VAISTINIŲ NOTRŲ (Stachys officinalis L.) AUGALINIŲ ŢALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

EGLĖ TALIJŪNĖ

VAISTINIŲ NOTRŲ (Stachys officinalis L.) AUGALINIŲ

ŢALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO

AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

Darbo vadovas Doc. dr. Raimondas Benetis

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

VAISTINIŲ NOTRŲ (Stachys officinalis L.) AUGALINIŲ

ŢALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO

AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

Darbo vadovas

Doc. dr. Raimondas Benetis Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Eglė Talijūnė Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10

1.1 Oksidatoriai ... 10

1.2 Oksidacinis stresas ... 11

1.3 Antioksidantai ... 12

1.4 Fenoliniai junginiai ... 13

1.5 Antioksidacinės fenolinių junginių savybės ... 15

1.6 Fenolinių junginių ekstrakcija, bendro kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose ... 16

1.7 Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) morfologija, paplitimas ir fitocheminė sudėtis .... 18

1.8 Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) panaudojimo sritys ... 21

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 23

2.1 Tyrimų objektas ... 23

2.2 Medţiagos ir reagentai ... 23

2.3 Naudota aparatūra ... 24

2.4 Tyrimų metodai ... 24

2.4.1 Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 24

2.4.2 Reagentų paruošimas ... 25

2.5 Vaistinių notrų (S. officinalis) žaliavos ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 26

2.5.1 Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 26

2.5.2 Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas ... 26

2.5.3 Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27

2.5.4 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį Fe2+jonų sujungimo metodą ...28

2.5.5 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį DPPH radikalų surišimo metodą ...28

2.5.6 Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas naudojant ABTS˙+ metodą ... 29

2.6 Duomenų analizė ... 30

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1.1 Ekstrahento poliškumo parinkimas ... 31

3.1.2 Ekstrakcijos trukmės parinkimas ... 32

3.1.3 Ekstrakcijos temperatūros parinkimas naudojant ultragarso vonelę ... 33

3.2 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavose .... 33

3.3 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavose ... 35

3.4 Bendro fenolio rūgščių kiekio nustatymas vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavose ... 37

3.5 Chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo metodu vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavos ekstraktuose ... 39

3.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavos ekstraktuose ... 41

3.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS radikalų surišimo metodu vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavos ekstraktuose ... 43

3.8 Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų, fenolio rūgščių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo ... 45

4. IŠVADOS ... 47

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

SANTRAUKA

E. Talijūnės magistro baigiamasis darbas „Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas“. Mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas, 2018.

Tikslas - ištirti iš įvairių Lietuvos vietovių surinktų, natūraliai gamtoje augančių vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) augalinių ţaliavų bendrąjį fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Uţdaviniai: 1) nustatyti optimalias fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš vaistinių notrų (S.

officinalis) ţaliavų; 2) ištirti fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį skirtingose

Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose surinktose vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavose ir jų įvairavimą atskirose augalo morfologinėse dalyse; 3) įvertinti vaistinių notrų (S. officinalis) ekstraktų chelatines savybes FIC metodu ir antiradikalines savybes ABTS ir DPPH metodais; 4) atlikti koreliacininių ryšių analizę tarp S. officinalis augalinių ţaliavų fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių bei jų ekstraktų

antioksidacinio aktyvumo rodmenų.

Tyrimo metodika. Tyrimui atlikti naudotos augalinės vaistinių notrų ţaliavos, surinktos iš 19 skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų. Bandinių ekstrakcija vykdyta ultragarsu, ekstrahentu naudojant 70 proc. (V/V) etanolį, ekstrakcijos laikas – 15 min, o temperatūra – 40 ˚C. Bendram fenolinių junginių kiekybiniam nustatymui taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas. Bendro flavonoidų kiekio nustatymui taikyta reakcija su AlCl3. Bendram fenolio rūgščių kiekybiniam nustatymui taikytas Arnow reagentas. Etanolinių ekstraktų antioksidacinės savybės tirtos DPPH, ABTS ir FIC spektrofotometriniais metodais.

Rezultatai ir išvados. Tyrimų metu nustatyta, kad vaistinių notrų ţaliavose sukaupiami reikšmingi fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekiai. Vaistinių notrų ţaliavų fitocheminei sudėčiai yra būdingas morfologinis bei populiacinis kintamumas. Bendras fenolinių junginių kiekis ţaliavose kito nuo 5,35 ± 0,24 mg/g iki 29,30 ± 0,91 mg/g, flavonoidų – nuo 0,61 ± 0,02 mg/g iki 28,42 ± 1,19 mg/g, fenolio rūgščių – nuo 7,38 ± 0,07 mg/g iki 355,9 ± 7,01 mg/g. Didţiausi biologiškai aktyvių medţiagų kiekiai nustatyti ţaliavose, surinktose iš gamtinių cenopopuliacijų, esančių Bagnapolyje, Upytėje ir Kazlų Rūdoje. S. officinalis ţaliavų etanoliniams ekstraktams būdingas reikšmingas antioksidacinis aktyvumas visose tirtose in

vitro sistemose. DPPH surišimas įvairavo plačiose ribose nuo 0,12 ± 0,08 proc. iki 80,12 ± 1,71 proc., o

ABTS TE reikšmės kito nuo 3,72 ± 0,15 μmol/g iki 46,82 ± 1,54 μmol/g. Chelatinio aktyvumo reikšmės įvairavo nuo 5,76 ± 0,9 proc. iki 79,32 ± 1,2 proc. Didţiausios antioksidacinio poveikio reikšmės būdingos ekstraktams, kurie paruošti iš Bagnapolio cenopopuliacijoje surinktų ţaliavų. Nustatyta stipri ir statistiškai reikšminga (p<0,05) priklausomybė tarp bendrų fenolinių junginių, flavonoidų, fenolio rūgščių kiekių S.

SUMMARY

E. Talijūnė master thesis “The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of wood - betony (Stachys officinalis L.) plants“. Supervisor dr. Raimondas Benetis, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Departament of Drug Chemistry, Kaunas, 2018.

The aim: Investigate the quantitative composition of wood - betony (Stachys officinalis L.) from naturally growing in Lithuania different cenopopulations raw materials phenolic compounds, flavonoids and phenolic acids and evaluate the antioxidant activity of their extracts.

The objectives of the study: 1) To optimize extraction conditions of phenolic compounds from wood - betony (S. officinalis) raw materials; 2) to 1 quantitative composition of total phenolics, flavonoids and phenolic acids in wood - betony raw materials collected from naturally growing in Lithuania different cenopopulations and to analyse their variation patterns depending on morphology of the plants; 3) to evaluate S.

officinalis antioxidant activity in the extracts with these methods: FIC, ABTS and DPPH; 4) to evaluate correlation between quantitative content of phenolic compounds, flavonoids and phenolic acids and their extracts antoxidant activity.

Research methodology: The samples of the reserch was raw materials of wood- betony plants collected from 19 different cenopopulations naturally growing in Lithuania The method of extraction - ultrasound agitation, extractant – 70 proc. (V/V) ethanol, extraction time - 15 min, extraction temperature – 40ºC. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used to determine the total content of phenolic compounds. To determine the total content of flavonoids was used reaction with AlCl3. To determine the total content of phenolic acids was used Arnow reagent. DPPH, ABTS and FIC spectrophotometric assays were used to find out the antioxidant properties of plant extracts.

SANTRUMPOS

ROS - reaktyviosios deguonies formos RNS - reaktyviosios azoto rūšys Ph. Eur. - Europos farmakopėja V/V - tūrio procentai

NADP - nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas ATP – adenozintrifosfatas

FIC – geleţies (II) jonų sujungimo metodas

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrikhidrazilo laisvasis radikalas

ABTS - 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. GAE - galo rūgšties ekvivalentai

TE - trolokso ekvivalentai

ĮVADAS

Kompleksinių ligų, tokių kaip širdies ir kraujagyslių ligų, Alzhaimerio, vėţinių susirgimų, antrojo tipo diabeto prevencija – tai mūsų dienomis labai aktuali tema. Gydytojai bei mokslininkai siekdami pagerinti visuomenės sveikatos lygį, atlieka daug ikiklinikinių bei klinikinių tyrimų bei ieško būdų, kaip sumaţinti sergamumą minėtomis ligomis [4,22,37,38,44]. Daugumoje mokslinių publikacijų akcentuojama, kad šių negalavimų raidai tiesioginės įtakos turi padidėjęs laisvųjų radikalų kiekis organizme, kitaip dar vadinamasis – oksidacinis stresas [15,45,49]. Organizme padidėjusiam laisvųjų radikalų kiekiui įtakos gali turėti netinkamas gyvenimo būdas: rūkymas, akoholio, riebaus maisto, tam tikrų ksenobiotikų vartojimas, sąlytis su sunkiaisiais metalais ar net kasdien patiriamas stresas. Kadangi šiuolaikinių ţmonių gyvenimo tempas yra labai greitas, išvengti oksidacinio streso išsivystymo yra sunku, todėl tikslingo antioksidantų vartojimo galima nauda tampa vis akivaizdesnė. Mokslinėse publikacijose vis didesnis dėmesys skiriamas natūraliems egzogeniniams antioksidandams – fenoliniams junginiams [18]. Fenoliniai junginiai kaupiami augalo organuose ir yra natūralus antioksidantų šaltinis [26,33]. Atlikti įvairūs tyrimai in vitro ir in vivo sistemose rodo galimą stiprų įvairių fenolinių junginių antioksidacinį aktyvumą, antiuţdegiminį, antirieumatinį, vėţinių ląstelių apoptozę skatinantį, gliukozės kiekį kraujyje reguliuojantį ir kt. poveikį [24,30,52]. Dėl šių prieţasčių mokslininkai visame pasaulyje fitochemiškai tiria vis daugiau įvairių augalinių ţaliavų, siekdami išsiaiškinti, ar jie gali būti natūralių antioksidantų – polifenolinių junginių šaltiniu.

Vaistinės notros (Stachys officinalis L.) yra notrelinių (Lamiaceae) šeimai priklausantys augalai, kurių ţaliavos turi ilgametę vartojimo patirtį tradicinėje įvairių Europos ir Azijos šalių medicinoje. Tradicinėje medicinoje šių augalų ţaliavos vartojamos virškinamojo trakto ligų gydymui, kojų prakaitavimo maţinimui, radikulito, kepenų, ţarnyno uţdegiminių ligų gydymui, taip pat esant inkstų bei šlapimo takų ligoms. Moksliniais tyrimais pagrįsta, jog augalo antţeminių dalių ţaliavose nustatomi reikšmingi įvairių fenolinių junginių, tokių kaip flavonoidai, fenolio rūgštys, kiekiai [21,26,27,51]. Mokslininkai vis intensyviau ieško šio augalo galimo medicininio pritaikymo, o atliktų tyrimų rezultatai ţada, kad galimai ateityje bus kuriami fitopreparatai, panaudojant S. officinalis augalines ţaliavas. Mokslinėje literatūroje yra publikuotų tyrimų, kurie rodo galimą vaistinės notros ţaliavų priešgrybelinį, priešuţdegiminį, hiperglikemiją reguliuojantį poveikį [10,12,17,18].

Lietuvoje dar nebuvo atlika išsamių vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) visų antţeminių dalių fitocheminių bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo tyrimų. Šio tyrimo metu pirmą kartą Lietuvoje įvertintas minėtų parametrų įvairavimas skirtingose Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Tikslas - ištirti iš įvairių Lietuvos vietovių surinktų, natūraliai gamtoje augančių vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) augalinių ţaliavų bendrąjį fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Uţdaviniai:

1) nustatyti optimalias fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavų;

2) ištirti fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolio rūgščių kiekybinę sudėtį skirtingose Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose surinktose vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavose ir jų įvairavimą atskirose augalo morfologinėse dalyse;

3) įvertinti vaistinių notrų (S. officinalis) ekstraktų chelatines savybes FIC metodu ir antiradikalines savybes ABTS ir DPPH metodais;

1.

LITERATŪROS APŢVALGA

1.1

Oksidatoriai

Oksidatoriai – tai molekulės, atomai, bei laisvieji radikalai, savo paskutiniame valentiniame sluoksnyje turintys bent vieną nesuporuotą elektronų porą. Jie labai nestabilūs, nes yra linkę prijungti arba atiduoti elektronus ir įgauti stabilesnę būseną [9]. Tie junginiai, kurie turi nesuporuotų elektronų porų, vadinami laisvaisiais radikalais ir turi labai stiprių oksidacinių gebėjimų. Tie, kurie neturi nesuporuotų elektronų paskutiniame sluoksnyje, vadinami neradikaliniais, tačiau jie taip pat turi oksidacinių savybių. Pavyzdţiui, vandenilio peroksidas neturi nesuporuotos ektronų poros, tačiau jis yra prekusorius susidaryti peroksilo radikalui [11,47]. Oksidatoriai yra labai maţos molekulės – egzistuoja tik keletas oksidatorių, kurių molekulinė masė viršytų 100. Maţi molekulių matmenys leidţia jiems nesunkiai prasiskverbti pro ląstelių membranas [47]. Paprastai laisvieji radikalai skirstomi į dvi pagrindines grupes: reaktyviąsias deguonies (ROS) ir reaktyviąsias azoto (RNS) formas. ROS ir RNS susidaro viduląstelinio metabolizmo metu, taip pat jų gaminimąsi skatina jonizuojančioji radiacija [11,47]. Reaktyviosios deguonies formos susidaro aerobinio metabolizmo metu mitochondrijose, veikiant įvairiems oksidazių grupės fermentams, tokiems kaip ksantinų oksidazė, ciklooksigenazė, gliukozės oksidazė, lipoksigenazė, taip pat citochromas P450 ir NADPH. Taigi laisvųjų radikalų susidarymas yra neišvengiamas procesas [11,25]. Superoksido anijonas O

2-susidaro vidinėje mitochondrijos dalyje, kaip deguonies redukcijos proceso į vandenį dalis, o iš superoksido anijono gali susidaryti kitos aktyvios ROS formos, tokios kaip vandenilio peroksidas H2O2 ir hidroksilo radikalas OH∙[11,38]. Be jų, dar ţinomos tokios aktyvios formos kaip hipochorito

rūgštis – HOCl, NO∙, peroksinitrito anijonas ir kt. 1 lentelėje yra pateikiama ROS ir RNS klasifikacija.

1 lentelė. Reaktyviųjų deguonies formų (ROS) ir reaktyviųjų azoto formų (RNS) klasifikacija [25]

Patys reaktyviausi ir pavojingiausi laisvieji radikalai, sukeliantys daugiausiai paţaidos ląstelei, - tai deguonies dariniai: superoksido anijonas ir hidroksilo radikalas [11]. Susiformuoti

Radikalai Reaktyviosios deguonies formos (ROS)

Reaktyviosios azoto formos (RNS)

Hidroksilo radikalas (OH∙) Azoto monoksidas (NO∙) Peroksilo radikalas (ROO∙) Azoto dioksidas (NO2∙)

Lipidų peroksilo radikalas (LOO∙) Superoksido anijonas (O2∙)

hidroksilo radikalams organizme padeda ir metalų, periodinėje elementų lentelėje vadinamų pereinamaisiais metalais, katijonai. Anot mokslinės literatūros, daugiausia ţalos biologinėse sistemose sukelia geleţies ir vario jonai. Dvivalentės geleţies katijonai sąveikauja su vandenilio peroksidu ir kaip reakcijos produktas susidaro trivalentės geleţies jonai ir oksidatorius – hidroksilo radikalas [11].

1.2

Oksidacinis stresas

1.3

Antioksidantai

Ţmogaus organizme egzistuoja natūrali apsaugos sistema, kuri slopina ţalingą oksidacinį poveikį, jų pagrindą sudaro antioksidantai. Antioksidantu gali būti vadinama medţiaga, kuri efektyviai redukuoja oksidantą, sudarydama netoksiškus arba maţiau toksiškus junginius [9,11,47]. Išskiriamos dvi antioksidacinės sistemos - fermentinės ir nefermentinės prigimties, kurios veikia sinergistiškai ir apsaugo ląsteles bei įvairius organus nuo ţalingo laisvųjų radikalų poveikio. Antioksidantai pagal kilmės šaltinius dar gali būti klasifikuojami į endogeninius ir egzogeninius. Egzogeniniai antioksidantai į organizmą patenka su maistu. Kai kurie junginiai, patekę į organizmą su maistu, tiesiogiai nesąveikauja su laisvaisiais radikalais, tačiau geba padidinti endogeninių antioksidatorių aktyvumą. Dėl šios prieţasties jie taip pat priskiriami prie antioksidantų [7,21]. Norint išvengti oksidatoriaus ţalos svarbu, kad antioksidantas sureaguotų su oksidatoriumi prieš jam paţeidţiant svarbias organizmo biomolekules [11].

Pagrindiniai fermentinės kilmės antioksidantai, yra superoksido dismutazė (SOD), katalazė ir glutationo peroksidazė, o nefermentinės kilmės – vitaminas E, vitaminas C, glutationas, melatoninas, kofermentas Q10, įvairūs flavonoidai ir kt. [11,25].

Gliutationo peroksidazė katalizuoja redukcijos reakcijas, kai peroksilo radikalas verčiamas į atitinkamą alkoholį ir vandenį. Tai uţkerta kelią lipidų peroksidacijai.

Katalazė katalizuoja vandenilio peroksido virtimą į vandenį ir deguonį. Šis fermentas turi didelį aktyvumą – viena katalazės molekulė per vieną minutę gali „nukenksminti“ apie 6 milijonus vandenilio peroksido molekulių [25].

Superoksido dismutazė (SOD) katalizuoja superoksido virtimą į vandenilio peroksidą ir deguonį [11].

Pagal sudėtyje esančių metalų katijonus ir buvimo vietą SOD klasifikuojama į tris izofermentus: Cu,Zn-SOD, Mn-SOD ir ekstraceliulinį SOD. Įdomu paţymėti, kad apie 50proc. ţmogaus kraujagyslėse esančio SOD yra ekstraceliulinis. Būtent ekstaceliulinis SOD yra labiausiai atsakingas uţ širdies ir kraujagyslių sistemos apsaugą nuo oksidatorių [11,25].

Nefermentinės kilmės antioksidantai daţniausiai įsiterpia į oksidacijos reakcijų grandinėlę ir atiduodami elektroną veikia kaip oksidacijos reakcijų grandinės nutraukėjai [11,25,47].

Vitaminas C – L-askorbo rūgštis – apsaugo membranos fosfolipidus nuo peroksidacijos poveikio [39,40]. Vitaminas C nukenksmina hidroksilo, alkoksilo, superoksido radikalus pats pavirsdamas į monodehidroaskorbo rūgštį [13,40,47].

Augalai yra vienas pagrindinių nefermentinės kilmės antioksidantų šaltinių. Natūralūs junginiai, antriniai augalų metabolitai (fenolio rūgštys, flavonoidai) taip pat yra ir stiprūs antioksidantai bei gali uţkirsti kelią oksidacinio streso sukeltai paţaidai susidaryti [11,26,33].

1.4

Fenoliniai junginiai

Fenolinai junginiai yra augalų karalystėje plačiai aptinkamos biologiškai aktyvios medţiagos. Tai yra antriniai metabolitai, padedantys augalams apsiginti nuo patogenų, streso, kurį sukelia šviesos ir temperatūros pokyčiai, oro uţterštumas [2,13,18]. Netirpūs fenoliniai junginiai daţniausiai kaupiami augalų ląstelių sienelėse, o tirpūs atstovai paprastai yra randami ląstelių vakuolėse [48]. Ţmogaus organizmas negali sintetinti daugelio polifenolinių junginių, todėl jų reikėtų gauti su maistu. Fenoliniai junginiai gali augalams suteikti spalvą bei kvapą, skonį, privilioti vabzdţius. Pavyzdţiui, eugenolis bananams iš dalies suteikia savitą kvapą [1,2,13].

Fenolinių junginių struktūros pagrindą sudaro aromatinis ţiedas su bent viena hidroksilo grupe. Fenolinai junginiai struktūriškai gali ţenkliai skirtis ir kinta nuo paprastų fenolio rūgščių iki kompleksinių molekulių, pavydţiui kondensuotų taninų. Mokslinėje literatūroje paprastai išskiriamos tokios svarbiausios polifenolinių junginių klasės: paprastieji fenoliai, fenolio rūgštys, flavonoidai, taninai ir lignanai. Skirstymas į šias grupes yra paremtas fenolinių ţiedų skaičiaus bei struktūrinių elementų, jungiančių šiuos ţiedus, skirtumais [24,43].

1 pav. Bendra flavonoidų su katecholio grupe B žiede formulė [13]

Flavonoidai skirstomi į šešis pogrupius pagal struktūros skirtumus C heterocikle (2 pav.). Skirtumai tarp pogrupių gali susidaryti dėl hidroksi grupių skaičiaus ir išsidėstymo, bei alkilinimo arba glikozilinimo.

Flavonoidų pogrupiai:

1. Flavonai (luteonlinas, apigeninas, taranitinas).

2. Flavonoliai (kvercetinas, kemferolis, miricetinas, izoramnetinas). 3. Flavononai (hesteretinas, naringeninas, eriodiktiolis).

4. Flavotrioliai(katechinai ir epikatechinai).

5. Izoflavonai (genisteinas, daidzeinas, gliukitinas).

6. Antocianidino junginiai (cianidinas, delfinidinas, malvidinas, pelargonidinas, peonidinas, petunidinas) [2,13,24,43].

2 pav. Flavonoidų pogrupių struktūrinės formulės [24]

Fenolio rūgštys yra dar viena labai stambi fenolinių junginių klasė. Šios rūgštys skirstomos į dvi grupes: cinamono rūgšties ir benzoinės rūgšties darinius. Cinamono rūgšties dariniams būdinga C6

-C3 struktūra, o benzoinės rūgšties dariniams C6-C1 struktūra (3 pav.) [24].

3 pav. Fenolio rūgščių bendrosios formulės: A – benzoinės rūgšties , B –cinamono rūgšties dariniai, kai R – OH, CH3 [24]

Fenolio rūgščių struktūrinį pagrindą sudaro benzeno ţiedas, o jų individualius skirtumus lemia hidroksilo ir metoksi grupių skaičius bei išsidėstymas. Tik nedidelė fenolio rūgščių darinių dalis egzistuoja laisva forma. Dauguma jų egzistuoja esterių pavidalu, prisijungusios prie eterių, acetatinių jungčių ar struktūrinių augalų komponentų, didesnių polifenolių ar maţesnių organinių molekulių [40,52]. Daţniausiai augaluose randamos fenolio rūgštys – kavos rūgštis, p-kumaro, vanilino ir ferulo rūgštys [46].

1.5

Antioksidacinės fenolinių junginių savybės

Moksliniuose šaltiniuose daugėja informacijos apie galimą fenolinių junginių naudą ţmogaus sveikatai, kuri gali būti susijusi su antioksidacinėmis jų savybėmis. Fenoliniai junginiai, įskaitant flavonoidus, funkcionuoja kaip antioksidantai trimis pagrindiniais mechanizmais:

1) inaktyvuoja radikalą su juo susijungdami. Dėl laisvos elektronų poros radikalas yra nestabilus, todėl radęs tinkamą elektronų akceptorių (šiuo atveju fenolinį junginį) jis perleidţia savo elektroną antioksidantui;

2) slopina RNS ir ROS formavimąsi, slopindami fermentines reakcijas, kurių metu susidaro laisvieji radikalai;

3) chelatuoja metalų, kurie dalyvauja laisvųjų radikalų gamyboje, jonus [11,39,48].

lipidų peroksidaciją, kurią sukelia ROS, o tai turi teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių sistemai. Tokiu poveikiu pasiţymi flavonoidai: kvercetinas, kemferolis, naringeninas [24,52]. Flavonoidai, tokie kaip kvercetinas, inhibuoja ląstelių proliferaciją, kuri vėţio atveju būna sutrikusi. Dar 1996 metais buvo įrodyta, kad flavonoidai in vitro skatina daugumos vėţinių auglių ląstelių apoptozę. Taip pat polifenoliai gali slopinti DNR paţaidą, todėl įvyksta maţiau DNR mutacijų [13,25]. Tačiau, nepaisant galimos fenolinių junginių naudos, nereikėtų uţmiršti, kad netinkamai vartojant antioksidantus jie gali turėti ir pro-oksidantinių savybių. Kai kurie tyrimai rodo, kad eksperimentiniuose modeliuose tik naudota dozė lėmė fenolinių junginių naudą ar ţalą kraujagyslių endotelio funkcijoms [6,25].

1.6

Fenolinių junginių ekstrakcija, bendro kiekio ir antioksidacinio

aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose

Norint išgauti fenolinius junginius iš tiriamosios ţaliavos, pirmiausia ţaliavas reikia tinkamai paruošti. Paprastai fenoliniai junginiai išgaunami iš švieţiai surinktos, dţiovintos arba liofilizuotos augalinės ţaliavos [7,43]. Jeigu pasirenkama ekstraktus gaminti iš dţiovintos ţaliavos, reikia atkreipti dėmesį, kad dţiovinant augalinę ţaliavą būtina vengti tiesioginės saulės šviesos ir aukštos temperatūros. Nesilaikant tokių sąlygų polifenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis gali kisti ir dėl to gali būti prarandamos antioksidacinės savybės [43].

Siekiant padidinti ţaliavos paviršiaus plotą prieš ekstrakciją, ţaliavą reikia susmulkinti. Patogiausias polifenolinių junginių ekstrakcijos būdas yra panaudojant tirpiklius. Šis būdas yra paprastas ir efektyvus. Ekstrakcijos išeigą lemia tirpiklio poliškumas, ekstrahavimo laikas, temperatūra, augalinės ţaliavos ir tirpiklio kiekio santykis ir kiti veiksniai [7,29]. Pavyzdţiui, ilgas ekstrakcijos laikas ir aukšta temperatūra gali paskatinti fenolinių junginių oksidaciją, degradaciją ir taip sumaţinti ekstrakcijos išeigą [32]. Daţniausiai naudojami tirpikliai fenolinių junginių ekstrakcijai - tai metanolis, etanolis, acetonas ir jų mišiniai su vandeniu. Naudojant metanolį geriausiai išekstrahuojami maţos molekulinės masės fenoliniai junginiai, o ekstrahuojant acetonu - didelės molekulinės masės flavonoidai. Etanolis yra daţniausiai naudojamas polinis ekstrahentas farmacijos pramonėje dėl saugumo veiksnių [7,16,43]. Fenolinių junginių ekstrakcijai gali būti naudojami ir kiti organiniai tirpikliai: etilacetatas, chloroformas, dietilo eteris [24].

sąnaudos. Be to, šiuo metodu išvengiama galimos fenolinių junginių degradacijos. Ekstakcija ultragarsu pagrįsta ultragarso bangų sklidimu tirpikliu. Šis procesas sukelia tirpiklyje susidarančių kavitacinių burbulų sprogimą, o tai sąlygoja sustiprėjusį tirpiklio skverbimąsi į bandinį [7].

Tiksliausi, efektyviausi ir detaliausiai atspindintys fenolinių kiekybę ir kokybę analizės metodai yra chromatografiniai metodai, tokie kaip atvirkštinių fazių didelio slėgio skysčių chromatografija (HPLC), sujungta su diodų matricos detektoriumi (DAD) arba spektrofotometriniu masės detektoriumi (LC-MS), dujų chromatografija, ultra didelio slėgio skysčių chromatografija. Deja, šie metodai yra labai brangūs ir sudėtingi, todėl pirmiausia tikslinga preliminariai įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį, taip pat nustatyti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, gebėjimą surišti laisvuosius radikalus [43]. Tam gali būti naudojami spektrofotometriniai metodai. Jų atlikimo metodika paprastai nesudėtinga, o gaunami rezultatai yra tikslūs ir patikimi [7,43].

Metodų, kuriais galima nustatyti fenolinių junginių bendrąjį kiekį yra daug: Folin-Denis, Folin-Ciocalteu, kolorimetrija su geleţies druskomis, UV spektrofotometrija ir kt. Šiuo metu mokliniuose tyrimuose daţniausiai naudojamas metodas yra Folin-Ciocalteu metodas. Folin-Ciocalteu metodas paremtas elektronų perdavimo reakcijomis. Tyrimo metu, mėginyje esant fenolinių junginių, šarminėje terpėje susidaro mėlynos spalvos kompleksai. Analitinis atsakas yra stebimas esant 760 -765 nm bangos ilgiui. Metode paprastai naudojamas etaloninis junginys yra galo rūgštis, todėl rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentais (miligramais galo rūgšties kilogramui ar litrui bandinio) [7,8,14,19].

Daţniausiai naudojamas spektrofotometrinis metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti yra kolorimetrinis metodas su aliuminio chloridu (AlCl3). Jo principas yra chelatinių flavonoidų

kompleksų susidarymas su Al jonais. Flavonai ir flavonoliai su Al jonais sudaro stabilius kompleksus dėl C4 esančios ketogrupės bei C3 ir C5 hidroksigrupių (4 pav.) [34]. Reakcija stebima esant 410-423

nm bangos ilgiui. Šioje metodikoje naudojamas etaloninis junginys yra rutinas arba kvercetinas, o rezultatai išreiškiami rutino ar kvercetino ekvivalentu (mg rutino ar kvercetino /g ekstrakto) [20, 29].

4 pav. Chelatinių flavonoidų kompleksų susidarymas su Al jonais [34]

ABTS metodai yra pagrįsti vandenilio atomo/jono perdavimo mechanizmu, o FIC - pagrįstas pereinamųjų metalų jonų surišimu [8,42].

DPPH. Šiuo antiradikalinio aktyvumo metodu matomas violetinės spalvos pokytis į šviesiai geltoną spalvą. Taip įvyksta, nes redokso reakcijos metu DPPH radikalas redukuojamas į hidraziną [16,42]. DPPH radikalų surišimo geba ir antioksidacinis poveikis yra tiesiogiai proporcingas absorbcijos sumaţėjimui ir spalvos pokyčiui nusistovėjus pusiausvyrai. Reakcija yra stebima esant 515–528 nm bangos ilgiui [19,28,42].

ABTS. Svarbu paminėti, kad šioje metodikoje pirmiausiai ABTS turi būti oksiduojamas kalio persulfato (K2S2O8) tirpalu, siekiant gauti mėlynai ţalios spalvos ABTS• radikalą-katijoną. Metodas

pagrįstas antioksidatorių, esančių ekstrakte, gebėjimu surišti ABTS radikalus. Naudojamas etalonininis junginys yra troloksas, o rezultatai išreiškiami trolokso ekvivalentais 1 gramui sausos ţaliavos. Reakcija stebima esant 734 nm bangos ilgiui [42].

FIC – tai fotometrinis metodas, pagrįstas Fe2+ jonų surišimu. Metode naudojamas ferozinas yra kompleksonas, kuris sujungia pereinamujų metalų jonus, tokius kaip dvivalentė geleţis. Įvykus reakcijai gaunama raudona spalva, kuri reiškia, kad susidarė ferozino ir Fe2+ kompleksas. Jeigu tiriamąjame mėginyje yra antioksidatorių, slopinamas ferozino ir Fe2+

komplekso formavimasis. Reakcijos mišinio absorbcija matuojama esant 562 nm bangos ilgiui. Maţėjanti absorbcija apibūdina tiriamo ekstrakto chelatų sudarymo efektyvumą [7,19,42].

1.7

Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) morfologija, paplitimas ir

fitocheminė sudėtis

5 pav. (Stachys officinalis L.) antžeminės anatominės dalys [23]

Vaistinės notros (S. officinalis) yra plačiai palitusios vidutinių platumų juostoje, Vidurţemio jūros regionuose, pietvakarių Azijoje, Šiaurės ir Pietų Amerikoje, tropiniuose regionuose [12]. Lietuvoje šis augalas taip pat nėra retas. Paprastai randamas derlingo dirvoţiemio pievose, pamiškėsė, kirtavietėse [13]. Palankiausios sąlygos šiems augalams natūraliai augti yra tuomet, kai jų nenustelbia aukštesnės ir saulės šviesą galinčios uţstoti kitos augalų rūšys. Atviros vietos, kur auga ţema ţolė, nėra uţuovėjos ir rūšinės įvairovės, šiai rūšiai taip pat nėra palankios [31].

Notrelinių (Lamiacea) šeima, dar kitaip vadinama magnolijūnų arba lūpaţiedţių, yra plati augalų šeima, kurią sudaro daugiau kaip 200 genčių ir 700 rūšių. Geriausiai ţinomos ir didţiausios šios šeimos gentys yra šalavijų (Salvia), kalpokių (Scutellaria), notrelinių (Stachys), čiobrelių (Thymus). Notrelinių (Stachys) genčiai priklauso apie 200 augalų rūšių. Lietuvoje plačiausiai paplitusios vaistinės notros (Stachys officinalis L.), dirvinės notros (Stachys arvensis L.) ir miškinės notros(Stachys sylvatica L.). Atlikti tyrimai rodo, kad vaistinės notros yra vienos iš perspektyviausių notrelinių šeimos atstovų gydymo tikslams dėl reikšmingo augalinėse ţaliavose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių kiekio [31,51].

Vaistinės notros savo anţeminėse augalo dalyse kaupia tokias biologiškai aktyvias medţiagas, kaip fenoliniai junginiai, taninai, flavonoidai ir fenolio rūgštys. Naujausių tyrimų duomenimis šio augalo ţaliavose sukaupiami didţiausi kiekiai fenolio rūgčių, turinčių stiprių anktioksidacinių savybių. Paprastai nustatomi reikšmingi kiekiai chlorogeno, ferulo, kavos ir rozmarino rūgščių. Taip pat vaistinės notros (S. officinalis) savo lapuose ir ţieduose kaupia flavonoidus: orientiną, luteolin-7-gliukozidą, apigenin-7-luteolin-7-gliukozidą, apigenin-3-luteolin-7-gliukozidą, apigeniną [25,26,27,51]. Tipinė vaistinių notrų antţeminės dalies metanolinio ekstrakto chromatograma pateikiama 6 pav.

6 pav. Vaistinių notrų antžeminės dalies metanolinio ekstrakto ESCH chromatograma [26] Fenolinių junginių sankaupoms ţaliavose didelę įtaką turi augalo vegetacijos fazė bei augimo metai. Įrodyta, kad daugiau taninų (pirogalolio) sukaupia tų vaistinių notrų antţeminnių augalo dalių ţaliavos, kurios buvo surinktos trečiais augalo augimo metais. Įdomu tai, kad taninų daugiau randama masinio ţydėjimo fazės metu, o kavos rūgšties didţiausia koncentracija stebima tuose ţolės ekstrakuose, kurie pagaminti iš ţaliavų, surinktų pradinėse augalo vegetacijos fazėse [26]. Sėklose nustatomam fenolinių junginių kiekiui augalo augimo metai tiesioginės įtakos neturi [27].

Iš S. officinalis antţeminių dalių galima išskirti eterinį aliejų, kurio sudėtyje daugiausiai, net 89 proc., vyrauja terpenai, iš kurių 69 proc. sudaro seskviterpeno angliavandeniliai (kandalenas, β-mirticenas, β-pinenas) ir 15 proc. oksiduoti seskviterpenai (kubenolis, α-kandinolis, torilenolis). Taip pat vaistinių notrų eteriniame aliejuje nustatomi bioaktyvieji junginiai: β-kariofilenas ir α- humulenas [33].

Nors visi publikuoti vaistinių notrų bendro fenolinių junginių, flavonoidų kiekio, antioksidacinių savybių nustatymo tyrimai rodo, kad šis augalas sukaupia didelius kiekius fenolinių junginių ir pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu, kiekybiškai rezultatai mokslinėse publikacijose daţnai skiriasi, nepaisant to, kad buvo naudotos labai panašios metodikos. Šiuos skirtumus gali lemti aplinkos veiksniai. Fenoliniai junginiai – tai antriniai metabolitai, kurių paskirtis yra apsaugoti augalą nuo nepageidaujamų apinkos sąlygų, todėl skirtingi aplinkos veiksniai gali lemti skirtingus sukauptų antrinių metabolitų kiekius. Biologiškai aktyvių junginių kiekybinės sudėties rodmenims ţaliavose įtakos gali turėti temperatūra, šviesios intensyvumas, drėgmės kiekis, CO2 koncentracija ore, mineralų

1.8

Vaistinių notrų (Stachys officinalis L.) panaudojimo sritys

Nors oficialiai patvirtintų vaistinių notrų (S. officinalis) ţaliavų panaudojimo indikacijų Europoje nėra, tradicinėje medicinoje šio augalo ţaliavos yra vartojamos labai plačiai. Pavyzdţiui, lapų nuovirai kvėpavimo takų sutrikimams gydyti: skatinti atsikosėjimą, slopinti astmos simptomus. Uţpilai buvo vartojami pilvo, podagros ir mėnesinių skausmams malšinti, aukštai temperatūrai, įvairioms neuralgijoms maţinti. Infekuotas atviras ţaizdas ar opas plaudavo vaistinių notrų nuovirais siekiant sumaţinti uţdegimą [1,12,25,31,51]. Anot tradicinės medicinos, vaistinių notrų (S. officinalis) arbatos gali būti vartojamos siekiant palengvinti galvos skausmus, gerklės skausmus, kepenų nepakankamumą, širdies nepakankamumą, diarėją [25]. Literatūroje teigiama, kad iš šių augalų buvo gaminami priešriaumatiniai vaistai ir netgi vaistai, skirti gydyti vėţinius susirgimus [10,20,31].

Nors vaistinės notros (Stachys officinalis L.) nėra Europos farmakopėjoje aprašyti augalai, tačiau vartotojams iš viso pasaulio po truputį nusigręţiant nuo cheminių antioksidantų ir ieškant natūralių alternatyvų, pastaraisiais metais atliekama vis daugiau tyrimų, siekiant įrodyti antioksidacines šio augalo ypatybes bei patvirtinti tam tikras naudojimo indikacijas. Tyrimais įrodyta, kad S. officinalis antţeminių dalių ekstraktai slopina įvairius fermentus, tokius kaip α-gliukozidazė ir α-amilazė. Ši sąveika daro įtaką hipergikemijai, todėl S. officinalis ţaliava turi didelį potencialą. Galima daryti prielaidą, kad iš vaistinių notrų ţaliavų įmanoma kurti fitopreparatus, pritaikytus antrojo tipo cukrinio diabeto kontrolei palaikyti [7].

Vengrijoje buvo atlikti tyrimai siekiant nustatyti Stachys genties atstovų - S. Recta, S. Palustris, S. officinalis, S. Sylvatica, S. Bysantica, S. Germanica - citotoksinį aktyvumą prieš tris karcinomos rūšis (MCF7, HeLA, A431). Tyrimo metu in vitro buvo gauti teigiami ir daug ţadantys rezultatai . S. Recta ir S. Palustris ţiedų metanoliniai ekstraktai pasiţymėjo didesniu nei 25 proc. ląstelių poliferaciją slopinanačiu poveikiu HeLA ląstelių kultūroms. S. Palustris, S. Bysantica, S. Germanica stiebų, lapų ir ţiedų metanoliniai ekstraktai taip pat turėjo didesnį nei 25proc. ląstelių poliferaciją slopinantį poveikį MCF7 ląstelių kultūroms. Kitos tirtos Stachys genties rūšys turėjo reikšmingai maţesnį karcinomos ląstelių poliferaciją slopinantį poveikį. Šioje mokslinėje publikacijoje pateikiama įrodymų, kad augalų ţaliavose kaupiamas aukubinas galimai gali turėti vėţinių ląstelių poliferaciją slopintį poveikį, o S. officinalis lapuose šios medţiagos taip pat yra randama [10].

S. officinalis ţaliavose kaupiami iridoidai [3,18]. Svarbu tai, kad tirtose modelinėse sistemose uţdegimą slopinantis antţeminės augalo dalies vandeninių ekstraktų poveikis trunka net iki 24 val [18].

Mokslinėje literatūroje galima rasti tyrimų, atliktų ne tik su vaistinių notrų augaliniais ekstraktais, tačiau ir su eteriniais aliejais. Juose teigiama, kad vaistinių notrų eterinis aliejus pasiţymi priešgrybeliniu poveikiu. Nustatyta, kad eterinis aliejus slopina Aspergillus niger ir Candida albicans grybelių augimą. Dėl šių savybių S. officinalis eterinis aliejus galėtų būti vartojamas kandidozių profilaktikai ar net gydymui [33].

2.

TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1

Tyrimų objektas

Tyrimo objiektas – natūraliai gamtoje augančios S. officinalis ţaliavos. Ţaliavos surinktos masinio ţydėjimo metu liepos – rugpjūčio mėnesiais 2016 – 2017 metais. Iš skirtingų cenopopuliacijų surinkti augalinių ţaliavų mėginiai buvo suskirstyti į ţiedus, lapus ir stiebus. Tokiu būdu paruošti augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdţiai. Ţaliavos surinktos pievose ir pamiškėse, esant toliau nuo vaţiuojamųjų kelių bei pramoninių objektų, išdţiovintos vietoje, apsaugotoje nuo drėgmės ir tiesioginių saulės spindulių, ir buvo laikomos kartoninėse dėţėse, kuriose buvo sudarytos sąlygos cirkuliuoti orui.

2 lentelė. Žaliavos rinkimo vieta ir laikas. Eil. Nr Ţaliavos rinkimo

data

Rinkimo vieta Lietuvos rajonas

1 2016-08-03 Šimkūnai Utenos raj.

2 2016-07-13 Ilgakiemis Kauno raj.

3 2016-08-03 Juodgalviai Ignalinos raj.

4 2016-07-19 Tytuvėnai Kelmės raj.

5 2016-08-04 Kazitiškis Ignalinos raj.

6 2016-07-17 Kazlų Rūda Kauno raj.

7 2016-08-15 Lazdijai Lazdijų raj.

8 2016-07-11 Anykščiai Ankyščių raj.

9 2016-07-11 Aţuoţeriai Ankykčių raj.

10 2016-08-06 Labanoras Švenčionių raj.

11 2016-07-08 Ginučių piliakalnis Ignalinos raj.

12 2016-08-04 Naujasis Daugėliškis Ignalinos raj.

13 2016-08-17 Bezdonys Vinliaus raj.

14 2017-07-03 Upytė Panevėţio raj.

15 2017-07-19 Paeţeriai Vilkaviškio raj.

16 2017-07-28 Akademija Kedainių raj.

17 2017-07-10 Sausinė Kauno raj.

18 2017-07-15 Bagnapolis Ukmergės raj.

19 2017-07-17 Kirkilai Birţų raj.

2.2

Medţiagos ir reagentai

heksahidratas (≥95 proc.) ir acto rūgštis (100 proc.)(Carl Roth GmbH, Vokietija), galo rūgšties monohidratas (≥98,0 proc.)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Kinija), Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (2M)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Šveicarija), bevandenis geleţies (II) chloridas (99,5 proc.) ir DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) (95 proc.) radikalas (Alfa Aesar GmbH & Co, Vokietija), rutino hidratas (≥94 proc.)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), ABTS (2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono)) rūgštis (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Kanada), kalio persulfatas (SIAL, Kanada), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8- tetrametilchromano-2-karboksi rūgštis) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, JAV), analitinio švarumo natrio nitritas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatas (≥ 99 proc.)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis (37 proc.)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio šarmas (99 proc.)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), etanolis (96 proc.) (V/V) (UAB „Stumbras“, Lietuva), išgrynintas vanduo.

2.3

Naudota aparatūra

Ekstrakcijai naudota ultragarso vonelė „ElmaSonic S40H“ (U=230V), gamintojas Elma Schmidbauer (Vokietija), automatinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic, gamintojas (IKA-WERKE, Vokietija). Spektrofotometrinei analizei naudoti 2 spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) ir „Agilent Technologies“ (Cary –60, JAV).

2.4

Tyrimų metodai

2.4.1

Tiriamųjų mėginių paruošimas

2.4.2 Reagentų paruošimas

70 proc. (V/V) etanolio - vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui

pagaminti reikia 665 ml 96proc. (V/V) etanolio ir 335 ml išgryninto vandens.

0,2 N Ciocalteu reagentas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 10 ml 2M

Folin-Ciocalteu fenolinio reagento praskiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

7,5 proc. (W/V) natrio karbonato (Na2CO3) tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 7,5g bevandenio natrio karbonato tirpinama 100 ml išgryninto vandens.

5 proc. metenamino tirpalas gaminamas 2,5 g metenamino tirpinant 50 ml išgryninto

vandens. 33 proc. acto rūgšties tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 33 ml 99,8 proc. ledinės acto rūgšties skiedţiama vandeniu iki 100 ml ţymos.

10 proc. aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas ruošiamas stiklinėje kolboje 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

Rutino etanolinis tirpalas gaminamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99 proc. grynumo rutino

tirpinant 25 ml 70 proc. (V/V) etanolio.

2 mM geležies (II) chlorido (FeCl2) tirpalas ruošiamas 0,0063g (tikslus svėrinys) bevandenio FeCl2 tirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas.

5 mM ferozino tirpalas gaminamas 0,0616 g ferozino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml

išgryninto vandens.

6×10-5 M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas gaminamas ir laikomas tamsaus

stiklo buteliuke, apsaugančiame nuo šviesos. 0,00118g (tikslus svėrinys) DPPH reagento ištirpinama 50 ml 96proc. (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas kiekvieną tyrimo dieną ruošiamas naujas.

ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių

tirpinama 50 ml išgryninto vandens, pridedama 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys 15 -16 val. laikomas tamsioje vietoje kambario temperatūroje. Motininis ABTS tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS•+ tirpalą.

0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas gaminamas atmatuojant 42 ml 37proc. vandenilio

chlorido rūgšties ir ją maišant su išgrynintu vandeniu iki 1 litro.

Praskiestas natrio šarmo tirpalas gaminamas pasveriant tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį,

kuris ištirpinamas išgrynintame vandenyje ir praskiedţiamas iki 100 ml.

Arnow reagentas gaminamas pasveriant tikslų 10,000 g natrio molibdato kiekį, ištirpinant jį

2.5

Vaistinių notrų (S. officinalis) žaliavos ekstraktų spektrofotometrinė

analizė

2.5.1

Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas

Folin-Ciocalteu reagentas bei spektrofotometrinė analizė buvo naudojama siekiant nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį etanoliniuose S. officinalis ekstraktuose. Analizei buvo imama 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:100) ir sumaišyta su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagento. Po 4 min. įpilama 4 ml 7,5 proc. (W/V) Na2CO3 tirpalo. Viskas paliekama stovėti 1 val . Gauto tirpalo absorbcija išmatuojama esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, kai palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Bendrasis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GRE), remiantis galo rūgšties kalibracine kreive 7 pav., skaičiavimams naudojama formulė:

GRE (mg/g) = c × V/m;

c– galo rūgšties koncentracija (mg/ml); v – pagaminto ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

Iš kiekvieno ekstrakto buvo gaminami du analizės bandiniai.

7 pav. Galo r. kalibracinė kreivė

2.5.2

Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas

Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatomas tiriamąjį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido ir metenamino tirpalais parūgštinus ekstraktą acto rūgštimi. Iš kiekvieno ekstrakto gaminti 2 analizės bandiniai. Kiekvienam iš jų ruošti du tirpalai: tiriamasis ir palyginamasis.

y = 10,756x + 0,0212 R² = 0,999 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1 A b sob ci jos d yd is

Tiriamasis tirpalas gaminamas 25 ml matavimo kolbutėje 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100) sumaišius su 10 ml 96 proc. (V/V) etanolio, 0,5 ml 33 proc. acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5 proc. metenamino tirpalo, gautas mišinys skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 25 ml ţymos, viskas sumaišoma. Po 30 min matuojamas tirpalo absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant 475 nm bangos ilgiui.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100), 10 ml 96 proc. etanolio (V/V), 0,5 ml 33 proc. acto rūgšties tirpalo. Mišinys skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 25 ml ţymos, sumaišomas. Kiekvienas bandinys matuojamas po 2 kartus.

Duomenys vertinami gautą tirpalo absorbciją lyginant su etaloninio rutino tirpalo absorbcija. Etanolinio tiriamojo ir palyginamojo rutino tirpalas ruošiamas vietoj 1 ml etanolinio ekstrakto įpilant 1 ml etanolinio rutino tirpalo. Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g remiantis formule:

;

mR – rutino masė, sunaudota etaloniniam rutino tirpalui ruošti (g); m – augalinės žaliavos masė, sunaudota ekstraktui ruošti (g); AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;

A – tiriamojo augalinio ekstrakto tirpalo absorbcijos dydis; VR – etaloninio rutino tirpalo tūris (ml);

V – augalinio ekstrakto tūris (ml).

2.5.3

Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu

metodu

Vienam analizės bandymui iš kiekvieno ekstrakto gaminama po du tirpalus – tiriamąjį ir lyginamąjį. Tiriamasis tirpalas gaminamas kolbutėje maišant 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, dedant 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedţiant išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišant. Gauto tirpalo absorbcija matuojama esant 525 nm bangos ilgiui.

Lyginamuoju tirpalu naudojamas tirpalas, paruoštas kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedţiant išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišant. Kiekvienas ekstraktas tiriamas po 2 kartus.

A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m – atsvertas žaliavos kiekis, g.

2.5.4

Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį Fe

jonų

sujungimo metodą

Gebėjimas sujungti pereinamųjų metalų, (pvz Fe2+

, Cu2+) jonuslemiafenolinių junginių antioksidacinį aktyvumą, todėl chelatines ekstraktų savybes galima įvertinti matuojant Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumaţėjimą. Analizėje naudojamas bangos ilgis -562 nm. Kiekvienam ekstraktui ruošiami 2 mėginiai. Į 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:200) įpilama 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo ir gerai sumaišoma. Reakcija inicijuojama įpylus 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo, dar kartą sumaišoma ir paliekama stovėti kambario temperatūroje 10 min. Matuojama gauto mišinio absorbcija. Tuščias bandinys ruošiamas vietoj 1 ml etanolinio ekstrakto įpilant 1 ml 70 proc. (V/V) etanolio ir sumaišant su tais pačiais reagentais. Palyginamasis tirpalas – 70 proc. (V/V) etanolis. Ekstrakto gebėjimas sujungti Fe2+

jonus išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamos pagal formulę:

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis; Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis.

2.5.5

Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį DPPH

radikalų surišimo metodą

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (po 30 min). Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).

2.5.6

Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas naudojant ABTS˙+ metodą

Antiradikalinio aktyvumo įvertinimui ţaliavų ekstraktuose taikytas 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgšties radikalo surišimo metodas.

Motininio tirpalo gaminimas: 2 mM motininis ABTS tirpalas gaunamas tiksliai sveriant 0,0548 g ABTS reagento ir tirpinant 50 ml išgryninto vandens. Tirpalas gaminamas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugotas nuo saulės šviesos.

Darbinio tirpalo gaminimas: gautas motininis ABTS tirpalas aktyvuojamas įpylus 70 mM kalio persulfato tirpalo, sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje 15-16 val, kol bus tinkamas naudoti. Po aktyvacijos gautas pradinis ABTS˙+ tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu, kol gaunama tiksli tirpalo absorbcija (0,800 ± 0,03), esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas - išgrynintas vanduo.

Tiriamųjų etanolinių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas matuojamas į 3,0 ml darbinio ABTS˙+ tirpalo įlašinant 30 μl tiriamojo ekstrakto. Iš kiekvieno ekstrakto gaminti 2 mėginiai, kurie laikomi kambario temperatūroje 60 min, po to jų absorbcija matuojama esant 734 nm bangos ilgiui.

Laisvųjų radikalų surišimo geba įvertinama remiantis trolokso kalibracine kreive (8 pav.) ir išreiškiama trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui ţaliavos.

8 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų – katijonų sujungimo metodu (n=3)

c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (μmol/g); V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

Etaloninio antioksidanto trolokso kalibracinė kreivė sudaroma ruošiant 6 skirtingų koncentracijų trolokso tirpalus. Pirminis trolokso tirpalas ruošiamas sveriant tikslų trolokso kiekį ir tirpinant jį 70 proc. (V/V) etanolyje. Iš šio tirpalo gaminami 5 skirtingų koncentracijų (250 – 6000 μmol/l) tirpalai, su kuriais atliekamas ABTS tyrimas. Išmatavus pagamintų koncentracijų trolokso tirpalų absorbcijos reikšmes, pagal jas sudaroma kalibracinė kreivė (8 pav.).

2.6

Duomenų analizė

3.

REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1

Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Analizuojant augalinių ţaliavų polifenolinių junginių kiekį bet jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, tikslinga pasigaminti ekstraktus, kuriuose būtų maksimali fenolinių junginių koncentracija. Tai pasiekti galima parenkant ekstrakcijos sąlygas atitinkamai augalinei ţaliavai. Mokslinėje literatūroje teigiama, kad polifenolinių junginių ekstrakcijai iš augalinių ţaliavų daţniausiai naudojami metanolio ir vandens arba acetono ir vandens mišiniai [30,39,49]. Tačiau dėl minetų tirpiklių toksiškumo šiame tiriamajame darbe buvo pasirinktas etanolis. Tinkamiausios ekstrakcijos sąlygos buvo optimizuotos įvertinus ekstrahento poliškumą, ekstrakcijos proceso trukmę bei tinkamiausią temperatūrą. Ekstraktai buvo gaminami iš Naujojo Daugėliškio augavietėje surinktų vaistinių notrų (S.

officinalis) lapų ţaliavų.

3.1.1

Ekstrahento poliškumo parinkimas

Siekiant išsiaiškinti, kokia yra tirpiklio poliškumo įtaka biologiškai aktyvių medţiagų išeigai, buvo parinktos 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc., 80 proc. etanolio (V/V) koncentracijos. Tam buvo naudojamas paprastosios maceracijos metodas. Ant 0,001 g ţaliavos tikslaus svėrinio buvo uţpilama 10 ml tam tikros koncentracijos etanolio ir 60 min. purtoma automatinėje purtyklėje. Po purtymo mėginiai buvo laikomi 24 val. tamsioje vietoje. Praėjus šiam laiko tarpui, mėginiai vėl buvo pakartotinai purtomi 60 min. Gauti ekstraktai buvo filtruojami popieriniu filtru į tamsaus stiklo buteliukus. Biologiškai aktyvių medţiagų išeigai nustatyti buvo naudojamas Folin-Ciocalteu metodas. Gauti rezultatai pateikiami 9 pav.

9 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas S. officinalis lapų žaliavos bandiniuose paprastosios maceracijos metodu. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=3)

10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 30 40 50 60 70 80 90 100 G RE , mg /g

9 pav. matyti, kad iš vaistinių notrų ţaliavos išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis didţiausias, kai etanolio koncentracija yra 70 proc. (25,79 ±.1,08 mg/g). Etanolio koncentracijai kylant nuo 40 proc. iki 70 proc., fenolinių junginių išeiga didėja, o pasiekus 80 proc. - sumaţėja. Atsiţvelgiant į tirpiklio poliškumo įvertinimo tyrimų metu pasiektą didţiausią fenolinių junginių išeigą, nuspręsta 70 proc. (V/V) etanolį naudoti kaip ekstrahentą vaistinių notrų ţaliavų tolimesniuose tyrimuose.

3.1.2

Ekstrakcijos trukmės parinkimas

Polifenolinių junginių ekstrakcijos išeiga priklauso nuo ekstrahavimo trukmės [32]. Šiai priklausomybei įvertinti buvo pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas. Ekstraktai (1:100) ruošti iš vaistinių notrų lapų ţaliavos, ekstrahentu naudojant 70 proc. (V/V) etanolio – vandens mišinį. Bandiniai veikti ultragarsu 5, 10, 15 ir 20 min., esant 30 °C ± 5°C temperatūrai. Gauti rezultatai pateikiami 10 pav.

10 pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės įvertinimas S. officinalis lapų žaliavų bandiniuose. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=3)

Nustatyta, kad net 5 min. ekstrakcija ultragarsu uţtikrina beveik tokią pačią fenolinių junginių išeigą (25,06 ± 0,51 mg/g), lyginant su paprastąja maceracija (25,79 ±.0,54 mg/g). Didţiausia fenolinių junginių išeiga pasiekta vykdant ekstrakciją ultragarsu 15 min. (26,49± 0,49 mg/g). Ektrakcijos trukmei pailgėjus iki 20 min. – fenolinių junginių išeiga neţymiai sumaţėjo, todėl tolimesniems tyrimams buvo pasirinkta 15 min. trukmė. Taigi atsiţvelgiant į ţenkliai trumpesnę ekstrakcijos trukmę tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas.

3.1.3

Ekstrakcijos temperatūros parinkimas naudojant ultragarso vonelę

Siekiant nustatyti temperatūrą, kurioje išekstrahuojama daugiausiai polifenolinių junginių, buvo atiekami tyrimai, kurių metu buvo naudojamos jau eksperimentiniais tyrimais pagrįstos sąlygos: tirpiklis - 70 proc. (V/V) etanolio ir vandens mišinys, metodas – ekstrakcija ultragarsu 15 min. Bandiniai buvo ekstrahuojami esant šioms temperatūroms: 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C. Gauti tyrimų rezultatai vaizduojami 11 pav.

11 pav. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros įvertinimas S. officinalis lapų žaliavos bandiniuose. GRE – galo rūgšties ekvivalentai (n=3)

Tyrimo metu nustatyta, kad tinkamiausia temperatūra fenolinių junginių ekstrakcijai iš S.

officinalis ţaliavos yra 40 °C (25,73 ± 0,29 mg/g). Toliau didinant temperatūrą, fenolinių junginių

išeiga tolygiai maţėja. Tokius rezultatus gali sąlygoti tam tikrų fenolinių junginių savybė oksiduotis ir degraduoti esant aukštai temperatūrai [32]. Remiantis šiais duomenimis tolimesniems tyrimams skirtų ekstraktų iš vaistinių notrų ţaliavų gamybai pasirinkta 40 °C temperatūra, siekiant gauti didţiausią biologiškai aktyvių medţiagų išeigą.

3.2

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas vaistinių notrų (S.

officinalis) ţaliavose

Bendras fenolinių junginių kiekis daugumoje mokslinių publikacijų gretinamas su gebėjimu surišti laisvuosius radikalaus [1,20,25,51]. Taigi, pirmiausia tikslinga įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį. Bendras fenolinių junginių kiekis vaistinių notrų etanoliniuose ekstraktuose buvo ištirtas naudojant Folin-Ciocalteu metodą. Šių tyrimų rezultatai pateikti 12 pav.

Tyrimų metu nustatyta, kad bendras fenolinių junginių kiekis skirtingose vaistinių notrų morfologinėse dalyse kinta labai plačiose ribose, nuo 5,35 ± 0,24 mg/g iki 29,30 ± 0,91 mg/g. Apskaičiuotos variacijos koeficientų skaitinės reikšmės lapams yra 16,60 proc., ţiedams - 20,05 proc., o stiebams - 28,29 proc. Vaistinių notrų lapų ţaliavose vidutinis fenolinių junginių kiekis yra 17,13 proc. didesnis negu ţiedų ţaliavose ir net 63,89 proc. didesnis nei stiebuose. Atsiţvelgiant į nustatytus didelius fenolinių junginių kiekio skirtumus tarp morfologinių augalo dalių ţaliavų (lapų, ţiedų ir stiebų), tikslinga būtų išsamiau paanalizuoti lapų ir ţiedų ţaliavas, kuriose sukaupiami reikšmingai didesni biologiškai aktyvių medţiagų kiekiai.

12 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis S. officinalis žiedų, lapų ir stiebų žaliavose, surinktose skirtingose Lietuvos vietovėse. Nurodytas vidurkis ± standartinė paklaida. GRE – galo

rūgšties ekvivalentai (n=2)

Fitocheminio tyrimo rezultatai parodė, kad tirtose S. officinalis lapų ţaliavose kaupiamų fenolinių junginių kiekis kinta nuo 16,86 ± 0,50 mg/g iki 29,30 ± 0,91 mg/g. Bendras aritmetinis lapų ţaliavų fenolinių junginių vidurkis yra 22,71 ± 1,13 mg/g. 10-yje iš 19-os cenopopuliacijų surinktų lapų ţaliavose buvo sukaupti didesni fenolinių junginių kiekiai uţ vidurkį, o likusiose 9-iose cenopopuliacijose surinktose lapų ţaliavose bendras fenolinių junginių kiekis buvo maţesnis uţ vidurkį. Didţiausi fenolinių junginių kiekiai buvo rasti Bagnapolio, Upytės, Kazlų Rūdos, Ilgakiemio ir Kirkilų augavietėse surinktose S. officinalis lapų ţaliavose (atitinkamai, 29,01 proc., 27,52 proc., 21,18 proc., 14,04 proc. ir 11,49 proc. daugiau uţ vidurkį). Maţiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti Kazitiškio, Aţuoţerių ir Tytuvėnų cenopopuliacijose surinktų lapų ţaliavose (atitinkamai, 25,76 proc., 17,52 proc. ir 17,30 proc. maţiau uţ vidurkį).

S. officinalis ţiedų ţaliavose kaupiamų fenolinių junginių kiekis kinta nuo 12,04 ± 0,47 mg/g

iki 26,96 ± 1,08 mg/g. Bendras aritmetinis ţiedų ţaliavos fenolinių junginių kiekio vidurkis yra 18,82 ± 0,73mg/g. 10-yje iš 19-os skirtingų cenopopuliacijų surinktose ţiedų ţaliavose buvo sukaupti didesni uţ vidurkį fenolinių junginių kiekiai, o likusiose 9-iose cenopopuliacijose surinktų ţiedų ţaliavose

bendras fenolinių junginių kiekis buvo maţesnis uţ vidurkį. Didţiausi fenolinių junginių kiekiai buvo rasti Upytės, Bagnapolio, Kazlų Rūdos, Sausinės ir Kirkilų augavietėse surinktose S. officinalis ţiedų ţaliavose (atitinkamai 43,25 proc., 28,05 proc., 17,53 proc., 17,05 proc. ir 13,97 proc. daugiau uţ vidurkį). Maţiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti Kazitiškio, Šimkūnų ir Tytuvėnų cenopopuliacijose surinktose ţiedų ţaliavose (atitinkamai, 44,22 proc., 36,02 proc. ir 13,33 proc. maţiau uţ vidurkį).

2015 metais Rumunijoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu Folin-Ciocalteu metodu buvo tiriama vaistinių notrų fenolinių junginių kiekis etanoliniuose augalo ekstraktuose. Tyrimo rezultatai parodė, kad S. officinalis lapų ţaliavose nustatytas vidutinis fenolinių junginių kiekis buvo 14,56 proc. didesnis nei ţiedų ţaliavose, tai sutampa su mūsų tyrimų metu gautais rezultatais [17].

2013 metais Lietuvoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo įvertintas S. officinalis lapų, surinktų Kauno botanikos sode, fenolinių junginių kiekis metanoliniuose ir acetoniniuose ekstraktuose. Tyrimo rezultatai parodė, kad metanoliniuose ekstraktuose fenolinių junginių kiekis buvo 61,2 ± 5,6 mg/g, o acetoniniuose ekstraktuose fenolinių junginių kiekis buvo 82,3 ± 4,6 mg/g [21]. Rezultatų skirtumui įtakos gali turėti ekstrahento pasirinkimas, galimai skirtingas ţaliavų surinkimo tarpsnis bei skirtingos ţaliavų laikymo ir dţiovinimo sąlygos [32]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad S. officinalis ţaliavos kaupiamų biologiškai aktyvių medţiagų kiekiui tiesiogiai įtakos turi augalo augimo metai. Trečiaisiais augalo metais augalo ţaliavos sukaupia reikšmingai didesnius biologiškai aktyvių medţiagų kiekius nei pirmaisias ir antraisiais augalo auginimo metais [27].

3.3

Bendro flavonoidų kiekio nustatymas vaistinių notrų (S. officinalis)

ţaliavose

Mokslinėje literatūroje augalinių ţaliavų antioksidacinės savybės paprastai siejamos ne tik su bendru fenolinių junginių kiekiu. Labai svarbu išsiaiškinti, kokią fenolinių junginių dalį sudaro flavonoidai, nes šiems junginiams charakteringas reikšmingas antioksidacinis poveikis [2,46]. Tyrimui pasirinktas UV spektrofotometrijos metodas, paremtas flavonoidų kompleksų su aliuminio jonais susidarymu. Vaistinių notrų ţaliavos tyrimo rezultatai, taikant šį metodą, pateikti 13 pav.

Atsiţvelgiant į nustatytus didelius flavonoidų kiekio skirtumus tarp morfologinių augalo dalių (lapų, ţiedų ir stiebų), tikslinga būtų išsamiau paanalizuoti lapų ir ţiedų ţaliavas, kurios kaupia reikšmingai didesnius flavonoidų kiekius.

Fitocheminių tyrimų rezultatai parodė, kad tirtose S. officinalis lapų ţaliavose sukauptų flavonoidų kiekis kinta nuo 13,56 ± 0,43 mg/g iki 28,42 ± 1,19 mg/g. Bendras aritmetinis lapų ţaliavų flavonoidų kiekio vidurkis yra 18,55 ± 0,92 mg/g.

13 pav. Bendras flavonoidų kiekis S. officinalis žiedų, lapų ir stiebų žaliavose, surinktose skirtingose cenopopuliacijose. Nurodytas vidurkis ± standartinė paklaida. RE – rutino ekvivalentai

(n=2)

Fitocheminių tyrimų rezultatai parodė, kad tirtose S. officinalis lapų ţaliavose sukauptų flavonoidų kiekis kinta nuo 13,56 ± 0,43 mg/g iki 28,42 ± 1,19 mg/g. Bendras aritmetinis lapų ţaliavų flavonoidų kiekio vidurkis yra 18,55 ± 0,92 mg/g. 8-iose iš 19-os cenopopuliacijų surinktose lapų ţaliavose buvo sukaupti didesni flavonoidų kiekiai uţ bendrą artimetinį vidurkį, o 11-oje likusių cenopopuliacijų ţiedų ţaliavose buvo nustatytas maţesnis flavonoidų kiekis nei aritmetis vidurkis. Didţiausi flavonoidų kiekiai nustatyti Bagnapolio, Upytės, Kazlų Rūdos, Kirkilų, Sausinės, Ilgakiemio cenopupuliacijų ţaliavose (atitinkamai, 52,2 proc.,47,00 proc.,42,53 proc., 35,51 proc., 16,24 proc. ir 15,42 proc. daugiau uţ vidurkį). Maţiausi flavonoidų kiekiai nustatyti Aţuoţerių, Labanoro, Naujojo Daugeliškio teritorijose surinktos ţaliavos (atitinkamai 49,97 proc., 32,50 proc. ir 24,90 proc. maţiau uţ vidurkį).

S. officinalis ţiedų ţaliavose sukauptų flavonoidų kiekis kinta nuo 4,50 ± 0,22 mg/g iki 12,66

± 0,62 mg/g. Bendras aritmetinis ţiedų ţaliavos vidurkis yra 8,33 ± 0,42 mg/g. 9-iose iš 19-os cenopopuliacijų surinktose ţiedų ţaliavose buvo sukaupti didesni flavonoidų kiekiai uţ vidurkį, o 10-yje cenopopuliacijų ţaliavose šių junginių rasta maţiau uţ vidurkį. Didţiausi flavonoidų kiekiai nustatyti Bagnapolio, Sausinės, Kazitiškio, Upytės, Kazlų Rūdos cenopupuliacijose surinktose ţiedų ţaliavose (atitinkamai, 51,98 proc., 37,21 proc., 37,21 proc., 30,13 proc., ir 27,85 proc. daugiau uţ

vidurkį). Maţiausi flavonoidų kiekiai nustatyti Šimkunų, Akademijos, Anykščių teritorijose surinktose ţiedų ţaliavose (atitinkamai 45,97 proc., 45,17 proc. ir 40,69 proc. maţiau uţ vidurkį).

Vertinant fitocheminių tyrimų rezultatus, galima pastebėti, kad bendro fenolinių junginių kiekio variacijos yra panašios į flavonoidų kiekybinės sudėties kitimus vaistinių notrų morfologinėse dalyse, bei populiacijose. Didţiausi flavonoidų kiekiai nustatyti lapų ţaliavose, o maţiausi - stiebuose. Didţiausi fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai nustatyti Bagnapolio, Upytės ir Kazlų Rūdos cenopopuliacijose surinktose ţaliavose.

2015 metais Rumunijoje buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo tiriamas vaistinių notrų antţeminių dalių etanolinių ekstraktų flavonoidų kiekis. Alikus išsamią analizę ESCH chromatografijos metodu, paaiškėjo, kad didţiausią jų kiekį sudaro šie flavonoidai: kvarcetinas - 2,97 µg/ml, kamferolis - 4,33 µg/ml, luteolinas - 1,85 µg/ml, apigeninas - 3,15 µg/ml, rutinas - 1,01 µg/ml. Minėtame tyrime taip pat buvo analizuojamas vaistinių notrų S. officinalis ekstraktų gebėjimas inhibuoti α-amilazės and α-gliukozidazės fermentus. Tyrimas parodė, kad flavonoidų kiekis turi stiprų koreliacinį ryšį su augalo ekstraktų fermentus inhibuojančiu poveikiu. Taigi S. officinalis antţeminėse augalo dalyse kaupiami flavonoidai gali būti siejami su priešdiabetiniu farmakologiniu poveikiu [7].

3.4

Bendro fenolio rūgščių kiekio nustatymas vaistinių notrų (S. officinalis)

ţaliavose

Literatūroje nurodoma, kad vaistinės notros (Stachys officinalis L) kaupia didelius kiekius chrorogeno, ferulo, kavos ir rozmarino rūgščių [7,10,12,15]. Todėl, atliekant tiriamąjį darbą, tikslinga preliminariai nustatyti bendrąjį fenolio rūgščių kiekį. Gauti tyrimų rezultatai pateikti 14 pav.

Atliktų tyrimų metu nustatyta, kad bendras fenolio rūgščių kiekis skirtingose augalo morfologinėse dalyse įvairuoja labai plačiose ribose nuo 7,38 ± 0,07 mg/g iki 355,9 ± 7,01 mg/g. Apskaičiuotos variacijos koeficientų skaitinės reikšmės lapų ţaliavoms yra 40,10 proc., ţiedų - 33,45 proc., o stiebams - 49,45 proc. S. officinalis lapų ţaliavose nustatytas vidutinis fenolio rūgščių kiekis 40,08 proc. didesnis lyginant su ţiedų ţaliava ir net 89,94 proc. didesnis lyginant su stiebų ţaliava. Atsiţvelgiant į nustatytus didelius fenolio rūgščių kiekio skirtumus tarp morfologinių augalo dalių, tikslinga būtų išsamiau paanalizuoti lapų ir ţiedų ţaliavas.