FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
MINDAUGAS LIAUDANSKAS
VACCINIUM ULIGINOSUM L. VAISIŲ ANTOCIANINŲ KIEKYBINĖS
SUDĖTIES IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai
Asistentas Raimondas Raudonis Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
VACCINIUM ULIGINOSUM L. VAISIŲ ANTOCIANINŲ KIEKYBINĖS
SUDĖTIES IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai
Asistentas Raimondas Raudonis Prof. habil.dr. Valdimaras Janulis
Recenzentas Darbą atliko
Dr. Deividas Burdulis Magistrantas Mindaugas Liaudanskas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 1. SANTRUMPOS ... 7 2. ĮVADAS ... 8 3. LITERATŪROS APŢVALGA ... 103.1. Vaivorų (Vaccinium uliginosum L.) apibūdinimas, biologinės savybės ir cheminė sudėtis ... 10
3.1.1.Vaivorų morfologiniai poţymiai ir paplitimas ... 10
3.1.2. Vaivorų vaisių cheminė sudėtis ... 11
3.1.3. Panaudojimas medicinoje ... 12
3.2. Antocianinai... 13
3.2.1. Bendra apţvalga ir paplitimas augaliniame pasaulyje ... 13
3.2.2. Struktūros ypatumai ... 14
3.2.3. Fiziko-cheminės savybės ... 16
3.2.4. Farmakokinetika ir metabolizmas ... 17
3.2.5. Poveikis ţmogaus organizmui ... 18
3.3. Biologinė oksidacija ir antioksidacinio aktyvumo vertinimo metodai ... 21
4. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ... 25
4.1. Tyrimų objektas ... 25
4.2. Medţiagos ir reagentai ... 26
4.3. Naudota aparatūra ... 26
4.4. Tyrimų metodai ... 26
5. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
5.1.Vaivorų vaisių antocianinų ekstrakcijos metodo optimizavimas ... 31
5.2. Suminio antocianinų kiekio įvairavimas vaivorų vaisiuose, vaisių išspaudose ir sultyse ... 35
5.2.1. Antocianinų kiekio įvairavimas vaisių nokimo metu ... 35
5.2.2. Antocianinų kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse surinktuose vaivorų vaisiuose ... 38
5.3. Suminio proantocianidinų kiekio įvairavimas vaivorų vaisiuose, vaisių išspaudose ir sultyse .. 40
5.3.1. Proantocianidinų kiekio įvairavimas vaisių nokimo metu ... 40
5.4. V. uliginosum L. vaisių, išspaudų ir sulčių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo vertinimas ... 44 5.4.1. V. uliginosum L. vaisių, surinktų skirtingu nokimo metu, antioksidacinio aktyvumo
vertinimas ... 44 5.4.2. V. uliginosum L. vaisių, surinktų skirtingose augavietėse, antioksidacinio aktyvumo
SANTRAUKA
Raktiniai ţodţiai: Vaccinium uliginosum L., vaivorai, antocianinai, proantocianidinai,
spektrofotometrija.
Tyrimo objektas ir metodai: vaivorų (Vaccinium uliginosum L.) vaisių antocianinų
kiekybinės sudėties ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas ABTS, CuPRAC, DPPH, FRAP, TFPH spektrofotometriniais metodais.
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliose augavietėse augančių vaivorų (Vaccinium uliginosum L.) vaisių, jų išspaudų ir sulčių antocianinų ir proantocianidinų kiekybinę sudėtį, jos
įvairavimą bei įvertinti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai: optimizuoti antocianinų ekstrakcijos sąlygas iš augalinės ţaliavos-vaivorų
vaisių. Nustatyti vaivorų vaisių, jų išspaudų ir sulčių antocianinų ir proantocianidinų kiekybinę sudėtį bei jos rodiklių kitimo dinamiką vaisių nokimo metu. Ištirti natūraliose augavietėse surinktų vaivorų vaisių ėminių, jų išspaudų bei sulčių antocianinų ir proantocianidinų kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą. Nustatyti vaivorų vaisių, jų išspaudų ir sulčių etanolinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti koreliacinį ryšį tarp kiekybinės antocianinų bei proantocianinų sudėties ir antioksidacinio aktyvumo.
Išvados: optimalios vaivorų vaisių antocianinų ekstrakcijos sąlygos – ekstrahuojama
SUMMARY
Key words: Vaccinium uliginosum L., bog bilberry, anthocyanins, proanthocyanidins,
spectrophotometry.
Object and methods: quantitative analysis of anthocyanins in bog bilberry (Vaccinium uliginosum L.) fruits and evaluation of antioxidant activity. Antioxidant activity was assessed by
ABTS, CuPRAC, DPPH, FRAP, TFPH spectrophotometric methods.
Aim: to investigate quantitative composition and its variance of anthocyanins and
proanthocyanidins in fruits, fruit pomace and juice of bog bilberry (Vaccinium uliginosum L.) handpicked in natural populations in Lithuania and assess antioxidant activity of extracts.
Objective: to optimize extraction of anthocyanins from bog bilberry fruits. Evaluate
quantitative composition of anthocyanins and proanthocyanidins in bog bilberry fruits, fruit pomace and juice and its dynamic changes during fruit ripening. Evaluate anthocyanins and proanthocyanidins quantitative composition and its variation in fruit samples, fruit pomace and juice of bog bilberry handpicked in different locations. Determine antioxidant activity of bog bilberry fruit, fruit pomace and juice ethanol extracts. Evaluate correlation between quantity of anthocyanins and proanthocyanidins and antioxidant activity.
Results: optimal extraction conditions of anthocyanins from bog bilberry fruits – modified
1. SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); AP-1 – transkripcijos aktyvatorius proteinas 1;CuPRAC – vario jonų redukcijos antioksidacinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant capacity);
DMCA – 4-dimetilaminocinamaldehidas; DNR – deoksiribonukleorūgštis;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;
FRAP – geleţies redukcijos antioksidacinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power); MMP – matrikso metaloproteinazės;
TEAC – trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity); TFPH – 2,4,6-tri (2-piridil)-1,3,5-triazinas;
2. ĮVADAS
Vaistiniai augalai – patys pirmieji vaistai, medicinoje vartojami nuo neatmenamų laikų. Augaliniai vaistiniai preparatai sukelia maţiau šalutinių poveikių, tad jų vartojimas kelia vis didesnį pacientų, vaistininkų, gydytojų ir mokslininkų susidomėjimą. Siekiant racionalaus vaistinių preparatų vartojimo, svarbu nustatyti vaistinėje augalinėje ţaliavoje sukauptų biologiškai aktyvių junginių kiekius ir pagrįsti jų farmakologinį poveikį. Moksliniais tyrimų metodais įvertinus augalinės ţaliavos kokybinius ir kiekybinius parametrus, galima uţtikrinti augalinių preparatų saugumą ir efektyvumą.
Vaivoras (Vaccinium uligonosum L.) priklauso erikinių (Ericaceae) šeimai [40]. Viena iš vaivorų vaisiuose esančių biologiškai aktyvių junginių grupių – antocianinai [53]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad jie pasiţymi antioksidaciniu [5, 56], priešuţdegiminu [33], širdies ir kraujagyslių sistemos funkcijas gerinančiu [56], priešvėţiniu [78], priešopiniu poveikiu [82]. Taip pat vaivorų vaisiai yra geras vitaminų bei mikro- ir makroelementų šaltinis [53]. Juose yra nemaţai askorbo rūgšties, kuri sustiprina antocianinų ir kitų polifenolinių junginių antioksidacinį poveikį, dalyvauja įvairių medţiagų metabolizme, yra svarbi imuninei sistemai [64]. Vaivorų vaisiuose gana daug kalio, mangano ir fosforo junginių, teigimai veikiančių širdies ir kraujagyslių sistemos veiklą [53].
Vaivoras – Lietuvos teritorijoje gana paplitęs augalas, tačiau vaivorų vaisiai, kaip vietinė augalinė ţaliava, kol kas maţai tyrinėti. Šiame magistro darbe įvertinti vaivorų vaisių antocianinų ir proantocianidinų kaupimosi dėsningumai, nustatyta vaivorų vaisių, jų išspaudų ir sulčių antocianinų bei proantocianidinų kiekybinė sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas.
Maisto pramonėje įvairių produktų gamybos metu daţnai atskiriamos vaisių išspaudos ir sultys. Išsiaiškinus vaivorų vaisių išspaudose ir sultyse sukauptų antocianinų ir proantocianidinų kiekius bei antioksidacinį aktyvumą, galima spręsti apie jų potencialų panaudojimą maisto papildų ir vaistinių preparatų gamyboje.
Darbo tikslas – ištirti Lietuvoje natūraliose augavietėse augančių vaivorų (Vaccinium uliginosum L.) vaisių, jų išspaudų ir sulčių antocianinų ir proantocianidinų kiekybinę sudėtį, jos
įvairavimą bei įvertinti ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai:
1) Optimizuoti antocianinų ekstrakcijos sąlygas iš augalinės ţaliavos – vaivorų vaisių.
3) Ištirti ir palyginti natūraliose augavietėse surinktų vaivorų vaisių, iš jų gautų išspaudų bei sulčių antocianinų ir proantocianidinų kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą.
4) Nustatyti Lietuvoje natūraliai augančių vaivorų vaisių, jų išspaudų ir sulčių etanolinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS, DPPH, FRAP, CuPRAC ir TFPH spektrofometriniais metodais.
3. LITERATŪROS APŢVALGA
3.1. Vaivorų (Vaccinium uliginosum L.) apibūdinimas, biologinės savybės ir
cheminė sudėtis
Karalystė: Augalai (Plantae)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Dilenijaţiedţiai (Dilleniidae) Šeima: Erikiniai (Ericaceae)
Gentis: Šilauogė (Vaccinium)
Rūšis: Vaivoras (Vaccinium uliginosum L.)
3.1.1.Vaivorų morfologiniai poţymiai ir paplitimas
Vaivoras (lot. Vaccinium uliginosum L. ) – erikinių (Ericaceae) šeimos augalas (1 pav.). Pagal dabartinę klasifikaciją vaivoriai priklauso šilauogės (Vaccinium L.) genčiai [40].
1 pav. Vaivorai (Vaccinium uliginosum L.), jų žiedai ir vaisiai
ţalios, neţymiai plaukuotos. Lapai paprastai 6-25 (35) mm ilgio ir 4-12 (20) mm pločio, storoki, odiški, ovališkai pailgi, atvirkščiai kiaušiniški arba elipsiški, lygiakraščiai, trumpakočiai, pliki, nusmailėjusia viršūne, smulkiai dantytais kraštais, numetami kiekvienais metais. Jų apatinė pusė ryškiai gyslota. Skirtingai nuo mėlynių, kurių lapai abipus ţali, vaivorų viršutinė lapo pusė tamsiai ţalia, o apatinė – melsvai ţalia [40].
Vaivoras praţysta geguţės pabaigoje ir ţydi iki birţelio vidurio, o pavienių ţiedų galima rasti ir vėliau. Ţiedai dvilyčiai, 4 – 6 mm ilgio, lapų paţastyse, daţniausiai pavieniai, kartais susitelkę į kekę iki 4 ţiedų, nusvirę, varpelio formos arba rutuliški, balti arba blyškiai rausvi, išauga ant trumpų kotelių. Taurelė priaugusi prie mezginės, vos įţiūrima. Piestelė aukštesnė uţ kuokelių dulkines. Kuokeliai 8 (10). Dulkinės be ragelių. Vaininklapiai daţniausiai 5. Vainikėlis baltas ar balsvai rausvo atspalvio, suaugtinis, rutuliškas, pūstas, išlikusi viršūninė anga su trumpomis, bukomis skiautėmis. Taurėlapiai keturi arba penki, trumpi, platūs, bukaviršūniai [40].
Vaisius – pailgai rutuliška, 5 – 8 mm skersmens, tamsiai arba šviesiai mėlyna, daugiasėklė, plona luobele uoga, daţniausiai su balsva apnaša. Brendimo pradţioje vaisiai būna ţalsvos spalvos, brendimo viduryje – rausvos, roţinės spalvos, o brendimo pabaigoje įgauna tamsiai arba šviesiai mėlyną spalvą. Prinoksta liepos – rugsėjo mėnesiais, priklausomai nuo klimatinių sąlygų. Vaisiai valgomi, sultingi, malonaus saldţiarūgščio skonio. Jų apatinėje dalyje yra rumbas, kartais – ir ţiedkočio fragmentas. Mėsingas minkštimas turi daug smulkių, ovalių, 1,3 -1,7 mm dydţio tamsiai rudų sėklų [40].
Dauginasi sėklomis ir atlankomis [40]. Daţniausiai auga drėgnuose, rūgščiuose, jauriniuose dirvoţemiuose, durpynuose, raistuose, aukštapelkėse ar tarpinio tipo pelkėse, pelkių pakraščiuose, pelkėjančiuose miškuose – pušynuose, rečiau mišriuose spygliuočių miškuose, kartais šlapiuose berţynuose [3]. Sudaro sąţalynus – vienas ar su kitais krūmokšniais. Šviesiamėgis augalas [40].
3.1.2. Vaivorų vaisių cheminė sudėtis
Mokslinėje literatūroje aprašyta, kad švieţiuose vaivorų vaisiuose vidutiniškai nustatyta 0,194 proc. antocianinų, išdţiovintoje ţaliavoje – 1,425 proc. Vaivorų vaisuose nustatyti delfinidino, cianidino, petunidino, peonidino ir malvidino glikozidai: galaktozidas, delfinidin-3-O-gliukozidas, delfinidin-3-O-arabinozidas, delfinidin-3-O-ksilozidas, cianidin-3-O-galaktozidas, cianidin-3-O-gliukozidas, cianidin-3-O-arabinozidas, cianidin-3-O-ksilozidas, petunidin-3-O-arabinozidas, petunidin-3-O-galaktozidas, petunidin-3-O-gliukozidas, petunidin-3-O-ksilozidas, galaktozidas, gliukozidas, arabinozidas, malvidin-3-O-ksilozidas, peonidin-3-O-gliukozidas, peonidin-3-O-galaktozidas, peonidin-3-O-arabinozidas, peonidin-3-O-ksilozidas [53].
Švieţiuose vaivorų vaisiuose nustatyta 0,154 proc. flavonolių , sausoje ţaliavoje –1,133 proc. Išskirti ir identifikuoti šie junginiai: 3-O-galaktozidas, 3-O-gliukozidas, miricetin-3-O-gliukuronidas, miricetin-3-O-arabinozidas, kvercetin-3-O-galaktozidas, kvercetin-3-O-gliukozidas, kvercetin-3-O-gliukuronidas, kvercetin-3-O-arabinozidas, laricitrin-3-O-galaktozidas, laricitrin-3-O-gliukozidas, laricitrin-3-O-gliukuronidas, laricitrin-3-O-arabinozidas, kempferol-3-O-heksozidas, izoramnetin-3-O-galaktozidas, izoramnetin-3-O-gliukozidas, izoramnetin-3-O-gliukuronidas, izoramnetin-3-O-arabinozidas, siringetin-3-O-galaktozidas, siringetin-3-O- gliukozidas, siringetin-3-O-arabinozidas) [53].
Vaisuose taip pat nustatyta proantocianidinų, 6,5 proc. angliavandenių, iki 1 proc. organinių rūgščių (obuolių, citrinų, benzoinės rūgšties ir kt.), pektinų, β-karoteno, askorbo rūgšties (iki 0,0262 proc.), tiamino, nikotinamido, mineralinių medţiagų (geleţies, kalcio, fosforo, kalio, mangano, cinko, vario ir kt) [25, 53].
3.1.3. Panaudojimas medicinoje
Vaivorų vaisiai buvo plačiai naudoti Šiaurės Amerikos indėnų ir eskimų genčių, šiaurės ir vidurio Europos bei šiaurės Azijos tautų medicinėje praktikoje [25, 57]. Lietuvių liaudies medicinoje ši vaistinė augalinė ţaliava taip pat buvo naudojama.
nerimas, akių nuovargis ir perštėjimas. Švieţi vaisiai vartoti skorbuto profilaktikai ir gydymui. Švieţios sultys arba vaivorų vaisių nuoviras buvo duodamas karščiuojantiems ligoniams. Vaivorų vaisiai naudoti ne tik kaip vienkomponentis vaistas, bet įėjo į įvairių sudėtinių vaistaţolinių vaistų (nuovirų, arbatų) sudėtį [25, 57, 62].
Šiuolaikinėje medicinoje vaivorų vaisių farmakologinis poveikis siejamas su jų veikliųjų medţiagų – antocianinų poveikiu ţmogaus organizmui. Antocianinai pasiţymi plačiu biologiniu veikimu – suriša laisvuosius radikalus [33, 51], stabiziuoja kolageną [5], maţina kapiliarų laidumą [56], gerina širdies ir kraujagyslių sistemos darbą [82], maţina gliukozės kiekį kraujyje [27, 71], apsaugo nuo diabetinės retinopatijos [27], stabdo geltonosios dėmės degeneraciją [48], pasiţymi priešuţdegiminiu [33], priešvėţiniu [78], priešopiniu ir Helicobacter pylori slopinančiu poveikiu [51, 82]. Vaivorų vaisiai turi nemaţai mineralinių medţiagų bei vitaminų, ypač vitamino C, todėl yra gera priemonė avitaminozių ir hipovitaminozių profilaktikai bei gydymui [25, 53]. Maisto pramonėje vaivorų vaisiai naudojami dţemų, ţelių, likerių gamyboje. Taip pat iš jų galima virti uogienes, kompotus, gaminti vyną, gaiviuosius gėrimus [53, 62].
Vaivorų vaisiai yra antocianinais turtinga ţaliava, todėl tikslinga atlikti jų sudėties tyrimus. Dėl savo farmakologinių poveikių jie gali būti panaudoti maisto papildų ir vaistinių preparatų gamyboje. Vaivoras – Lietuvoje gana daţnas augalas, todėl vertėtų nustatyti perserpektyvias cenopopuliacijas augalinės ţaliavos paruošoms vykdyti.
3.2. Antocianinai
3.2.1. Bendra apţvalga ir paplitimas augaliniame pasaulyje
Antocianinai yra augalų pasaulyje plačiai paplitę natūralūs pigmentai. Tai didţiausia flavonoidų grupė. Antocianinai aptinkami tik sausumoje augančiuose augaluose. Tikėtina, kad, vykstant evoliucijai, antocianinų biosintezė atsirado sausumos augalams prisitaikant prie intensyvios ultravioletinės spinduliuotės. Antocianinai randami daugumoje gaubtasėklių augalų. Samanose, sporiniuose induočiuose, plikasėkliuose sutinkami rečiau [30, 60].
randama erškėtinių (Rosaceae), vynmedinių (Vitaceae) ir erikinių (Ericaceae) šeimų augalų vaisiuose – vynuogėse (Vitis vinifera L.), slyvose (Prunus), vyšniose (Prunus cerasus L.), braškėse (Fragaria
ananassa L.), avietėse (Rubus), mėlynėse (Vaccinium myrthilius L.), šilauogėse (Vaccinium
corymbosum L.), vaivoruose (Vaccinium uliginosum L.). Juos kaupia ir kitų šeimų augalai – baklaţanai
(Solanum melongena L.), juodieji serbentai (Ribes nigrum L.), raudonieji kopūstai (Brassica oleracea
var. capitata f. rubra) [4, 18].
Antocianinų biosintezė vyksta ląstelės membranoje. Šviesa, jos intensyvumas, bangos ilgis yra vieni iš pagrindinių veiksnių, lemiančių antocianinų biosintezę augaluose. Didelės įtakos antocianinų susidarymui turi temperatūra, vandens, angliavandenių, makro- ir mikro- elementų kiekiai augalo augimo metu [33, 71]. Antocianinų biosintezė gali sutrikti ar net visai sustoti įvykus DNR genetinio kodo paţaidoms [60]. Susintetinti antocianinai pernešami į epidermio ląstelių vakuoles, kuriose jie kaupiami [18].
Antocianinai suteikia augalų organams įvairius atspalvius ir spalvas, todėl jie atlieka svarbų vaidmenį priviliojant vabzdţius, kurie dalyvauja augalų apdulkinime [18]. Antocianinai apsaugo augalų organus nuo ţalingo UV spinduliuotės poveikio [4], dalyvauja augalui prisitaikant prie nepalankių aplinkos sąlygų (šalčio, sausros, oksidacinio streso ir pan.) [29, 59], kai kurie antocianinai dėl savo nemalonaus skonio atbaido ţolėdţius gyvūnus [73].
3.2.2. Struktūros ypatumai
2 pav. Antocianidinų bendroji struktūrinė formulė
Daţniausiai augaluose aptinkami šeši pagrindiniai antocianidinai: delfinidinas, cianidinas, petunidinas, malvidinas, peonidinas ir pelargonidinas (3 pav.). Jie sudaro daugumos ţinomų antocianidinų struktūros pagrindą. [4, 73]
Pelargoninas Cianidinas Peonidinas
Delfinidinas Malvidinas Petunidinas
3 pav. Dažniausiai gamtoje sutinkami antocianidinai
nėra nustatyta [4]. Monoglikozidų molekulėse cukrinė dalis su aglikonu jungiasi per C3 padėtyje esančią hidroksilo grupę O–glikozidine jungtimi. Daţniausiai antocianinų molekulėje nustatomi cukrūs: gliukozė, galaktozė, arabinozė, ksilozė, ramnozė, rečiau – gliukurono rūgštis. Susidarant diglikozidams, cukraus molekulės jungiasi per C3 ir C5 ar C5 ir C7 padėtyse esančias hidroksilo grupes. Triglikozidus sudaro C3 padėtyje esanti linijiška ar šakota trijų cukrų grandinė, taip pat monosacharidų molekulės gali prisijungti 3´-, 4´- ir 5´- padėtyse [4, 18]
Augaluose daţnai sutinkami acilinti antocianinai. Aciliniai pakaitai gali būti monosacharido molekulėje 2, 3, 4 padėtyse. Antocianinų molekulės sudėtyje nustatytos fenolinės rūgštys (p-kumaro, p-hidroksibenzoinė, kavos, ferulo, sinapo ir galo rūgštys). Taip pat gali būti prisijungusių ir alifatinių rūgščių – acto, obuolių, malono, oksalo ir gintaro rūgštys [18, 43].
3.2.3. Fiziko-cheminės savybės
3.2.4. Farmakokinetika ir metabolizmas
Antocianidinai yra hidrofobinės molekulės. Dėl šios prieţasties jie laisvai difunduoja į ląstelės vidų per plazminę membraną. Susijungimas su cukraus molekulėmis įtakoja jų biologines savybes, lemia pernašos būdus, patekimą į sisteminę kraujotaką [6]. Antocianinų tirpumas vandenyje didesnis, o tai riboja pasyviąją pernašą [5, 22].
Antocianinų patekimo į sisteminę kraujotaką mechanizmas dar nėra tiksliai nustatytas. Manoma, kad jų absorbcijai reikalingas specifinis aktyviosios pernašos mechanizmas (pvz.: natrio – gliukozės simportas) arba jie turi būti hidrolizuoti [22]. Didţiausia antocianinų koncentracija, vartojant peroraliai, ţmogaus kraujo plazmoje buvo nustatyta po 1,5-2,8 val. Vėliau ji laipsniškai maţėja [47].
Dalis antocianinų absorbuojama skrandyje, tačiau atlikti moksliniai tyrimai leidţia teigti, jog jų struktūra skrandyje nekinta, nes antocianinai išlieka stabilūs rūgščioje skrandţio terpėje [30]. Didţiausi kiekiai antocianinų glikozidų absorbuojama plonajame ţarnyne. Antocianinai pasiskirsto įvairiuose organuose, bet didţiausios jų koncentracijos aptinkamos virškinimo trakte, inkstuose ir smegenyse [12, 73].
Didţioji dalis sisteminėje kraujotakoje ir šlapime aptiktų metabolizuotų antocianinų nustatyti kaip metilinti arba su gliukurono bei glicino rūgštimis susijungę konjugatai. Susijungimas su gliukurono rūgštimi, susidarant gliukuronidams, yra pagrindinis antocianinių metabolizmo kelias. Antrasis antocianinų metabolizmo kelias yra metilinimas. Šių darinių susidarymas daugiausia vyksta kepenyse. Jungimasis su glicino rūgštimi pasireiškia, kai į organizmą patenka nedideli kiekiai antocianinų [22].
3.2.5. Poveikis ţmogaus organizmui
Antioksidacinis poveikis. Mokslinėje literatūroje plačiai aprašytas antocianinų
antioksidacinis poveikis. Jį lemia skirtingi mechanizmai. Antocianinai veikia kaip radikalų surišėjai [79], slopina aktyviųjų deguonies formų susidarymo procesus [17, 51], apsaugo lipofilinius antioksidantus (tokoferolį ir kt.) nuo oksidacinio poveikio [28], skatina antioksidaciniu veikimu pasiţyminčių fermentų išsiskyrimą [72].
Antocianinai gali atiduoti vandenilio atomą, todėl pasiţymi antioksidaciniu poveikiu. Jie gali prisijungti azoto oksido ir peroksido radikalus [45, 79]. JAV mokslininkai W. Zheng ir S.Y. Wang tyrinėdami antocianinų molekules nustatė keletą dėsningumų. Nustatyta, kad didesnis laisvų hidroksi- grupių skaičius molekulėje lemia antioksidacinio aktyvumo didėjimą. Glikozidai maţiau aktyvūs nei atitinkami aglikonai. C ţiede esanti dviguba jungtis apsprendţia elektrono delokalizaciją molekulėje. A ir C ţieduose (C3 ir C5 padėtyse) esančios OH grupės suteikia didţiausią laisvuosius radikalus surišantį poveikį [83].
Palyginus antocianidinų antioksidacinį poveikį, pastebėta, kad skirtingus hidroksi- ir metoksi- grupių pakaitus turintys junginiai pasiţymi nevienodu antioksidaciniu aktyvumu. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas būdingas junginiams, turintiems laisvas hidroksilo grupes B ţiedo 3„ir 4„ padėtyse. Pagal antioksidacinio poveikio stiprumą surišant hidroksilo ir superoksido anijono radikalus, antocianidinus galima išdėstyti tokia tvarka: cianidinas > delfinidinas > peonidinas = petunidinas = malvidinas. Stipriausiu azoto oksido radikalus surišančiu poveikiu pasiţymėjo delfinidino glikozidai [39, 83].
Antocianinai ne tik pasiţymi laisvuosius radikalus surišančiu poveikiu, bet ir apsaugo organizmą nuo jų susidarymo. Yra išskiriami keli šio poveikio mechanizmai [17, 51, 58].
Pereinamųjų metalų (geleţies, vario) jonai dalyvauja Fentono tipo reakcijose, susidarant hidroksilo radikalams, sukeliantiems grandinines lipidų peroksidacijos reakcijas. Antocianinai sudaro chelatinius junginius su šiais jonais ir taip slopina hidroksilo radikalų formavimąsi bei stabdo lipidų peroksidacijos procesus [17, 51].
Kolageną stabilizuojantis ir kapiliarų laidumą maţinantis poveikis. Esant uţdegimui,
leukocitų išskiriami fermentai sukelia kolageno segmentaciją ir paţeidţia kapiliarų jungiamąjį audinį, sukeldami kraujo išsiliejimą į aplinkinius audinius [5, 33]. Dėl uţdegiminių procesų vyksta raiščių, kremzlių, sausgyslių jungiamojo audinio paţeidimai. Jie ypač stipriai pasireiškia sergant reumatoidiniu artritu. Kolageną stabilizuojantis poveikis palaiko raiščių, sausgyslių, kremzlių vientisumą bei skatina jų regeneraciją formuojantis naujam jungiamajam audiniui [5].
Antocianinų apsauginis poveikis paaiškinamas šiais veikimo mechanizmais: antocianinai neutralizuoja leukocitų išskirtus fermentus, ţalojančius jungiamąjį audinį [5], apsaugo jį nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio [33, 73], skatina kolageno skaidulų ir mukopolisacharidų sintezę [5], dalyvauja paţeistų kraujagyslių sienelių regeneracijos procese [56], skatina persikryţiuoti kolageno skaidulas, spartina jungiamojo audinio formavimąsi [5], pasiţymi stipriu „P vitamininiu” veikimu, dėl kurio padidina viduląstelinį vitamino C kiekį, maţina kapiliarų laidumą ir paţeidţiamumą [56].
Antocianinai maţina hematoencefalinio barjero laidumą. Padidėjęs hematoencefalinio barjero pralaidumas yra viena iš autoimuninių nervų sistemos ligų prieţasčių. Kolageną stabilizuojantis antocianinų poveikis apsaugo smegenų kapiliarų sieneles nuo ţalojančio vaistų ir kitų cheminių medţiagų veikimo. Tai lemia neuroprotekcinį antocianinų poveikį ir leidţia juos vartoti depresijos, nerimo bei kitų neurodegeneracinių ligų profilaktikai ir gydymui [24, 42].
Priešuţdegiminis poveikis. Priešuţdegiminis poveikis yra glaudţiai susijęs su kolageną
stabilizuojančiu antocianinų veikimu. Pagrindinis priešuţdegiminio poveikio mechanizmas – uţdegimo mediatorių (histamino, serino proteazių, prostaglandinų ir leukotrienų) atpalaidavimo ir sintezės slopinimas [33, 71]. Įrodyta, kad antocianinai slopina fermentus ciklooksigenazę–1 ir ciklooksigenazę–2, kurie katalizuoja prostaglandinų susidarymą iš arachidono rūgšties. Prostaglandinai, kartu su kitais uţdegimo mediatoriais, didina kapiliarų pralaidumą, sukelia alergines reakcijas ir veikia pirogeniškai. Be to, nustatyta, kad ciklooksigenazė–2 yra slopinama labiau. Tai labai svarbu priešuţdegiminei terapijai, nes selektyvesnis poveikis sukelia maţiau nepageidaujamų šalutinių efektų [5]. Eksperimentiniu tyrimu su ţiurkėmis metu nustatyta, kad antocianinai pasiţymi stipriausiu priešalerginiu poveikiu iš visų tirtų flavonoidų [16].
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Mokslinėje literatūroje aprašytas kraujagysles nuo
Gliukozės koncentraciją maţinantis kraujyje poveikis. Eksperimentiniai tyrimai su triušiais ir ţiurkėmis in vivo ir klinikiniai tyrimai parodė, kad antocianinai maţina gliukozės koncentraciją kraujyje, ypač antrojo tipo cukrinio diabeto atveju. Jie gerina gliukozės toleranciją, maţina trigliceridų koncentraciją, apsaugo kasos β ląsteles nuo oksidacinio streso poveikio [27, 73].
Kapiliarų paţeidimai dėl padidėjusios gliukozės koncentracijos kraujyje sukelia cukrinio diabeto komplikacijų: formuojasi trofinės opos, atsiranda inkstų, širdies ir smegenų kraujotakos sutikimų, vystosi diabetinė retinopatija, sukelianti aklumą [27, 56]. Kolageno baltymai susijungia su gliukozės molekulėmis, sudarydami nebūdingus kolageno fragmentus kapiliarų sienelėse. Antocianinai slopina tokių junginių susidarymo procesą ir stabdo cukrinio diabeto komplikacijų vystymąsi [71]. Šis poveikis ypač svarbus esant diabetinei retinopatijai, kuri yra viena daţniausių cukrinio diabeto komplikacijų. Antocianinų vartojimas stabdo jos progresavimą ir padeda apsaugoti ligonius nuo regos praradimo [27].
Priešopinis poveikis. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad antocianinai pasiţymi priešopiniu
poveikiu [5, 51]. Jie didina apsauginių gleivių gamybą skrandyje [5, 70]. Helicobacter pylori padermės sukeliama infekcija yra viena pagrindinių skrandţio opos ir skrandţio vėţio atsiradimo prieţasčių. Antocianinai turi poveikį Helicobacter pylori padermės bakterijoms. Gydant Helicobacter pylori padermės bakterijų sukeliamus susirgimus ir kartu vartojant augalinės kilmės preparatus, kuriuose biologiškai aktyvios medţiagos yra antocianinai, būtų galima pagerinti gydymo efektyvumą ir šiuos preparatus naudoti skrandţio opaligės gydymui ir profilaktikai [82].
Priešvėţinis veikimas. Antocianinai yra svarbūs biologiškai aktyvūs junginiai vėţio gydyme
bei karcinogenezės ir mutagenezės prevencijoje. Jie suriša laisvuosius radikalus, aktyvina arba slopina fermentus, apsaugo baltymus, lipidus ir nukleino rūgštis. Antocianinai slopina vėţinių ląstelių augimą bei jų transformaciją, navikų augimą, vėţinių ląstelių proliferaciją, angiogenezę, skatina vėţinių ląstelių apoptozę [70, 82].
Tirtas antocianinų poveikis metastazių formavimuisi ir išplitimui. Didţiausiu priešmetastaziniu aktyvumu pasiţymėjo delfinidino glikozidai. Šie efektai siejami su fermentų matrikso metaloproteinazės (MMP) ir urokinazės tipo plaziminogeno aktyvatoriaus (u-PA) aktyvumo slopinimu [21, 52].
Geltonosios dėmės degeneraciją stabdantis poveikis. Geltonosios dėmės degeneracija yra
viena iš regėjimo praradimo prieţasčių, išsivysčiusiose šalyse vyresnių nei 60 metų ţmonių tarpe. Nustatyta, kad veikiant šviesai, autofluorescencinis pigmentas fluoroforas A2E pagamina aktyvųjį deguonį, kuris, reaguodamas su kitomis fluoroforo A2E molekulėmis, sudaro epoksidus. Fluoroforo A2E epoksidai veikia ląstelės DNR ir yra pagrindinė tinklainės pigmentinių epitelio ląstelių apoptozės prieţastis [41, 48].
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad antocianinai efektyviai sumaţina fluoroforo A2E epoksidaciją slopindami aktyvųjį deguonį [41, 48]. Didţiausiu slopinančiu poveikiu pasiţymi malvidino monoglikozidai. Malvidino molekulė savo struktūroje turi du metoksi (CH3O-) pakaitus, kas lemia didesnį jos hidrofobiškumą, lyginant su kitais antocianinais. Hidrofobiškumo padidėjimas leidţia malvidino molekulei sąveikauti su fluoroforo A2E šoninėmis grandinėmis ir neutralizuoti aktyviuosius deguonies junginius jų susidarymo vietoje [48].
3.3. Biologinė oksidacija ir antioksidacinio aktyvumo vertinimo metodai
Ţmogaus organizme veikiant įvairiems vidiniams (uţdegiminių, metabolinių reakcijų, aktyvios peroksidacijos peroksisomose, aktyvios fagocitozės ir kt.) ir išoriniams (UV ar radiacinė spinduliuotės, rūkymo, aplinkos uţterštumo ir kt.) veiksniams, susidaro aktyvios deguonies formos [49]. Jos paţeidţia organizmo makromolekules – baltymus, lipidus, angliavandenius ir DNR, o tai lemia ląstelių paţeidimus, mutacijas, fermentinių sistemų ir organizmo funkcijų sutrikimus bei skatina ligų –išeminės širdies ligos, insulto, reumatoidinio artrito ir vėţio – vystymąsi [59]. Aktyvios deguonies formos gali būti radikalai (superoksido, hidroksilo, azoto ir lipidų peroksidų) bei neradikalai (ozonas, vandenilio peroksidas, singletinis deguonis, hipochloritinė rūgštis) [32].
Superoksido radikalas (O2•-). O2 redukcijos metu susidaro superoksido radikalas (O2•-).
neutrofilų, makrofagų) aktyvinimo funkciją, kuri yra itin svarbi organizmo imuniniam atsakui. O2
•-yra oksidantas, reaguodamas su baltymais, turinčiais prostetines pereinamųjų metalų grupes, jis gali paţeisti fermentines sistemas. Prisijungiant protoną, iš O2•- susidaro HO2•- radikalas. Jis pasiţymi dar stipresnėmis oksidacinėmis savybėmis nei O2
•-. HO2
•-gali tiesiogiai reaguoti su linoleno ir arachidono rūgštimis sudarydamas hidroperoksidus [10, 32].
Vandenilio peroksidas H2O2. Ţmogaus organizme H2O2 susidarymas vyksta fagocituojančiose ląstelėse, mikrosomose ir mitochondrijose. Tai aktyvus deguonies junginys, dalyvaujantis radikalų susidaryme. Vandenilio peroksidas pasiţymi silpnomis oksidacinėmis savybėmis. Jis gali paţeisti biologines molekules, turinčias SH grupes ar Fe-S centrus. Fentono ir Haber-Veiso reakcijų metu vandenilio peroksidas reaguoja su pereinamųjų metalų (Fe, Cu ir kt.) jonais, susidarant dideliu aktyvumu pasiţymintiems hidroksilo radikalams [10].
Hidroksilo radikalas OH•. Susidaro vandenilio peroksido redukcijos metu. Susidarymo vietoje hidroksilo radikalas reaguoja su gretimomis molekulėmis, sukeldamas jų paţaidas. Tai ypač stiprus oksidantas. OH• sąveikos su riebalų rūgštimis metu daţniausiai susidaro maţiau reaktyvūs peroksidų radikalai. Jie laisvai difunduoja pro biologines membranas ir grandininės reakcijos metu paţeidţia kitas molekules. Hidroksilo radikalui reaguojant su DNR ir RNR struktūroje esančiomis azotinėmis bazėmis susidaro antriniai radikalai, paţeidţiantys kitas azoto bazes ir monosacharidus. Tokios paţaidos gali sukelti mutacijas ir ląstelių ţūtį [32, 49].
Peroksinitrito radikalas ONOO-. Susidaro azoto monoksidui reaguojant su superoksido radikalu. ONOO- pasiţymi stipriomis oksidacinėmis savybėmis. Jis lengvai skyla į hidroksilo radikalą ir NO2. Peroksinitrito radikalas sukelia biologinių membranų lipidų, baltymų oksidaciją. Be to, jis gali jungtis su baltymuose esančiu tirozinu. Susidarę nitrotirozino junginiai aptinkami ląstelėse uţdegiminių susirgimų metu (aterosklerozės paţeistose kraujagyslių sienelėse) [32].
Medţiagos, maţinančios biologinių membranų oksidacinį paţeidimą, vadinamos antioksidantais. Antioksidantai gali apsaugoti ţmogaus organizmą nuo laisvųjų radikalų ir sustabdyti daugelio lėtinių ligų progresavimą [6]. Antioksidaciniu aktyvumu pasiţymintys junginiai (polifenoliai, askorbo rūgštis) gali atiduoti elektroną ir taip laisvuosius radikalus paversti organizmui nekenksmingomis formomis [77]. Šia antioksidantų savybe pagrįsti jų antioksidacinio aktyvumo vertinimo metodai [7].
Sintetiniai radikalai daţniausiai naudojami kaip indikatoriai vertinant elektrono perdavimo pajėgumą ir antiradikalinį aktyvumą [6, 7]. Laisvojo radikalo tirpalas yra spalvotas. Reaguojant su antioksidantu, kaip įvykusios reakcijos pasekmė, stebimas tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumaţėjimas. Šios grupės metodai yra paplitę ir plačiai taikomi įvairių medţiagų antiradikaliniam aktyvumui nustatyti [6, 8]. Jiems priskiriami ABTS, DPPH ir TFPH metodai.
Fotometrinis ABTS•+ radikalo katijono sujungimo metodas. Taikomas nustatant
lipofilinius ir hidrofilinius antioksidantus, įskaitant flavonoidus, karotenoidus ir plazmos antioksidantus [67]. Reakcijos tarp ABTS ir kalio persulfato metu gaunamas mėlynai ţalios spalvos ABTS•+ radikalo katijono tirpalas. Jis turi keletą absorbcijos maksimumų – 415 nm, 645 nm, 734 nm, 815 nm. Terpės pH – 7,4. Radikalui reaguojant su antioksidaciniu aktyvumu pasiţyminčiais junginiais, jis redukuojamas į bespalvę ABTS formą [67].
Fotometrinis DPPH• radikalo sujungimo metodas. Pirmą kartą paskelbtas mokslininko A.
Gadow [26]. Skirtingai nei taikant ABTS metodą, DPPH radikalas yra stabilus, jo nereikia gauti reakcijos metu [8]. DPPH• tirpinamas alkoholiniuose tirpikliuose, daţniausiai metanolyje. DPPH• tirpalas yra purpurinės spalvos, jo absorbcijos maksimumas – 517 nm.Vykstant laisvojo radikalo surišimo reakcijai, DPPH radikalas tampa redukuota DPPH-H forma, kuri yra bespalvė [7, 15].
Fotometrinis TFPH•+ radikalo katijono sujungimo metodas. Šis metodas pirmą kartą
paskelbtas Pakistano mokslininkų M.N. Asghar ir I.U. Khan 2008 m. Kaip įprastų ir pasaulinėje praktikoje plačiai taikomų ABTS ir DPPH metodų, jo veikimo mechanizmas pagrįstas laisvuosius radikalus surišančių medţiagų antiradikaliniu poveikiu. TFPH•+ radikalo katijono tirpalas gaunamas reakcijos metu tarp TFPH, kalio persulfato ir sieros rūgšties. Terpės pH – stipriai rūgštinė. TFPH•+ katijono radikalo tirpalas yra ryškiai oranţinės spalvos. Jo šviesos absorbcijos maksimumas –502 nm. Radikalui reaguojant su antioksidantais, spalvos intensyvumas maţėja, o tai lemia šviesos absorbcijos sumaţėjimą [9].
CuPRAC ir FRAP metodai pagrįsti reakcijomis su kompleksiniais junginiais, savo sudėtyje turinčiais pereinamųjų metalų (vario, geleţies) jonų. Antioksidanto molekulei reaguojant su kompleksiniu junginiu, ji atiduoda elektroną, vyksta pereinamųjų metalų jonų redukcija. Kaip įvykusios reakcijos pasekmė, stebimas ryškus šviesos absorbcijos didėjimas [7, 49].
Fotometrinis FRAP metodas. Pagrįstas geleţies (III)-TPTZ geltonos spalvos komplekso
Fotometrinis CuPRAC metodas. Jis pagrįstas vario-neokuproino komplekso (II) redukcija į
4. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI
4.1. Tyrimų objektas
Augalinė ţaliava – vaivorų (Vaccinium uliginosum L.) vaisiai, surinkti iš įvairiuose Lietuvos regionuose esančių natūralių augaviečių 2010 m. liepos – rugpjūčio mėnesiais (4 pav.).
4 pav. Vaivorų (V.uliginosum L.) vaisių rinkimo vietos (pažymėtos skaičiais) skirtingose gamtinėse cenopopuliacijose.
Darbe naudotų vaivorų vaisių rinkimo vietos Lietuvos Respublikos teritorijoje: 1-Darynės miškas, Švenčionių rajonas; 2-Dičiūnų miškas, Utenos rajonas; 3-Kumponiškio miškas, Kupiškio rajonas; 4-Lapynų miškas, Šilutės rajonas; 5-Lekėčių miškas, Šakių rajonas; 6-Slavinčiškių miškas, Alytaus rajonas.
4.2. Medţiagos ir reagentai
Naudoti tirpikliai, reagentai ir standartai yra analitinio švarumo. ABTS, natrio acetato trihidratas, neokuproinas, amonio acetatas, geleţies trichlorido heksahidratas, TPTZ, TFPH, Trolox® -6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis įsigyti iš „Sigma – Aldrich GmbH“ (Buchs, Šveicarija), etanolis (96,3 proc. v/v). iš AB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva), kalio chloridas iš „Scharlau“ (Ispanija), kalio bisulfatas, (-)epikatechinas iš „Fluca Chemie GmbH“ (Buchs, Šveicarija), DPPH•, vario chlorido dihidratas gauti iš „Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe, Vokietija), sulfato rūgštis iš 95 proc. „Chempur“ (Lenkija). Analizei naudotas išgrynintas vanduo.
4.3. Naudota aparatūra
Antocianinų bei proantocianidinų kiekybinė sudėtis vaivorų (V. uliginosum L.) vaisiuose, vaisių išspaudose ir sultyse, jų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas nustatytas naudojant spektrofotometrą „Beckman DU-70“ (JAV). Ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje „Bio Sonic UC-300“ (JAV). Buferinių tirpalų pH rodiklis išmatuotas pH –metru „Knick“ (Vokietija).
4.4. Tyrimų metodai
Vaivorų vaisių, jų sulčių ir išspaudų ekstraktų paruošimas. Šaldyti vaivorų vaisiai
homogenizuojami elektriniu trintuvu iki homogeninės masės. Atsveriama 2,5 g (tiksli masė) homogenizuotų vaisių, uţpilama 25 ml 60 proc. etanoliu ir ekstrahuojama 15 min ultragarso vonioje. Gautas vaisių ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą į 25 ml kolbutę. Likutis ant filtro plaunamas 60 proc. etanoliu ir praskiedţiama iki ţymės.
Sultys nuo išspaudų atskiriamos spaudţiant ţaliavą presine sulčiaspaude. 2,5 g (tiksli masė) neapdorotų sulčių 25 ml kolbutėje praskiedţiama 60 proc. etanoliu iki ţymės.
Antocianinų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Antocianinų kiekis
vaivorų vaisiuose, išspaudose ir sultyse buvo tiriamas taikant pH – diferencinį metodą. Šis metodas pagristas antocianinų spalvos kitimais skirtingo pH (1,0 ir 4,5) terpėse [29].
0,025 M kalio chlorido (pH 1,0) buferinis tirpalas paruošiamas. 1,86 g kalio chlorido
ištirpinama 980 ml išgryninto vandens 1000 ml talpos matavimo kolboje. Buferinio tirpalo pH rodiklis iki pH 1,0 koreguojamas koncentruota vandenilio chlorido rūgštimi. Į matavimo kolbą pripilama išgryninto vandens iki ţymės. Pakartotinai patikrinamas buferinio tirpalo pH rodiklis.
0,4 M natrio acetato (pH 4,5) buferinis tirpalas paruošimas. 54,43 g natrio acetato
trihidrato ištirpinama 960 ml išgryninto vandens. Buferinio tirpalo pH rodiklis koreguojamas iki pH 4,5 koncentruota vandenilio chlorido rūgštimi. Gautas tirpalas perkeliamas į 1000 ml tūrio matavimo kolbą ir pripilama išgryninto vandens iki ţymės. Pakartotinai patikrinamas buferinio tirpalo pH rodiklis. Pagaminti buferiniai tirpalai laikomi kambario temperatūroje, jų pH rodiklis tikrinamas ir koreguojamas prieš kiekvieną naudojimą.
0,625 ml (tikslus tūris) vaivorų vaisių, sulčių ar išspaudų ekstrakto kiekybiškai perkeliama į 25 ml matavimo kolbutę ir praskiedţiama buferiniu tirpalu iki ţymės. Praskiedimo faktorius – 40. Iš vieno bandinio atliekami du tokie praskiedimai – vienas su kalio chlorido buferiniu tirpalu (pH 1,0), kitas su natrio acetato buferiniu tirpalu (pH 4,5). Laikoma 15 min, kol nusistovės tirpalų pusiausvyra. Tirpalų šviesos absorbcijos dydis matuojamas spektrofotometru esant 520 nm ir 700 nm bangų ilgiui. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Naudojama 1 cm storio kvarcinė kiuvetė.
Absorbcijos dydis (A) apskaičiuojamas pagal formulę: pH4,5 700 520 pH1,0 700 520
-
A
)
-
(A
-
A
)
(A
A
Čia: A520(pH 1,0) – absorbcijos dydis esant 520 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=1,0;
A700(pH 1,0) – absorbcijos dydis esant 700 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=1,0;
A520(pH 4,5) – absorbicijos dydis esant 520 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=4,5;
A700((pH 4,5) – absorbcijos dydis esant 700 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH=4,5
Suminis antocianinų kiekis ekstrakte išreiškiamas cianidin-3-gliukozido ekvivalentu. (mg/l) , 1 ε 1000 DF MW A X1
Čia: X1-suminis antocianinų kiekis, mg/l;
DF-praskiedimo faktorius; čia: 40 (0,625 ml ekstrakto praskiedţiama buferiniu tirpalu iki 25 ml);
ε-cianidin-3- gliukozido molinis absorbcijos koeficientas, 26900; 1-naudotos kvarcinės kiuvetės storis, cm.
Antocianinų suminio kiekio procentinė išraiška: (proc.) , 1000 m 0,001 100 V X X2 1
X1-suminis antocianinų kiekis ekstrakte, mg/l; X2-antocianinų suminis kiekis ţaliavoje, proc.;
V-vaivorų vaisių ekstrakcijai paimtas ekstrahento tūris; čia: 25 ml 60 proc. (v/v) etanolis; m-analizei imtas bandinio kiekis (tiksli masė).
Proantocianidinų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. 10 µl
etanolinio vaivorų vaisių, išspaudų ar sulčių ekstrakto sumaišoma su 3 ml 0,1 proc. DMCA etanoliniu vandenilio chlorido rūgšties (9:1, v/v) tirpalu. Po 5 min. matuojama tirpalo šviesos absorbcija esant 640 nm bangos ilgiui [34]. Suminis proantocianidinų kiekis etanoliniame ekstrakte išreiškiamas (-) epikatechino ekvivalentu (mg/ml), pagal (-)epikatechino kalibracinę kreivę:
y=4,6598x+0,042; R²=0,9997;
(–)Epikatechino koncentracijos ribos 0-0,5 mg/ml. Proantocianidinų suminio kiekio procentinė išraiška:
) (proc. , 1000 100 X2 1 m V X
Čia: X1 – proantocianidinų suminis kiekis ekstrakte (mg/ml); X2 – proantocianidinų suminis kiekis ţaliavoje, proc;
V – vaivorų vaisių, išspaudų ar sulčių ekstrakcijai paimtas ekstrahento tūris; čia: 25 ml 60 proc. (v/v) etanolio;
m-analizei imtas bandinio kiekis g (tiksli masė).
Vaivorų vaisių, išspaudų ir sulčių etanolinių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas. Ekstraktų antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalento antioksidacine
galia, TEAC. TEAC atitinka trolokso koncentraciją (mM), turinčią tokį patį antioksidacinį aktyvumą, kaip 1 g augalinės ţaliavos.
) mmol/g ( , .(g) m (ml) V 1000 a b A TEAC band band.
a – nuolydis (angl. slope) iš trolokso kalibracinės kreivės lygties;
b – nuokrypis (angl. y-intercept) iš trolokso kalibracinės kreivės lygties; Vband. – tiriamos augalinės ţaliavos ekstrakto bandinio tūris (ml);
mband. – tiriamos augalinės ţaliavos atsvertas (tikslus) kiekis (g).
Fotometrinis ABTS•+ radikalo katijono surišimo metodas. Motininis ABTS•+ radikalo tirpalas gaunamas oksiduojant ABTS su kalio persulfatu. 2 mM ABTS ištirpinama išgrynintame vandenyje ir pridedama 0,7mM kalio persulfato. Gautas tirpalas laikomas 16-17 val. tamsoje kambario temperatūroje, kol ABTS ir kalio persulfatas visiškai sureaguoja. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS•+ radikalo katijonas. Motininis ABTS•+ tirpalas, apsaugotas nuo šviesos poveikio, kambario temperatūroje yra stabilus daugiau nei 2 paras. Darbinis ABTS•+ tirpalas gaunamas praskiedţiant motininį ABTS•+ tirpalą išgrynintu vandeniu iki 0,8±0,03 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui [66]. 10 μl tiriamojo ekstrakto kvarcinėje kiuvetėje sumaišoma su 3 ml darbiniu ABTS•+ tirpalu. Spektrofotometru matuojamas bandinių šviesos absorbcijos sumaţėjimas, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 60 min.). Antiradikalinis aktyvumas ABTS metodu išreiškiamas TEAC pagal trolokso kalibracinę kreivę:
y0,000084x -0,002068; R²=0,998777; Trolokso koncentracijos ribos – 0-8000 μM.
Fotometrinis DPPH• laisvojo radikalo surišimo metodas [26]. 10 μl tiriamojo ekstrakto
kvarcinėje kiuvetėje sumaišoma su 3 ml 6×10-5
M DPPH• tirpalu 96,3 proc. (v/v) etanolyje. Spektrofotometru išmatuojamas mėginių šviesos absorbcijos maţėjimas esant 517 nm. bangos ilgiui, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 30 min.). Antiradikalinis aktyvumas DPPH metodu išreiškiamas TEAC pagal trolokso kalibracinę kreivę:
y0,000111x0,000709; R2=0,998024;
Trolokso koncentracijos ribos – 0-6000 μM.
Fotometrinis FRAP metodas. FRAP reagento sudėtis: natrio acetato buferinis tirpalas 300
absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 90 min.). Antioksidacinis aktyvumas FRAP metodu išreiškiamas TEAC pagal trolokso kalibracinę kreivę:
y0,000128x0,034745; R² = 0,998682;
Trolokso koncentracijos ribos – 0-28000 μM.
Fotometrinis CuPRAC metodas. CuPRAC reagento sudėtis: 1,010-2 M vario (II) chlorido vandeninis tirpalas, 1,010-3 M amonio acetato buferinis tirpalas (pH=7), 7,5x10-3 M neokuproino etanolinis tirpalas. Į 3 ml kiuvetę įpilama po 1 ml vario (II) chlorido, neokurproino tirpalų ir amonio acetato buferinio tirpalo [7]. Sumaišoma su 10 μl tiriamojo ekstrakto. Spektrofotometru išmatuojamas mėginių šviesos absorbcijos didėjimas esant 450 nm bangos ilgiui, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 90 min.). Antioksidacinis aktyvumas CuPRAC metodu išreiškiamas TEAC pagal trolokso kalibracinę kreivę:
y0,000048x0,001273;R² = 0,998580;
Trolokso koncentracijos ribos – 0-56000 μM.
Fotometrinis TFPH•+radikalo katijono surišimo metodas. Motininio tirpalo paruošiamas. TFPH motininis tirpalas gaunamas ištirpinus 0,480 g (tiksli masė) TFPH 10 ml
išgryninto vandens. Laikomas tamsoje 4°C temperatūroje išlieka stabilus 2 mėnesius. Darbinio
tirpalo paruošiamas. 100 ml matavimo kolboje 0,5 ml motininio TFPH tirpalo sumaišoma su 0,1 ml
100 mM K2S2O8 ir 70 ml 4 M sulfato rūgšties. Pripilama 4 M sulfato rūgšties iki 100 ml. Gautas tirpalas laikomas tamsoje 15-20 min. Išmatuota šviesos absorbcija turi siekti 0,70±0,1 absorbcijos vienetų esant 502 nm bangos ilgiui. Darbinis tirpalas išlieka stabilus 2 val. laikant tamsoje, kambario temperatūroje [9]. 10 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma kvarcinėje kiuvetėje su 3 ml darbinio TFPH tirpalo. Spektrofotometru matuojamas mėginių šviesos absorbcijos sumaţėjimas, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (apytiksliai po 60 min.). Antiradikalinis aktyvumas TFPH metodu išreiškiamas TEAC pagal trolokso kalibracinę kreivę:
0,002531; 0,000043x
y R²=0,999238;
Trolokso koncentracijos ribos – 0-8000 μM.
Duomenų analizė. Statistinis duomenų įvertinimas atliktas „MS Excel“ (Microsoft, JAV)
5. REZULTATŲ APTARIMAS
5.1.Vaivorų vaisių antocianinų ekstrakcijos metodo optimizavimas
Ekstrakcijos metodo ir ekstrahento parinkimas yra vienas svarbiausių ţingsnių, optimizuojant augalinių ţaliavų biologiškai aktyvių junginių kiekybinio nustatymo metodikos sukūrimą. Norint išskirti antocianinų kompleksą ir uţtikrinti gautų ekstraktų stabilumą, būtina nustatyti optimalias augalinės ţaliavos ekstrakcijos sąlygas.
Siekiant šio tikslo, buvo atlikti tyrimai, parenkant optimaliausią ekstrahentą, ekstrakcijos metodą, trukmę, nustatytas optimalus ekstrahento ir tiriamosios augalinės ţaliavos santykis, įvertinta temperatūros įtaka ekstrakcijos procesui.
Antocianinai gerai tirpūs vandenyje [33]. Daţniausiai, siekiant kuo didesnės jų ekstrakcijos išeigos, ekstrahentais naudojami etanolis, metanolis, acetonas, įvairūs jų mišiniai su vandeniu. Antocianinai neutralioje ar šariminėje terpėje yra nestabilūs, todėl, siekiant pagerinti jų stabilumą, pridedami nedideli vandenilio chlorido, citrinų, skruzdţių, acto, vyno ar trifluoracto rūgšties kiekiai [4, 18]. Vandenilio chlorido rūgšties pasirinkimą ekstrahento parūgštinimui lėmė tai, kad jos panaudojimas plačiai aprašytas mokslinėje literatūroje ir ši rūgštis daţniausiai naudojama ekstrahuojant antocianinus [1, 4, 18]. Tyrimuose naudota 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštis.
5 pav. Suminis antocianinų kiekis V. uliginosum L. vaisių ėminiuose, ekstrakcijai naudojant vandenį ir įvairių koncentracijų etanolį (n=3)
Vertinta ekstrakcijos trukmės įtaka antocianinų išeigai. Ekstrakcijos efektyvumo palyginamiesiems tyrimams taikyta maceracija mechaninėje purtyklėje ir modifikuota maceracija ultragarso vonelėje (sonifikacija). Ekstrahentu naudotas 60 proc. (v/v) etanolis, parūgštintas 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi. Vaivorų vaisių ėminiai ekstrahuoti purtyklėje, ekstrakciją vykdant skirtingais laiko intervalais (1, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 480, 960, 1440 min.). Taikant šį ekstrakcijos metodą, didţiausia antocianinų išeiga (0,253±0,007 proc.) gauta ekstrahuojant ėminius 1440 min (24 val.) (6 pav.).
Antocianinų ekstrakcijos išeigos efektyvumas vertintas, ekstrakciją vykdant ultragarso vonelėje, bandinius ekstrahuojant skirtingais laiko intervalais (1; 5, 10, 15 , 20; 30, 60 min.). Didţiausia antocianinų išeiga (0,257±0,002 proc.) gauta ėminius ekstrahuojant 15 minučių. Ilginant ultragarsinės ekstrakcijos ekspozicijos laiką, antocianinų išgava maţėja. Tolimesniems tyrimams pasirinkta 15 min. trunkanti antocianinų ekstrakcija ultragarso vonelėje (7 pav.).
7 pav. Suminis antocianinų kiekis V. uliginosum L. vaisių ėminiuose, ekstrahuojant ultragarso vonelėje (n=3)
Atlikti temperatūros poveikio tyrimai antocianinų ekstrakcijos išgavai iš vaivorų vaisių ėminių. Moksliniuose šaltiniuose apraštytas temperatūros poveikis antocianinų ekstrakcijai iš augalinių ţaliavų. Nustatyta, kad temperatūra teigiamai įtakoja antocianinų ekstrakciją iš augalinės ţaliavos dėl padidėjusių difuzijos procesų ir augalinės ţaliavos ląstelių membranų laidumo. Tačiau temperatūros padidėjimas gali aktyvinti fermentus glikozidazes, kurios skaido antocianinus į cukrus ir aglikonus – antocianidinus, dėl to sumaţėja gautų ekstraktų stabilumas [45].
8 pav. Suminis antocianinų kiekis V.uliginosum L vaisių ėminiuose, ekstrahuojant maceracijos metodu skirtingose temperatūrose (n=3)
Atlikti tyrimai įvertinant ir nustatant optimalų ekstrahento ir tiriamosios augalinės ţaliavos santykį. Ekstrahentu naudotas 60 proc. (v/v) etanolis, parūgštintas 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi. Tyrimui naudoti šie augalinės ţaliavos ir ekstrahento santykiai: 1:20, 1:15, 1:10, 1:7, 1:5, ekstrakciją vykdant modifikuotos maceracijos metodu ultragarso vonelėje 15 min.
Nustatyta, kad optimalus ekstrahento ir tiriamosios augalinės ţaliavos santykis yra 1:10. Esant šiam santykiui, pasiekiama gaunama didţiausia antocianinų išeiga (0,266±0,002 proc.). Naudojant kitus augalinės ţaliavos ir ekstrahento santykius, antocianinų išeiga maţesnė (p<0,05) (9 pav.).
Nustatytos optimalios V. uliginosum L. vaisių ėminiuose esančių antocianinų ekstrakcijos sąlygos. Geriausia ekstrakcijos išgava (0,266±0,002 proc.) nustatyta ekstrakciją vykdant modifikuotos maceracijos būdu ultragarso vonelėje, 15 min. kambario temperatūroje, ekstrahentu naudojant 60 proc. (v/v) etanolį, parūgštintą 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi. Nustatytas optimalus ţaliavos ir ekstrahento santykis 1:10.
5.2. Suminio antocianinų kiekio įvairavimas vaivorų vaisiuose, vaisių
išspaudose ir sultyse
5.2.1. Antocianinų kiekio įvairavimas vaisių nokimo metu
V. uliginosum L. vaisių paruošos vykdomos nuo augalų, augančių natūraliose augavietėse.
Klimatinės sąlygos, geografinė padėtis, ţaliavos rinkimo laikas gali turėti įtakos vaivorų vaisių antocianinų ir kitų biologiškai aktyvių junginių kokybinei ir kiekybinei sudėčiai [14, 53]. Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas vaistinių augalinių ţaliavų, kaupiančių antocianinus, paieškoms, jų cheminės sudėties ir preparatų poveikio tyrimams [80]. Antocianinai yra viena iš biologiškai aktyvių junginių grupių, todėl svarbu išsiaiškinti jų sudėties ir kiekio pokyčius vaivorų vaisiuose jų nokimo metu. Įvertinus antocianinų kaupimosi vaivorų vaisiuose dėsningumus, galima nustatyti, kada tikslingiausia vykdyti vaivorų vaisių augalinės ţaliavos paruošas. Vaivorų vaisių ėminių tyrimų rezultatai įgalins nustatyti antocianinų kaupimosi dėsningumus, ţaliavos kokybės rodiklius ir ruošti aukštos kokybės vaistinę augalinę ţaliavą.
10 pav. Suminiai antocianinų kiekiai V. uliginosum L. vaisiuose jų nokimo metu (n=3)
Vaisių išspaudos – viena iš maisto pramonės atliekų. Jos gali būti panaudotos kaip pigi ir biologiškai aktyviais junginiais turtinga ţaliava antocianinų ekstrakcijai [2, 46]. Tikslinga išsiaiškinti antocianinų kiekius vaivorų vaisių išspaudose ir įvertinti galimybę jas panaudoti maisto papildų bei vaistinių preparatų gamyboje.
Vaivorų vaisių išspaudose, gautose iš vaisių ėminių, surinktų nokimo pradţioje, liepos 24 d., nustatytas maţiausias antocianinų kiekis (0,187±0,029 proc.). Didţiausias suminis antocianinų kiekis (0,245±0,026 proc.) nustatytas vaisių išspaudose, gautose iš nokimo pabaigoje, rugpjūčio 22 d., surinktų vaisių ėminių. Jis padidėjo 31,19 proc. lyginant su kiekiu nokimo pradţioje (11 pav.).
Vaisių sultyse yra įvairių biologiškai aktyvių medţiagų (polifenolinių junginių, vitaminų ir kt.), todėl jų vartojimas naudingas ţmogaus sveikatai [61]. Siekiant panaudoti vaivorų vaisius kaip potencialią ţaliavą sultims gaminti, tikslinga atlikti antocianinų kiekybinės sudėties tyrimus.
Vaivorų vaisių sultyse, išspaustose iš vaisių ėminių, surinktų nokimo pradţioje, liepos 24 d., nustatytas maţiausias antocianinų kiekis (0,143±0,015 proc.). Didţiausias antocianinų kiekis (0,198±0,031proc.) nustatytas nokimo pabaigoje, rugpjūčio 22 d., surinktų vaivorų vaisių sultyse. Antocianinų kiekis vaisių sultyse, išspaustose iš nokimo pabaigoje surinktų vaivorų vaisių ėminių, yra 38,79 proc. didesnis, lyginant su kiekiu nokimo pradţioje (12 pav.).
12 pav. Suminiai antocianinų kiekiai V.uliginosum L. vaisių sultyse (n=3)
Apibendrinant gautus tyrimų rezultatus galima teigti, kad vaivorų vaisiuose, jiems nokstant, antocianinų kiekis didėja. Šis dėsningumas stebimas visose tirtose augavietėse surinktų vaivorų vaisių ėminuose, jų išspaudose ir sultyse.
Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad suminio antocianinų kiekio skirtumas skirtingu nokimo metu (nuo liepos 24 d iki rugpjūčio 22 d.) surinktuose vaivorų vaisiuose, vaisių išspaudose ir sultyse yra statistiškai reikšmingas (p<0,05).
Didţiausi suminiai antocianinų kiekiai (0,219±0,016 proc.) nustatyti vaivorų vaisių ėminiuose, surinktuose vaisių nokimo pabaigoje. Panašūs dėsningumai nustatyti ir vaisių išspaudose (0,245±0,026 proc.) bei sultyse (0,198±0,031proc.). Vaivorų vaisių augalinę ţaliavą galima rekomenduoti ruošti vaisių nokimo pabaigoje. Nurodytu laikotarpiu surinkta augalinė ţaliava gali būti panaudota sulčių, turinčių didţiausią antocianinų suminį kiekį, gamybai.
0,187-0,245 proc. ribose. Literatūros šaltiniuose nepavyko rasti duomenų apie vaivorų išspaudų ir sulčių antocianinų kiekio tyrimus. Atlikti ir aprašyti mokslinių tyrimų rezultatai su vynuogių ir šilauogių išspaudomis parodė, kad šiose ţaliavose sukaupiami dideli antocianinų kiekiai [2, 46]. Tuo galima paaiškinti mūsų tyrimo metu gautus rezultatus. Vaivorų vaisių išspaudas, kaip antocianinais turtingą ţaliavą, tikslinga panaudoti maisto papildų bei vaistinių preparatų gamyboje.
Literatūros duomenų apie antocianinų kitimų dėsningumus vaivorų vaisiuose, jų išspaudose ir sultyse vaisių nokimo metu neaptikta. Tačiau atlikti tyrimai su Lietuvos teritorijoje augančių vaivorams giminiškų mėlynių (Vaccinium myrtillus L.) vaisiais rodo, kad juose didţiausi antocianinų kiekiai sukaupiami rugpjūčio antroje pusėje iki vaisių nubyrėjimo (rugsėjo 15 d.) [2].
5.2.2. Antocianinų kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse surinktuose
vaivorų vaisiuose
Vaistinių augalinių ţaliavų, surinktų iš skirtingų augaviečių, cheminė sudėtis ir junginių kiekiai dėl klimatinių, geografinių, genetinių ar kitų faktorių įtakos gali varijuoti [14]. Norint vykdyti kokybiškas vaivorų vaisių, kaip vaistinės augalinės ţaliavos, paruošas, yra svarbu išsiaiškinti, kuriuose šalies regionuose augančių vaivorų cenopopuliacijose sukaupiami didţiausi antocianinų kiekiai
Šešiose natūraliai augančių vaivorų (V. uliginosum L.) cenopopuliacijose surinkti vaisių ėminiai ir nustatyti suminiai antocianinų kiekiai. Suminis antocianinų kiekis vaivorų vaisių ėminiuose varijuoja 0,183-0,231 proc. ribose. Didţiausias antocianinų kiekis nustatytas Lekėčių (0,239±0,004 proc.), Slavinčiškių (0,224±0,006 proc.) ir Darynės (0,220±0,003 proc.) apylinkių miškuose surinktų vaivorų vaisių ėminiuose (13 pav.).
Suminis antocianinų kiekis vaivorų vaisių išspaudose varijuoja 0,199-0,275 proc. ribose. Didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti iš Lekėčių (0,275±0,004 proc.), Slavinčiškių (0,259±0,003 proc.) ir Darynės (0,249±0,006 proc.) apylinkių miškuose surinktų vaivorų vaisių ėminių gautose išspaudose (13 pav.).
13 pav. Suminiai antocianinų kiekiai vaivorų vaisiuose, išspaudose ir sultyse (n=3)
Literatūros duomenų apie Lietuvos Respublikos teritorijoje augančių vaivorų vaisių sudėtį rasti nepavyko. Atlikti Suomijos teritorijoje augančių vaivorų vaisių tyrimai parodė, kad skirtinguose šalies regionuose surinktų vaisių antocianinų kiekiai reikšmingai skiriasi. Antocianinų kiekiai palyginti atsiţvelgiant į augaviečių geografinę padėtį šiaurės poliarinio rato atţvilgiu. Didţiausia įtaką antocianinų kiekio įvairavimui turėjo geografinis veiksnys – skirtingos augaviečių klimatinės sąlygos [53]. Atlikus skirtingose Lietuvos vietovėse surinktų mėlynių vaisių antocianinų kiekio tyrimus, nustatytas neţymus antocianinų kiekio įvairavimas [19].
Norint įvertinti suminių antocianinų kiekių įvairavimą mūsų surinktų ir tirtų vaivorų vaisių ėminiuose, jų išspaudose ir sultyse apskaičiuoti bandinių grupių – vaisių, išspaudų ir sulčių – variacijos koeficientai. Jie siekė atitinkamai: vaisių – 10,20 proc., išspaudų – 13,41 proc., sulčių – 14,17 proc. Tai rodo neţymų antocianinų kiekio įvairavimą. Palyginus vaivorų vaisių ėminių, jų išspaudų ir sulčių antocianinų kiekių vidurkius su didţiausiu antocianinų kiekiu vaisių ėminyje, nustatytas reikšmingas skirtumas tarp bendro antocianinų kiekio vidurkio ir daugiausiai antocianinų sukaupusio ėminio (p<0,05). Palyginus trijų, didţiausius antocianinų kiekius sukaupusių ėminių, vaisių, išspaudų ir sulčių antocianinų kiekių vidurkius, reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05).
rinkimo vietų skaičiaus. Remiantis atliktų tyrimų duomenis, galima preliminariai teigti, kad Lekėčių, Darynės ir Slavinčiškių vaivorų cenopopuliacijos galėtų būti perspektyvios vaisių paruošoms vykdyti, nes jose surinktuose vaisuose nustatyti dideli antocianinų kiekiai.
5.3. Suminio proantocianidinų kiekio įvairavimas vaivorų vaisiuose, vaisių
išspaudose ir sultyse
5.3.1. Proantocianidinų kiekio įvairavimas vaisių nokimo metu
Mokslinės literatūros šaltiniuose nurodyta, kad šilauogės (Vaccinium L.) genties augaluose nustatyti proantocianidinai [54]. Proantocianidinų grupei priklausantys junginiai pasiţymi reikšmingais farmakologiniais poveikiais (atpalaiduoja kraujagysles, suriša laisvuosius radikalus, pasiţymi antimikrobiniu veikimu), todėl pastaruoju metu jų tyrimams skiriamas didelis dėmesys [63, 65]. Antocianinų, proantocianidinų ir kitų polifenolinių junginių kiekių santykis vaisių nokimo metu kinta [14, 35]. Literatūros šaltiniuose nurodyta, kad proantocianidinai gali susidaryti iš antocianinų, todėl jų sintezės keliai susiję [23]. Norint geriau suprasti biologiškai aktyvių junginių kaupimosi vaivorų vaisiuose dėsningumus, tikslinga įvertinti ne tik antocianinų, bet ir proantocianidinų kiekybinę sudėtį vaivorų vaisių ėminuose.
14 pav. Suminiai proantocianidinų kiekiai vaivorų vaisiuose (n=3)
Atlikti tyrimai nustatant proantocianidinų suminį kiekį vaivorų vaisių išspaudose ir sultyse. Maţiausias proantocianidinų kiekis (0,0173±0,0036 proc.) nustatytas išspaudose, gautose iš nokimo pradţioje surinktų vaisių ėminių. Didţiausias proantocianidinų kiekis (0,0234±0,0029 proc.) nustatytas išspaudose iš vaisių ėminių, surinktų nokimo pabaigoje. Suminis proantocianidinų kiekis vaisių išspaudose, gautose iš nokimo pabaigoje surinktų vaisių ėminių, padidėjo 35 proc., lyginant su kiekiu nokimo pradţioje (15 pav.).
15 pav.Suminiai proantocianidinų kiekiai V.uliginosum L.vaisių išspaudose (n=3)
16 pav. Suminiai proantocianidinų kiekiai V. uliginosum L. vaisių sultyse (n=3)
Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad proantocianidinų kiekių skirtumas tarp skirtingu vaisių nokimo metu surinktų vaivorų vaisių ėminių, jų išspaudų ir sulčių yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Suminis proantocianidinų kiekis vaisių ėminiuose, surinktuose skirtingose augavietėse, vaisiams nokstant didėja. Didţiausi proantocianidinų kiekiai (0,0316±0,0027 proc.) nustatyti rugpjūčio mėnesio pabaigoje surinktuose vaisių ėminiuose. Panašūs proantocianidinų kiekio didėjimo dėsningumai nustatyti jų išspaudose (0,0234±0,0029 proc.) ir sultyse (0,0373±0,0052 proc.) vaisių nokimo metu. Sultyse nustatyti didţiausi proantocianidinų kiekiai, lyginant su kiekiais nustatytais vaisiuose ir išspaudose (p<0,05).
Duomenų apie Lietuvos klimatinėse sąlygose augančių vaivorų vaisių proantocianidinų kiekybinę sudėtį aptikti nepavyko. Mūsų gauti rezultatai panašūs mėlynių vaisių ėminiuose nustatytiems proantocianidinų kiekams (0,001 – 0,007 proc.) [31].
5.3.2. Proantocianidinų kiekio įvairavimas skirtingose augavietėse
surinktuose vaivorų vaisiuose
Atlikus tyrimus ir įvertinus suminius antocianinų kiekius skirtinguose Lietuvos regionuose surinktų vaisių ėminiuose, svarbu nustatyti ir proantocianidinų suminių kiekių įvairavimą. Suminis proantocianidinų kiekis skirtingose augavietėse surinktų vaivorų vaisių ėminiuose kinta 0,0267-0,0352 proc. ribose. Didţiausias proantocianidinų kiekis nustatytas Darynės (0,0352±0,0002 proc.), Slavinčiškių (0,0328±0,0008 proc.) ir Lekėčių (0,0319±0,0008 proc.) apylinkių miškuose surinktų vaivorų vaisių ėminiuose (17 pav.).
Suminis proantocianidinų kiekis vaivorų vaisių išspaudose varijuoja 0,0173-0,0270 proc. ribose. Didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti Darynės (0,0270±0,0008 proc.), Slavinčiškių (0,0246±0,0004 proc.) ir Lekėčių (0,0234±0,0005 proc.) apylinkių miškuose surinktų vaisių ėminių išspaudose (17 pav.). Suminis proantocianidinų kiekis vaivorų vaisių sultyse kinta nuo 0,0311 iki 0,0439 proc. Didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti iš Darynės (0,0439±0,0006 proc.), Slavinčiškių (0,0421±0,0005 proc.), Lekėčių (0,0370±0,0004 proc.) apylinkių augavietėse surinktų vaivorų vaisių ėminių sultyse (17 pav.).
17 pav. Proantocianidinų kiekis V.uliginosum. L vaisuose, išspaudose ir sultyse (n=3)
pavyzdţiuose vertintinas kaip neţymus. Atlikus skirtingose augavietėse surinktų vaisių ėminių, jų išspaudų ir sulčių proantocianidinų kiekių vidurkių palyginamąją analizę, nustatytas reikšmingas skirtumas (p<0,05). Palyginus trijų, didţiausius proantocianidinų kiekius sukaupusių, vaisių ėminių, jų išspaudų ir sulčių antocianinų kiekių vidurkius, reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05).
Lietuvos miškuose, esančiuose Darynės, Lekėčių ir Slavinčiškių apylinkėse, surinktuose vaivorų vaisių ėminiuose, jų išspaudose ir sultyse nustatyti didţiausi proantocianidinų kiekiai. Šios vaivorų augavietės galėtų būti perspektyvios, vykdant kokybiškų ţaliavų paruošas. Manome, kad pradėti tyrimai bus tęsiami. Surinkus didesnės imties vaisių ėminius ir atlikus tyrimus, bus galima daryti platesnes ir labiau apibendrinančias išvadas apie proantocianidinų kaupimosi dėsningumus.
Atlikus vaivorų vaisių ėminių kiekybinės antocianinų ir proantocianidinų sudėties tyrimus, galima teigti, kad suminis antocianinų ir proantocianidinų kiekis vaisiams nokstant didėja. Didţiausi šių biologiškai aktyvių medţiagų kiekiai nustatyti rugpjūčio mėn. pabaigoje rinktuose vaivorų vaisių ėminiuose. Didţiausi antocianinų kiekiai nustatyti vaivorų vaisių išspaudose, o proantocianidinų – vaisių sultyse.
5.4. V. uliginosum L. vaisių, išspaudų ir sulčių ekstraktų antioksidacinio
aktyvumo vertinimas
5.4.1. V. uliginosum L. vaisių, surinktų skirtingu nokimo metu,
antioksidacinio aktyvumo vertinimas
Literatūros duomenimis šilauogės (Vaccinium L.) genties augalų vaisių ekstraktai pasiţymi stipriu antioksidaciniu poveikiu [83]. Nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai tarp polifenolinių junginių (antocianinų, fenilkarboninių rūgščių, flavonolių, proantocianidinų) kiekio augalinėse ţaliavose ir antioksidacinio aktyvumo [44, 64]. Oksidacinis stresas laikomas viena svarbiausių įvairių ligų (reumatoidinio artrito, atminties, regėjimo sutrikimų, vėţio, širdies ir kraujagyslių sistemos ligų, insulto) atsiradimo ir vystymosi prieţasčių, todėl natūralių ţaliavų antioksidacinio poveikio tyrimai yra aktualūs ir svarbūs [63, 82].
