mN). Etanolinio ekstrakto kontrolei naudojamas 70 % etanolis.
2.5. Poveikio kraujagyslių tonusui tyrimai
Žiurkės buvo numarinamos naudojant CO2 dujas, dekapituojamos. Atvėrus pilvo ertmę, išimama plonasis žarnynas su pasaitu ir dedamas į atšaldytą (4 – 6°C) Ringerio (II) tirpalą. Pasaito smulkiosios arterijos preparuojamos stebint pro optinį mikroskopą (Olympus, Japonija), atskiriamos nuo šalia esančių venų, atlaisvinamos nuo dengiančių riebalų ir patalpinamos į DMT (Danish Myo Technology) miografo (versija 520A , DMT, Danija) (9 pav.) vonelę. Pasirinktų kraujagyslių diametras 200-350 μm, ilgis – apie2 mm. Paruošta kraujagyslės dalis tvirtinama miografo vonelėje prie mikrometro ir prie jėgos daviklio įvedant į spindį dvi plienines 40 μm skersmens vielas. Vonelė, kurioje yra pritvirtinamos kraujagyslės, pripildoma 10 ml Ringerio (II) tirpalo. Kraujagyslių susitraukimas ir atsipalaidavimas registruojamas duomenų rinkimo ir analizės programa LabChart (AD Instruments).
Eksperimento protokolas. Eksperimento metu palaikomos fiziologinės sąlygos. Temperatūra vonelėje – 370C. Deguonies (95%) ir anglies dioksido (5%) mišinys nepertraukiamai tiekiamas į vonelėje esantį Ringerio (II) tirpalą. Prieš eksperimentą atliekama kraujagyslių DMT standartizuota įtempimo normalizavimo procedūra, leidžianti visoms kraujagyslėms pasiekti vienodą įtempimą – atitinkantį 90 mm Hg stulpelio spaudimo sukeliamą kraujagyslės sienelės įtempimą. Kraujagyslių susiraukimo ir atsipalaidavimo funkcija patikrinta naudojant standartinius reagentus: 0,01 M/l noradrenalino ir 0,01 M/l acetilcholino tirpalus.
Tiriant atpalaiduojantį ekstrakto poveikį, taikoma kraujagyslės prekontrakcija – išankstinis sutraukimas. Kraujagyslių prekontrakcijai naudojamas noradrenalinas (NA). Pradedant eksperimentą kraujagyslės sutraukiamos noradrenalinu: į eksperimentinę vonelę, kurioje yra 10 ml Ringerio (II) tirpalo įšvirkščiama 5 µl ar 10 µl NA tirpalo, kurio koncentracija 0,01 M/l.Vonelėje gaunama atitinkamai 5×10 -6
M/l ar 10 -5 M/l noradrenalino koncentracija. Tiriant atpalaiduojamąjį kiekvieno reagento poveikį prekontrakcijai iš pradžių naudojama didesnė noradrenalino koncentracija: NA koncentracija vonelėje 10 -5
M/l. Po to poveikis tiriamas naudojant mažesnę NA koncentraciją: NA koncentracija vonelėje 5×10 -6
M/l. Pridėjus NA, tiriamasis preparatas į vonelę lašinamas apytiksliai po 1 min, kai kraujagyslės susitraukimas stabilizuojasi - pasiekia plato.
Tiriamieji preparatai: vandeninis juodglavių ekstraktas, etanolis (70%) , etanolinis juodgalvių ekstraktas, etanolinis sukatžolių ekstraktas. Etanolis (70%) naudojamas kontrolei, kad būtų galima įvertinti galimą tirpiklio įtaką etanolinio ekstrakto atpalaiduojančiam poveikiui. Etanolinio sukatžolių ekstrakto kraujagysles atpalaiduojantis poveikis stebimas tam, kad būtų galima palyginti su etanoliniu juodgalvių ekstraktu. Šis ekstraktas pasirinktas, nes paprastoji sukatžolė (lot. Leonurus
cardiaca) yra plačiai ištirtas augalas, įtrauktas į Europos farmakopėją, bei šio augalo kraujagysles
atpalaiduojantis poveikis yra patvirtintas analogiškais miografiniais tyrimais, atliktais LSMU [1]. Kiekvieno iš šių preparatų atpalaiduojamasis poveikis tiriamas taip: noradrenalinu sutraukus kraujagyslės raumenis, kas minutę švirkščiamas tam tikras pasirinkto tiriamojo preparato kiekis (0,1 ml). Procedūra kartojama tris kartus. Duomenys fiksuojami, kai tiriamojo preparato koncentracija vonelėje yra: 10 µl/ml, 20 µl/ml arba 30 µl/ml. Ištyrus preparatą nurodyta seka, iš vonelės tirpalas išsiurbiamas. Vonelė kelis kartus perplaunama Ringerio (II) tirpalu.
Paprastųjų juodgalvių ekstraktų kraujagysles sutraukiantis poveikis buvo tiriamas lašinant preparatus į vonelę, kai kraujagyslės yra atpalaiduotos. Siekiant sukelti susitraukimą buvo naudojamos šios preparato koncentracijos: 10 µl/ml, 20 µl/ml, 30 µl/ml, 100 µl/ml ir 200 µl/ml.
2.6. Statistinė analizė
Skirtumai tarp priklausomų grupių reikšmių įvertinti bifaktorine ANOVA taikant Tukey post hoc testą. Statistinė analizė atlikta naudojant Prism v. 5.04 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) programų paketą. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± standartinės procentinės vidurkio paklaidų reikšmės. Skirtumas tarp grupių laikomas statistiškai patikimu, kai p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Preparatų įtaka širdies susitaukimų dažniui
Vertinant vandeninio juodgalvių ekstrakto įtaką širdies susitraukimo dažniui (ŠSD) koncentracijos ribose nuo 0 iki 1,00 µl/ml poveikio nepastebėta (p>0,05). Nustatytas reikšmingas ŠSD sumažėjimas kintant vandeninių juodgalvių ekstrakto koncentracijai vonelėje nuo 1,67 µl/ml iki 10,00 µl/ml. Didžiausias poveikis pasiektas, kai eksperimentinėje vonelėje vandeninio paprastųjų juodgalvių ekstrakto kiekis padidintas iki 10,00 µl/ml, ŠSD sumažėjo daugiau nei 20 % pradinės vertės (p<0,05) (10 pav.).
10 pav. Vandeninio ir etanolinio juodgalvių ekstraktų poveikis širdies susitraukimų dažniui (ŠSD %), noradrenalino fone, n =11. ŠSD prieš poveikį prilyginamas 100%. * – pokytis, lyginant su pradine reikšme, patikimas (p<0,05); # – poveikis, lyginant su kontroline grupe (etanolis 70%),–
Tiriant etanolinį juodgalvių ekstraktą koncentracijos ribose nuo 0 iki 4,67 µl/ml, reikšmingo poveikio ŠSD nepastebėta. Esant etanolinio juodgalvių ekstrakto koncentracijai 6,33 µl/ml, nustatyta, kad ŠSD sumažėjo daugiau nei 10% pradinės reikšmės (p<0,05). Nustatytas reikšmingas ŠSD sumažejimas kintant etanolinio ekstrakto koncentracijai nuo 6,33 iki 10,00 µl/ml (p>0,05). Didžiausias poveikis pasiektas, kai eksperimentinėje vonelėje etanolinio paprastųjų juodgalvių ekstrakto kiekis padidintas iki 10,00 µl/ml, ŠSD sumažėjo daugiau nei 14 % pradinės vertės (p<0,05).
Įdomu tai, kad palyginus vandeninio juodgalvių ekstrakto poveikį ŠSD su etanoliniu juodgalvių ekstrakto poveikiu, matome, kad vandeninis ekstraktas veikia stipriau, tačiau reikšmingo skirtumo nepastebėta. Etanolis (70%) reikšmingo ŠSD mažinančio poveikio neturi.
Šie rezultatai rodo, kad tiek vandeninis, tiek etanolinis juodgalvių ekstraktas turi širdies susitraukimų dažnį mažinantį poveikį. Išryškėjo tendencija, kad didinant ekstrakto koncentraciją, šis poveikis ŠSD stiprėja.
Paprastųjų juodgalvių preparatų ŠSD didinantis poveikis eksperimentų metu nepastebėtas.
3.2. Preparatų įtaka širdies susitaukimo jėgai
Tiriant juodgalvių vandeninį ir etanolinį ekstraktą koncentracijos intervale nuo 0 iki 2,33 µl/ml reikšmingo poveikio širdies susitraukimo jėgai nenustatyta. Esant 3,00 µl/ml vandeninio ar etanolinio juodgalvių ekstrakto koncentracijai, pastebimas širdies susitraukimo jėgos mažėjimas daugiau nei 10 % (p<0,05 vs 0 µl/ml) (11 pav.). Įdomu tai, kad etanolis (70 %) nesukelia reikšmingo širdies susitraukimo jėgos mažėjimo.
Palyginus tirtų preparatų poveikį širdies susitraukimo jėgai, nustatytas reikšmingas skirtumas tarp etanolinio juodgalvių ekstrakto ir etanolio (70%) koncentracijų intervale nuo 3,00 µl/ml iki 10,00 µL/ml: esant etanolinio juodgalvių ekstrakto 10,00 µl/ml, koncentracijai širdies susitraukimo jėga sumažėja daugiau nei 14 % lyginant su susitraukimo jėga veikiant tokia pačiai etanolio (70 %) koncentracija (p<0,05). Šiame intervale pastebėtas reikšmingas skirtumas tarp etanolio (70%) ir vandeninio juodgalvių ekstrakto poveikio širdies susitraukimo jėgai. Didžiausias skirtumas nustatytas esant 10,00 µl/ml koncentracijai: veikiant vandeniniu juodgalvių ekstraktu širdies susitraukimo jėga sumažėjo daugiau nei 25 % (p<0,05 vs etanolis (70%)).
11 pav. Vandeninio ir etanolinio juodgalvių ekstraktų poveikis širdies susitraukimo jėgai (%) noradrenalino fone, n =11. ŠSD prieš poveikį prilyginamas 100%. * – poveikis, lyginant su
kontroline grupe (etanolis 70%) – patikimas (p<0,05)
Svarbu paminėti, kad lyginant vandeninio ir etanolinio juodgalvių ekstrakto poveikį širdies susitraukimo jėgai, reikšmingo skirtumo nenustatyta.
Gauti rezultatai rodo, kad tiek vandeninis tiek etanolinis juodgalvių ekstraktas turi širdies susitraukimo jėgą mažinantį poveikį. Pastebėta, kad didinant ekstrakto koncentraciją, poveikis stiprėja.
Paprastųjų juodgalvių preparatų širdies susitraukimo jėgą didinantis poveikis eksperimentų metu nepastebėtas.
3.3. Preparatų įtaka žiurkės žarnyno pasaito kraujagyslių atsipalaidavimui
3.3.1. Vandeninio juodgalvių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo
jėgai
Kraujagyslių prekontrakcijai naudojant 10-5 M/l NA koncentraciją, o po to jas veikiant 20 µl/ml ir 30 µl/ml vandeninių juodgalvių ekstraktu, gautas atpalaiduojamas poveikis (p<0,05 vs 0 µl/ml). Didžiausias poveikis pasiektas naudojant 30 µl/ml ekstrakto koncentraciją, kraujagyslių susitraukimo jėga sumažėjo daugiau nei 5 % nuo pradinės reikšmės (p<0,05) (12 pav.).
12 pav. Vandeninio juodgalvių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai . Susitraukimo jėga prieš poveikį prilyginama 100%. * – pokytis lyginant su pradine reikšme patikimas (p<0,05),
n=18
Verta pastebėti, kad lyginant susitraukimo jėgos pokyčius kraujagysles veikiant 5×10-6 ir 10-5 M/l NA tirpalais, reikšmingas skirtumas nenustatytas.
3.3.2. Etanolio poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai
Kraujagyslių prekontrakcijai naudojant 10-5 M/l NA arba 5×10-6 M/l NA tirpalą, o po to jas veikiant etanoliu (70 %), pastebėtas reikšmingas susitraukimo jėgos mažėjimas. Įdomūs rezultatai gauti naudojant 5×10-6 M/l NA kraujagyslių sutraukimui ir jas veikiant 20 µl/ml ir 30 µl/ml etanolio (70 %) koncentracija: susitraukimo jėgos pokytis buvo daugiau nei 10 % didesnis lyginant su reikšmėmis, gautomis naudojant 10-5
M/l NA (p<0,05) (13 pav.).
13 pav. Etanolio 70 % poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai (%). Susitraukimo jėga prieš poveikį prilyginama 100%. * – pokytis lyginant su pradine reikšme patikimas (p<0,05), n=18
Gauti rezultatai rodo, kad naudojant mažesnės koncentracijos noradrenalino tirpalą kraujagyslių susitraukimui sukelti, etanolio atpalaiduojantis poveikis yra didesnis.
3.3.3. Etanolinio juodgalvių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai
Kraujagyslių prekontrakcijai naudojant 10-5 M/l NA tirpalą arba 5×10-6 M/l NA tirpalą, o po to jas veikiant etanoliniu juodgalvių ekstraktu, pastebėtas reikšmingas susitraukimo jėgos mažėjimas vonelėje esant koncentracijai 30 µl/ml. Svarbu paminėti, kad kraujagyslės sutraukimui naudojant 10-5 M/l NA tirpalą, o po to ją veikiant ekstraktu, gautas susitraukimo jėgos pokytis, reikšmingai nesiskyrė nuo rezultatų, gautų naudojant 5×10-6 M/l NA tirpalą. Pateiktame grafike matyti, kad nepriklausomai nuo naudotos noradrenalino koncentracijos, kraujagysles veikiant 30 µl/ml etanoliniu juodgalvių ekstraktu susitraukimo jėga sumažėjo daugiau nei 30 % pradinės reikšmės (p<0,05) (14 pav.).
14 pav. Etanolinio juodgalvių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai (%). Susitraukimo jėga prieš poveikį prilyginama 100%. * – pokytis lyginant su pradine reikšme
patikimas (p<0,05), n=18
Remiantis šiais rezultatais, galima teigti, kad juodgalvės etanolinio ekstrakto atpalaiduojamasis poveikis nepriklauso nuo naudotos noradrenalino koncentracijos.
3.3.4. Etanolinio sukatžolių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai
Kraujagyslių sutraukimui naudojant 10-5 M/l NA tirpalą arba 5×10-6 M/l NA tirpalą, o po to jas veikiant etanoliniu juodgalvių ekstraktu pastebėtas reikšmingas susitraukimo jėgos mažėjimas koncentracijų intervale nuo 10 µl/ml iki 30 µl/ml. Pateiktame paveiksle matyti, kad kraujagyslės sutraukimui sukelti naudojant 5×10-6 M/l NA tirpalą, o po to ją veikiant ekstraktu, gautas susitraukimo jėgos pokytis, reikšmingai nesiskyrė nuo rezultatų, gautų naudojant 5×10-6
NA tirpalą (15 pav.).
15 pav. Etanolinio sukatžolių ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai (%). Susitraukimo jėga prieš poveikį prilyginama 100%. *, # – pokytis lyginant su pradine reikšme
patikimas (p<0,05), n=18
Stipriausias susitraukimo jėgą mažinantis poveikis gautas naudojant 30 µl/ml etanolinio juodgalvių ekstrakto, jėga sumažėjo daugiau nei 43% pradinės reikšmės (p<0,05).
Apibendrinant galima teigti, kad sutrauktas kraujagysles veikiant etanoliniu sukatžolių ekstraktu, atpalaiduojamasis poveikis priklauso nuo preparato koncentracijos, tačiau priklausomybė nuo sutraukimui sukelti naudotos NA koncentracijos nepastebėta.
3.3.5. Tiriamųjų preparatų poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai veikiant
10
-5M/l NA tirpalu
Palyginus rezultatus gautus tiriant visų keturių preparatų poveikį kraujagyslėms sutrauktomis 10-5 M/l NA tirpalu, reikšmingi skirtumai gauti koncentracijų intervale nuo 20 µl /ml iki 30 µl/ml (16 pav.).
16 pav. Tiriamųjų preparatų poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai 10-5 M/l noradrenalino prekontrakcijos fone ,*- sukatžolių ekstrakto poveikis lyginant su etanoliu (70 %) patikimas
(p<0,05), n=18
Tyrimo rezultatai rodo, kad naudojant 20 µl/ml etanolinio sukatžolės ekstrakto, kraujagyslės susitraukimo jėga sumažėjo 10 % daugiau nei naudojant tokios pačios koncentracijos etanolinį juodgalvių ekstraktą (p<0,05). Etanolis (70 %) sumažino kraujagyslių susitraukimo jėgą 10 % daugiau nei vandeninis juodgalvių ekstraktas, o etanolinis sukatžolių ekstraktas daugiau nei 13 % daugiau lyginant su vandeniniu juodgalvių ekstraktu (p<0,05). Įdomu tai, kad vandeninio ir etanolinio juodgalvių ekstrakto poveikis sutrauktoms kraujagyslėms reikšmingai nesiskyrė. Be to, gauti duomenys parodė, kad etanolinio juodgalvių ekstrakto ir etanolinio sukatžolių ekstrakto įtaka susitraukimų jėgai reikšmingai nesiskyrė nuo etanolio (70 %).
Kraujagysles veikiant 30 µl/ml etanoliniu sukatžolių ekstraktu, pasiekiamas reikšmingas 11 % didesnis atpalaiduojamasis poveikis, nei naudojant tą patį etanolio 70 % kiekį, skirtingai nei
naudojant 20 µl/ml ekstrakto. Taip pat, kraujagyslę veikiant 30 µl/ml etanoliniu sukatžolių ekstraktu, susitraukimo jėga sumažinama 14 % daugiau, nei naudojant tos pačios koncentracijos etanoliniu juodgalvių ekstraktu. Vandeninis juodgalvių ekstraktas kraujagysles atpalaiduoja mažiausiai: esant 30 µl/ml koncentracijai susitraukimo jėga 20 % mažesnė nei etanolinio juodgalvių ekstrakto (p<0,05).
Apibendrinant gautus rezultatus pastebėta tiesioginė priklausomybė: visų preparatų atpalaiduojantis poveikis didėjo, didinant jų koncentraciją miografo vonelėje. Vandeninio juodgalvės ekstrakto poveikis kraujagyslės susitraukimo jėgai reikšmingai mažesnis nei etanolinio juodgalvių ekstrakto (p<0,05), tačiau tik 30 µl/ml koncentracijos etanolinis sukatžolių ekstraktas kraujagysles atpalaidavo reikšmingai stipriau nei etanolis (70%).
3.3.6. Tiriamųjų preparatų poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai veikiant
5
×10
-6M/l NA
Pateiktame grafike matyti (17 pav.), kad esant 10 µl/ml preparatų koncentracijai didžiausią atpalaiduojantį poveikį turėjo vandeninis juodgalvių ekstraktas. Tačiau kaip minėta ankščiau, esant 10 µl/ml koncentracijai nei vienas iš keturių tirtų preparatų nesukėlė statistiškai reikšmingo atpalaidavimo lyginant su 0 µl/ml.
Naudojant 20 µl/ml koncentraciją tirtų preparatų grupėje stipriausią kraujagysles atpalaiduojantį poveikį turėjo sukatžolės ekstraktas: sukatžolių ekstraktas kraujagysles atpalaidavo daugiau nei 20% stipriau nei etanolis (70 %) (p<0,05).
Aukščiausios tirtos koncentracijos (30 µl/ml) etanolinis suskatžolės ekstraktas kraujagysles atpalaidavo net 27 % daugiau nei etanolis (70 %), o etanolinis juodgalvių ekstraktas kraujagysles atpalaidavo 17 % daugiau lyginant su vandeniniu juodgalvių ekstraktu (p<0,05). Vis dėlto kraujagyslių susitraukimo jėga gauta veikiant etanoliniu juodgalvių ekstraktu ir etanoliu (70%) reikšmingai nesiskyrė.
17 pav. Tiriamųjų preparatų poveikis kraujagyslių susitraukimo jėgai (%) 5×10-6 M/l noradrenalino prekentrakcijos fone, *- sukatžolių ekstrakto poveikis lyginant su etanoliu (70 %)
patikimas p<0,05, n=18
Remiantis aptartais rezultatais galima teigti, kad etanolinis sukatžolių ekstraktas, tirtų preparatų grupėje, sukėlė stipriausią atpalaiduojantį poveikį. Etanolinio juodgalvių ekstrakto įtaka kraujagyslės susitraukimo jėgai reikšmingai nesiskyrė nuo etanolio (70 %). Eksperimentų metu tirtas vandeninio juodgalvių ekstrakto kraujagysles atpalaiduojantis poveikis buvo silpniausias.
3.4. Preparatų įtaka žiurkės žarnyno pasaito atpalaiduotoms kraujagyslėms
Eksperimentų metų buvo tiriamas paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikis kraujagyslių susitraukimui. Atpalaiduotas kraujagysles veikiant tiek mažomis prepararatų koncentracijomis (10 µl/ml, 20 µl/ml, 30 µl/ml), tiek didesnėmis (100 µl/ml, 200 µl/ml) koncentracijomis, susitraukimas nepastebėtas.
Remiantis šiais rezultatais galima teigti, kad eksperimentų metu kraujagysles sutraukiantis paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikis nenustatytas.
4. IŠVADOS
• Nustatyta, kad vandeninis ir etanolinis juodgalvių ekstraktas turi širdies susitraukimo dažnį mažinantį poveikį. Poveikis priklauso nuo tirtų ekstraktų koncentracijos.
• Nustatyta, kad vandeninis ir etanolinis juodgalvių ekstraktas turi širdies susitraukimo jėgą mažinantį poveikį. Poveikis susitraukimo jėgai priklauso nuo tirtų ekstraktų koncentracijos. • Vandeninio ir etanolinio paprastųjų juodgalvių ekstraktų poveikis širdies funkcijai
nesiskiria.
• Kraujagysles sutraukiantis paprastųjų juodgalvių vandeninio ir etanolinio ekstrakto poveikis nenustatytas. Vandeninis juodgalvių ekstraktas turi silpną kraujagysles atpalaiduojantį poveikį.
• Palyginus juodgalvių ir sukatžolių etanolinio ekstrakto poveikį kraujagyslėms, atpalaiduojantis juodgalvių ekstrakto poveikis yra žymiai silpnesnis arba nestebimas.
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Labuckaitė M. Veikliųjų medžiagų, identifikuotų sukatžolių ekstrakte (flavanoidų, chlorogeno ir ursolo rūgšties), įtaka kraujagyslių funkcijai. Magistrinis darbas. 2014.
2. Lukšaitė R. Prunella vulgaris L. žolės fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai. Magistro baigiamasis darbas. 2016.
3. Abu Mweis SS, Barake R, Jones PJH. Plant sterols/stanols as cholesterol lowering agents: A meta-analysis of randomized controlled trials. Food Nutr Res, 2008, 1–17.
4. Bai Y., Xia B., Xie W., Zhou Y., Xie J., Li H., Liao D., Lin L., Li C. Phytochemistry and pharmacological activities of the genus Prunella. Food Chem, 2016, 483–496.
5. Bohou X., Liujuzuo, Lichun, Heyingchun, Lianghang, Gonglimin, Pengjiangli, Linlimei. Anti-hypertensive Effect of Aqueous Extract and Supernatants of Alcohol Extracting-Water Precipitation of Prunella vulgaris. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2014, 113-116.
6. Chen Y, Guo Q, Zhu Z., and Zhang L. Changes in bioactive components related to the harvest time from the spicas of Prunella vulgaris. Pharmaceutical Biology, 2012, 1118– 1122.
7. Chen Y., Zhu Z., Guo Q., Zhang L., Zhang X. Variation in concentrations of major bioactive compounds in Prunella vulgaris L. related to plant parts and phenological stages. Biol. Res., 2012, 171-175.
8. Chen R,Y., Chung Y.Y., Li F.Y., Yang W.H., Jinn T.R. and Tze J.T. Steroid-like compounds in Chinese medicines promote blood circulation via inhibition of Na+/K+ -ATPase. Acta Pharmacologica Sinica, 2010, 696–702.
9. Chen R.J., Jinn T.Z., Chen Y.C., Chung T.Y., Yang W.H., Tzen J.T. Active ingredients in Chinese medicines promoting blood circulation as Na+/K+-ATPase inhibitors. 2011, 141-151.
10. Cheung H.Y., Zhang Q. F. Enhanced analysis of triterpenes, flavonoids and phenolic compounds in Prunella vulgaris L. by capillary zone electrophoresis with the addition of running buffer modifiers. Journal of Chromatography, 2008, 231-238.
11. Choia H.G., Kim T.H, Kim S.H, Kim J.A. Anti-allergic Inflammatory Triterpenoids Isolated from the Spikes of Prunella vulgaris. Nat Prod Commun,2015.
12. De-biao X. et al. Study on Effect of the Water Extracts from Spica Prunella vulgaris on Systolic Function of Isolated Frog Heart. 2011.
13. Fang X., Chuen-Chung Chang R., Yue W.H. and Yong S. Immune modulatory effects of Prunella vulgaris L. International Jornal of Molacular, 2005, 491-496.
14. Feng L., Jia X., Zhu, M. M., Chen, Y., Shi, F. Antioxidant Activities of Total Phenols of Prunella vulgaris L. in Vitro and in Tumor-bearing Mice. Molecules, 2010, 15: 9145-9156.
15. Fenske K. S., Bollinger L., Xu H., Yao Y., Horke S., Forstermann U., and Li H. Reciprocal Regulation of Endothelial Nitric-Oxide Synthase and NADPH Oxidase by Betulinic Acid in Human Endothelial Cells. The Journal of Farmacology and experimantal therapeutics, 2007, 836–842.
16. Golembiovska O. Simultaneous Determination of Flavonoids and Phenolic Acids in Different Parts of PrunellaVulgaris L. by High-Performance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection. International Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2014, 1248-1255.
17. Golembiovska O., Tsurkan A.,Vynogradov B. Components of Prunella vulgaris L. Grown in Ukraine. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2014, 2 (6): 140-146.
18. Gu X., Li Y., Mu J., Zhang Y. Chemical constituents of Prunella vulgaris. Journal of Environmental Sciences, 2013, 161–163.
19. Harikrishnan R., Kim J.S., Kim M.C., Balasundaram C., Heo M.S. Prunella vulgaris enhances the non-specific immune response and disease resistance of Paralichthys olivaceus against Uronema marinum. Aquacultur, 2011, 61–66.
20. Huang N., Hauck C., Yum Y. M., Rizshsky L., Widrlechner M.P., McCoy J.A., Patricia A. Murphy, Philip M. Dixon, Basil J. Nikolau and Diane F. Birt. Rosmarinic Acid in Prunella vulgaris Ethanol Extract Inhibits Lipopolysaccharide-Induced Prostaglandin E2 and Nitric Oxide in RAW 264.7 Mouse Macrophages. J. Agric. Food Chem, 2009, 57 (22), 10579– 10589.
21. Hwang Y. J., Lee E.J., Kim H.R. and Hwang K.A. In vitro antioxidant and anticancer effects of solvent fractions from prunella vulgaris var. Lilacina, Hwang et al. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2013, 13(310): 1-9.
22. Hwang Y-J, Lee E-J, Kim H-R, Hwang K-A. NF-κB-Targeted Anti-Inflammatory Activity of Prunella vulgaris var. lilacina in Macrophages RAW 264.7.International Journal of Molecular Sciences, 2013;14(11): 21489-21503.
23. Yan H. X. et al. The Mechanism Study of Lowering the Blood Pressure of Rabbit with Prunella Asiatica Nakai, 2002.
24. Jesus J.A., Lago J.H.G., Laurenti M.D., Yamamoto E.S., Passero L.F.D. Antimicrobial Activity of Oleanolic and Ursolic Acids. An Update, Hindawi Publishing Corporation, 2015.
25. Kim M. The Effect of Prunellaon Anti-Inflammatory Activity in RAW264.7 Mouse Macrophage Cells. Food and Nutrition Sciences, 2012, 1290-1295.
26. Li C., Fu X., Huang Q., Luo F., You L. Ultrasonic extraction and structural identification of polysaccharides from Prunella vulgaris and its antioxidant and antiproliferative activities. Eur Food Res Technol, 2014, 49-60.
27. Li C., Huanga Q., Fua X, Yuea X. J., Liua R.H., You L.J.. Characterization, antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from Prunella vulgaris Linn. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 298–305.
28. Li H. Effects of Vasoactive Chinese Herbs on the Endothelial NO System.Recent Advances in Theories and Practice of Chinese Medicine, 2012, 267-283.
29. Liu F. , Ng T.B. Antioxidative and free radical scavenging activities of selected medicinal herbs. 2000, 725-735.
30. Mahboubi M., Mahboubi A., Kazempour N. The antimicrobial activity of Prunella vulgaris extracts. Herba polonica, 2015, 32-38.
31. Mathews Y. Plant fact sheet for lance selfheal (Prunella vulgaris ssp. lanceolata). USDA-Natural Resources. Conservation Service, Corvallis Plant Materials Center, Corvallis, OR, 2012.
32. McHoy P.,Westland P. Žolynų paslaptys. Vertė Liuda Petkevičiūtė. Algarvė, 2010, p. 82-83. 33. Meng G., Wang M., Zhang K., Guo Z.,Shi J. Research Progress on the Chemistry and
Pharmacology of Prunella vulgaris Species. Open Access Library Journal, 2014, 1, 1-19. 34. Paberdy V. Hypertension: putting the pressure on the silent killer, 2016.
35. Park S. H. , Koo H.J, Sung Y.Y. and Kim H.K. The protective effect of Prunella vulgaris ethanol extract against vascular inflammation in TNF-α-stimulated human aortic smooth muscle cells. BMB Rep. 2013, 352-357.
36. Psotova, J., M. Kolar, J. Sousek, Z. Svagera, J. Vicar and J. Ulrichova. Biological activities of Prunella vulgaris extract. 2003.
37. Rasool R. and Ganai B. Prunella vulgaris L. : A Literature Review on its Therapeutic Potentials. Pharmacologia, 2013, 441-448.
38. Ryu S.Y. , Oak M.H. , Yoon S.K., Cho D.I. , Yoo G.S., Kim T.S., Kim T.M. Anti-Allergic and Anti-Inflammatory Triterpenes from the Herb of Prunella vulgaris. Planta Med, 2000, 358-360.
39. Sahin S., Demir C., Malyer H. Determination of phenolic compounds in Prunella L. by liquid chromatography-diode array detection. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 1227–1230.
40. Sun H.X, Qin F., Pan Y.J. In vitro and in vivo immunosuppressive activity of Spica Prunellae ethanol extract on the immune responses in mice. Journal of Ethnopharmacology, 2005, 31–36..
41. Tzen J.T., Chen R.Y., Chung Y., Chen Y.C., Lin N.H. Active Compounds in Chinese Herbs and Medicinal Animal Products Which Promote Blood Circulation via Inhibition of Na+, K+-ATPase. 2010, 126-136.
42. Vázquez F.J.L., Alvarado C.I., Molina A.R., Molina I.R.and Sánchez M. A. Z. Vasodilator Compounds Derived from Plants and Their Mechanisms of Action. Molecules 2013, 5814-5857.
43. Winston D. The American extra pharmakopoeia. Self-heal, 2005, p. 43-44.
44. Xia N, Bollinger L., Steinkamp-Fenske K., Förstermann U. and Li H. Prunella vulgaris L. Upregulates eNOS Expression in Human Endothelial Cells. The American Journal of Chinese Medicine, 2010, 599–611.
45. Xu, S. R., Jin, G., Li, W. and Jin, F. X. Vasodilative Effect of Prunella vulgaris Linn on Thoracic Aorta of Rats in Vitro. Journal of Sichuan of Traditional Medicine, 2010, 52-54 46. Zhou, Bin et al. Worldwide trends in blood pressure from 1975 to 2015: a pooled analysis of
1479 population-based measurement studies with 19·1 million participants, 2016, 37 – 55
47. Dual wire myograph system - 420A & 520A. Prieiga per internetą:
https://www.dmt.dk/dual_wire_myograph_420a_520a.html
48. Dual wire myograph system - 420A & 520A: User guide. Prieiga per internetą:
49. Imarket: Mikroskopas binokuliarinė lupa Crystal-Pro. Prieiga per internetą:
http://imarket.lt/imarket/ziuronai-teleskopai/2710-mikroskopas-binokuliarin-lupa-crystal-pro.html
50. Waluewalk: The Desktop PC Might Finally Be Making A Comeback. Prieiga per internetą:
