FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
DOVILĖ KUKLERYTĖ
TYRIMO METODOLOGIJOS VYSTYMAS 10-HIDROKSI-2-DECENO RŪGŠTIES NUSTATYMUI BIČIŲ PIENELIO ŢALIAVOJE IR
PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. Liudas Ivanauskas
KAUNAS, 2019
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
TYRIMO METODOLOGIJOS VYSTYMAS 10-HIDROKSI-2-DECENO RŪGŠTIES NUSTATYMUI BIČIŲ PIENELIO ŢALIAVOJE IR
PRODUKTUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas Darbą atliko
Doc. R. Radţiūnas Magistrantė
Data Dovilė Kuklerytė
Data
KAUNAS, 2019
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
PADĖKA ... 7
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Bičių pienelio apibūdinimas ... 11
1.2. Bičių pienelio cheminė sudėtis ... 12
1.3. 10-hidroksi-2-deceno rūgštis ... 14
1.4. Liofilizuotas bičių pienelis ... 14
1.5. Bičių pienelio laikymo sąlygos ... 15
1.6. Bičių pienelio biologinis aktyvumas ... 15
1.7. Bičių pienelio vartojimo būdas ... 17
1.8. Maisto papildai, kurių sudėtyje yra bičių pienelio ... 17
1.9. Efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymas 10-hidroksi-2deceno rūgšties nustatymui ... 17
1.10. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos pritaikymas 10-hidroksi-2-deceno rūgšties nustatymui ... 19
1.11. Dujų chromatografija - masių spektrometrija ... 20
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tyrimo organizavimas ... 21
2.2. Tyrimo objektas ... 21
2.3. Naudotos medţiagos ir aparatūra ... 21
2.4. Tyrimų metodikos... 22
2.4.1. Mėginių paruošimas ... 22
2.4.2. 10-HDA kokybinis ir kiekybinis įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 23
2.4.3. 10-HDA kokybinis įvertinimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu 24 2.4.4. 10-HDA kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu ... 25
2.5. Duomenų statistinė analizė ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. 10-HDA kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos
metodu ... 27
3.1.1. 10-HDA kokybinė analizė taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą ... 27
3.1.2. 10-HDA kiekybinė analizė taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. ... 28
3.1.3. Metodo validacija ... 28
3.2. 10-HDA kokybinė analizė taikant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą .. 31
3.3. 10-HDA kiekybinis nustatymas taikant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą ... 33
3.4. 10-HDA kokybinis nustatymas taikant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą ... 33
3.5. 10-HDA kiekybinis nustatymas taikant plonasluoksnės chromatografijos analizės metodą .. 35
4. IŠVADOS ... 37
5. REKOMENDACIJOS ... 38
6. PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ... 39
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
SANTRAUKA
Dovilės Kuklerytės magistro baigiamasis darbas „Tyrimo metodologijos vystymas 10-hidroksi-2- deceno rūgšties nustatymui bičių pienelio ţaliavoje ir produktuose“ mokslinis vadovas Prof. Liudas Ivanauskas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas.
Darbo tikslas: Ištirti 10-hidroksi-2-deceno rūgštį bičių pienelio ţaliavoje ir produktuose.
Darbo uţdaviniai:
1. Surinkti bičių pienelio ţaliavą ir produktus, juos paruošti ekspermentiniams tyrimams.
2. Parinkti optimalias 10-hidroksi-2-deceno rūgšties (10-HDA) ekstrahavimo sąlygas iš bičių pienelio ţaliavos ir produktų.
3. 10-hidroksi-2-deceno rūgšties kiekybiniam nustatymui pritaikyti efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (DC-MS) analizės metodų sąlygas.
4. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) analizės metodu identifikuoti bei kiekybiškai įvertinti 10-hidroksi-2-deceno rūgštį.
5. Įvertinti 10-hidroksi-2-deceno rūgšties pasiskirtymą skirtinguose bičių pienelio produktuose ir ţaliavoje.
Tyrimo metodai:
10-HDA ektrakcijai iš bičių pienelio ţaliavos ir produktų buvo taikyti du metodai, ekstrakcija naudojant tirpiklį metanolį ir ultragarsą. Atliekant ekstrakciją antruoju metodu buvo naudojamas dietileteris, po to likusi netirpi medţiaga ekstrahuojama metanoliu. 10-HDA kiekybiškai nustatyta naudojantis efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC), DC-MS, EPC metodikomis. 10-HDA identifikavimas buvo atliekamas naudojant efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodiką.
Rezultatai ir išvados:
10-HDA ekstrahavimo metodas, kurio metu naudojamas tirpiklis metanolis ir ultragarsas, yra tinkamas
10-HDA ekstrakcijai iš tablečių, o 10-HDA ekstrakcijai iš kapsulių ir bičių pienelio ţaliavos
naudojamas dietileteris, po to likusi netirpi medţiaga ekstrahuojama metanoliu. ESC metodu nustatyta,
kad vidutinis kiekis 10-HDA bičių pienelio ţaliavoje yra 0,93%, vienoje kapsulėje – 0,71 mg, vienoje
tabletėje – 1,50 mg, DC-MS nustatyta, kad vidutinis kiekis 10-HDA bičių pienelio ţaliavoje yra
0,85%, vienoje kapsulėje – 0,81 mg, vienoje tabletėje – 1,72 mg, o EPC metodu nustatyta, kad
vidutinis kiekis 10-HDA bičių pienelio ţaliavoje yra 0,80%, vienoje kapsulėje– 0,88 mg, vienoje
tabletėje – 1,93 mg. 10-HDA identifikuota naudojantis EPC metodiką.
SUMMARY
The master thesis „Development of assay method for determination of 10-hydroxy-2-decenoic acid in royal jelly and food supplements” written by Dovilė Kuklerytė, leading professor Liudas Ivanauskas.
Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas.
The aim: Determinate 10-hydroxy-2-decenoic acid in royal jelly and in different food supplements.
Objectives:
1. To collect royal jelly and food supplements, which contain royal jelly, and prepare it for experimental research.
2. To select the optimal conditions for extraction of 10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA) from royal jelly and products, which contain it.
3. To quantify 10-hydroxy-2-decenoic acid by using the High-performance liquid chromatography (HPLC) and Gas chromatography-mass spectrometry methods.
4. To identify and quantify 10-hydroxy-2-decenoic acid by High-performance thin-layer chromatography method.
1. To compare amount of 10-hydroxy-2-decenoic acid in royal jelly products and raw material.
Methods:
Two methods were used for extraction of 10-HDA from raw material and products, which contain it, extraction using methanol as a solvent and ultrasound, extraction using diethyl ether and methanol. 10-HDA was quantified by HPLC, Gas chromatography and High-performance thin-layer chromatography methods. 10-HDA was identificated by High-performance thin-layer chromatography.
Results and conclusions:
10-HDA extraction method, when methanol is used as a solvent with ultrasound, is suitable for tablets,
but not for capsules and raw material, we could not receive separation of 10-HDA and other
excipients. Because of that, the content of capsules and raw material is extracted with a portion of
diethyl ether and then non-soluble material is extracted with methanol. HPLC estimates that the
average amount of 10-HDA in raw material is 0.93%, in capsules – 0.71 mg per average mass of
capsule, in tablets – 1.50 mg per average mass of tablet. Gas chromatography estimates that the
average amount of 10-HDA in raw material is 0.85%, in capsules – 0.81 mg per average mass of
capsule, in tablets – 1.72 mg. per average mass of tablet. High-performance thin-layer chromatography
estimates that the average amount of 10-HDA in raw material is 0.80%, in capsules – 0.88 mg per
average mass of capsule, in tablets – 1.93 mg per average mass of tablet.10-HDA identificated by
High-performance thin-layer chromatography.
PADĖKA
Norėčiau padėkoti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Analizinės ir toksikologinės
chemijos katedrai, ypač darbo vadovui prof. Liudui Ivanauskui uţ pagalbą ir vertingas pastabas, taip
pat Mindaugui Marksai ir Ivan Bezruk uţ kantrybę ir visus patarimus rašant magistro baigiamąjį darbą.
SANTRUMPOS
BP – bičių pienelis
10-HDA – 10-hidroksi-2-deceno rūgštis
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
EPC – efektyvioji plonasluoksnė chromatografija
DC-MS – dujų chromatografija-masių spektrometrija
SSN – santykinis standartinis nuokrypis
ĮVADAS
Bičių pienelis (BP) yra gelsvai baltos spalvos, kreminės konsistensijos, aštroko skonio ir kvapo produktas, kuris išskiriamas bičių darbininkių galvose esančiose hipofaringinėje ir apatinio ţandikaulio liaukose [4]. Bičių pienelis yra labai nestabilus produktas, jis yra jautrus šviesos poveikiui, šilumai bei sąlyčio metu su oru oksiduojasi, todėl siekiant pagerinti jo stabilumą jis yra liofilizuojamas.
Norint išlaikyti kokybišką bičių pienelio ţaliavą yra svarbu pasirinkti tinkamamas laikymo sąlygas, tam kad nepakistų BP išvaizda, klampa, skonis bei kvapas [7].
Bičių pienelį sudaro baltymai, organinės rūgštys, aminorūgštys, esteriai, fenoliniai junginiai, cukrūs, mineralinės medţiagos, vitaminai ir kitos sudedamosios dalys [32,29]. Lipidai sudaro 8-19 proc. sausųjų medţiagų kiekio, tai yra svarbiausia bičių pienelio sudedamoji dalis [7], kadangi BP yra aptinkama riebalų rūgštis, 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (10-HDA), kuri randama tik bičių pienelyje [32]. 10-HDA dar vadinama bičių pienelio rūgštimi ir yra naudojama kaip markeris, norint įvertinti BP kokybę. 10-HDA kiekis BP yra tarptautinis bičių pienelio kokybės standartas ir jis tiesiogiai nustato BP kainą tarptautinėje rinkoje [4]. Todėl jos identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas gali būti laikomas bičių pienelio tapatybės ir kokybės rodikliu.
Bičių pienelis dėl savo unikalios sudėties pasiţymi antimikrobiniu, priešuţdegiminiu, priešvėţiniu, kolageno susidarymą skatinančiu, imunomoduliaciniu, antibakteriniu, priešgrybeliniu ir priešuţdegiminiu poveikiais [15,18,20]. Pastaraisias metais mokslininkai vis daugiau dėmesio skiria bandydami pritaikyti BP savybes, siekiant sukurti preparatus, kuriuos būtų galima panaudoti ligų prevencijai. Taip pat BP visame pasaulyje yra plačiai naudojamas kosmetikos industrijoje bei kaip maisto papildas [23]. Tačiau Lietuvoje jis nėra taip plačiai paplitęs kaip medus ar propolis, todėl aptinkamas tyrimų trūkumas analizuojant šią ţaliavą bei nustatinėjant 10-HDA, todėl yra aktualu vystyti tyrimų metodologiją 10-hidroksi-2-deceno rūgšties nustatymui bičių pienelio ţaliavoje ir produktuose.
Tiriant BP labai svarbu pasirinkti tinkamą analizės metodą norint identifikuoti bei kiekybiškai nustatyti 10-HDA. Moksliniuose literatūros šaltiniuose identifikavimui ir kiekybiniami 10-HDA nustatymui bičių pienelio ţaliavoje ir produktuose naudojamas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) analizės metodas [3,16]. Be šio metodo taip pat gali būti taikomi dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (DC-MS) ir efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) metodai.
Ištirti 10-HDA bičių pienelio ţaliavoje ir produktuose yra reikšminga siekiant įvertinti bičių
pienelio bei maisto papildų, kurių sudėtyje yra BP, kokybę.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti 10-hidroksi-2-deceno rūgštį bičių pienelio ţaliavoje ir produktuose.
Darbo uţdaviniai:
1. Surinkti bičių pienelio ţaliavą ir produktus, juos paruošti ekspermentiniams tyrimams.
2. Parinkti optimalias 10-hidroksi-2-deceno rūgšties (10-HDA) ekstrahavimo sąlygas iš bičių pienelio ţaliavos ir produktų.
3. 10-HDA kiekybiniam nustatymui pritaikyti efektyviosios skysčių ir dujų chromatografijos-masių spektrometrijos (DC-MS) analizės metodų sąlygas.
4. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos (EPC) analizės metodu identifikuoti bei kiekybiškai įvertinti 10-hidroksi-2-deceno rūgštį.
5. Įvertinti 10-hidroksi-2-deceno rūgšties pasiskirtymą skirtinguose bičių pienelio produktuose ir
ţaliavoje.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Bičių pienelio apibūdinimas
Bičių pienelis (BP) – tai rūgštoka, baltai gelsvos spalvos, turinti būdingą kvapą ir aštrų skonį, ţele primenanti medţiaga, kurią išskiria bitės darbininkės galvoje esančios hipofaringinės ir apatinio ţandikaulio liaukos [2,4]. Bičių pienelis yra vienintelis maistas, kuriuo bičių darbininkių lervutės, yra maitinamos pirmąsias tris gyvenimo dienas, o bičių motinėlės – visą gyvavimo ciklą [25]. Be to, BP turi didelę įtaką gyvenimo trukmei ir dydţiui. Motinėlės yra 1,5-2 kartus didesnės ir sunkesnės, bei gali išgyventi iki penkerių metų, ir padėti apie 2000-3000 kiaušinėlių, priklausant nuo jų kūno masės, per dieną, keletą metų, o bitės darbininkės gyvena tik apie 45 dienas [12].
Juslinės savybės tokios kaip išvaizda, kvapas ir skonis yra svarbūs kokybės rodiklai. Švieţias bičių pienelis yra baltai gelsvos spalvos, geltona spalva išryškėja ilgiau laikant. Bičių pienelis pavaizduotas 1 paveiksle. Pasenęs BP yra tamsesnės spalvos ir kartaus skonio. Klampumas kinta priklausomai nuo vandens kiekio ir amţiaus. Siekiant optimalios kokybės BP turi būti laikomas -18 °C temperatūroje, nes yra jautrus šviesai ir karščiui, taip pat gali įvykti oksidacija tiesioginio sąlyčio su oru metu [7,12]. Kadangi bičių pienelis yra nepatvarus, norint pagerinti jo kokybę, jį galima liofilizuoti [7].
1 pav. Avilys su bičių pieneliu ir bičių motinėlių lervomis [12]
(Fratini ir kt.)
A. Avilys su bičių pieneliu ir bičių motinėlių lervomis. B. Bičių motinėlių lervos bičių motininėse akutėse, uţpildytose bičių pieneliu. C. Bičių pienelio surinkimas, pašalinamos
bičių motinėlių lervos iš bičių motininių akučių.
1.2. Bičių pienelio cheminė sudėtis
Bičių pienelis yra sudarytas iš baltymų, organinių rūgščių, aminorūgščių, esterių, fenolinių junginių, cukrų, mineralinių medţiagų, mikroelementų ir kitų sudedamųjų dalių [29,32]. Be to, bičių pienelio sudėtis gali skirtis priklausomai nuo bičių metabolinės ir fiziologinės būklės, bičių šeimos pajėgumo, taip pat nuo motinos lervutės amţiaus, sezoninių ir regioninių sąlygų [3]. Informacija apie bičių pienelio cheminę sudėtį yra svarbi, norinti nustatyti jo kiekį bei įvertinti farmacinių preparatų, savo sudėtyje turinčių bičių pienelio, kokybę [29].
Bičių pienelis yra labai nestabilus produktas. Liofilizacija yra svarbiausias technologinis metodas, kurio metu pagerinamas BP stabilumas. Taip pat jo stabilumas gali būti pasiektas įmaišius 1- 2 proc. BP į medų, sustabdoma visa fermentinė veikla [7]. Švieţio bičių pienelio sudėtis skiriasi nuo liofilizuoto. Pasak Bogdanov, „Nėra tarpautinio bičių pienelio standarto. Tačiau kai kurios šalys, pavyzdţiui, Brazilija, Bulgarija, Japonija ir Šveicarija, nustatė nacionalinius standartus. Tarptautinės medaus komisijos darbo grupė, kuriai vadovauja Sebatini, dirba prie tarptautinio standarto parengimo.
Buvo paskelbtas pirmasis darbas siekiant sukurti standartą.“ [Bogdanov, 2017, p. 1]. 1 lentelėje nurodyti pagrindiniai komponentai sudarantys bičių pienelį.
1 lentelė. Natūralaus ir liofilizuoto bičių pienelio cheminė sudėtis [7,32]
Natūralus bičių pienelis Liofilizuotas bičių pienelis
Vanduo (g/100 g) 60-70 <5
Lipidai (g/100 g) 3-8 8-19
10-HDA (g/100 g) >1,4 >3,5
Baltymai (g/100 g) 9-18 27-41
Fruktozė (g/100 g) 3-13 -
Gliukozė (g/100 g) 4-8 -
Sacharozė (g/100 g) 0,5-2,0 -
Pelenai (g/100 g) 0,8-3,0 2-5
pH 3,4-4,5 3,4-4,5
Rūgštingumas (ml 0,1N NaOH/g)
3,0-6,0 -
Furozinas (mg/100 g baltymo) <50 -
(Sebatini, 2009- cit. iš Bogadanov, 2017)
Švieţiame bičių pienelyje veikliųjų medţiagų yra iki trijų kartų maţiau negu liofilizuotame.
Taip pat švieţias BP savo sudėtyje turi 60-70 proc. vandens, daugiausiai iš visų bičių produktų [7,32].
Liofilizuotame bičių pienelyje baltymų kiekis sudaro 27-41 proc. bendro sausųjų medţiagų kiekio ir kiekybiniu poţiūriu, tai yra svarbiausia bičių pienelio sudedamoji dalis [32]. Apie 60 proc.
baltymų yra tirpūs vandenyje. Laisvosios aminorūgštys sudaro 0,6-1,5 proc., iš kurių prolino, lizino, glutamo rūgšties, β-alanino, fenilalanino, aspartato ir serino buvo aptinkamas didţiausias kiekis [7,32].
Angliavandeniai sudaro 30 proc. sausųjų medţiagų kiekio, kaip ir meduje pagrindiniai cukrūs yra monosacharidai, fruktozė ir gliukozė. Taip pat aptinkama oligosacharidų, tokių kaip maltozė, izomaltozė, gentibiozė, erlozė [32].
Bičių pienelyje aptinkami nedideli kiekiai vitaminų ir mineralinių medţiagų, tokių kaip K, Ca, Mg, Zn, Fe, Cu ir kt., jų kiekiai pateikti 2 lentelėje. Taip pat BP pasiţymi plačiu spektru B grupės vitaminų, didţiausi kiekiai aptinkami pantoteno rūgšties, niacino, piridoksino, riboflavino, tiamino, ir kt., jų kiekiai pateikti 3 lentelėje [7,12]. Vitaminų kiekis BP gali kisti skirtingais sezonais, kadangi pagrindinis vitaminų šaltinis yra ţiedadulkės, todėl tai priklausys nuo kokios ţiedadulkės bus surenkamos tuo sezonu [12,29].
2 lentelė. Mineralinių medžiagų kiekis mg/100g BP [7]
Mineralinės medţiagos Kiekis mg/100g
Kalis 200-1000
Kalcis 25-85
Magnis 20-100
Cinkas 0,7-8
Geleţis 1-11
Varis 0,33-1,6
(Bogdanov, 2011)
3 lentelė. Vitaminų kiekis mg/100g BP [7]
Vitaminai Kiekis mg/100g
Niacinas (B3) 4,5-19
Piridoksinas (B6) 0,2-5,5
Tiaminas (B1) 0,1-1,7
Riboflavinas (B2) 0,5-2,5
Pantoteno rūgštis 3,6-23
Folio rūgštis 0,01-0,06
Biotinas (H) 0,15-0,55
(Bogdanov, 2011)
Bičių pienelyje esantys lipidai sudaro 8-19 proc. sausųjų medţiagų kiekio, tai svarbiausias BP komponentas. Organinės rūgštys sudaro 80-90 prc. lipidų dalies. Dauguma bičių pienelyje esančių organinių rūgščių yra laisvosios riebiosios rūgštys, kurių struktūra yra gana neįprasta ir retai aptinkama gamtoje. Jos sudarytos iš mono-, dihidroksi- ir dikarboksi- rūgščių su 8-10 specifiškai išsidėsčiusių anglies atomų. Svarbiausia riebalų rūgštis yra 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (10-HDA), kuri randama tik bičių pienelyje [7,32].
1.3. 10-hidroksi-2-deceno rūgštis
10-HDA yra vidutinio ilgio, tiesios grandinės, hidroksi- mononesočioji riebalų rūgštis, taip pat priskiriama omega-hidroksi- aminorūgštims, priklausančioms 2-deceno rūgštims, kuriose vienas iš vandenilio atomų yra pakeistas hidroksi grupe ir C = C dvigubas ryšys turi E konfigūraciją [28].
Struktūra pavaizduota 2 paveikslėlyje.
; 2 pav. 10-HDA struktūra [28]
10-HDA yra tirpi organiniuose tirpikliuose, tokiuose kaip etanolis, metanolis, dimetilsulfoksidas. Tirpumas etanolyje vidutiniškai yra 20 mg/ml, o dimetilsulfokside 30 mg/ml.
Tačiau ši rūgštis yra maţai tirpi vandeniniuose tirpaluose [28].
10-HDA yra daţnai vadinama bičių pienelio rūgštimi. 10-HDA yra pagrindinis ir unikalus BP komponentas, sudarantis apie 50 proc. visų riebalų rūgščių. Kituose bičių produktuose ši rūgštis nėra aptinkama, todėl 10-HDA yra naudojama kaip markeris, norint įvertinti BP kokybę. Todėl jos nustatymas ir kiekybinis įvertinimas gali būti laikomas bičių pienelio tapatybės ir kokybės rodikliu [32]. Sebatini (2009) teigia, kad 10-HDA kiekis BP gali sumaţėti dėl netinkamų laikymo sąlygų. Šis sumaţėjimas yra daţniau aptinkamas meduje, į kurio sudėtį yra papildomai įdėtas BP, todėl svarbu atlikti kokybinius ir kiekybinius tyrimus vertinant BP kokybę [32].
1.4. Liofilizuotas bičių pienelis
Liofilizacija – dţiovinimas šalčiu, tai procesas, kuris daţniausiai yra naudojamas norint
išsaugoti nestabilias medţiagas, kurios yra linkusios greitai oksiduotis, tokios kaip bičių pienelis,
norint išgauti ilgesnį produktų galiojimo laiką. Kadangi bičių pienelis yra jautrus temperatūrai, šviesai ir orui, dėl patogesnių laikymo sąlygų, vartojimo ir didesnio prieinamumo ţmonėms, daţniausiai jis yra liofilizuojamas [13].
Šio proceso metu BP yra uţšaldomas. Šį procesą sudaro 3 etapai: šaldymas, pirminis ir antrinis dţiovinimai. Pirmojo dţiovinimo etapo metu BP esantis vanduo iš kietos fazės tiesiogiai pereina į garų fazę, kai temperatūra yra ţemiau 0,0099 °C, o slėgis – ţemiau 0,00603 atm. Antrinio dţiovinimo etapo metu keliant temperatūrą yra pašalinamas vandens kiekis, likęs po pirmojo dţiovinimo etapo [24].
Liofilizuoti BP milteliai yra maţiau jautrūs temperatūros pokyčiams, todėl gali būti laikomi kambario temperatūroje ar lengvai transportuojami, taip pat gali būti naudojami kitų produktų gamybai, pavydţiui tablečių. Brazilijoje, San Paulo mieste buvo atliktas tyrimas, kuris parodė, kad liofilizuoto ir švieţio BP chromatografiniai profiliai turi panašų pirštų atspaudą (angl. fingerprint) ir 10-HDA buvo aptiktas abiejuose mėginiuose. Taigi, liofilizavimo procesas neturėjo įtakos riebalų rūgščių degradacijai [6].
1.5. Bičių pienelio laikymo sąlygos
Švieţias bičių pienelis yra jautrus šilumai, šviesai ir orui. Dėl netinkamų laikymo sąlygų gali pakisti BP spalva, iš balsvai gelsvos tapti ruda, taip pat gali padidėti klampa, sumaţėti laisvųjų aminorūgščių kiekis bei 10-HDA kiekis [13]. Mokslininkai Chen ir Chen ištyrė fizikinius ir cheminius pokyčius, atsiradusius BP, kai jis buvo laikomas skirtingomis sąlygomis. Tyriamieji mėginiai buvo laikomi –20°C temperatūroje, esant 4°C temperatūrai ir kambario temperatūroje, apsaugojus nuo šviesos poveikio, septynis mėnesius. Rezultatai parodė, kad laikant BP kambario temperatūroje labai pasikeitė klampumas, spalva, tirpių baltymų frakcija ir angliavandenių kiekis, tačiau šie pokyčiai nebuvo pastebėti BP laikant -20ºC temperatūroje. Pagrindiniai pokyčiai buvo klampos padidėjimas, spalvos pasikeitimas iš baltai gelsvos į rudą, angliavandenių kiekio bei tirpių baltymų kiekio sumaţėjimas [11].
Švieţias bičių pienelis turėtų būti laikomas tamsaus stiklo, hermetiškame indelyje, norint apsaugoti nuo oksidacijos. Jei planuojama bičių pienelį sunaudoti greitai, tai jis turėtų būti laikomas šaldiklyje 0-5 °C. Tačiau norint išlaikyti BP biologiškai aktyvų ilgesnį periodą jis turi būti laikomas ţemesnėje nei -18 °C temperatūroje ir neilgiau nei 12 mėnesių laikotarpį [13].
1.6. Bičių pienelio biologinis aktyvumas
Bičių pienelis pasiţymi unikalia ir plačia chemine sudėtimi. Todėl BP būdingas platus
biologinio aktyvumo spektras. Pavel C. ir kt. savo apţvalginiame straipsnyje išskiria šiuos BP
biologinio aktyvumo poveikius, kurie taip pat aptinkami ir kituose moksliniuose šaltiniuose [15,18,20,26,27]:
3 pav. BP biologinis aktyvumas
Taip pat, tyrimai rodo, kad 10-HDA skatina T limfocitų pogrupio augimą ir interleukino-2, kurie gali reikšti, kad ši riebalų rūgštis turi imunoreguliacinį ir priešvėţinį poveikius (Zhou ir kt., 2007- cit. iš Bărnuţiu, 2011).
Buvo tiriamas 10-HDA, išgautos ir BP, antimikrobinis poveikis. Tyrimas parodė, kad 10- HDA antimikrobinis poveikis skyrėsi su patogenetiniais mikrobais. Minimali 10-HDA antimikrobinė dozė buvo: (Escherichia coli 0,625 mg · ml-1, Bacillus subtilis 1,25 mg · ml-1, Staphylococcusaureus 2,5 mg · ml-1. Taip pat 10- HDA pasiţymėjo antimikrobiniu poveikiu prieš Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. Taigi tyrimas parodė, kad 10-HDA gali veiksmingai slopinti bakterijų augimą (Bărnuţiu, 2011).
Biologinis aktyvumas Antioksidacinis
Antidiabetinis
Priešvėžinis
Antibiotinis
Priešuždegiminis Žaizdų gijimą
skatinantis Imunoduliacinis
ir antialerginis Tonizuojantis
Senėjimą lėtinantis
1.7. Bičių pienelio vartojimo būdas
Bičių pienelis daţniausiai yra vartojamas dėl gydomųjų ir imunitetą stiprinačių savybių.
Bogdanov teigia, remdamasis Chauvin, kad bičių pienelis turėtų būti vartojamas sublingvaliniu patekimo būdu, norint, kad BP patektų tiesiogiai į kraują, aplenkiant virškinamąjį traktą ir išvengiant galimo baltymų skilimo virškinimo trakte, ir atkreipia dėmesį, kad BP injekcija yra labai rizikinga, todėl šis vartojimo būdas nėra rekomenduojamas [7].
1.8. Maisto papildai, kurių sudėtyje yra bičių pienelio
Lietuvoje maisto papildus, kurių sudėtyje yra bičių pienelio gamina UAB „Medicata Filia“, šiuo metu rinkoje yra trys maisto papildai, kurie nurodyti 4 lentelėje.
4 lentelė. Lietuvos rinkoje esantys maisto papildai su bičių pieneliu
Pavadinimas Gamintojas Bičių pienelio kiekis 2
tabletėse
Apilakas 50 N20 UAB „Medicata Filia“ 100 mg
Apilakas 70 N20 UAB „Medicata Filia“ 140 mg
Visiovitalis N24
UAB „Medicata Filia“ 100 mg
1.9. Efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymas 10-hidroksi-2deceno rūgšties nustatymui
Efektyvioji skysčių chromatografija yra vienas tiksliausių analizės metodų, kuris plačiai naudojamas kiekybinei ir kokybinei analizei. ESC metodo dėka galima atskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti junginius, kai mėginys yra tirpus skysčiuose [10,30].
Šiuo analizės metodo metu tiriamasis mėginys yra įšvirkščiamas į porėtą kolonėlę (stacionari
fazė) ir skystis (judanti fazė) yra pumpuojamas per ją naudojant aukštą slėgį. Mėginio atskyrimas yra
pagrįstas skirtingu mišinio komponentų judėjimo greičiu nejudančioje fazėje [30]. Analičių
pasiskirstymas priklauso nuo skirtingo analitės afiniteto stacionarios fazės paviršiui, tos analitės,
kurios turi didesnį giminingumą stacionarios fazės paviršiui, judės lėčiau ir trumpesnį atstumą, o tos
analitės, kurios yra maţiau giminingos stacionariai fazei, tai jos judės greitai ir ilgesnį atstumą [34].
Efektyvioji skysčių chromatografija yra universalesnė uţ dujų chromatografiją, nes ESC neapsiriboja tik lakiais ir termiškai stabiliais mėginiais kaip DC, taip pat yra galimas platesnis mobilios ir stacionarios fazių pasirinkimas [22].
ESC metodo privalumai [30] :
Didelis metodo jautrumas;
Didelė raiška;
Geras pakartojamumas;
Galima naudoti nedidelius tiriamųjų mėginių kiekius;
Tinka nelakiems ir termolabiliems dariniams nustatyti;
Lengva frakcionuoti ir išvalyti mėginį.
Taip pat ESC metodas turi ir trūkumų, vienas iš jų yra brangi įranga, su kuria gali dirbti tik kvalifikuoti asmenys [30].
Bičių pienelis yra aptinkamas kaip gryna ţaliava arba įeina į kitų produktų sudėtį, tokių kaip medus, maisto papildai, kosmetiniai gaminiai. Kadangi 10-HDA yra vienas svarbiausių BP komponentų ir jis nėra aptinkamas kituose bičių produktuose, todėl 10-HDA nustatymas ir kiekybinis įvertinimas gali būti laikomas bičių pienelio ir produktų, kurių sudėtyje yra BP kokybės rodikliu [32].
Todėl svarbu pasirinkti tinkamą analizės metodą norint identifikuoti bei kiekybiškai nustatyti 10-HDA.
Moksliniuose literatūros šaltiniuose identifikavimui ir kiekybiniami 10-HDA nustatymui bičių pienelio
ţaliavoje ir produktuose plačiai naudojamas ESC analizės metodas. San Paulo mieste, Brazilijoje buvo
analizuojamos bičių pienelio ţaliavos iš Brazilijos, norint identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti 10-HDA
buvo pasirinktas ESC metodas. Parametrai pateikti 5 lentelėje. Atlikus analizę buvo nustatyta 10-HDA
koncentracija bičių pienelio ţaliavoje, kuri buvo diapozone tarp 1.58 ir 3.39 proc. [16]. Taip pat buvo
atliktas tyrimas Kostinbrode, Bulgarijoje, kuriame naudojant ESC metodą buvo siekiama kiekybiškai
nustatyti 10-HDA bičių pienelio ţaliavose bei nustatyti ar 10-HDA kiekis BP ţaliavoje kinta
priklausomai nuo bičių šeimos mitybos. Tyrime buvo kontrolinė grupė, kurioje bitės maitinosi įprastai,
antrajai grupei priklausė bitės, kurių mitybą papildė kepimo mielės, trečioji grupė papildomai gavo
vitaminų kompleką AD3E. ESC tyrimo parametrai pateikti 5 lentelėje. Atlikus analizę nustatyta, kad
bičių, kurios vartojo kepimo mieles, bičių pienelyje 10-HDA kiekis buvo ţenkliai didesnis lyginant su
kontroline grupe, o vitaminų kompleksas neturėjo didelės įtakos 10-HDA kiekiui BP. Kontrolinėje
grupėje 10-HDA diapozonas buvo tarp 1.64 – 2.32 proc. Taigi, ESC metodas yra plačiai naudojamas
10-HDA identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui [3]. Taip pat 10-HDA gali būti nustatinėjama ir
kitais metodais, tokiais kaip dujų ar efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC).
5 lentelė. ESC analizės parametrai
Parametras Brazilija Bulgarija
Judri fazė Metanolis ir vanduo (45:50) Metanolis ir vanduo (35:65)
Parametras Brazilija Bulgarija
Metodo trukmė 30 min 10 min kiekvienam mėginiui
Tėkmės greitis 0,5 ml/min 1,0 ml/min
Absorbcija 225 nm 215 nm
Injekcijos tūris 5 mikro L 0,2 mikro L
Kolonėlė C18-H C18
pH 2,5 ( Fosforo rūgštis) 3 ( Acto rūgštis)
1.10. Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos pritaikymas 10-hidroksi-2- deceno rūgšties nustatymui
Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija – tai paprastas, greitas ir nebrangus analizės metodas, kuris daţnai taikomas norint nustatyti mišinyje esančių komponentų sudėtį, patikrinti junginio tapatybę ir grynumą, patikrinti reakcijos eigą. Šis chromatografijos metodas gali būti naudojamas kokybinei ir kiekybinei analizei [21].
Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija yra chromatografijos metodas, naudojamas atskirti mišinius. EPC yra atliekama ant stiklo, plastiko ar aliuminio folijos plokštelių, kurios padengtos plonu sorbento sluoksniu. Daţniausiai naudojami sorbentai yra silikagelis, aliuminio oksidas arba celiuliozė.
Šis sorbento sluoksnis yra stacionari fazė. Po mėginio uţnešimo ant plokštelės, ji yra dedama į judriąją fazę, kuri daţniausiai sudaryta iš kelių organinių tirpiklių mišinio. Labai svarbu pasirinkti tinkamą tirpiklių sistemą, nes nuo jos priklausys atskyrimas. [5]. Mobili fazė, kuri neša tiriamąsias medţiagas, teka per stacionarę fazę. Mišinio sudedamųjų dalių judėjimo greitis nejudančioje fazėje skiriasi, tai lemia medţiagų atskyrimą. Kuo junginio panašesnės fizikinės savybės į judančios fazės, tuo ilgiau jis išliks mobilioje fazėje. Mobilioji fazė neša tirpiausius junginius toliausiai nuo starto linijos ant chromatografinės plokštelės. Tačiau junginiai, kurie yra maţiau tirpūs mobiliojoje fazėje ir turi didesnį giminingumą dalelėms, esančioms ant chromatografinės plokštelės, kyla maţiausiai [21].
Chromatografinei plokštelei ryškinti gali būti naudojami cheminiai reagentai arba
ultravioletinė šviesa. Bespalvės medţiagos gali būti aptinkamos tik naudojant ryškinamuosius
reagentus, kurių dėka yra matomi spalvoti plotai medţiagų aptikimo vietose. Naudojant bendrinius
ryškinamuosius reagentus su koncentruota sieros rūgštimi ir pašildţius chromatografinę plokštelę organinės medţiagos apanglėja ir matomos juodos dėmės [21].
Grupė mokslininkų atliko tyrimą, kuriame buvo taikytas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodas 10-HDA identifikavimui bičių pienelio ţaliavoje. 10-HDA buvo identifikuota naudojant šias metodo sąlygas: mėginys buvo išekstrahuotas naudojant chloroformą, ekstraktas perkeltas ant silikagelio chromatografinės plokštelės ir įdėtas į mobiliąją fazę sudarytą iš 1- butanolio, etilo alkoholio ir koncentruotas amonio hidroksidas (7:3:2). Chromatografinei ploštelei ryškinti buvo naudota untravioletinė šviesa 225 nm. [19].
1.11. Dujų chromatografija - masių spektrometrija
Dujų chromatografija-masių spektrometrija (GC-MS) yra unikali technologija, kurios dėka galima identifikuoti ir charakterizuoti naujus junginius gautus po sintezės ir derivatizacijos reakcijų atlikimo. Šis analizės metodas yra plačiai naudojamas chemijos, nanotechnologijojų ir biotechnologijojų srityse [9].
Dujų chromatografija-masių spektrometrija yra analitinis metodas, kuris sujungia dujų - skysčių chromatografijos ypatybes su masių spektrometrija, siekiant identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti skirtingas medţiagas esančias tiriamajame mėginyje. Dujų chromatografas, kuris gali atskirti lakiuosius organinius junginius ir pusiau lakius junginius, bet negali jų identifikuoti, yra sujungiamas su detektoriumi – masių spektrometru, kuris gali pateikti išsamią struktūrinę informaciją apie daugelį junginių, kad juos būtų galima identifikuoti [17].
GC-MS prietaisą sudaro du pagrindiniai komponentai, tai dujų chromatografas ir masių spektrometras. Dujų chromatografijoje (GC) judančioji fazė yra inertinės dujos, tokios kaip helis ar azotas, nejudančioji fazė yra plonu inertinio skysčio sluoksniu padengtas kietas inertinis nešiklis, vadinamas kolonėle, kurios vidus pripildytas kieto sorbento [9]. DC metu tiriamojo mėginio tirpalas įleidţiamas į DC įleidimo angą, kur jis išgarinamas kartu su mobilia faze, patenka į chromatografinę kolonėlę. Analizuojamos medţiagos yra atskiriamos chromatografinėje kolonėlėje. Mėginys tekėdamas per kolonėlę, sąveikauja su nejudria faze, kuria yra padentas kolonėlės vidus. Taip pat labai svarbi dujų chromatografijos dalis yra detektorius, kuris reguoja į išeinančių iš kolonėlės dujų pokytį ir perduota šią informaciją registruojančiajam prietaisui [1].
Kad 10-HDA būtų galima analizuoti naudojant DC-MS metodiką, ji turi būti pakankamai laki
ir termiškai stabili,todėl prieš analizę gali prireikti cheminio modifikavimo (derivatizavimo), kad būtų
pašalinti nepageidaujami adsorbciniai efektai [8].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo organizavimas
Planuojant tyrimą buvo ieškoma literatūros šaltinių, naudojantis LSMU bibliotekos prenumeruojamomis duomenų bazėmis. Išanalizavus surinktą informaciją buvo iškeltas darbo tikslas bei suformuoti uţdaviniai, pradėtas planuoti tyrimas, kuris buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universitete Farmacijos fakultete Analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje.
Tyrimas buvo atliekamas su bičių pienelio ţaliava ir produktais, kurių sudėtyje yra bičių pienelio, siekiant juose nustatyti 10-HDA, naudojant chromatografinės analizės metodus. Gauti duomenys buvo analizuojami, pateikiami rezultatai ir formuojamos darbo išvados.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas yra bičių pienelio ţaliava ir jos produktai (6 lentelė).
6 lentelė. Tiriamieji preparatai
Pavadinimas Farmacinė forma Bičių pienelio kiekis
BIČIŲ PIENELIS 20g (Vokietija) Gryna medţiaga 100%
APILAKAS 70 (Medicata Filia, Lietuva) Tabletės 70 mg liofilizuoto BP tabletėje
APITONIN (Actavis, Bulgaria) Kapsulės 60 mg liofilizuoto BP kapsulėje
2.3. Naudotos medţiagos ir aparatūra
Naudotos medţiagos:
1) 10-hidroksi-2-deceno rūgštis (royal jelly acid) (Sigma-Aldrich);
2) Metanolis (≥ 99,8 % Sigma-Aldrich, Izraelis);
3) Dietileteris (≥99 % Sigma-Aldrich, Izraelis);
4) Piridinas (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
5) MTBSTFA - N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamid (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
6) Helio dujos (≥99,999%AGA GAS, Lietuva);
7) Išgrynintas vanduo;
8) Chloroformas (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
9) Kalio dichromatas (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
10) Sieros rūgštis (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
11) 0,1 proc. TFA (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
12) Acetonitrilas (≥99 % Sigma-Aldrich, Missouri, JAV);
13) Etanolis 96,6 % (v/v) (Sigma-Aldrich).
Naudota aparatūra:
1) Vandens gryninimo sistema (Millipore, JAV);
2) Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mavajai, JAV);
3) Elektroninės svarstyklės Sartorius AG (Götingen, Vokietija);
4) Termostatinė vonelė Heidolph (Vokietija);
5) Automatinės pipetės Eppendorf (Hamburgas, Vokietija);
6) Pusiau automatinis mėginių uţnešiklis CAMAG Linomat 5 (Camag, Muttenz, Šveicarija);
7) CAMAG Twin trough Chamber 10x10 kamera (Camag, Muttenz, Šveicarija);
8) Kaitlentė CAMAG TLC Plate heater III (Camag, Muttenz, Šveicarija);
9) CAMAG TLC Visualizer (Camag, Muttenz, Šveicarija);
10) Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV);
11) Fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Waters Corporation, Milford, JAV);
12) Empower 3 chromatographic manager system (Waters Corporation, Milford, USA);
13) Dujų chromatografas „SHIMADZU GCMS-QP2010 Ultra” (Japonija).
2.4. Tyrimų metodikos 2.4.1. Mėginių paruošimas
Standartinio mėginios paruošimas
Analitinėmis svarstyklėmis atsisveriama 2,0 mg (tikslus svėrinys) 10-HDA standarto ir
tirpinama 1 ml metanolio tirpalo, gauta tirpalo koncentracija 2,0 mg/ml.
Tiriamųjų mėginių paruošimas
Tiriamieji tirpalai buvo paruošti naudojant du skirtingus ekstrakcijos metodus. Pirmuoju ekstrakcijos metodu buvo ruošiami ekstraktai iš liofilizuotų tablečių. Dvi „APILAKAS 70“ tabletės perkialiamos į grūstuvę ir susmulkinamos iki vienalytės masės. Gautų miltelių masė pasveriama, vidutinė 2 tablečių masė yra 0,93655 g, kuriose yra 140 mg liofilizuoto bičių pienelio. Milteliai perkeliami į 10 ml matavimo kolbą ir pilama 6 ml metanolio. Gauta suspensija dedama į ultragarso vonelę 15min. Tada įgautą suspensiją pilama metanolio iki 10 ml ribos. Gautas ekstraktas centrifuguojamas 5 min ir filtruojamas pro sudrėkintą išgrynintu vandeniu popierinį filtrą. Likęs tirpiklis pašalinamas dţiovinant azoto srove, tada gautas sausas likutis tirpinamas 200 µl metanolio.
Antrasis ekstrakcijos metodas buvo naudojamas kapsulių ir ţaliavos ekstrakcijai. 2
„APITONIN“ kapsulių turinys perkialiamos į grūstuvę ir susmulkinamos iki vienalytės masės. Gautų miltelių masė pasveriama, vidutinė dviejų kapsulių masė yra 0,52905 g, kuriose yra 120 mg liofilizuoto bičių pienelio. Milteliai perkeliami į kolbą, pilama 15 ml dietiletrio ir nuolat maišoma 15 minučių. Po to netirpi medţiaga ekstrahuojama metanoliu (3 x 15 ml). Kiekvieno ekstrakcijos ciklo trukmė kambario temperatūroje buvo 15 min. Gautas ekstraktas filtruojamas per popieriaus filtrą, likęs tirpiklis pašalinamas dţiovinant azoto srove. Gautas sausas likutis tirpinamas 200 µl metanolio.
Tiriamasis ţaliavos tirpalas buvo paruoštas naudojant tą pačią metodologiją, kuri buvo naudojama kapsulių ekstrakcijai. Natūralaus bičių pienelio masė panaudota tyrime buvo 0,5188 g.
Šiais ekstrakcijos būdais gauti tiriamieji mėginiai buvo analizuojami ESC ir efektyviosios plonasluoksnės skysčių chromatografijos metodais. Tačiau norint 10-HDA nustatyti dujų chromatografijos metodu, bandinių paruošimui buvo panaudota derivatizacijos reakcija. Derivatizacijai naudota 100 µl piridino, 50 µl MTBSTFA ir 200 µl bandinio. Mėginiai šildomi 100°C 4 val. Po reakcijos gauti tiriamieji tirpalai analizuojami dujų chromatografijos aparatu su masių spektrometru.
2.4.2. 10-HDA kokybinis ir kiekybinis įvertinimas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Tiriamajame darbe 10-HDA kokybinė ir kiekybinė analizė buvo atlikta naudojantis Waters
2695 chromatografijos sistema (Waters, Milford,USA) su diodų matricos detektoriumi Waters 996,
taikant laboratorijoje įdiegtą ir validuotą metodiką. Tiriamosios medţiagos analizinei buvo taikomas
mobilios fazės gradientinis kitimas, dviejų eliuentų sistema, kurioje eliuntas A – 0,1 proc. TFA, o
eliuntas B – acetonitrilas. Šis linijinis gradientis kitimas pavaizduotas 7 lentelėje. Informacija buvo
surinkta ir analizuojama naudojantis kompiuteriu ir Empower 3 chromatographic valdymo sistemą
(Waters Corporation, Milford, USA).
7 lentelė. ESC mobilios fazės gradientinis kitimas Laikas (min.) 0,1 proc. Trifluoracto r.
(proc.)
Acetonitrilas (proc.)
0 95 5
20 25 75
21 95 5
28 95 5
Chromatografinei analizei taikytos sąlygos:
• Kolonėlė – ACE C18 (250 x 4,6 mm);
• Judri fazė – A: 0,1 proc. trifluoracto r., B: acetonitrilas;
• Injekcijos tūris – 10 µl;
• Tėkmės greitis – 1 ml/min;
• Kolonėlės temperatūra – 25 °C;
• Detekcija – 210 nm šviesos bangos ilgis.
2.4.3. 10-HDA kokybinis įvertinimas efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos metodu
10-HDA analizė buvo atlikta naudojant efektyviosios pluonasluoksnės chromatografijos metodą, mėginius uţnešus ant silikagelio chromatografinės plokštelės (HPTLC Silica gel 60 F 254).
Mėginių uţnešimui ant plokštelės buvo naudojamas pusiau automatinis mėginių uţnešiklis CAMAG Linomat 5, uţneštų mėginių tūris – 5 µl, uţnešimo vietose ant pradinės linijos matomos brūkšnelio formos dėmės.
Chromatografinė plokštelė dedama į CAMAG Twin trough Chamber 10x10 kamerą, uţpildytą mobilia faze, kuri sudaryta iš chloroformo: metanolio: vandens (65:35:7). Tirpiklių sistemai pakilus iki nurodytos ribos – 7 cm, plokštelė yra išimama iš kameros ir dţiovinama bei kelias minutes kaitinama 150˚ C ant specialios kaitlentės.
Pakaitinta plokštelė yra purškiama 5% kalio dichromato sieros rūgštyje tirpalu ir dedama
pakartotinai ant kaitlentės. Plokštelei atvėsus ji yra analizuojama naudojant CAMAG TLC Visualizer,
dienos šviesoje ir apšvietus UV spinduliuote ties 366 nm šviesos bangos ilgiu.
2.4.4. 10-HDA kokybinis ir kiekybinis įvertinimas dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu
10-HDA kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui buvo naudojamas dujų chromatografijos metodas su masių spektrometriniu detektoriumi Shimadzu QP2010 (Shimadzu Corporation, Japonija).
Metodo sąlygos pateiktos 8 lentelėje.
8 lentelė. Chromatografinei analizei taikytos sąlygos
Parametras Sąlygos
Kapiliarinė kolonėlė RXI-5ms (Restek Corporation), ilgis - 30 m, skersmuo - 0,25 mm, sorbento sluoksnio storis - 0,25 µm
Stacionari fazė Sudaryta iš 5% difenilo ir 95% polisiloksano Nešančios dujos Helio dujos
Injektoriaus temperatūra 260°C Injekcijos tūris 1 µL
Injekcijos tipas Srauto skirstymas 1:10 Tėkmės greitis
kolonėlėje
1,24 ml / min.
Jonų šaltinio įtampa 70 eV
Analizės metu kolonėlės temperatūra kito, ji buvo keliama palaipsniui. Gradientinis temperatūros kitimas pavaizduotas 9 lentelėje. Bendras vieno bandinio analizės laikas 40 min.
9 lentelė. DC-MS metodo gradientinis temperatūros kitimas Temperatūros kėlimo
greitis (°C/min)
Temperatūra (°C) Uţlaikymo laikas (min)
- 75 5
10 290 5
20 320 5
Organinės rūgštys buvo identifikuojamos lyginant su junginių masių spektrais, esančiais duomenų bazėje arba analizuojant masių spektre būdingus jonus. Masių spektrai buvo skenuojami tarp 35-450 m/z, skenavimo laikas – 0,2 s, sąsajos temperatūra 280 °C. Chromatogramos buvo analizuojamos Lab Solution GMSS solution Shimadzu programa. 10-HDA identifikavimas buvo atliktas NIST ir WR10 Mass spectral programa lyginant masių spektrus.
2.5. Duomenų statistinė analizė
Duomenys analizuoti, naudojantis Microsoft Office Excel 2007, winCATS 1.4.9 ir SigmaPlot
12.5, Empower 3 chromatographic valdymo sistema (Waters Corporation, Milford, USA) programas.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. 10-HDA kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Naudojant ESC metodą buvo atliktas 10-HDA, kuri buvo išskirta iš BP ţaliavos ir produktų, kurių sudėtyje yra BP, kokybinis ir kiekybinis įvertinimas metanoliniuose ekstraktuose.
10-HDA ekstrakcijai iš BP ţaliavos ir produktų, tokių kaip tabletės ir kapsulės, kuriose yra BP, panaudojome 3 skirtingus tirpiklius: metanolį, chloroformą ir etilacetatą. Standartas buvo ištirpintas kiekviename iš šių tirpiklių, geriausia smailės forma buvo gauta naudojant metanolį kaip tirpiklį, todėl metanolis buvo pasirinktas kaip tinkamiausias tirpiklis.
Norint įrodyti ESC metodo tinkamumą numatytiems rezultatams gauti, nustatinėjant 10-HDA standartinį tirpalą ir tiriamuosius tirpalus, kuriuose yra BP ţaliava ir produktai, kurių sudėtyje yra BP, yra atliekama validacija.
3.1.1. 10-HDA kokybinė analizė taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą
Pritaikant ESC metodiką 10-HDA atskyrimui ir identifikavimui, buvo atlikti tyrimai su standartiniu 10-HDA tirpalu. 10-HDA standarto tiriamojo mėginio sulaikymo laikas yra 13,513 min.
(4 pav.). Lyginant tiriamųjų tirpalų ir 10-HDA standarto tirpalo sulaikymo laikus, matoma, kad sulaikymo laikai yra labai panašūs (10 lentelė). Skirtumas tarp tablečių tiriamojo tirpalo ir standarto tiriamojo tirpalo yra 2 s, tarp kapsulių tiriamojo tirpalo ir standarto tiriamojo tirpalo yra 11 s, o tarp BP ţaliavos ir standarto tiriamojo tirpalo yra 5 s (10 lentelė). Taip pat buvo analizuojamas mėginys, kuriame buvo tik tirpiklis, šio mėginio chromatogrmojame nebuvo aptikta jokių smailių, kurios turėjo tą patį sulaikymo laiką kaip standartinis 10-HDA tirpalas. Kadangi standarto ir tiriamųjų tirpalų smailių sulaikymo laikai sutampa, o tirpiklyje nebuvo aptikta jokių smailių, kurios turėjo tą patį sulaikymo laiką kaip standartinis 10-HDA tirpalas, todėl galima daryti išvadą, kad tiriamuosiuose mėginiuose yra 10-HDA ir pasirinktos ESC metodo sąlygos yra tinkamos 10-HDA identifikavimui.
10 lentelė. Tiriamųjų tirpalų sulaikymo laikai
Tiriamasis tirpalas Sulaikymo laikas (min) Nuokrypis
1 2 3
Standartas 13,51
1 2 3
Tabletės 13,53 0,31
Kapsulės 13,40 0,86
BP ţaliava 13,46 0,47
4 pav. 10-HDA standarto tirpalo chromatograma. Sulaikymo laikas (tR=13,513 min)
3.1.2. 10-HDA kiekybinė analizė taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.
Atliekant 10-HDA kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyta, kad vidutinis kiekis 10-HDA bičių pienelio ţaliavoje yra 0,93%, vienoje kapsulėse - 0,71 mg, vienoje tabletėje – 1,5 mg .
3.1.3. Metodo validacija
Validacija įrodoma, kad ESC metodas yra tinkamas numatytiems rezultatams gauti. ESC metodo validacija atlikta naudojant standartinį 10-HDA tirpalą. Buvo tirti šie validacijos parametrai:
Specifiškumas;
Tiesiškumas
Pakartojamumas;
Tarpinis preciziškumas.
Chromatografinio metodo specifiškumo tyrimas atliekamas atskiriant analitę iš kitų galimų komponentų, pvz., priemaišų, pagalbinių medţiagų. Specifiškumas įrodytas palyginus 10-HDA standarto (1 pav.) ir tiriamųjų mėginių chromatogramas, t.y smailių sulaikymo laikus (10 lentelė) bei analizuojamo mėginio, kuriame buvo tik tirpiklis, chromatogramoje nebuvo aptikta smailių, turinčių tą patį sulaikymo laiką kaip standartinis tirpalas. Todėl galima teigti, kad specifiškumas tenkina reikalavimus 10-HDA analizei.
Metodo tiesiškumas yra jo gebėjimas gauti bandymo rezultatus, kurie yra tiesiogiai proporcingi mėginio koncentracijai tam tikrame intervale. ESC metodams nustatomas tiesinis santykis tarp detektoriaus atsako (smailės ploto ir aukščio) ir mėginio koncentracijos. Tiesiškumas buvo įvertintas naudojant kalibracinę kreivę (5 pav.). 10-HDA standarto kalibracinis grafikas buvo nubrėţtas 4,08-261,00 μg/ml ribose, koreliacijos koeficientas buvo 0,9996 (11 lentelė).
5pav.10-HDA standarto kalibracinė kreivė
11 lentelė. 10-HDA standarto kalibracinės kreivės charakteristika
Preparatas Koncentracijos Regresijos lygtis Koreliacijos
koeficientas R
210-HDA 4,08-261,00 μg/ml y = 3,36∙10
4x – 1,01∙10
50,9996
Tyrimų metu buvo sudaryta kalibracinės kreivės grafikas, kurio lygtis yra tiesinė. 10-HDA
standarto koreliacijos koeficiento reikšmė yra artima 1, todėl galima teigti, kad tiesiškumas tenkina
reikalavimus 10-HDA analizei.
Analizės metodo preciziškumas arba rezultatų glaudumas nustatomas atlikus matavimų seriją su tuo pačiu tiriamuoju mėginiu ir tomis pačiomis sąlygomis. Nustatinėjant preciziškumą buvo vertinami pakartojamumas, tarpinis preciziškumas.
Pakartojamumas parodo rezultatų tikslumą, analizė yra atliekama tą pačią dieną, penkis kartus iš eilės, o tarpinis preciziškumas yra įvertinimas analizuojant tuos pačius tiriamuosius tirpalus 2 dienas iš eilės po 5 kartus. Iš gautų rezultatų yra apskaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis sulaikymo laikui (12 lentelė). SSN sulaikymo laikui vertė atliekant kiekybinį tyrimą turėtų neviršyti nustatytos ribos (≤5 proc.), o tarpinis preciziškumas neviršyti nustatytos ≤10 proc. ribos.
12 lentelė. Metodikos rezultatų glaudumo įvertinimas
Preparatas Pakartojamumas, SSN sulaikymolaikui (proc.)
Tarpinis preciziškumas, SSN sulaikymo laikui (proc.)
Standartas 0,12 0,26
Tabletės 0,35 0,52
Kapsulės 0,99 1,18
BP ţaliava 0,68 0,92
6 pav. Pakartotinų 10-HDA standarto injekcijų chromatogramos
Iš gautų analizės rezultatų matyti, kad pakartojamumas SSN sulaikymo laikui maţai skiriasi kaip ir tarpinis preciziškumas SSN sulaikymo laikui. Pakartojamumas SSN sulaikymo laikui svyruoja nuo 0,12-0,99%, tačiau neviršija 5% ribos (12 lentelė). O tarpinis preciziškumas SSN sulaikymo laikui svyruoja nuo 0,26-1,18%, tačiau neviršija 10% ribos (12 lentelė), dėl to galime teigti, kad tiesiškumas ir tarpinis preciziškumas tenkina reikalavimus 10-HDA analizei.
Visi rezultatai, kurie gauti vertinant validacijos parametrus tenkino reikalavimus 10-HDA analizei. Todėl galima teigti, kad norint identifikuoti bei kiekybiškai nustatyti 10-HDA galima naudoti ESC metodiką.
3.2. 10-HDA kokybinė analizė taikant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą
Pritaikant DC - MS metodiką 10-HDA atskyrimui ir identifikavimui, pirmiausia tyrimai buvo atliekami su standartiniu tirpalu. 10-HDA standartinio mėginio sulaikymo laikas yra 16,95 min.
(7 pav.). Lyginant tablečių tirimojo tirpalo ir standartinio 10-HDA tirpalo sulaikymo laikus, matoma, kad sulaikymo laikai yra panašūs, skirtumas yra 4 s (13 lentelė). Taip pat, panašūs rezultatai gauti lyginant kapsulių tiriamojo tirpalo ir standartinio 10-HDA sulaikymo laikus, skirtumas yra 15 s (13 lentelė). Sulaikymo laikų skirtumas tarp BP ţaliavos ir 10-HDA standarto tipalo yra 7 s (13 lentelė).
Kadangi, standarto ir tiriamųjų tirpalų smailių sulaikymo laikai sutampa, galima daryti išvadą, kad tiriamuosiuose mėginiuose yra 10-HDA ir šios pasirinktos dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodo sąlygos yra tinkamos 10-HDA identifikavimui.
7 pav. 10-HDA standarto tirpalo chromatograma. Sulaikymo laikas (tR=16,95 min)
10-HDA
13 lentelė. Tiriamųjų tirpalų sulaikymo laikai
Tiriamasis tirpalas Sulaikymo laikas (min) Nuokrypis
Standartas 16,95
Tabletės 16,99 0,24
Kapsulės 16,80 0,89
BP ţaliava 16,88 0,41
Taip pat norėdami identifikuoti 10-HDA tyrimo metu naudojome masių spektrą, gauti rezultatai atitiko bibliotekoje turimą masių spektrą, kurio dėka galime dar tiksliau identifikuoti 10- HDA tiriamuosiuose tirpaluose (8 pav.).
8 pav. 10-HDA etaloninio tirpalo masių spektrai
Buvo nustatyti 10-HDA molekulinių jonų masių ir krūvių santykiai-tiriamuosiuose tirpaluose (m/z), kurie nurodyti 14 lentelėje.
14 lentelė. 10-HDA molekulinių jonų masių ir krūvių santykiai m/z aukščiausia
viršūnė
41 m/z antra aukščiausia
viršūnė
55 m/z trečia aukščiausia
viršūnė
81
Nustatant metodikos rezultatų glaudumą, vertinti buvo pakartojamumus ir tarpinis
preciziškumas. Iš gautų rezultatų yra apskaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis sulaikymo
laikui (15 lentelė). SSN sulaikymo laikui vertė atliekant kiekybinį tyrimą turėtų neviršyti nustatytos
ribos (≤5 proc.), o tarpinis preciziškumas neviršyti nustatytos ≤10 proc. ribos.
15 lentelė. Metodikos rezultatų glaudumo įvertinimas
Preparatas Pakartojamumas, SSN sulaikymolaikui (proc.)
Tarpinis preciziškumas, SSN sulaikymo laikui (proc.)
Standartas 0,10 0,23
Tabletės 0,37 0,43
Kapsulės 0,95 1,12
BP ţaliava 0,61 0,83
