MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TOMA RAIŠYTĖ
VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS
VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas prof. dr. K. Ramanauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data:
VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS
VERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Kristina Ramanauskienė Data:
Recenzentas Darbą atliko: Magistrantė Toma Raišytė Data: Data:
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) bendra charakteristika ... 11
1.2.Vaistinių melisų žaliavos cheminė sudėtis ... 11
1.2.1.Polifenoliniai junginiai augalinėje žaliavoje ... 12
1.3.Vaistinių melisų biologinis poveikis ir pritaikymas medicinos praktikoje ... 14
1.4.Vaistinių melisų preparatai, esantys Lietuvos rinkoje ... 17
1.5.Užpilai, nuovirai, tinktūros ir ekstraktai. Jų technologija bei analizės metodai ... 18
1.6.Ekstrahentų, naudojamų augalinių ištraukų gamyboje, charakteristikos ... 20
2.TYRIMO METODIKA IR METODAI... 22
2.1.Tyrimuose naudotos medžiagos ... 22
2.2.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų technologija ... 22
2.3.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų technologija ... 24
2.4.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ištraukų gamyba ekstrahuojant ultragarsu ... 25
2.5.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) arbatos technologija ... 25
2.6.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ir vandeninių ištraukų analizės metodai ... 26
2.6.1.Sauso likučio kiekio nustatymas ... 26
2.6.2.Suminio polifenolinių junginių kiekio nustatymas pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą spektrofotometriniu metodu ... 26
2.6.3.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų antimikrobinio aktyvumo vertinimas.. .. 27
3.REZULTATAI ... 28
3.1.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų kokybės vertinimas ... 28
3.1.1.Ekstrahento įtaka vaistinių melisų tinktūrų (1:5) kokybei ... 28
3.1.2.Ekstrahavimo metodo įtaka melisų tinktūrų (1:5) kokybei ... 29
3.2.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų kokybės vertinimas ... 34
3.2.1Ekstrahento įtaka melisų ekstraktų (1:1) kokybei ... 34
3.3.Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei ... 41
3.3.1.Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei gaminant maceracijos metodu.. 41
3.3.2.Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei ekstrahuojant ultragarsu ... 43
3.4.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) vandeninių ištraukų kokybės vertinimas... 44
3.5.Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų antimikrobinis aktyvumas ... 46
IŠVADOS ... 48
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49
PUBLIKACIJOS MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA ... 50
SANTRAUKA
T. Raišytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė prof. dr. K. Ramanauskienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. – Kaunas.
VAISTINIŲ MELISŲ IŠTRAUKŲ TECHNOLOGIJA IR KOKYBĖS VERTINIMAS
Darbo tikslas:Pagaminti vaistinių melisų ištraukas ir įvertinti jų kokybę. Darbo uždaviniai:
1. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis parinkti tinkamą vaistinių melisų skystą vaisto formą, atsižvelgiant į veikliosios medžiagos farmakologines savybes bei parinkti analizės metodus preparatų kokybei įvertinti;
2. Nustatyti ekstrahento (etanolio ir vandens) įtaką melisų ištraukų kokybei; 3. Palyginti ekstrahavimo metodo daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 4. Ištirti žaliavos ir ekstrahento santykio daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei.
Metodika:
1. Tyrimo objektas – vaistinių melisų ištraukos;
2. Vaistinių melisų vandeninių ir etanolinių ištraukų technologija: a) Ištraukos gamintos klasikinės maceracijos ir perkoliacijos metodais;
b) Etanolinės ištraukos gamintos ekstrahuojant ultragarsu ir kokybė vertinama po 20 min., 30 min. ir 40 min. ekstrahavimo;
3. Taikytas spektrofotometrinis metodas pagal Folin – Ciocalteau metodiką, norint nustatyti suminį polifenolinių junginių kiekį pagal KRE;
4. Sauso likučio tyrimas atliktas gravimetriniu metodu;
5. Antimikrobinis aktyvumas nustatytas pagal Ph. Eu. 01/2002, 2.6.12 metodiką. Rezultatai:
Spektrofotometriniu metodu nustatyta, kad ekstrahentas turi įtakos veikliųjų junginių išsiskyrimui: didesnis suminis polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekis nustatytas, kai ekstrahentu pasirenkamas etanolis, o ne vanduo. Vertinant etanolio koncentraciją nustatyta, kad mažiausiai veikliųjų junginių išsiekstrahuoja naudojant 70 proc. etanolį, o daugiausiai - 40 ir 50 proc. etanolį. Technologinis metodas taip pat turėjo įtakos vaistinių melisų ištraukų kokybei. Daugiausiai veikliųjų junginių nustatyta, technologijai pasirinkus ekstrahavimą ultragarsu, 30 min. Ištraukų kokybei reikšmės turi ir žaliavos bei ekstrahento santykis – skystuosiuose ekstraktuose, pagamintuose santykiu 1:1, nustatytas didesnis veikliųjų junginių kiekis, lyginant su tinktūromis, kai santykis 1:5.
Išvados:
1. Tyrimų rezultatai parodė, jog ekstrahentu naudojant vandenį, veikliųjų junginių nustatyta mažiau, nei naudojant etanolį. Nustatyta, kad etanolio koncentracija turi įtakos veikliųjų junginių išsiekstrahavimui – didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis ir sausas likutis nustatytas ištraukose, kai etanolio koncentracija yra 50 ar 40 proc.;
2. Eksperimentinių tyrimų metu nustatyta, jog ekstrahavimo metodas daro įtaką melisų ištraukų kokybei. Tinkamiausias ekstrahavimo metodas melisų skystųjų ekstraktų ir tinktūrų gamyboje yra ekstrahavimas ultragarsu. Rekomenduojama ekstrahavimo trukmė – 30 min.;
3. Tyrimų rezultatai parodė, jog žaliavos ir ekstrahento santykis turi įtakos ištraukų kokybei. Didesnis veikliųjų junginių kiekis nustatytas skystuosiuose melisų ekstraktuose, pagamintuose santykiu 1:1, lyginant su melisų tinktūromis, pagamintomis santykiu 1:5;
4. Tyrimų metu nustatyta, jog vaistinių melisų tinktūros pasižymi antimikrobiniu aktyvumu. Labiausiai jautrios yra S. aureus bei K. pneumoniae, o labiausiai atspari – C. albicans.
Praktinės rekomendacijos:
1. Gaminant etanolines vaistinių melisų ištraukas, rekomenduojama rinktis skystuosius ekstraktus, pagamintus santykiu 1:1, kai ekstrahentas yra 40 ar 50 proc. etanolis;
SUMMARY
THE ANALYSIS OF QUALITY AND TECHNOLOGY OF EXTRACTS OF MELISSA OFFICINALIS
Purpose of work:
To make and evaluate the quality of Melissa officinalis extracts. Tasks of work:
1. According to the scientific literature to identify an appropriate Balm liquid dosage form according to the pharmacological properties of the active material and the selection of analytical methods for evaluating the quality of products;
2. To set an extraction solvent (ethanol and water) influence on the quality of extracts of Melissa officinalis;
3. To compare extraction method influence on the quality of extracts of Melissa officinalis; 4. To investigate the relationship between the raw material and extraction solvent influence on the quality of extracts of Melissa officinalis.
Methods:
1. Object of analysis – extracts of Melissa officinalis; 2. Preparation of an aquous and ethanolic extracts:
a) Extracts have been produced by tradicional maceration and percolation methods;
b) Ethanol extracts have been produced by extraction by ultrasound. The quality of these extracts has been evaluated after 20, 30, 40 min.
3. Spectrophotometric method (Folin – Ciocalteua method) – common amount of total polyphenolic compounds by p-cumaric acid equivalent has been evaluated;
4. The evaluation of dry residual according to gravimetric analysis has been calculated; 5. Antimicrobial activity by Ph. Eu. 01/2002, 2.6.12 method has been evaluated.
Results:
By spectrophotometric method it has been evaluated that extrahent has the influence on active compounds emission: higher amount of total polyphenolic compounds and dry residue have been evaluated when extrahent is ethanol. Concentration of ethanol has influence too: the lowest amount of active compounds has been evaluated when ethanol concentration is 70 percent, the highest amount is with 40 or 50 percent ethanol. Method of technology has the influence on quality of extracts of Melissa officinalis also. The best technological method for extracts of Melissa officinalis is extraction by ultrasound. Test results show, that the time of extraction has influence on extracts quality of Melissa officinalis – the highest amount of extractives has been evaluated when the time of extraction is 30 min. It has been shown, that ratio of herbal raw materials and volume of extrahent has influence on quality of extracts too - the highest amount of extractives has been evaluated when ratio is 1:1.
Conclusions:
1. Test results show, that when extrahent is water, amount of extractives is significant lower than extrahent is ethanol. It has been evaluated, that the most suitable ethanol concentration is 40 or 50 percent.
2. Experimental tests show, that the best method of technology is extraction by ultrasound, when extraction time – 30 min.;
3. Test results show, that is very important to choose the most suitable method of technology for ratio of herbal raw materials and volume of extrahent;
4. Test results show, that tictures of Melissa officinalis have antimicrobial activity. The most sensitive are S. aureus and K. pneumoniae and the most resistant is C. albicans.
Practice recommendation:
1. Prepaired ethanolic extracts of Melissa officinalis it is recommented to choose liquid extracts (1:1), when extrahent is 40 or 50 percent ethanol;
PADĖKA
Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti mokslinį tiriamąjį darbą tema „Vaistinių melisų ištraukų technologija ir kokybės vertinimas“ dėkoju prof. dr. K. Ramanauskienei bei visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui.
SANTRUMPŲ SĄRAŠAS
KRE – p-kumaro rūgšties ekvivalentas; r. – rūgštis;
Ach – acetilcholinas; CD – cukrinis diabetas;
EMEA – Europos medicinos agentūra;
GABA-T – gama amino butirinės rūgšties transaminazė; RA – rozmarininė rūgštis;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija; ŽIV – žmogaus imunodeficito virusas; TSH – tiroidus stimuliuojantis hormonas; CNS – centrinė nervų sistema;
COX – ciklooksigenazė; LOX – lipoksigenazė; Pg – prostaglandinai; Lt – leukotrienai;
Ph. Eur. – Europos farmakopėja; UAB – uždaroji akcinė bendrovė;
ĮVADAS
Vaistinės melisos (lot. Melissa officinalis L.) yra vienos iš seniausių, tačiau vis dar vienos iš populiariausių vaistinių augalų [29]. Jau nuo senų laikų ši vaistažolė buvo vartojama nerimo bei nemigos gydyme. Šiandieninėje mokslinėje literatūroje randame vis daugiau duomenų apie šių vaistinių augalų cheminę sudėtį ir kur kas platesnį jų pritaikymą medicinos praktikoje.
Didelis mokslininkų dėmesys yra skiriamas vaistinių melisų sudėtyje esantiems polifenoliniams junginiams, kurie ir nulemia daugelį vaistinių melisų poveikių. Šiuolaikinės mokslinės studijos labiausiai orientuotos į vaistinių melisų pritaikymą Alzheimerio ligai, taip pat Herpes simplex viruso gydymui, plačiai tiriamos antioksidacinės šio vaistinio augalo savybės. Todėl studijuojant mokslinę literatūrą, planuojama pateikti išsamesnę ir koncentruotą informaciją apie vaistinių melisų pritaikymą šių ir kitų ligų gydyme, analizuoti ir interpretuoti gautus rezultatus.
Tam, kad būtų atskleistos vaistinių melisų terapinės savybės, būtina parinkti tinkamą vaisto formą. Remiantis mokslinėmis publikacijomis, kaip viena iš formų gali būti pasirenkamos skystos vaistinių melisų vaisto formos, tokios kaip tinktūros ar ekstraktai, užpilai ar nuovirai. Tikslinga atlikti tyrimus, kurie padėtų išsiaiškinti, kokios – etanolinės ar vandeninės melisų ištraukos yra tinkamesnės vartoti į vidų ar išoriškai.
Temos aktualumas. Moksliniu požiūriu aktualu tai, kad vaistinės melisos pasižymi bakteriostatiniu, antimikrobiniu, antioksidaciniu ir antivirusiniu poveikiu, kas lemia jų pritaikymą įvairių ligų gydyme ir prevencijoje. Todėl tikslinga atlikti tyrimus, kuriais būtų galima įvertinti šių vaistažolių kokybę.
Aktualu vertinti ekstrahento įtaką vaistinių melisų kokybei, taip pat ištraukų paruošimo technologijas, kurios garantuotų optimalų veikliųjų junginių išsiekstrahavimą bei žaliavos ir ekstrahento santykio įtaką siekiant išgauti kuo didesnius veikliųjų junginių kiekius.
Tyrimo problema: skystos vaistinių melisų vaisto formos parinkimas, tinkamiausios technologijos pritaikymas ir kokybės vertinimas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: pagaminti vaistinių melisų ištraukas ir įvertinti jų kokybę;
Darbo uždaviniai:
1. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis parinkti tinkamą vaistinių melisų skystą vaisto formą, atsižvelgiant į veikliosios medžiagos farmakologines savybes bei parinkti analizės metodus preparatų kokybei įvertinti;
2. Nustatyti ekstrahento (etanolio ir vandens) įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 3. Palyginti ekstrahavimo metodo daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei; 4. Ištirti žaliavos ir ekstrahento santykio daromą įtaką vaistinių melisų ištraukų kokybei;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) bendra charakteristika
Vaistinė melisa (lot. Melissa officinalis L.) – tai daugiametis žolinis augalas, užaugantis iki 120 cm aukščio [20,42]. Augalas šakotas, apaugęs liaukiniais ir paprastais plaukeliais. Stiebas keturbriaunis, status. Lapai kiaušiniški, karbuoti arba karbuotai dantyti, kotuoti, priešiniai. Viršutinė lapų pusė plaukuota, o apatinė plaukuota tik prie gyslų [9,42]. Žiedai baltos arba rožinės spalvos, išsidėstę viršutinių lapų pažastyse [9,34,41,42].
Lotyniškas melisų pavadinimas kilęs iš graikiško žodžio ,,melitos" - tai reiškia medų nešančią bitę [22,34].
Šeima: Notreliniai (Lūpažiedžiai) – Lamiaceae (Labiateae) [7,9,11,14,17,28,33-35,42].
VAŽ – visa antžeminė dalis: stiebai, lapai, žiedai [6,10,35,42]. Gali būti renkama melisų žolė arba lapai [9]. Žolė renkama 15-30 cm ilgio, prieš pat žydėjimą. Džiovinama gerai vėsinamoje patalpoje ar džiovykloje ne aukštesnėje nei 400
C temperatūroje. Gerai išdžiovinta žolė - tai 15-30 cm ilgio stiebų viršūnės su lapais, žalios spalvos, kartoko skonio, citrinų kvapo [9,33,34].
Paplitimas. Vaistinės melisos labai paplitusios Pietų ir Pietryčių Europoje, Azijoje bei Afrikoje [7,9,14,17,22,30,33-35,40,42].
1.2. Vaistinių melisų žaliavos cheminė sudėtis
1. 0.06 – 0.8 proc. eterio aliejaus (40 proc. monoterpenai ir 35 proc. seskviterpenai: citralis, citronelalis, linalolis, geraniolis, nerolis ir kt.) [5,9,13,14,16,17,26,32,34,36,33,40];
2. Fenoliniai junginiai (rozmarininės rūgšties (RA) ≥ 6 proc., p-kumaro bei kofeino rūgštys) [9,11,16-18,22,24,27,31,33,35-37,39];
3. Askorbo rūgštis [5,9,10,27,34,42];
4. Vitaminas B (tiaminas, riboflavinas) [5,27,34,42]; 5. Karotinas [27,34,42];
8. Flavonoidai (ramnazinas, kvercetinas, kemferolis) [9,10,16,17,26,27,32,34,39,42]; 9. Triterpeninės rūgštys [9,10,16,18,27,34,39,42].
Svarbiausių struktūrinių elementų formulės pateiktos 1 lentelėje [31,37,42].
1 lentelė. Vaistinių melisų struktūrinių elementų formulės
Cheminio junginio pavadinimas Cheminio junginio formulė
Rozmarino rūgštis (RA)
Citralis (izomerų neralio ir geranialio mišinys)
ir Citronelalis
Linalolis
Nerolis
Geraniolis
1.2.1. Polifenoliniai junginiai augalinėje žaliavoje
Polifenoliniai junginiai – antriniai augalų metabolitai, kurie nustatomi beveik visuose aukštesniuosiuose augaluose [2,20,29]. Dažniausiai jie aptinkami augaliniame maiste, pvz. vaisiuose, daržovėse, grūduose) ir augalinės kilmės skysčiuose – vyne, kavoje bei arbatoje [20]. Jų reikšmė augalams iki galo neištirta. Manoma, kad polifenoliniai junginiai atlieka biocheminių procesų moduliatorių funkcijas, dalyvauja ekranuojant UV spinduliavimą bei augalui prisitaikant prie nepalankių aplinkos sąlygų. Jie apsaugo augalų ląsteles nuo oksidacinio bei deguonies trūkumo sukelto streso, sujungdami susiformavusius laisvuosius radikalus, dėl savo antimikrobinių savybių saugo augalą nuo patogeninių mikroorganizmų
lapams, žiedams, stiebams, vaisiams, todėl atlieka svarbų vaidmenį priviliojant vabzdžius, apdulkinančius augalus [2]. Dažniausiai aptinkami polifenoliniai junginiai yra fenolinės rūgštys, flavonoidai bei taninai [29].
Fenoliniai junginiai sudaro junginių klasę, kurios pagrinde yra fenolis C6H5OH. Polfifenoliai -
tai fenoliniai junginiai, kurių aromatinis žiedas turi daugiau nei vieną hidroksigrupę. Farah A., Donangelo C. M. (2006) autorių duomenimis, fenoliniai junginiai, atsižvelgiant į jų struktūrą, gali būti skirstomi į skirtingas klases ir poklasius (2 lentelė).
2 lentelė. Fenolinių junginių pagrindinės klasės ir poklasiai (Farah A., Donangelo C. M)
Klasės ir poklasiai Specifinių junginių pavyzdžiai
Neflavonoidų junginiai Fenolinės rūgštys
Benzoinės rūgštys Galo r., protokatechetinė r., p-hidrobenzoinė r. Hidroksicinamoninės rūgštys Kumaro r., kofeino r., ferulinė r.
Hidrolizuojamieji taninai Pentagaloilgliukozė
Stilbenai Resveratrolis
Lignanai Matairezinolis, pinorezinolis, karikirezinolis ir
kt. Flavonoidiniai junginiai
Flavonoliai Kemferolis, kvercetinas, miricetinas
Flavonai Apigeninas, liuteolinas
Flavononai Naringeninas, hesperetinas
Flavanoliai Katechinai, galokatechinai
Antocianidinai Pelargonidinas, cianidinas, malvidinas
Kondensuoti taninai ar proantocianidinai Trimeriniai proantocianidinai, prodelfinidinai
Izoflavonai Genisteinas, gliciteinas, daidzeinas
(ciklooksigenazės (COX) ir lipoksigenazės (LOX)) bei mediatorių (leukotrienų (Lt) ir prostaglandinių (Pg)) aktyvumą [2]. Dėl minėtų antioksidantinio ir uždegimą slopinančių poveikių, polifenoliai turi teigiamą poveikį širdies ir kraujagyslių sistemai [2,20,29]. Taip pat, mokslinėje literatūroje yra aprašytas polifenolių priešvėžinis aktyvumas [2,20,29]. Yra manoma, kad šie junginiai slopina vėžinių ląstelių augimą bei jų transformaciją, navikų augimą, vėžinių ląstelių proliferaciją, angiogenezę, skatina vėžinių ląstelių apoptozę. Taip pat jie inhibuoja tirozinui specifinius fermentus: baltymų kinazes, topoizomerazę I ir topoizomerazę II. Dėl to vėžinių ląstelių augimas ir dalijimasis sulėtėja. Tačiau ne visi polifenoliniai junginiai turi vienodą poveikį vėžinėms ląstelėms. Nustatyta, kad stipriausiu antivėžiniu veikimu pasižymi kvercetino grupės flavonoliai. Be minėtų poveikių, mokslinėje literatūroje yra aprašomas ir antimikrobinis polifenolinių junginių veikimas. Tyrimų rezultatai parodė, jog šie junginiai bakterijų nesunaikina – jų poveikis labiau bakteriostatinis [2].
Suminis polifenolinių junginių kiekio nustatymas dabartinėse studijose dažniausiai atliekamas spektrofotometriniu metodu [30]. Taip pat gali būti taikomas kolorimetrinis metodas arba efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) [29].
1.3. Vaistinių melisų biologinis poveikis ir pritaikymas medicinos praktikoje
Vaistinių melisų sudėtyje yra daug veikliųjų junginių, kurie nulemia labai platų biologinį poveikį bei pritaikymą medicinoje. Labiausiai žinoma ir paplitusi vaistinių melisų indikacija yra nerimas bei nemiga, todėl vaistinės melisos dažnai būna raminamųjų arbatų ar kitų augalinių preparatų sudedamoji dalis [4,5,7,9,10,14,16-18,26,30,34,35,37,38,42]. Buvo atlikti tyrimai su žiurkėmis, kurių metu nustatyta, kad melisų vandeninė ar metanolinė ištrauka smegenyse esančią GABA transaminazę (GABA-T) veikia kaip inhibitorius nerimo, epilepsijos ir kitų neurologinių ligų terapijoje [10,18,38,39]. Identifikavus ir išskyrus veikliuosius junginius, nustatyta, kad didžiausią įtaką terapinio poveikio pasireiškimui turi RA bei triterpenininiai junginiai [18]. Fitocheminės analizės metu nustatyta, kad iš jų lyderiaujantį vaidmenį atlieka RA [10]. Kadangi vaistinės melisos vaikia raminančiai, jas vartojant patartina vengti alkoholio bei kitų raminamuoju poveikiu pasižyminčių vaistinių preparatų, pvz. lorazepamas, zolpidemas ir kt. [39].
kremu, kita dalis - placebu. Gydymas buvo pradėtas per 72 val. nuo simptomų pasireiškimo ir tęsiamas nuo 5 iki 10 dienų, tepant pažeistą vietą 2-4 kartus per dieną. Gydymas buvo įvertintas "labai gerai" 41 pacientui, gydomam melisų ekstrakto kremu ir tik 19 pacientų, gydomiem placebu (p=0.022). Kadangi vaistinės melisos pasižymi antivirusiniu poveikiu, kai kurie autoriai teigia, jog jos gali būti vartojamos užsikrėtus ŽIV-1. Vaistinių melisų preparatai inhibuoja ŽIV-1 atvirkštinę transkriptazę tyrimuose in vitro [40].
Yra atlikti moksliniai tyrimai, kurie įrodo, jog vaistinės melisos, dėl jų sudėtyje esančios RA, stabdo vėžinių ląstelių dalijimąsi [9]. Boehm K. et al. (2012) atliko tyrimą in vitro, kuriame analizavo aromaterapijos svarbą. Vienas iš tyrimų objektų - vaistinės melisos. Šių autorių teigimu, melisų priešvėžinis aktyvumas pasireiškia dėl eterinių aliejų. Gauti rezultatai parodė, jog melisų aliejus buvo labai efektyvus prieš vėžines ląsteles, todėl padaryta išvada, jog jis gali būti potenciali priemonė gydant vėžį. Šis poveikis aiškinamas tuo, jog vaistinės melisos veikia kaip antioksidantai. Tokį poveikį yra aprašę ir kiti autoriai, tačiau jų teigimu, melisos efektyvumą naviko gydyme lemia ne eteriniai aliejai, o RA [9,16,17,19,24,26-28,31,33,34,36,37].
Mokslinėje literatūroje yra duomenų, jog vaistinės melisos pasižymi antihistamininiu poveikiu, todėl gali būti naudojamos išoriškai, dedant susmulkintą žolę ant vabzdžių įkandimo ar kitų sudirgintų vietų [9,14,33,37].
Melisos pasižymi kraujagysles plečiančiu bei kraujospūdį mažinančiu poveikiu, todėl gali būti vartojamos esant švelniai hipertenzijos formai ar kaip profilaktikos priemonė [9,30,37]. Yra duomenų, jog melisų preparatai padeda esant širdies skausmui, permušimams ar kitiems širdies veiklos sutrikimams [4,9,14,24,26-28,37].
Vaistinės melisos gali būti vartojamos kaip prieštraukulinė, nuskausminanti priemonė, kuri šalina stiprų galvos skausmą bei galvos svaigimą, mažina ūžimą ausyse [9,14,24,34]. Daugelio autorių teigimu, melisos turėtų būti rekomenduojamos pacientams, sergantiems epilepsija ar migrena [9,16,17,24,27,28,30,37].
Remiantis moksline literatūra, kai kurių autorių teigimu, vaistinės melisos skatina prakaitavimą, todėl gali būti vartojamos karščiuojant. Kadangi veikia priešuždegimiškai, padeda esant reumatiniams ir neuralginiams skausmams [5,9,14,17,26,31,34,36,37,39]. Amina Bounihi et al. (2013) atliko tyrimą su žiurkėmis, kuriame naudojo vaistinių melisų eterinį aliejų 200 mg/kg bei 400 mg/kg doze ir indometaciną įprasta 10 mg/kg doze. Gauti rezultatai parodė, jog po 6 val. melisų eterinis aliejus pasižymėjo didesniu priešuždegiminiu poveikiu nei indometacinas. Uždegimo slopinimas buvo išreikštas procentais, o rezultatai - atitinkamai 61.76 proc., 70.58 proc. ir 52.94 proc. Maike Petersen, Monique S. J. autorių teigimu, melisų priešuždegiminis poveikis yra pagrįstas LOX ir COX slopinimu.
Atliekama daug tyrimų, norint įrodyti vaistinių melisų poveikį Alzheimerio ligos gydyme [7,9,10,14,26-28,34]. S. Akhondzadeh, M. Noroozian et al. (2003) autorių teigimu, toks poveikis egzistuoja dėl to, kad vaistinės melisos pasižymi acetilcholino (Ach) receptorių aktyvumu centrinėje nervų sistemoje (CNS). Nors daugelis autorių teigia, jog vaistinės melisos nesukelia šalutinių reakcijų, šių autorių tyrimo metu buvo pastebėta, kad vaistinės melisos vis dėlto gali sukelti mieguistumą ar sumišimą, taip pat pykinimą, vėmimą, viduriavimą, galvos skausmą, svaigimą bei dusulį. EMEA duomenimis, norint įrodyti vaistinių melisų poveikį gydant Alzheimerio ligą, buvo atliktas dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas atsitiktinis tyrimas su vaistinių melisų eteriniu alieju bei donepezilu – vienu iš pagrindinių cheminių vaistų, vartojamų Alzheimerio ligos gydyme. Eterinis aliejus buvo vartojamas išoriškai, dedant kompresus ant rankų. Tyrimų rezultatai parodė, jog melisų aromaterapija sukėlė pastebimą virpėjimo sumažėjimą lyginant su donepezilu ar placebu [39].
Analizuojant mokslinę literatūrą, randama duomenų, jog vaistinės melisos gali būti vartojamos esant virškinimo sutrikimams: gerina apetitą, skatina tulžies išsiskyrimą, slopina pykinimą bei vėmimą, mažina pilvo pūtimą [5,9,10,16,17,24,26,28,30,33,38,42]. EMEA duomenimis, vaistinių melisų sudėtyje esantys eteriniai aliejai tyrimuose in vivo, naudojant izoliuotas Gvinėjos kiaulių klubines bei triušių dvylikapirštes žarnas, pasižymėjo stipriu spazmolitiniu poveikiu [39].
Vaistinių melisų ištraukos yra rekomenduojamos pacientams, sergantiems cukriniu diabetu (CD), kadangi nustatyta, kad jos mažina gliukozės kiekį kraujyje. Poveikis gydant CD galimai pasireiškia dėl melisų sudėtyje esančio riboflavino, kuris veikia angliavandenių, riebalų bei baltymų apykaitą [5,26]. EMEA duomenimis, hipoglikeminis vaistinių melisų poveikis pasireiškia dėl jų sudėtyje esančio eterinio aliejaus. 2 tipo CD užkrėstos pelės buvo gydomos 6 savaites po 0.0015 mg/d eterinio aliejaus iš vaistinių melisų. Rezultatai parodė reikšmingą gliukozės kiekio kraujyje sumažėjimą, taip pat padidėjusią toleranciją gliukozei bei reikšmingą insulino kiekio serume padidėjimą lyginant su kontroline grupe. Yra tyrimų, įrodančių vaistinių melisų antilipideminį poveikį [39]. EMEA duomenimis, duodant vandeninio vaistinių melisų ekstrakto hiperlipideminėms žiurkėms 28 dienas po 2 g/kg buvo sumažintas bendras cholesterolio bei lipidų kiekis kraujyje [39].
Kai kurių autorių teigimu, melisų preparatai padeda esant skydliaukės hiperfunkcijai, inhibuodami tiroidus stimuliuojančio hormono (TSH) aktyvumą. Taip pat gali būti vartojami sergant Greivs'o liga [15,17,39,40].
1.4.
Vaistinių melisų preparatai, esantys Lietuvos rinkoje
Šiuo metu Lietuvos rinkoje su vaistinių melisų žaliava yra šios vaistinės formos:
1. Arbata. Bendrais atvejais rekomenduojama 1.5 – 4.5 g trintų lapų per dieną [39,41,42]. Melisų arbatos galima įsigyti ir grynos, ir mišiniuose su kitomis vaistažolėmis, pvz. arbata "Melisų žolė" bei sudėtinė arbata, pvz. "Neuro-3", kurios sudėtyje kartu su melisomis yra ir valerijonų šaknų, apynių spurgų bei pipirmėčių lapų [45]. Yra atlikti tyrimai, kuriuose nustatytas arbatos dozavimas konkrečiais atvejais, pvz. esant miego sutrikimams suaugusiems pacientams reikia išgerti 80-150 mg vandeniu užplikytų melisų lapų kartu su 160-320 mg valerijonų šaknų 3 kartus per dieną. Gydymo kursas - 1 mėnuo. Dozuojant 1-2 kartus per dieną mažiausiomis dozėmis miegas pagerėja ir vaikams [23].
2. Kapsulės. Tradicinis vaistinių melisų kapsulių dozavimas, jei nenurodyta kitaip, yra 300-500 mg, 3 kartus per dieną [39,41]. Kapsuliuotoje vaisto formoje, kaip ir arbatoje, vaistinės melisos gali būti vienos arba kartu su kitais vaistiniais augalais, pvz. ,,Persen forte", kuriame yra 17.5 mg melisų sausojo ekstrakto, ar net mikroelementais (pvz. magniu) - ,,Magnis 24", kuriame yra 100 mg melisų [45].
3. Ekstraktai - vaistinių melisų ekstraktai yra naudojami gaminant kapsuliuotas ar tabletuotas vaistinių melisų formas, tačiau galima rasti ir skysto ekstrakto pavidalu. Melisų sausasis ekstraktas randamas prieš tai minėtame preparate ,,Persen forte". Didesnės koncentracijos melisų ekstrakto randame ,,Vital nature top sleep herbal su melisų ekstraktu" preparate, kuriame vaistinių melisų yra 200mg, o rekomenduojama paros dozė - 1-2 tabletės per dieną [45]. Vartojant melisų ekstraktus skysta forma, jei nenurodyta kitaip, rekomenduojama paros dozė yra 2-4 ml tris kartus per dieną [39,41,42]. Ši dozuotė įrodyta moksliniais tyrimais, gydant Alzheimerio ligą. Tyrimuose naudota 60 lašelių standartizuoto melisų ekstrakto per dieną, paruošto naudojant 45 proc. etanolį, santykiu 1:1. Gydymas buvo tęsiamas 4 mėnesius, po kurių melisų ekstraktu gydomiems pacientams reikšmingai pagerėjo pažintinės funkcijos lyginant su placebo grupe [7,39]. Šiuo metu rinkoje galime rasti melisų ekstraktą, pagamintą santykiu 1:1, ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį.
4. Tinktūros - jei nenurodyta kitaip, rekomenduojama paros dozė yra 2-6 ml tris kartus per dieną [39,41,42]. Rinkoje egzistuoja melisų tinktūra, pagaminta santykiu 1:10, ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį.
6. Aliejus. Melisų aliejus yra vartojamas išoriškai, dažniausiai įvairioms vonioms ar kompresams. Tokių aliejų dozavimas būna nuo 2 iki 5 lašų [42].
7. Kremas - dažniausiai naudojamas 3 kartus per dieną, norint nuraminti paraudusią ar sudirgusią odą. Naudojant melisų kremą užsikrėtus Herpes labialis virusu, patariama jo tepti 2-4 kartus per dieną, tęsiant gydymą iki 14 dienų [41,42].
8. Sirupai. Melisų sirupas, kaip ir daugelis kitų sirupų dažniausiai skiriamas vaikams. Šiuo metu rinkoje galima rasti ,,Melisovit" sirupą, kurio dozuotė priklauso nuo vaiko amžiaus ir įprastai skiriama nuo 5 iki 10 ml 3 kartus per dieną [45].
1.5. Užpilai, nuovirai, tinktūros ir ekstraktai. Jų technologija bei analizės metodai
Galima išskirti šias augalinės kilmės skystų vaisto formų kategorijas [6,12,25]: 1. Užpilai;
2. Nuovirai; 3. Tinktūros; 4. Ekstraktai.
Vaistažolių arbatos (lot. Plantae ad ptisanam) - tai viena ar kelios vaistinės augalinės žaliavos, skirtos ruošti vandeninius preparatus - nuovirus (lot. Infusum), užpilus (lot. Decoctumu) ar maceratus. Ruošiamos prieš vartojimą. Vaistažolių arbatos, pagal Ph. Eu. (1997, 5.1.4 - 4 kategorija) gali būti ruošiamos naudojant verdantį ar neverdantį vandenį [6]. Gaminant augalines ištraukas karštuoju būdu, svarbi kaitinimo ir aušinimo trukmė. Užpilai kaitinami 15 min., aušinami - 45 min., nuovirai kaitinami 30 min., aušinami 10 min [12,43,44].
Tinktūros paprastai gaunamos naudojant 1 dalį augalinės žaliavos ir 10 ekstrakcinio tirpiklio arba 1 dalį augalinės žaliavos ir 5 dalis ekstrakcinio tirpiklio [6,12]. Pagamintos tinktūros būna skaidrios, tačiau laikymo metu gali susidaryti nedidelis kiekis nuosėdų, nepakeičiančių tinktūrų sudėties [6].
Ekstraktai (lot. Extracta) - tai kietos, skystos ar tirštos (tarpinės) konsistencijos preparatai, dažniausiai gaunami iš išdžiovintos (sausos) augalinės medžiagos [5,6]. Pagal tai, kiek skystos fazės yra pašalinama iš augalinės ištraukos ekstrakto gamybos metu, ekstraktai skirstomi į skystuosius (lot. Extracta fluida), tirštuosius (lot. Extracta spisa) ir sausuosius (lot. Extracta sicca) [5,12]. Taip pat ekstraktus galima klasifikuoti pagal panaudotą ekstrahentą: vandeniniai, etanoliniai, eteriniai ar aliejiniai ekstraktai [5].
Skystieji ekstraktai yra skysti preparatai, kurių viena masės ar tūrio dalis yra ekvivalentiška vienai sausos (išdžiovintos) žaliavos daliai. Jeigu reikia, šių preparatų sudėtis tikslinama, kad atitiktų tirpiklio kiekio, sudedamųjų dalių ar sausų liekanų reikalavimus. Skystieji ekstraktai gali būti gaminami maceracijos, perkoliacijos bei reperkoliacijos metodais [25]. Dažniausiai taikomas perkoliacijos metodas [12]. Perkoliacija – tai procesas, kurio metu žaliava yra užpilama nedideliu kiekiu pasirinkto tirpiklio iki vienodo sudrėkinimo. Taip paruošta žaliava paliekama 15 min., po to perkeliama į perkoliatorių. Tada žaliava prisotinama likusiu tirpikliu. Kada tirpiklis pradeda lašėti pro perkoliatorių, jis yra uždaromas. Žaliava paliekama maceruotis 24 valandoms arba ilgesniam laikui. Gautas ekstraktas yra renkamas, pridedant reikiamą kiekį tirpiklio taip, kad ekstrahuojama žaliava visada būtų prisotinta ekstrahentu. Jei surinkto ekstrakto nepakanka, perkoliatas toliau yra plaunamas pasirinktu tirpikliu ir surinkta ekstrakto porcija yra sumaišoma su prieš tai gauto ekstrakto dalimi [12]. Dar vienas skystų ekstraktų gamybos metodas yra ištirpinti tirštą ar sausą ekstraktą reikiamame tirpiklyje, ir jei reikia, perfiltruoti.
Ekstraktui pastovėjus, leidžiamas nedidelis nuosėdų kiekis, jeigu po to jo sudėtis labai nepasikeičia [6].
Skystieji ekstraktai gali turėti reikalingų antimikrobinių konservantų [6].
Ir tinktūros, ir ekstraktai yra vertinami pagal vienodus kriterijus. Ph. Eu. nurodyti šie kokybės tyrimai:
1. Santykinis tankis (Ph. Eur. 1997, 2.2.5). Pagal šį rodiklį tinktūros/skystieji ekstraktai turi atitikti monografijoje nurodytas normas.
2. Etanolio kiekis (Ph. Eur. 1997, 2.9.10). Etanoliniams skystiems ekstraktams/tinktūroms nustatomas etanolio kiekis turi atitikti nurodytą.
4. Sausos liekanos. Konkrečiu taikytinu atveju tinktūra/skystasis ekstraktas turi atitikti monografijoje nurodytas normas. Rezultatai pateikiami masės procentais arba gramais/litre.
Laikymas. Laikoma sandariai uždarytame inde nuo šviesos apsaugotoje vietoje.
Analizės metodai. Ekstraktų bei tinktūrų analizei gali būti naudojami įvairūs fito-cheminiai analizės metodai, pvz. efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), spektrofotometrija, masių spektroskopija (MS) ir kt.
Eksperimentinių tyrimų metu planuojama tirti melisų etanolines ir vandenines ištraukas, vertinant sauso likučio kiekį gravimetriniu metodu bei suminį polifenolinių junginių kiekį pagal KRE spektrofotometriniu metodu.
1.6. Ekstrahentų, naudojamų augalinių ištraukų gamyboje, charakteristikos
Tik vartojant tinkamą ekstrahentą galima pagaminti kokybišką vaistą. Ekstrahentas parenkamas atsižvelgiant į šias savybes [1]:
1. Yra atrankus (selektyvus), t.y. tirpina tik tas medžiagas, kurias reikia ekstrahuoti, ir netirpina kitų, nereikalingų;
2. Chemiškai indiferentiškas ekstrahuojamoms medžiagoms; 3. Stabdo mikrofloros veikimą ekstrakte;
4. Farmakologiškai indiferentiškas; 5. Lakus, išgarinus nepalieka kvapo;
6. Nedegus, nesudaro su oru sprogstamųjų medžiagų; 7. Pigus.
Vanduo - jis pasižymi daugeliu anksčiau išvardintų savybių ir dažniausiai vartojamas vienas ar mišiniuose su organiniais tirpikliais (pvz. etanoliu). Yra kelių švarumo kategorijų vanduo: išgrynintasis ir distiliuotas, nemineralizuotas ir geriamasis. Pastarasis turi atitikti higienos normas [1]. Modeliuojant farmacines vaistų formas (išskyrus injekcines), naudojamas išgrynintas arba distiliuotas vanduo. Jis turi atitikti Ph. Eu. 2000:0008 nurodytus reikalavimus [6]. Yra nustatyta, jog išgrynintojo vandens sausos liekanos negali viršyti 0.001 proc. (1 mg priemaišų 100 ml vandens). Pagrindiniai metodai, gaminant išgrynintą vandenį yra distiliacija, jonų mainų ar atvirkštinės osmosės [12,25]. Visgi, vandeniniai ekstraktai lieka nepatvarūs laikymo metu. Juose atsiranda mikroorganizmų, todėl jie greitai sugenda [1]. Tačiau vanduo vis tiek išlieka dažniausiai naudojamu tirpikliu pasaulyje [12,25].
pasirenkamas modeliuojant farmacinius preparatus, vartojamus per os [12,25]. Etanolis turi atitikti Ph. Eu. 01/2002:1317 straipsnio reikalavimus [6]. Nors šis ekstrahentas turi daug neigiamų savybių (farmakologinis neindiferentiškumas, žema užsiliepsnojimo temperatūra ir kt.), tačiau jas kompensuoja ir dažną jo pasirinkimą nulemia atrankumas ir atsparumas mikroorganizmams [1,25]. Platų etanolio pritaikymą taip pat lemia jo gebėjimas maišytis su vandeniu bei ištirpinti daugelį vandenyje netirpių medžiagų [25]. Šalia minėtų etanolio neigiamų savybių, jo pritaikymas yra ribojamas dėl galimo toksinio poveikio modeliuojant vaistų formas, skirtas vaikams. Maisto ir vaistų administracija įvertino ir nustatė rekomenduotinas etanolio koncentracijas įvairių amžių vaikams: iki 6 metų – 0.5 proc., 6-12 metų – 5 proc. , 12 metų – 10 proc. [25].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimuose naudotos medžiagos
1) Vaistinių melisų išdžiovinti lapai (UAB ,,Acorus calamus", 50 g, Lietuva); 2) 96 proc. etilo alkoholis (UAB ,,Stumbras", Lietuva);
3) Distiliuotas vanduo;
4) Na2CO3 (Merck KGaA, Vokietija);
5) Folin-Ciocalteu’s reagentas (Folin-Ciocalteu’s phenol reagent) (Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH, Vokietija).
2.2. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų technologija
Melisų tinktūros buvo gaminamos klasikinės maceracijos metodu, kai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:5. Technologinės maceracijos metodo stadijos pateiktos 3 lentelėje [1]:
3 lentelė. Technologinės maceracijos metodo stadijos
T in k tūrų te ch n ologi jos sc h em a
1. Žaliavos į maceratorių dėjimas, ekstrahento pripylimas 2. Maceravimas (5-7 paras)
3. Ištraukos nupylimas ir slėgimas
4. Kartotinis ekstrahento pripylimas ir slėgimas 5. Sujungtų ištraukų nusistovėjimas (5-7 paras) 6. Dekantavimas ir filtravimas
7. Analizė ir standartizavimas
Ekstrahento gamyba
atitikti Ph. Eu. 01/2002:1317 straipsnio reikalavimus [5]. Reikalingas 96 proc. koncentracijos etanolio kiekis apskaičiuotas, naudojantis proporcija:
96 t. d. – 100 t. d.
A t. d. – x t. d. 96 proc. etanolio x = 100*A /96; kur:
A – norima etanolio koncentracija; x – reikalingas 96 proc. etanolio kiekis.
Vandens kiekis kiekvienai etanolio koncentracijai yra lygus 100 ml – x ml 96 proc. etanolio arba tiksliau - vandens iki 100 ml.
Melisų tinktūrų technologija klasikinės maceracijos metodu
Tinktūros gaminamos maceracijos metodu, santykiu 1:5 [5]. Gaminama 25 ml melisų tinktūros. Tinktūroms gaminti imama 5 g išdžiovintos melisų žaliavos, kuri susmulkinama iki reikiamo dydžio dalelių. Žaliava užpilama 40 ml 40 proc., 50 proc., 60 proc. ir 70 proc. etanoliu, kurio kiekis apskaičiuojamas atsižvelgiant į sugerties koeficientą: c = V + a*k; kur
a – žaliavos kiekis (g);
V – norimas pagaminti tinktūros kiekis (ml); c – bendras etanolio kiekis (ml);
k – minkštųjų augalo dalių sugerties koeficientas (šiuo atveju - 3).
Ekstrahavimosi metu pagamintos tinktūros buvo laikomos uždarame inde, tamsioje, vėsioje vietoje septynias dienas, kartas nuo karto pamaišant.
Filtravimas
Po septynių dienų tinktūros filtruojamos per filtravimo popierių.
2.3. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų technologija
Vaistinių melisų skystieji ekstraktai buvo gaminami klasikinės maceracijos bei perkoliacijos metodais, kai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:1. Ekstraktų technologijos schema pateikta 4 lentelėje [1].
4 lentelė. Ekstraktų technologijos schema
E k str ak tų te ch n ologi jos sc h em a 1. Ektrahento gamyba 2. Žaliavos brinkinimas 3. Perkoliavimas 4. Koncentravimas 5. Koncentrato filtravimas 6. Ženklinimas 7. Kokybės kontrolė Ekstrahento gamyba
Technologijai buvo naudotas 96 proc. koncentracijos etanolis, iš kurio pagaminta po 100 ml 40 proc., 50 proc., 60 proc. ir 70 proc. koncentracijos etanolio. Etanolis turi atitikti Ph. Eu. 01/2002:1317 straipsnio reikalavimus [5]. Reikalingas 96 proc. koncentracijos etanolio kiekis apskaičiuotas pagal proporciją:
96 t. d. – 100 t. d.
A t. d. – x t. d. 96 proc. etanolio x = 100*A /96; kur:
A – norima etanolio koncentracija; x – reikalingas 96 proc. etanolio kiekis.
Vandens kiekis kiekvienai etanolio koncentracijai yra lygus 100 ml – x ml 96 proc. etanolio arba tiksliau - vandens iki 100 ml.
Melisų ekstraktų technologija klasikinės maceracijos metodu
Melisų ekstraktų technologija perkoliacijos metodu
Melisų ekstraktai perkoliacijos metodu buvo gaminami pagal Ph. Eu. nurodytą metodiką [5]. Gaminama 25 ml ekstrakto, santykiu 1:1. Ekstrahuojama medžiaga susmulkinama iki reikiamo dydžio dalelių, tada sumaišoma su nedideliu kiekiu technologijai pasirinkto ekstrahento (etanolio) ir paliekama kurį laiką pastovėti (apie 15 min). Po to perkeliama į perkoliatorių ir leidžiama lėtai filtruotis užtikrinant, kad ekstrahuojama medžiaga visą laiką būtų padengta tirpikliu. Kada tirpiklis pradeda lašėti pro perkoliatorių, jis yra uždaromas. Žaliava paliekama maceruotis 7 dienom. Po 7 dienų gautas ekstraktas yra surenkamas, pridedant reikiamą kiekį tirpiklio taip, kad ekstrahuojama žaliava visada būtų prisotinta ekstrahentu [12].
Iš viso pagaminti 4 ekstraktai po 25 ml, naudojant 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc. koncentracijos etanolį, taikant klasikinės maceracijos metodą bei 4 ekstraktai po 25 ml, naudojant 40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc. koncentracijos etanolį, taikant perkoliacijos metodą.
2.4.
Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ištraukų gamyba
ekstrahuojant ultragarsu
Eksperimentinis tyrimas atliekamas tam, kad būtų galima įvertinti, kaip fizikinis faktorius
(ultragarsas) įtakoja vaistinių medžiagų išsiskyrimą iš melisų žaliavos. Šiuo metodu gaminamos melisų tinktūros (1:5) bei melisų ekstraktai (1:1). Žaliavos imama tiek pat, kiek gaminant anksčiau aprašytus - tinktūras bei ekstraktus - maceracijos ar perkoliacijos metodais. Žaliava stikliniuose cilindruose užpilama keturiomis skirtingomis etanolio koncentracijomis (40 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc.), tada uždedama speciali plėvelė, apsauganti tinktūras bei ekstraktus nuo išgaravimo. Taip paruošta žaliava dedama į ultragarsinę vonelę (Bandelin Sonorex Digitec ultragarso vonelė (DT 156, Bandelin electronic GmbH & Co. KG, Berlynas, Vokietija)), 20, 30 ir 40 min, esant 550C temperatūrai. Gauti ekstraktai ir tinktūros filtruojami ir paliekami tolimesnei analizei.
2.5.
Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) arbatos technologija
imama 4 g, o ekstrahento (vandens) - 32 ml (vandens kiekis apskaičiuotas pagal žaliavos sugerties koeficientą). Melisų žaliava apipilama verdančiu vandeniu ir uždengus laikoma apie 15-20 min. Tada filtruojama pro filtravimo popierių [6].
2.6.
Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) etanolinių ir vandeninių ištraukų
analizės metodai
2.6.1. Sauso likučio kiekio nustatymas
Tinktūrose, ekstraktuose bei vandeninėse ištraukose esantis veikliųjų junginių sausasis likutis matuotas drėgnomačiu (MLS 50-3HA160). Imta 3 kartus po 2 ml kiekvienos etanolinės ir vandeninės ištraukos. Kaitinama 1050
C temperatūroje 30 min [Ph. Eur. 2.8.16]. Iš gautų rezultatų vedamas aritmetinis vidurkis.
2.6.2. Suminio polifenolinių junginių kiekio nustatymas pagal p-kumaro rūgšties
ekvivalentą spektrofotometriniu metodu
Suminis polifenolinių junginių kiekis pagal p-kumaro rūgšties ekvivalentą (KRE) ekstraktuose ir tinktūrose bei vandeninėje ištraukoje buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu, atliekant reakciją pagal Folin-Ciocalteu's metodą. Šį metodą suminiam polifenolinių junginių kiekio nustatymui yra aprašę ir kiti autoriai [39,43]. Tyrimui buvo naudojamas Agilent 8453 UV-Vis spektrofotometrą (,,Agilent Technologies, Inc." Santa Clara, JAV). 25 µl tiriamojo tirpalo matavimo kolbutėje buvo sumaišomi su 3 ml išgrynintojo vandens ir 1 ml Folin-Ciocalteu's fenolinio reagento. Po to buvo pridedama 1.5 ml 20 proc. Na2CO3 tirpalo. Mišinys buvo skiedžiamas išgrynintuoju
2.6.3. Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų antimikrobinio aktyvumo
vertinimas
3. REZULTATAI
3.1.
Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) tinktūrų kokybės vertinimas
Kad įvertinti ekstrahento įtaką vaistinių medžiagų išsiskyrimui iš vaistinių melisų žaliavos pagamintų tinktūrų, kaip tirpikliu pasirinktas 40, 50, 60 ir 70 proc. etanolis.
3.1.1. Ekstrahento įtaka vaistinių melisų tinktūrų (1:5) kokybei
Vaistinių melisų tinktūrų kokybė vertinta nustatant veikliųjų junginių kiekį. Svarbu įvertinti suminį polifenolinių junginių išsiskyrimą pagal 2.6.2 metodiką. Rezultatai pateikiami 5 lentelėje.
5 lentelė. Etanolio koncentracijos įtaka suminiam polifenolinių junginių kiekiui vaistinių melisų tinktūrose
Etanolio koncentracija, % 40% 50% 60% 70%
Suminis polifenolinių junginių kiekis pagal KRE (mg/ml)
11.41 ±0.87 12.93 ±0.76 8.25 ±0.32 6.98 ±0.36
Didžiausias polifenolinių junginių kiekis, tiriant vaistinių melisų tinktūras, nustatytas naudojant 50 proc. etanolį. Naudojant 40 proc. etanolį gautas suminis polifenolinių junginių kiekis buvo panašus, taigi statistiškai reikšmingas skirtumas tarp šių dviejų etanolio koncentracijų nebuvo nustatytas (1 lentelė). Naudojant 60 ir 70 proc. etanolį, išsiskyręs polifenolinių junginių kiekis buvo statistiškai reikšmingai mažesnis (5 lentelė).
6 lentelė. Etanolio koncentracijos įtaka sauso likučio kiekiui vaistinių melisų tinktūrose Etanolio koncentracija, % 40% 50% 60% 70% Sausas likutis, % 14.36 ±0.95 15.42 ±0.91 4.59 ±0.53 3.21±0.39
Mažiausias sauso likučio kiekis melisų tinktūrose nustatytas, kai ekstrahentu naudojamas 70 proc. etanolis. Kai ekstrahentu pasirenkamas 60 proc. etanolis, sauso likučio reikšmė šiek tiek padidėja. Tačiau statistiškai reikšmingas sauso likučio kiekio padidėjimas melisų tinktūrose nustatytas, kai ekstrahentas yra 50 proc. ir 40 proc. etanolis (6 lentelė).
Taigi, įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, jog tinkamiausias ekstrahentas melisų tinktūroms yra 40 arba 50 proc. etanolis.
3.1.2. Ekstrahavimo metodo įtaka melisų tinktūrų (1:5) kokybei
Eksperimentiniams tyrimams atlikti pasirinktas klasikinės maceracijos metodas (2.2) ir augalinės žaliavos ekstrahavimas ultragarsu (2.4). Aktualu įvertinti, kaip fizikinis faktorius daro įtaką veikliųjų medžiagų išsiskyrimui iš melisų žaliavos. Tikslinga šį faktorių lyginti su klasikiniu metodu (maceracija), kurios metu žaliava ekstrahuojama nenaudojant nei fizikinių, nei cheminių faktorių. Panašų tyrimą atliko Ince A. E. et al. (2013). Autoriai ištyrė ir aprašė technologinio metodo įtaką suminio polifenolinių junginių išsiskyrimui iš vaistinių melisų žaliavos. Tyrime buvo studijuojami keturi skirtingi technologiniai metodai, tarp kurių buvo ir klasikinė maceracija bei ekstrahavimas ultragarsu [21].
3.1.2.1. Klasikinės maceracijos metodo įtaka melisų tinktūrų kokybei
pasirinktas suminio polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekio nustatymas. Gauti rezultatai pateikiami 1 ir 2 paveiksluose.
1 pav. Suminis polifenolinių junginių kiekis, gautas taikant klasikinės maceracijos metodą
Gaminant melisų tinktūras maceracijos būdu, didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis (11.67±0.76 mg/ml) išsiskyrė naudojant 50 proc. etanolį. Tačiau ekstrahavimui panaudojus 40 proc. etanolį statistiškai reikšmingo skirtumo nepastebėta. Mažiausias suminis polifenolinių junginių kiekis (7.41±0.24 mg/ml), gaminant tinktūras klasikinės maceracijos metodu, nustatytas ekstrahentu naudojant 70 proc. etanolį (1 pav.).
2 pav. Sauso likučio kiekis, gautas taikant klasikinės maceracijos metodą
Tinktūras gaminant klasikinės maceracijos metodu, didžiausias sauso likučio kiekis gautas ekstrahentu naudojant 50 proc. etanolį (13.79±0.36 proc.). Tačiau panaudojus 40 proc. etanolį, statistiškai reikšmingo skirtumo nepastebėta (14.09±0.29 proc.). Ekstrahentu naudojant 60 proc. ir 70 proc. etanolį, sauso likučio kiekis reikšmingai sumažėjo (2 pav).
3.1.2.2. Ekstrahavimo ultragarsu įtaka melisų tinktūrų kokybei
Atlikus eksperimentinius tyrimus su vaistinių melisų tinktūromis, pagamintomis klasikinės maceracijos metodu ir įvertinus gautus rezultatus, tikslinga tyrimą pakartoti melisų ištraukas ekstrahuojant ultragarsu. Kad būtų galima objektyviai palyginti gautus rezultatus, tyrimui pasirenkami tie patys kokybės rodikliai, t.y. suminio polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekiai. Tyrimui ultragarsu pasirinkti skirtingi laiko intervalai - 20, 30 ir 40 min.
Gauti rezultatai pateikiami 3 ir 4 pav.
3 pav. Suminis polifenolinių junginių kiekis, gautas ekstrahuojant ultragarsu
Įvertinus gautus rezultatus, pastebime tendenciją, jog didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis yra gaunamas ekstrahentu pasirinkus 40 etanolį. Tačiau panaudojus 50 proc. etanolį, statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta. Matome, jog veikliųjų junginių išsiskyrimui įtakos turi ir ekstrakcijos laikas. Daugiausiai polifenolinių junginių nustatyta, kai ekstrakcijos ultragarsu trukmė - 30 min. Kai ekstrahentas 40 proc. etanolis - polifenolinių junginių kiekis yra 16.52±0.51 mg/ml, kai 50 proc. - 16.04±0.48 mg/ml. Mažiausiai veikliųjų junginių su visomis ekstrahento koncentracijomis gaunama, kai ekstrakcijos trukmė 20 min. Vertinant gautus rezultatus po 30 ir po 40 min. statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo (3 pav.).
Atikus eksperimentinį tyrimą, tikslinga gautus rezultatus palyginti su rezultatais, kuriuos yra aprašę kiti autoriai. Ince A. E et al. (2013) autorių tyrime buvo nustatinėjamas suminis polifenolinių junginių kiekis, gautas naudojant 50 ir 80 proc. etanolį bei taikant skirtingus technologinius metodus. Vienas iš metodų buvo ekstrahavimas ultragarsu, mėginius analizuojant po 5, 10, 20 ir 30 min. Buvo padaryta išvada, jog tinkamesnis ekstrahentas yra žemesnės koncentracijos etanolis, t.y. 50 proc., o
ekstrakcijos trukmė – 30 min. Autorių teigimu, naudojant aukštos koncentracijos etanolį, mažesnis veikliųjų junginių kiekis gaunamas dėl galimo jų suirimo. Taip pat buvo lyginami maceracijos ir ekstrahavimo ultragarsu metodai. Kaip tinkamesnis metodas melisų tinktūrų gamyboje pasirinktas ekstrahavimas ultragarsas.
Toliau, atliekant eksperimentinius tyrimus, vertinamas sauso likučio kiekis.
4 pav. Sauso likučio kiekis, gautas ekstrahuojant ultragarsu
Pagal gautus rezultatus pastebime, jog vertinant sauso likučio kiekį, tinkamiausias ekstrahentas visais laiko intervalais yra 50 proc. etanolis. Visgi, didžiausias sauso likučio kiekis nustatomas, kai ekstrakcijos trukmė - 30 min. Nors, vertinant statistiškai, su visomis ekstrahento koncentracijomis reikšmingo skirtumo tarp 30 ir 40 min. nenustatyta. Statistiškai reikšmingas skirtumas pastebimas tik tarp skirtingų etanolio koncentracijų, bei vykdant ekstrakciją 20 min (4 pav.).
3.1.2.3. Vaistinių melisų tinktūrų gamybos metodų palyginamieji tyrimai
Taigi, įvertinus gautus rezultatus pagal polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekius ir padarius išvadą, jog tinkamiausias ekstrahentas yra 40 ir 50 proc. etanolis bei tinkamiausia ekstrahavimo ultragarsu trukmė - 30 min, galima atlikti kokybišką ekstrahavimo metodo įtakos melisų tinktūrų kokybei vertinimą (5 ir 6 pav.).
5 pav. Ekstrahavimo metodo įtaka suminiam polifenolinių junginių kiekiui melisų tinktūrose
Taigi, iš 5 grafiko galima matyti, jog lyginant klasikinės maceracijos metodą su ekstrakcija ultragarsu, tarp gautų rezultatų pastebimas statistiškai reikšmingas skirtumas. Polifenolinių junginių kiekis, melisų tinktūrų technologijai panaudojus ultragarsą yra ženkliai didesnis nei gaminant klasikinės maceracijos metodu. Tarp skirtingų ekstrahento koncentracijų statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo, tačiau didesnis polifenolinių junginių kiekis ekstrahuojant ultragarsu gaunamas, kai ekstrahentas 40 proc. etanolis (16.14±0.32 mg/ml) (5 pav.).
6 pav. Ekstrahavimo metodo įtaka sauso likučio kiekiui melisų tinktūrose
Apžvelgus gautus rezultatus lyginant ekstrahavimo metodo įtaką pagal sausą likutį, didesnis jo kiekis, kaip ir tiriant polifenolinius junginius, nustatomas ekstrahuojant ultragarsu. Tarp skirtingų etanolio koncentracijų statistiškai reikšmingo skirtumo nepastebėta. Kai etanolio koncentracija 40 proc., sausas likutis lygus 16.32±0.22 proc, o kai 50 proc. - 17.04±0.49 proc. (6 pav.).
Taigi, atlikus išsamų vaistinių melisų tinktūrų tyrimą, galima daryti išvadą, jog tinkamiausias ekstrahentas yra 40 arba 50 proc. etanolis, o geriausias technologinis metodas - ekstrahavimas ultragarsu, kai ekstrakcijos trukmė 30 min.
3.2.
Vaistinių melisų (lot. Melissa officinalis) ekstraktų kokybės vertinimas
Kad įvertinti ekstrahento įtaką vaistinių medžiagų išsiskyrimui iš melisų žaliavos pagamintų ekstraktų, kaip tirpiklis pasirinktas skirtingų koncentracijų etanolis. Tai vienas iš dažniausiai naudojamų ekstrahentų skystųjų ekstraktų gamyboje [7]. Yra pakankamai mokslinių tyrimų duomenų, jog ekstrahentas daro įtaką veikliųjų medžiagų išekstrahuojamam kiekiui iš augalinės žaliavos, todėl aktualu ištirti ir palyginti vaistinių melisų skystųjų ekstraktų kokybę, gamyboje panaudojant skirtingų koncentracijų etanolio tirpalus. Vieną iš tokių tyrimų yra atlikę Angelov G. et al (2007). Autoriai analizavo įvairių etanolio koncentracijų įtaką sauso likučio kiekiui melisų tinktūrose bei ekstraktuose.
3.2.1 Ekstrahento įtaka melisų ekstraktų (1:1) kokybei
Skystieji ekstrakati gaminti naudojant 40, 50, 60 ir 70 proc. koncentracijos etanolius. Kaip ir
melisų tinktūrų, taip ir ekstraktų kokybei įvertinti būtina nustatyti suminį polifenolinių junginių kiekį bei įvertinti sausą likutį. Rezultatai pateikti 7 ir 8 lentelėje.7 lentelė. Etanolio koncentracijos įtaka suminiam polifenolinių junginių kiekiui vaistinių melisų ekstraktuose
Etanolio koncentracija, % 40% 50% 60% 70%
Suminis polifenolinių junginių kiekis pagal KRE (mg/ml) 11.84 ±0.71 10.31 ±0.48 8.32 ±0.17 7.83 ±0.11
Didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis, tiriant melisų ekstraktus, buvo nustatytas ekstrahentu naudojant mažiausios koncentracijos, t.y. 40 proc. etanolį. Ekstrahentu naudojant didžiausios koncentracijos etanolį, t.y. 70 proc., priešingai, buvo gautas mažiausias suminis polifenolinių junginių kiekis (7 lentelė).
8 lentelė. Etanolio koncentracijos įtaka sauso likučio kiekiui melisų ekstraktuose Etanolio koncentracija, % 40% 50% 60% 70% Sausas likutis, % 8.24 ±0.36 7.86 ±0.43 5.94 ±0.49 5.82 ±0.24
Nustačius sausą likutį keturiuose, skirtingų koncentracijų melisų ekstraktuose, buvo pastebėta, jog tinkamiausias ekstrahentas yra 40 proc. etanolis. Tačiau naudojant 50 proc. etanolį, statistiškai reikšmingo skirtumo tarp gautų rezultatų nebuvo. Vertinant 60 ir 70 proc. etanolio koncentracijų ekstraktus, gautas sauso likučio kiekis buvo statistiškai reikšmingai mažesnis (8 lentelė).
Angelov G. et al. (2007) atliktame tyrime buvo nustatyta, jog vertinant vaistinių melisų ekstraktų kokybę pagal sausą likutį, optimaliausias ekstrahentas yra 50 proc. etanolis. Taigi, atlikus eksperimentinius tyrimus matome, jog mūsų gauti rezultatai atitiko užsienio autorių padarytas išvadas. Angelov et. al. autorių teigimu, mažesnis sauso likučio kiekis labiau koncentruotose ištraukose gaunamas todėl, kad padidėja kitų medžiagų (chlorofilo ir kt.) tirpumas didesnės koncentracijos etanolyje.
3.2.2. Ekstrahavimo metodo įtaka melisų ekstraktų (1:1) kokybei
Eksperimentiniams tyrimams atlikti, kaip ir tinktūrų technologijai, pasirinktas klasikinės maceracijos metodas (2.2) bei augalinės žaliavos ekstrahavimas panaudojant ultragarsą (2.4). Ekstraktų technologijai papildomai buvo taikytas perkoliacijos metodas (2.3). Todėl aktualu įvertinti, kaip pakinta vaistinių melisų ištraukų kokybė gaminant jas skirtingais metodais, kartu parenkant tinkamiausią technologiją.
3.2.2.1. Klasikinės maceracijos metodo įtaka melisų ekstraktų kokybei
7 pav. Suminio polifenolinių junginių kiekis, gautas taikant klasikinės maceracijos metodą
Gauti rezultatai parodė, jog didžiausias polifenolinių junginių kiekis nustatytas, kai ekstrahentu pasirinktas 40 proc. etanolis (11.2±0.38 mg/ml). Tačiau, lyginant rezultatus su kitomis ekstrahentų koncentracijomis pastebėta, jog naudojant 50 proc. etanolį statistiškai reikšmingo skirtumo nepastebėta - suminis polifenolinių junginių kiekis yra 10.81±0.22 mg/ml. Naudojant 60 ir 70 proc. etanolį gauti rezultatai buvo pastebimai mažesni (7 pav.).
Vėliau, vertintas ir sauso likučio kiekis. Tyrimo rezultatai pateikiami 8 pav.
8 pav. Sauso likučio kiekis, gautas taikant klasikinės maceracijos metodą
Įvertinus rezultatus, gautus tiriant sausą likutį, pastebima, jog didžiausias jo kiekis nustatomas, kai ekstrahentas yra 40 proc. etanolis (7.61±0.11 proc.). Statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo ir kai ekstrahentas 50 proc. etanolis. Su kitomis ekstrahento koncentracijomis sauso likučio kiekis buvo reikšmingai mažesnis (8 pav.).
3.2.2.2. Perkoliacijos metodo įtaka melisų ekstraktų kokybei
Toliau vykdant eksperimentinius tyrimus, melisų ekstraktų technologijai pasirinktas perkoliacijos metodas. Gauti rezultatai pateikiami 9 pav.
9 pav. Suminio polifenolinių junginių kiekis, gautas taikant perkoliacijos metodą
Didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis, gaminant skystuosius ekstraktus perkoliacijos metodu, gaunamas ekstrahentu pasirinkus 50 proc. etanolį (13.26±0.77 mg/ml). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp gautų rezultatų nepastebėta, kai ekstrahentas 40 proc. etanolis (12.36±0.81 mg/ml). Pritaikius perkoliacijos metodą skystųjų ekstraktų gamybai pastebime, jog lyginant su klasikinės maceracijos metodu, pastebimai didesnis veikliųjų junginių kiekis gaunamas ekstrahavimui pasirinkus 60 proc. etanolį (11.87±0.43 mg/ml). Ir tik naudojant 70 proc. etanolį, gaminant šiuo metodu, nustatytas statistiškai reikšmingai mažesnis suminis polifenolinių junginių kiekis (9 pav.).
Toliau vertinama perkoliacijos metodo įtaka sauso likučio kiekiui melisų skystuosiuose ekstraktuose. Gauti rezultatai pateikiami 10 pav.
10 pav. Sauso likučio kiekis, gautas taikant perkoliacijos metodą
Įvertinus sausą likutį, pastebima, jog kaip ir vertinant polifenolinius junginius, tinkamiausias ekstrahentas yra 40 arba 50 proc. etanolis. Kai 40 proc. - sauso likučio reikšmė lygi 10.49±0.38 proc., kai 50 proc. - 9.59±0.21 proc. Taigi statistiškai reikšmingo skirtumo nėra (10 pav.).
3.2.2.3. Ekstrahavimo ultragarsu įtaka melisų ekstraktų kokybei
Kaip ir gaminant melisų tinktūras, ekstrakcijai ultragarsu pasirinkti trys skirtingi laiko intervalai - 20, 30 ir 40 min. Praėjus atitinkamam laikui, imami mėginiai ir tiriamas suminis polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekis. Rezultatai pateikiami 11 ir 12 pav.
11 pav. Suminio polifenolinių junginių kiekis, gautas ekstrahuojant ultragarsu
Gauti rezultatai parodė, jog tinkamiausias laikas ekstrahuojant ištraukas ultragarsu yra 30 min. Nors statistiškai reikšmingo skirtumo tarp 30 ir 40 min. nepastebėta, vertėtų atkreipti dėmesį, jog visgi,
didžiausias suminis polifenolinių junginių kiekis nustatytas, kai ekstrakcija vyksta 30 min ir kai ekstrahentas 40 ar 50 proc. etanolis (11 pav).
12 pav. Sauso likučio kiekis, gautas ekstrahuojant ultragarsu
Gauti rezultatai dar kartą įrodo, jog norint pagaminti aukštos kokybės skystuosius melisų ekstraktus, tinkamiausias ekstrahentas yra 40 ar 50 proc. etanolis, o ekstrakcijos ultragarsu trukmė - 30 min. (12 pav.).
3.2.2.4. Vaistinių melisų ekstraktų gamybos metodų palyginamieji tyrimai
Atlikus visus eksperimentinius tyrimus ir įvertinus gautus rezultatus pagal tirtus kriterijus, galima daryti išvadą, jog tinkamiausias ekstrahentas melisų ekstraktų gamyboje yra 40, 50 ir 60 proc. etanolis. Priešingai nei vaistinių melisų tinktūrose, ekstrahuojant 60 proc. etanoliu, veikliųjų junginių išsiskiria statistiškai reikšmingai daugiau, todėl galima daryti išvadą, jog ekstraktų technologijai taikytas pekoliacijos metodas įtakoja didesnį veikliųjų junginių išsiskyrimą iš 60 proc. melisų ekstraktų. Tolimesniems tyrimas naudojamos šios trys etanolio koncentracijos.
Taip pat nustatyta, jog tinkamiausia ekstrahavimo ultragarsu trukmė - 30 min. Pagal gautus rezultatus, galima atlikti vaistinių melisų ekstraktų technologijai taikomų metodų palyginimą (13 pav.).
13 pav. Ekstrahavimo metodo įtaka suminio polifenolinių junginių kiekiui melisų ekstraktuose
Vertinant skirtingus technologinius metodus pagal suminį polifenolinių junginių kiekį pastebima, jog geriausias metodas yra ekstrakcija ultragarsu. Skirtumas tarp klasikinės maceracijos ir perkoliacijos metodų nėra didelis, tačiau naudojant perkoliaciją, polifenolinių junginių išsiskiria daugiau. Tinkamiausias ekstrahentas su visais gamybos metodais yra 40 ir 50 proc. etanolis. Tuo tarpu naudojant 60 proc. etanolį statistiškai reikšmingo skirtumo, lyginant su kitomis ekstrahento koncentracijomis, nebuvo tik taikant perkoliacijos metodą (13 pav.).
Technologinių metodų įtaka vaistinių melisų ekstraktų kokybei palyginama ir pagal sauso likučio tyrimų duomenis (14 pav).
14 pav. Ekstrahavimo metodo įtaka sauso likučio kiekiui melisų ekstraktuose
Vertinant ekstrahavimo metodo įtaką pagal sausą likutį, pastebime, jog didžiausias jo kiekis nustatytas kai technologijai pasirenkamas ekstrahavimas ultragarsu, o etanolio koncentracija - 40 proc. (16.34±0.32 proc.). Gaminant klasikinės maceracijos bei perkoliacijos metodais tinkamesnis ekstrahentas taip pat yra 40 proc. etanolis, tačiau technologijai pasirinkus 50 proc. etanolį, statistiškai reikšmingas skirtumas nepastebėtas (14pav). Kaip ir nustatant suminį polifenolinių junginių kiekį,
naudojant 60 proc. etanolį statistiškai reikšmingo skirtumo tarp gautų rezultatų, lyginant su kitomis ekstrahento koncentracijomis, nepastebėta tik kai ekstraktų technologijai taikomas perkoliacijos metodas (14 pav.)
Taigi, apibendrinant galima teigti, jog tinkamiausias technologinis metodas vaistinių melisų ekstraktų gamybai yra ekstrahavimas ultragarsu, o gaminant šiuo metodu geriausias ekstrahentas yra 40 arba 50 proc. etanolis. Jei technologijai norima pasirinkti perkoliacijos metodą, kaip ekstrahentas gali būti ir 60 proc. etanolis. Pagal gautus rezultatus, nėra statistiškai reikšmingo skirtumo tarp šių ekstrahento koncentracijų gaminant skystuosius melisų ekstraktus perkoliacijos metodu.
3.3.
Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei
Vykdant eksperimentinius tyrimus ir norint įvertinti melisų ištraukų kokybę buvo tiriama ekstrahento įtaka, taip pat technologinio metodo įtaka polifenolinių junginių bei sauso likučio kiekiui. Pagal gautus rezultatus buvo vertinama, kokios koncentracijos ekstrahentas ir koks technologinis metodas yra tinkamiausias melisų etanolinėms ištraukoms. Tačiau tikslinga būtų įvertinti ir kokia melisų vaisto forma - tinktūros ar ekstraktai - labiausiai atskleidžia melisų gydomąsias savybes. Todėl aktualu įvertinti, kokia yra žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei.
Atliekant žaliavos ir ekstrahento santykio įtakos vaistinių melisų ištraukų kokybei tyrimą, lyginsime tik tas žaliavas, kurios buvo pagamintos klasikinės maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsu metodais, nes perkoliacijos metodu buvo gaminami tik vaistinių melisų skystieji ekstraktai. Tam kad atlikti kokybišką tyrimą, būtina atsižvelgti į anksčiau padarytas išvadas. Iš gautų rezultatų pastebime, jog didžiausias veikliųjų junginių kiekis, naudojant klasikinės maceracijos ir ekstrahavimo ultragarsu metodus yra nustatomas naudojant 40 ir 50 proc. etanolį, todėl tolimesniems eksperimentiniams tyrimams naudojamos tik šios ekstrahento koncentracijos.
3.3.1. Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka melisų ištraukų kokybei gaminant
maceracijos metodu
15 pav. Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka suminiam polifenolinių junginių kiekiui gaminant maceracijos metodu
Įvertinus gautus rezultatus, galima daryti išvadą, jog kokybiškesnės melisų ištraukos, gaminant jas klasikinės maceracijos metodu, gaunamos kai žaliavos ir ekstrahento santykis yra 1:5, t.y. melisų tinktūrose. Daugiausia polifenolinių junginių (11.5±0.42mg/ml) buvo nustatyta melisų
tinktūroje, kai ekstrahentas yra 40 proc. etanolis (15 pav.).
Kitas rodiklis, kuris taip pat svarbus vertinant melisų ištraukų kokybę yra sausas likutis. Gauti rezultatai pateikti 16 pav.
16 pav. Žaliavos ir ekstrahento santykio įtaka sauso likučio kiekiui gaminant maceracijos metodu
Gauti rezultatai parodė, jog gaminant melisų ištraukas klasikinės maceracijos metodu, didesnis sauso likučio kiekis gaunamas kai žaliavos ir ekstrahento santykis 1:5 lyginant su ištraukomis, pagamintomis santykiu 1:1. Vertinat melisų tinktūrų kokybę pastebime, jog didžiausias sauso likučio kiekis nustatytas kai etanolio koncentracija 50 proc. - 14.5±0.37proc. Tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo tarp gautų rezultatų su 40 ir 50 proc. etanoliu nebuvo (16 pav.).
Taigi, galima daryti išvadą, jog gaminant vaistinių melisų etanolines ištraukas klasikinės maceracijos metodu, tinkamesnis žaliavos ir ekstrahento santykis yra 1:5.
